Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С

Деветьярова, Ольга Нурзадиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С"

На правах рукописи

Деветьярова Ольга Нурзадиновна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ, ПЕРЕНЕСШИХ КРИОАНАБИОЗ ПРИ -20°С

03.00.13 - физиология 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киров-2005

Работа выполнена в Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (РАН)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Сведенцов Евгений Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Иржак Лев Исаакович

доктор медицинских наук, Черепанова Валентина Васильевна

Ведущая организация: Челябинская государственная

медицинская академия

Защита состоится <ь1б» илОЛ- 2005 г. в .часов на заседании диссертационного совета К 208.036.01 при ГОУВПО «Кировская государственная медицинская академия» по адресу: 610027, г. Киров, ул. Карла Маркса, 112

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кировской государственной медицинской академии по адресу: 610027, г. Киров, ул. Карла Маркса, 137

Автореферат разослан <»¿6» 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Хлыбова Светлана Вячеславовна

¿te г-f.

H £>304

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время многими исследователями (Zhang Q., Tiersch T.R., 1995; Svedentsov Е.Р. et al., 1998; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2003, 2004;0сташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004; Смольянинова Е.И.и соавт., 2004) активно изучаются механизмы криоповреждения и криозащиты клеток животного происхождения. Большое внимание уделяется изучению физиологии клеток крови после воздействия различных стресс-факторов, в том числе отрицательных температур (Терентьева Э.И. и соавт., 1966; Цуцаева A.A. и соавт., 2004). Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма неустойчивыми к действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Необходимость исследования физиологических свойств белых клеток крови человека и разработки способов сохранения их в биологически полноценном состоянии, прежде всего, связана с расширением показаний к применению лейкоцитных концентратов (JIK). Трансфузии JIK являются эффективным средством профилактики и лечения инфекционного менингита, разлитого перитонита, сепсиса, лучевой болезни и других заболеваний (Ермолович C.B., 1981; Рыжков C.B. и соавт., 1992, 1995; Мельникова В.Н. и соавт., 1995; Cairo M.S. et. al., 1992; Bhatia S. et. al., 1994; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Мирошниченко А.Г. и соавт., 1996; Neppert J., 1996; Herzog R., 1999; Балашов Д.Н., 2001).

На протяжении многих лет (Абезгауз H.H., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович C.B., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов C.B. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2004) ведется поиск оптимальных методов замораживания и хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза. Накопленный опыт свидетельствует о том, что сохранить в биологически полноценном состоянии лейкоциты при положительной температуре (+4°С) можно до 24 часов (Цуцаева A.A., 1983), при температуре от 0 С до -4°С - до 48 часов (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), при -5 С в условиях гипербарии (при 400 атм) - до 3 недель (Павленко P.A. и соавт., 1988), при -60°С +-80°С - до 12 месяцев (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов C.B., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001), a при -196°С - в среднем до 20 месяцев (Лобынцева Г.С. и соавт., 1974; Пушкарь Н.С. и соавт., 1974; Аграненко В.А. и соавт, 1982,1997).

Анализ данных литературы позволяет заключить, что существующие методы замораживания до -196°С и хранение при данной температуре, хотя и являются наиболее результативными, но в тоже время требуют применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота и привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной, существенно затрудняет ее использование в криобиологической практике. ___

РОС. HAíi'-'O^ VbíMfl

200ЪИ< _ '

зарубежной литературе метод сохранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии при температуре -20°С не описан.

Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного воздействия холодового стресса используют различные криопротекторы: глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и другие, которые не являются абсолютно безвредными для организма и требуют удаления перед их применением с помощью отмывания (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н.,1997). Менее токсичный криопротектор диметилацетамид (ДМАЦ) в нашей стране не производится. Поэтому необходима разработка нетоксичного, эффективного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора. С другой стороны, для сохранения функциональной активности клеток требуется применение щадящей и нетрудоемкой программы охлаждения. Данным условиям отвечает экспоненциальная программа замораживания (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994).

Таким образом, для изучения физиологических особенностей лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20°С, актуальной остается разработка технологии замораживания и хранения их в условиях субумеренно-низких температур.

Разработка данного метода сохранения лейкоцитов в полноценном состоянии имеет и большое теоретическое значение, так как касается высокодифференцированных со сложными функциями клеток организма. Выяснение условий введения таких клеток в холодовой анабиоз при данной температуре и выведения из него создаст теоретическую основу для разработки подобных методов в отношении высокоорганизованных клеток и тканей организма млекопитающих и человека.

Цель исследования - определить функциональную активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20°С, достигнутый применением экспоненциальной программы охлаждения и нового криозащитного раствора.

Задачи исследования:

1. С целью выбора оптимального хладоограждающего раствора провести сравнительную характеристику влияния трех вариантов растворов (№№ 1, 2, 3) на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -20°С и хранившихся в условиях холодового анабиоза в течение 24 часов

2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов, фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и моноцитов, перенесших криоанабиоз (-20°С) продолжительностью 1-90 суток под защитой оптимального варианта хладоограждающего раствора.

3. Оценить в опытах на животных острую и хроническую токсичность и

пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и установить

переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов после их

хранения в течение 1 суток при -20°С.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучены функциональные и морфологические свойства лейкоцитов, вышедших из холодового анабиоза при -20°С, достигнутого с использованием оригинального хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания, показано, что в этих условиях сохранить фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов, целостность плазматической мембраны лейкоцитов, стабильность их морфологического состава и их общее количество на высоком уровне возможно в течение 21 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека, в том числе о высокой жизнеспособности лейкоцитов в условиях применения гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ) и оксиметилэтилпиридина сукцината (ОМЭПС) при -20°С. Дано научное обоснование криозащитных свойств разработанного хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства - криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ и мембраностабилизирующее и антиоксидантное вещество -ОМЭПС. На данный раствор получен патент на изобретение № 2240000 (РФ) от 20.11.2004 года. Кроме того, в опытах на экспериментальных животных доказана безвредность этого раствора на клеточном и организменном уровнях. Для высокой функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу при -20°С, предложен эффективный недорогостоящий и доступный метод, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы охлаждения, быстрого отогрева. Доказано, что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания, подходит для взвеси, содержащей разные популяции клеток. Установлено, что для осуществления данной процедуры замораживания не требуется применение дорогостоящей жидкоазотной технологии, возможно использование электрического морозильника для осуществления экспоненциальной программы и не требуется высокой квалификации обслуживающего персонала. На основе данных об отсутствии пирогенности, острой и хронической токсичности оригинального хладоограждающего раствора, о полноценной

морфофункциональной сохранности замороженных с ним клеток дано заключение о возможности и безопасности внедрения его в работу научных лабораторий и криобиологическую практику.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, введенных в холодовой анабиоз при -20°С, сохраняются на высоком уровне в течение 21 суток.

3. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз способствует сохранению их жизнеспособности и потому наряду с разработанным хладоограждающим раствором может использоваться для замораживания лейкоцитов при температуре -20°С.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), на заседании Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова (Киров, 2004), на научной сессии Кировского филиала Российской Академии Естествознания (Киров, 2004), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт- Петербург, 2004), заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20°С, в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в центральной печати; имеется t патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 машинописных страницах, состоит из «Введения», четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты экспериментальных исследований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), «Выводов», «Списка использованной литературы» (203 источника, в т.ч. 70 зарубежных авторов), «Списка работ, опубликованных по теме диссертации». Диссертация содержит 28 таблиц, 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились 118 донорских лейкоцитных концентратов, полученные из цельной крови 42 доноров - добровольцев путем цитафереза в отделении гравитационной хирургии крови при клинике ГУ КНИИГиПК. При цитаферезе использовалась центрифуга Sorvell (США)

с ускорением 2500{>/мин и охлаждением в течение 5 мин, гемоконсервант CDF.

Лейкоконцентрат смешивали в соотношении 1:1 с одним из вариантов хладоограждающего раствора. Смешивание проводили в пластикатном контейнере "Компопласт 300", экспозиция при комнатной температуре составляла 20 мин (рН раствора вместе с лейкоконцентратом - 7,0-7,2).

Средний объем биообъекта составлял 23,35±8,23 мл. Подготовленный биообъект в указанном контейнере погружали в заполненную хладоносителем (96% этиловым спиртом) 4000-миллилитровую ванну камеры электроморозильника «Криостат», охлажденную до -28°С («Криостат» на -30°С разработан Институтом проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины и ГУ Кировским НИИ гематологии и переливания крови). Регистрацию температуры осуществляли с помощью прибора ГСП - 04 (скорость движения ленты самописца - 240 мм/ч), используя датчик ТСМ-3-02, установленный в одном из контейнеров, содержащий имитатор - криозащитный раствор с конечной концентрацией его ингредиентов, как при смешивании с ЛК.

Замораживание лейкоцитов производили до -20°С в течение 10,00±1,83 мин по двухступенчатой экспоненциальной программе (рис.1) и хранили лейкоконцентраты в морозильнике при -20 С фирмы Derby (Дания). Быстрое размораживание лейкоконцентрата и его согревание до +2°С проводили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35 - 45 сек (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера.

Оптическую плотность растворов определяли на рефрактометре ИРФ-23 в лаборатории консервирования крови и тканей ГУ КНИИГиПК. Измерение рН хладоограждающих растворов и испытуемой биосреды (при смешивании ее с криозащитным раствором и после выхода из холодового анабиоза) проводили при комнатной температуре на ионометре ЭВ-74 стеклянными электродами (597 тестирований).

Изучение морфологического состава и функциональных свойств лейкоцитов ЛК осуществляли до введения в холодовой анабиоз и после выхода из него по следующим методикам.

Интегральность клеточной мембраны лейкоцитов определяли методом суправитального окрашивания эозином (Shreck R., 1936; Трошина В.М., 1981), считая признаком гибели клетки ее диффузное окрашивание в розовый цвет. В течение 2-3-х минут после добавления красителя подсчитывали количество морфологически полноценных лейкоцитов (т.е. неокрашенных) на 100 клеток (597 проб).

Подсчет общего количества лейкоцитов (в 597 пробах) проводили в камере Горяева общепринятым методом (объектив 40х, окуляр 7х).

Морфологический состав лейкоцитных концентратов (всего - 446) изучали по методу Г.И. Козинца (1998), используя увеличение 90х; мазки крови окрашивали последовательно красителями Май-Грюнвальда (лейкоциты до замораживания окрашивали в течении 45 сек, после

размораживания - 6 сек) и Романовского (до замораживания - 30 мин, после размораживания - 10 мин).

Биологическую полноценность гранулоцитов и моноцитов (1812 исследований) оценивали по их фагоцитарной активности, используя инертные частицы латекса диаметром 1,05 микрона и разведение 1:200 средой Хенкса. .Биообъект в объеме 0,1 мл смешивали с 0,05 мл раствора латекса и помещали в термостат при +37°С на 30 минут, каждые 10 минут смесь перемешивали встряхиванием, затем готовили мазки и окрашивали их красителями Лейшмана и Романовского. Вычисляли процент фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов и их фагоцитарный индекс по методу С.Г. Потаповой и соавт. (1977).

Окислительно-восстановительный метаболизм нейтрофилов и моноцитов (831 наблюдение) проводили по НСТ-тесту (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992), основанному на спонтанном восстановлении бесцветного нитросинего тетразолия до формазана, гранулы которого имеют синий цвет. Определение степени активации кислородзависимой биоцидной способности нейтрофилов и моноцитов осуществляли путем определения процента клеток с формазаном.

Влияние криозащитного раствора на сохранность лейкоцитов крови человека изучали в трех сериях опытов (1260 тестирований). Концентрат лейкоцитов смешивали с хладоограждающим раствором в соотношении 1:1 и экспонировали в течение 24 часов: в серии 1 - при +20°С, в серии 2 - при +4°С, в серии 3 - при -20°С (вводили в криоанабиоз по стандартной программе). Замороженный биообъект через 24 часа размораживали в течение 35-45 сек и последующие 24 часа экспонировали при +20°С (серия За) и при +4°С (серия 36). В каждой серии оценивали (по описанным выше методикам) жизнеспособность лейкоцитов, их количество, морфологический состав и ФАН через 1, 2, 3,4, 5, 6 и 24 часа.

Изучение стабильности хладоограждающих свойств применяемого раствора проведено согласно «Временной инструкции по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре» (1979) на 9 пробах (270 исследований). Исследовали раствор через 45 суток с момента его изготовления и хранения при +60°С, что соответствует двум годам хранения при +4°С. До замораживания оценивали прозрачность и рН раствора. Замораживание лейкоцитов проводили по экспоненциальной программе до -20°С; их хранили в течение 24 часов, после чего оценивали жизнеспособность и количество лейкоцитов, их морфологический состав, ФАН и окислительно- восстановительный метаболизм (по НСТ-тесту).

Испытание хладоограждающего раствора на «острую» токсичность проводили на белых мышах обоего пола (п=5) массой 19-20 г., согласно методике XI-ой Государственной Фармакопеи (1990). Раствор вводили в объеме 0,3 мл в хвостовую вену мыши со скоростью 0,1 мл/с. Срок наблюдения за животными после введения раствора составлял 5 суток.

Испытание хладоогразвдающего раствора на «хроническую» токсичность выполняли на двух видах животных: мышах и кроликах.

При исследовании на мышах (п=20), весом 19-20 г, испытуемый раствор в тест-дозе 0,5 мл вводили ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. В эти же сроки контрольной группе мышей (п=5) весом 19-20 г внутрибрюшинно вводили такой же объем 0,9% раствор ЫаС1. После десятой инъекции мыши опытной и контрольных групп подвергались эвтаназии (эфиром) с последующим гистологическим исследованием органов: головного мозга, легких, сердца, печени, почек, надпочечников, селезенки, половой железы, тонкого кишечника (275 гистологических препаратов) с целью выявления деструктивных изменений по общепринятому методу. Тестируемый раствор считался выдержавшим испытание, если после его 10-дневного введения не погибла ни одна из подопытных мышей, и в органах животных не обнаруживались деструктивные изменения.

При исследовании на кроликах обоего пола (п=10), неальбиносах, массой 2-3,5 кг, раствор вводили животным ежедневно в течение 10 дней в краевую вену ушной раковины в тест-дозе 6,6 мл/кг массы тела со скоростью 0,05 мл/с. В эти же сроки контрольной группе кроликов (п=5) весом 2-3,5 кг вводили такой же объем 0,9% раствор №С1. В первый день (до введения испытываемого раствора) и в последний день испытания у животных проводили общий анализ крови и мочи и измеряли массу тела. На 6-й день проведения эксперимента у кроликов регистрировали ЭКГ с помощью электрокардиографа ЭК- 1Т-03 (во II стандартном отведении) за 1 час до введения раствора и через час после введения. На 10-й день эксперимента кроликов подвергали эвтаназии (внутривенным введением 50-60 мл воздуха) с целью обнаружения деструктивных изменений органов (всего 135 препаратов) по общепринятому методу. Хладоограждающий раствор считали выдержавшим испытание, если после его 10-дневного введения не погибало ни одно из подопытных животных, а показатели крови, мочи и ЭКГ оставались в пределах нормы и в органах животных не было обнаружено деструктивных изменений.

Испытание хладоограждающего раствора на пирогенность проводили на здоровых кроликах обоего пола (п=3) неальбиносах, массой 2-3,5 кг, имеющих ректальную температуру 38,5-39,5°С, измеряемой медицинским термометром на протяжении 3-х суток и за 30 мин до испытания в соответствии с ГФ XI, 1990. Раствор вводили в ушную вену в количестве 6,6 мл/кг массы тела животного с последующим измерением ректальной температуры через 1, 2 и 3 часа после испытания. Раствор считали апирогенным, если сумма повышений температуры при трехкратном измерении у животного не превышала 1,4°С.

Переносимость трансфузий концентратов лейкоцитов, замороженных с разработанным хладоограждающим раствором, исследовали на здоровых беспородных собаках (п=3) массой 6,6; 10,0 и 17,8 кг. У животного брали венозную кровь в объеме, составляющем 1% от массы тела.

Центрифугирование крови проводили на центрифуге ЦР-3 со скоростью 2000 об/мин Е течение 7 мин. Лейкоцитный концентрат получали с помощью плазмоэкстрактора (фирмы Baxter) общепринятым способом. JIK смешивали с испытуемым раствором в соотношении 1:1, экспонировали при комнатной температуре 20 мин и замораживали до -20°С по экспоненциальной программе в течение 10±1,83 мин. После суточного хранения при -20°С производили быстрое размораживание концентрата лейкоцитов в 20-литровой водяной ванне при температуре + 38°С в течение 2-3 мин в зависимости от объема биообъекта до температуры +2°С и осуществляли аутологичную трансфузию со скоростью 20-30 капель/мин. В день взятия крови и спустя сутки после трансфузии JIK животным у них оценивали поведение, замеряли массу тела, частоту пульса и дыхания, ректальную температуру и показатели крови и мочи (на основе их общего анализа). Критерием переносимости трансфузий JIK, замороженного с тестируемым хладоограждающим раствором, считали отсутствие изменений всех перечисленных показателей после трансфузии ЛК.

Полученные данные, основанные на 6410 наблюдений, обработаны методами параметрической статистики; результаты выражали в виде М±а, а различия оценивали по критерию Стьюдента, считая их достоверными при р<0,05 (Гланц С., 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка влияния экспоненциальной программы замораживания до -20°С и трех вариантов хладоограждающего раствора на функциональное состояние лейкоцитов при их хранении в течение 24 часов. Показано, что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов до -20°С (рис. 1) при использовании всех трех вариантов хладоограждающий раствора (табл. 1) способствует сохранению жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов, особенно при использовании раствора № 2 (табл. 3, 4). Предваряя анализ этих данных, отметим, что, судя по термограмме (рис. 1), для экспоненциальной программы, сущность которой заключается в двухэтапном снижении температуры - на 1-ом этапе со скоростью 10° /мин до точки эвтектики (-2,1°С), а на 2-ом этапе со скоростью 2-3°/мин до температуры -20°С, не происходит выброса кристаллизационного тепла, о чем свидетельствует отсутствие плато кристаллизации. Это, согласно данным Е.А. Гордиенко, Н.С. Пушкарь (1994), свидетельствует о том, что в биообъекте не должно происходить рекристаллизации. Таким образом, экспоненциальная программа эффективна не только при замораживании лейкоцитов до -80°С (Утемов C.B., 1999), до -50°С (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003), до -40°С (Щеглова О.О. и соавт.,2002), но и до -20°С. Очевидно, что этот режим замораживания можно использовать для введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при разных температурах. Достоинством этой программы в сравнении с линейной программой замораживания (Леонтович В.А., 1974) является ее меньшая продолжительность и трудоемкость, а также она не

требует применения жидкоазотной технологии и высокой квалификации обслуживающего персонала.

Рис I Термограмма замораживания лейкоцитов до -20°С по экспоненциальной программе с оптимальным вариантом хладоограждающего раствора (№2)

В работе было изучено влияние трех вариантов хладоограждающего раствора для лейкоцитов, различающихся по концентрации входящих в него ингредиентов - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины и оксиметилэтилпиридина сукцината, на функциональную активность лейкоцитов, подвергнутых суточному хранению при -20°С. Конечная концентрация веществ, входящих в состав растворов №1, №2 и №3 после смешивания с Ж в соотношении 1:1, представлена в табл.1. При смешивании с JIK pH среды всех вариантов раствора не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 1

р Состав трех вариантов криозащитного раствора (в конечной концентрации) для введения

лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20 °С

Номер варианта хладоограждающего раствора Компоненты раствора и их процентная концентрация

ГМБТОЭМ, в % ОМЭПС, в %

1 13 0,05

2 14 0,075

3 15 0,10

Подсчет общего количества лейкоцитов (табл.2) показал, что при использовании всех трех вариантов растворов сохранность лейкоцитов достаточно высокая (92,40-95,25% от исходного уровня) и не зависит от композиции раствора. Однако оценка жизнеспособности лейкоцитов с помощью метода суправитального окрашивания эозином выявила (табл.3), что при использовании раствора № 2 показатели жизнеспособности

лейкоцитов, введенных в криоанабиоз (-20°С), после их 24-часового хранения оказались достоверно выше (83,20% лейкоцитов, не окрашенных эозином), чем при использовании растворов № 1 (72,80%, р2.|<0,05) и № 3 (78,17%).

Таблица 2

Количество лейкоцитов до введения в холодовой анабиоз (-20°С в течение 24 ч) и после _выведения из него с тремя вариантами хладоограждающего раствора (М±ст)_

Вариант раствора Число опытов Число лейкоцитов

до замораживания, в 1 мкл после размораживания

В 1 мкл в % от исходного уровня

1 5 10520±3987 9730±3649 92,40±1,50

2 5 1323015543 12300+4810 95,25+3,86

3 6 10530+1926 9933±2085 94,33±4,63

Примечание различия между эффектами растворов и между группами лейкоцитов носят недостоверный характер (р>0,05)

Таблица 3

Эозинорезистентность лейкоцитов до введения в холодовой анабиоз (-20°С, в течение 1 и

21 суток) и после выхода из него при использовании трех вариантов __хладоограждающего раствора (М±а)__

Вариант раствора Число опытов Количество эозинорезистентных лейкоцитов, в % от всех лейкоцитов

до замораживания после размораживания

Длительность холодового анабиоза 1 сутки

1 5 99,00±0,80 72,80±5,76*

2 5 98,60±1,67 83,20±2,95*

3 6 98,83±0,75 78,17±7,52*

Достоверность различия между растворами - Рм<0,05

Длительность холодового анабиоза 21 сутки

1 7 98,86±1,46 77,71±9,79*

2 7 98,71±1,38 83,50±5,86»

3 7 99,00±0,82 83,00±5,86*

Достоверность различия между растворами - -

Примечание *- различия с данными до замораживания достоверны при р<0,05

Оценка морфологического состава лейкоцитов выявила, что при использовании хладоограждающего раствора № 2 число гранулоцитов существенно не меняется (исходно - 37,33±9,45% от всех лейкоцитов, после размораживания - 32,67±5,03% от всех лейкоцитов или 88,67±8,39% от исходного уровня, р>0,05), в то время как применение растворов № 1 и №3 сопровождается достоверным его снижением (соответственно до 62,33±8,08% и 65,67±4,04% от исходного уровня, р<0,05).

При оценке ФАН установлено (табл.4), что хранение в течение 24 ч при -20°С сопровождается достоверным снижением этого показателя при использовании всех трех вариантов растворов, однако в условиях применения раствора Кг 2 выраженность этого снижения была достоверно ниже (до 82,33% от исходного уровня против 63,80% и 57,60%, Р2.|,з<0,05).

Таблица 4

Фагоцитарная активность нейтрофилов до введения в холодовой анабиоз (-20°С в течение 1 и 21 суток) и после выхода из него с тремя вариантами __ хладоограждающего раствора (М±о)_

Вариант раствора Число опытов Фагоцитарная активность нейтрофилов

до замораживания, % после размораживания

% | в%отисх уровня

Длительность холодового анабиоза 1 сутки

1 5 66,60±6,31 42,40±4,33* 63,80±6,45*

2 5 71,00±7,00 60,00±6,25* 82,33±4,51*

3 6 61,83±5,42 36,00±3,81* 57,60±6,50*

Достоверность различия между растворами Р2.З<0,05 Р2-1,З<0,05 Р2.1,з<0,05

Д ^ительность холодового анабиоза 21 сутки

1 7 63,43±2,88 30,33±11,47* 42,20± 16,02

2 7 56,86±6,52 38,29+7,76* 71,67+10,82

3 7 66,14±4,34 30,00±3,65* 45,71 ±7,27

Достоверность различия между растворами Р2..,З<0,05 - Рм,з<0.05

Примечание *- различия с данными до замораживания достоверны при р<0,05

Таким образом, вариант раствора №2 (ГМБТОЭМ - 14% и ОМЭПС -0,075% в конечной концентрации) в сравнении с вариантами раствора № 1 и № 3, судя по жизнеспособности лейкоцитов, сохранности гранулоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов, проявляет лучшие криозащитные свойства в условиях субумеренно-низкой температуры (- 20°С) в течение 24 ч. Однако, этот вывод требовал дополнительного подтверждения при использовании этого варианта раствора в условиях продолжительного криоанабиоза (-20°С), в частности, длящегося 21 сутки.

2. Оценка влияния экспоненциальной программы замораживания до -20°С и хладоограждающих растворов на функциональное состояние лейкоцитов при их хранении в течение 21 суток. Исследования показали, что при использовании раствора № 2 показатели функциональной активности лейкоцитов, введенных в криоанабиоз (-20°С) после их хранения в течение 21 суток оказались достоверно выше, чем при использовании растворов № 1 и № 3 (табл.4). Количество лейкоцитов, как и в течение 24 ч, достоверно не менялось при использовании всех вариантов раствора. При определении эозинорезистентности установлено достоверное (р<0,05) снижение жизнеспособных лейкоцитов при использовании всех вариантов хладоограждающего раствора (табл.3), т.е. выявить преимущество какого-либо раствора выявить не удалось. Уровень ФАН (табл.4) при

использовании всех трех вариантов раствора к 21суткам хранения достоверно снизился, но степень этого снижения при использовании хладоограждающего раствора №2 была достоверно ниже, чем при использовании растворов №1 и №3.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о высокой функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов крови человека при замораживании по предложенному способу с использованием хладоограждающего раствора №2, который оказался более эффективным и при суточном, и при 21-суточном хранении. Это дает основание признать раствор №2 оптимальным для длительного хранения лейкоцитов в условиях холодового анабиоза при -20°С. Полагаем, что более выраженные криозащитные свойства у варианта раствора №2 (по сравнению с вариантами №1 и №3) обусловлены такой концентрацией криопротектора ГМБТОЭМ (Сведенцов Е.П. и соавт., 1995, 1997) и мембраностабилизирующего, антиоксидантного и антигипоксантного вещества - ОМЭПС (Лукьянова Л.Д., 1990; Девяткина Т.А. и соавт., 1999; ВИДАЛЬ, 2001), при которой репаративные способности лейкоцитов после выхода из криоанабиоза (-20°С) максимальны. Впервые выявленная нами способность ОМЭПС в сочетании с ГМБТОЭМ сохранять функциональную активность лейкоцитов в условиях криоанабиоза (-20°С) позволяет рекомендовать его как компонент криоконсервантов в тех случаях холодового анабиоза, при которых фракции внутриклеточной связанной и фиксированной воды остаются в незамерзшем состоянии (Сведенцов Е.П., 2004), т.е. от -20°С и выше.

З.Зависимость функционального состояния нативных лейкоцитов от длительности экспозиции в хладоограждающем растворе при +20°С и при +4°С. С целью определения сроков сохранения оптимальной жизнеспособности и функциональной активности нативных лейкоцитов в хладоограждающем растворе при положительной температуре до их введения в холодовой анабиоз были проведены 4 серии экспериментов, что имеет существенное значение для криофизиологии и трансфузиологии. Исследование нативных лейкоцитов, хранящихся при +20°С (серия 1) или при +4°С (серия 2) показало, что во всех случаях их свойства постепенно снижаются, однако степень этого снижения при +4°С была достоверно ниже. Действительно, количество эозинорезисгентных лейкоцитов при +20°С достоверно снизилось уже через 3 ч от начала экспозиции (с 99Д5±1Д5% в исходном состоянии до 95,01±3,60%, р<0,05), а при +4°С -только через 5 ч (до 97,69±1,25%), общее количество лейкоцитов снизилось соответственно через 3 часа (от 99,33±0,64% в исходном состоянии до 94,83±3,50%) и через 4 часа (до 95,25±1,00%). Количество гранулоцитов достоверно уменьшалось в обеих сериях через 3 ч, в том числе при +20°С - с 32,20±2,64% в исходном состоянии до 2б,56±2,66%, а при +4°С - до 25,64±4,20%. ФАН также снижалась достоверно через 2 часа экспозиции и при +20°С (с 68,00±0,82% в исходном состоянии до 65,23±2,24%), и при +4°С (до64,12±3,01%).

Следовательно, нативные лейкоциты, хранившиеся с хладоограждающим раствором №2 при комнатной температуре (+20°С) или в электрохолодильнике (+4°С), имеют оптимальную жизнеспособность и ФАН в первые 2 часа после их получения от доноров-добровольцев. Этот временной фактор необходимо учитывать при введении лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20°С с разработанным криозащитным раствором.

4. Изменение функционального состояния размороженных лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20°С в течение 1 суток.

Проведенные 2 серии (За и 36) экспериментов показали, что при хранении лейкоцитов после размораживания при +20°С (серия За) и при +4°С (серия 36) общее число клеток достоверно (р<0,05) снижалось после 1 ч экспозиции (от 96,26±1,25% в исходном состоянии до 90,00±3,25% и до 92,48±2,56% соответственно); их эозинорезистентность - через 30 минут в серии За (от 89,25±2,24% в исходном состоянии до 70,56±2,22%) и в серии 36 (до 72,51±2,10%). Количество гранулоцитов достоверно уменьшалось через 30 мин экспозиции и в серии За (с 29,60±3,13% в исходном состоянии до 15,06±1,10%) и в серии 36 (до 15,63*3,12%). ФАН снижалась достоверно через 30 мин экспозиции и в серии За (с 49,38+2,41% в исходном состоянии до 17,66±2,03%), и в серии 36 (до 20,66±2,03%).

Результаты исследования указывают на то, что рационально использовать размороженные лейкоциты в пределах первых 30 мин после их выведения из холодового анабиоза.

5. Влияние длительного (в течение 45 суток при температуре +60° С) хранения хладоограждакицего раствора № 2 на его криозащитные свойства. Хранение при указанных условиях, которые, как известно (Временная инструкция..., 1979) эквивалентны 2-летнему хранению при +4°С, не выявило снижение его криозащитных свойств (табл. 5). Действительно, результаты исследований показали, что раствор №2, хранившийся в течение 45 суток при +60°С способен сохранять функциональную активность лейкоцитов, криоконсервированных при -20°С (24 ч), в той же степени, как и свежеприготовленный раствор №2, т.е. не подвергавшийся «старению» (табл. 2 и 3). В процессе 45-суточного «старения» раствора №2 не менялась его прозрачность и pH.

6. Жизнеспособность лейкоцитов, фагоцитарная и метаболическая активность нейтрофилов и моноцитов, подвергнутых криоанабиозу (-20°С) разной длительности (1-90 суток) при использовании хладоограждающего раствора №2. С целью определения оптимального срока хранения лейкоцитные концентраты, смешанные с хладоограждающим раствором №2, хранили в условиях холодового анабиоза (-20°С) в течение 1, 14, 21, 28, 42, 56, 70, 80 и 90 суток. Установлено, что при такой технологии хранения лейкоцитов параметры, характеризующие их функциональную активность, остаются на высоком уровне в течение 21 суток, после чего большинство из них снижаются; исключение представляет такой показатель как эозинорезистентность, который уменьшается при всех сроках всего на 10-13% от исходного уровня. В частности показано, что достоверное

снижение количества гранулоцитов (табл.6) и показателей ФАН (табл.7, рис.2) происходило спустя 28 суток от начала холодового анабиоза (-20°С). Попутно отметим, что в наших исследованиях (табл.7) выявлена зависимость исходного уровня ФАН от сезонов года (конец зимы, весна, начало лета), что уже отмечалось в литературе (Федорова М.З. и соавт., 2003).

Таблица 5

Показатели лейкоконцентрэта (М±сг) с хладоограждающим раствором №2 (подвергнутым _«старению») до и после выхода из суточного криоанабиоза (-20°С)_

Показатели лейкоконнентрата До замораживания После размораживания

ед.измер. ед нзмер в % к исходному уровню

Количество лейкоцитов 14760А1230 в 1 мкл 13800*890 в 1 мкл 93,49±4,62

Количество жизнеспособных лейкоцитов 98,25*1,45% 92,44±4,28%* 94,08*4,25

Морфологический состав лейкоцитов гранулошггы 33,82±4,64% 29,87±4,45% 88,3214,48

моноциты 12,28*4,42% 14,58±4,02% 118,72*19,15

лимфоциты 52,65±3,14% 56,68±4,82% 107,65±8,66

Число фагоцитарно активных нейтрофилов, 46,38±4,35% 38,03±5,85%* 81,68*5,23

Число метаболически активных нейтрофилов, % (НСТ-тест) 4,80±0,45% 12,68±0,66% • 264,16*10,54

Примечание п = 9, * - достоверное (р<0,05) отличие от данных до замораживания

Изучение фагоцитарной активности моноцитов показало (табл.8), что после размораживания она достоверно не изменялась, однако через 28 суток хранения наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение количества поглощенных частиц латекса одной клеткой (ФИ), тогда как у нейтрофилов этот показатель снижался уже через 1 сутки хранения (табл.7).

По данным НСТ-теста до введения в состояние холодового анабиоза способностью восстанавливать формазан обладали в среднем 4% нейтрофилов. Хладоограждающий раствор №2 не влиял на этот показатель. После размораживания среди нейтрофилов количество клеток с темно-синими гранулами увеличивалось, при этом среди хранившихся в течение 121 суток это число возрастало в 3 раза, а среди хранившихся в течение 28 суток - в 9 раз (рис.3). Вероятно, при удлинении срока воздействия холодового стресса кислородзависимый метаболизм у гранулоцитов и, прежде всего, функция гексозомонофосфатного шунта, а также связанная с ним продукция свободных радикалов кислорода существенно повышаются, в результате чего в размороженных клетках наблюдается респираторный взрыв. При более длительном нахождении клеток в криоанабиозе (более 28 суток) определить процент НСТ-положительных клеток весьма затруднительно, т.к. общее количество размороженных нейтрофилов в мазках (после 30-минутной инкубации в термостате) резко снижено, что,

вероятно, связано с повышенными процессами аутолиза, вызванного образованием резервных активных форм кислорода при холодовом стресс-воздействии на клетки.

Таблица 6

Количество отдельных форм лейкоцитов (М±а), хранившихся с раствором №2 при -20°С __от 1 до 90 суток (п=7)_

Сроки хранения, сутки До замораживания в % После размораживания

от общего числа в % от общего числа в % от исходного уровня

лейкоцитов леикоцитов

Гранулоциты

1 34,17±6,99 30,43±7,30 80,80±12,30

14 30,57±8,77 28,29±7,61 93,71±9,79

21 36,09±6,80 31,18±4,09 87,29±6,71

28 34,86±4,88 26,14±4,71» 75,14±9,%

42 46,57±8,56# 32,57±5,47* 71,86±17,63

56 43,29±6,67# 35,86±3,18» 84,00± 10,61

70 42,25±6,41# 31,17±5,15» 74,42±11,69

80 26,20±4,38# 15,67±8,08»# 67,50±23,04

90 28,25±6,50 20,50±3,70*# 74,50± 17,99

Лимфоциты

1 52,60*7,57 56,60±5,08 108,60*11,52

14 54,26±4,13 55,32±3,12 101,95±2,75

21 52,65±4,28 57,54±5,62 109,28±4,56

28 52,90±3,86 58,18±4,12 109,98±4,18

42 40,03±8,44# 48,62±5,65# 121,45±6,98#

56 44,09±6,82# 47,00±5,43# 106,60±5,96

70 44,21±6,59# 49,40±5,31# 111,73±5,64

80 61,92±4,93# 64,91±9,95# 104,82±6,89

90 58,93±8,84 60,56±4,19 102,76±8,15

Моноциты

1 12,8<Ш>,84 13,40±1,14 104,60±4,22

14 13,65*2,04 13,82±1,84 101,24±1,90

21 11,26±2,41 11,28±2,50 100,17±3,44

28 12,24±1,80 15,68±1,74*# 128,10±1,80*

42 13,40±2,11 18,81±2,21»# 140,37±2,18#

56 12,62±1,20 17,14±1,83*# 135,81±1,64#

70 13,54±3,08 19,43±2,15*# 143,50±2,84#

80 11,88±2,14 17,68±1,12*# 148,82±2,Ш

90 12,82±1,48 18,94±2,80*# 147,73±2,64#

Примечание *- различия с данными до замораживания достоверны при р<0,05, # -

данные достоверно отличаются от результатов хранения в течение одних суток

В отношении моноцитов установлено, что до замораживания способностью восстанавливать формазан обладали 1,25±0,45 % клеток, а после размораживания количество таких клеток увеличивалось, причем степень этого увеличения зависела от сроков нахождения клеток в состоянии холодового анабиоза: при 1 и 14 суточном хранении - в 6 раз, при 21-суточном - в 12 раз, а при 28-90-суточном - в 26 раз. Более продолжительная активность моноцитов по сравнению с нейтрофилами, возможно, объясняется большей их устойчивостью к неблагоприятному воздействию холода.

Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов (М±а), хранившихся при -20°С

от 1 до 90 суток (п=7)

Сроки холодово 14) анабиоза (сутхи) Фагоцитарная активность нейтрофилов Фагоцитарный индекс нейтрофилов

до замораживания, % после размораживания до замораживя ния после разморажнва ния

% %отисх

1 68,43*7,21 51,17±10,53* 75,67± 7,94 5,00±1,41 2,57±0,78*

14 46,29±1,25# 35,20± 3,70*# 75,20± 8,14 7,43±0,53# 3,0011,15«

21 56,86±6,52# 38,29± 7,76*# 71,67±10,82 4,71±0,95 3.14±0,90*

28 60,43±5,91# 36,43± 2,94*# 60,57± 7,32# 8,14±0,90# 3,43±0,79*

42 58,86±4,91# 36,00± 6,35*# 58,33±10,82# 11,86±4,34# 4,00±1,91*

56 57,71±5,44# 36,14± 4,85*# 60,43±10,72# 14,00±2,94# 3,71 ±0,95 *#

70 61,67±4,89 35,08± 4,72*# 57,08± 8,26# 8,92±1,83# 3,08±1,30*

80 61,00±8,22 27Д0± 2,39*# 45,40± 7,83# 14,40±2,19# 2,20*0,45*

90 51,75±2,50# 23,50± 3,42'й 45,75± 8,66# 3,25±0,50 2,00±0,00*

Примечание *- различия с данными до замораживания достоверны при р<0,05; # - данные достоверно отличаются от результатов хранения в течение одних суток

1 14 21 28 42 56 70 80 90

сутки

Рис 3 Число фагоцитарно активных нейтрофилов в % к исходному уровню (М±с), хранившихся при -20°С в течение 1-90 суток

Таким образом, разработанный нами метод введения в холодовой анабиоз при -20°С лейкоцитов, включающий в себя: применение нового криозащитного раствора, экспоненциальной программы замораживания и быстрого отогрева, позволяет сохранить функциональную активность лейкоцитов на высоком уровне в течение 21 суток.

Показатели фагоцитарной активности моноцитов (М±а), хранившихся при

__от 1 до 90 суток (п~7) ______

Сроки холодового анабиоза (сутки) Фагоцитарная активность моноцитов(%) Фагоцитарный индекс моноцитов

до замораживания после размораживания ДО замораживания после размораживания

1 4,57*1,72 3,57±0,79 3,00±1,41 2,00x0,81

14 3,57*0,53 3,48±1,12 2,00*1,15 1,86*0,38

21 4,60*1,34 4,28*1,14 2,57*0,97 2,14*0,69

28 4,15*1,88 4,66*1,22 6,14±0,90# 2,86±0,38*#

42 5,00*1,00 4,62*1,02 7,86±2,27# 3,43*0,53«#

56 4,29±0,49 4,15*0,75 7,00*1,83# 3,71*0,49*#

70 4,86±1,07 3,89±0,81 4,50*2,61 2,17*0,39*

80 3,60*0,55 3,54±0,60 2,80*0,64 1,80*0,45*

90 3,25*0,50 3,41±0,25 2,25*0,51 1,50*0,58*

Примечание * - различия с данными до замораживания достоверны при р<0,05; # данные достоверно отличаются от результатов хранения в течение одних суток

40 -,

J J J

__НШНН_^_—ЛЕ^^Н

1 сутки

14 суток

21 сутки

28 суток

идо замораживания ■ после размораживания

Рис 3 Процент НСТ- положительных нейтрофилов, перенесших холодовой анабиоз (-20°С) различной длительности, * - различия с исходным уровнем достоверны, р<0,05

6. Оценка в опытах на животных «острой», «хронической» токсичности и пирогенности оптимального хладоограждающего раствора и переносимости аутологичных лейкоцитных концентратов после их хранения в течение 1 суток при -20°С. Экспериментальные исследования на животных показали, что предлагаемый нами криозащитный раствор является нетоксичным. Все особи при определении «острой» токсичности хладоограждающего раствора по истечении 5 суток остались живы. При определении «хронической» токсичности раствора животные (мыши и кролики) благоприятно перенесли многократное его введение. Показатели общих анализов крови, мочи и ЭКГ (кролики) после 10-дневного курса введения раствора не изменились относительно исходных. При гистологическом исследовании органов животных (мыши и кролики):

головного мозга, легких, сердца, печени, почек, надпочечников, селезенки, половой железы, тонкого кишечника деструктивных изменений не выявлено.

Доказано, что разработанный нами криозащитный раствор, апирогенен - ни у одного из исследуемых животных не было зафиксировано изменения ректальной температуры тела, превышающего норму.

При исследовании переносимости аутотрансфузии лейкоцитного концентрата экспериментальными животными (собаками) не наблюдалось отклонений от нормы в поведении, изменений ректальной температуры, массы тела, показателей гемограммы и урограммы, частоты дыхания и частоты сердечных сокращений.

Следовательно, в опытах на животных подтверждено, что разработанный нами раствор в отличие от ранее применяемых криофилактиков (глицерин, ДМСО) является нетоксичным, апирогенным и хорошо переносимым, следовательно, не требует отмывания от биообъекта перед его использованием.

Таким образом, разработан эффективный метод введения лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20°С), включающий в себя применение нетоксичного, апирогенного криозащитного раствора, экспоненциальной программы замораживания и быстрого размораживания. Применение данного метода позволяет защитить лейкоциты от неблагоприятных факторов, связанных с охлаждением и отогреванием, и способствует сохранению лейкоцитами функциональной активности после размораживания.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальным криозащитным раствором, сохраняющим жизнеспособность, морфологический состав и фагоцитарную активность нейтрофилов, введенных в состояние криоанабиоза (-20°С) по экспоненциальной программе и хранившихся в течение 1 и 21 суток, признан раствор №2, содержащий криопротектор ГМБТОЭМ (14% в конечной концентрации) и мембраностабилизируюшее, антиоксидантное и антигипоксантное вещество ОМЭПС (0,075%). В его присутствии сохраняется в течение 1 суток 95,25% лейкоцитов, жизнеспособными из которых являются 84,00%, а фагоцитарной активностью обладают 82,33% нейтрофилов. Способность проявлять криозащитные свойства у данного раствора сохраняется в течение 45 суток (при +60°С), что эквивалентно 2 годам хранения при +4°С.

2. Оптимальным сроком хранения лейкоцитов в условиях криоанабиоза (-20°С) являются 21 сутки, в течение которых сохраняется 90,91±7,56% лейкоцитов, из них 89,27±6,84% остаются жизнеспособными. Фагоцитарная активность нейтрофилов составляет 71,67±10,82%, их метаболическая активность (НСТ-тест) повышается в 3 раза. Фагоцитарная активность моноцитов не изменяется после размораживания при всех сроках хранения. Метаболическая активность моноцитов увеличивается в зависимости от сроков нахождения клеток в состоянии холодового анабиоза: через 1 и 14

суток - в 6 раз, через 21 сутки - в 12 раз, а через все последующие сроки (2890 суток) - в 26 раз.

3. Хладоограждающий раствор №2 является нетоксичным и апирогенным, так как не вызывает гибель животных и не изменяет их поведения, показателей ЭКГ, гемограммы, урограммы, не повышает ректальную температуру, не приводит к деструктивным изменениям органов. Физиологически активные аутологичные лейкоцитные концентраты, подвергнутые холодовому анабиозу при -20°С с хладоограждающим раствором, не требующим отмывания после размораживания, при внутривенном переливании не вызывают реакций и осложнений у экспериментальных животных

4. Применение экспоненциальной программы замораживания и оригинального хладоограждающего раствора является эффективным и доступным методом для хранения лейкоцитов в условиях субумеренно-низкой температуры (-20°С), что может использоваться для криофизиологии и трансфузиологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Способ криоконсервирования лейкоцитов человека (Патент РФ №2240000 от 20.11.2004), основанный на использовании хладоограждающего раствора № 2, экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов и их хранения при -20°С (в электрическом морозильнике, например, фирмы Derby), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 21 суток, рекомендуется для использования в криофизиологии и в лабораториях биологического и медицинского профиля.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Деветьярова О.Н. Консервирование лейкоцитов крови человека при -20°С/ О.Н. Деветьярова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, C.B. Утемов, О.О. Щеглова, Д.А. Карпов // Актуальные вопросы эндокринной хирургии, хирургической гепатологии и трансфузионной медицины: Сб. научн. Тр. -Пермь, ПГМА, 2003. - С.267-271.

2. Деветьярова О.Н. Морфофункциональная активность криоконсервированных лейкоцитов при -20°С в разные сроки хранения / О.Н. Деветьярова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.О. Щеглова, C.B. Утемов, Д.А. Карпов // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика: Матер. Всеросс. научн. школы.-Киров: ВятГТУ, 2003.- С. 268-269.

3. Сведенцов Е.П. Морфологические и функциональные свойства гранулоцитов через разные сроки хранения при -20°С / Е.П. Сведенцов, О.Н. Деветьярова, Т.В. Туманова, C.B. Утемов, О.О. Щеглова // Науке нового века - знания молодых: Матер. 3-й научн. конф. аспирантов и соискателей. -Киров: ВГСХА, 2003. -С.120-121.

4. Svedentsov Ye.P. Conservation of biological full value leukocytes at freezing with original ciyoprotective solutions under an exponential programme /

Ye.P. Svedentsov, O.O. Chtcheglova, O.N. Devetyarova, T.V. Tumanova, S.V. Utyomov, A.A. Kostyayev // Materials of the international conference «Preservation of genetic resources» (St. Petersburg, October 19-22, 2004) / Цитология. - T. 46. - №9. - 2004. - с. 853-854

5. Сведенцов Е.П. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-40°С) / Е.П. Сведенцов, 0.0. Щеглова, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, A.A. Костяев, C.B. Утемов // Е.П. Сведенцов, 0.0. Щеглова, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, A.A. Костяев, C.B. Утемов //Бюлл. эксперим. биол. и мед..-2004,- Т.138,№ 10. - С.400-402.

6. Патент РФ N»2240000. Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, C.B. Утемов, A.A. Костяев, 0.0. Щеглова. Заявлено 4.12.2002; Опубл. 20.11.2004, Бюл.32.

7. Сведенцов Е.П. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20°С) по экспоненциальной программе / Е.П. Сведенцов, О.Н. Деветьярова, Т.В. Туманова, О.О. Щеглова, A.A. Костяев, C.B. Утемов // Росс, физиол. журнал им. И.М. Сеченова. -2005.- Т.91, №5. - С.558-566.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

ГФ - Государственная Фармакопея

ДМАЦ - диметилацетамид

ДМСО - диметилсульфоксид

ЛК — лейкоцитный концентрат

HCT - нитросиний тетразолий

ОМЭПС - оксиметилэтилпиридина сукцинат

ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов

ФИ - фагоцитарный индекс

CDF - цитратфосфатдекстроза

Отпечатано в типографии КГМА. г. Киров, ул. К. Маркса, 112 Заказ 215. Тираж 100. .

РНБ Русский фонд

2005-4 46309

19 МАЙ 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Деветьярова, Ольга Нурзадиновна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы. Современное состояние проблемы введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при температуре -20°С

1.1. Функциональные свойства лейкоцитов.

1.2. Методы получения лейкоцитного концентрата и его применение.

1.3.Сроки хранения лейкоцитов при различных температурах.

1.4. Концепции и теории криоповреждения и криозащиты плазматических мембран.

1.5. Криопротекторы и криоконсерванты, используемые при . - замораживании лейкоцитов.

1.6. Методы криоконсервирования лейкоцитов.

Глава П. Материалы и методы исследований.

Глава III. Результаты экспериментальных исследований

3.1. Разработка метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20°С.

3.1.1. Применение экспоненциальной программы для замораживания лейкоцитов до -20°С.

3.1.2. Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора.

3.1.3. Изучение влияния длительности хранения применяемого хладоограждающего раствора на сохранение его криозащитных свойств.

3.2. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (-20°С) и после выхода из него.

3.2.1. Действие криозащитного раствора на сохранность лейкоцитов.

3.2.2. Определение оптимального срока хранения лейкоцитов. .•.

3.2.3. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека при оптимальном сроке хранения с разными вариантами хладоограждающего раствора.

3.3. Изучение биологических особенностей разработанного хладоограждающего раствора для лейкоцитов.

3.3.1. Изучение «острой токсичности» хладоограждающего раствора.

3.3.2. Изучение «хронической токсичности» хладоограждающего раствора.

3.3.3. Изучение пирогенности хладоограждающего раствора.

3.3.4. Изучение переносимости экспериментальными ^животными трансфузий концентрата лейкоцитов, замороженных с разработанным хладоограждающим раствором.

Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С"

Актуальность темы.

В настоящее время многими исследователями (Zhang Q., Tiersch T.R., 1995; Svedentsov Е.Р. et al., 1998; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2003, 2004;0сташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004; Смольянинова Е.И.и соавт., 2004) активно изучаются механизмы криоповреждения и криозащиты клеток животного происхождения. Большое внимание уделяется изучению физиологии клеток крови после воздействия различных стресс-факторов, в том числе отрицательных температур (Терентьева Э.И. и соавт., 1966; Дудаева А.А. и соавт., 2004). Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма неустойчивыми к действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Необходимость исследования физиологических свойств белых клеток крови человека и разработки способов сохранения их в биологически полноценном состоянии, прежде всего, связана с расширением показаний к применению лейкоцитных концентратов (ЛК). Трансфузии JIK являются эффективным средством профилактики и лечения инфекционного менингита, разлитого перитонита, сепсиса, лучевой болезни и других заболеваний (Ермолович С.В., 1981; Рыжков С.В. и соавт., 1992, 1995; Мельникова В.Н. и соавт., 1993; Cairo M.S. et. al., 1992; Bhatia S. et. al., 1994; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Мирошниченко А.Г. и соавт., 1996; Neppert J., 1996; Herzog R., 1999; Балашов Д.Н., 2001).

На протяжении многих лет (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович С.В., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов С.В. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004) ведется поиск оптимальных методов замораживания и хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза. Накопленный опыт свидетельствует о том, что сохранить в биологически полноценном состоянии лейкоциты при положительной температуре (+4°С) можно до 24 часов (Цуцаева А.А., 1983), при температуре от 0°С до -4°С - до 48 часов (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), при -5°С в условиях гипербарии (при 400 атм) - до 3 недель (Павленко Р.А. и соавт., 1988), при -60°С -^-80°С - до 12 месяцев (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов С.В., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et^al., 2001),-а при^196°С - в-среднем до 20 месяцев (Лобынцева Г.С. и соавт., 1974; Пушкарь Н.С. и соавт., 1974; Аграненко В.А. и соавт, 1982, 1997).

Анализ данных литературы позволяет заключить, что существующие методы замораживания-до--196-G и хранение приданной температуре,хотя и являются наиболее результативными, но в тоже время требуют применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота и привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной, существенно затрудняет ее использование в криобиологической практике.

Поэтому весьма актуальным является создание простого, эффективного и экономичного метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз без использования жидкоазотной технологии при других температурах, в том числе субумеренно-низких тем более, что в отечественной и зарубежной литературе метод сохранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии при температуре -20°С не описан.

Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного воздействия холодового стресса используют различные криопротекторы: глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и другие, которые не являются абсолютно безвредными для организма и требуют удаления перед их применением с помощью отмывания (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н.Д997). Менее токсичный криопротектор диметилацетамид (ДМАЦ) в нашей стране не производится. Поэтому необходима разработка нетоксичного, эффективного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора. С другой стороны, для сохранения функциональной активности клеток требуется применение щадящей и нетрудоемкой программы охлаждения. Данным условиям отвечает экспоненциальная программа замораживания (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994).

Таким образом, для „изучения физиологических особенностей — лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20°С, актуальной остается разработка технологии замораживания и хранения их в условиях субумеренно-низких температур.

Разработка данного метода сохранения лейкоцитов в полноценном^— состоянии имеет и большое теоретическое значение, так как касается высокодифференцированных со сложными функциями клеток организма. Выяснение условий введения таких клеток в холодовой анабиоз при данной температуре и выведения из него создаст теоретическую основу для разработки подобных методов в отношении высокоорганизованных клеток и тканей организма млекопитающих и человека.

Цель исследования - определить функциональную активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при —20°С, достигнутый применением экспоненциальной программы охлаждения и нового криозащитного раствора.

Задачи исследования: 1. С целью выбора оптимального хладоограждающего раствора провести сравнительную характеристику влияния трех вариантов растворов (№№ 1, 2, 3) на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -20°С и хранившихся в условиях холодового анабиоза в течение 24 часов

3. Оценить в опытах на животных острую и хроническую токсичность и пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и установить переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов после их----хранения в течение 1 суток при -20°С.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучены функциональные и морфологические свойства лейкоцитов, вышедших из холодового анабиоза при достигнутого с использованием оригинального хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания, показано, что в этих условиях сохранить фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов, целостность плазматической мембраны лейкоцитов, стабильность их морфологического состава и их общее количество на высоком уровне возможно в течение 21 суток.

РФ) от 20.11.2004 года. Кроме того, в опытах на экспериментальных животных доказана безвредность этого раствора на клеточном и организменном уровнях. Для высокой функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу при -20°С, предложен эффективный недорогостоящий и доступный метод, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы охлаждения, быстрого отогрева. Доказано,-----что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость^ процедуры -замораживания,—подходит—для —взвеси, содержащей разные популяции клеток. Установлено, что для осуществления данной процедуры замораживания не требуется применение дорогостоящей жидкоазотной технологии, возможно использование электрического морозильника для осуществления экспоненциальной программы и не требуется высокой квалификации обслуживающего персонала. На основе данных об отсутствии пирогенности, острой и хронической токсичности оригинального хладоограждающего раствора, о полноценной морфофункциональной сохранности замороженных с ним клеток дано заключение о возможности и безопасности внедрения его в работу научных лабораторий и криобиологическую практику.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ и ОМЭПС, и являясь нетоксичным, апирогенным, не требующим отмывания после оттаивания биообъекта, способствует сохранению функциональной активности лейкоцитов, подвергнутых криоанабиозу при -20° С. 3. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз способствует сохранению их жизнеспособности и потому наряду с разработанным хлад о ограждающим раствором может использоваться для замораживания лейкоцитов при температуре —20°С.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), на заседании Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова — (Киров, 2004), на научной сессии Кировского филиала Российской Академии Естествознания (Киров, 2004), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт- Петербург, 2004), заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в центральной печати; имеется 1 патент.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Деветьярова, Ольга Нурзадиновна

выводы

1. Оптимальным криозащитным раствором, сохраняющим жизнеспособность, морфологический состав и фагоцитарную активность нейтрофилов, введенных в состояние криоанабиоза (-20°С) по экспоненциальной программе и хранившихся в течение 1 и 21 суток, признан раствор №2, содержащий криопротектор ГМБТОЭМ (14% в конечной концентрации) и мембраностабилизирующее, антиоксидантное и антигипоксантное вещество ОМЭПС (0,075%). В его присутствии сохраняется в течение 1 суток 95,25% лейкоцитов, жизнеспособными из которых являются 84,00%, а фагоцитарной активностью обладают 82,33% нейтрофилов. Способность проявлять криозащитные свойства у данного раствора сохраняется в течение 45 суток (при~+60°С), что эквивалентно й годам хранения при +4°С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Деветьярова, Ольга Нурзадиновна, Киров

1. Абезгауз Н.Н., Леонтович В. А. Замораживание белых клеток периферической крови для длительного хранения при ультранизких температурах // Пробл. гематологии и переливания крови. 1966. - № 9 - С. 24-30.

2. Аграненко В.А., Тибилова Н.Н. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов // Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга. Справочник.- М.: Медицина, 1997.- С. 120-161.

3. Актуальные проблемы криобиологии / Под ред. Пушкаря Н. С. Киев: Наукова Думка, 1981. - 605 с.

4. Алексеев Н.А. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. СПб.: Фолиант, 2002. - 416-с;

5. Алмазов В.А. Физиология лейкоцитов человека.- Л.: Наука, 1973.-232 с.

6. Антимикробная активность миелопероксидазы пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, Р.А. Муравьев, В.А. Фомина и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2002. - № 3. - С.266-270.

7. Атлас клеток крови и костного мозга / Под ред. профессора Г. И. Козинца. -М.: Триада-X, 1998.- 160 с.

8. Балашов Д.Н. Лечебные трансфузии гранулоцитов для лечения тяжелых инфекционных осложнений у пациентов с нейтропенией. Автореф. .канд.мед. наук (НИИДГ), М., 2001. 24 с.

9. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи современной биологии. 1991.-Т. 111.- Вып. 6. - С. 21-28.

10. Белова Л.А. Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов// Биохимия. 1997.-Т.62, №6. - с. 659-668.

11. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция.-М.: Высшая школа,1987. 80 с.

12. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова Думка, 1994.-430 с.

13. Биологические свойства криоконсервированных лейкоцитов и их клиническое применение / В.А. Аграненко, Ф.Э. Файнштейн, С.В. Ермолович и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1982. - № 4. - С.6-10.

14. Биохимия/ Под ред. Е.С. Северина. М. ГЭОТАР-МЕД.- 2003. - С. 36296

15. Биохимия человека/ Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1993. - Т.1. - 384 с.

16. Бурлакова Е. Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксидатны // Успехи химии. 1985. Т. LIV. Вып. 9. С. 15401558.

17. Быков B.J1. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека).~СПб;гСОТИС, 1999. 520 с. ~

18. Виксман М.Е., Маянский А.Н. Применение реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека // Казан. Мед. журн. 1997. - Т. 55, №5. - С.99-100.

19. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

20. Влияние мексидола и его структурных компонентов на содержание углеводов и перекисное окисление липидов при остром стрессе/ Т.А. Девяткина, Р.В. Луценко, Е.М. Важничая, Л.Д. Смирнов// Вопросы медицинской химии.- 1999.-Т.45, вып. 3. С. 246-249.

21. Влияние низкотемпературной консервации на поверхностные свойства лимфоцитов крови / Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова, Г.М. Щербак, Э.П. Обозный // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974.- С. 67-69.

22. Вода и водные растворы при температурах ниже 0°С / Пер. с англ.; Под ред. Ф. Франкса. Киев: Наукова Думка, 1985. - 387 с.

23. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре. -М., 1979.- 7 с.

24. Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода // Цитология. 2001. - Т. 43, №5. - С. 432-436.

25. Герасимов И.Г., Калуцкая О.А. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология. 2000. -Т. 42, №2.-С. 160-165.

26. Герман А.С. Пиридин. Большая медицинская энциклопедия. М.; 1981. -T.17.-c. 1054-1055.

27. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. —459 с.

28. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск: Изд-во Томского гос. ун-та, 1992. — 264 с.

29. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1994. - 144 с.

30. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа, лекарственное растительное сырье / 11-е изд. — М.: Медицина, 1990. С. 182185

31. Гусейнов И.С., Федорова Л.И. Выделение лейкоцитов из крови доноров для экспериментальных и клинических целей // Пробл. гематологии и переливания крови. 1963. - №4. - С. 52-55.

32. Демин С.Ю. Основные типы и жизненные формы периферических и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека, выявляемые in vitro // Цитология. 2003. - Т. 45, №6. - С.535-547.

33. Ермолович С.В. Криоконсервирование лейкоцитов и их клиническое применение // Воен.-мед. журн. 1981. - №12. — С. 38-41.

34. Ермолович С.В. Современные подходы к использованию лейкоцитарной массы в гематологической клинике // Медицинский реферативный журнал. 1981. - №5. - С. 22-28.

35. Жибурт Е.Б. Трансфузиология. СПб.: Питер, 2002. -736 с.

36. Замораживание: факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологический суспензий / Ю.А. Иткин, B.JI. Бронштейн, Е.А. Гордиенко,

37. B.Ф. Марценюк // Консервирование клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1983.-С. 26-34.

38. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса / С.Г. Потапова, B.C. Хрустиков, Н.В. Демидова, Г.И. Козинец // Пробл. гематологии и переливания крови. -1977. №9. - С.58-59.

39. Инструкция по применению полимерных контейнеров «Гемакон» и «Компопласт» / В.П. Кошивая, Е.М. Макарова, Н.М. Шишов и др. М.,1983. -13 с.--- Истаманова—Т.С., Алмазов "В.А.7" Канаев С.В. Фунщйональнаягематология. Л.: Медицина, 1973.-310с.

40. Калинин И.Н. Получение и применение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов // Пробл. гематологии и переливания крови. 1980. - №10. - С. 50-56.

41. Калинин И.Н. Получение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов с помощью сепаратора клеток крови и их применение при миелодепрессии // Автореф. канд. дисс., 1978. -20 с.

42. Консервирование гранулоцитов с раствором «Лейкокриодмац» / В.А. Аграненко, Н.Н. Абезгауз, В.М. Трошина и др. // Гематология и трансфузиология. 1986. - № 12. - С.26-29.

43. Консервирование лейкоцитов замораживанием при низких температурах (-60-f-80°C) / Е.П. Сведенцов, С.В. Утемов, А.А. Костяев идр. //

44. Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Мат-лы науч.-практ. конф. (С.-Петербург, 6-8 июня, 2000 г.). СПб, 2000. - С. 261-262.

45. Корреляция скоростей охлаждения с ограждающей средой в поиске оптимальных режимов замораживания гранулоцитов / И.К. Махатадзе, JI.X. Каличава, Н.Н. Мгебришвили и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1975. - №9. - С. 25-27.

46. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. А.А. Цуцаевой — Киев: Наукова Думка, 1983. 240 с.

47. Криоконсервирование лейкоцитов с новым ограждающим раствором / С.В. Утемов, Е.П. Сведенцов, А.А. Костяев и др. // Вопросы трансфузионной и клинической медицины: Мат-лы 6-й науч. конф. молодых ученых (29-30 марта 1999 г.). Киров, 1999. - С.28.

48. Криопротекторы / Н.С. Пушкарь, М.Н. Шраго, A.M. Белоус, Ю.В. Калугин. Киев: Наукова Думка, 1978. - 204 с.

49. Криоустойчивость лимфоцитов крови и лимфоидных тканей / А.А. Цуцаева, А.Н. Попов, Т.Н. Воскобойникова и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюзн. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1981 г.). -М.,1981. С.75-77.

50. Лаврик С.С., Зверкова А.С., Афанасьева Е.Ю. Консервирование клеток селезенки поливинилпирролидоном методом глубокого замораживания // Врачеб. дело. 1971. - №2. - С. 9-12.

51. Лаврик С.С., Когут Г.И., Афанасьева Е.Ю. Применение низкомолекулярного ПВП в качестве защитной среды для консервирования и длительного хранения лейкоцитов методом глубокого замораживания // Врачеб. дело. 1971. - №12. - С. 80-83.

52. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М.: Наука, 1990.-224 с.

53. Леонтович В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. Метод замораживания гранулоцитов с диметилацетамидом // Современные проблемы криобиологии и криомедицины. М., 1975. - С.75-84.

54. Леонтович В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. Получение лейкоцитной массы из периферической крови человека и ее фракционирование на гранулоциты и лимфоциты //'Пробл. гематологии и переливания крови. -1971. №1. - С.51-57.

55. Лобынцева Г.С., Тимошенко Ю.П. Влияние скорости отогрева на выживаемость клеток крови // Криобиология и криомедицина. 1981. - №8. -С. 15-18.

56. Лобынцева Г.С., Щербак Г.М., Полякова А.И. Низкотемпературное консервирование ядросодержащих клеток крови под защитой полиэтиленоксида различного молекулярного веса // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974.- С. 69-70.

57. Максимов Н.А. О замерзании и холодостойкости растений. СПб.: Изд. Лесн. института, 1913. - 136 с.

58. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. Т.2./ Изд. 14-е, перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна. 2002.- 608 с.

59. Маянский А.Н., Маянский ДН. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. 2 изд., перераб. И доп. - Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1989. - 344 с.

60. Мельникова В.Н. Получение и клиническое применение при гнойно-септических заболеваниях лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров // Трансфузионная медицина. 1995. - №5. - С.32-36.

61. Механизм бактерицидной активности в фагосомах нейтрофилов / Р.А. Муравьев, П.Г. Бут, В.А. Фомина и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. -2002. -№4.-С. 437-441.

62. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений / А.А. Цуцаева, А.О. Котляров, О.В. Кудокоцева и др. // Цитология. 2004. -Т. 46, №9. - С. 879.

63. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. М.: Мир, 1980. -Т.2. - с. 317-319, с. 321-322.

64. Мечников И.И. Учение о фагоцитозе и его экспериментальные основы // Вопросы иммунитета / И.И. Мечников. М.: Изд-во АН СССР, 1951. - С. 520-646.

65. Миелопероксидаза пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, В.А7 Фомина, Р.А. Муравьев и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2003. - № 3. -С.261-265.

66. Муравьев Р.А., Роговин В.В. Химические основы неспецифического иммунитета // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2001. - №3. - С.284-292.

67. Муравьев Р.А., Фомина В.А., Роговин В.В. Желатиназные гранулы нейтрофильных гранулоцитов // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. —2003. №4. - С.389-394.

68. Набокина С.М. Внутриклеточная локализация белка LAMP 1 в нейтрофилах человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. — Т. 131, №2. - С.160-161.

69. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков / Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 7. - С. 10-18.

70. Низкотемпературная консервация лимфоцитов / Н.С. Пушкарь, А.И. Полякова, А.А. Цуцаева и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. -1974. №7. - С.23-26.

71. Низкотемпературная консервация ядерных клеток крови / А.И. Полякова, Ю.А. Иткин, А.А. Цуцаева, О.А. Дроздова // Новая медицинскаятехника, медицинские изделия и их испытания. Сб. трудов. М, 1976. - с. 151-157

72. О возможных факторах повреждения биологических объектов и их ДНК при криоконсервации/А.В. Зинченко, В.Д. Зинченко, Е.Ф. Копейка, Е.В. Онищенко// Цитология. 2004. - Т. 46, №9. - С. 796.

73. Основы трансфузиологии / Под ред. М.Ф. Заривчацкого. Пермь: Изд-во Пермского ун-та, 1995. - С. 74-75.

74. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен / Л.Д. Лукьянова, В.Е. Романова и др. //Хим. фарм. журн. - 1990. - №8. - С.9-11

75. Осташко В.Ф., Осташко Ф.И. Температурный шок клеток как гидравлический удар в резонансной системе // Цитология. — 2004. Т. 46, №9.-С. 831-832.

76. Павленко Р.А., Зельманович Б.М., Куденко Ю.А. Изучение фагоцитарной способности лейкоконцентрата донорской крови, хранившегося в условиях высокого давления и температуры ниже 0°С//Гематология и трансфузиология, №7, 1988.-С. 16-18.

77. Патент на изобретение №2184449. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, А.Н. Семенов, С.А. Хомякова, А.А. Костяев, С.В. Утемов. Приоритет 18.04.2001. Опубл. 10.07.2002.

78. Перекисное окисление и стресс/ В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голотин Ю.Б. Кудряшов СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

79. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. — М.: Медицина, 1978. С.104-108.

80. Пичугин Ю.И. Итоги и перспективы поиска новых эндоцеллюлярных криопротекторов// Проблемы криобиологии.- 1993.-№2.- С.3-10.

81. Полякова А.И. Влияние низкотемпературной консервации на клеточный состав лейкоконцентрата донорской крови // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974. - С. 124-126.

82. Полякова А.И. Изучение влияния низких температур икриопротектора (ПЭО-400) на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Харьков, 1975.- 14 с.

83. Попов С.В. Взаимодействие фагоцитов млекопитающих с полисахаридами растений. Сыктывкар, 2002. - 100 с.

84. Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 1999.-19 с.

85. Практическая трансфузиология / Г.И. Козинец, JI.C. Бирюкова, Н.А. Горбунова и др. -М., 1997.-435 с.

86. Применение лейкоконцентрата при гнойно-септических состояниях / С.В. Рыжков, А.Н. Плоцкий, С.Ф. Малахов и др. // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии (Тез. докл. Рос. конф., 1995, С. Петербург) -СПб, 1995.-С.343-344.

87. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. Киев: Наукова Думка, 1975.-342 с.

88. Разработка оптимальных программ охлаждения для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека / В.А. Леонтович, Н.Н. Абезгауз, В.Я. Перфильев и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1973. - №9. -С. 44-47.

89. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов / Н.С. Пушкарь, Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова и др. // Проблемы гематологии и переливания крови. 1966. - №1. -С.28-34.

90. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов / Н.С. Пушкарь, Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1978. - №8. - С.8-13.

91. Резник С.Е. Мечников. — М.: Молодая гвардия, 1973. 365 с.

92. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Муштакова В.М. Состав пероксидазосом нейтрофилов // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2001. - №4. - С.396-401.

93. Руководство по общей и клинической трансфузиологии / Ю.Л. Шевченко, В.Н. Шабалин, М.Ф. Заривчацкий, Е.А. Селиванов. СПб.: Фолиант, 2003.-608 с.

94. Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е.П. Сведенцова. -Киров, 1999.-715 с.

95. Рыжков С.В., Калеко С.П., Плоцкйй А.Н. Клиническое применение лейкоконцентрата // Вест, хирургии. 1992. - №1-3. — С.78-82.

96. Сведенцов Е.П. К классификации разных уровней отрицательных температур, используемых для консервирования биообъектов // Материалы научной сессии (30-31 марта 2004 г.). Киров, 2004. - С.117-120.

97. Сведенцов Е.П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Л., 1987. - 45 с.

98. Сведенцов Е.П., Архиереев В.П., Симкин Д.С., Кузнецов Е.В. Средство для криоконсервирования костного мозга. Патент №2049391 (РФ) от 10.12.1995.

99. Сведенцов Е.П., Костяев А.А. Отечественные криоконсерванты для костного мозга // Вестник службы крови России.- 1997. -№1. С. 26-28.

100. Сезонные колебания неспецифической активности и сопротивляемости осмотическим и механическим воздействиям лейкоцитов периферической крови / М.З.Федорова, В.Н.Левин, В.Д. Горичева, О.Н.Семенова // Педагогический вестник, 2003. -№11.- с.421

101. Скулачев В.П. В своем межмембранном пространстве митохондрия таит «белок самоубийства», который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз // Биохимия. 1996. - Т. 61. - С. 2060-2063.

102. Славянский А.А. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов // Клинич. лаб. диагностика. 2002. - №3. - С.39-42.

103. Смольянинова Е.И., Линник Т.П., Гордиенко О.И. Проницаемость мембран ооцитов мыши для криозащитных веществ ряда диолов и амидов// Цитология. 2004. - Т. 46, №9. - С. 855-857.

104. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -50°С / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, С.А. Якшина и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2003. - №11. - С.35-37.

105. Справочник ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России/ Изд. 7 перераб., испр. и доп. М.: Астра ФармСервис, 2001. - 1536 с.

106. Субмикроскопическая организация клеток крови, хранившихся в замороженном состоянии/ Э.И. Терентьева, В.А. Леонтович, Л.И. Федорова и др.//Р.Ж. ВИНИТИ 04.Ai Общие проблемы биологии. 1966. - №1. - С.154-168

107. Трошина В.М. Криоконсервирование гранулоцитов с диметилацетамидом: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1981. 14 с.

108. Трошина В.М., Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А. Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживании гранулоцитов // Пробл. гематологии и переливания крови. 1977. - №5. -С.50-53.

109. Туманов И.И. Физиологические основы зимостойкости культурных растений. М.-Л., 1970. 56 с.

110. Ульянкина Т.И. Зарождение иммунологии. М.: Наука, 1994.-133с.

111. Утемов С.В. Методы выделения лейкоцитов для клинических целей // Препараты крови и кровезаменители производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф. - Киров, 1995. - С.68.

112. Утемов С.В., Сведенцов Е.П., Костяев А.А. Современные методы низкотемпературного консервирования лейкоцитов // Препараты крови и кровезаменители производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф. - Киров, 1995. - С.69-70.

113. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-40°С) / Е.П. Сведенцов, О.О. Щеглова, Т.В. Туманова и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -2004. Том. 138. - С.400 - 402.

114. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний алкилзамещенными 3-окси-пиридинами / Л.Д. Смирнов, Т.А. Воронина и др. //Фармакологическая коррекция кислородзависимых патологических состояний. М., 1989 - С.87

115. Физико-химические механизмы криоповреждений биологических структур / Под ред. Н.С.Пушкаря. Итоги науки и техники, вып. Биофизика, Т.9-Москва, 1978.

116. Физиология человека: в 4-х томах / Под ред. Р. Шмидта и Г.Тевса.-М.: Мир, 1986.-Т.3.-288 с.

117. Фонталин Л.Н. Иммунологическая реактивность лимфоидных органов и клеток. Л.: Медицина, 1967. - 209 с.

118. Фролова О.Е. Морфофункциональная характеристика моноцитов. Значение исследования нуклеолярного аппарата (обзор литературы) // Клинич. лаб. диагностика. 1998. - №10. - С.3-8.

119. Ханевич М.Д., Маринин А.В. Использование лейкоцитарной массы при лечении тяжелых форм разлитого перитонита // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.). -СПб, 1995. С.344-345.

120. Цитохимия замороженной клетки / Э.И. Обозная, Н.С. Пушкарь, О.П. Маркова, Е.Я. Панков. Киев: Наукова Думка, 1981. - С.38-43.

121. Чередеев А.Н. Fc-рецепторы на фагоцитирующих клетках // Иммунология. 1995. - №3. - С. 21-25.

122. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. М. СПб.: БИНОМ -Невский диалект, 2000. - 448 с.

123. Энзиматическая диагностика криоповреждений клеток лейкоконцентрата / В.И. Луговой, А.Н. Дзюба, Л.П. Кравченко и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюз. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1978 г.). М., 1981. - С.64-65.

124. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 605 с.

125. Яровая Г.А. Биорегулирующие функции и патогенетическая роль протеолиза. III. Физиологическая роль и биохимические механизмы протеолитической деградации белков //Лабораторная медицина №6. 2003. -С. 259-265.

126. A co-stimulatory signsl through ICAM (З2 integrin-binding potentiates neutrophil phagocytosis / N. Schnitzeler, G. Haase, A. Podbielski et al. // Nature Medicine - 1999. - Vol. 5. - P. 231-235.

127. Abdel-Mageed A., Rosalio M.L.U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997.-Vol.90.-P. 321b (4194).

128. Asachina E. Cryobiology, Acad. Pres. N.Y. - London, 1966.- P.326-332.

129. Baggiolini M., Bretz U., Gusus B. Biochemical characterization of azurophil and specific granules from human and rabbit polymorphonuclear leukocytes. «Schweiz.med.Wschr.», 1974, Bd 104.S.129-132.

130. Babior B.M., Kipnes R.S., Curnutte J.T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // J. Clin. Invest. 1973. - Vol. 52. - P. 741-744.

131. Baggiolini M. Chekines and leukocyte traffic// Nature. 1998. - Vol.392. -P7565-568.-----------

132. Bainton D.F., Ulliot J.L., Farquhar M.G. The development of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow //J. Exp.Med. 1971- Vol. 134(4): P.907-934

133. Bainton D.F. Distinct granule populations in human neutrophils and lysosomal organelles identified by immuno-electron microscopy // J. Immunol. Methods. 1999. - Vol.232. - P. 153-168.

134. Bainton D.F. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - Vol.336. - P. 17-33.

135. Barnes D.W., Loutit J.F. The radiation recovery factor: preservation by the Polge-Smith-Parkes technique// J. Nat. Cancer Inst. 1955.- Feb; 15(4):901-5.

136. Bjerrum O.W., Borregaard N. Mixed enzyme-linked immunosorbent assay (MELISA) for HLA class I antigen: a plasma membrane marker // Scand. J. Immunol. 1990.- Vol.31, №3.- P. 305-313.

137. Borregaard N., Cowland J.B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte// Blood. 1997. - V.89. №10.- P.3503-3521

138. Borregaard N. Development of neutrophil granule diversity //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1997. Vol. 15.№832. - P. 62-68

139. Carroll M.C. The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity // Annu. Rev. Immunol. 1998. Vol. 16. - P. 545-568.

140. Cham B.P., Gerrard J.M., Bainton D.F. Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation // Am. J. Pathol. — 1994. Vol.144. -P.1369-1380.

141. Clark R.A. The human neutrophil respiratory burst oxides // J. Infect. Dis. -1990.-Vol.161.-P.l 140-1147.

142. Cowland J.B., Borregaard N. Molecular characterization and pattern of tissue expression of the gene for neutrophil gelatinase-associated lipocalin from humans //Genomics. 1997. - Vol. 45,№1. - P. 17-23

143. Cryomicroscopic determination of the membrane osmotic properties of human monocytes at subfreezing temperatures/ C. McCaa, K.R. Diller, S.J. Aggarwal, T. Takahashi //Cryobiology. 1991.- 28(4).- P.391-9.

144. Cryopreservation of hematopoetic progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide at -80°C without ratecontrolled freezing / A. Galmes, I. Besalduch, I. Barday et al. // Transfusion. 1996. - Vol.36. - P.794-797.

145. Daeron M. Fc receptor biology // Annu. Rev. Immunol. 1997. - Vol. 15. -P. 203-234.

146. Daniels R.H., Bokoch G.M. P- 21 activated protein kinase: a crucial component of morphological signaling // Trend Biochem. Sci. 1999. Vol. 24. №9. -P. 350-354.

147. Effect of dimethylsulphoxide on lipoproteins stored at low temperatures / Klein E., Luman R.B., Peterson L. et al. // Cryobiology.- 1967. 4, №3, p. 328334.

148. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood / W. Hubl, J. Iturraspe, C.E. Hutcheson et al. //Blood. 1997.- Vol.90. - P.4217.

149. Evidence for retrograde traffic between terminal lysosomes and the prelysosomal/late endosomal compartment / A. Jahraus, B. Storrie, Griffiths, M. Dejardins//J. Cell Sci.- 1994. Vol. 107.№1. - P.145-157.

150. Expression of the protein kinase Csubstrate pleckstrin in macrophagesT association with phagosome membranes / J. H. Brummell, J.C. Howard, K. Craig, S. Grinstein, A.D.Schreiber, M. Tyers // J. Jmmunol. 1999. - V. 163. - №6. P. 3388-3395.

151. Flower D.R. The lipocalin protein family: structure and function// Biochem. J.- 1996. Vol.318. -№1. P. 1-14.

152. Functional activity of blood polymorphonuclear leukocytes as an oxidative stress biomarker in human subjects / S.S. Chan, H.P. Monteiro, G.P. Deucher et al. // Free Radical Biology and Medicine. 1998. - Vol.24. - P. 1411-1418.

153. Granulocyte Transfusions: eficacy in treating fungal infections in neutropenic patients following bone marrow transplantation / S. Bhatia, J. McCullough, E.H. Perry et. al. // Transfusion. 1994. - Vol.134. - P. 226-232.

154. Griffiths M.T., Halestrap A.P. Mitochondrial non-specific Pores Remain Closed During Cardiac Isquemia, but Open upon Reperfusion // Biochem. J. -1995.-V. 307. -P. 93-98.

155. Herzog R. Kalteanwendung in der Medizin. Kryochirurgie // Ki Luft und Kaltetechn. - 1999. - Vol.35. - P.l 17-124.

156. Makino M., Baba M. A cryopreservation method of human peripheral blood mononuclear cells for efficient production of dendritic cells // Scand. J. Immunol. — 1997.-Vol.45.-P.618-622.

157. Mazur P. Cryobiology. The freezing of biological system // Science. 1970. -Vol.169.-P.939-949.

158. Meryman H.T. Crioprotective agents // Criobiology. 1971. - 3, № 2. - P. 173-183.

159. Mitochondrial Implication in Accidental and Programmed Cell Death: Apoptosis and Necrosis/ N. Zamzami, T. Hirsch, B. Dallaporta, P.X. Petit, G. Kroemer // J. Bioenerg. Biomembr. 1997. - V. 29. - P. 185-193.

160. Model for p-53-induced Apoptosis/ K. Polyak, Y. Xia, J.L. Zweier, K.W. Kinzler, B. A. Vogelstein //Nature. 1997. - V. 389. - P. 300-305.

161. Myeloperoxidase: active site strukture and catalyticmehanisms / J.K. Hurst, J. Everse, K.E. Everse, M.P. Grisham // Peroxidase in Chemistry and Biology. -Boston: CRC Press.- 1991. P. 37-62.

162. Nei T. Electron microscopic study of microorganisms subjected to freezing and drying: cinematographic observations of yeast and coli cells //Exp. Cell7Res7 1962.-№28. P. 560-75

163. Neppert J. Therapie mit Granulozyten// Transfusions medizin, Berlin: Verlog - Springer. - 1996. - S. 339-344.

164. Nishimura M., Mitsunaga S., Juji T. Frozen-stored granulocytes can be used for an immunofluorescence test to detect granulocyte antibodies // Transfusion. — 2001. Vol.41, №10. - P.1268-1272.

165. Osmotic stress and the freeze-thaw cycle cause shedding of Fc and C3b receptors by human polymorphonuclear leukocytes/ T.Takahashi, S. Inada, C.G. Pommier, J.J. O'Shea, E.J. Brown // J Immunol. 1985. - 134(6). - P. 4062-8.

166. Oxidants in Mitochondria: from Physiology to Diseases/ Ch. Richter, V. Gogvadze, R. Laffranchi, R. Schlapbach // Biochem. Biophys. Acta. 1995. - V. 1271. - P. 67-74.

167. Peroxynitrite formation from activated human leukocytes / N. Fukuyama, K. Ichimori, Z. Su, H. Ishida, H. Nakazawa //Biochem. Biophys. Res.Commun. -1996. Vol. 224, №2.- P. 414-419.

168. Pennell C.A. Heat shock proteins in immune response in the Fall of 2004 // Immunology. 2005. - Vol. 114, №3. - P. 297-300.

169. Pettit E.J., Fay F.S. Cytosolic Free Calcium and the Cytoskeleton in the Control of Leukocyte Chemotaxis // Physiological Reviews. 1998. - Vol.78. -P.949-967.

170. Purvis A.C., Shewfelt R.L., Georgenie J.W. Superoxide Production by Mitochondria Isolated from Green Bell Pepper Fruit // Physiol. Plant. 1995. - V. 94. - P. 743-749.

171. Randomized trial of granulocyte transfusions versus intravenous immuneglobulin therapy for neonatal neutropenia and sepsis / M.S. Cairo, C.C. Worchester, R.W. Rset et. al. // J.Pediatr. 1992. - Vol.120. - P.281-285.

172. Scheck R. A method for counting the viable cells in normal and malignant cell suspension//Ann. J. Cancer 1936. - Vol.28 - P.389-391.

173. Scheiwe M.W., Korber C. Quantitative cryomicroscopic analysis of intracellular freezing of granulocytes without cryoadditive // Cryobiology. 1987. -Vol.24.-P.473-483.

174. Segal A.W., Shatwell K.P., The NADPH oxidase of phagocytic leukocytes //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1997. -Vol. 832. -P.215-222.

175. Srivastava P.K. Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-Peptide complexes // Curr. Oncol. Rep. 2005. - Vol. 7, №2. - P. 104-108.

176. Takahashi T, Hirsh A. Calorimetric studies of the state of water in deeply frozen human monocytes / Biophys J. 1985. - 47(3) - P. 373-80.

177. The sre-family protein tyrosine kinase p59hck is located on the secretory granules towards the phagosome during cell activation / H. Mohn, V. LeCabec, S. Fisher, J. Mordonnean Parini // Biochem. J. - 1995. - V. 309.№2. P.657-668.

178. Thioredoxin Peroxidase is a Novel Inhibitor of Apoptosis with a Mechanism Distinct from that of Bcl-2 / P. Zhang, B. Lui, S.W. Kang, M.S. Seo, G. Rhees, L.M. Obeid //J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 30615-30618.

179. Weiner R.S., Normann S.J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes / J Natl Cancer Inst. 1981. - 66(2). P.255-60.

180. Weis W.I., Taylor M.E., Drrickamer K. The C-type lectin superfamily in the immune system // Immunological Rev. 1998. - Vol. 163. - 19-34.

181. Zhang Q., Tiersch T. R. Cryopreservation of leucocytes of channel catfish gor subsequent cytogenetic analysis // J. Fish. Biol. 1995. - P. 1016-1025.

182. Список работ, опубликованных по теме диссертации

Информация о работе

Деветьярова, Ольга Нурзадиновна
кандидата биологических наук
Киров, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы