Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов

Степанова, Евгения Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов"

На правах рукописи Степанова Евгения Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

1 о МАР 2011

4840240

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Сведенцов Евгений Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Василевская Людмила Сергеевна

доктор биологических наук, доцент Сизова Елена Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная

медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится 21 марта 20 Н г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129164 Москва, ул. Кибальчича, д.6, корп. 4, ауд. 205

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119991 Москва, ул. Малая Пироговская, д.1

Автореферат разослан « 1( » ббизЬАиЛ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Холмогорова Н. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из наиболее чувствительных популяций лейкоцитов к воздействиям различных стресс-факторов являются гранулоциты, что связано с их более сложной структурной организацией (Гребенюк А.Н. с соавт., 1998; Давтян Т.К., Аванесян JI.A., 2001). Благодаря своему уникальному положению в системе неспецифической резистентности и иммунитета, а также наличию рецепторов к огромному числу биологически активных веществ, они быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов C.B., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001).

Данный компонент крови является крайне необходимым для клинических целей при лейкопении, угнетении функциональной активности фагоцитов, признаках вторичного иммунодефицита в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, заболеваниях инфекционного характера: менингите, перитоните, сепсисе и других (Шалаев С.А. и соавт., 1990; Рыжков C.B. и соавт., 1992, 1995; Cairo M.S. et. al., 1992; Абдулкадыров K.M., 1994; Мельникова B.H. и соавт., 1995; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Neppert J., 1996; Vamvakas E.C. et al, 1996; Herzog R., 1999; Muncunill J., 1999; Schiffer C., 1999; Балашов Д.Н., 2001; Гордеев В.И., 2003; Sputtek A., 2004). Широкому распространению использования гранулоцитов мешает ряд нерешенных проблем, в том числе связанных с их низкой устойчивостью, необходимостью наличия больших доз для получения терапевтического эффекта.

Ранее лейкоцитный концентрат (Ж) сохраняли только криоконсервацией, то есть замораживанием биообъекта (-20°С^—196°С), при этом лейкоциты находились в состоянии анабиоза (Абезгауз H.H., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович C.B., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000,2004; Деветьярова О.Н., 2005; Утемов C.B. и соавт., 2005; Щеглова О.О., 2005). Однако после размораживания ЛК функциональная активность гранулоцитов часто оказывалась на низком уровне, что негативно сказывалось на качестве Ж и его терапевтическом эффекте. Поэтому проблема оптимизации условий сохранения функций гранулоцитов крови человека вне организма является весьма актуальной на сегодняшний день. По существующей классификации отрицательных температур (Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., 2007) температура -10°С относится к температурам переохлаждения, при которой не замерзают все виды внутриклеточной и внеклеточной воды. Биообъект, охлажденный до данной температуры, не замерзает, а входит в состояние гипобиоза, характеризующееся незначительным замедлением метаболизма в клетке. В отечественной и зарубежной литературе нами не было обнаружено метода сохранения функций гранулоцитов в данном состоянии. Использование температуры переохлаждения позволит избежать последствий холодового стресса, в частности разрушения мембран кристаллами льда, вымораживания воды, гиперконцентрации солей, и применять ЛК в

физиологически полноценном состоянии для клинических целей.

Цель исследования - изучить функциональную активность лейкоцитов крови человека при использовании переохлаждения (-10°С) под защитой специально созданных хладоограждающих растворов.

Задачи исследования:

1. Разработать способ введения лейкоцитов без потери их функциональной активности в холодовой гипобиоз путем нелинейного охлаждения до -10°С.

2. Создать незамерзающие при температуре переохлаждения и не требующие отмывания от биообъекта хладоограждающие растворы, позволяющие сохранять функциональную полноценность лейкоцитов человека при их переохлаждении до -10°С.

3. Изучить физиологическое состояние гранулоцитов, подвергнутых холодовому стресс-воздействию под защитой созданных хладоограждающих растворов.

4. Определить токсичность, апирогенность предложенных хладоограждающих растворов и переносимость трансфузий ЛК, подвергнутого переохлаждению.

Научная новизна. Впервые сохранена физиологическая активность лейкоцитов крови человека в течение 12 суток путем их переохлаждения до -10°С.

Впервые показано, что влияние холодового стресс-фактора температуры переохлаждения устраняется при помощи созданного метода введения клеток в гипобиоз, включающего нелинейную Программу охлаждения и оригинальные незамерзающие при -10°С хладоограждающие растворы.

На основании исследования функциональной активности гранулоцитов крови человека, перенесших холодовое стресс-воздействие, выявлен оптимальный состав и дано научное обоснование криозащитных свойств предложенных хладоограждающих растворов (получен патент РФ № 2261 595 от 10.10.2005).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили создать метод сохранения лейкоцитов периферической крови в функционально активном состоянии, что создало основу для разработки надежных и безопасных методов хранения высокоспециализированных клеток. Работа развивает представления о механизмах холодового повреждения и защиты ядерных клеток крови человека в условиях температуры переохлаждения.

Предложенный эффективный и доступный метод отличается простотой в техническом исполнении и требует применения только электрического холодильника с морозильной камерой на -10°С и разработанных хладоограждающих растворов.

Установлено, что разработанный способ сохранения лейкоцитов и их

функциональной активности в течение 12 суток путем введения в холодовой гипобиоз (-10°С) под защитой созданных хладоограждающих растворов может быть рекомендован для внедрения в практику научных биологических и медицинских учреждений.

Положения, выносимые на защиту:

1. При использовании температуры переохлаждения (-10°С) гранулоциты под защитой растворов, содержащих желатиноль или модежель, сохраняют функциональную активность после холодового воздействия в течение 12 суток (максимальный срок хранения).

2. Для введения в состояние холодового гипобиоза (-10°С) лейкоцитов крови человека предлагается применять разработанные хладоограждающие растворы, включающие глицерин, сукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина (ОМЭПС) и препараты желатина (модежель или желатиноль) с использованием нелинейной трехэтапной программы охлаждения клеток.

3. Разработанный хладоограждающий раствор, содержащий желатиноль, является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносится экспериментальными животными и не требует отмывания от биообъекта после его отогрева.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003); на XV Коми Республиканской молодежной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004); на XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004), на объединенном заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов и Кировского отделения общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2008), на Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар, 2008).

Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал участие в создании метода введения лейкоцитов в гипобиоз при -10°С, в определении оптимального состава незамерзающих хладоограждающих растворов, проводил все экспериментальные работы по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и вышедших из холодового гипобиоза гранулоцитов, статистическую обработку полученных результатов, участвовал в написании статей и докладов по теме диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, одна в республиканском журнале и одна в международном. Получен патент на изобретение «Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10бС» № 2261595 от 10.10.2005.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение),

выводов, практических рекомендаций, списка литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 186 и 70 источников отечественных и зарубежных авторов соответственно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовали гранулоциты крови человека в составе ЛК - трансфузионной среды с содержанием лейкоцитов в 4-8 раз больше, чем в периферической крови, с примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы. В целом, проведено 136 экспериментов, более 2000 исследований по изучению холодового влияния на функциональные свойства гранулоцитов.

Ж получали с информированного согласия от 42 доноров-добровольцев в отделении гравитационной хирургии крови клиники Федерального государственного учреждения Кировского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства Минздравсоцразвития (ФГУ КНИИГиПК ФМБА) методом цитафереза периферической крови. Использовали центрифугу фирмы «Sorvell» (США) при ускорении 1170*g (2500 об/мин, охлаждение 5 мин) и консервант цитратфосфатдекстрозу (CDF). Полученное количество Ж в среднем составляло 27,2±12,2 мл. Все доноры были от 25 до 44 лет, в среднем 35,6+4,9.

Перед охлаждением Ж смешивали в соотношении 1:1 с хладоограждающим раствором в пластикатном контейнере "Компопласт 300". Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого контейнер с биоматериалом погружали в заполненную хладоносителем (96%-ный этиловый спирт) и охлажденную до -10°С 4-х-литровую ванну камеры электрического морозильника «Криостат». Регистрацию температуры осуществляли с помощью прибора ГСП-04 в составе программного замораживателя УОП 700.00.00 (Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины). Его датчик ТСМ-3-02 был установлен в одном из контейнеров с имитатором (хладоограждающим раствором с конечной концентрацией его ингредиентов). Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч. Далее биообъект переносили для хранения в герметично закрытую емкость, заполненную 45%-ым этиловым спиртом, охлажденным до -10°С, и помещали в морозильную камеру (-10°С) электрического холодильника. Отогрев проводили через: 1, 5, 7, 9, 11, 12 и 14 суток в 10-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 2-4 сек при интенсивном покачивании контейнера.

Измерение рН Ж проводили на ионометре Эксперт-001 фирмы «Эконикс-эксперт» (Россия) стеклянными электродами при комнатной температуре после смешивания клеток с хладоограждающим раствором до охлаждения и после их отогрева.

Изучение функциональных свойств гранулоцитов осуществляли по указанным далее методикам до введения их в холодовой гипобиоз и после выхода из него.

Количество гранулоцитов определяли по формуле: КГ = KJI «доля Г, где КГ - общее количество гранулоцитов в мкл, KJI - общее количество лейкоцитов в мкл, доля Г - доля гранулоцитов (по данным лейкоформулы). Подсчет КЛ проводили в камере Горяева (286 проб) общепринятым методом (Никанкина Л.В. и соавт., 2001). Для разрушения эритроцитов использовали 0,4 мл 3-5 % уксусной кислоты, которую смешивали с 0,02 мл ЛК и оставляли на 10 мин. Определение лейкоформулы осуществляли путем подсчета процента различных видов лейкоцитов в составе Ж (в 286 пробах) по методу Г.И. Козинца (1998).

Жизнеспособность ядерных клеток крови (286 проб) определяли в пробах исключения эозина по методу Шрека (Shreck R., 1936). При нарушении целостности мембраны клетки диффузно окрашивались в розовый цвет.

Фагоцитарную активность нейтрофилов (286 проб) оценивали по методу С.Г. Потаповой и соавторов (1977), где в качестве объекта фагоцитоза применяли взвесь частиц инертного полистирольного латекса (Sigma, США; диаметр частиц 1,03 микрона), разведенного 1:200 в среде Хенкса, который в количестве 0,05 мл смешивали с 0,1 мл ЛК. Вычисляли фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) - процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарный индекс (ФИ) - количество захваченных частиц латекса клеткой. Кроме того, вычисляли абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов (абс.ФАН) и абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) - суммарный показатель активности нейтрофилов (СП 3.3.2.561-96), которые рассчитывали по формулам:

Абс.ФАН = ФАН • абсолютное количество нейтрофилов

АФП = абс.ФАН «ФИ

Активность азурофильных и специфических гранул нейтрофилов (130 проб) определяли по методу A.A. Славинского и соавт. (1999) в ЖБ - тесте.

Оценку окислительно-восстановительного метаболизма в нейтрофилах (286 проб) осуществляли визуально-цитохимически с помощью НСТ-теста по методу Парка (Park В., 1969). Подсчет производили на 100 нейтрофилов путем определения процента клеток с диформазаном (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992).

Изучение «острой», «хронической» токсичности и пирогенности разработанных равноценных хладоограждающих растворов проводили на растворе, содержащем желатиноль, на белых мышах (п=30) и кроликах неальбиносах (п=13) [согласно методикам XI-ой Государственной Фармакопеи (ГФ, 1990)]. Также изучали переносимость трансфузий аутологичных Ж, подвергавшихся холодовому гипобиозу с исследуемым хладоограждающим раствором на экспериментальных животных (собаках, п=3). Исследовательскую работу проводили в экспериментально-биологической клинике ФГУ КНИИГиПК ФМБА, а также в виварии ГОУ ВПО Вятской государственной

сельскохозяйственной академии.

Изучение стабильности применяемого хладоограждающего раствора для лейкоцитов проводили на трех его сериях методом ускоренного старения (Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "Ускоренного старения" при повышенной температуре, 1983), при котором образцы выдерживали в течение 45 суток при +60 С, что соответствовало двум годам хранения при +4°С. Изучили девять флаконов с исходным составом применяемого в опытах криозащитного раствора и такое же количество раствора без содержания желатиноля в эксперименте по введению гранулоцитов в холодовой гипобиоз.

Полученные данные были подвергнуты статистической обработке при помощи компьютерной программы для медико-биологической статистики BIOSTAT.EXE: вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение (М±у). Достоверность различия между показателями оценивали по критерию Уилкоксона (Гланц С., 1998). Результаты считали достоверными при р<0,05.

Фотосъемку биологического объекта проводили с помощью видеоокуляра USB марки DSM 130 и программного обеспечения ImageBase 1.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка метода сохранения лейкоцитов и их функциональной активности путем введения в холодовой гипобиоз при -10°С. Для сохранения гранулоцитов и их функциональной активности в течение определенного времени необходимо замедление метаболизма этих клеток. Для получения состояния замедленной жизнедеятельности (холодового гипобиоза) обязательным условием является сохранение в жидкой фазе как внеклеточной, так и внутриклеточной воды. При температуре переохлаждения -10°С с применением криопротекторов все фракции воды в клетке и вне ее не замерзают (Сведенцов Е.П., 2004; Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., 2007). По нашим данным, без криозащитного раствора в Ж, подвергнутом охлаждению до -10°С, наблюдаются кристаллообразование и гибель клеток. Уже через сутки в клетках происходят глубокие деструктивные изменения, и остаются неизмененными лишь 13,5 ± 4,7% гранулоцитов от их исходного числа. Чтобы стабилизировать и предотвратить спонтанную кристаллизацию воды, исследовали восемь хладоограждающих растворов (табл.1), не замерзающих при -10°С, а образующих гель. В растворы бьши включены следующие компоненты: глицерин (в нетоксичной конечной концентрации) и препараты желатина. Для реализации механизмов формирования функционирующих жидкостных локусов в мононасыщенных мембранах и антиокислительной защиты липидов (Тимофеев H.H., 1997, 2005) одним из основных компонентов хладоограждающего раствора был выбран ОМЭПС - стабилизатор мембран (Смирнов Л.Д., 2000, 2002) и антиоксидант (Дюмаев K.M. и соавт., 1995;

Воронина Т.А., 2001). Благодаря защитным свойствам данных компонентов и подобранным опытным путем их оптимальным концентрациям (табл.1) стало возможным сохранение функциональной активности гранулоцитов путем переохлаждения Ж до -10°С.

Таблица 1

Конечная концентрация ингредиентов различных хладоограждающих

растворов в смеси с Ж

№ хладо-ограждающего раствора Конечная концентрация ингредиентов хладоограждающего раствора после смешивания 1:1с лейкоцитным концентратом, в % ЛКв смеси

Глицерин омэпс Цитрат натрия Лимонная кислота Трилон Б Модежель Желатиноль

1 2,5 0,0375 0,7 - - 42,8 - 50

2 3,0 0,075 0,7 - - 42,8 - 50

3 3,5 0,150 0,7 - - 42,8 - 50

4 4,5 0,150 0,7 - - 42,8 - 50

5 3,5 0,150 0,7 - - 40 50

6 3,5 0,150 - 0,5 0,05 - 25 50

7 3,5 0,150 - 0,5 0,05 - 35 50

8 3,5 0,150 - 0,5 0,05 - 40 50

Для введения лейкоцитов в состояние холодового гипобиоза выбрали нелинейную трехэтапную программу охлаждения. Запись термограмм показала, что происходит охлаждение Ж в хладоограждающем растворе, содержащем модежель (рис.1.), на первом этапе 2 минуты до 0°С (средняя скорость 12 град/мин), затем 8 минут до -7°С (0,9 град/мин) и в последующие 35 минут до -10°С (0,3 град/мин).

время, мин

Рисунок 1 - Термограмма охлаждения лейкоцитов в составе Ж до - 10°С в хладоограждающем растворе №3, содержащем модежель

С раствором, содержащим желатиноль (рис. 2), охлаждение лейковзвеси проводится по аналогичной схеме: 1,5 минуты до 0°С (15 град/мин), затем 4,5 минуты до -6,2 С (1,4 град/мин) и в последующие 22 минуты до -10°С (0,3 град/мин).

время, мин

Рисунок 2 - Термограмма охлаждения лейкоцитов в составе ЛК до - 10°С в хладоограждающем растворе №7, содержащем желатиноль

Оценка физиологического состояния лейкоцитов после их суточного холодового гипобиоза (-10°С). С целью оценки криозшцитных свойств 4-х растворов, содержащих модежель, и 4-х, содержащих желатиноль, отличающихся процентным содержанием компонентов, проводили исследования физиологического состояния лейкоцитов после их суточного холодового гипобиоза (-10°С) в данных хладоограждающих растворах. В раствор №5, содержащий желатиноль, включили в качестве антикоагулянта цитрат натрия в той же концентрации, как и в растворы, содержащие модежель. Однако при его использовании наблюдали необратимую коагуляцию лейкоцитарных клеток, что делало невозможным дальнейшие исследования. Поэтому в другие растворы, содержащие желатиноль (№№ 6-8), были введены более сильные антикоагулянты в нетоксичных конечных концентрациях, в частности, лимонная кислота и трилон Б (табл.1).

В результате было найдено, что для сохранения функциональной активности лейкоцитов наилучшим криозащитным действием обладают растворы №3 и №7, содержащие модежель и желатиноль соответственно. Наиболее высокая сохранность (табл.2) после выхода Ж из гипобиоза отмечается для раствора №7, содержащего желатиноль, а именно 89,2±13,1%, что достоверно (р<0,05) выше, чем для растворов №2, №4 и №6. При этом с хладоограждающими растворами №3 и №7 не выявили достоверных (р<0,05) различий между данными до и после холодового гипобиоза.

Сохранению целостности мембраны (табл.2) также лучше способствует раствор №7 (97,2±3,2%), при этом достоверные (р<0,05) различия наблюдаются со всеми растворами, содержащими модежель. Показатель ФАН (табл.2) достоверно (р<0,05) выше после отогрева ЛК при использовании хладоограждающего раствора №3 (99,0±1,6%), хотя и с раствором №7 не выявлено достоверных (р<0,05) различий между данными до и после холодового гипобиоза в отличие от всех остальных предложенных растворов.

Таблица 2

Функциональные показатели (М±о) лейкоцитов крови человека, хранившихся в течение 1 суток при -10°С в предложенных хладоограждающих ____растворах___

Растворы, содержащие Номер раствора Число опытов Количество клеток Р Сохранность клеток после гипобиоза к исходному уровню

до гипобиоза после выхода из гипобиоза

Абсолютное количество гранулоцитов, в мкл

Модежель №1 7 2902 ±1616,0 2588 ± 1037,0 >0,05 73,2 ± 15,5

№2 5 2046 ± 579,1 1076 ± 454,3 >0,05 62,6 ± 18,9**

№3 7 5614 ± 611,5 4687 ± 505,1 >0,05 82,3 ± 7,6

№4 7 2156 ± 251,9 1534 ± 651,7 >0,05 39,0 ± 6,7**

Желатиноль №6 7 2118 ± 345,0 1496 ± 96,2 <0,05 70,8 ± 8,0*

№7 7 1606 ± 164,3 1323 ± 568,4 >0,05 89,2 ± 13,1

№8 6 2091 ± 767,9 1470 ± 458,1 >0,05 73,5 ± 13,9

Количество жизнеспособных лейкоцитов

Модежель №1 7 98,9 ± 0,9 86,9 ± 9,9 <0,05 87,7 ± 9,6#

№2 5 99,4+ 0,9 89,2 + 9,0 <0,05 89,7+ 9,1*

№3 7 99,0 ± 0,8 90,4 ± 6,1 <0,05 91,3 ± 5,5"

№4 7 99,0+ 0,0 88,6 ± 4,9 <0,05 89,5 ± 4,9*

Желатиноль №6 7 99,3 ± 0,6 94,9 ± 4,2 <0,05 95,4 ± 4,0

№7 7 99,3 ± 0,5 94,4 ± 6,1 >0,05 97,2 ± 3,2

№8 6 99,5 + 0,7 94,3 ± 4,0 >0,05 95,0+ 4,2

Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов

Модежель №1 7 30,1 ± 7,5 22,1+ 5,8 <0,05 78,4+ 6,7*"

№2 5 41,4+ 5,8 36,8 ± 6,9 >0,05 83,2+17,2*

№3 7 29,7 ± 4,8 29,4 ± 4,6 >0,05 99,0 ± 1,6*

№4 7 22,3 + 5,5 14,6+ 4,6 <0,05 68,7+ 6,1**

Желатиноль №6 7 48,0+ 10,8 33,7+ 7,8 <0,05 67,1+ 4,8**

№7 7 37,4 ± 16,1 33,4 ± 15,5 >0,05 88,4+ 7,0

№8 6 43,5+ 17,7 26,0+ 5,8 <0,05 62,5 ± 12,6**

Примечание - р - коэффициент достоверности между данными до и после холодового гипобиоза; * - данные достоверно (р<0,05) отличаются от таковых после выхода из гипобиоза ЛК с раствором №3; * - данные достоверно (р<0,05) отличаются от таковых после выхода из гипобиоза Ж с раствором №7

Физиологическая активность лейкоцитов, подвергнутых переохлаждению разной продолжительности с оптимальными хладоограждающими растворами. Результаты наших исследований показали, что при температуре переохлаждения (-10°С) функциональная активность гранулоцитов остается неизменной (нет достоверных различий между данными по всем исследованным показателям относительно суточного гипобиоза) под защитой оптимальных хладоограждающих растворов, содержащих модежель и

желатиноль, в течение 9 и 7 суток соответственно. Способность к фагоцитозу сохраняется без достоверных изменений после вывода клеток из гипобиоза через 9 суток и падает менее чем на 50% при пребывании гранулоцитов в данном состоянии в течение 12 суток. Фагоцитоз нейтрофилов сохраняется и через 14 суток после выхода из гипобиоза, но при этом наблюдаются заметно более низкие показатели функциональной активности. Таким образом, пребывание гранулоцитов в гипобиозе в течение 12 суток можно рассматривать как максимальный срок сохранения их функциональной активности (табл.3). Так, способность к фагоцитозу у этих клеток после 12 суток гипобиоза в растворе №3 сохраняется на 75,7±4,3% после их вывода из гипобиоза, а с использованием раствора №7 - на 57,2±4,4% (табл.3). Кроме того, в растворах №3 и №7, соответственно, сохраняется 69,7 ± 11,0 и 59,6±10,8% гранулоцитов, 69,7 ± 11,0 и 57,3±9,2% - нейтрофилов, 81,3 ± 4,6 и 76,6±7,7% клеток с целостной мембраной.

Таблица 3

Фагоцитарные показатели нейтрофилов (М±о) до и после холодового гипобиоза различной длительности в оптимальных хладоограждающих

растворах (№3 и №7)

Сроки хра-«ния, сутки Число опытов Относительные фагоцитарные показатели Абсолютные фагоцитарные показатели, количество клеток в мкл лейковзвеси

ФАН от исходных значений ФИНот исходных значений Абс. ФАН АФП

До гипобиоза После выхода из гипобиоза До гипобиоза После выхода из гипобиоза

раствор №3, содержащий модежель

1 7 98,4 ±2,1 88,6 ± 3,4 1366±259 1180±205 1015 ±4238 8403 ±3203

5 7 94,7 ±4,3 88,0 ± 7,1 1155± 76 1014±117* 9339 ± 633 7155± 726

7 9 94,8 ± 4,8 87,5 ±12,6 1364± 27 1011± 94 13110 ±4735 6967 ±2772

9 10 76,7 ±5,0" 80,0 ±11,1 640± 19 389± 66* 3688 ± 894 1639 ± 251*

11 7 75,5 ± 9,8* 70,3 ± 5,3* 487±206 258±159* 4293± 393 1368 ± 387'

12 6 75,7 ±4,3" 62,0 ±15,1* 864± 50 412± 56" 6506 ± 847 1794 ± 708'

14 7 , 52,9 ±6,1* 60,0 ± 4,7* 850± 20 252± 63* 9173 ±2293 1592± 453'

раствор №7, содержащий желатиноль

1 7 88,4 ±7,0 86,8 ±9,2 237,3± 120,1 196,0± 78,6 5230± 2877 3625±870

5 8 81,0 ±1,1 86,4 ±4,6 580,6± 79,7 389,0± 73,0 6447± 1452 3762±966

7 9 78,5 ± 2,7" 85,9 ±5,5 622,1± 83,9 340,4± 90,9 4292± 1483 2206±683

9 7 72,6 ±3,8* 78,4 ± 7,8 663,0± 75,1 293,0± 80,8 7011±2523 2929±299*

и 9 61,4 ±2,8" 78,0 ±4,1* 374,0± 0,0 165,6± 54,6' 6102± 2001 1592±552'

12 8 57,2 ± 4,4* 71,4 ±9,3* 459,0± 84,4 154,8± 33,5' 3895± 713 Ю25±226'

14 8 45,5 ± 3,0* 64,6 ± 10,7" 513,0± 0,0 106,0± 22,0" 6637± 4903 317± 98'

Примечание - * - данные достоверно (р<0,05) отличаются от таковых до холодового гипобиоза; * - данные достоверно (р<0,05) отличаются от таковых через 1 сутки гипобиоза.

После 12 суток воздействия холодового стресс-фактора функциональная активность гранулоцитов уменьшается и, следовательно, эффект криозащитных растворов снижается. Усиливается свободно-радикальное окисление, что подтверждается результатами НСТ-теста (рис.3).

□ до холодового гипобиоза

га о £ <8 й 5

и ■88 ё. 20 Й !» 0)

¿1 С О

10--

Ш после холодового гипобиоза с

раствором №3 И после холодового гипобиоза с раствором №7

* - данные достоверно (р<о,05) отличаются оттаковыхдо холодового гипобиоза

1 сутки

7 суток

12 суток

Рисунок 3 - Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов, до и после холодового гипобиоза различной длительности при -10°С под защитой хладоограждающих растворов №3 и №7 Содержание в гранулоцитах активных форм кислорода (АФК) в каждом из двух оптимальных хладоограждающих растворах к 12 суткам хранения Ж достоверно увеличивается в 1,5 раза и далее возрастает. Это, вероятно, приводит к увеличению перекисного окисления липидов в мембранах. Установлено, что к этому времени достоверно уменьшается эозинорезистентность клеточной мембраны (рис.4) относительно исходных значений (81,3 ±4,6% - с раствором №3 и 76,6±7,7% - с раствором №7).

120 100 80 : 60 -40 20 0

-жизнеспособность клеток

с хладоограждающим раствором №3

----жизнеспособность клеток

с хладоограждающим раствором №7

-I—I—I—I—I—I

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 время пребывания в холодовом гипобиозе, сутки

Рисунок 4 - Динамика количества эозинорезистентных лейкоцитов относительно исходных данных, находившихся в состоянии холодового гипобиоза при -10°С различной длительности с хладоограждающими растворами №3 и №7.

Вероятно, мембранные дефекты приводят к дегрануляции и выходу в цитоплазму активных компонентов гранул, а вследствие этого к нарушению функций целой клетки и в дальнейшем к ее аутолизу. После 12 суток уменьшается содержание в нейтрофильных гранулах ЖБ с 56,9 ± 1,8% до 47,2 ± 3,1% к 14 суткам хранения Ж при -10°С с раствором №7. Также снижается более чем на 50% ФАН, абс.ФАН, АФП, количество гранулоцитов и, в

частности, нейтрофилов (табл.3).

В течение 12 суток воздействия переохлаждения на лейкоциты не наблюдается достоверных отличий по всем исследуемым показателям, кроме ФАН в применении растворов №3 и №7. Поэтому оба раствора могут использоваться для сохранения функциональной активности лейкоцитов при температуре переохлаждения на высоком уровне в течение 12 суток.

Влияние длительного хранения раствора №7 на его криозащитные свойства. Для выяснения срока сохранности оптимального раствора №7, содержащего желатиноль, девять проб этого раствора выдерживали 45 суток при +60°С по методу «ускоренного старения лекарственных средств», что соответствует двум годам хранения при +4°С. Результаты исследования по введению лейкоцитов в холодовой пшобиоз с использованием всех девяти проб (для статистики) хранившегося таким образом раствора показали, что функциональная активность данных клеток не сохраняется в такой же степени, как с применением свежеприготовленного раствора №7. Нами было выдвинуто предположение о разрушительном влиянии длительного воздействия температуры +60°С на олигомерные и мономерные связи в желатиноле за счет возможного гидролиза. Данный гипотетический вывод проверили следующим образом. Все ингредиенты раствора №7, кроме желатиноля, смешивали, доводили рН раствора гидроксидом натрия до значения 7,3 и автоклавировали, затем помещали в термостат при +60°С на 45 суток для проведения «ускоренного старения».

Проведенный таким образом эксперимент показал, что через 45 суток исследуемый раствор имеет рН=7,3 и сохраняет прозрачность. При добавлении к нему необходимого по рецептуре количества желатиноля рН хладоограждающего раствора изменяется до 7,24, оставаясь в пределах нормы. Полученный раствор использовали для хранения клеток Ж в состоянии холодового гипобиоза 1 и 12 суток. При этом не было выявлено достоверных различий (р<0,05) между применением данного раствора и раствора №7, не подвергавшегося эксперименту по «ускоренному старению».

Таким образом, необходимо использование либо свежеприготовленного раствора, либо раствора, хранившегося в течение 2 лет при +4°С без желатиноля, но при его добавлении в раствор непосредственно перед охлаждением Ж до -10°С.

Оценка «острой», «хронической» токсичности и пирогенности оптимального раствора №7. Переносимость животными аутотрансфузий ЛК после суточного холодового гипобиоза. Соответствие хладоограждающего раствора №7 требованиям, предъявляемым к трансфузионной среде для внутривенного введения, в том числе и к криозащитной среде (ГФ XI, 1990), подтверждено нами исследованиями на лабораторных животных. При определении «острой» токсичности хладоограждающего раствора все пять

белых мышей по истечении 5 суток остались живы. При выявлении «хронической токсичности» раствора №7 показано, что животные (20 белых мышей и 5 кроликов) переносят также без осложнений и реакций многократное введение хладоограждающего раствора, что подтверждается данными об их состоянии и гистологическими исследованиями их внутренних органов. В эксперименте на пирогенность раствора ни у одного из трех исследуемых кроликов не было зафиксировано суммарного изменения температуры тела, превышающего норму (1,4°С). При исследовании переносимости экспериментальными животными (собаками) аутотрансфузий ЛК после вывода последних из суточного холодового гипобиоза без отмывания хладоограждающего раствора у животных не наблюдали отклонений от нормы в поведении, изменений температуры, массы тела, показателей гемограммы и урограммы, частоты дыхания и частоты сердечных сокращений. По результатам экспериментов установлено, что хладоограждающий раствор № 7 нетоксичен, апирогенен, его благоприятно переносят животные, он не требует отмывания биообъекта.

Таким образом, впервые показано, что сохранность гранулоцитов с высоким уровнем их функций может достигаться введением клеток ЛК в гипобиоз (-10°С) с использованием созданных эффективных, незамерзающих, нетоксичных, не требующих отмывания хладоограждающих растворов и трехэтапной программы охлаждения, что позволяет сохранять высокий уровень активности гранулоцитов до 12 суток пребывания их в холодовом гипобиозе.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод сохранения лейкоцитов и их функциональной активности путем переохлаждения лейкоконцентрата (до -10°С) под защитой хладоограждающих растворов и при использовании нелинейной трехэтапной программы охлаждения.

2. Созданы новые эффективные, незамерзающие при температуре переохлаждения и не требующие отмывания от биообъекта хладоограждающие растворы, позволяющие сохранять функциональную полноценность гранулоцитов (-10°С).

3. Показано, что при -10°С в присутствии растворов, содержащих желатиноль или модежель, гранулоциты полностью сохраняют способность к фагоцитозу после выхода из гипобиоза через 9 суток, значительная часть функциональной активности сохраняется до 12 суток пребывания в состоянии гипобиоза.

4. Найдено, что воздействие температуры переохлаждения на лейкоциты в течение 12 суток приводит к увеличению содержания активных форм кислорода в 1,5 раза и усилению дегрануляции в 16 раз, следствием чего является рост перекисного окисления липидов в цитоплазматической мембране, разрушение клеточной структуры и нарушение функций клетки,

что ведет к ее аутолизу. 5. Доказано, что хладоограждающий раствор, содержащий желатиноль, является нетоксичным, апирогенным, а трансфузии подвергнутого переохлаждению с ним лейкокондентрата животные переносят без реакций и осложнений.

Практические рекомендации

Разработанный метод сохранения лейкоцитов и их функциональной активности с использованием температуры переохлаждения (-10°С) может быть рекомендован для дальнейшего исследования холодового стресс-воздействия на метаболизм ядросодержащих клеток в научных лабораториях биологического, медицинского и ветеринарного профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах:

1. Степанова Б.С. Создание ограждающего раствора для консервирования лейкоцитов на основе препаратов желатина / Е.П. Сведенцов., Е.С. Степанова, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007. - Т.144, №10 -С.445. Пл. 0,2 (авт. 90%)

2. Степанова Б.С. Криозащитное действие лемнана, пектина ряски малой / Е. П. Сведенцов, Т. В. Туманова, Р. Г. Оводова, В. В. Головченко, О. О. Зайцева, О. Н. Соломина, Е. С. Степанова, Ю. С. Оводов // Доклады Академии наук. - 2008. - №4, Т.421. - С.559-561. П.л. 0,2 (авт. 60%)

3. Stepanova E.S. Effect of cryohypobiosis on concervation of human blood leukocytes / E.P.Svedentsov, E.S.Stepanova, T.V.Tumanova, O.O.Shcheglova, O.N.Devetyarova, S.V.Utyomov // Cryoletters. - 2005. - № 26(6). - C.387-394 (Великобритания). П.л. 0,5 (авт. 80%)

4. Степанова Е.С. Новый метод сохранения лейкоцитов в условиях холодового гипобиоза (-10°С) / Е. П. Сведенцов, Е. С. Степанова, Т. В. Туманова, О. О. Зайцева, О. Н. Соломина, С. В. Утемов // Трансфузиология. -2008. - №1. - С. 13-19. П.л. 0,4 (авт. 90%)

Тезисы докладов на конференциях:

5. Камышева (Степанова) Е.С. Криоконсервирование лейкоцитов -прогрессивный метод их длительного сохранения в жизнеспособном состоянии // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика: Сб. материалов Всероссийской научной школы. Выпуск I -Киров, 2003. - С. 265-267. П.л. 0,2 (авт.100%)

6. Степанова Е.С. Морфофункциональные показатели лейкоцитов, перенесших холодовой гипобиоз при -10°С в течение суток / Е.С.Степанова, Т.В.Туманова, О.О.Щеглова, О.Н.Деветьярова, С.В.Утемов //Тезисы докладов Пятнадцатой Коми республиканской молодежной научной конференции (в 2-х томах). Том I - Сыктывкар, 2004. - С.139-140. П.л. 0,1 (авт. 80%)

7. Степанова Е.С. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового гипобиоза / Е.С.Степанова, Е.П. Сведенцов, Т.В.Туманова, О.О.Щеглова, О.Н.Деветьярова, С.В.Утемов // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика: Сб. материалов Всероссийской научной школы. Выпуск II - Киров, 2004. - С. 277278. П.л. 0,1 (авт. 80%)

8. Степанова Е.С. Оценка функциональных свойств гранулоцитов, перенесших криогипобиоз // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика: Сб. материалов Всероссийской научной школы. Выпуск II - Киров, 2004. - С. 278-279. П.л. 0,1 (авт. 100%)

9. Степанова Е.С. Функциональное состояние гранулоцитов, подвергнутых криогипобиозу (-10°С) в течение 7 суток // Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: Тез. докл. IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН - Сыктывкар, 2005. - С.86. Пл. 0,1 (авт. 100%)

Ю.Степанова Е.С. Функциональное состояние лейкоцитов, перенесших холодовой гипобиоз (-10°С) / Е.С.Степанова, Е.П. Сведенцов, Т.В.Туманова, О.Н.Деветьярова, О.О.Щеглова // Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда: Бюллетень сибирской медицины - Т.4, Приложение 1,2005. - С.143. П.л. 0,1 (авт.90%)

П.Степанова Е.С. Функциональное состояние гранулоцитов крови человека, подвергавшихся холодовому гипо- и анабиозу / Е.П. Сведенцов, Т.В.Туманова, Е.С.Степанова, О.Н.Деветьярова, О.О.Щеглова // Успехи современного естествознания. - 2005. - №4. - С.38-39. П.л. 0,1 (авт. 70%)

12.Степанова Е.С. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу (-70°С) / Т.В.Туманова, О.Н.Деветьярова, О.О.Щеглова, Е.С.Степанова, С.В.Утемов, Д.А.Карпов // Физиология и медицина. Вестник молодых ученых: Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей-СПб, 2005.-С. 122. П.л. 0,1 (авт.50%)

13.Степанова Е.С. Сохранность лейкоцитов человека в условиях околонулевых и отрицательных температур / О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев, Е.С. Степанова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова // Тезисы докладов «VI Сибирского физиологического съезда», - г. Барнаул, 2527 июня 2008г. - том I, с. 87-88. П.л. 0,1 (авт. 60%)

Н.Степанова Е.С. Новые криоконсерванты для сохранения функции ядерных клеток крови при температурах -10°-80°С / Е. П. Сведенцов, Ю. С. Оводов, О. Н. Соломина, Т. В. Туманова, О. О. Зайцева, А. Н. Худяков, Д.С. Лаптев, Е. С. Степанова, Р. Г. Оводова, В. В. Головченко, С.В.Утемов, А.А.Костяев, Ф.С. Шерстнев // Мат-лы межд. конф. «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия». -Пущино, 28-30 октября 2008. -с.117-118. П.л. 0,1 (авт. неделимо)

Патент:

15.Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Камышева (Степанова) Е.С., Костяев А.А., Утемов C.B., Деветьярова О.Н., Щеглова О.О. Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С. Патент РФ на изобретение №2261595. Заявлено 19.01.2004; Опубл. 10.10.2005, Бюл. №28

Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность за помощь в выполнении диссертационной работы: научному руководителю доктору медицинских наук профессору Е.П. Сведенцову; директору института физиологии Коми НЦ УрО РАН академику Ю.С.Оводову; сотрудникам лаборатории криофизиологии крови Коми НЦ УрО РАН: к.б.н. Т.В. Тумановой, к.б.н. О.О. Зайцевой, к.б.н. О.Н. Соломиной, Г.А. Никулиной; сотрудникам ФГУ КНИИГ и ПК: км.н. C.B. Утемову, H.JI. Ежовой, Ф.С. Шерстневу, к.м.н. Н.В. Рябову, к.б.н. Н.НКоряковцевой.

âsRP/' /

Подп. к печ. 02.12.2010 Объем 2,25 пл. Заказ № 121 Тир 100 экз.

Типография Mill У

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Евгения Сергеевна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1 Современное состояние проблемы влияния переохлаждения на физиологическую активность лейкоцитов (обзор литературы).

1.1 Физиологические изменения в клетках in vivo при развитии гипобиоза.

1.2 Особенности функционального состояния гранулоцитов в норме и при воздействии холодового стресса.

1.3 Методы защиты лейкоцитов в условиях холодового воздействия.

1.4 Характеристика веществ, входящих в состав исследуемых хладоограждающих растворов.

Глава 2 Материалы и методы исследования.

Глава 3 Результаты экспериментальных исследований.

З.Ь Разработка метода сохранения лейкоцитов и их функциональной активности путем их переохлаждения до -10°С.

3.2 Оценка физиологического состояния лейкоцитов после их суточного холодового гипобиоза (-10°С).

3.3 Физиологическая активность лейкоцитов, введенных в холодовой гипобиоз (-10°С) разной продолжительности, и эффективность влияния на нее оптимальных хладоограждающих растворов.

3.3.1 Оценка эффективности применения оптимального раствора, содержащего модежель, на функциональную сохранность лейкоцитов, подвергнутых переохлаждению.

3.3.2 Оценка эффективности применения оптимального раствора, содержащего желатиноль, на функциональную сохранность лейкоцитов, подвергнутых переохлаждению.

3.4 Исследование возможности введения лейкоцитов в состояние, гипобиоза для сохранения их функциональной активности при температуре -10°С без хладоограждающего раствора.

3.5 Влияние длительного хранения хладоограждающего раствора №7 на его криозащитные свойства.

3.6 Оценка в опытах на животных «острой», «хронической» токсичности и пирогенности оптимального желатиноль-содержащего раствора и переносимости аутотрансфузий лейкоцитных концентратов после их суточного пребывания в холодовом гипобиозе при -10°С.

3.6.1 Испытание на «острую» токсичность хладоограждающего раствора.

3.6.2 Испытание на «хроническую» токсичность хладоограждающего раствора.

3.6.3 Изучение пирогенности хладоограждающего раствора.

3.6.4 Изучение переносимости аутотрансфузий лейкоконцентратов, выведенных из холодового гипобиоза при —10°С с оптимальным хладоограждающим раствором, содержащим желатиноль.

Глава 4 Обсуждение результатов экспериментальных исследований.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов"

Актуальность исследования

Одной из наиболее чувствительных популяций лейкоцитов к воздействиям различных стресс-факторов являются гранулоциты, что связано с их более сложной структурной организацией (Гребенюк А.Н. с соавт., 1998; Давтян Т.К., Аванесян JI.A., 2001). Благодаря своему уникальному положению в системе неспецифической резистентности и иммунитета, а таюке наличию рецепторов к огромному числу биологически активных веществ, они быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов C.B., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001).

Данный компонент крови является крайне необходимым для клинических целей при лейкопении, угнетении функциональной активности фагоцитов, признаках вторичного иммунодефицита в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, заболеваниях инфекционного характера: менингите, перитоните, сепсисе и других (Шалаев С.А. и соавт., 1990; Рыжков C.B. и соавт., 1992,1995; Cairo M.S. et. al., 1992; Абдулкадыров K.M., 1994; Мельникова B.H. и соавт., 1995; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Neppert J., 1996; Vamvakas Е.С. et al, 1996; Herzog R., 1999; Muncunill J., 1999; Schiffer С., 1999; Балашов Д.Н., 2001; Гордеев В.И., 2003; Sputtek А., 2004). Широкому распространению использования гранулоцитов мешает ряд нерешенных проблем, в том числе связанных с их низкой устойчивостью, необходимостью наличия больших доз для получения терапевтического эффекта.

Ранее лейкоцитный концентрат (ЛК) сохраняли только криоконсервацией, то есть замораживанием биообъекта (—20°С^—196°С), при этом лейкоциты находились в состоянии анабиоза (Абезгауз H.H., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович C.B., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004; Деветьярова О.Н., 2005; Утемов C.B. и соавт., 2005; Щеглова О.О., 2005). Однако после размораживания ЛК функциональная активность гранулоцитов часто оказывалась на низком уровне, что негативно сказывалось на качестве ЛК и его терапевтическом эффекте. Поэтому проблема оптимизации условий сохранения функций гранулоцитов крови человека вне организма является весьма актуальной на сегодняшний день. По существующей классификации отрицательных температур (Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., 2007) температура —10°С относится к температурам переохлаждения, при которой не замерзают все виды внутриклеточной и внеклеточной воды. Биообъект, охлажденный до данной температуры, не замерзает, а входит в состояние гипобиоза, характеризующееся незначительным замедлением метаболизма в клетке. В отечественной и зарубежной литературе нами не было обнаружено метода сохранения функций гранулоцитов в данном состоянии. Использование температуры переохлаждения позволит избежать последствий холодового стресса, в частности разрушения мембран кристаллами льда, вымораживания воды, гиперконцентрации солей, и применять ЛК в физиологически полноценном состоянии для клинических целей.

Задачи исследования:

Впервые показано, что влияние холодового стресс-фактора температуры переохлаждения устраняется при помощи созданного метода введения клеток в гипобиоз, включающего нелинейную программу охлаждения и оригинальные незамерзающие при -10°С хладоограждающие растворы.

Предложенный эффективный и доступный метод-отличается простотой в техническом исполнении и требует применения только электрического холодильника с морозильной камерой на и разработанных хладоограждающих растворов.

Установлено, что разработанный способ сохранения лейкоцитов и их функциональной активности в течение 12 суток путем введения в холодовой гипобиоз (-10°С) под защитой созданных хладоограждающих растворов может быть рекомендован для внедрения в практику научных биологических и медицинских учреждений.

Положения, выносимые на защиту:

Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал участие в создании метода введения гранулоцитов в гипобиоз при -10°С, в определении оптимального состава незамерзающих хладоограждающих растворов, проводил все экспериментальные работы по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и вышедших из холодового гипобиоза гранулоцитов, статистическую обработку полученных результатов, участвовал в написании статей и докладов по теме диссертации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендуемых ВАК. Получен патент РФ на изобретение «Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С» № 2261595 от 10.10.2005.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Степанова, Евгения Сергеевна

выводы

4. Найдено, что воздействие температуры переохлаждения на гранулоциты в течение 12 суток приводит к увеличению содержания активных форм кислорода в 1,5 раза и усилению дегрануляции в 16 раз, следствием чего является рост перекисного окисления липидов в цитоплазматической мембране, разрушение клеточной структуры и нарушение функций клетки, что ведет к ее аутолизу.

5. Доказано, что хладоограждающий раствор, содержащий желатиноль, является нетоксичным, апирогенным, а трансфузии подвергнутого переохлаждению с ним лейкоконцентрата животные переносят без реакций и осложнений.

Практические рекомендации

Разработанный метод сохранения лейкоцитов и их функциональной активности с использованием холодового гипобиоза (-10°С) может быть рекомендован для дальнейшего исследования холодового стресс-воздействия на метаболизм ядросодержащих клеток в научных лабораториях биологического, медицинского и ветеринарного профиля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Евгения Сергеевна, Сыктывкар

1. Абдулкадыров K.M. Гемокомпонентная терапия при заболеваниях системы крови / K.M. Абдулкадыров // Клинич. медицина. — 1994. — Т. 72.-№2.-С. 10-13.

2. Абезгауз Н. Н. Замораживание белых клеток периферической крови для длительного хранения при ультранизких температурах / Н. Н. Абезгауз, В. А. Леонтович // Пробл. гематологии и переливания крови. 1966. - № 9. - С. 24-30.

3. Абелев Г. И. Основы иммунитета / Г. И. Абелев // Соросовский Образовательный журнал. 1996. — № 5. — С. 4 - 10.

4. Аграненко В. А. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов / В. А. Аграненко, Н. Н. Тибилова // Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга: Справочник. / Под ред. Г. Н. Хлябича. М.: Медицина, 1997. - С.144-161.

5. Аграненко В. А. Криоконсервирование лейкоцитов / Аграненко В. А., Ермолович С. В. // Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. В. А. Цуцаевой. Киев: Наукова думка, 1983. - С.98-106.

6. Александров В. Я. Клетки, макромолекулы и температура. / В. Я. Александров. — Ленинград: Наука, Ленинградское отд-е, 1975. 330 с.

7. Антиоксидантная система, онтогенез и старение (обзор) / О. Н. Воскресенский и др. // Вопр.мед.хим. 1982. - Т.28, №1. - С. 14-27.

8. Асадов Ч. Д. Связь между фагоцитарной функцией и цитохимическими показателями нейтрофилов крови / Ч. Д. Асадов, Л. С. Нумерова, М. Э. Мирзоева// Лабораторное дело. 1990. -№11. — С.19-21.

9. Балашов Д. Н. Лечебные трансфузии гранулоцитов для лечения тяжелых инфекционных осложнений у пациентов с нейтропенией: дис. .канд. мед. наук / Балашов Дмитрий Николаевич. М., 2001. - 94 с.

10. Барабой В. А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В. А. Барабой // Успехи современной биологии. 1991.- Т. 111, вып. 6. - С. 21-28.

11. Барышев Б. А. Влияние сукцинированного модифицированного желатина на тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза в плазме крови у донора in vitro / Б. А. Барышев, Т. В. Вавилова, М. И. Кадинская // Журнал Инфузионная терапия. — 2005. №3. — С.

12. Бахметьев Б. А. Соотношение фагоцитарной активности лейкоцитов между артериальной, капиллярной и венозной кровью в норме и при патологии / Б. А.Бахметьев, А. В.Агафонова // Доклады Академии наук.- 2002. Т.384, №3. - С.415-417.

13. Белоус А. М. Актуальные проблемы криобиохимии / А. М. Белоус, В. И. Луговой, А. К. Гулевский // Криобиология и криомедицина / А. М. Белоус. Киев, 1975. - С.8-15.

14. Белоус А. М. Замораживание и криопротекция / А. М. Белоус, Е. А. Гордиенко, Л. Ф. Розанов. М.: Высшая школа, 1987. - 80 с.

15. Белоус А. М. Криобиология / А. М. Белоус, В. И. Грищенко. Киев: Наукова Думка, 1994. - 430 с.

16. Белоус А. М. Молекулярные механизмы криоповреждения мембранных структур / А. М. Белоус, Т. П. Бондаренко, В. А. Бондаренко // Криобиология и криомедицина. 1979. - № 5. — С. 3-13.

17. Белоус А. М. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении / А. М. Белоус, В. А. Бондаренко. Киев: Наук.думка, 1982.- 256 с.

18. Бережная Н. М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз / Н. М. Бережная. Киев, 1998.

19. Биологические свойства криоконсервированных лейкоцитов и их клиническое применение / В. А. Аграненко и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1982. № 4. - С. 6-10.

20. Биолюминесцентная модель для подбора криопротекторов / Н. В. Войнова и др. // Биофизика живой клетки. — Т.8. — 2006. — С.292-297.

21. Биохимия : учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.-925 с.

22. Бочкарев Е. Г. Влияние на иммунную систему препаратов, обладающих антиоксидантными и антигипоксантными свойствами / Е. Г. Бочкарев, Ю. В. Сергеев // Иммунопатология. — 2000. №4.

23. Быков В. Л. Цитология и общая гистология. Функциональная морфология клеток и тканей человека / В. Л. Быков. СПб.: СОТИС, 1999.-520 с.

24. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20°С) по экспоненциальной программе / Е. П. Сведенцов и др. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. - Т.91, №5.- С.558-566.

25. Виксман М. Е. Применение реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека / М. Е. Виксман, А. Н. Маянский // Казан, мед. журн. 1997. -Т. 55, №5.-С. 99-100.

26. Виноград-Финкель Ф. Р. Актуальные проблемы замораживания крови / Ф. Р. Виноград-Финкель, А. Е. Киселев // Пробл. гематологии и переливания крови. 1970. - № 4. - С. 3-4.

27. Владимиров Ю. А. Кальциевые насосы живой клетки / Ю. А. Владимиров // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. - № 3. — С. 20-27.

28. Владимиров Ю. А. Перикисное окисление липидов в биологических мембранах. / Ю. А. Владимиров, А. Н. Арчаков. М.: Наука. - 1972. -252 с.

29. Владимиров Ю. А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран / Ю. А. Владимиров // Биофизика. 1987. - Т. 32, № 5. - С. 830-844.

30. Влияние мексидола и его структурных компонентов на содержание углеводов и перекисное окисление липидов при остром стрессе / Т. А. Девяткина и др. // Вопросы медицинской химии. 1999. - Т45, №3.1. С.246.

31. Влияние мексидола на систему крови в условиях эмоционального стресса после воздействия ионизирующей радиации / Б. Б. Мороз и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. — Приложение 1. - С.213.

32. Влияние низкотемпературной консервации на поверхностные свойства лимфоцитов крови / Г. С. Лобынцева и др. // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Материалы симпозиума. Киев, 1974.-С. 67-69.

33. Возможности использования замороженных лейкоцитов человека в области биологической психиатрии / Г. П. Секирина и др. // Журнал неврологии и психиатрии. 1991. - №1. - С.60-61.

34. Антистрессорные эффекты антиоксиданта мексидола и его аналогов в экстремальных ситуации / Т.А. Воронина, и др. // Психофармакол. Биол.Наркол. 2001. - Т. 1, № 1.-С.2-12.

35. Гаврилов О. К. Клетки костного мозга и периферической крови / О. К. Гаврилов, Г. И. Козинец, Н. Б. Черняк. М.Медицина, 1985. - 288с.

36. Гемопоэз, гормоны, эволюция / В. В. Новицкий и др.. Новосибирск: Наука, 1997.-432 с.

37. Герасимов И. Г. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека/ И. Г. Герасимов, О. А. Калуцкая // Цитология. 2000. - Т.42, №2. - С. 160-165.

38. Герасимов И. Г. Неоднородность нейтрофилов в фагоцитозе и респираторном взрыве / И. Г. Герасимов // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. - №6. - С.34-36.

39. Герасимов И. Г. Особенности активации нейтрофилов in vitro / И. Г. Герасимов, Д. Ю. Игнатов // Цитология. 2004. - Т.46, №2. - С.155-158.

40. Герасимов И. Г. Особенности восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека: I. Влияние pH / И. Г. Герасимов, Д. Ю. Игнатов, М. А. Котельницкий // Цитология. 2005. - Т.47, №6. - С.549-552.

41. Герасимов И. Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода / И. Г. Герасимов, Д. Ю. Игнатов // Цитология. 2001. - Т.43, №5. - С. 432 - 436.

42. Гительзон И. И. Использование возможности хранения клеток крови, охлажденной ниже 0°С, в условиях высокого давления / И. И. Гительзон, Р. А. Павленко, Ю. А. Куденко // Гематология и трансфузиология. 1986. - №10. - С. 15-18.

43. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. М.: Практика, 1998.-459 с.

44. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое применение / A.M. Голдовский. JL: Наука, 1986. - 167 с.

45. Гольдберг Е. Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. П. Шахов. Томск: Изд-во Томского гос. унта, 1992.-264 с.

46. Гордиенко Е. А. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий / Е. А. Гордиенко, Н. С. Пушкарь. Киев: Наукова Думка, 1994. — 144 с.

47. Гребенюк А. Н. Нейтрофил и экстремальные воздействия / А. Н. Гребенюк и др.. СПб., 1998. - 216с.

48. Гребенюк А. Н. Цитохимия нейтрофила / А. Н. Гребенюк и др.. СПб., 1999.-68с.

49. Давтян Т. К. О взаимоотношении иммунного и адаптивного ответов / Т. К. Давтян, Л. А. Аванесян // Успехи современной биологии. — 2001. — Т.121, №3. С.275-286.

50. Деветьярова О.Н. Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С: автореферат дис. . канд. биол. наук / Ольга Нурзадиновна Деветьярова — Киров, 2005. 20с.

51. Дискретный плазмолейкоцитоферез в комплексном лечении деструктивных и септических пневмоний / Сост. Гордеев В.И. СПб.: Изд.КГМА, 2003.-9с.

52. Дюмаев К. М. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС / К. М. Дюмаев, Т. А. Воронина, Л. Д. Смирнов.- М., 1995.- 271 с.

53. Ермолович С. В. Криоконсервирование лейкоцитов и их клиническое применение / С. В. Ермолович // Воен.-мед. журн. 1981. - №12. - С. 3841.

54. Ермолович С. В. Современные подходы к использованию лейкоцитарной массы в гематологической клинике / С. В. Ермолович // Мед. реферативный журнал. 1981. - №5. — С. 22-28.

55. Жибурт Е. Б. Трансфузиология / Е. Б. Жибурт. СПб.: Питер, 2002. -736с.

56. Журавлев А.И. Развитие идей В.Н. Тарусова о роли цепных процессов в биологии / А. И. Журавлев // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М.: Наука, 1982. — С. 3 — 36.

57. Российская Федерация. Законы. О донорстве крови и ее компонентов : федер.закон : принят 9 июня 1993г. / Дом Советов России. М., 1993г., №5142-1.

58. Замораживание: факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологический суспензий / Ю.А. Иткин и др. // Консервирование клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1983. — С. 26-34.

59. Иржак JI. И. Состав и функции крови / JI. И. Иржак // Соросовский Образовательный Журнал. 2001. - Т.7, №2. - С. 11-19.

60. Испытание эффективности режимов с постоянной скоростью охлаждения для замораживания гранулоцитов человека / В.А. Леонтович и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1975. - №9. - С. 2325.

61. Калабухов Н. И. Спячка млекопитающих / Н. И. Калабухов. М.: Наука. -1985.-240 с.

62. Кетлинский С. А. Эндогенные иммуномодуляторы / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев, А. А. Воробьев. — СПб.: Гиппократ, 1992. 256 с.

63. Клебанов Г. И. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина / Г. И. Клебанов и др. // Вопросы медицинской химии. 2001. — Т47, №3.- С.288.

64. Козлова В.Ф. Морфофункциональная характеристика действия ряда полиолов и их оксиэтилированных производных на биологические системы: автореферат дис. . доктора биол. наук / Козлова В.Ф. — Харьков, 1989.-32с.

65. Консервирование лейкоцитов замораживанием при низких температурах (-60-т~80°С) / Е. П. Сведенцов и др. // Актуальные пробл. гематологии и трансфузиологии: Мат-лы науч.-практ. конф. (С.-Петербург, 6-8 июня, 2000 г.). СПб, 2000. - С. 261-262.

66. Корреляция скоростей охлаждения с ограждающей средой в поиске оптимальных режимов замораживания гранулоцитов / И. К. Махатадзеи др. // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1975. №9. - С. 2527.

67. Котляров А.О. Влияние криоконсервирования на синтез белка в микроорганизмах и перевариваемых клеточных культурах: автореферат дис. .канд. мед. наук : 03.00.02. / Котляров А.О. Харьков, 1991, - 17с.

68. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. A.A. Цуцаевой — Киев: Наукова Думка, 1983. 240 с.

69. Криоконсервирование лейкоцитов с новым ограждающим раствором / С.

70. B. Утемов и др. // Вопросы трансфузионной и клинической медицины: Мат-лы 6-й науч. конф. молодых ученых (Киров, 29-30 марта 1999 г.). -Киров, 1999.-С.28.

71. Криопротекторы / Н.С. Пушкарь и др.. Киев: Наукова Думка, 1978. -204 с.

72. Кузнецов В. Ф. Патофизиология дисфункций нейтрофилов / В. Ф. Кузнецов, В. А.Черешнев. — Киров, 1998. — 119с.

73. Лаврик С. С. Консервирование клеток селезенки поливинилпирролидоном методом глубокого замораживания / С. С. Лаврик, А. С. Зверкова, Е. Ю. Афанасьева // Врачеб. дело. 1971. - №2.1. C. 9-12.

74. Лаврик С. С. Применение низкомолекулярного ПВП в качестве защитной среды для консервирования и длительного хранения лейкоцитов методом глубокого замораживания / С. С. Лаврик, Г. И. Когут, Е. Ю. Афанасьева // Врачеб. дело. 1971. - №12. - С. 80-83.

75. Левин C.B. Структурные изменения клеточных мембран / С. В. Левин. -Л.: Наука, 1976.-197 с.

76. Лобынцева Г. С. Влияние скорости отогрева на выживаемость клеток крови / Г. С. Лобынцева, Ю. П. Тимошенко // Криобиология и криомедицина. 1981. - №8. - С. 15-18.

77. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Адаптация и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам Л. К. Лозина-Лозинский. Л.: Наука, 1972. - 288 с.

78. Лукьянова Л.Д. Проблемы фармакологической коррекции гипоксии и поиска антигипоксантов / Л. Д. Лукьянова // Клеточные механизмы реализации фармакологического эффекта. — М.: Медицина. 1990. -С. 184-216.

79. Майстрах Е. В. Гипотермия и анабиоз / Е. В. Майстрах. М.-Л.: Наука, 1964.-327с.

80. Майстрах Е. В. Патологическая физиология охлаждения человека / Е. В. Майстрах. Л.: Медицина, 1976. - 216с.

81. Мамаев А. Е. Модежель как новое средство инфузионной терапии разлитого гнойного перитонита / А. Е. Мамаев, М. Д. Ханевич, Е. А. Селиванов // Актуальные вопросы специальной медицинской помощи. Сборник научных трудов. Энгельс, 1998. - С.35.

82. Мамаев А. Е. Опыт применения взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перетонитом / А. Е. Мамаев, М. Д. Ханевич, Е. А. Селиванов // Terra medika nova 1997. - Т.З, №3.-С.42-44.

83. Мамаев А.Е. Применение модежеля и взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перетонитом: автореферат дис. .канд.мед.наук / А. Е. Мамаев. СПб, 1998 - 16с.

84. Машковский М. Д. Лекарственные средства: В 2 т. / М. Д. Машковский Т.2./ Изд. 14-е, перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна. 2002.- 608 с.

85. Маянский А. Н. Активация макрофагов / А. Н. Маянский, Д. Д. Цырендоржиев // Успехи современной биологии. 1990. - Т.109, №3. -С.352-368.

86. Маянский А. H. Механизмы рекогносцировочных реакций нейтрофила / А. Н. Маянский // Успехи современной биологии. — 1986. — Т. 102, №3. -С.360-375.

87. Маянский А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1989. - 344 с.

88. Меерсон Ф. 3. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца / Ф. 3. Меерсон, Н. Ю. Малышев. М., Наука, 1993. - 158 с.

89. Мельникова В. Н. Получение и клиническое применение при гнойно-септических заболеваниях лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров / В. Н. Мельникова // Трансфузионная медицина. — 1995. №5. -С. 32-36.

90. Механизмы воспаления и активации лейкоцитов / Н. Ali, В. Haribabu, R. M. Richardson, R. Snyderman // Medical Clinics of North America. 1997. -Vol. 81, №1.-P. 15-28.

91. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений / А. А. Цуцаева и др. // Цитология. 2004. - Т. 46, №9. - С. 879.

92. Моисеев В. А. Молекулярные механизмы криоповреждения и криофизиологии белков и биологических мембран: автореф. дис. .доктора биол. наук : 03.00.22. Харьков, 1984. - 47с.

93. Мокеев И. Н. Инфузионно-трансфузионная терапия: Справочник / И. Н. Мокеев. М.: Изд-ль Мокеев, 1998. - 232 с.

94. Муравьев Р. А. Желатиназные гранулы нейтрофильных гранулоцитов / Р. А. Муравьев, В. А. Фомина, В. В. Роговин // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. -2003. №4. - С. 389-394.

95. Мурский Л. И. Физиология гипотермии / Л. И. Мурский. Ярославль, 1958.-238с.

96. Набокина С. М. Регулируемый экзоцитоз в нейтрофилах человека / С. М. Набокина.- Саранск: Изд-во Мордовского университета, 2001. 84 с.

97. Нагоев Б. С. Катионный белок лейкоцитов и его значение. Метод.указания / Б. С. Нагоев. Нальчик, 1982. - 67с.

98. Нестерова И.В., Колесникова H.B. Цитокиновая регуляция и функционирующая система нейтрофильных гранулоцитов / И. В. Нестерова, Н. В. Колесникова // Гематология и трансфузиология. — 1999. Т.44, №2. - С.43-47.

99. Низкотемпературная консервация лимфоцитов / Н.С. Пушкарь и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1974. №7. с. 23-26.

100. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова и др.. М.: Фирма «Слово», 2006. - 556с.

101. Опыт получения и клинического применения лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров при гнойно-септических заболеваниях / В. Н. Мельникова и др. // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. СПб., 1993. - С. 342-343.

102. Основы трансфузиологии / Под ред. М.Ф. Заривчацкого. Пермь: Изд-во Пермского ун-та, 1995. - С. 74-75.

103. Основы физиологии человека / Под ред. Б.И. Ткаченко. — СПб.: Международный фонд истории науки, 1994. С. 212-218.

104. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен / Л. Д. Лукьянова и др. // Хим.-фарм.журн. 1990. - №8. - С.9-11.

105. Осташко В.Ф. Температурный шок клеток как гидравлический удар в резонансной системе / В. Ф. Осташко, Ф. И. Осташко // Цитология. -2004. Т. 46, №9. - С. 831-832.

106. Паркер Ч. В. Медиаторы: вычвобождение и функции / Ч. В. Паркер // Иммунология / Ч. В. Паркер. М.: Мир, Т.З. - 1989. - С.170-247.

107. Патент на изобретение № 2261595. Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре —10°С / Е.П. Сведенцов,

108. T.B. Туманова, E.C. Камышева (Степанова), C.B. Утемов, О.Н. Деветьярова, О.О. Щеглова. Приоритет 19.01.2004. Опубл. 10.10.2005.

109. Патент на изобретение №2049391 (РФ). Средство для криоконсервирования костного мозга / Е.П. Сведенцов, В.П. Архиреев, Д.С. Симкин, Е.В. Кузнецов. Опубл. 10.12.1995.

110. Патент на изобретение №2184449. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, А.Н. Семенов, С.А. Хомякова, A.A. Костяев, C.B. Утемов. Приоритет 18.04.2001. Опубл. 10.07.2002.

111. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой, И. И. Брехман, В. Г. Голотин, Ю. Б. Кудряшов СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

112. Петров И. Р. Искусственная гипотермия / И. Р. Петров, Е. В. Гублер. — Л.: Медгиз, 1961. 227с.

113. Пигаревский В. Е. Зернистые лейкоциты и их свойства / В. Е. Пигаревский. -М.: Медицина, 1978. С. 104-108.

114. Полякова А. И. Изучение влияния низких температур (-196°С) и криопротектора (ПЭО-400) на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови: автореф. дис. . канд. биол. наук / А. И. Полякова Харьков, 1975.- 14 с.

115. Понамарев А. Д. Влияние белков теплового шока на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами человека / А. Д. Понамарев, В. Ф. Семенков, А. М. Сапожников // Иммунология. 2005. - Т.26, №2. -С.72-75

116. Попов С. В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: автореф. дис. . канд. биол. наук / Попов Сергей Владимирович. — Сыктывкар, 1999. 19 с.

117. Прийма О. Б. Неферментные катионные белки лейкоцитов периферической крови фактор неспецифической реакции организма на повреждения / О. Б. Прийма // Клиническая медицина. - 1997. - №2. -С.4 -6.

118. Применение лейкоконцентрата при гнойно-септических состояниях / C.B. Рыжков и др. // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.). СПб., 1995.- С.343-344.

119. Применение мексидола в интенсивной терапии гнойных нейроинфекций у детей / Д. В. Хвойнов и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. - Приложение 1. - С. 91

120. Проблемы криобиохимии / A.M. Белоус и др. // Вест. АН СССР. -1976. Сер. 40, № 2. - С. 38-48.

121. Пушкарь Н. С. Введение в криобиологию / Н. С. Пушкарь, А. М. Белоус. Киев: Наукова Думка, 1975. — 342 с.

122. Разработка оптимальных программ охлаждения для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека / В.А. Леонтович и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1973. - №9. - С. 44-47.

123. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов / Н.С. Пушкарь и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1978. - №8. - С. 8-13.

124. Ре Л. Консервация жизни холодом / Л. Ре. М.: Мир, 1962. - 155 с.

125. Режимы замораживания гранулоцитов при применении диметилацетамида в качестве криопротектора / H.H. Абезгауз и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов 1 Всесоюз. симпоз. (Москва, 27-29 сентября 1981 г.). М., 1981. -С. 56-58.

126. Розанова Е. Д. Влияние низкой температуры и криопротекторов на структуру и функцию изолированной цитохромоксидазы: автореферат дис. .канд. биол. наук. : 03.00.02 / Е. Д. Розанова — Харьков, 1984. -20с.

127. Ройт А. Основы иммунологии / А. Ройт. М.: Мир, 1991. - 328 с.

128. Руководство по гематологии / Под ред. А.И. Воробьева. М.: Изд-во «Ньюдиамед», 2002. - Т1. - С.88-100.

129. Руководство по общей и клинической трансфузиологии / Ю.Л. Шевченко и др.. — СПб.: Фолиант, 2003. — 608 с.

130. Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е.П. Сведенцова. — Киров, 1999.-715 с.

131. Рыжков С. В. Клиническое применение лейкоконцентрата / С. В. Рыжков, С. П. Калеко, А. Н. Плоцкий // Вест, хирургии. 1992. - №1-3. -С.78-82.

132. Сааков Б.А. Гипотермия / Б.А.Сааков // Патологическая физиология экстремальных состояний — М.: Медицина, 1973. — с.237-268.

133. Свиридов С. В. Гетерогенные коллоидные плазмозамещающие растворы: настоящее и будущее / С. В. Свиридов // Российский Журнал Анестезиологии и Интенсивной Терапии. 1999. - № 2.

134. Свободные радикалы в живых системах / Ю. А. Владимиров и др. // Итоги науки и техники. Биофизика. 1992. - Т. 29. - С. 3-250.

135. Серебряков Э.П. Лимонная кислота // Большая Российская энциклопедия. 2001.

136. Славинский А. А. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов / А. А. Славинский // Клинич. лаб. диагностика. — 2002. №3. - С. 39-42.

137. Слоним А. Д. Эволюция терморегуляции / А. Д. Слоним. Л.: Наука, ленингр.отд-ние, - 1986. - 76 с.

138. Смирнов Л. Д. Фармакологические свойства и перспективные области клинического применения антиоксидантов гетероароматического ряда / Л. Д. Смирнов // Свободные радикалы и антиоксиданты в химии и биологии. Тезисы докладов — М.: РАН. — 2000. — С.11.

139. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения / О. Смит. М.: Изд-во ин. лит., 1963 - 503 с.

140. Смольянинова Е. И. Проницаемость мембран ооцитов мыши для криозащитных веществ ряда диолов и амидов / Е. И. Смольянинова, Т.

141. Н. Липник., О. И. Гордиенко // Цитология. 2004. - Т. 46, №9. - С. 855856.

142. Современные антиоксиданты в медицине / Под ред. В.И. Петрова. Волгоград: ФГУП «ИПК «Царицын». -2001. С.12.

143. СП 3.3.2.561-96. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарные правила. -Введ. 1996-10-31.-М.Д998.-127 с.

144. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -50°С / Е.П. Сведенцов и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -2003. -№11.-С. 35-37.

145. Старков П. М. Изменение ЭКГ при гипотермии / П. М. Старков, Е. К. Аганянц // Электрофизиология нервной системы. — Ростов-на-Дону, 1963.-c.364.

146. Субмикроскопическая организация клеток крови, хранившихся в замороженном состоянии / Э. И. Терентьева и др. // Р.Ж. ВИНИТИ 04.А1 Общие проблемы биологии. 1970. - №1. - С.154-168.

147. Тепаев Д. В. Исследование возможности фармакологической коррекции мексидолом вегетативных и иммунных нарушений у лиц с признаками вегетативных изменений / Д. В. Тепаев // Бюллетень экспериментальнойбиологии и медицины. — 2006. — Приложение 1. — С. 86.

148. Теселкин Ю. О. Ингибирование мексидолом пероксидного окисления липопротеинов сыворотки крови / Ю. О. Теселкин, Б. В. Давыдов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — Приложение 1. — С. 139.

149. Тимофеев H. Н. Гипобиоз и криобиоз. Настоящее, прошлое и будущее / H. Н. Тимофеев. М.: Информ-Знание, 2005. - 256 с.

150. Тимофеев H. Н. Искусственный гипобиоз / H. Н. Тимофеев. М., «Медицина», 1983.- 192 с.

151. Тимофеев H. Н. Прокопьева JI. П. Нейрохимия гипобиоза и пределы криорезистентности организма. Состояния гипобиоза (нормотермического и сверхглубокого) / H. Н. Тимофеев, Л. П. Прокопьева. М., «Медицина», 1997. - 208с.

152. Точилкин А. И. Лимонная кислота / А. И. Точилкин // БМЭ, 1980. Т. 13. - С.131-132.

153. Трансфузиология в вопросах и ответах / Под ред. А. А. Рагимова. М.: Мед.информационное агенство, 2004. - С.46-48.

154. Трошина В. М. Криоконсервирование гранулоцитов с диметилацетамидом: дис. .канд.биол.наук : 14.00.29 / Трошина Вера Михайловна. М., 1981. - 114 с.

155. Трошина В. М. Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживании гранулоцитов / В. М. Трошина, Н. Н. Абезгауз, В. А. Леонтович // Пробл. гематологии и переливания крови. 1977. - №5. - С. 50-53.

156. Тяпкина А. Д. Функциональная активность лейкоцитов крови в условиях гипотермии: автореферат дис. .канд. биол. наук : 03.00.13 / А. Д. Тяпкина. Ярославль, 2002. — 26 с.

157. Утемов С. В. Методы выделения лейкоцитов для клинических целей / С.

158. B. Утемов // Препараты крови и кровезаменители — производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф. -Киров, 1995. С.68.

159. Утемов С. В. Низкотемпературное (-80°С) консервирование лейкоцитных концентратов: Автореф. дис . канд. мед. наук / Утёмов Сергей Вячеславович. Санкт-Петербург, 2005. — 23 с.

160. Ушатинская Р. С. Скрытая жизнь и анабиоз / Р. С. Ушатинская. М.: Наука, 1990.- 180с.

161. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-40°С) / Е.П. Сведенцов и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2004. Том. 138. - С.400 - 402.

162. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний алкилзамещенными 3-окси-пиридинами / Л. Д. Смирнов и др. //

163. Фармакологическая коррекция кислородзависимых патологических состояний. -М.: Медицина. 1984. - С.87.

164. Физиология лейкоцитов человека / Под ред. В. А. Алмазова JI.: Наука, 1979. - 232 с.

165. Физиология человека / Н. А. Агаджанян и др. — М.: Медицинская книга, Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2001. 526 с.

166. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии / Ю. Б. Филиппович. — М.: Высшая школа, 1993. С. 348-350.

167. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов / И. С. Фрейдлин. -М.: Медицина, 1984. 272 с.

168. Фролова О. Е. Морфофункциональная характеристика моноцитов. Значение исследования нуклеолярного аппарата (обзор литературы) / О. Е. Фролова // Клинич. лаб. диагностика. — 1998. №10. — С. 3-8.

169. Ханевич М. Д. Использование лейкоцитарной массы при лечении тяжелых форм разлитого перитонита / М. Д. Ханевич, А. В. Маринин // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.). СПб, 1995. - С.344-345.

170. Цитохимия замороженной клетки / Э. И. Обозная и др.. Киев: Наукова Думка, 1981. - С. 38-43.

171. Шалаев С.А. Трансфузии лейкоцитов в комплексном лечении острых легочных нагноений / С.А. Шалаев. В.Н. Мельникова, С.Д. Волкова // Грудная и сердечно сосудистая хирургия. -1990. № 11. - С. 52-56.

172. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Ф. Дж. Шиффман. М.-СПб.: БИНОМ - Невский диалект, 2000. - 448 с.

173. Щеглова О.О. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре: Афтореф. дис. . канд. биол. наук / Щеглова Оксана Олеговна. — Киров, 2005. — 22 с.

174. Электронная микроскопия лейкоцитов в процессе их хранения / Э.И. Терентьева и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1978. -№1. С. 28-34.

175. Эмирбеков Э. 3. Биохимические механизмы зимней спячки / Э. 3. Эмирбеков, С. П. Львова // Протокриобиологические процессы у организмов. Сборник научных трудов. — Якутск: Издательство Якутского госуниверситета, 1990. С. 149-155.

176. Энзиматическая диагностика криоповреждений клеток лейкоконцентрата / В.И. Луговой и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюз. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1978 г.). М., 1981. - С. 64-65.

177. Этическая экспертиза биомедицинских исследований. Практические рекомендации / Ред. Ю. Б. Белоусов.- М., 2005. С.148-153 // www.aspirantura.spb.ru/other/filearchive.html

178. Яковлев Н. И. Живое и среда: Молекулярные и функциональные основы приспособления организма к условиям окружающей среды / Н. И. Яковлев. — Л.: Наука. Ленинградское отделение, 1986. 195с.

179. A convenient and economical freezing procedure for mononuclear cells / J. Vingerhoets, G. Vanham, L. Kestens, P. Gigase // Cryobiology. 1995. - Vol. 32.-P. 105-108.

180. Abdel-Mageed A. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential / A.Abdel-Mageed, M.L.U.Rosalio, C.E. Hutcheson // Blood. 1997.- Vol. 90, №10. - P. 321b (4194).

181. Abramson J. S. The natural immune system: the neutrophil / J. S. Abramson, J. G. Wheeler. Oxford: Oxford Univ. Press., 1993. - 336 p.

182. Aderem A. A. Mechanisms of phagocytosis in macrophages / A. A. Aderem, D. M. Underhill // Annu. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 17. - P. 593-623.

183. Baggiolini M. Biochemical characterization of azurophil and specific granules from human and rabbit polymorphonuclear leukocytes / M.Baggiolini, U.Bretz, B.Gusus. «Schweiz.med.Wschr.», 1974. - Bd 104. - S.129-132.

184. Bainton D. F. Distinct granule populations in human neutrophils and lysosomal organelles identified by immuno-electron microscopy / D. F. Bainton // J. Immunol. Methods. 1999. - Vol. 232, №1-2. - P. 153-168.

185. Bainton D. F. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function / D. F. Bainton // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - Vol. 336. - P.17-33.

186. Bainton D. F. The development of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow / D. F. Bainton, J. L. Ulliot, M. G. Farquhar //J. Exp.Med. 1971- Vol. 134(4 ): P.907-934

187. Biosynthesis of granule proteins in normal human bone marrow cells. Gelatinase is a marker of terminal neutrophil differentiation / N. Borregaard, et al. // Blood. 1995. - Vol. 85, №3. - P. 812-817.

188. Bjerrum O. W. Mixed enzyme-linked immunosorbent assay (MELISA) for HLA class I antigen: a plasma membrane marker / O. W. Bjerrum, N. Borregaard // Scand. J. Immunol. 1990.- Vol.31, №3.- P. 305-313.

189. Borregaard N. Development of neutrophil granule diversity / N. Borregaard //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1997. Vol. 15.№832. - P. 62-68

190. Borregaard N. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte / N. Borregaard, J. B. Cowland // Blood. 1997. - V.89. №10.-P.3503-3521

191. Burdon R. H. Active oxygen species and heat shock protein induction / R. H.Burdon, V Gill, C. R. Evans // Stress Proteins. Induction and Function. -Berlin: Springer-Verlag, 1990. P. 19-25

192. Cham B.P. Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation / B. P. Cham, J. M. Gerrard, D. F. Bainton // J. Pathol. 1994. -Vol.144.-P.1369-1380.

193. Clement L. Identification of neutrophil subpopulations with monoclonal antibodies / L. Clement, J. Lehmeyer, G. Gartland // Blood. 1983. - № 61. -P. 326-332.

194. Cryomicroscopic determination of the membrane osmotic properties of human monocytes at subfreezing temperatures / C. McCaa et al. // Cryobiology. 1991. - Vol. 28, №4. - P. 391-399.

195. Cryopreservation of hematopoetic progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide at -80°C without ratecontrolled freezing / A. Galmes et al. // Transfusion. 1996. - Vol. 36, №9. - P. 794-797.

196. Cytokine-treated human neutrophils contain inducible nitric oxide synthase that produces nitration of ingested bacteria / TJ. Evans et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93, №18. - P. 9553-9558.

197. Effect of dimethylsulphoxide on lipoproteins stored at low temperatures / Klein E. et al. // Cryobiology.- 1967. 4, №3. - p. 328-334.

198. Effect of pentoxifylline on polarization and migration of human leukocytes / C. Domínguez-Jiménez et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2002. -Vol. 71.-P. 588-596.

199. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood / W. Hubl et al. //Blood. 1997.- Vol.90. - P.4217.

200. Extracellular acidification induces human neutrophil activation / A. S. Trevani et al. // J. Immuol. 1999. - № 162. - P. 4849-4857.

201. Farrant J. Thermal shock and dilution shock as the causes of freezing injury / J.Farrant, G.J.Morris // Cryobiology. 1973. - Vol. 10, №2. - P. 134-140.

202. Fatty acid desaturase regulation of membrane fluidity in acclimation of Tetrahymena cells / C. E. Martin et al. // Biochemistry. — 1976. Vol.15, № 24.-P. 5218-5228.

203. Grant C.K. A simple method for the cryopreservation of lymphocytes. Retention of specific immune effector functions by frozen-stored cells / C.K.Grant // Clinical Experimental Immunology. 1976. - Vol. 23, №1. - P. 166-174.

204. Granulocytic cryopreservation: further studies on the pathogenesis of impaired cellular function / D.M. McCarthy et al. // Br. J. Haematol. 1984. -Vol. 56, №1.-P. 45-54.

205. Haberland M.E. Sequestration of aggregated LDL by macrophages studied with freeze-etch electron microscopy / M.E.Haberland, G. Le M.Mottino, J.S. Frank// J. Lipid. Res. 2001. - Vol. 42, №4. - P. 605-619.

206. Hastie R. Ultrastructure of human basophil leukocytes studied after spray freezing and freeze-substitution / R.Hastie // Lab. Invest. 1990. - Vol. 62, №1.-P.l 19-130.

207. Herzog R. Kalteanwendung in der Medizin. Kryochirurgie / R.Herzog // Ki Luft und Kaltetechn. - 1999. - Vol.35. - P.l 17-124.

208. Human peripheral blood eosinophils express stem cell factor / M.L. Hartman et al. //Blood. -2001. Vol. 97, №4. - P. 1086-1091.

209. Identification of a highly mobilizable subset of human neutrophil intracellular vesicles that contains tetranectin and latent alkaline phosphatase / N. Borregaard et al. // J. Clin. Invest. 1990. - Vol.85, №2. - P. 408-416.

210. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience / P.K. Lund et al. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000. -Vol. 60, №5.-P. 357-365.

211. Lardner A. The effect of extracellular pH on immune function / A. Lardner // J. Leukoc.Biol. -2001. -№ 69. P. 522-530.

212. Levitt J. Criobiology / J.Levitt. -London: Acad. Press. N.Y., 1966. -P. 495.

213. Lovelock J. E. The mechanism of the protective action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing / J. E. Lovelock // Biochim. et Biophys. Acta. 1953. Vol.11 - P. 28-36.

214. Low temperature Leukocyte concentrate conserving / E.P. Svedentsov et al. // Vox Sanguineous. 25th Congress JSBT, 1998. Oslo, Norway. - P. 1254.

215. Lyons J.M. Phase transitions and control of cellular metabolism at low temperatures / J.M. Lyons // Cryobiology. 1972. -№9. - P. 341-350.

216. Lysosomal enzyme trafficking between phagosomes, endosomes, and lysosomes in J774 macrophages / V. Claus et al. // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 273.-P. 9842-9851.

217. Makino M. A cryopreservation method of human peripheral blood mononuclear cells for efficient production of dendritic cells / M. Makino, M. Baba // Scand. J. Immunol. 1997. - Vol.45. - P.618-622.

218. May R.C. Phagocytosis and the actin cytoskeleton / R. C. May, L. M. Machesky // Journal of Cell Science. 2001. - Vol. 114, №6. - P. 1061-1077.

219. Mazur P. Cryobiology. The freezing of biological system / P.Mazur // Science. 1970. -Vol. 169, №5135. - P. 939-949.

220. Merymen H.T. Crioprotectiv agents: A review / H. T. Merymen //Cryobiology. 1971. - Vol. 3, №2, - P. 173-183.

221. Merymen H.T. Freezing injure and its prevention in living cells / H. T. Merymen // Annu. Rev. Biophysical and Bioeng. 1974. - Vol.3. - P.341-363.

222. Monterrosso B. L'anabiosi nei cirripedi il problema della vita latente (ipoliosi). / B.Monterrosso // Apch.zool. Ital.- 1934. Vol. XIX. - p. 17-379.

223. Muncunill J. Transfusiones de granulocitos. Regreso al pasado / Josep Muncunill // Med. clin. 1999. - Vol. 112, № 15. - P. 574-576.

224. Myhrvold V. The use of frozen monocytes in phagocytosis studies / V.Myhrvold, B.Morland // Acta. Patho.l Microbiol. Immunol. Scand. 1985. -Vol. 93, №2.-P. 43-48.

225. Neppert J. Therapie mit Granulozyten / J.Neppert // Transfusionsmedizin. -Berlin: Verlag-Springer, 1996. -P.339-344.

226. Nesterova I.V. Current Views on the Role of Neutrophil Granulocyte System / I.V.Nesterova, N.V. Kolesnikova // Russ. J. Immunol. 1999. - Vol. 4, №3. -P. 229-233.

227. On the problem of dehydration and intracellular crystallization during freezing of cell suspension / N.S. Pushkar et al. // Ibid. -1976. Vol. 13, №2.-P. 147-152.

228. Pennell C.A. Heat shock proteins in immune response in the Fall of 2004 / C.A. Pennell // Immunology. 2005. - Vol. 114, №3. - P. 297-300.

229. Peroxynitrite formation from activated human leukocytes / N. Fukuyama et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol. 224, №2.- P. 414-419.

230. Pettit E.J. Cytosolic Free Calcium and the Cytoskeleton in the Control of Leukocyte Chemotaxis / E.J.Pettit, F.S.Fay // Physiological Reviews. 1998. - Vol. 78, №4. - P. 949-967.

231. Polymorphonuclear leukocytes adherence induces actin polymerization by a transduction pathway which differs from that used by chemoattractants / F.S. Southwick et al. // The Journal of Cell Biology. 1989. - Vol. 109. - P. 1561-1569.

232. Randomized trial of granulocyte transfusions versus intravenous immuneglobulin therapy for neonatal neutropenia and sepsis /M.S. Cairo et al. // J.Pediatr. 1992. - Vol. 120. - P. 281-285.

233. Release of granule proteins by eosinophils from allergic and nonallergic patients with eosinophilia on immunoglobulin-dependent activation / M. Tomassini et al. // Journal of Allergy Clin. Immunology. 1991. - Vol. 88. -P. 365-375.

234. Risom L. Use of cryopreserved peripheral mononuclear blood cells in biomonitoring / L. Risom, L.E.Rnudsen // Mutat. Res. 1999. - Vol. 440, №2.-P. 131-138.

235. Role of the liver in regulating numbers of circulating neutrophils / J. Shi et al. // Blood. 2001. - Vol. 98, №4. - P. 1226-1230.

236. Schiffer C. Granulocyte transfusion therapy / C. Schiffer // Curr. Opin. Hematol. 1999. - № 6. - P. 3-7.

237. Shimada K. Visualization of intracellular ice crystals formed in very rapidly frozen cells at -270C / K.Shimada, E.Asahia // Cryobiology. 1975. - Vol. 12, №3.-P. 209-218.

238. Siegenthaler R.K. The importance of having thermosensor control in the DnaK chaperone system / R.K.Siegenthaler, P.Christen // J. Biol. Chem. -2005. -№ 10.-P. 8057.

239. Signaling mechanisms of enhanced neutrophil phagocytosis and chemotaxis by the polysaccharide purified from Ganoderma lucidum I M.J. Hsu et al. // British Journal of Pharmacology. 2003. - Vol. 139. - P. 289-298.

240. Spitz D.R. Hydrogen peroxide or heat shock induces resistance to hydrogen peroxide in Chinese hamster fibroblasts / D.R.Spitz, W.C.Dewey, G.C.Li // J. Cell. Physiol. 1987. - Vol.131. -P.364-373.

241. Sputtek A. Cryopreservation in Transfusion Medicine and Haematology / A. Sputtek, R.Sputtek // In Life in the Frozen State / B. J. Fuller, N. Lane, E. E. Benson. London, New York, Washington: CRS Press, 2004. - P.483 - 504.

242. Srivastava P.K. Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-Peptide complexes / P.K. Srivastava // Curr. Oncol. Rep. 2005. - Vol. 7, №2.-P. 104-108.

243. Storage of macrophages at -196 degrees C. / B. Lukomska et al. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1978. - Vol. 26, №1. -P. 417-422.

244. Taylor M. J. Function of lymphocytes and macrophages after cryopreservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity / M. J.Taylor, H. L. Bank // Cryobiology. 1988. -Vol. 25, №1.-P. 1-17.

245. The sre-family protein tyrosine kinase p59hck is located on the secretory granules towards the phagosome during cell activation / H. Mohn et al. // Biochem. J. 1995. -V. 309.№2. P.657-668.

246. Vamvakas E.C. Meta-analysis of clinical studies of the efficacy of granulocyte transfusions in the treatment of bacterial sepsis / E.C. Vamvakas, A. A. Pineda // J. Clin. Apheresis. 1996. - Vol. 11. - P. 1-9.

247. Venkataraman M. Effects of cryopreservation on the mononuclear cells of patients with lung cancer and normal controls / M.Venkataraman, M.P. Westerman// Cryobiology. 1987. - Vol. 24, №2. - P. 103-111.

248. Weiner R.S. Functional integrity of cryopreserved human monocytes R. S. Weiner, S. J. Normann // J. Natl. Cancer. Inst. 1981. - Vol. 66, №2. - P. 255-260.

249. Zhang Q. Cryopreservation of leucocytes of channel catfish for subsequent cytogenetic analysis / Q. Zhang, T.R.Tiersch // J. Fish. Biol. 1995. - P. 10161025.

250. Список работ, опубликованных по теме диссертации1. Статьи в журналах:

251. Степанова Е.С. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу (-70°С) / Т.В.Туманова,

252. О.Н.Деветьярова, О.О.Щеглова, Е.С.Степанова, С.В.Утемов, Д.А.Карпов // Физиология и медицина. Вестник молодых ученых: Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей — СПб, 2005. — С. 122. П.л. 0,1 (авт. 50%)

253. Пущино, 28-30 октября 2008. с.117-118. П.л. 0,1 (авт. неделимо) Патент:

Информация о работе

Степанова, Евгения Сергеевна
кандидата биологических наук
Сыктывкар, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы