Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов

Тимохина, Татьяна Харитоновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов"

На правах рукописи

Тимохина Татьяна Харитоновна

ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I ¡18'АВГИИ

Оренбург - 2011

4852259

Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрОРАН

Научный консультант:

Член-корреспондент РАН, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Оренбургская государственная медицинская академия

Чайиикова Ирина Николаевна

Доктор медицинских наук, профессор Тюменская государственная медицинская академия

Жданова Екатерина Васильевна

Заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор Башкирский государственный медицинский университет

Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «Л$у> eewTjlTh\ 2011 г. в/А. часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03; при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: org-ma@esoo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА Автореферат разослан « » 2011 г., автореферат и

текст объявления размещены на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии в сети Интернет « // » ию/; 2011 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

На современном этапе уделяется большое внимание изучению закономерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных организмов во времени, что является таким же важным свойством живой системы, как и их пространственное строение. Временная организация биологической системы определяется как совокупность упорядоченных изменений во времени, в том числе в виде биологических ритмов, ее структур и функций, иерархически взаимодействующих и согласованных между собой и с колебаниями условий внешней среды. Поэтому жизнедеятельность организмов, функционирование органов и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется закону биологической структурно-функциональной временной дискретности (Агаджанян H.A. с соавт, 1998; Комаров Ф.И. с со-авт., 2000; Романов Ю.А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).

Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабильно выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уровнях организации эукариот, не вызывает сомнений (Aschoff J., 1960; Dunlap J.C., 1999). Очевидно, что ультрадианные и инфрадиан-ные составляющие являются неотъемлемыми в структуре биологических ритмов прокариот. Однако, результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А.,1980; Загускин С.Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et. al., 2005; Soriano M.I. et. al., 2010).

В изучении и формировании представлений о пространственно-временной организации используют системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить механизмы ее регуляции (Губин Г.Д., 2000; Романов Ю.А., 2002).

необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени (AschofF J., 1984). С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г.Д. с соавт. 2000).

К сожалению, отсутствуют сведения о суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств госпитальных изолятов микроорганизмов. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики, что могло бы иметь значение для клинической практики. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноструктуры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микробиоты. Не определена пространственно-временная организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном уровне, что имеет важное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. Поставленные выше вопросы требуют своего разрешения.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - выявить особенности временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и ее изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить суточную динамику пролиферативной, протеазной, ката-лазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцимной активности госпитальных изолятов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.

2. Исследовать чувствительность госпитальных изолятов S. aureus и Р. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.

3. Изучить изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время суток.

4. Охарактеризовать на популяционном уровне фазово-амплитудную стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa для определения их временной организации.

Новизна исследования Впервые проведены многофакторные исследования и представлен комплексный анализ особенностей хроноинфраструктуры биологических свойств популяций патогенных и условно-патогенных госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa в спектре ритмов высокой и средней частоты.

Посредством впервые примененного метода косинор-анализа, адаптированного к микробиологическим исследованиям, выявлен спектральный состав ритмов в популяциях изучаемых прокариот и сформировано представление о временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009 г. Бюл. № 4), что отражает стратегию распределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.

Доказано наличие как ультрадианных гармоник, так и циркадиан-ных составляющих ритмов биологических свойств патогенных прокариот. У госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa обнаружены в основном ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенности. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позво-

лили разработать способ дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28) и С. albicans (патент РФ на изобретение № 2319747 от 20.03.2008 г. Бюл. № 8) от музейных штаммов.

Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным препаратам на модели музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus и P. aeruginosa. Выявлены периоды резистентности к антибиотикам у музейных (антибиотикочувствительных) штаммов и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.

Выявлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на суточную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и P. aeruginosa (патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006г. Бюл. № 28). Изменение хроноинфраструктуры их ритмов - свидетельство адаптационных возможностей микроорганизмов к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных ритмометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.

Экспериментально продемонстрировано влияние экзометаболитов микробов-ассоциантов на суточную динамику показателей физиологической активности патогенов, обусловливающее десинхронизацию их ритмов.

Предложенный методический подход к изучению биологических свойств может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий (акт внедрения № 03.1/3068 от 22.12.2010 г.), а также использован в учебно-педагогическом процессе кафедр микробиологии и биологии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03.1/2842 от 16.11.2010 г; № 03.1/2884 от 22.11.2010 г.).

Научно-практическая значимость

Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации проявления биологи-

ческих свойств, как на уровне популяции, так и на уровне ассоциативных взаимоотношений прокариот. Выявленные биоритмы пролифера-тивной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, пленкообразующей и антилизоцимной активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa, их лабильность под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, последовательность и синхронность проявления в суточной динамике расширяют теоретические представления о биологии патогенных прокариот, их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.

Совокупность полученных данных о циркадианных и ультрадиан-ных ритмах биологических свойств возбудителей позволяет обосновать положение о временной организации изучаемых патогенов и может быть использовано не только при определении различных биологических функций микроорганизмов, но и при обосновании их адаптивных реакций. Временная организация биологических свойств возбудителей инфекций, представляющая последовательность упорядоченных во времени изменений биоритмов, взаимодействующих и согласованных между собой под воздействием биотических и абиотических факторов, отражает адаптационные возможности патогенов и служит методическим ключом к изучению механизмов их регуляции.

Практическое значение исследований определяется разработкой хронобиологического метода изучения пролиферативной активности S. aureus, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного показателя возбудителей. Хронобиологические исследования позволили выявить различные периоды активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и их чувствительность к антибиотикам в течение суток, что представляет интерес для разработки рациональных антимикробных мероприятий.

Положения, выносимые на защиту: 1. Физиологические функции госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов имеют ультрадианную и циркадиан-

ную ритмичность, модифицирующуюся под действием биотических и абиотических факторов среды.

2. Амплитудно-фазовая оценка суточных ритмов биологических функций госпитальных изолятов и музейных штаммов - объективная индивидуальная характеристика патогенов.

3. Временная организация биологических свойств возбудителей госпитальных инфекций, представляющая совокупность упорядоченных изменений во времени биологических ритмов, взаимодействующих и согласованных между собой, как и изменения их спектрального состава под воздействием ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов - отражение адаптационных возможностей патогенов и методический ключ изучения механизмов их регуляции.

4. Использование метода косинор-анализа в изучении временной организации патогенов раскрывает стратегию распределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006); пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва 2007); научной сессии, посвященной 10-летию ЮжноУральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука - здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии (Санкт-Петербург, 2008); совместном заседании Бюро отделения профилактической медицины Российской академии медицинских наук и президиума Южно-Уральского научного центра РАМН «Профилактика профессиональных, экологически обусловленных и инфекционных заболеваний в Южно-Уральском регионе» (Челябинск, 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; на XVIII Международной научной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 4 патента на изобретения и свидетельство на программу для ЭВМ.

Объем и структура диссертационной работы Диссертация изложена на 251 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий в себя 175 отечественных и 121 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 50 таблицами и 69 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Для исследования биоритмов пролиферативной активности, факторов патогенности, персистенции и чувствительности бактерий к антибиотикам были использованы 11 моно- и ассоциированных изолятов (S. aureus, Е. coli и P. aeruginosa), выделенных из клинического материала раневого отделяемого пациентов ожогового отделения, гнойной хирургии/реанимации ГЛГГУ ТОКБ г. Тюмени и 7 музейных штаммов (S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa и С. albicans), полученных из американской коллекции типовых культур (АТСС) и государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени JI.A. Тарасевича. Выделение и идентификацию возбудителей проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Изоляты S. aureus, Е. coli и P. aeruginosa, выделенные из клинического материала, обладали полиантибио-тикорезистентностью.

Биоритмы пролиферативной активности S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa изучали многократно по разработанной нами методике проведения биоритмологического эксперимента и обработке данных, учитывающих особенности работы с микроорганизмами. Пролифератив-ная активность оценивалась по общему микробному числу (ОМЧ). Для исследований были получены 12- часовые культуры, что соответствовало началу стационарной фазы развития бактерий. Исследования проводили в течение суток с 3-часовым интервалом, начиная с 08.00 часов (патент РФ на изобретение «Способ диагностики госпитальных штаммов» № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

У микроорганизмов были изучены биологические свойства, включающие плазмокоагулазную (Меньшиков В.В., 2003), протеазную (Нетрусов А.И., 2005), каталазную (Бухарин О.В. с соавт., 2000), гемолитическую (Бухарин О.В. с соавт., 2006), антилизоцимную -АЛА (Бухарин О.В. с соавт., 1999), биопленкообразующую - БПО (OToole G., 2000) активности, а также изучали чувствительность к антибиотикам исследуемых культур с использованием диагностических панелей MicroScan «Pos Combo Type 20» и MicroScan «Neg Combo Type 31» фирмы Dade Behring (USA) на бактериологическом анализаторе AutoScan-4 (Siemens, Германия).

Влияние антибиотиков на биоритмы пролиферативной активности изучаемых микроорганизмов определяли по стандартной методике серийных разведений, используя МПК препаратов (Меньшиков В.В., 2003; Кириллов Д.А., 2004).

Исследование биологических свойств изучаемых микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов микробов-ассоциантов в питательный бульон (Елагина H.H., 2001; Перунова Н.Б., 2003).

Результаты исследований получены на основе анализа суточной динамики биологических свойств госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa.

Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2003. Определяли M - среднее арифметическое, 8 - среднеквадратичное отклонение, m - средняя ошибка среднего арифметического, данные представляли по форме М±гп или М±8. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по х,2) использовали t - критерий Стьюдента.

При определении регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов и антимикробных препаратов, а также сравнении музейных и госпитальных изолятов бактерий достоверность различия сравниваемых выборок определяли непараметрическими методами статистической обработки: критерий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок, критерий Манна-Уитни (Т) - для несвязанных выборок. Анализируемые различия считали достоверными при р<0,05. Для установления связи между параметрами использовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции), относящийся к категории непараметрических, что позволило отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых признаков (Гланц С., 1999)

Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцениваемой функции 8-ми измерений в сутки с 3-5-ти кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности р<0,05 (Nelson W. et al., 1979). Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т=8, Т=12 и Т=24 часа: МЕЗОР (М) - среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (А) - расстояние от экстремума до МЕЗОРа и акрофаза (ф) -момент времени ожидаемого экстремума функции.

Для оценки амплитудно-фазовых характеристик экспериментальных серий была разработана и применена автоматизированная система

«Косинор-анализ», адаптированная к микробиологическим исследованиям. С помощью прикладной графической программы «Групповой косинор анализ» построены доверительные эллипсы (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009 г. Бюл. № 4).

Результаты исследований и их обсуждение На первом этапе исследований выявлено, что пролиферативная активность госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa имела суточную динамику, которая подвержена активной регуляции под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.

Ритмометрический анализ временных параметров пролифератив-ной активности S. aureus показал, что для госпитальных изолятов S. aureus 2888, 2891 и 2305 характерна ультрадианная ритмичность. В доступном анализу спектре основными достоверными гармониками были ритмы с Т=12 и 8 часам, которые различались по своему удельному вкладу и основным параметрам - амплитудам и фазовому положению в суточном цикле (рис. 1).

Для S. aureus 2305, 2891 характерны 12-часовые периоды ритма пролиферативной активности, вклады которых в спектральном составе равны 44,0 % и 17,8 %, амплитуды - 31,4±3,9 КОЕ/мл и 25,4±8,9 КОЕ/мл, соответственно, (р<0,05). Для S. aureus 2888 достоверным был 8-часовой ритм с вкладом 74,6 %, амплитудой 41,8±16,4 КОЕ/мл (р<0,05). Выявление ультрадианного ритма с различными гармониками в биологических исследованиях предполагает проявление нескольких акрофаз в течение суток. С учетом этого, акрофазы пролиферативной активности у S. aureus 2891 регистрировались в 08.09 и 20.00 часов, у S. aureus 2305 - в 09.16 и 21.00 часов, а у S. aureus 2888 - в 05.00; 14.00 и 23.00 часа.

% 100

I 80

! 40

2305 2888 2891 25923 209 И- 24-часовой ритм а- 12-часовойритм

Рис. 1 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus

Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2305, 2888, 2891) и музейные штаммы (25923, 209); по оси ординат - вклад ритмов, %; * - ритм достоверен (р <0,05)

Ритмометрический анализ выявил у музейных штаммов S. aureus 25923 и 209-Р ведущий циркадианный (околосуточный) ритм пролиферативной активности с вкладом 56,1 % и 38,4 %, амплитудой 39,8±5,9 КОЕ/мл и 37,8±7,9 КОЕ/мл, соответственно, (р<0,05). Акро-фазы обоих штаммов регистрировались около 22.30 часов.

Таким образом, пролиферативная активность музейных штаммов S. aureus имела достоверные циркадианные ритмы с высокой амплитудой и акрофазой в одно и то же время, что свидетельствует о стабильности их свойств.

У госпитальных изолятов ведущим являлся ультрадианный ритм. По всей видимости, ультрадианные ритмы, как ритмы с высокочастотными гармониками, для госпитальных изолятов наиболее значимы при адаптации к меняющимся условиям макроорганизма. Преобладание тех или иных гармоник в хроноинфраструктуре явно выражено и, можно сказать, является типовым признаком изученных временных рядов пролиферативной активности данных штаммов.

Различия ритмометрических параметров пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов S. aureus, включая вклады циркадианных, ультрадианных ритмов и амплитуды, имеют значение для дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006г. Бюл. № 28).

При оценке временных параметров пролиферативной активности у госпитальных изолятов Е. coli (2898, 2364, 2909, 2336) было определено, что ведущими ритмами являлись ультрадианные, а у музейных штаммов Е. coli (35218 и 25922) - циркадианные. Однако, у госпитального изолята 2898 помимо ультрадианного ритма (вклад 30,0 %) дополнительно регистрировался достоверный циркадианный ритм (вклад 47,1 %), а у музейного штамма 35218 дополнительно проявлялся ульт-радианный ритм равнозначный по вкладу циркадианному ритму, вклад их составлял 20,8 % и 21,8 %, соответственно (рис. 2).

Акрофазы ультрадианных ритмов госпитальных изолятов Е. coli регистрировались в дневной и ночной периоды суток. У музейных штаммов ведущие циркадианные ритмы пролиферативной активности максимально проявлялись в вечернее время суток.

Ритмометрический анализ пролиферативной активности Р. aeruginosa выявил у госпитальных изолятов и музейных штаммов ведущий ультрадианный ритм (р<0,05). Однако, в спектральном составе биоритмов Р. aeruginosa 2898, 2345 и 9027 отмечался и достоверный циркадианный ритм (рис. 3).

Ультрадианные ритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов Р. aeruginosa 2364 и 2345 имели стабильные акрофазы в 11.00 и 23.00 часа, у изолятов Р. aeruginosa 2889 и 2898 - в 08.00 и 20.00 часов. У музейных штаммов Р. aeruginosa (27853 и 9027) акрофазы ультрадианных ритмов пролиферативной активности приходились на 03.00 и 17.00 часов.

Таким образом, интегральная оценка хроноинфраструктуры пролиферативной активности госпитальных изолятов и. музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa позволяет сделать ряд обобщений.

24-часовой ритм □- 12-часовой ритм

Рис. 2. Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов Е. coli. Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2898, 2364, 2909, 2336) и музейные штаммы (35218, 25922); по оси ординат - вклад ритмов, % ;* - ритм достоверен (р <0,05)

24-часовой ритм О- 12-часовой ритм Рис. 3 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов Р. aeruginosa Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2364, 2889, 2898, 2345) и музейные штаммы (27853, 9027); по оси ординат - вклад ритмов, %; * - ритм достоверен (р <0,05)

У госпитальных микроорганизмов ведущим ритмом являлся ультради-анный. По всей видимости, этот ритм с более высокими гармониками имеет важное значение для госпитальных изолятов в плане их адаптации к меняющимся условиям биотической и абиотической среды. В то же время, наличие циркадианных ритмов в спектральном составе прокариот одновременно с ультрадианными гармониками также усиливает адаптивные возможности популяции (следует учесть, что для макроорганизма циркадианный ритм - ведущий и является единственным генетически обусловленным в рассматриваемом нами спектральном диапазоне). Поэтому, появление околосуточных ритмов, с одной стороны, может быть обусловлено влиянием макроорганизма, как основной среды обитания для S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa. С другой стороны, обсуждается вопрос о циркадианности в проявлении ряда физиологических функций бактерий и формируется доказательная база, объясняющая наличие у прокариот генов, ответственных за околосуточные ритмы (Павлович Н.В. с соавт., 1991; Rogers L.A. et. al., 1930; Dvornyk V. et. al., 2005; Soriano M.I. et. al., 2010).

Вместе с тем, выявлено, что микроорганизмы, выделенные в ассоциациях из ожоговой раны, проявляли сходные биологические ритмы. Так, для Е. coli 2364 и Р. aeruginosa 2364 были характерны 12-часовые ритмы пролиферативной активности с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа. Для Е. coli 2898 и Р. aeruginosa 2898 характерны как 12-, так 24-часовые ритмы (р<0,05) и совпадение акрофаз. Вероятно, микроорганизмы одного биотопа подвержены одинаковым воздействиям со стороны окружающей среды (макроорганизма, ассоциативной мик-робиоты, абиотических факторов и др.), что и объясняет сходство их хронобиологических характеристик.

Для подтверждения вышесказанного, было изучено влияние микробных экзометаболитов на ритмические процессы физиологической активности биологических свойств возбудителей в бактериально - грибковых ассоциациях (рис. 4, 5).

S. aureus 2888

E. coli 2364

1 - контроль

2 — под действием экэометаболитов Е. coli

1 - контроль

2 — под действием экзометаболитов S. aureus

3 - под действием зкзометаболтов P. aeruginosa } _ пад дейстаИем экзометаболитовР. aeruginosa

4 - под действием экзометаоолтов С. albicans

4 - под действием экзомета оолит ов С. albicans

P. aeruginosa2364

1 - контроль; 2 — под действием экзометаболитовВ. aureus: 3 - под действием экзометаболитов Е. coli; 4 - под действиемэкзометаболитов С. albicans

Рис. 4 - Амплитудно-фазовая характеристика стабильности суточных ритмов пролиферативной активности возбудителей под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов.

Примечание: местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства — амплитуд и фаз) отражают временную область проявления ультрадианного ритма по результатам популяционного косинор-анализа. По окружности -время суток, градусная мера суточного цикла, 24 часа = 360°. По радиусу от центра - единицы измерения амплитуды - КОЕ/мл

Контроль

ВоисПсгвлр

МСГаООЛИГОВ

S *ur«is

BourAcmir 8о»де-йС1»нр

мпабозяяа шавштоа ? aeragutou С »Ibiraju

80 70 60

I I

Контроль Воздействие BoajfftoiBHc Воэдевсткяе мздбеяихм «етасслнюи метаболию» S ашещ £ toll С ¿beam

Рис. 5 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus (А), Е. coli (Б), Р. aeruginosa (В) под влиянием экзометаболи-тов микробов-ассоциантов.

Примечание: по оси абсцисс - возбудитель; по оси ординат - вклад ритмов, циркадианный ритм; - ультрадианный 12- часовой

ритм; - ультрадианный 8- часовой ритм; * - ритм достоверен (р<0.05).

Экспериментально доказано, что на хроноинфраструктуру проли-феративной активности S. aureus 2888 оказывали влияние метаболиты Р. aeruginosa и Е. coli, которые достоверно снижали мезор (W=30,0; р < 0,05), амплитуду, но не изменяли акрофазу. Вклад ультрадианного 12-часового ритма уменьшился в 3,9 раза, но увеличилась доля высокочастотных ультрадианных 8-часовых гармоник.

На пролиферативную активность Е. coli 2364 более активное воздействие оказывали экзометаболиты S. aureus и Р. aeruginosa. В результате этого произошло нивелирование циркадианного ритма и появление дополнительной гармоники 8-часового ультрадианного ритма (вклады ритмов 34,3 %, 29,9 %). Мезор и амплитуда не изменялись по сравнению с контролем (W=6,0; р>0,05), однако акрофаза смещалась с 10.00 на 05.00 часов.

Экзометаболиты S. aureus, Е. coli, С. albicans стимулировали появление достоверного циркадианного ритма пролиферативной активности Р. aeruginosa 2364 (р<0,05), акрофаза изучаемого показателя смещалась с 01.38 часа на 11.00 часов, мезор и амплитуда достоверных различий не дали (W= -10,0; р > 0,05).

Таким образом, результаты исследования позволили выявить, что у S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa сохранялись ультрадианные ритмы пролиферативной активности под воздействием экзометаболитов мик-робов-ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя. Появление дополнительных гармоник, на наш взгляд, способствует усилению адаптивных возможностей популяции. Выявленный эффект изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами ассоциантов отражает напряженность биологической системы, которая, по всей видимости, неизбежна в процессе формирования межмикробных взаимоотношений.

О.Н., 2002; Бухарин О.В. с соавт., 2002; Иванова Е.Б., 2004), мы предприняли попытку изучить влияние антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus и P. aeruginosa. Под воздействием суббактерио-статических концентраций гентамицина у музейного штамма S. aureus (гентамицинчувствительный) изменились ритмометрические параметры пролиферативной активности: уменьшился вклад циркадианного ритма (в 2,5 раза), появился ультрадианный ритм с акрофазой в 14.00 часов (вклад 16,1 %), снизились мезор (в 8 раз) и амплитуда (в 5 раз), т.е. наблюдалась десинхронизация ритма. Изменения биоритмов пролиферативной активности музейного штамма S. aureus свидетельствуют о снижении адаптационных возможностей микроба и, возможно, о необратимых изменениях, в дальнейшем приводящих культуру к гибели.

У госпитального изолята S. aureus (гентамицинрезистентного) достоверных изменений при таком же режиме воздействия гентамицином не выявлено (р>0,05). Отсутствие изменений может быть использовано для дифференциации госпитальных изолятов от музейных штаммов (Патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

Под действием суббактериостатических концентраций ванкоми-цина на пролиферативную активность S. aureus (все штаммы ванкоми-цинчувствительные) было установлено изменение ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34; -30, соответственно, р<0,05). Увеличивалось среднесуточное значение пролиферативной активности почти в 3 раза (с 107,0±3,2 КОЕ/мл до 298,5±7,4 КОЕ/мл и с 126,4±2,3 КОЕ/мл до 354,5±3,8 КОЕ/мл, соответственно). У музейного штамма появлялся ультрадианный ритм, акрофаза пролиферативной активности музейного штамма смещалась с ночного периода на утро, у госпитального изолята акрофаза роста отмечалась в 14.00 и 20.00 часов, в отличие от контроля с максимумами в 5.00; 14.00 и 23.00 часа. У обоих штаммов зарегистрировано сильное увеличение амплитуды циркадианного ритма (у музейного - с 26,6 КОЕ/мл до 87,6 КОЕ/мл; у госпитального - с 14,2

КОЕ/мл до 130,9 КОЕ/мл), что свидетельствовало о значительном адаптивном напряжении после стрессового воздействия ванкомицина.

У музейного штамма и госпитального изолята P. aeruginosa также было выявлено изменение ритмометрических показателей проли-феративной активности под влиянием суббактериостатических концентраций ципрофлоксацина (W =28,0 и 36,0, соответственно; р<0,05). Уменьшилось среднесуточное значение показателя у музейного штамма по сравнению с контролем в 3 раза (с 143,4±4,7 КОЕ/мл до 45,9±9,1 КОЕ/мл) и у госпитального - в 7 раз (с 211,9±14,2 КОЕ/мл до 30,6±1,7 КОЕ/мл). Амплитуды ритмов под воздействием антибиотика изменялись значительно. У музейного штамма появился дополнительный циркадианный ритм пролиферативной активности (вклад - 46,0 %) и акрофаза сместилась с 02.00 часов на 11.00 часов. У госпитального изолята произошло нивелирование ультрадианного ритма, но увеличился вклад циркадианного ритма на 28 %, и акрофаза сместилась с 14.08 часов на 17.52 часов. Изменения, зарегистрированные у обоих штаммов P. aeruginosa под воздействием ципрофлоксацина также свидетельствовали об адаптивном напряжении, что, в конечном итоге, может приводить к десинхронозу и гибели патогенов. Вышеизложенные результаты свидетельствуют об эффективности воздействия на антибиотикочувствительные штаммы патогенов суббактериостатических концентраций антибиотиков, что может быть рассмотрено как один из подходов к рациональной антимикробной терапии.

На следующем этапе работы была изучена суточная динамика функциональных показателей, отражающих патогенные свойства S. aureus, P. aeruginosa и Е. coli (плазмокоагулазная, протеазная, каталаз-ная, гемолитическая активность) и влияние на нее экзометаболитов ассоциативной микробиоты.

У музейного штамма S. aureus 25923 обнаружены циркадианные и ультрадианные ритмы протеазной, каталазной и гемолитической активности с акрофазами, соответственно, в 05.00; 11.00 и 23.00 часа. Максимальная активность изучаемых патогенных факторов равнялась 4,1±0,2 мг/мин-мл; 6,2±0,2 мкмоль/мин и 20,1±0,2%, соответственно.

Протеазная активность Каталазная активность Гемолитическая активность

— — _ —

S. aureus

............. ||Г

Е. coli

_ ......... _ ■ - .

С * ^

™ -,JS=~

Р. aeruginosa

Рис. 6 - Амплитудно-фазовая характеристика патогенных свойств госпитальных изолятов под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты.

Примечание: 1-контроль; S. aureus +метаболиты: 2-Е. coli, 3 - Р. aeruginosa, 4 - С. albicans; Е. coli+метаболиты: 2 - S. aureus, 3 - Р. aeruginosa, 4 - С. albicans; Р. aeruginosa +метаболиты: 2 - S. aureus, 3 -Е. coli, 4 - С. albicans

Госпитальный штамм S. aureus 2888 проявлял протеазную активность в циркадианном ритме, максимальные показатели активности фермента (0,74±0,1 мг/мин-мл) регистрировали в 21.30 нас (рис. 6). Среднесуточное значение показателя равнялось 0,4±0,1 мг/мин-мл, что было в 6,5 раз ниже среднесуточного значения протеазной активности музейного штамма (Т= 36,0; р<0,05).

Под воздействием экзометаболитов Е. coli количество фермента у госпитального изолята S. aureus 2888 увеличилось в 10 раз (W = -36,0; р<0,05) и в 4 раза - под влиянием экзометаболитов Р. aeruginosa (W = - 22,0; р<0,05); в спектральном составе появились ультрадианные ритмы.

Активность каталазы S. aureus 2888 проявлялась как в ультради-анных, так и в циркадианных ритмах, максимальные значения фермента (4,48±0,2 мкмоль/мин) выявляли в 03.52 часа, мезор равнялся 3,1±0,1 мкмоль/мин и не отличался от показателя музейного штамма (Т=58,0; р>0,05). Под воздействием экзометаболитов Р. aeruginosa и С. albicans мезор каталазной активности снизился в 1,7 раза (W = 28,0; р<0,05) и в 2,2 раза (W = 36,0; р<0,05), соответственно. Экзометаболи-ты Е. coli сместили акрофазу каталазной активности S. aureus на 11.00 часов, а экзометаболиты С. albicans - на 20.30 часов.

Для гемолитической активности S. aureus 2888 был характерен ведущий ультрадианный ритм с 8-часовым периодом, акрофазы ритма совпадали с пролиферативной активностью и были зафиксированы около 03.00; 11.00 и 19.00 часов. Среднесуточная активность показателя (4,7±0,6 %) в 3 раза ниже по сравнению с гемолитической активностью музейного штамма (Т=96,0; р<0,05). Под влиянием экзометаболитов Р. aeruginosa гемолитическая активность S. aureus увеличилась в 2,7 раза (W = - 36,0; р<0,05). Следует отметить, что хронобиологиче-ский подход позволил выявить динамику гемолитической активности у госпитального изолята S. aureus, типированного традиционным бактериологическим методом как негемолитический вариант, что открывает перспективы для выявления нестабильно экспрессируемых биологических свойств атипичных штаммов.

В результате проведенных исследований также обнаружено, что музейные штаммы S. aureus 25923 и 209-Р проявляли плазмокоагулаз-ную активность в циркадианном ритме с акрофазой в 11.00 часов, минимальная активность наблюдалась в вечерние и ночные часы (17.00 и 23.00 часа). У госпитальных изолятов S. aureus, напротив, отмечался ультрадианный ритм изучаемого показателя с акрофазами в 02.00 и 14.00 часов, однако они характеризовались более высокой плазмокоа-гулазной активностью, т.к. время коагуляции плазмы было достоверно меньше в сравнении с музейными штаммами (Т= 36,0; р<0,05).

У музейного штамма Е. coli 35218 выявлены: циркадианные ритмы протеазной и гемолитической активности с акрофазами в 07.52 и 17.00 часов и среднесуточными значениями - 0,19 ± 0,04 мг/мин-мл и 10,7±0,3 %, соответственно. Активность каталазы проявлялась в ультрадианном ритме, мезор равнялся 0,7±0,02 мкмоль/мин, акрофазы наблюдались в 08.04 и 20,00 часов, максимальная активность составляла 2,32± 0,01 мкмоль/мин.

У госпитального изолята Е. coli 2364 активность протеазы проявлялась также в циркадианном ритме с акрофазой в 00.20 часов. Под воздействием экзометаболитов S. aureus и С. albicans циркадианный ритм протеазной активности изменялся на ультрадианный ритм. Ак-рофаза смещалась на утреннее и вечернее время.

Ведущий ритм каталазной активности госпитального изолята Е. coli - ультрадианный (12-часовой). Среднесуточная активность (2,11±0,2 мкмоль/мин) в 2,6 раза выше активности музейного штамма, акрофаза регистрировалась в 10.48 часов. Под воздействием экзометаболитов 12-часовой ритм госпитального изолята сохранялся, но дополнительно формировался более высокочастотный 8-часовой ритм. Среднесуточная активность, амплитуда и акрофаза не изменялись под воздействием бактериальных метаболитов. Однако, метаболиты С. albicans снижали среднесуточную активность фермента в 1,5 раза (W = 24,0; р<0,05) и способствовали появлению дополнительно циркадиан-ного ритма.

Гемолитическая активность госпитального изолята Е. coli до и после воздействия экзометаболитов проявлялась в цирка-, и ультрадиан-ном ритмах. Среднесуточный уровень активности гемолизинов (72,1 ± 2,02 %) снижался под воздействием экзометаболитов Р. aeruginosa на 48,6 % (W = 36,0; р<0,05) и на 64 % (W = 36,0; р<0,05) под воздействием экзометаболитов С. albicans. Регистрировалось смещение акрофазы гемолитической активности под влиянием всех изучаемых экзометаболитов.

У музейного штамма Р. aeruginosa 27853 активность протеазы и каталазы проявлялась в циркадианном ритме с акрофазами в 23.32 и 21.04 час, с среднесуточными значениями ферментов - 0,17±0,03 мг/мин-мл и 1,64 ± 0,05 мкмоль/мин. Для гемолитической активности музейного штамма Р. aeruginosa характерен ультрадианный ритм с ак-рофазой в 11.48 часов и среднесуточным значением - 5,08 ±0,21 %.

У госпитального изолята Р. aeruginosa 2364 активность протеазы определялась в циркадианном ритме, как и у S. aureus и Е. coli. Среднесуточные показатели активности фермента находились на уровне 1,16 ± 0,19 мг/мин-мл и не отличались от показателей музейных штаммов. Наиболее активное воздействие на суточную динамику протеазы оказывали метаболиты Е. coli, которые в 2,5 раза повышали ее активность (W = - 36,0; р<0,05). Акрофаза (22.48 часа) не изменялась под воздействием метаболитов. Примечателен факт сходства ритмов активности протеазы Р. aeruginosa и Е. coli, выделенных из одного биотопа. Эти возбудители проявляли протеазную активность в едином циркадианном ритме. По всей видимости, согласованность ритмов по этим позициям в условиях пребывания в одном биотопе для них биологически обоснована.

Каталазная активность Р. aeruginosa характеризовалась циркади-анным ритмом с акрофазой в 07.00 часов. Среднесуточный уровень фермента (4,33 ± 0,4 мкмоль/мин) в 2,5 раза выше уровня музейного штамма. Под воздействием метаболитов Е. coli и С. albicans активность фермента увеличилась в 1,7 раза (W = - 36,0; р<0,05) и в 1,3 раза (W = - 34,0; р<0,05), соответственно, а акрофаза сместилась на ночной период суток. В дополнение к ведущему циркадианному ритму под

воздействием метаболитов S. aureus и Е. coli появлялись ультрадиан-ные 8-часовые гармоники.

Гемолитическая активность Р. aeruginosa проявлялась в циркади-анном ритме, вклад которого в спектре ритмов был явно доминирующим (76,3 %).

Среднесуточная активность соответствовала 13,58 ± 0,6%. Акро-фазу регистрировали в 01.20 час. Под воздействием экзометаболитов Е. coli гемолитическая активность Р. aeruginosa возрастала на 8,1 % и на 24,9 % - под воздействием экзометаболитов С. albicans (W = - 30,0; р<0,05), а также появлялся ультрадианный ритм данного свойства.

Таким образом, госпитальные изоляты изучаемых микроорганизмов проявляли относительную стабильность факторов патогенности (протеазная, каталазная, гемолитическая активность) под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов, кроме экзометаболитов С. albicans, которые десинхронизировали биологические ритмы патогенов. На музейные штаммы экзометаболиты всех микробов-ассоциантов оказывали модулирующее воздействие, что отражает их лабильность в течение суток.

Для выявления согласованности различных функций S. aureus, Р. aeruginosa и Е. coli, обеспечивающих их приспособление к различным условиям обитания мы провели корреляционный анализ между про-лиферативной активностью и патогенными характеристиками. У музейного штамма S. aureus показатели пролиферативной активности положительно коррелировали с гемолитической активностью (г = 0,38; р<0,05), но отрицательно - с каталазной активностью (г = - 0,58; р<0,05) и протеазной активностью (г = - 0,60; р<0,05). Иначе говоря, в период минимальной пролиферативной активности стафилококков продукция ферментов (протеазы и каталазы) была максимально выражена, что может способствовать выживанию патогенов в организме человека. С увеличением пролиферативной активности максимальных значений достигала продукция повреждающих факторов - гемолизинов. У госпитального изолята S. aureus выявлена положительная корреляция пролиферативной активности с каталазной активностью (г = 0,57; р<0,05). С протеазной и гемолитической активностью достовер-

ной корреляции нет (г = - 0,07; р>0,05 и г = - 0,3; р>0,05, соответственно), но в период минимальной пролиферативной активности наблюдали увеличение продукции протеазы и гемолизинов.

У музейного штамма Е. coli обнаружена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеолитической активностью (г = - 0,5; р<0,05) и отсутствие связи с каталазной и гемолитической активностью (г = - 0,1; р>0,05 и г = - 0,1; р>0,05, соответственно). У госпитального изолята Е. coli выявлена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеазной и каталазной активностью (г = - 0,4; р<0,05 и г = - 0,6; р<0,05, соответственно) и сильная прямая связь с гемолитической активностью (г = 0,7; р<0,05).

У музейного штамма Р. aeruginosa не обнаружена достоверная корреляция между пролиферативной активностью и факторами пато-генности (р>0,05). У госпитального изолята выявлена корреляция только с гемолитической активностью (г = - 0,4; р>0,05).

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что при интенсивном функционировании той или иной системы активность многих других систем снижается: в одной и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продукции других. Это означает, что организму свойственна способность экономии материальных и энергетических ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определенный временной период (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф.И., 2000).

Проведенные исследования суточной динамики чувствительности S. aureus к некоторым антибиотикам позволили обнаружить различные МПК (минимальная подавляющая концентрация) антибиотиков в отношении музейного штамма S. aureus 25923. Максимальная чувствительность к большинству изученных антибиотиков (амоксиклав, ими-пенем, ванкомицин, гентамицин, рифампицин, тетрациклин, клинда-мицин) зарегистрирована в раннее утреннее время - 05.00 часов и вечернее время - 20.00; 23.00 часа. Были выявлены периоды повышения МПК антибиотиков и приближение этих значений к показателям резистентности в утреннее и дневное время - 08.00; 11.00; 14.00 часов.

У госпитального изолята S. aureus 2888 была отмечена динамика чувствительности только к следующим антибиотикам: линезолид, це-фапотин, гатифлоксацин, моксифлоксацин, синерцид. МПК линезоли-да, цефалотина, выявлена в 02.00 и 05.00 часов, МПК моксифлоксаци-на наблюдалась в 05.00; 20.00 и 23.00 часа, МПК гатифлоксацина - на всем протяжении суточного ритма, кроме 02.00 и 08.00 часов, МПК синерцида выявлена в 02.00; 05.00 и 23.00 часа. Следовательно, у госпитального изолята, напротив, были отмечены периоды чувствительности к антибиотикам в течение суток, но только к ванкомицину на всем протяжении суточного периода возбудитель проявлял стабильную чувствительность.

Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток, что может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рационального применения антимикробных препаратов.

Биологические ритмы персистентных свойств S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa изучали по их способности формировать биопленки (биоплёнкообразующая способность - БПО), проявлять антилизоцимную активность (AJIA), а также изучали влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на суточную динамику этих факторов.

Способность к образованию биопленок S. aureus характеризовалась циркадианным (вклад ритма - 46,6 %, акрофаза - в 17.16 часов) и ультрадианным 8-часовым ритмами (вклад ритма - 46,9 %, акрофазы -в 06.00, 14.00 и 23.00 часов), мезор равнялся 0,33±0,01 ед. OD, амплитуды ритмов были одинаковы (0,08±0,02 ед. OD). Под влиянием экзометаболитов Е. coli, Р. aeruginosa, С. albicans сохранялся только цирка-дианный ритм, а экзометаболиты Р. aeruginosa снижали и амплитуду ритма в 2 раза. Изменение мезора и акрофазы не отмечалось.

Ведущим ритмом БПО активности Е. coli являлся ультрадианный 12-часовой ритм, с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа, мезором -0,28±0,01 ед. OD и амплитудой - 0,05±0,01 ед. OD. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, Р. aeruginosa появлялись дополнительно 8-

часовые гармоники с акрофазой в раннее утреннее время (с 04.00 -05.00 часов).

Ритм БПО активности P. aeruginosa характеризовался ультрадиан-ными 8-часовыми гармониками, мезор равнялся 0,34±0,01ед. OD, амплитуда - 0,03±0,01 ед. OD, акрофаза регистрировалась около 06.00, 14.00 и 23.00 часов. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, Е. coli, С. albicans в спектральном составе появился дополнительно стабильный циркадианный ритм с возрастанием амплитуды в 2-3 раза. В то же время, экзометаболиты С. albicans нивелировали ультрадианный ритм и достоверно снижали мезор (W = 36,0; р<0,05). Акрофазы изучаемого показателя синхронизированы во времени и проявлялись у циркадиан-ного ритма около 19.00 часов, у ультрадианного - около 06.00, 14.00 и 23.00 часов.

Таким образом, анализ ритмометричесих показателей БПО активности S. aureus под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов выявил стабильность циркадианного ритма данного персистентного фактора возбудителя. Однако, на БПО активность Р. aeruginosa оказывали мощное воздействие экзометаболиты С. albicans. Сравнительный анализ позволил выявить только у Р. aeruginosa наличие отрицательной корреляции между пролиферативной активностью и способностью образовывать биопленки (г = - 0,67; р<0,05).

Изучение АЛА показало наличие в спектральном составе всех госпитальных изолятов циркадианного ритма с акрофазами в утреннее и дневное время. У музейных штаммов наблюдалась гетерогенность ритмов с преобладанием в спектре ультрадианных гармоник и регистрация акрофаз в различные периоды суток. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на AJIA возбудителей изучали на модели музейных штаммов. Под воздействием экзометаболитов у S. aureus появлялся достоверный циркадианный ритм, но амплитуда не изменялась. Однако под воздействием экзометаболитов Р. aeruginosa и С. albicans акрофаза с ночного периода суток смещалась на утреннее и дневное время. Мезор показателя увеличивался под влиянием экзометаболитов Е. coli (W = -24,0; р<0,05) и снижался под влиянием экзометаболитов С. albicans (W = 16,0; р<0,05).

Под влиянием экзометаболитов ультрадианные ритмы AJIA Е. coli изменялись на циркадианные, акрофазы которых регистрировались в вечернее и ночное время, амплитуда увеличивалась в 2-3 раза, а мезор снижался только при воздействии экзометаболитов С. albicans (W = 26,0; р<0,05).

Антилизоцимная активность P. aeruginosa характеризовалась гетерогенностью ритмов, однако под влиянием экзометаболитов микро-бов-ассоциантов ведущим оставался циркадианный ритм, а акрофаза, амплитуда и мезор оставались без изменения (р>0,05).

Таким образом, влияние экзометаболитов способствовало появлению у всех музейных штаммов возбудителей 24-часового ритма AJIA, что было свойственно только госпитальным изолятам. По всей видимости, это можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Матияш И.Н.,1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В.,1999). Из всех изучаемых микроорганизмов только для Е. coli были характерны изменения ритмометрических параметров антилизо-цимной активности, которые, вероятно, свидетельствовали также о напряжении механизмов адаптации и поиске биосистемой адекватной реакции на изменение условий функционирования.

Для выявления функциональной согласованности пролифератив-ной и антилизоцимной активности проведен корреляционный анализ, который показал обратную корреляцию у музейного штамма Е. coli (г = - 0,47; р<0,05) и прямую связь этих показателей у госпитального изолята P. aeruginosa (г = 0,44; р<0,05). У остальных возбудителей корреляционная зависимость не выявлена.

Следовательно, обнаруженные изменения биологических ритмов пролиферативной активности, патогенных и персистентных свойств (протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, антилизоцимной активности) изучаемых микроорганизмов под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, отражают адаптационные возможности патогенов, биологиче-

ские ритмы подстраиваются к новой среде обитания в целях максимальной возможности микроорганизма адаптироваться к окружающей среде путем синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами (Агаджанян H.A., 1998; Губин Г.Д., 1989; Смирнов В.М., 2002; Маркина В.В., Романов Ю.А., 2005).

Состояние временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa представлено иллюстрацией амплитудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбудителей (рис. 7).

У музейного штамма S. aureus в период минимальной пролифера-тивной активности - 06.00 - 13.00 часов продукция ферментов (про-теазы, катапазы, плазмокоагулазы) была максимально выражена. Небольшая площадь их эллипсов свидетельствует о значительном постоянстве основных параметров ритма. С увеличением пролиферативной активности - 18.30 - 21.30 часов максимальных значений достигала продукция факторов адгезии и вирулентности - биопленкообразующей и гемолитической активности. Показатель АЛА как фактор пер-систенции - ночного типа с акрофазой около 02.00 часов (с доверительным интервалом от 23.00 до 05.00 часов).

У госпитального изолята S. aureus зарегистрированы ультрадиан-ные ритмы изучаемых показателей в отличие от циркадианных ритмов музейных штаммов. Учитывая, что у госпитального изолята S. aureus активность физиологических функций проявлялась с 12-часовым периодом, можно отметить, что пролиферативная, каталазная, протеаз-ная и плазмокоагулазная активности относятся к ночному и дневному типам. AJIA и гемолитическая активность относятся к утреннему и вечернему типам ритмичности.

Временная организация биологических свойств грамнегативной микробиоты отличалась от таковой S. aureus. У музейного штамма Е. coli пролиферативная, гемолитическая и каталазная активности синхронизированы между собой и для них характерен дневной тип ритмичности. Их акрофазы отмечены соответственно в 14.30, 15.00 и

E. coli (госшпальный): Т=24 ч. Е. coli (музейный).Т=24 ч.

Р. aeruginosa (госпитальный), Т=24 ч. P. aeruginosa (музейный), Т=24 ч.

Рис. 7 - Сравнительная характеристика амплитудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбудителей

16.00 часов. Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы их акрофаз указывают на высокую стабильность параметров их циркадианных ритмов.

Акрофаза АЛА была смещена на вечерние часы с максимумом около 20.00 часов. Четкая синхронность АЛА прослеживалась с биопленкообразующей активностью. Акрофаза показателя протеазной активности имела утренний тип ритмичности с максимумом около 08.00 часов и доверительным интервалом в пределах ± 90 минут и находилась в полной противофазе к АЛА.

У госпитальных изолятов Е. coli показатели пролиферативной и гемолитической активности сохраняли те же фазовые характеристики, которые присущи музейному штамму, но стабильность их ритмов несколько слабее, о чем можно судить по большим площадям их доверительных эллипсов. Акрофазы каталазы и протеазы по сравнению с музейными штаммами смещались на вечерние часы, претерпевали фазовую инверсию по отношению друг к другу. Акрофаза АЛА госпитальных изолятов, напротив, сдвигалась в дневную область - 10.00 часов, тогда как у музейных штаммов пик активности регистрировался в вечерние часы. При этом в обоих случаях ритмы достаточно стабильны.

У музейных штаммов Р. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой и имели утренний тип ритмичности, их акрофазы приурочены, соответственно, к 09.00 и 07.00 часам. Показатели АЛА, биопленкообразующей, каталазной и протеазной активности также были синхронизированы между собой, но имели вечерне-ночной тип активности. Их акрофазы отмечались в 20.00 - 23.00 часа.

У госпитальных изолятов Р. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой, как и у музейных штаммов, но акрофазы регистрировались в ночное время (02.00 часа). Показатели протеазной активности сохраняли те же фазовые характеристики, что присущи музейным штаммам. Существенные различия при сравнительном анализе амплитудно-фазовых характеристик госпитальных изолятов и музейных штаммов касались

местоположения акрофаз показателей АЛА и каталазной активности, т.е. произошла смена утреннего типа ритмичности на вечерний.

Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил, что для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты, как условно-патогенных микроорганизмов, характерна синхронизация во времени и пространстве пролиферативной активности с одним из основных факторов патогенности - гемолитической активностью. Для них также отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне.

Таким образом, метод косинор-анализа позволил выявить отличия хроноинфраструктуры биоритмов госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa. Последовательность проявлений биологической активности микроорганизмов в течение суток можно представить в виде следующих логических схем (рис. 8, 9, 10).

У музейного варианта S. aureus выявлена четкая последовательность экспрессии факторов адгезии и колонизации, вирулентности и персистенции, тогда как у госпитального изолята выявлена иная временная зависимость, которая, возможно, сформировалось под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов и макроорганизма в целом.

Выявлено, что временной период проявления максимума пролиферативной активности и синхронизированного с ней максимума гемолитической активности одинаков, как у госпитальных изолятов, так и музейных штаммов Е. coli, Р. aeruginosa. Эта особенность отмечалась только для грамнегативной микробиоты.

Стабильность акрофазы, предопределяющая устойчивость ритмического колебания во времени, ориентирует на разработку эффективных способов микробиологической диагностики и мер антимикробной профилактики.

S. aureus (госпитальный). T=12 ч.

.............i__

00 Г !

02 —

03 —

04 —

05 11 _ 1

07 —

08 —

09 —

10 — \

11 —

12 г

14 —

15 _

16 —

17 - 1 ~~ t

18 1 г _ J

19 —

20 —

21 —

22 -V

23 —

24 1

Пролиферация

00-01.30*-03.00 Каталаза 0! 00-02.00*-03.00 Плазмокоагулаза

01.00-02,00*-03.00

01.30 ч.

Гемолизин

04.30-05.30*-06.30

АЛА 05.30-06.00*-06.30

03..ЭД ч.

Протеаза

10.00-11.00*-] 2.00 Пролиферация 12.00-13.30*-15.00

Каталаза 13.00-14.00*-15.00 Плазмокоагулаза 13.00-14.00*-! 5.00

Протеаза

22.00-23.00*-24.00:

01.30 ч.

Гемолизив !6.30-17.30*-18 30 АЛА 17.30-18.00*-! 8.30

03.30 ч.

s-ж

е-

00 01 02

10 11 12

20 21 22

S. aureus (музейный), Т=24

- >

- L

Биопленка

15.30-17,30*-19.30 :

Гемолизин

18.00-19.00*-20.00

Пролиферация

18.30-20.00*-21.30

01.30 ч.

АЛА;

E. coli (госпитальный), Т--24 >

Е. coli (музейный), Т=241

00 01 02

10 11 12

20 21 22

07.00 ч.

Протеаза 06.00-08.00*-! 0.00

03.00 ч.

Пролиферация

13.00-I4.30-M6.00

Гемолизин 13.30-15.00*-!7.00

Каталаза 14.00-16.00*-18.00

АЛА !7.00-20.00*-23.00

Биопленка

21.60-22,00*-23.00

P. aeruginosa (госпитальный), T=24 ч.

00 01 02

10 11 12

16 17 IS

20 21 22

aeruginosa (музейный), T=24 > 1

02.00 ч

Гемолизин

03.00-07.00*-11.00

Пролиферация

06.00-09.00*-12.00

05.00 ч.

о а

АЛА; !7.00-20.00*-23.00

Биопленка

19.00-20.00*-21.00

Каталаза

20.00-21.00*-22.00

Протеаза 22.00-23.30*-01.00

>5 3

Таким образом, анализ амплитудно-фазовых взаимоотношений между изучаемыми показателями выявил определенную последовательность проявления биологических свойств возбудителей и позволил сформировать представление о временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов патогенных микроорганизмов.

Проведенная работа позволила выделить три основных момента:

1. Доказано наличие как циркадианных, так и ультрадианных ритмов биологических свойств у гетерогенных популяций патогенных и условно-патогенных прокариот.

2. Выявлено модулирующее влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов на ритмические процессы биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот.

3. Исследование ритмичности физиологической активности биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот с применением косинор-анализа позволило составить пространственно-временную характеристику их последовательности и согласованности.

Выводы:

1. В спектральном составе прокариот доказано наличие циркадианных ритмов одновременно с ультрадианными гармониками изучаемых биологических свойств у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa, что имеет важное значение для их адаптации к меняющимся условиям внешней среды.

2. Выявленные изменения биологических ритмов основных физиологических характеристик госпитальных и музейных штаммов микроорганизмов отражают их адаптационные возможности путем синхронизации собственных ритмов с условиями внешней среды.

3. Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.

4. Изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами ассоциантов - показатель межмикробных симбиотических взаимоотношений, отражающих формирование микросимбиоценозов.

5. На основании амплитудно-фазовой характеристики выявлена стабильность проявления биологических ритмов вирулентных свойств (протеаза, каталаза, гемолитическая активность) госпитальных изоля-тов под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов, тогда как у музейных штаммов патогенные и персистентные свойства проявляли лабильность в течение суток.

6. Формирование циркадианного ритма антилизоцимной активности изученных музейных штаммов под влиянием экзометаболитов госпитальных изолятов можно рассматривать как результат симбионтных отношений патогенов в микросимбиоценозе.

7. Использование метода косинор-анализа в изучении хронобиологи-ческой организации патогенов позволило сформировать представление о временной организации возбудителей (популяций) госпитальных инфекций. Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты синхронизацию во времени и пространстве пролиферативной активности с гемолитической активностью, а у госпитальных вариантов грампозитивных микроорганизмов - с плазмокоагулазной активностью.

8. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств у грамнегативных патогенов между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне, что отражает перестройку метаболических процессов микробной популяции.

Список работ, опубликованных в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Этиология гнойных инфекций в Тюменской области по данным больничного стационара/ Т.Х. Тимохина, P.M. Хохлявина, Л.Б. Козлов, И.В. Остапенко и соавт.// Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - № 8. - С. 46-49.

2. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницына, Э.А. Кашуба, Д.Г. Губин и соавт. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 4. - С. 3-5.

3. Суточные биоритмы антибиотикорезистентности, плазмокоа-гулазной и антилизоцимной активности Staphylococcus aureus/ Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Я.И. Паромова, Т.Х. Тимохина, СЛ. Гапян, О.В.Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008.-№ 3. - С. 6-9.

4. Биоритмы антибиотикорезистентности микроорганизмов/ О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Т.Х. Тимохина и соавт. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. -№ 5. - С. 35-38.

5. Тимохина Т.Х. Динамика в течение суток отдельных факторов патогенности и персистентности Staphylococcus aureus под влиянием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 4. - С. 15-18.

6. Биоритмы биологических свойств Staphylococcus aureus как фактор их адаптации при госпитальной инфекции/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт. // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 118-119.

7. Оценка суточной динамики чувствительности к цефтриаксону и меропенему грамотрицательных возбудителей нозокомиальной хирургической инфекции/ С.Б. Фадеев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, О.В. Бухарин // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. -№3.- С. 16-19.

8. Биологические свойства доминирующих микроорганизмов в отделениях хирургического профиля/ Т.Х. Тимохина, М.В. Никол ен-ко, Я.И. Паромова, A.A. Барадулин // Медицинская наука и образование Урала. - 2010.-№ 2. - С. 100-101.

9. Суточная динамика каталазной активности Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Леонов, В.В. Варницына // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 4. - С. 60-62.

10. Суточная динамика темпа роста микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 4. - С. 84-86.

11. Особенности временной организации биологических свойств госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa/ Т.Х. Тимохина, Д.Г. Губин // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - № 2. - С.98-100.

12. Модификация инфраструктуры Candida albicans под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.Б. Перунова, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2011. -№ З.-С. 67-70.

Публикации в других изданиях

13. Хронобиологические особенности Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына//Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкин-ские чтения. Санкт-Петербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 2. - № 2. - С. 83.

14. Чувствительность Candida albicans, выделенных из различных биотопов, к антимикотическим препаратам/Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына и соавт.// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкин-ские чтения. Санкт-Петербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 2. - № 2. - С. 84.

15. Суточная динамика пролиферативной активности как способ индикации Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В.

Варницына// Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. -№1 .-С. 30-31.

16. Влияние экзометаболитов грамотрицательной микрофлоры на формирование патогенного потенциала Candida albicans/ Т.Х. Ти-мохина, М.В. Николенко, В.В. Леонов// Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - № 1. - С. 31-32.

17. Влияние экзометаболитов на пролиферативную активность Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, M.B. Николенко, B.B. Варницына, B.B. Леонов// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицинской микологии.- 2009. - Т. 11. - № 2. - С. 116.

18. Оценка способности формировать биопленку грибами рода Candida, выделенных из различных источников/ В.В. Леонов, В.В. Варницына, Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, М.В. Николенко и со-авт.// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицинской микологии.- 2009. - Т. 11. - № 2. - С. 91.

19. Этиология гнойных инфекций в хирургических стационарах Тюменской областной больницы/ Т.Х. Тимохина, P.M. Хохлявина, Л.Б. Козлов и соавт.//Научный вестник Тюменской медицинской академии. Материалы международного симпозиума. Медицина и охрана здоровья 2002. - Тюмень, 2002. -№ 7-8. - С. 105.

20. Цикличность пролиферативной активности микроорганизмов в современных условиях/ Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, В.В. Варницына, P.M. Хохлявина и соавт.//Научный вестник Тюменской Государственной медицинской академии. - 2003. - № 5-6. - С. 116-117.

21. Госпитальная инфекция: современные подходы к эпидемиологии, диагностике, лечению, профилактике/ Э.А. Кашуба, H.A. Курлович, Г.И. Козинец, Т.Х. Тимохина и соавт.//Медицинская наука и образование Урала. - 2004. - № 3-4. - С. 194.

22. Биоритмы пролиферативной активности микроорганиз-мов/Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, H.A. Курлович, Я.И. Паромо-

ва//Материалы международной научной конференции Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере. Сургут, 2004. - С. 364-366.

23. Суточная динамика биохимической активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов под действием пероксимеда/ Я.И. Паромова, C.J1. Галян, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович и со-авт.//Медицинская наука и образование Урала. - 2005. - № 5. - С. 86.

24. Адаптивный потенциал Staphylococcus aureus при госпитальных инфекциях/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт.// Медицинская наука и образование Урала. -2006.-№2.-С. 94-103.

25. Адаптивный потенциал госпитальных штаммов Staphylococcus aureus/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.Б. Пе-рунова и соавт.// Материалы VI Всеармейской международной конференции. Инфекции в хирургии мирного и военного времени. - М., 2006.- С. 3.

26. Пролиферативная активность и чувствительность к антимикробным препаратам Pseudomonas aeruginosa/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. - М., 2007. - Т. 2. - С. 242-243.

27. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность основных возбудителей гнойно-воспалительных инфекций в хирургических отделениях многопрофильной клиники/ P.M. Хохлявина, P.JI. Хохлявин, Т.Х. Тимохина, Э.А. Кашуба и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. - М., 2007. - Т. 2. - С. 83-84.

28. Хронобиологические особенности адаптивных свойств грибов рода Candida/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.А. Курлович и соавт.// Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии. Успехи медицинской микологии. - М., 2007. -Т.9.-С. 26-27.

29. Суточная динамика антилизоцимной активности грибов рода Candida/ О.В. Бухарин, Т.Х. Тимохина, Н.Б. Перунова, В.В. Варницы-на и соавт.//Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии. Успехи медицинской микологии. - М., 2007. - Т. 10. - С. 48-49.

30. Хронобиологическая характеристика чувствительности к ок-сациллину Staphylococcus aureus - возбудителей абсцессов мягких тканей/ Б.С. Фадеев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, О.В. Бухарин// Актуальные вопросы профилактики, диагностики и терапии хирургических инфекций. ЦВДО Подмосковье. - 2007. - С. 139.

31. Особенности биологии грибов рода CANDIDA/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Н.Б. Перунова и соавт.// Тезисы докладов II съезда по микологии. Москва, 2008. Современная микология в России. -2008.-Т. 2.-С. 280-281.

32. Характеристика временной организации штаммов Candida spp., выделенных из клинического материала/ Н.Б. Перунова, М.В. Николенко, В.В. Варницына, М.В. Янина, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - № 2/52. - С. 58-59.

33. Влияние экзометаболитов ассоциативной микрофлоры на временную организацию музейных штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa/ T.X. Тимохина, Я.И. Паромова, В.В. Леонов, Н.Б. Перунова и соавт.// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. -№ 2/52. - С. 89-90.

34. Временная организация биологических свойств Staphylococcus aureus/Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Н.Б. Перу-нова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - № 2/52. - С. 56-57.

35. Вычислительная система «Групповой косинор-анализ»/ А.Г. Санников, Т.Х. Тимохина, Н.А. Соколовский// Академический вестник. - Тюмень, 2010. - № 2(12). - С. 146-149.

36. К вопросу о циркадианной и ультрадианной ритмичности у нефотосинтезирующих бактерий/ Д.Г. Губин, Т.Х. Тимохина, М.В.

Николенко// Материалы XVIII международной конференции. Ставрополь, 2010. Циклы природы и общества. - 2010. - С. 106-108.

Патенты и свидетельства

1. Способ диагностики госпитальных штаммов: Патент РФ на изобретение № 2285258/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, P.M. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б. Козлов// Бюл., 2006. - № 28.

2. Способ индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий: Патент РФ на изобретение №2285257/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, P.M. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б. Козлов// Бюл., 2006. - № 28.

3. Способ индикации госпитальных штаммов стафилококков: Патент РФ на изобретение №2292398/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, P.M. Хохлявина, Л.Б. Козлов// Бюл., 2007. - № 3.

4. Способ выявления Candida albicans по биоритмам: Патент РФ на изобретение №2319747/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Я.И. Паромова Л.Б. Козлов, Н.Б. Перунова, Д.Г. Губин, О.П. Тверскова// Бюл., 2008. - № 8.

5. Автоматизированная система «Косинор-анализа»: Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932/ Т.Х. Тимохина, А.Г. Санников, В.В. Варницына, H.A. Соколовский// Бюл., 2009. - № 4.

Список сокращений:

АТСС - American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур) КОЕ - колониеобразующая единица ОМЧ - общее микробное число БПО - биоплёнкообразование АЛА — антилизоцимная активность МПК - минимальная подавляющая концентрация г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена Т - критерий Манна-Уитни W - критерий Уилкоксона

ТИМОХИНА ТАТЬЯНА ХАРИТОНОВНА

ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 19.05.2011 г. Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тимохина, Татьяна Харитоновна

Страница

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РОЛЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ РИТМОВ В АДАПТАЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (обзор литературы).

1.1. Хронобиологическое представление об организации живых систем.

1.2. Механизмы адаптации,патогенных микроорганизмов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика микроорганизмов,* используемых в исследованиях.

2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов.

2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов.

2.4. Методика изучения регулирующего влияния антимикробных препаратов на биологические свойства микроорганизмов'.

2.5. Метод изучения взаимного влияния микроорганизмов-ассоциантов наих биологические свойства.

2.6: Методы статистической обработки полученных результатов.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГОСПИТАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ И МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ S. AUREUS, Е. COLI, P. AERUGINOSA В ТЕЧЕНИЕ СУТОК.

3.1. Пролиферативная активность микроорганизмов в течение суток.

3.2. Протеазная активность микроорганизмов в течение суток.

3.3. Каталазная активность микроорганизмов в течение суток.

3.4. Гемолитическая активность микроорганизмов в,течение суток

3.5. Плазмокоагулазная активность микроорганизмов в течение суток.

3.6. Антилизоцимная активность микроорганизмов в течение суток.

3.7. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам в течение суток.

ГЛАВА 4. РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ АССОЦИАТИВНОЙ

МИКРОБИОТЫ И АНТИБИОТИКОВ НА РИТМЫ БИОЛОГИ

ЧЕСКИХ СВОЙСТВ S. AUREUS, Е. COLI, Р. AERUGINOSA В

ТЕЧЕНИЕ СУТОК.

4.1. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на биоритмы*

I пролиферативной активности микроорганизмов.

4.2. Влияние антибиотиков набиоритмыпролиферативной активности микроорганизмов«.

I 4.3. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на биоритмы

I протеазной активности микроорганизмов ..143;

I 4.4. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на биоритмы каталазной активности микроорганизмов

4.5. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на биоритмы гемолитической^ активности микроорганизмов.165"

I • . ' ' • ' i 4.6: Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиотьг на биоритмы,

V ■ ' антилизоцимной активности микроорганизмов-.

4.7. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на биоритмы f биопленкообразующей активности микроорганизмов«.

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГОСПИТАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ И МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ S. AUREUS, Е. COLI, Р. AERUGINOSA.

5.1. Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов;биологических* свойств 8. aureus.

5.2. Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств Е. coli.

5.3. Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств: Р. aeruginosa.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов"

На современном этапе уделяется большое внимание изучению закономерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных организмов во времени, что является таким же важным свойством живой системы, как и их пространственное строение. Временная организация биологической системы определяется как совокупность упорядоченных изменений во времени, в том числе в виде биологических ритмов,* ее структур и функций, иерархически взаимодействующих и согласованных между собой и с колебаниями условий« внешней среды. Поэтому жизнедеятельность организмов,' функционирование органов,и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется закону биологической структурно-функциональной временной дискретности (Агаджанян H.A. с соавт, 1998; Комаров Ф.И. с соавт., 2000; Романов Ю.А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).

Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабильно^ выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уровнях организации эукариот, не вызывает сомнений! (Aschoff J., 1960; Dunlap J.C., 1999). Очевидно, что ультрадианные и инфрадианные составляющие являются неотъемлемыми в структуре биологических ритмов прокариот. Однако результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А.,1980; Загускин С.Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et. al., 2005; Soriano M.I. et. al., 2010).

Оптимальный уровень функционирования любой живой системы обусловлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и сбалансированное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Ашофф Ю., 1984). С этой точки; зрения хронобиологиче-ский подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г.Д. с соавт. 2000).

К сожалению, отсутствуют сведения о суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств госпитальных изолятов микроорганизмов. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей, их суточной динамики, что могло бы иметь значение для клинической- практики. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноинфраструк-туры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитовгассоциативной микробиоты. Не определена пространственно-временная' организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном уровне, что имеет важное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. Поставленные выше вопросы требуют своего разрешения.

Цель и задачи исследования

Цель исследования — выявить особенности временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и ее изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.

Для реализации этой цели были,поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать суточную динамику пролиферативной, протеазной, ката-лазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцимной активности госпитальных изолятов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.

2. Определить чувствительность госпитальных изолятов S. aureus и P. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.

3. Выявить изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время1 суток.

4. Охарактеризовать на« популяционном уровне фазово-амплитудную стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. аеп^тозащля определения их временной организации.

Новизна исследования

Впервые проведены многофакторные исследования и представлен комплексный анализ особенностей хроноинфраструктуры биологических свойств популяций патогенных и условно-патогенных госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и P. aeruginosa в спектре ритмов высокой и средней частоты.

Доказано наличие как ультрадианных гармоник, так и циркадианных составляющих ритмов биологических свойств патогенных прокариот. У госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa обнаружены в основном ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенно-сти. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ' на изобретение- № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28) и С. albicans (патент РФ на изобретение № 2319747 от 20.03.2008 г. Бюл. № 8) от музейных штаммов.

Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным1 препаратам на модели музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus и Р. aeruginosa. Выявлены периоды резистентности- к антибиотикам у музейных (антибиотикочувствительных)* штаммов и периоды, чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.

Выявлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на суточную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов* и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa (патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006г. Бюл. № 28). Изменение хроноинфраструктуры их ритмов^ - свидетельство адаптационных возможностей микроорганизмов к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных рит-мометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.

Экспериментально продемонстрировано влияние экзометаболитов мик-робов-ассоциантов на суточную динамику показателей физиологической активности патогенов, обусловливающее десинхронизацию их ритмов.

Предложенный методический подход к изучению биологических свойств.может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий (акт внедрения № 03.1/3068 от 22.12.2010 г.), а также использован в учебно-педагогическом процессе кафедр микробиологии и биологии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03.1/2842 от 16.11.2010 г; №03.1/2884 от 22.11.2010 г.).

Научно-практическая значимость

Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации проявления биологических свойств, как на уровне популяции, так и на уровне ассоциативных взаимоотношений прокариот. Выявленные биоритмы пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и< антилизоцимной активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa, их лабильность под влиянием экзометаболитов ассоциативной^микробиоты.и антимикробных препаратов, последовательность и синхронность проявления в суточной« динамике расширяют теоретические представления- о биологии патогенных прокариот, их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.

Совокупность полученных данных о циркадианных и ультрадианных ритмах биологических свойств возбудителей позволяет обосновать положение о временной организации изучаемых патогенов и может быть использована не только при определении различных биологических функций микроорганизмов, но и при обосновании их адаптивных реакций. Временная организация биологических свойств возбудителей инфекций, представляющая последовательность упорядоченных во времени изменений биоритмов, взаимодействующих и согласованных между собой под воздействием биотических и абиотических факторов, отражает адаптационные возможности патогенов и служит методическим ключом к изучению механизмов их регуляции.

Практическое значение исследований определяется разработкой хроно-биологического метода изучения пролиферативной активности S. aureus, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного показателя! возбудителей. Хронобиологические исследования позволили выявить различные периоды активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и их чувствительность к антибиотикам в течение суток, что представляет интерес для разработки рациональных антимикробных мероприятий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физиологические функции госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов имеют ультрадианную и циркадианную ритмичность, модифицирующуюся под действием биотических и абиотических факторов среды.

2. Амплитудно-фазовая; оценка суточных ритмов биологических функций госпитальных изолятов; и музейных штаммов - объективная индивидуальная «характеристика патогенов. ,.

3; Временная! организация биологических свойств возбудителей« госпитальных инфекций; представляющая совокупность упорядоченных изменений во времени биологических ритмов; взаимодействующих; и согласованных между собой, как и изменения.их спектрального состава под воздействием ассоциативной? микробиоты и; антимикробных препаратов - отражение адаптационных, возможностей патогенов и методический ключ изучения механизмов их регуляции.

4: Использование метода косинор-анализа в изучении; временной; организации, патогенов раскрывает стратегию распределения: патогенных, ресурсов микробной^ популяции во времени.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов»; (Оренбург, 2006); пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва 2007);; научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного' центра РАМН «Медицинская; академическая; наука - здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008);; Всероссийской, научно-практической конференции по?ме-дицинской микологииг (Санкт-Петербург, 2008; 2011); совместном заседании Бюро отделения профилактической медицины Российской академии медицинских наук и президиума Южно-Уральского научного центра РАМН «Профилактика профессиональных, экологически обусловленных и инфекционных заболеваний в Южно-Уральском регионе» (Челябинск, 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; на XVIII Международной научной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 научных работ, из них 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 4 патента на изобретения и свидетельство на программу для ЭВМ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тимохина, Татьяна Харитоновна

223 Выводы:

1. В спектральном составе ритмов госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa доказано наличие циркадианных и ультрадианных гармоник изучаемых биологических свойств, что имеет важное значение для их адаптации к меняющимся условиям внешней среды.

2. Выявленные изменения биологических ритмов основных физиологических характеристик госпитальных и музейных штаммов микроорганизмов отражают их адаптационные возможности^ путем синхронизации собственных ритмов с условиями внешней'среды.

3. Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности1 у госпитальных (антибиотикорези-стентных) изолятов в течение суток.

5. На основании амплитудно-фазовой характеристики выявлена стабильность проявления биологических ритмов вирулентных свойств (протеаза, ка-талаза, гемолитическая активность) госпитальных изолятов под влиянием эк-зометаболитов микробов-ассоциантов, тогда как у музейных штаммов патогенные и персистентные свойства проявляли лабильность в течение суток.

6. Трансформация ультрадианного в циркадианный ритм антилизоцимной активности у музейных штаммов под влиянием экзометаболитов госпитальных изолятов можно рассматривать как результат симбионтных отношений патогенов в микросимбиоценозе.

7. Использование метода косинор-анализа в изучении хроноинфраструктуры биологических свойств патогенов позволило сформировать представление о временной организации возбудителей (популяций) госпитальных инфекций. Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил для грамнегатив-ной микробиоты синхронизацию во времени и пространстве пролифератив-ной активности с гемолитической активностью, а у S. aureus (представителя грампозитивной микробиоты) - с плазмокоагулазной активностью. 8. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств у грамнегативных патогенов между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне, что отражает перестройку метаболических процессов микробной популяции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы интенсивно развивается концепция о временной организации биологических систем, которая стала по существу центральной проблемой в хронобиологии. Временная организация биологической системы образуется совокупностью всех ее ритмических процессов, взаимодействующих и согласованных во времени между собой и с изменяющимися условиями внешней среды. Жизнедеятельность организмов, функционирование органов и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется-закону биологической структурно-функциональной временной дискретности (Агаджанян H.A. с соавт., 1998; Комаров Ф.И. с соавт., 2000; Романов Ю.А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).

Оптимальный, уровень функционирования любой живой системы обусловлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Aschoff J., 1984). Для изучения и формирования представлений о пространственно-временной организации необходимо использовать системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить механизмы ее регуляции. С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г.Д. с соавт., 2000; Романов Ю.А., 2002).

Биологические ритмы различных функций хорошо изучены на всех уровнях организации эукариот. Однако результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, порой противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А.,1980; Загускин С.Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et al, 2005; Soriano M.I. et al., 2010).

К сожалению, отсутствуют сведения по суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств прокариот, включая госпитальные и музейные штаммы. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики. В то »же время это могло бы иметь значение для разработки новых подходов к проведению рациональных антимикробных мероприятий. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноинфраструктуры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитов'ассоциативной микробиоты. Не определена пространственно-временная организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном* уровне, что имеет немаловажное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. В связи с поставленными выше вопросами целью нашего^ исследования явилось изучение' особенностей' временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и её изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов в течение суток.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: изучена суточная динамика пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцим-ной активности госпитальных изолятов S. aureus, Р. aeruginosa, Е. coli; исследована чувствительность госпитальных изолятов S. aureus, Р. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики; определены изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli, Р: aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время суток; охарактеризована на популяционном уровне фазово-амплитудная стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa для определения их пространственно-временной организации.

Биоритмы пролиферативной активности патогенов изучали на модели госпитальных изолятов (клинические культуры) и музейных штаммов (коллекция АТСС) по разработанной нами методике проведения, биоритмологического исследования и обработке данных, учитывающих особенности работы- с микроорганизмами (патент РФ' на изобретение «Способ диагностики госпитальных штаммов» № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28). Для графического представления амплитудно-фазовых, характеристик выявленных стабильных ритмов использован косинор-анализ, служащий базовым- методом для выявления циклических процессов в биологических системах и их моделирования. С помощью прикладной-графической программы «Групповой ко-синор-анализ», адаптированной к микробиологическим исследованиям, по полученным параметрам построены* доверительные эллипсы, отражающие амплитудно-фазовую характеристику выявленных ритмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10109.2009 г. Бюл. № 4).

В-серии проведенных экспериментов была выявлена суточная динамика пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa. Ритмометрический анализ временных параметров пролиферативной активности S. aureus показал, что для.госпитальных изолятов S. aureus 2888, 2891 и 2305 характерна ультрадианная ритмичность, для. музейных штаммов S. aureus 25923 и 209-Р ведущим являлся циркадиан-ный ритм (околосуточный). Отличия были выявлены также по величине амплитуды - показателя, коррелирующего с вкладом ритма, отражающими стабильность и мощность ритма. Выявлены различия между музейными и госпитальными штаммами и по акрофазам ритмов, у госпитальных изолятов S. aureus максимальные значения пролиферативной активности наблюдались в разное время суток, у музейных - только в вечернее и ночное время. Достоверные отличия ритмометрических показателей (вклад ритма, амплитуда и акрофаза) госпитальных изолятов от показателей музейных штаммов являются, вероятно, типовым признаком в хроноинфраструктуре пролиферативной активности S. aureus. Результаты исследований позволили, разработать «Способ диагностики1' госпитальных штаммов», дифференцирующий- госпитальные изоляты S. aureus от музейных культур по отсутствию совпадения; хроноинфраструктуры их биоритмов с биоритмамш последних (патент РФ №'2285258; 2006): Метод» дает возможность оценить различные:периоды? физиологической активности возбудителей^ проведении сравнительного анализам госпитальных изолятов с эталонными культурами.

Анализ временных параметровпролиферативной активности Е. coli выявил у госпитальных изолятов ведущий ультрадианныи ритмгс активностью в ночное время, а у музейных штаммов - циркадианный с акрофазой в вечернее время.

Совершенно противоположная; пролиферативная активность в течение суток регистрировалась у P. aeruginosa: У госпитальных изолятов изучаемый показатель был максимально активен, и в утренние, и дневные часы^ тогда как у музейных штаммов; - только ночыо. В спектральном- составе биоритмов пролиферативной активности у госпитальных изолятов музейных штаммов ведущим ритмом был ультрадианный.

Интегральная оценка хроноинфраструктуры пролиферативной активности- госпитальных изолятов и музейных: штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa позволила сделать ряд обобщений; У госпитальныхс микроорганизмов ведущимшвлялся ультрадианныйритм, что имеет большое значение в плане адаптации госпитальных изолятов S; aureus, Е. coli, Р. aeruginosa к меняющимся условиям биотической и абиотической среды. Этот факт согласуется с выводами исследований Lloyd A., Rossi Е. (1992), Min Н., Guo Н., Xiong J. (2005). К характерным свойствам таких ритмов относятся: значительная нерегулярность (вариабельность периодов), детерминированность, устойчивость к внешним воздействиям и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители (Сергеева Э.П. с соавт., 1987; Нечаева Н.В., Харазова А.Д., 1989; Kippert F., Lloyd D., 1987; Lloyd A., Lloyd D., 1993). Доказанное нами наличие циркадианных ритмов в спектральном составе прокариот одновременно с ультрадианными гармониками усиливало адаптивные возможности популяции. Не исключено, что появление околосуточных ритмов обусловлено'влиянием макроорганизма, как. основной- среды обитания для S. aureus, Е. coli; Р. aeruginosa.

Из вышесказанного следует, что ультрадианные и циркадианные составляющие являются неотъемлемыми в структуре спектра1 микробных популяцию Вот почему изучение изменений соотношения ультра- и циркадианных. компонентов в спектральном составе, которое при различных воздействиях окружающей'среды не является стационарным, дает возможность отличать патологические нарушения хроноинфраструктуры от приспособительных изменений (Губин Г.Д. с соавт., 1994, 2000; Halberg F. et alt, 1984).

Кроме того, хронобиологический метод позволил выявить практически полную идентичность ритмометрических показателей- изучаемых свойств госпитальных изолятов, выделенных из одного- биотопа и подверженных одинаковым воздействиям со стороны окружающей среды (макроорганизма, ассоциативной микробиоты, абиотических факторов и др.).

Для подтверждения'вышесказанного было изучено влияние микробных экзометаболитов на ритмические процессы физиологической активности биологических свойств возбудителей в бактериально-грибковых ассоциациях. Экспериментально доказано, что на пролиферативную активность госпитального изолята S. aureus 2888 оказывали значительное влияние экзометабо-литы грамнегативной микробиоты (Р. aeruginosa и Е. coli), которые достоверно снижали среднесуточную активность пролиферации (W=30,0; р < 0,05), амплитуду, но не изменяли время проявления этой активности в течение суток (акрофазу). Вклад ультрадианного 12-часового ритма уменьшился в 3,9 раза, но увеличилась доля высокочастотных ультрадианных 8-часовых гармоник, что, по-видимому, свидетельствовало об адаптивном напряжении патогена.

На пролиферативную активность госпитального изолята Е. coli; 2364 наиболее активное воздействие оказывали экзометаболиты S. aureus и Р. aeruginosa. В результате произошло нивелирование циркадианного ритма: и появление дополнительной гармоники: 8-часового ультрадианного ритма (вклады ритма;34,3%, 29,9%), смещалась акрофаза, показателя; снижалась амплитуда. Мезор достоверно не изменялся по сравнению с контролем (W=6,0; р>0,05). Экзометаболиты С. albicans не изменяли; акрофазу, но> достоверно снижали амплитуду (р < 0,05).

Экзометаболиты5 S- aureus, Е. coli, С. albicans стимулировали появление циркадианного? ритма пролиферативной активности Р. aeruginosa 2364* (р<0,05), акрофаза изучаемого показателя смещалась с 01.38 часа на 11.00 часов, мезор и амплитуда различий не дали (W— - 10,0; р > 0,05).

Таким образом,, результаты исследования; позволили выявить, что у S. aureus, Е. coli; Р. aeruginosa сохранялись ультрадианные; ритмы пролифера-тивной; активности под; воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя. Появление дополнительных гармоник способствовало усилению адаптивных возможностей популяции.

Выявленный эффект изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активности; прокариот бактериально-грибковыми; экзометаболитами отражает напряженность биологической системы, которая? неизбежная процессе формирования межмикробных взаимоотношений: Смещение времени проявления максимальной пролиферативной активности, по всей видимости, будет приводить к изменению ритмометрических параметров других биологических свойств.

Учитывая, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами возможны изменения численности популяции, стрессоустойчивости, факторов патогенности (Красильников А.П., 1994; Эль-Регистан Г.И., 2001; Ильинская О.Н., 2002; Бухарин О.В. с соавт., 2002; Иванова Е.Б., 2004), мы предприняли попытку изучить влияние антимикробных препаратов- на биоритмы пролиферативной активности госпитальных изоля-тов и музейных штаммов S. aureus и P. aeruginosa.

Под воздействием суббактериостатических концентраций; гентамицина у музейного штамма- S. aureus-(гентамицинчувствительный)-существенно- снижались-все ритмометрические параметры пролиферативной активности; т.е. наблюдалась десинхронизация ритма. Изменения показателей хроноинфра-структуры биоритмов музейного штамма S. aureus, вероятно, отражают состояние сильного стресса, десинхроноза, который может привести к необратимым изменениям и гибели микроорганизмов;

У госпитального изолята-S. aureus (гентамицинрезистентного) достоверных изменений при таком-же режиме воздействия гентамицином не выявлено (р>0,05). Госпитальный изолят сохранял свой суточный ритм пролиферативной активности после обработки антибиотиком в отличие от музейного штамма. Выявленные различия были положены, в основу дифференциации госпитальных изолятов S. aureus от музейных штаммов S. aureus (Патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus (все штаммы ванкомицинчувстви-тельные) было выявлено стимулирующее воздействие препарата на изучаемый показатель и изменение всех ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34; -30 соответственно, р<0,05). Полученные данные согласуются с результатами работы Н.Е. Сузи-ной с соавт. (2001), обнаруживших ростстимулирующий эффект низких концентраций химических препаратов. Полученные результаты свидетельствовали о существенном воздействии на антибиотикочувствительные штаммы патогенов суббактериостатических концентраций антибиотиков, что может быть рассмотрено как один из подходов к рациональной антимикробной терапии.

На следующем этапе работы была изучена суточная динамика функциональных показателей, отражающих патогенные свойства S. aureus, Р. aeruginosa и Е. coli (протеазная, каталазная, гемолитическая активность) И' влияние на нее экзометаболитов ассоциативной гмикробиоты.

Результаты хронобиологического анализа1 патогенных характеристик госпитального изолята S. aureus показали, что циркадианный ритм протеаз-ной активности проявлялся в вечерне-ночной период и был-синхронизирован с пролиферативной активностью возбудителя. Косинор-анализ выявил фазовую стабильность протеазы под воздействием экзометаболитов, однако ак-рофазы каталазной и гемолитической активности изменялись под влиянием ■ экзометаболитов ассоциативной микробиоты. В'этой связи следует отметить стимулирующую роль экзометаболитов Р. aeruginosa, которые в-3 раза увеличивали гемолитическую активность S. aureus (W = - 36,0; р<0,05), характеризуя лабильность проявления.этих патогенных свойств в течение суток.

Следует также отметить чувствительность хронобиологического метода, позволившего выявить, признак гемолитической активности госпитального изолята S. aureus, типированного традиционным бактериологическим методом как негемолитический вариант. Это открывает перспективы * для выявления нестабильно экспрессируемых биологических свойств патогенов.

Анализ амплитудно-фазовой характеристики патогенных свойств госпитального изолята Е. coli 2364 показал, что для этого возбудителя каталазная активность проявлялась по дневному типу и характеризовалась фазовой стабильностью под влиянием экзометаболитов. Дестабилизацию акрофаз протеазной и гемолитической активности вызывали экзометаболиты S. aureus, Р. aeruginosa и С. albicans.

У госпитального изолята P. aeruginosa 2364 активность протеазы проявлялась в циркадианном ритме, как и у S. aureus и Е. coli. Акрофаза (22.48 часа) не изменялась под воздействием метаболитов. Выявлено сходство ритмов активности протеазы P. aeruginosa и Е. coli, выделенных из одного'биотопа. Эти возбудители проявляли протеазную активность в едином циркадианном ритме. По всей видимости, согласованность ритмов по этим* позициям в условиях пребывания в одном биотопе для них биологически обоснована: Гемолитическая активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, отличаясь стабильностью под влиянием экзометаболитов » (акрофазу регистрировали1 в 01.20 час). Под влиянием экзометаболитов С. albicans и Е. coli активность, гемолиза^ тест-культуры-усиливалась. Каталазная активность Р: aeruginosa также проявлялась в циркадианном ритме, с акрофазой в 07.00 часов, но фазовая характеристика не отличалась стабильностью - метаболиты Е. coli и С. albicans смещали акрофазу на ночной период суток.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что-при интенсивном' функционировании одних биологических свойств бактерий- активность других признаков снижается: в одной-и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ин-гибированием продукции других. Вероятно, это связано- со способностью экономии, материальных и энергетических ресурсов и максимальной концентрацией их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определенный временной период (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф:И., 2000).

Для выявления согласованности различных функций.S. aureus, P. aeruginosa и Е. coli, обеспечивающих их приспособление к различным условиям обитания, мы провели корреляционный анализ между пролиферативной активностью и патогенными характеристиками. У госпитального изолята S. aureus выявлена положительная корреляция пролиферативной активности с ка-талазной активностью (г = 0,57; р<0,05). С протеазной и гемолитической активностью достоверной корреляции не отмечалось (г = - 0,07; р>0,05 и г = - 0;3; р>0,05 соответственно), но в период минимальной пролиферативной активности выявлено увеличение продукции протеазы и гемолизинов. У госпитального изолята Е. coli выявлена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеазной и каталазной активностью? (г = - 0;4; р<0,05 и г = - 0,6; р<0^05 соответственно) и сильная прямая связь с гемолитической активностью (г = 0,7; р<0,05).У госпитального изолята установлена корреляция только с гемолитической активностью (г.— - 0,4; р>0,05).

Исследование суточной« динамики, чувствительности S. aureus к антибиотикам с применением; хроыобиологического метода позволило выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов- и периоды чувствительности у госпитальных (антибиоти-корезистентных) изолятов в течение суток, что может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рационального' применения» антимикробных препаратов;

Биологические ритмы персистентных свойств патогенов (S. aureus, Е. coli, Р; aeruginosa) и их модификация под влиянием экзометаболитов ассоциативной? микробиоты были изучены на примере антилизоцимной активности; (АЛА)/ патогенов; и их способности формировать биопленки (БПО). Перси-стентные свойства микроорганизмов изучались под влиянием экзометаболи-тов музейных штаммов; и госпитальных изолятов. , Достоверные изменения АЛА и БПО были зарегистрированы только иод воздействием экзометаболи-тов госпитальных изолятов.

Способность к БПО S. aureus регистрировалась в циркадианном ритме, Е. coli и Р. aeruginosa — в;ультрадианном. У S. aureus ритм БПО вечернего типа, у Е. coli - ночного и дневного типа, у Р.! aeruginosa — утреннего, дневного и вечернего типов. Под воздействием экзометаболитов; ассоциативной микробиоты положение акрофаз не изменялось. Корреляционный анализ позволил выявить только у Р. aeruginosa наличие отрицательной корреляции между пролиферативной активностью и способностью образовывать биопленки (г = -0,67; р<0,05).

Изучение АЛА показало наличие в спектральном составе всех госпитальных изолятов циркадианного ритма с акрофазами в утреннее и-дневное время. У музейных штаммов наблюдалась гетерогенность ритмов х преобладанием в спектре ультрадианных гармоник и регистрация акрофаз в различные периоды суток. При-изучении влияния экзометаболитов ассоциативной микробиоты.на АЛА возбудителей (на модели музейных штаммов) отмечено,-что у S. aureus появлялся циркадианнышритм АЛА с нестабильной акрофа-зой, но амплитуда не изменялась.

Под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты ультрадиан-ные ритмы АЛА Е. coli менялись на циркадианные, акрофазы которых регистрировались в вечернее и ночное время, амплитуда увеличивалась в 2-3 раза, а мезор снижался только при воздействии экзометаболитов , С. albicans (W = 26,0; р<0,05).

Для Р. aeruginosa была характерна гетерогенность ритмов, однако под влиянием-экзометаболитов всех исследуемых штаммов ассоциативных микроорганизмов ведущим оставался циркадианный ритм, а акрофаза, амплитуда» и мезор оставались без изменения (р>0,05).

Таким, образом, влияние экзометаболитов способствовало появлению у музейных штаммов 1 возбудителей 24-часового ритма АЛА, что было свойственно только госпитальным изолятам. По всей видимости, это можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Мати-яш И.Н., 1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В., 1999). Из всех изучаемых микроорганизмов только для Е. coli были характерны изменения ритмометрических параметров АЛА, свидетельствующие о напряжении механизмов адаптации и поиске биосистемой адекватной реакции на изменение условий функционирования.

Для выявления функциональной согласованности пролиферативной и антилизоцимной активности проведен корреляционный анализ, показавший обратную корреляцию у музейного штамма Е. coli (г = - 0,47; р<0,05) и прямую связь этих показателей у госпитального изолята Р. aeruginosa (г = 0,44; р<0,05). У остальных возбудителей корреляционная.зависимость не выявлена. Обнаруженные изменения биологических ритмов! пролиферативной активности, патогенных и персистентных свойств (протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной; биопленкообразующей, антилизоцимной активности), чувствительности к антибиотикам госпитальных изолятов под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, отражают адаптационные возможности патогенов, биологические ритмы которых подстраиваются к новой среде обитания в целях максимальной возможности микроорганизма адаптироваться к окружающей среде путем- синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами (Агад-жанян H.A., 1998; Губин Г.Д., 1989; Смирнов В.М., 2002; Маркина В.В., Романов Ю.А., 2005).

Состояние временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa позволило представить в определенной последовательности амплитудно-фазовую стабильность суточных ритмов биологических свойств возбудителей при применении адаптированной к микробиологическим- исследованиям прикладной графической программы «Групповой косинор-анализ» (свидетельство РФ, 2009), где местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства — амплитуд и фаз) отражают временную область проявления ритма изучаемых биологических свойств.

Результаты косинор-анализа показали, что у музейного штамма S. aureus в период минимальной пролиферативной активности (06.00 - 13.00 часов) продукция ферментов (протеазы, каталазы, плазмокоагулазы) была максимально выражена. Небольшая площадь их эллипсов отражала значительное постоянство основных параметров ритма. С увеличением пролиферативной активности (18.30 - 21.30 часов) максимальных значений достигала продукция факторов адгезии и вирулентности - биопленкообразования и гемолитической активности. АЛА проявлялась по ночному типу (доверительный интервал от 23.00 до 05.00 часов) с акрофазой около 02.00 часов.

У госпитального изолята S. aureus регистрировали ультрадианные ритмы изучаемых показателей в отличие от циркадианных ритмов музейных штаммов. Учитывая, что у госпитального изолята S. aureus активность физиологических функций* проявлялась с 12-часовым периодом, можно отметить, что пролиферативная, каталазная, протеазная и плазмокоагулазная активности относились к ночному и дневному типам активности. АЛА и гемолитическая активность относились к утреннему и вечернему типам ритмичности.

Временная^ организация биологических свойств грамнегативной микро-биоты.отличалась от таковой S. aureus. У музейного штамма Е. coli пролиферативная, гемолитическая и каталазная активности синхронизированы между собой и для них характерен дневной тип ритмичности. Их акрофазы отмечались, соответственно, в 14.30, 15.00 и 16.00 часов. Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы их акрофаз указывали на высокую стабильность параметров их циркадианных ритмов. Акрофаза АЛА смещалась на вечерние часы с максимумом около 20.00 часов. Акрофаза показателя протеазной активности имела утренний тип ритмичности с максимумом около 08.00 часов, доверительным интервалом в пределах ± 90 минут и находилась в полной противофазе к АЛА и БПО, у которых прослеживалась четкая синхронизация проявления активности во времени.

У госпитального изолята Е. coli показатели пролиферативной и гемолитической активности сохраняли те же фазовые характеристики, которые присущи музейному штамму, но стабильность их ритмов несколько слабее, о чем можно судить по большим площадям их доверительных эллипсов. Акрофазы катал аз ной и протеазной активности по сравнению с музейным штаммом смещались на вечерние часы, претерпевая фазовую инверсию по отношению друг к другу. Акрофаза АЛА госпитального изолята, напротив, сдвигалась.в. дневную область - 10.00 часов, тогда как у музейного штамма пик активности регистрировался в вечерние часы. При этом в обоих случаях ритмы были достаточно стабильны.

У музейного штамма P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой и имели утренний тип ритмичности, их акрофазы приурочены-к 09.00 и 07.00 часам. Показатели АЛА, биопленкообразующей, каталазной и протеазной активности также были синхронизированы между собой, но имели вечерне-ночной тип активности. Их акрофазы отмечались в 20.00 - 23.00 часа.

У госпитального изолята P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой, как и у музейного штамма, но акрофазы регистрировались в ночное время, (02.00 часа). Показатели протеазной активности сохраняли те же фазовые характеристики, что и у музейного штамма. Существенные различия при сравнительном анализе амплитудно-фазовых характеристик госпитального изолята и музейного штамма касались местоположения акрофаз показателей АЛА и каталазной активности в связи со сменой утреннего типа ритмичности на вечерний.

Анализ амплитудно-фазовой стабильности биологических ритмов возбудителей выявил следующие особенности. У музейного штамма S. aureus определена синхронизация во времени (17.30 -20.00 часов) основного биологического признака (пролиферативная активность) с фактором адгезии (БПО) и гемолитической активностью. В период минимальной пролиферативной активности музейных штаммов S. aureus наблюдалась продукция факторов вирулентности (плазмокоагулазы, протеазы, каталазы).

У госпитального изолята S. aureus обнаружена иная временная зависимость, которая, возможно, сформировалась под воздействием экзометаболи-тов микробов-ассоциантов и макроорганизма в целом. У госпитального изолята S. aureus дневной тип проявления максимальной пролиферативной активности, который синхронизирован с каталазной, протеазной и плазмокоа-гулазной активностью.

Для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты характерна синхронизация- во времени и пространстве пролиферативной активности с одними из, основных факторов» патогенности - гемолитической активностью. Для них также отмечены значительные' временные интервалы отсутствия максимальной» активности биологических свойств между временем проявления факторов агрессии.и персистенции в суточном диапазоне.

Анализ амплитудно-фазовых взаимоотношений между изучаемыми показателями позволил выявить определенную последовательность проявления: биологических свойств возбудителей и сформировать представление о пространственно-временной организации* госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa.

Таким образом, стабильность акрофазы предопределяет устойчивость ритмического колебания во времени, ориентирует на разработку эффективных способов микробиологической диагностики и антимикробных мероприятий.

Оценивая полученный фактический материал в целом, следует выделить следующие моменты:

- Доказано наличие как циркадианных, так и ультрадианных ритмов-физиологической активности биологических свойств у гетерогенных популяций патогенных и условно-патогенных прокариот.

- Выявлено модулирующее влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов на ритмические процессы биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот.

- Исследование ритмичности физиологической активности биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот с применением коси-нор-анализа позволило составить пространственно-временную характеристику их последовательности и согласованности.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тимохина, Татьяна Харитоновна, Тюмень

1. Агаджанян H.A. О физиологических механизмах биологических ритмов // Успехи физиологических наук, 1987. Т. 18. № 4. - С. 80-104.

2. Агаджанян H.A. Хроноархитектоника биоритмов и среда обитания / H.A. Агаджанян, Г.Д. Губин, Д.Г. Губин, И.В. Радыш // Тюмень: Изд-во Тюменского гос. унив., 1998. 168 с.

3. Агаджанян H.A., Губин Д.Г. Десинхроноз: механизмы развития от моле-кулярно-генетического до организменного уровня // Успехи физиологических наук. 2004. - Т.35. № 2. - С. 57-72.

4. Алпатов A.M. Циркадианные ритмы человека и режим труда-отдыха: гипотеза «сжатой пружины» // Известия РАН. Сер. биол. 1993. - № 6. - С. 810-812.

5. Алпатов A.M. Толковый словарь терминов хронобиологии // Руководство по хронобиологии и хрономедицине. М.: Наука, 2000. - С. 482-488.

6. Алякринский Б.С. Биологические ритмы и- организация жизни человека в космосе; М.: Наука, 1983. - 284 с.

7. Алякринский Б.С. Биоритмологические исследования в космической биологии и медицине. Проблема циркадианности // Проблемы космической биологии. М.: Наука, 1989. - Т. 646 - С. 12-34.

8. Анохин П.К. Опережающее отражение действительности // Вопр. философии. 1962. - № 7. - С. 97.

9. Анохин П.К. Философские аспекты теории функциональной системы // Философские аспекты теории функциональной системы. М.: Наука, 1978.-С. 27-48.

10. Арушанян Э.Б. Основы хронофармакологии // Ставрополь: Изд-во СГМА, 2000. 565 с.

11. Ашофф Ю. Обзор биологических ритмов // Биологические ритмы: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - Т. 1. - С. 12-21.

12. Белобородов В.Б., Митрохин С.Д. Стафилококковые инфекции // Инфекции и антимикробная терапия, 2003. Т. 5. № 1. - С. 12-18.

13. Биологический энциклопедический словарь / Под ред. М.С. Гильярова. -М.: Директ Медиа, 2006. 960 с.

14. Брискин Б.С. Антибактериальная профилактика и лечение послеоперационных осложнений и внутрибольничных инфекций // Врач, 2004. № 3. -С. 30-33.

15. Брудастов Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий: Автореф. дис. .канд. мед. наук. Челябинск, 1992.-24 с.

16. Брудастов Ю.А., Сборец Т.С., Дерябин Д. Г. Активность каталазы и су-пероксиддисмутазы Staphylococcus aureus при их персистировании в макроорганизме // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол: 200 k - № 2. -С.13-16.

17. Брудастов Ю.А., Сборец Т.С., Гриценко В.А., Брудастов А.Н., Воронов О.Н: Свойства Staphylococcus aureus при неблагоприятном течении-ожоговой инфекции // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 4. - С. 47-51.

18. Брудастов Ю.А. Выживание бактерий при взаимодействии с эффектор-ными механизмами защиты хозяина: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. -Оренбург, 2004. 44 с.

19. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. - № 2. - С. 27-28.

20. Бухарин О.В. Механизмы- бактериальной персистенции // Персистенция бактерий / Под ред. О.В. Бухарина. Куйбышев, 1990. - С. 5-14.

21. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1994. - Прил. - С. 4-13.

22. Бухарин О.В., Дерябин Д.Г. Таксономическое значение бактерий рода Staphylococcus к инактивации ряда факторов естественной противоинфек-ционной резистентности // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. -№ 4. -С. 30-33.

23. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - 207 с.

24. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург: УрО РАН, 1997. - 277 с.

25. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий // М.: Медицина, Екатеринбург: УрО РАН, 1999. 366 с.

26. Бухарин О.В. Механизмы персистенции бактериальных патогенов // Вест. Рос. АМН. 2000. - № 2. - С. 44-49.

27. Бухарин О.В. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р / О.В. Бухарин, С.В. Черкасов, А.В. Сгибнев, Т.М. Забирова, Ю.Б. Иванов // Бюлл. эксп. биол., 2000. ТГ 130. № 7. - С. 80-82.

28. Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б. Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов / Патент РФ № 2180353 от 10.03.2002 г.

29. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - 282 с.

30. Бухарин О.В. Механизмы выживания бактерий / Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 2005. - С. 9-10.

31. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эдь-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. - 367 с.

32. Бухарин О.В. Проблемы персистенции-патогенов в инфектологии // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - № 4. - С. 4-8.

33. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В. и др. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 264 с.

34. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко Ю.А. Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценоза человека // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. - № 4. - С. 4-8.

35. Бухарин О.В. Симбиоз биологическая основа инфекции // Симбиоз и его роль в инфекции / Под ред. О.В. Бухарина. - Екатеринбург: УрО РАН, 2011.-С. 37-60.

36. Веретельникова И:Ю., Захарова Ю.В. Антибиотикорезистентность стафилококков; выделенных от медицинского персонала // Медицина в Кузбассе. 2007. В. 2. - С. 39-40.

37. Воложин А.И., Субботин Ю.К. Адаптация и компенсация — универсальный биологический механизм приспособления: М.: Медицина, 1987. -176 с.

38. Волошин С.А., Капрельянц A.C. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях // Биохимия. 2004. - № 11. - С. 1555-1564.

39. Воскун С.Е. Ренотипические и фенотипические особенности поведения / Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий: в процессе культивирования. Иваново: Ивановский гос. мед. ин-т, 1985. С. 11-18.

40. Герасимов В.Е. Роль антилизоцимной активности во внутриклеточном паразитировании шигелл: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск,1989.-24 с.я

41. Гинцбург A.JL, Ильина Т.С., Романова Ю.М. «Quorum sensing», или социальное поведение бактерий // Микробиологии. 2004. - № 5. - С. 86-93.

42. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика, 1999.-459 с.

43. Головлев E.J1. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. - Т. 62. № 2. - С. 149-155.

44. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и*химиотерапия. 2003. - Т. 48. Вып: 10:-С. 32-39.

45. Губин Г.Д., Герловин Е.Ш. Суточные ритмы биологических процессов и их адаптивное значение в онто- и филогенезе позвоночных. Новосибирск: Наука, 1980. - 277 с.

46. Губин Г.Д. Циркадианная организация биологических процессов в фило-и онтогенезе позвоночных / Хронобиология и хрономедицина. М.: Медицина, 1989.-С. 70-82.

47. Губин Г.Д., Дуров A.M., Губин Д.Г. Биоритмы, второй закон термодинамики, биологический возраст // Циклы природы и общества. — 1994. Т.4. -С. 15-19.

48. Губин Г.Д., Губин Д.Г. Хроном сердечно-сосудистой системы на различных этапах онтогенеза человека. Тюмень, 2000. - 176 с.

49. Гудвин Б. Временная организация клетки. М.: Мир,- 1966. - 250 с.

50. Гусев М.В., Минеева JI.A. Микробиология. -М.: Академия, 2003. -464 с.

51. Дерябин Д.Г. Способность к инактивации факторов естественной резистентности в биологии и экологии стафилококков: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Челябинск, 1997. - 28 с.

52. Дильман В.М. Большие биологические часы: Введение в интегральную медицину // 2-е изд., перераб. и доп. М.: Знание, 1986. - 256 с.

53. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: Наука, 2002. - 282 с.

54. Ерюхин И.А. Хирургические инфекции: новый уровень»познания ишовые проблемы // Инфекции в хирургии. 2003. - № 1. - С. 4-5.

55. Ефименко Н:А., Гучев И.А., Сидоренко C.B. Инфекции в хирургии / Фармакотерапия и профилактика. Смоленск, 2004. - 296 с.

56. Желтова В1И., Шульга И.А., Сафронов A.A. Антилизоцимная. активность и биологические свойства стафилококков при гнойно-септических заболеваниях // Персистенция микроорганизмов / Под ред. Бухарина О.В. Куйбышев, 1987. - С. 19-22.

57. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. «Quorum sensing», или как бактерии «разговаривают» друг с другом // Молекулярная биология. 2001. — Т. 35. - С. 268-277.

58. Загускин C.JI. Что такое хронобиология? Управление биологическим временем, согласованием биоритмов и устойчивостью биосистем // Циклы природы и общества: матер. IX Междунар. конф. Ставрополь, 2001. - С. 6-9.

59. Загускин.С.Л. Временная организациям устойчивость биосистем // Проблема времени в культуре, философии- и науке: Сб. науч. тр. / Под ред. B.C. Чуракова. Шахты: Изд-во ЮРГУЭС, 2006. - 155 с.

60. Звягин A.A., Блатун Л.А., Терехова Р.В., Оруджева С.А. Нозокомиальная инфекция в отделении реанимации и интенсивной терапии у больных схирургической инфекцией // Анестезиология и реанимация. 2005. - № 6. -С. 67- 70.

61. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наукова думка, 1984. - 280 с.

62. Иванова Е. В., Перунова Н. Б., Валышев А. В. и др. Видовая характеристика и факторы персистенции бифидофлоры кишечника в норме и при дисбиозах // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. - № 2. - С. 8993.

63. Иванова Е. В. Биологические свойства бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека: Автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2010. - 24.

64. Ильина Т. С., Романова Ю. М., Гинцбург A. J1. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - Т.40. № 11. - С. 1445-1456.

65. Ильинская О.Н.Б., Колпаков А.И., Шмидт М.А. и др. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002. - Т. 71. № 1. - С. 2329.

66. Казначеев В.П. Современные аспекты адаптации. Новосибирск, 1980. -188 с.

67. Капитанов Е.А, Жмакин А.И. Действие дексаметазона на циркадианные биоритмы бактерий // Микробиол., эпедемиол. и иммунобиол. 1992. - № 5-6. - С. 71.

68. Карп В.П., Катинас Г.С. Математические методы исследования биоритмов // Хронобиология, и хрономедицина: Руководство / Под ред. Ф.И. Комарова. М.: Медицина, 1989. - С. 29-45.

69. Карташова O.JL, Киргизова С.Б., Потехина Л.П., Бухарин О.В. Диагностическое значение персистентных характеристик стафилококков при бактерионосительстве // Мкробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007. - № 5. -С.13-16.

70. Катинас Г.С. Уровни организации живых систем и биологические ритмы / Фактор времени и функциональной организации деятельности живых систем. Л., 1980. - С. 82-85.

71. Катинас Г.С., Яковлева В.А. Основные понятия хронобиологии и хроно-медицины // Хронобиология и хрономедицина / Под ред. Ф.И. Комарова. -М.: Медицина, 1989. С. 17-29.

72. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина // М.: «Триада-Х». 2000. - С. 9-24.

73. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., Чибисов С. М. Хронобиология и хрономедицина — актуальное направление в науке // Владикавказский медико-биологический вестник. 2007. - Т. 7. Вып. 13. - С. 22-26.

74. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Живая природа: неразрывное единство материи, энергии и сознания // Кубанский научный медицинский вестник. -2007. № 3 (96). - С. 4-20.

75. Лобакова Е.С., Бухарин О.В. Симбиоз как форма существования организмов // Симбиоз и его роль в инфекции / Под ред. О.В. Бухарина. Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - С. 13-36.

76. Лукомская К.А. Микробиология с основами вирусологии: Учебн. пособие для пед. институтов по биол. и хим. специальностям. М.: Просвещение, 1987. - 192 с.

77. Льюис К. (Lewis К.) Персистирующие клетки и загадка выживания биопленок // Биохимия. 2005. - Т. 70. Вып.2. - С. 327-336.

78. Маркина В.В., Романов Ю.А. Хронотопобиологический механизм гомео-стаза структурно-функциональных единиц органов как функция их пространственно-временной организации // Современные наукоемкие технологии. 2005. - № 2. - С. 39-40.

79. Матияш И. Н. Биологические ритмы показателей естественного-иммунитета человека: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва, 1983. - 23 с.

80. Мельникова В.А., Баснакьян И.А. Синтез важнейших макромолекуляр-ных соединений в» различных условиях культивирования микроорганизмов // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1973. - № 4. — С. 98104.

81. Меньшиков В.В., Астафьева Р.Ф., Курилин Л.Б. Мониторинг возбудителей гнойно-септических заболеваний в стационаре скорой медицинской помощи // Микробиол., эпидемиол: и иммунобиол. 2003. - №1. - С. 1013.

82. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 143 с.

83. Несвижский Ю. В., Воробьев А. А., Белоносов С. С. и др. Анализ простых межмикробных, взаимоотношений в микробиоценозе толстой кишки человека // Вестник РАМН. 1997. - № 3. - С. 23 -26.

84. Нечаева Н.В., Харазова А.Д., Фатеева ВМ. Околочасовая периодичность синтеза белка в тканях некоторых беспозвоночных // Цитология. 1989. — Т. 31. №5.-С. 601 -603.

85. Николаев Ю. А:, Плакунов В- К. Биопленка "город микробов " или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - № 2. -С. 140-163.

86. Николаев Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Москва, 2011. - 47 с.

87. Павлович Н.В., Павлович С.А., Галлиулин Ю.И. Биомагнитные ритмы. -Минск: Университетское, 1991. 186 с.

88. Паршута Л.И. Особенности формирования микробного биоценоза слизистой оболочки носа при стафилококковом бактерионосительстве: Авто-реф. дис. . канд. мед. наук.- Оренбург, 1998: 24 с.

89. Патент РФ на изобретение № 2285258 «Способ диагностики госпитальных штаммов»-// Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович Н.А., Паромова'Я:И., Варницына В.В., Хохлявина P.M.,. ГубингД:Г., Козлов Л.Б. -2006 г.- 11 с.

90. Патент РФ на изобретение № 2285257 «Способ¡индикации1 госпитальных штаммов по биоритмам бактерий» // Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович Н:А., Паромова Я:И., Варницына В.В., Хохлявина P.M., Губин Д:Г., Козлов Л.Б; 2006 г. - 9 с.

91. Патент РФ на изобретение № 2292398 «Способ'индикации госпитальных-штаммов стафилококков» // Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович-. НА., Паромова Я.И., Варницына В.В., Хохлявина P.M., Козлов Л.Б. 2007 г. - 7 с.

92. Патент РФ на изобретение № 2319747 «Способ выявления Candida albicans по биоритмам» // Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович Н.А., Ни-коленко М.В., Варницына В.В., Паромова ЯМ., Козлов Л.Б., Перунова Н.Б., Губин Д.Г, Тверскова О.П: 2008 г. - 4 с.

93. Перунова Н. Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника человека: Авто-реф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2003. - 24 с.

94. Перунова Н. Б. Механизмы формирования ассоциативного симбиоза в бактериально-грибковых сообществах человека // Медицинская наука и образование Урала. 2009. - № 3. - С. 45-46.

95. Перунова Н. Б., Иванова Е. В. Влияние бифидобактерий на антилизо-цимную активность микроорганизмов и их способность к образованию биопленок // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. - № 4. - С. 4649.

96. Перу нова* Н.Б., Иванова Е.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция биологических свойств бактерий кишечного микросимбиоценоза человека // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2010. №6. С. 76-80.

97. Питтендрих К. Циркадные ритмы и циркадная организация живых систем / Биологические часы. М.: Мир, 1964. - С. 263-303.

98. Питтендрих К. Циркадианные системы: общая перспектива. // Биологические ритмы / Под ред. Ю. Ашоффа. Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - Т.1. - С. 22-53.

99. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиол. и инфекц. бол. 1996. - № 2. - С. 4-9.

100. Полежаев А.А., Птицын М.О. Механизмы возникновения пространственно-временной упорядоченности в бактериальных системах. // Биофизика: 1990. - Т. 35. Вып. 2. - С. 302-306.

101. Поликарпов Н.А. Солнечная активность и продукция потенциально патогенными микроорганизмами факторов агрессии // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1994. - С. 19 - 20.

102. Поликарпов Н.А. Гелиогеомагнитная активность и биологические свойства Staphylococcus aureus // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1995. № 6. - С. 8-9.

103. Поликарпов Н.А. О связи показателей солнечно-геомагнитной активности и автоколебаний биологических свойств у субкультур Staphylococcus aureus 209 in vitro // Микробиол., эпидемиол. и иммунолби-ол. 1996.- № 1.-С. 27-30.

104. Поспелова C.B., Горовиц Э.С. Характеристики штаммов стафилококков, изолированных при обследовании на бактерионосительство // Проблемы и перспективы современной науки: Сб. науч. тр. 2008. — Вып. 2. -С. 26-31.

105. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова // М.: Академия, 2005. 608 с.

106. Прозоров A.A. Феромоны компетентности у бактерий // Микробиология.-2001.-Т. 70. № 1.-С. 5-14.

107. Прозоровский C.B. Роль L-формы в персистенции патогенных бактерий // Вестн. АМН СССР. 1985. - №3. - С. 3-9.

108. Романов Ю.А. Биологические ритмы) на разных уровнях биологической организации. // Проблемы космической биологии. 1980. - № 4. - С. 10-25.

109. Романов Ю.А. Проблемы хронобиологии. М.: Знание, 1989. - 164 с.

110. Романов Ю.А. Теория биологических систем и проблема их временной организации // Проблемы хронобиологии. 1991. - №. 3-4. - С. 3-15.

111. Романов Ю.А. Хронобиология как одно из важнейших направлений современной теоретической биологии // Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. М.: «Триада-Х», 2000. - С. 9-24.

112. Романов Ю.А. Пространственно-временная организация биологических систем: актовая речь. М.: РГМУ, 2001. - 38 с.

113. Романов Ю.А. Пространственно-временная организация биологических систем // Владикавказский мед.-биол. вестн. 2002. - Т. 1. Вып. 2. — С. 42-49.

114. Романов Ю.А. Пространственно-временная организация биологической системы: роль и свойства / Материалы III Междунар. конф. «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского». М.: Изд-во РУДН, 2005.-С. 40-41.

115. Руководство «Хронобиология и хрономедицина» / Под ред. Ф.И. Комарова. М.: Медицина, 1989. - 400 с.

116. Руттенбург С.О., Слоним А.Д. Циркадный ритм физиологических процессов и трудовая деятельность человека. Фрунзе: Илим, 1976. - 188 с.

117. Савинов А.Б. Биосистемология-(системные основы теории эволюции и экологии). Н.Новгород: Изд-во ННГУ, 2006. - 205 с.

118. Савинов-А.Б. Развитие интегративной (симбиотической)> теории эволюции (к знаменательным датам жизни и творчества Ламарка и Дарвина) / Современные проблемы эволюции. Ульяновск: УлГПУ, 2009. С. L13-124.

119. Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 «Автоматизированнаяf система Косинор-анализа» /' Тимохина Т.Х., Санников А.Г., Варницына В.В., Соколовский Н.А. 2009 г. - 1 с.

120. Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Сидоренко С.В. Особенности эпидемиологии и эпидемиологического надзора за внутрибольничны-ми инфекциями на современном этапе // Эпидемиология и инфекционные-болезни. 2006. - № 4. - С. 22-26.

121. Сергеева Э.П. Периодичность синтеза белка в клетках изолированных жабр мидии в разное время года / Э.П. Сергеева, А.Д. Харазова, В.И. Фатеева, Н.В. Нечаева // Биология моря. 1987. - № 3. - С. 19-22.

122. Сидоренко С.В. Клиническое значение Pseudomonas aeruginosa // Клиническая фармакология и терапия. 2003'. - Т. 12. № 2. - С. 12-17.

123. Сидоренко С.В. Роль бактериальных биоплёнок в патологии человека // Инфекции в хирургии. 2004. - № 2. - С. 16-20.

124. Сидоренко С.В. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей // Антибиотики и химиотерапия. 2005. - № 2-3. - С. 33-41.

125. Скала JI.3. Практические аспекты современной клинической микробиологии / JL3. Скала, C.B. Сидоренко, А.Г. Нехорошева, И.Н. Лукин, С.А. Грудинина; Тверь: Изд-во «Триада», 2004. - 312 с.

126. Смирнов В.М., Дубровский В.И: Физиология физического воспитания и спорта. М:: Изд-во ВААДОС-ПРЕСС, 2002. - 608 с.

127. Смирнов С.Г. Этология бактерий — новое направление в исследовании прокариотов // Физико-химические исследования; патогенных энтеробактерий в процессе культивирования: Сб. науч. тр. Иваново: Ивановский гос. мед. институт, 1985. - С. 4-10.

128. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. МО. Биргера. М'.: Мёдицина, 1982. - 464 с.

129. Степанова С.И., Галичий В.А. Космическая биоритмология / Ф. И. Комаров, С.И. Рапопорт // Хронобиология и хрономедицина. М.: «Триада-X». 2000. - С. 266-298.

130. Сузина Н.Е., Мулюкин A.JL, Лойко Н.Г. и др. Тонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндуктора анабиоза // Микробиология. 2001. -Т. 70. № 6. - С. 776-784.

131. Тец В.В., Норманн Л.Л. Изменение вирулентности' энтеробактерий; в> присутствии субингибирующих концентраций' антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия. 199 Г. - Т. 36. № 4. - С. 20-22.

132. Тец В;В., Кнорринг Г.Ю., Артеменко Н.К. и-др. Влияние экзогенных* протеолитических ферментов на бактерии // Антибиотики и химиотерапия. 2004. - № 12. - С. 3-7.

133. Тец В.В., Заславская Н.В. Эффективность действия-антибиотиков на бактерии в биопленках // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. -№5.-С. 24-26.

134. Тец В.В., Артеменко Н.К., Заславская Н.В. и др. Биопленки возбудителей уроинфекций и использование фторхинолонов // Consilium medicum. -2008: № 4. - С. 110-114.

135. Тец Г.В. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биоплёнок с антибиотиками: Дис. . канд. мед. наук. -Санкт-Петербург, 2007. 133 с.

136. Тимофеев-Ресовский Н.В. Структурные уровни биологических систем / Системные исследования: Ежегодник. М.: Наука, 1970. - С. 80-114.

137. Фадеев С.Б., Немцева Н.В., Перунова Н.Б. и* др. Способность возбудителей флегмон мягких тканей формировать биопленки. // Инфекции в хирургии. 2009. - Т. 7. №2. - С.41-45.

138. Фадеев С.Б., Немцева Н.В., Перунова Н.Б. и др. Формирование биопленок возбудителями раневой инфекции и флегмон мягких тканей // Хирург. 2010. - №1. - С. 11-18.

139. Фадеева Н.И., Падейская E.H., Дегтярева И.Н., Першин Г.Н. Влияние производных ди-п-окиси хиноксалина на ДНК-азу и плазмокоагулазу золотистого стафилококка // Фармакология и токсикология. 1978. - № 5. -С. 613-617.

140. Фельдман Ю.М. Количественное определение бактерий в клинических материалах // Лаб. Дело. 1984. - № 10. - С. 616-619.

141. Флуер Ф.С., Прохоров В .Я., Бондаренко В.М. и др. Частота выделения энтеротоксигенных стафилококков среди больных сепсисом, пневмонией, и ожогами // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 5. - С. 36.

142. Халберг Ф. Временная координация физиологических функций / Биологические часы. -М.: Мир, 1964. С. 475-506.

143. Хетагурова Л.Г. Патофизиология- десинхронозов- // Владикавказский медико-биологический вестник. 2005. - Т. 5. Вып. 9. - С. 32-40.

144. Хетагурова Л.Г. Хронопатофизиология — новое направление классической патофизиологии / Материалы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ: ИПО СОИГСИ, 2008. - С. 47-55.

145. Хмель И.A. «Quorum sensing» регуляция экспрессии генов, фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий // Микробиология. - 2006. - Т. 75. № 4. - С. 457-464.

146. Цинзерлинг A.B. Современные инфекции. Патологическая анатомия и вопросы патогенеза. СПб.: Сотис, 1993. - 363 с.

147. Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Челябинск, 1989.-24 с.

148. Чернуха М.Ю., Шагинян И.А. и др. Роль регуляторной системы «Quorum sensing» в симбиотическом взаимодействии бактерий BURKHOLDERIA CEPACIA и PSEUDOMONAS AERUGINOSA при смешанной инфекции // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - № 4. - С. 32-37.

149. Чибисов С.М. Биоритмы и гелиогеофизические факторы / Фундаментальные исследования. М., 2006. - № 9. - С. 34-41.

150. Чопикашвили J1.B., Бобылева JI.A., Пухаева Е.Г. и др. Биоритмы репродуктивной активности в живой природе / Материалы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ: ИПО СОИГСИ, 2008. - С. 177-178.

151. Шаталова Е.В., Бельский В.В. Смешанные инфекции ожоговой раны. -Курск: КГМУ, 1998. 94 с.

152. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса: Сб. научш тр. М:: Наука, 1983. - 360 с.

153. Шпаков'А. О., Перцева М. JI. Системы сигнальной трансдукции прокариот // Журн: эвол. биохим. Физиологии. 2008. - Т. 44. - С. 113-130.

154. Шпаков А-. О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы QS-типа//Микробиология. 2009. - Т. 78. № 2. - С. 163 - 175.

155. Шурлыгина А.В; Основы хронобиологии и хрономедицины в таблицах и схемах / Метод, пособие. Изд-во Новосибирский государственный университет. Новосибирск, 2001. - 32 с.

156. Aschoff J. Exogenous and endogenous components in circadian rhythms // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology: Volume XXV. Biological Clocks. New York: Cold Spring Harbor Press, 1960. P.l 1-28.

157. Aschoff J., Wever R. Biologische Rhythmen und Regelung. In: Probleme der zentralnervosen Regulation. Bad Oeyenhausener Gespräche V, Berlin -Gottingen Heidelberg, Springer-Verlag, pp. 1-15, 1962.

158. Aschoff J., Hoffman К., Pohe R. Re-entrainment of circadian rhythms after ohase-shifts of the Zeitgeber //Chronobiologia. 1975. - V. 2. N. 1. - P. 23-78.

159. Aschoff J., Pohl H. Phase relations between a circadian rhythm and its Zeitgeber within the range of entrainment // Naturwissenschaften, 1978. Vol. 65. -P. 80-84.

160. Aschoff J., Wever R. Uber Reproduzierbarkeit circadianer Rhythmen beim Menschen. Klin. Wochenschr. - 1980. - Bd. 58. -N. 7. - P. 323-335.

161. Aschoff J. Circadian systems in animals and man // Monit. Zool. ital. -1985.-Vol. 19. N. 3.-P. 143-144.

162. Bell-Pederson D., Cassone V.M., Earnest D.J., Golden S.S., Hardin P.E., Thomas T.L., Zoran M.J. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat Rev Genet. - 2005. - № 6. - P. 544-556.

163. Bremer H., Churchward G., Young R. Relation between growth and replication in bacteria // J. Theor. Biol. 1979. - V. 8K - P. 535-545.

164. Brook L, Yokum P. Bacteriology of chronic tonsillitis in young adults // Arch Otolaryngo Head Neck Surg. 1984. - Vol. 110. - P. 803-805:

165. Burgess N. A., Kirke D. F., Williams P. et ah LuxS-dependent quorum-sensing in Porphyromonas gingivalis modulates protease and* haemagglutinin activities but is not essential for virulence // Microbiology, 2002. V. 148. - P. 763 - 772:

166. Casterton J.W., Steward P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common-cause persistent infection // Science, 1999. Vol. 284. - P. 1318-1322.

167. Coote J.G. Antigenic switching and pathogenicity: environmental effects on virulence gene expression in Borellia pertussis // J. Gen. Microbiol. 1991. -V. 137.-P. 2493-2503.

168. Cornelissen G., Halberg F. Introduction to Chronobiology // Medtronic Chronobiology Seminar, 1994'. N. 7. - 52 p.

169. Ditty J.L. Stability of the Synechococcus elongatus PCC 7942 circadian clock under directed anti-phase expression of the kai genes/ J.L. Ditty,

170. S.R. Canalts, B.E. Anderson, S.B. Williams, S.S. Golden // Microbiology, 2005.-N. 8.-P. 2605-2613.

171. Ditty J.L., Mackey S.R., Jonson C.H. Bacterial Circadian Programs. Springer, Berlin, 2009. 333 p.

172. Donachie W.D. Regulation of cell division in bacteria // Brit. Med. Bull. -1973.-V. 29, 3.-P. 203-208.

173. Donachie W.D., Degg K.J., Vincente M. Cell length cell growth and cell division//Nature. 1976. -V. 264, 25. - P. 328-333.

174. Donlan R.M., Costerton W. Biofilms,survival mechanisms of clinical relevant microorganisms // Clin Microbiol Rev, 2002. Vol. 15. - P. 167-193.

175. Douglas A.E. Symbiotic interaction. Oxford: Oxford Univer. Press: N. Y., 1994.- 148 p.

176. Dunlap J.C. Molecular bases for Circadian clocks // Cell. 1999. - Vol. 96. -P. 271-290.

177. Dvornyk V., Knudsen B. Functional divergence of the circadian clock proteins in prokaryotes // Genetica, 2005. Vol. 124. - P.247-254.

178. Dvornyk V. Subfamilies of cpmA, a gene involved in circadian output, have different evolutionary histories in cyanobacteria // Microbiology, 2006. -Vol. 152. P. 75-84.

179. Edwards R., Harding K.G. Bacteria and wound healing // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 17(2). - P. 91-96.

180. Fong K. P., Chung W. O., Lamont R. J. et al. Intra and interspecies regulation of gene expression by Actinobacillus actinomycetemcomitans LuxS // Infect. Immun., 2001. V. 69. - P. 7625 - 7634.

181. Fuller Ch.A. The effects of gravity on the circadian timing system // J. Of Gravitational Physiology. 1994. - V. 1. N. k - P. 1-4.

182. Gaily D.L., Bogan J.A., Eisenstein B.I., Blornfield I.C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbriae phase variation in E. coli K-12: effects of temperature and media // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 6186-6193.

183. Gaily D.L., Leathart J., Blofield I.C. Interaction of FimB and FimE with the fim switch that controls the phase variation of type 1 fimbriae in E. coli K-12 // Mol. Microbiol. 1996. -V. 21. - P. 725-738.

184. Gerritsen L.J.M., de Raay G., Smits P.H. Characterization of form variants of Xenorhabdus luminescens // Appl. Envirion. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 1975-1979.

185. Golden S.S., Canales S.R. Cyanobacterial circadian clocks-timing is everything // Nat Rev Microbiol. 2003. - V. 1. - P. 191-199.

186. Gotz F. Staphylococcus and biofilms // Mol'Microbiol., 2002. Vol. 93». -P. 1367-1378.

187. Greenberg E., Winans S., Fuqua C. Quorum-sensing by bacteria // Ann Rev Microbiol: 1996. - Vol. 50. - P. 727-751.

188. Halberg F., Howard R.B. 24-hour periodicity and experimental medicine. Example and interpretations // Postgrad. Med. 1958. - Vol.24. - P. 349-358.

189. Halberg F. Physiologic 24-hour periodicity; general and procedural considerations with special to the adrenal cycle // Z. Vitamin, Hormon Fermentforsch. 1959. - Vol. 11. - P. 225-269.

190. Halberg F. Body temperature, circadian rhythms and eye // Centre National de la Recherche Scientifique: Photoregulation de la Reproduction chez les Oiseaux et les Mammifleres: Paris, 1970. - N. 172. - P. 497-528.

191. Halberg F., Katinas G.S. Chronobiologic glossary of the international society for the study of biological rhythms // Int. J. Chronobiol. 1973. - Vol. 1. N 1.-P. 31-63.

192. Halberg F.,Carsndente F., Cornelissen G., Katinas G. S. Glossary of chro-nobiology // Chronobiologia. 1977. -Vol. 4. - Suppl. 1. - P. 1-189.

193. Halberg F., Scheving L.e., Lucas E. et al. Chronobiology of human« blood pressure in the light of static (room-restricted) automatic monitoring // Chronobiologia. 1984. - Vol.11. N.3. - P. 217-247.

194. Halberg F. Chronome: introduction to workshop // Workshop on computer methods on Chronobiology and Chronomedicine: 20th International Congress of Neurovegetative Research. Tokyo, 1992.-P. 1-4.

195. Halberg F., Cornelissen G., et al. // Chronobiology's progress. Part I, II season^ appreciations 2004-2005: time-, frequency-, variable-, individual-, age-and site-specific chronomics. J. Appl. Biomed. 2006. - N. 4. - P. 1-38.

196. Hastings M. The brain, circadian rhythms, and clock genes // BMJ. 1998. -Vol. 317.-P. 1704-1707.

197. Hildebrandt G. Chronobiologische Aspecte der Physiotherapie // Z. Phy-siother. — 1979. — Bd 31, H. 3. S. 173-198.

198. Holden M.T., Feil E.J., Lindsay J.A., et al. Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug'resistance // Proc. Natl. Acad. Sei,USA, 2004. Vol. 101. - P. 9786-9791.

199. Ishiura M., Kutsuna S., Aoki T. et al. Expression of a gene claster kai ABC as a circadian. feedback process in Cyanobacteria. Sciens. 1998. - Vol. 281. — P. 1519-1523.

200. Isken S. Bacteria'tolerant to organic solvents // Extremophiles. 1998. V. 2, № 3. - P. 229-238.

201. Johnson C.H. As time glows by in bacteria // Nature. 2004. - Vol. 430(6995). - P. 23.

202. Johnson C.H. Testing the adaptive value of circadian systems. Methods in Enzymology, 2005. P. 393818-393837.

203. Johnson C.H., Mori T., Xu Y. A cyanobacterial circadian clockwork / Curr Biol, 2008.-Vol. 18(17).-P. 816-825.

204. Kaper J., Sperandio V. Bacterial Cell-to-Cell Signaling in the Gastrointestinal Tract // Infect. Immun., 2005. Vol. 73. N. 6. - P. 3197-3209.

205. Kara T. Primary and secondary mechanisms of action, of visible to near-IR radiation on cells // J. Photochem. Photobiol., 1999: V. 49. - P. 1-17.

206. Rippert F. A temperature compensated ultradian clock explains temperature-dependent quantal cell cycle times/ F. Rippert, D. Lloyd D. // Soc. Exp. Biol. Symp.-1987.-Vol. 41.-P. 135-155.

207. Kirketerp-Moller K., Jensen P. O., Fazli M. et al. Distribution, organization, and ecology of bacteria in chronic wounds // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46(8).-P. 2717-2722.

208. Kleinpeter G., Schatzer R. Is blood pressure really a trigger for the circadian rhythm of subarachnoid'hemorrhage // Stroke. 1995 26(10): 1805-10.

209. Kolenbrander P. E. Oral microbial-communities: biofilms, interactions, and: genetic systems // Annu. Rev. Microbiol., 2000. V. 54. - P. 413-437.

210. Kolenbrander P. E., Andersen R. N., Blehert D. S. et. al. Communication among Oral Bacteria // Microbiology and molecular biology reviews, 2002. P. 486-505.

211. Kondo T. Circadian clock mutants of cyanobacteria/ T.Kondo, F. Tsinore-mans, S.S. Golden // Science, 1994. N. 226. - P. 1233-1236.

212. Kondo T., Ishiura M. The circadian clock of plants and cyanobacteria. Trends Plant.Sci. 1999. -Vol. 4.-P. 1711-1776.

213. Konopka» R., Benzer S. Clock mutants of Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - Vol. 68. - P. 2112-2116.

214. Kutsuna S., Kondo T., Aoki S. et. al. A period extender gene pex that extends the period-of the circadian clock in the cyanobacterium Synechococcus // J. Bacteriol., 1998. Vol. 180. - P. 2167-2174.

215. Lewis. K. Riddle of Biofilm Resistance // Antimicrob. agents Chemother. -2001. Vol. 45(4). - P. 999-1007.

216. Liu Y., Tsinoremas N.F., Golden S.S; et. al. Circadian expression of gene involved in the purine biosynthetic pathway of the cyanobacterium Synecho-coccus sp. Strain PCC 7942. Mol. Microbiol., 1996. Vol. 20.-P. 1071-1081.

217. Li Y.H., Lau P. C. Y., Lee J. H. et al: Natural genetic transformation of Streptococcus mutans growing in biofilms // J. Bacteriol., 2001. V. 183. - P. 897 - 908:

218. Mas P., Yanovsky M.J. Time for circadian rhythms: plants get synchronized. Curr Opin Plant Biol. 2009; 12: 574-579.

219. Meieney F.L. Bacterial synergism in disease processes with confirmation of synergistic bacterial etiology of ceptain type of progressive gangrene of: abdominalwall//Ann. Surg. — 1931. 94. S. 961.

220. Milks M. Microbial IgA proteases // Bacterial Enzymes and Virulence / Ed: A. Holder. CRC Press, Ins., Bosa Raton, Fla. -1985 : P. 81-104:248; Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria // Ann; Rev. Microbiol., 2001.-Vol. 55.-P. 165-199.

221. Mobile DNA / Eds. Berg. D.E. et al. Washington D.C.: Amer. Soc. Microbiol., 1989.-972 p.

222. Molla A., Matsumoto K., Oyamada I. et al. Degradation of protease infibi-tors, immynoglobulins and other serum proteins by Serratia protease and its toxicity to fibrolasts in culture // Infect. Immun., 1986. V. 53. - P. 522-529.

223. Moore R.Ji Photic entrainmemt pathways in the mammalian circadian system // Cronobiol. Int. 1997. - V. 14. - Suppl. 1. - 118 p.

224. Palmer R. J., Kazmerzak K. Jr., Hansen M. G. et al. Mutualism versus independence: strategies of mixed-species oral biofilms in vitro using saliva as the sole nutrient source // Infect. Immun., 2001. V. 69. - P. 5794 - 5804.

225. Palmer R: J., Diaz P. I., Kolenbrander P. E. Rapid succession; within the Veillonella population of a developing human oral biofilm in: situ // J. Bacte-rioll, 2006. V. 188: - PI4117 -4124'

226. Palmer R. J. Jr., Stoodley P: Biofilms 2007: Broadened Horizons and New Emphases //J. of Bacteriology. 2007. - Vol. 189 (22). - P. 7948-7960.

227. Pattanayek R., Williams D.R., Xu Y., Mori T. et al. Analysis of Kai C protein interactions in the cyanobacterial circadian clock using hybrid structuralmethods. EMBO, 2006. Vol. 25(9). - P. 2017-2028.

228. Pujol M., Pena. C., Pallares R. et al. Nosocomial Staphylococcus aureus bacteremia among nasal carriers of methicillin-resistent and methicillin-susceptible streins //Am J. Med, 1996; 100:509-16.

229. Rogers E.A., Greenbank G.R. The intermittent growth of bacterial cultures* // J Bacteriol. 1930. - Vol. 19. - P. 181-190.

230. Rotstein;©®:, Pruett T.E., Simmons R;E. Mechanisms of microbial synergy in polymicrobial surgical infections // Rev. Infect. Dis. 1983. - Vol. 7(2). - P. 151-170.

231. Saint Girons I., Barbour A.G. Antigenic variation in Borellia // Res: Microbiol.- 1991.-V. 142. P. 711-717.

232. Salmond G., By croft B., Stewart C., Williams P. The bacterial «enigma»: cracking the code of cell^cell communication // Mol Microbiol. 1995. - Vol. 16. N. 4. -P. 615-624.

233. Shapiro J.A. The significances of bacterial ¡colony patterns / J.A. Shapiro // BioEssays. 1995. - Vol. 17. N: 7. - P. 597-607.

234. Sheetal R., De Vizio D., Odell M. et al. Microbial quorum sensing: a tool or a target for antimicrobial therapy? // Biotechnol. Appl: Biochem., 2009. V. 54. - P. 65-84.

235. Smigelski A.J., Akhurst P.J., Boemare N.E. Phase variation in Xenorhabdus nematophilus and Potorhabdus luminescens: differences in respiratory activity and membrane energization // Appl. Environ. Microbiol; 1994: - V. 60. - P. 120-125.

236. Smith H. Bacterial subversion rather than suppression of immune defebres // Bacterial and viral inhibition and modulation of host defences. — Acad, press, 1984.- P. 171-189.

237. Smith R.M., Williams S.B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elon-gatus // The National Academy of Sciences. 2006. - Vol. 103. N. 5. - P. 85648569.

238. Soriano M.I., Roibas B., Garcia A.B., Espinosa-Urgel MJ. Evidence of circadian rhythms in non-photosynthetic bacteria? // J. Circadian Rhythms, 2010. -8:8 doi: 10.1186/1740-3391-8-8.

239. Stewart P., Costerton W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms // Lancet, 2001.-Vol. 358.-P. 135-138.

240. Swartz.T.E., Tseng T.S., Frederickson M.A., Paris G., Comerci Dtf: et al. Blue-light-activated histidine kinases: two-component sensors in bacteria- // Science. 2007. - Vol. 317. - P. 1090-1093.

241. Takahashi N. Acid-neutralizing activity during amino acid fermentation by Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Fusobacterium nucleatum // Oral Microbiol. Immunol., 2003. V. 18. - P. 109 - 113.

242. Tan Y., Merrow M., Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J: Biol. Rhythms. 2004. - Vol. 19. - P: 135-143.

243. Tauber E., Last K.S., Olive P.J. et al. Clock gene evolution and functional divergence // J. of Biol. Rhythms. 2004. - Vol. 19 (5). - P. 445.

244. Tomita N., Tomita T., Kamio Y. Stochastic Assembly of Two-Component Staphylococcal y-Hemolysin into Heteroheptameric Transmembrane Pores with Alternate Subunit Arrangements in Ratios. Journal, of Bacteriology, 2002. -Vol. 184. N. 17. P. 4747-4756.

245. Tomita J. No Transcription-Translation Feedback in Circadian Rhythm of KaiC Phosphorylation/ J.Tomita, M. Nakajima, T. Kondo, H. Iwasaki // Science, 6, 2005: V. 307. - P. 251-254.

246. Tong H.} Chen W., Shi W. et al. SO-LAAO, a novel L-amino acid oxidase that enables Streptococcus oligofermentans to outcompete Streptococcus mu-tans by generating H202 from peptone // J. Bacterid., 2008. V. 190. - P. 4716 -4721.

247. Van der Woude M., Braaten B., Low D. Epigenetic phase variation of the pap operon in Escherichia coli // Trens in Microbiol. 1996. - V. 4. - P. 5-9.

248. Verweij W.R., Namavar F., Schouten W.F. et al. Early events after intraabdominal infection with Bacteroides Fragilis and Escherichia coli // J. Med. Microbiol. 1991. - Vol. 35(1). - P. 18-22.

249. Williams S.B. A circadian timing mechanism in the cyanobacteria. Adv. Microb Physiol. 2007. - Vol. 52. - P. 229-296.

250. Woelfle M.A., Johnson C.H. No promoter left behind: global circadian gene expression in cyanobacteria. J Biol Rhythms, 2006. Voli 21(6). - P. 419-431.

251. Woelfle M.A., Xu Y., Qin X. Johnson C.H. Circadian rhythms of superheli-cal status of DNA in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. Vol. 104' (47).-P. 18819-18824.

252. Xu Y., Piston D., Johnson C.H. A biolumiscence resonance energy transfer* (BRET) system-application to interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 95. - P. 15-16.

253. Xu Y., Mori T., Johnson C.H. Cyanobacterial circadian clockwork: roles of KaiA, KaiB and kai BC promoter in regulating KaiC. EMBO, 2003, J. P. 222117-222126.

254. Xu X., Soutto M., Xie Q., Servick S. Imaging protein interactions with bioluminescence resonance energy transfer in plant and mammalian cells and tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. Vol. 104 (24). - P. 10264-10269.

255. Young M.W. & Kay S.A. Time zones: a comparative genetics of circadian clocks. // Nat Rev Genet 2. 2001. - P. 702-715.

256. Zheng X., Sehgal A. Probing the Relative Importance of Molecular Oscillations in the Circadian Clock // Genetics. 2008. - Vol. 178 (3). - P. 1147-1156.

257. Zordan M., Costa R., Macino G. Circadian clocks: what makes them tick? // Chronobiology international. 2000. - V. 17. N. 4. - P. 433-436.

Информация о работе

Тимохина, Татьяна Харитоновна
доктора биологических наук
Тюмень, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тимохина, Татьяна Харитоновна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тимохина, Татьяна Харитоновна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тимохина, Татьяна Харитоновна, Тюмень

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология