Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биологических свойств микроорганизмов фитосубстанциями как основа разработки антибактериальных средств

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биологических свойств микроорганизмов фитосубстанциями как основа разработки антибактериальных средств"

На правах рукописи

ЗОЛОТАРЕВ ПАВЕЛ НИКОЛАЕВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИТОСУБСТАНЦИЯМИ КАК ОСНОВА РАЗРАБОТКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДСТВ

03 00 07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3167548

Москва-2008

003167548

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Жесткое Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Плетенева Татьяна Вадимовна

доктор медицинских наук,

профессор Потатуркина - Нестерова Наталия Иосифовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится 2008 года в /^часов на

заседании диссертационного совета Д 212 203 05 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу. 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомится в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул Миклухо-Маклая, 6

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат биологических наук, доцент

Ольга Борисовна Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Прошедшее столетие ознаменовалось рядом крупных открытий в области этиологии и лечения инфекционных заболеваний Одним из немаловажных достижений явилось открытие и создание антимикробных средств, способных воздействовать на патогенные возбудители

Однако постоянное и широкое применение таких препаратов приводит к ряду явлений, осложняющих возможность их рационального использования (Красильников АП, 1995, Вичканова СА, 2003, Лабинская АС с соавт, 2004)

Причинами этого являются природная или приобретенная устойчивость ряда болезнетворных микроорганизмов к антимикробным препаратам, которая обуславливает их низкую терапевтическую эффективность (Мефодьев, В.В, 2002, Бурмистрова AJI с соавт, 2004), а также способность возбудителей изменять свои патогенные и персистентные свойства под действием этих средств (Бухарин О В , 1999, Кириллов Д А., 2004)

Кроме того, стоит отметить побочные реакции при антибиотикотерапии, которые выражаются в токсическом действии (органотропное фармакологическое действие), аллергических реакциях (крапивница, контактный дерматит, бронхиальная астма и др ), торможении иммуногенеза под действием антибиотиков, а также в виде дисбиотических процессов, развивающихся после длительного приема антибиотиков с широким спектром действия (Машковский М Д, 2000, Страчунский JIС с соавт, 2000, Коротяев А И с соавт , 2002)

В плане решения этих актуальных проблем большой интерес представляют лекарственные растения, которые способны служить не только основой для разработки средств с антимикробной активностью, но и выступать в качестве источника соединений, обладающих необходимой модифицирующей активностью в отношении патогенного и персистентного потенциала патогена (Мизина П Г, 2001, Бухарин О В с соавт, 2003, Челпаченко О Е, 2003, Куркин В А, 2004; Тарасевич А В , 2004, Smith-Palmer А, 2002)

Таким образом, изучение способности фитосубстанций изменять биологические свойства бактерий и создание антимикробного лекарственного средства на основе полученных данных является в настоящее время актуальной задачей, решение которой требует комплексного и системного подхода

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась оценка воздействия фитосубстанций на биологические свойства микроорганизмов для разработки антибактериального препарата на основе фракции углекислотного экстракта гвоздики

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи

1 Определить чувствительность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к фитосубстанциям, содержащим фенйлпропаноиды и флавоноиды

2 Изучить действие фитосубстанций на патогенные и персистентные свойства, а также антибиотикочувствительность бактерий под действием фитосубстанций

3 Разработать и исследовать свойства лекарственной антимикробной мембраны, изготовленной на основе активной фракции углекислотного экстракта гвоздики

Научная новизна работы. Впервые проведен целенаправленный анализ регуляции биологических свойств микроорганизмов, высеянных из гнойных ран, фитосубстанциями на основе фенилпропаноидов и флавоноидов.

Впервые изучена чувствительность микроорганизмов к ряду фитосубстанций и доказано, что различные роды микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей, обладают разнонаправленной чувствительностью к представленным фитообразцам

Изучено изменение патогенных и персистентных свойств бактерий под действием фитосубстанций и установлено, что фитообразцы оказывают модифицирующее влияние на биологические свойства микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей

Доказано, что изменения патогенных и персистентных свойств микроорганизмов, помимо видовой принадлежности бактерий, зависят от природы самой субстанции

Выявлена закономерность между воздействием субингибируюших концентраций второй фракции углекислотного экстракта гвоздики (УЭГ) на микроорганизмы и их антибиотикочувствительностью (A4) Установлено, что штаммы Staphylococcus spp, Streptococcus spp и Escherichia coli изменяют чувствительность к таким препаратам, как цефтриаксон, цефтазидим, эритромицин и доксициклин

Разработана и изучена лекарственная пленка, изготовленная на основе 0,7% диметилсульфоксидного раствора второй фракции УЭГ и комбинации пленкообразователей хитозан-метилцеллюлоза (1,5 1)

Выявлено, что при применении 0,5% лекарственной фотопленки для лечения белых крыс с гнойно-некротическими ранами стафилококковой этиологии очищение и заживление раны происходит быстрее, чем в группах животных, у которых применяли препараты сравнения

Практическое значение работы. Экспериментальное изучение биологической регуляции микроорганизмов фитосубстанциями, содержащими фенилпропаноиды и флавоноиды, показывает целесообразность применения ряда фитообразцов в клинической практике в качестве вспомогательных противомикробных средств как на этапе этиотропного лечения, так и для профилактики ряда инфекционных заболеваний

Разработан оригинальный состав 0,5% лекарственной пленки, изготовленной из второй фракции УЭГ на основе хитозана и метилцеллюлозы (1,5 1) (патент РФ на полезную модель 66198 от 10 09 2007 года)

Данные по регуляции биологических свойств микроорганизмов фитосубстанциями и результаты исследований разработанной антимикробной лекарственной пленки для лечения гнойных ран используются в учебном процессе и включены в материалы лекций и практических занятий на кафедрах общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии (акт внедрения от 2410 2007 года), фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии (акт внедрения от 30 10 2007 года), фармацевтической технологии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 13 11 2007 года) Антимикробные фитопленки используются при лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей у крупного рогатого скота в СХА «Восход» Похвистневского района Самарской области (акт внедрения от 16 11 2007 года)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы гнойно-воспалительных ран, обладают разнонаправленной чувствительностью к фитосубстанциям, содержащим флавоноиды и фенилпропаноиды

2 Фитосубстанции модифицируют факторы патогенности, персистенции и антибиотикочувствительность бактериальных патогенов Характер и степень изменений факторов определяется химическим составом субстанций и видовой особенностью микроорганизмов

3 Вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики обладает максимальной антимикробной активностью и значительно ингибирует патогенные и персистентные свойства патогенной флоры

4 Обоснование состава, технологии получения и результаты изучения химиотерапевтической активности лекарственной пленки на основе хитозана и метилцеллюлозы (1,5:1) с 0,5% содержанием активной фракции углекислотного экстракта гвоздики

Апробация рабогы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на Международном конкурсе по антимикробной химиотерапии, посвященном памяти член-кор. РАМН, профессора JIС Страчунского (Смоленск, 2007), II Международном молодежном форуме «Развитие» (Сочи, 2007); I Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2006), Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006), IX Всероссийской Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2005), 60-й Итоговой научной конференции молодых ученых (Ростов-на-Дону, 2006); 71-й Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006), 64-й открытой научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2006)

Основное содержание диссертации опубликовано в 15 научных работах Получен патент Российской Федерации на полезную модель «Антимикробная лекарственная мембрана» № 66198 от 10 09 2007 года

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Республиканской программой МЗ и СР РФ «Создание и стандартизация фитопрепаратов на основе фенилпропаноидов и флавоноидов» (номер государственной регистрации 01990007536) и тематического плана НИР ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (номер государственной регистрации 01200202299)

Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 23 рисунка Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, приложения и списка литературы, включающего 215 источников, из которых 54 - иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования явились 85 штаммов бактерий, высеянных из ран при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей (абсцесс, флегмона, панариций, фурункул, карбункул и другие заболевания), музейные штаммы, а также 39 штаммов грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек

Видовой состав был представлен следующими микроорганизмами-Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterobactenaceae spp, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Trichophyton spp, Microsporum canis, Candida albicans

В экспериментах также были использованы и изучены фитосубстанции, содержащие флавоноиды и фенилпропаноиды эхинацеи пурпурной настойка, сирени настойка, родиолы розовой настойка, мелиссы настойка, лимонника настойка, лимонника плодов настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, березы настойка, полыни эстрагон настойка, прополиса настойка, расторопши экстракт жидкий, ивы остролистной экстракт жидкий, родиолы розовой экстракт жидкий, элеутерококка экстракт жидкий, эфирное масло аниса, эфирное масло гвоздики, эфирное масло фенхеля, углекислотный экстракт аниса, углекислотный экстракт гвоздики, углекислотный экстракт фенхеля, фракции углекислотного экстракта гвоздики (ФУЭГ) № 1, 2, 3, 4 -продукты дробной перегонки

В работе были использованы следующие методы:

- Методы выделения и идентификации микроорганизмов Метод выделения применялся при заборе материала во время первичного хирургического вмешательства; при этом избегалось загрязнение нормальной флорой со смежных участков. Индикацию и идентификацию микроорганизмов проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе «MiniAPI» (фирма «BioMerieux», Франция).

- Методы изучения патогенных свойств бактерий. Изучение гемолитической (ГА), липолитической (ЛипА) и лецитовителлазной

активности (ЛецА) микроорганизмов проводили чашечным методом (Биргер М 0, 1982)

- Методы определения перси стентных свойств микроорганизмов.

Антшшзоцимную и антикарнозиновую активность определяли у микроорганизмов фотометрическим методом до и после воздействия субингибирующих концентраций фитосубстанций (Бухарин О В , 1999)

- Диско-диффузный метод применялся для изучения чувствительности микроорганизмов к стандартным дискам, содержащим определенные концентрации антибиотических веществ, а также к дискам, изготовленным из лекарственных пленок (Стецюк О У с соавт., 2004)

- Метод серийных двойных разведений в плотной и жидкой питательной среде применялся для определения чувствительности микроорганизмов к фитосубстанциям (Лабинская А С с соавт, 2004)

- Метод изготовления лекарственных пленок применялся для создания 0,05%, 0,25% и 0,5% лекарственных пленок на основе второй фракции углекислотного экстракта гвоздики (Мизина П.Г., 2001)

- Метод изучение химиотерапевтической активности 0,5% лекарственной пленки на основе активной фракции УЭГ изучалась на модели стафилококковой локализованной гнойной инфекции на животных (Мяленкова ИЮ, 1996) В опыте было использовано 50 белых половозрелых крыс-самцов линии Вистар весом 250-300 г Курс наблюдения за животными составил в среднем 12 дней - до полной ликвидации воспалительного процесса в опытной группе (Першин Г Н, 1971, Кобзарева Е В , 2000) Эффективность терапевтического воздействия препаратов на течение локализованной гнойной инфекции осуществлялась визуально по площади заживления ран, а также на основании микроскопического и микробиологического методов Критериями выздоровления белых крыс являлись как клиническое выздоровление, так и отрицательные результаты лабораторных исследований (Выгодчиков ГВ, 1963; Гацура В.В, 1974, Заугольников С Д., 1979, Лемешко СИ, 1994)

- Математические методы. Данные, полученные в ходе исследований, были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде доверительного интервала (M±m) О достоверности различий судили с помощью критерия (t) Стьюдента Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости р<0,05 Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета прикладных программ StatSoft Staüstica v 6 0 и Excel 2000 (MS Office 2000, USA)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследований проводили определение чувствительности патогенных и условно-патогенных бактерий, выделенных из ран при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей, а также грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек

В результате эксперимента получены средние значения чувствительности исследуемых бактерий к фитосубстанциям, выраженные в минимально-подавляющих концентрациях (МПК)

Установлено, что бактерии обладают разнонаправленной чувствительностью к представленным фитообразцам (рис 1)

Так определено, что Staphylococcus spp и Bacillus сегеш обладают максимальной чувствительностью ко второй фракции УЭГ (МПК = 3,42+0,70 мкг/мн и 109,31+22,48 мкг/мл), Streptococcus spp - к третьей фракции УЭГ (МПК = 23,19±0,00 мкг/мл), Proteus spp - к экстракту элеутерококка жидкому (МПК = 535,71+85,02 мкг/мл), Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa - к УЭГ (МПК = 242,48+30,31 мкг/мл и 394,02+31,33 мкг/мл).

При изучении чувствительности грибов к фитосубстанциям выявлено, что изученные штаммы так же, как и бактерии, обладают разнонаправленной чувствительностью к изученным фитообразцам (рис 2)

Установлено, что такие грибы, как Trichophyton spp, Microsporum cams и Candida albicans обладают максимальной чувствительностью ко второй фракции УЭГ (МПК = 55,68+13,99 мкг/мл, 83,52+14,01 мкг/мл и 26,68+7,87 мкг/мл)

Таким образом, в ходе экспериментальных исследований была впервые изучена чувствительность микроорганизмов к ряду фитосубстанций, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды, а также доказано, что микроорганизмы, вызывающие гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей, обладают чувствительностью к фитосубстанциям, причем она носит разнонаправленный характер

При изучении патогенных свойств бактерий были исследованы изменения таких свойств, как гемолитическая, липолитическая и лецитовителлазная активности

Гемолитическая активность (ТА)

Установлено, что максимальным ингибирующим эффектом на ГА Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Pseudomonas aeruginosa (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладали сирени настойка, мелиссы настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, полыни эстрагон настойка, настойка березы, расторопши экстракт жидкий, эфирное масло гвоздики, УЭГ и все его фракции

Также установлено, что лимонника плодов настойка и родиолы экстракт жидкий оказали стимулирующее воздействие на ГА Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes, увеличивая данный признак у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более (рис 3)

IV фракция УЭГ ill фракция УЭГ II фракция УЭГ I фракция УЭГ С02 фенхеля СО-2 гвоздики СО-2 аниса Эфирное масло фенхеля Эфирное масло гвоздики Эфирное масло аниса Экстракт элеутерококка жидкий Родиолы экстракт жидкий Ивы остролистной экстракт Расторопши экстракт жидкий Тополя почек настойка Прополиса настойка Настойка берёзы Зверобоя настойка Полыни эстрагон настойка Лимонника плодов настойка Лимонника настойка Мелиссы настойка Родиолы розовой настойка Сирени настойка Эхинацеи пурпурной настойка

о

& Staphylococcus spp. Ш Escherichia coli

500 1000 1500 2000

Я Streptococcus spp. Ш Bacillus cereus

2500 3000 3600 4000

M кг/мл

□ Proteus spp. В Pseudomonas aeruginosa

Рисунок 1 - Средние значения чувствительности исследуемых бактерий к фитосубстанциям, выраженные в МПК («=10)

Эфирное масло фенхеля

Эфирное масло гвоздики

Родиолы экстракт жидкий

Ивы остролистной экстракт

Расторопши экстракт жидкий

Тополя почек настойка

Прополиса настойка

Настойка берёзы

Зверобоя настойка

Полыни эстрагон настойка

3 ТпсЬорЬу(оп врр.

Ш М1сго$рогит самв

П Сапс/Мв й/Ысапв

Рисунок 2 - Средние значения чувствительности исследуемых грибов к фитосубстанциям, выраженных в МПК (п =10)

VI фракция УЭГ III фракция УЭГ II фракция УЭГ I фракция УЭГ С02 гвоздики Эфирное масло гвоздики Родиолы экстракт жидкий Расторопши экстракт жидкий Полыни эстрагон настойка Настойка березы Зверобоя настойка Тополя почек настойка Лимонника плодов настойка Мелиссы настойка Сирени настойка

-100-90-80-70-60-50-40-30-20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100«,

/я

■ Степень уменьшения ГА Staphylococcus aureus Ш Степень увепиченияГА Staphylococcus aureus ИСтепень уменьшения ГА Streptococcus pyogenes ОСтепень увеличения ГА Streptococcus pyogenes □ Степень уменьшения ГА Pseudomonas aeruginosa ■ Степень увеличения ГА Pseudomonas aeruginosa

Рисунок 3 - Степень изменения гемолитической активности микроорганизмов под действием фитосубстаяций

Липолитическая активность (ЛипА).

Установлено, что из всех представленных фитообразцов максимальным снижающим воздействием на ЛипА Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (снижение признака у 60100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладают мелиссы настойка, лимонника настойка, лимонника плодов настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, полыни эстрагон настойка, берёзы настойка, расторопши экстракт жидкий, эфирное масло аниса, гвоздики, углекислотный экстракт аниса, гвоздики и все его фракции. В эксперименте также было определено, что максимальное стимулирование ЛипА у Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (увеличение признака у 60100% исследуемых штаммов на 50% и более) было отмечено под действием только ивы остролистной экстракта (у 87,5% штаммов на 64,21%) и экстракта элеутерококка жидкого (у 100% штаммов на 74,59%) (рис. 4).

Препараты

IV фракция УЭГ

III фракция УЭГ II фракция УЭГ I фракция УЭГ С02 гвоздики С02 аниса Эфирное масло гвоздики Эфирное масло аниса Экстракт элеутерококка жидкий Ивы остролистной экстракт Расторопши экстракт жидкий Полыни эстрагон настойка Настойка березы Зверобоя настойка Тополя почек настойка Лимонника плодов настойка Лимонника настойка Мелиссы настойка

I

-100-90

П—I—I—I—I—I—I—Г~1—I—I—I—I—I—I I—I—I—I

-80-70-60-50-40-30-20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100%

■ Степень уменьшения ЛипА Staphylococcus aureus Ш Степень уменьшения ЛипА Streptococcus pyogenes □ Степень уменьшения ЛипА Escherichia coli S Степень уменьшения ЛипА Pseudomonas aeruginosa

□ Степень увеличения ЛипА Staphylococcus aureus S Степень увеличения ЛипА Streptococcus pyogenes ■ Степень увеличения ЛипА Escherichia coli 0 Степень увеличения ЛипА Pseudomonas aeruginosa

Рисунок 4 - Степень изменения липолитической активности микроорганизмов под действием фитосубстандий

Ледитовителлазная активность (ЛецА).

Максимальное снижение ЛецА Staphylococcus aureus (уменьшение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) было выявлено под действием сирени настойки, мелиссы настойки, лимонника настойки, лимонника плодов настойки, тополя почек настойки, зверобоя настойки, березы настойки, полыни эстрагон настойки, эфирного масла аниса, гвоздики, УЭГ, а также первой, второй и четвертой фракции УЭГ.

В отношении изменения ЛецА Staphylococcus aureus (увеличение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) было установлено, что данными свойствами обладают расторопши экстракт жидкий, ивы остролистной экстракт, родиолы экстракт жидкий.

Таким образом, в результате изучения изменения патогенных свойств бактерий под действием фитосубстанций, выявлено, что обсуждаемые образцы оказывают как стимулирующее, так и ингибирукяцее влияние на патогенные характеристики микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей Разнонаправленное действие зависит как от видовой принадлежности бактерий, так и от природы фитосубстанции Так, наиболее часто максимальное стимулирующее воздействие на патогенные свойства микроорганизмов оказывают ивы остролистной экстракт, родаолы розовой экстракт жидкий, элеутерококка экстракт жидкий В отношении большинства изученных свойств максимальной ингибифующей активностью обладают сирени настойка, мелиссы настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, полыни настойка, эфирное масло гвоздики, УЭГ и его фракции

В рамках исследования по изменению персистентных свойств бактерий под действием субингибирующих концентраций фитосубстанций определяли антилизоцимную активность (рис 5)

Уменьшение АЛА Staphylococcus aureus отмечается только под действием эхинацеи пурпурной настойки с 0,331±0,2 мкг/мл*ОП до 0,000+0,0 мкг/мл*ОП (уменьшение признака на 100%)

В отношении Staphylococcus haemolyticus было установлено, что АЛА под действием всех изученных фитосубстанций только увеличивалась с 0,191+0,05 мкг/мл*ОП до 2,145+1,15 мкг/мл*ОП; случаев снижения данного признака зафиксировано не было

Bacillus cereus изменили значения АЛА в сторону уменьшения в результате воздействия углекислотных экстрактов фенхеля, аниса и второй фракции УЭГ

В отношении штаммов Escherichia coli было установлено, что в большинстве случаев их АЛА снижается под действием фитосубстанций, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды (экстракт элеутерококка жидкий, эхинацеи пурпурной настойка, сирени настойка, лимонника плодов настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, углекислотный экстракт фенхеля и аниса, вторая фракция УЭГ) И только в отношении березы настойки, прополиса настойки и мелиссы настойки отмечается увеличение данного фактора

Значения АЛА Pseudomonas aeruginosa уменьшалась в результате воздействия лимонника плодов настойки, УЭГ, второй фракции УЭГ

Снижение АЛА Klebsiella pneumoniae (ГИСК им. Тарасовича №278) в 1,5-2 раза происходит под действием сирени настойки, экстракта элеутерококка жидкого, эфирного масла аниса, УЭГ и второй фракции УЭГ

Таким образом, установлено, что все фитообразцы способны воздействовать на микроорганизмы как усиливая, так и ослабевая их персистентные факторы. Разнонаправленное действие, также как и в случае с изменением патогенных характеристик, зависит как от видовой принадлежности бактерий, так и от химической природы фитосубстанции

II фракция УЭГ

С02 гвоздики С02 аниса Эфирное масло аниса

Экстракт элеутерококка жидкий

Зверобоя настойка

Тополя почек настойка

Лимонника настойка

Сирени настойка

Эхинацеи настойка

1 Г

1-Г

"I-1 I-1-г

1—I—I

-100-90 -80 -70 -60-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%

■ Степень уменьшзния АЛА Staphylococcus aureus В Степень уменьшения АЛА Staphylococcus haemolyticus Ш Степень уменьшения АЛА Escherichia coli В Степень уменьшзния АЛА Ffceudomonas aeruginosa й Степень уменьшзния АЛА Bacillus cereus □ Степень уменьшения АЛА Klebsiella pneumoniae

■ Степень увеличения АЛА Staphylococcus aureus И Степень увеличения АЛА Staphylococcus haemolyticus ü Степень увеличения АЛА Escherichia coli И Степень увеличения АЛА Pseudomonas aeruginosa ^Степень увеличения АЛА Bacillus cereus □ Степень увеличения АЛА Klebsiella pneumoniae

Рисунок 5 - Степень изменения АЛА микроорганизмов под действием

фитосубстанций

При изучении изменения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам под действием фитосубстанций установлено, что в результате воздействия субингибирующих концентраций второй фракции УЭГ на патогены изменяется их антибиотикочувствительность.

Так, штаммы Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Escherichia coli изменяют чувствительность к таким препаратам, как цефтриаксон, цефтазидим, эритромицин и доксициклин, увеличения зоны задержки роста (рис. 6).

Эритромицин Доксициклин

Препарат

0 Стегеть увеличения A4 Staphylococcus aureus ЕЭСтепень увеличения A4 Streptococcus pyogenes В Степень увеличения A4 Escherichia coli

□ Частота увеличения A4 Staphylococcus aureus Г: Частота увеличения A4 Streptococcus pyogenes ■ Частота увеличения A4 Escherichia coli

Цефтриаксон Цефтазидим

Рисунок 6 - Увеличение АЧ микроорганизмов после воздействия второй

фракции УЭГ

Таким образом, подводя итоги анализа определения чувствительности бактерий к фитосубстанциям, а также изменения их патогенных и персистентных свойств, можно отметить, что фитосубстанции регулируют размножение и патогенные характеристики микроорганизмов, и этот эффект зависит от видовой принадлежности микроорганизмов и химического состава фитосубстанции. Данные исследования могут быть взяты за основу при разработке новых антимикробных препаратов.

Так, из представленных выше результатов можно сделать вывод, что наиболее перспективным антимикробным соединением является вторая фракция УЭГ. Данная фракция обладает максимальной антимикробной активностью и существенно ингибирует патогенные и персистентные свойства возбудителей гнойно-воспалительиых заболеваний.

В ходе проведенных исследований по созданию лекарственного средства на основе второй фракции УЭГ, первоначально были получены рабочие растворы, содержащие различный процент активной фракции. Растворы изготавливались на основе 96% спирта этилового и диметилсульфоксида. Исходная концентрация второй фракции подбиралась из принципа содержания 30 мкг активной фракции в одном диске лекарственной пленки (диаметром 6,0 мм). Указанные диски, изготовленные из лекарственной пленки, применяли для определения их свойств.

В последующем концентрацию активной фракции увеличивали в 5, 10 и 15 раз от исходного значения. В результате были получены растворы со следующим содержанием второй фракции УЭГ: 0,7%, 3,5%, 7,0% и 10,5%.

Перед созданием лекарственных форм рабочие растворы с различным содержанием второй фракции УЭГ проверялись на антимикробную активность методом колодцев

В качестве тест-культуры для определения антимикробных свойств рабочих растворов выбрали Staphylococcus aureus (АТСС 25923).

Параллельно были проведены эксперименты с 96% спиртом этиловым и диметилсульфоксидом, применяемыми для изготовления раствора. Результаты исследования представлены в таблице 1 Так установлено, что 96% спирт этиловый и диметилсульфоксид, применяемые в качестве объекта сравнения, антистафилококковой активностью не обладают, тогда как рабочие растворы, содержащие различный процент второй фракции УЭГ, обладают активностью в разной степени.

Наибольшей антимикробной активностью обладают растворы, содержащие 7,0% и 10,5% второй фракции УЭГ, изготовленные на основе диметилсульфоксида

В связи с тем, что рабочие растворы, содержащие 10,5% активной фракции УЭГ, проявили такую же антимикробную активность, как растворы, содержащие 7,0% активной фракции, растворы большей концентрации, на наш взгляд, можно считать неперспективными для дальнейшего изучения На их получение затрачивается большее количество фракции, что менее экономически выгодно

Также установлено, что 7,0% диметилсульфоксидный раствор активной фракции проявляет повышенную активность, в отличие от 7,0% спиртового раствора

Таблица 1 - Средние значения зон задержки роста Staphylococcus aureus под действием рабочих растворов второй фракции УЭГ и объектов сравнения

микрооргани . __ зм _ Средние значения диаметра зоны задержки роста (мм) (М±т)

0,7% 3,5% 7,0% 10,5% 96% спирт 1 DMSO ;

96% спирт DMSO 96% старт DMSO i 96% спирт' DMSO 96% спирт . ___________1 DMSO i

Staphylococcus aureus ГАТСГ. ?.s<m чо <N +1 оо о" СП <s +1 сп ■О СП CN СП +1 гп 43,1 ±1,5 Г 44,1+3,5 51,3+3,1 ОО cf +1 <4 vT СП сп +1 Os, w 0,0+0,0 o'o+o'o

Таким образом, из 7,0% диметилсульфоксидного раствора активной фракции были созданы лекарственные формы в виде пленок В качестве основы для лекарственных форм использованы биологически активные полимеры,

которые в сочетании с антимикробными субстанциями позволяют поддерживать концентрацию последних в ране, а также защищать рану от повторного инфицирования

В эксперименте были использованы только биологические формообразователи, такие как хитозан крабовый (ТУ 9289-003-49857769-2003), метилцеллюлоза (ТУ 6-10-717-72), а также их комбинация в соотношениях 1 1, 1 1,5,1,5 1

В результате использования технологических способов по получению лекарственных форм из 7,0% диметилсульфоксидного раствора второй фракции УЭГ были получены 0,5% лекарственные пленки

Все полученные образцы лекарственных форм исследовались на антимикробную активность методом дисков к клиническим штаммам, высеянным из гнойно-воспалительных ран мягких тканей Результаты представлены в таблице 2

Установлено, что наибольшую активность проявляют пленки на основе хитозана-метилцеллюлозы (1,5:1) в отношении всех представленных микроорганизмов. Максимальная активность у пленки проявляется к Staphylococcus spp с зоной задержки роста, равной 43,9±0,63 мм.

Кроме того полученные пленки оценивались по обобщенной функции желательности Определено, что лекарственная пленка, изготовленная из хитозана и метилцеллюлозы (1,5 1) с добавлением 7,0% раствора фракции УЭГ, обладает оптимальными свойствами Помимо выраженной антимикробной активности, данная пленка характеризуется однородностью, эластичностью, легко отстает от формы и плотно прилипает к поверхности агара

Все эти факторы позволяют сделать вывод лекарственная пленка, изготовленная из 7,0% диметилсульфоксидного раствора активной фракции на основе комбинации пленкообразователя хитозан-метилцеллюлоза (1,5 1), является новым антимикробным препаратом полученным на основание результатов регуляции биологических свойств микроорганизмов фитосубстанциями.

После получения и изучения свойств 0,5% лекарственную пленку исследовали на химиотерапевтическую активность С этой целью на белых крысах воспроизводили гнойно-некротическое воспаление раны, а затем применяли для лечения опытный препарат и препараты сравнения (хлорофиллипт и сангвиритрин). Воздействие всех препаратов на гнойно-некротическую рану начали через 72 часа от начала заражения.

В результате определения химиотерапевтической активности лекарственной пленки учитывались следующие параметры бактериологическое исследование раневого содержимого у экспериментальных животных в разных группах, а также сроки заживления раны у экспериментальных животных под действием различных препаратов

Таблица 2 - Средние значения зон задержки роста клинических штаммов микроорганизмов под действием дисков из

0,5% лекарственных пленок и пленок с плацебо (74=10)

ll/n СОДЕРЖАНИЕ ПЛЕНКИ Значения диаметра зоны задержки роста (мм) (М±т)

Staphylococcus spp Streptococcus SPP Proteus spp Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus

1 Хитозан + 7,0% раствор фракции 32,010,58 31,0±1,12 19,310,35 19,410,37 18,810,50 23,3+0,59

2 Хитозан + диметилсульфоксид (плацебо) 6,2+0,30 6,1+0,23 6,0+0,36 6,110,40 6,210,45 6,210,35

3 Метилцеллюлоза + 7,0% раствор фракции 35,110,51 35,310,35 23,910,41 19,910,63 21,5+0,50 22,8+0,81

4 Метилцеллюлоза + диметилсульфоксид (плацебо) 0,0+0,00 0,010,00 0,010,00 0,010,00 0,010,00 0,010,00

5 Хитозан-метилцеллюлоза (1 1) + 7,0% раствор фракции 33,5+0,38 31,810,74 25,410,37 22,3+0,35 21,210,45 24,0+0,36

6 Хитозан -метилцеллюлоза (1 1) + диметилсульфоксид (плацебо) 7,1+0,40 7,0+0,34 6,010,48 5,910,40 6,1+0,23 7,110,23

7 Хитозан - метилцеллюлоза (1,5 1) + 7,0% раствор фракции 43,9±0,63 40,311,01 26,410,50 23,0+0,34 23,91,023 26,610,60

8 Хитозан-метилцеллюлоза (1,5 1) + диметилсульфоксид (плацебо) 7,0±0,58 6,0+0,00 6,310,59 6,210,56 6,9+0,23 7,2+0,85

9 Хитозан - метилцеллюлоза (1 1,5) + 7,0% раствор фракции 34,1+0,53 35,510,50 22,910,23 21,710,75 23,2+0,45 24,3+0,35

10 Хитозан - метилцеллюлоза (1 1,5) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,0+0,34 6,8+0,30 6,410,69 6,210,74 6,010,00 7,2+0,30

Отметим, что в опытной группе (1 группа) к 12-м суткам из скудного раневого отделяемого не высевается Staphylococcus aureus, тогда как в контрольной группе и группах сравнения отмечен умеренный и скудный рост данной культуры Также выявлено, что уменьшение площади гнойных ран и их заживление происходит быстрее всего при лечении 0,5% лекарственными пленками

Суммарный процент заживления ран при использовании 0,5% лекарственных пленок (1-я группа) составил к 12-м суткам 89,53%; 0,2% спиртового раствора сангвиритрина (2-я группа) - 59,18%, 1% спиртового раствора хлорофиллипта (3-я группа) - 38,48%, пленок плацебо (4-я группа) -41,81% В то же время в контрольной группе (5-я группа) за аналогичный период площадь заживления составила 16,44%

Также установлено, что при применении 0,5% лекарственных пленок для лечения белых крыс с гнойно-некротическими ранами стафилококковой природы очищение и заживление раны происходит к 12-м суткам, тогда как в эти же временные сроки у животных групп сравнения и контрольной группы отмечался только разгар гнойно-воспалительного процесса с присоединением вторичной инфекции

Таким образом, в ходе проведения комплексных исследований была достигнута цель, изучено воздействие фитосубстанций на биологические свойства микроорганизмов, что возможно использовать при разработках антимикробных средств

Результатом всего выполненного объема исследований явилось получение новых данных последующим направлениям чувствительность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к фитосубстанциям, содержащим фенилпропаноиды и флавоноиды, изучено действие фитосубстанций на патогенные и персистентные свойства бактерий под действием фитосубстанций, разработана лекарственная антимикробная мембрана, изготовленная на основе активной фракции УЭГ

ВЫВОДЫ

1 Определено, что Staphylococcus spp, Bacillus cereus, Trichophyton spp, Microsporum cams и Candida albicans обладают максимальной чувствительностью ко второй фракции углекислотного экстракта гвоздики (УЭГ), Streptococcus spp - к третьей фракции УЭГ, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa - к суммарному УЭГ, Proteus spp. - к экстракту элеутерококка жидкому

2 Изученные фитосубстанции, содержащие в качестве доминирующей группы соединения фенилпропаноидной и флавоноидной природы, оказывают модифицирующее влияние на биологические свойства мшфоорганизмов Установлено достоверное ингибирующее воздействие на патогенные свойства микроорганизмов со стороны сирени настойки, мелиссы настойки, тополя почек настойки, зверобоя настойки, полыни настойки, эфирного масла гвоздики, УЭГ и его фракций Ингибирующее воздействие на персистентяый потенциал оказывают элеутерококка экстракт жидкий, эфирное масло гвоздики и аниса, а также УЭГ и вторая фракция УЭГ.

3 Доказано, что чувствительность микроорганизмов к фитосубстанциям, а также изменения патогенных и персистентных свойств бактерий зависят как от видовой принадлежности патогена, так и от химического состава самой фитосубстанции При этом выявлены преимущества у образцов с доминированием соединений фенилпропаноидной природы

4 Выявлена закономерность между воздействием субингибирующих концентраций второй фракции УЭГ на микроорганизмы и их антибиотикочувствительностью Установлено, что штаммы Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Escherichia coli изменяют чувствительность к таким препаратам, как цефтриаксон, цефтазидим, эритромицин и доксициклин, увеличивая зоны задержки роста

5 Разработана лекарственная пленка, изготовленная из 0,7% диметилсульфоксидного раствора второй фракции УЭГ на основе комбинации пленкообразователей хитозан-метилцеллюлоза (1,5 1), которая обладает максимальной антимикробной активностью в отношении Staphylococcus aureus, а незначительное угнетение роста Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Bacillus cereus стоит рассматривать, как дополнительный положительный эффект

6 Установлена высокая антимикробная активность 0,5% лекарственной пленки на основе второй фракции УЭГ для лечения гнойно-некротических ран стафилококковой природы у белых крыс. Очищение и заживление раны при использовании пленки происходит к 12-м суткам,

тогда как в эги же временные сроки у животных группы сравнения и контрольной группы отмечался разгар гнойно-воспалительного процесса с присоединением вторичной инфекции

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОЛШЩАЦИИ

1 В комплексном лечении инфекционных заболеваний необходимо шире применять фитосубстанции, содержащие флавоноиды и фенилпропаноиды, как вспомогательные противомикробные средства

2 Разработанный новый антимикробный препарат на основе активной фракции углекислотного экстракта гвоздики (патент РФ на полезную модель 66198 от 10 092007 года) целесообразно применять в виде аппликаций после вскрытия и первичной хирургической обработки гнойно-воспалительного очага мягких тканей Наложенную пленку рекомендуется менять каждые 24 часа, длительность применения - 714 дней (до полного клинического выздоровления)

3 При разработке антимикробных препаратов растительного происхождения, помимо их противомикробных свойств, рекомендуется учитывать и их способность изменять патогенный и персистентный потенциал патогенных микроорганизмов

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Золотарев, П Н Антимикробные свойства химических соединений растительного происхождения / ПН Золотарев // Материалы 71-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием - Уфа Изд-во ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава», 2006 - С 443-444

2 Золотарев, П Н Воздействие фракций углекислотного экстракта гвоздики на микроорганизмы / П.Н. Золотарев // Аспирантские чтения - 2006 Труды межвузовской конференции молодых ученых. Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья» - Самара, 2006 - С 12-14.

3 Золотарев, ПН Выявление и определение антибактериальных свойств фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, и чистых веществ /ПН Золотарев // Медицинский вестник Башкортостана Специальный выпуск -2006 - №1 -С 131-135

4 Золотарев, П.Н Определение чувствительности микроорганизмов к ряду фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды / ПН Золотарев // Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых РостГМУ - Ростов-на-Дону. Изд-во РостГМУ, 2006 -С 44

5 Золотарев, П.Н. Оценка антибактериальной активности лекарственных пленок, содержащих II фракцию углекислотного экстракта цветков гвоздики (СагуоркуПш аготайст Ь ) / П Н. Золотарев // Вестник СамГУ Естественнонаучная серия - Самара. Издательство «Самарский университет»,2006 -№9(49) -С 145-154

6 Золотарев, П.Н Оценка антимикробных свойств фитопрепарата «Сирени настойка» / П.Н Золотарев // Материалы I Международной (X Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал - М РГМУ -2006, №2 (49) - С 271.

7 Золотарев, ПН Разработка способа получения продукта растительного происхождения, обладающего антимикробной активностью / ПН Золотарев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и тут итога и перспективы» - Саратов, 2006' - С 76

8 Золотарев, ПН. Растительные соединения как антимикробные средства нового поколения / ПН Золотарев // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины Материалы 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ -Волгоград, 2006 - С. 119-120

9 Золотарев, П Н Исследование зависимости антибактериального эффекта и химической структуры некоторых растительных веществ / ПН Золотарев // Международные стандарты, основанные на принципах доказательной медицины, в проведении научных исследований в

здравоохранении сборник трудов конференции - Самара Британский Совет,2007.-С 71-73

10 Золотарев, ПН Динамика антибиотикочувствительности микроорганизмов под действием фитосубстанций У ПН Золотарев // Аспирантские чтения - 2007 Труды межвузовской конференции молодых ученых Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья» -Самара,2007.-С.21-25

11 Золотарев, П Н Динамика гемолитической активности бактерий, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей под действием фитосубстанций / ПН Золотарев, А В Жестков, А В Куркина, ВН Фоменко, Н.В Зайцева, ДМ Яранов // Известия Самарского научного центра Российской Академии Наук XII Конгресс «Экология и здоровье человека» -2007 -Т 2 - С 163-167

12 Золотарев, П Н Новый антимикробный препарат растительной природы / ПН Золотарев // Сборник материалов 35-й конференции молодых ученых и научных работ 59-й студенческой конференции СГМА -Смоленск, 2007 - С 54-55

13. Золотарев, ПН Создание антибактериальной лекарственной пленки на основе перспективной субстанции / ПН Золотарев // Аспирантские чтения - 2007 Труды межвузовской конференции молодых ученых Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья» -Самара, 2007 - С 9-21

14 Сатдарова, ФШ. Современные подходы к стандартизации сырья и разработке новых препаратов лимонника китайского с изучением влияния на вирулентную активность бактерий / Ф Ш Сатдарова, П Н Золотарев, НР Шагалиева // Известия Самарского научного центра Российской Академии Наук XII Конгресс «Экология и здоровье человека» - 2007 -Т 2-С. 198 - 203.

15 Яранов, ДМ Выявление минимальных подавляющих концентраций фитопрепаратов / Д.М Яранов, П.Н Золотарев / Материалы I Международной (X Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции Вестник РГМУ Периодический медицинский журнал -М. ГМУ - 2006, №2 (49) - С 4.

Изобретения

1. Жестков А В, Мизина П.Г., Куркин В А, Авдеева Е В , Жданов И П, Золотарев П.Н «Антимикробная лекарственная мембрана» Патент РФ № 66198 на полезную модель от 1009 2007 г (приоритет от 03 042007 г) Бюллетень №25 -2007 г

РЕГУЛЯЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИТОСУБСТАНЦИЯМИ КАК ОСНОВА РАЗРАБОТКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДСТВ

Золотарев Павел Николаевич В работе проведено исследование воздействия фитосубстандий на биологические свойства микроорганизмов для разработки антибактериального препарата Установлено, что микроорганизмы, вызывающие гнойно-воспалительные заболевания, обладают разнонаправленной чувствительностью к фитосубстанциям, содержащим флавоноиды и фенилпропаноиды Выявлено, что фитосубстанции модифицируют факторы патогенности, персистенции и антибиотикочувствительность бактериальных патогенов Характер и степень изменений факторов определяется химическим составом субстанций и видовой особенностью микроорганизмов Обоснован состав, технологии получения и результаты изучения химиотерапевтической активности лекарственной пленки, на основе хитозана и метилцеллюлозы (1,5 1), с содержанием 0,5% активной фракции углекислотного экстракта гвоздики

ADJUSTING BIOLOGIC PROPERTIES OF MICROORGANISMS BY PHYTOSUBSTANCES IS A BASE OF COMPOSING ANTIBACTERIAL

MEDICINES

Zolotarev Pavel Nikholaevich The search has been studying the impact of phytosubstanses on biologic characteristics of microorganisms for composing an antibacterial medicine It has been established that microorganisms causing pyoinflammatory diseases have got different sensitivity to flavonoids and phenylpropanoids phytosubstances It was find out that phytosubstances can modify pathogenic and persistence factors and sensitivity to antibiotics of bacterial pathogens The character and degree of factor changing depend on chemical structure of the substances and specific features of microorganisms Structure, manufacturing techniques and results of studying chemotherapeutic activity of a medicine film produced on the basis of chitosan and methylcellulose (1,5 • 1) with 0,5 % active fraction of Caryophyllus aromaticus L C02-extracts were established

Золотарев Павел Николаевич

Регуляция биологических свойств микроорганизмов фитосубстанциями как основа разработки антибактериальных средств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 10 04 2008 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Объем 0,84 уел печ л Тираж ЮОэкз Заказ 1624

Отпечатано с готового оригинал-макета в Центре Оперативной Полиграфии ООО «Стройкомплект» г Самара, 443010 ул Молодогвардейская, д 104 тел (846) 333-33-32,332-39-05