Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние производственных штаммов пробиотиков на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Влияние производственных штаммов пробиотиков на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов"

^а правах рукописи

Гаранкина Анна Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ПРОБИОТИКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Уфа - 2013

11 ДЕК 2013

005543772

Работа выполнена на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Научный руководитель Жуков Алексей Петрович

доктор ветеринарных наук, профессор, декан факультета ветеринарной медицины и биотехнологий, ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Официальные оппоненты: Исмагилова Эльза Равильевна

доктор ветеринарных наук, профессор кафедры морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней, ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»

Галиуллин Альберт Камилович

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, декан факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Ведущая организация ФГБОУ ВПО «Ульяновская

государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 г. в 15:00 часов на заседании диссертационного совета Д. 220.003.03 при ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу: 450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34, ауд. 325/2. Тел./факс: +7 (347) 228-08-98.

С диссертацией можно ознакомиться в ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет».

Автореферат разослан 18 ноября 2013 г. и размещен на официальном сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.vak.ed.gov.ru и ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ http://www.bsau.ru

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Ог^11'

Гиниятуллин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время эффективное ведение животноводства и птицеводства просто немыслимо без применения пробиотиков. Предпосылкой являются уникальные качества этих препаратов, а именно способность одновременно интенсифицировать пищеварительные процессы, стимулировать неспецифическую резистентность, тем самым повышать продуктивные качества сельскохозяйственных животных и птиц (Лебедева И.А., 2008, Мирош-ников С.А., 2008, Ушакова Н.Ф., 2012).

Между тем, большая часть исследований посвящена определению эффективности воздействия пробиотиков на продуктивные качества сельскохозяйственных животных, при этом доля микробиологических экспериментов по данному направлению чрезвычайно мала. В данный момент пробиотики практически не рассматриваются как регуляторы антиоксидантного статуса макроорганизма, что, однако, не исключает их вероятную и эффективную роль в поддержании устойчивости организма к активным формам кислорода (Панин А.Н., Малик Н.И., 2006; Сидоренко О.Д., 2010).

Использование пробиотиков является одним из наиболее эффективных и физиологических путей профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, а также развивающихся вследствие этого ряда вторичных расстройств не только пищеварительной, но и иммунной, эндокринной систем (Смирнова Т.А., 2010).

Для коррекции дисбиотических состояний наиболее рационально и физиологически обосновано использование пробиотиков -живых микробных культур, входящих в состав пищевых добавок. Изучение условий регулирующего воздействия на персистентные свойства микроорганизмов открывает возможности для поиска эффективных методов терапии и профилактики заболеваний (Stanton Т.В., 2013).

Часто возникает проблема постепенного снижения уровня антагонистической активности для препаратов, выпускаемых на основе давно известных производственных штаммов, что в конечном итоге отражается на лечебно-профилактической эффективности пробиотика.

Таким образом, необходимо изучение антагонистической активности подобных штаммов (Давыдов Д.С., 2007).

В последние годы отмечается возрастающая роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении острых кишечных инфекций. Однако факт выделения указанных микроорганизмов не всегда свидетельствует об их этиологической значимости при данных заболеваниях. В итоге эффективность препарата снижается, что вызывает нарекания со стороны специалистов. В связи с этим актуальным и интересным является исследование, направленное на изучение регуляции пробиотиками персистентных характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Алешкин В.А., Тихонова Н.Т., 2002).

Цель исследования - изучение антагонистической активности штаммов, входящих в состав пробиотиков, и их влияние на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить антагонистическую активность микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- определить влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- установить влияние микроорганизмов на способность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к биопленкообра-зованию.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна. Установлено, что различные пробиотики неодинаково влияют на персистентные признаки и способности к биопленкообразованию условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лакгобацилл при создании новых биопрепаратов. Установлено, что наиболее эффективным среди выбранных биопрепаратов оказался Лактоамиловорин, снижающий

антилактоферриновую и антилизоцимную активности у большинства изученных видов микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в расширении представлений знаний о влиянии микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Полученные данные могут представлять интерес с точки зрения формирования колонизационного потенциала пробиотиков, поскольку известно, что штаммы микроорганизмов с высокими показателями персистентных признаков переживают в организме более длительное время. Полученные данные могут быть использованы в практике ветеринарного врача при коррекции дисбио-тических нарушений с использованием эффективных пробиотиков, отобранных под контролем биологических характеристик.

Реализация результатов исследования. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе и проведении научно-исследовательской работы в Оренбургском, Саратовском ГАУ, Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина, Самарской, Ижевской, Вятской ГСХА, в ГАУ Северного Зауралья, в Рязанском агротехно-логическом университете им. П.А. Костычева, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены, одобрены и опубликованы в трудах итоговых научных конференций: VII международной научно-практической конференции «Наука. Теория и практика - 2011» (Варшава, 2011), 1-й международной научно-практической интернет-конференции (г. Ставрополь, 2011), Международной научно-практической интернет-конференции (Ставрополь, 2012).

Публикации результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в четырех научных работах, в том числе две публикации - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ,

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. В изучении антагонистической активности метод прямого антагонизама имеет качественные преимущества при оценке антагонистической активности Lactobacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

2. Различные пробиотики неодинаково влияют на персистент-ные признаки условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лактобацилл для создания биопрепаратов.

3. Пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus разнонаправленно влияют на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 118 страницах компьютерного набора; включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические рекомендации, библиографический список. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 11 таблицами. Библиографический список включает 219 источников, в том числе 74 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Материалом исследования послужили 24 штамма условно-патогенных микроорганизмов: лакто-зонегативные гемолитические Е. coli, грибы рода Candida, бактерии родов Staphylococcus, Klebsiella, предоставленных лабораторией по изучению механизмов персистенции микроорганизмов ИКВС УрО РАН, и штаммы бактерий рода Lactobacillus spp., выделенные из ветеринарных пробиотиков Лактоферон (L. acidophilus), Лак-тоамиловорин (L. amylovorus) и Лактобифадол (L. acidophilus), а также штаммы Е. coli, выделенные из пробиотиков Микроцикол, Колибактерин, Бификол. Из препаратов Ветом 1.1, Споровит, Спо-робактерин были выделены Bacillus subtilis, из препарата Бакти-субтил - Bacillus cereus.

Исследования проводились в период с 2010 по 2012 гг. в лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистентных свойств бактерий кафедры микробиологии и заразных болезней животных ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Антагонистическую активность пробиотических штаммов изучали модифицированным вариантом чашечного метода по принципу от-

сроченного антагонизма (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1996). Степень чувствительности к антагонистическим факторам выражали с помощью коэффициента, который рассчитывали как отношение диаметра зоны задержки роста условно-патогенного микроорганизма к диаметру зоны роста представителей нормальной микрофлоры. Изучение антагонистической активности методом прямого антагонизма проводили Е.И. Ермоленко, С.Х. Ждан-Пушкина, А.Н. Суворов (2004). Изучение способности лактобацилл к продукции лизоцимподобных ферментов проводили по методу A.A. Ленцнера с соавт. (1975). Результаты учитывали через 48 часов после инкубации при 37 °С в микроаэрофильных условиях. О степени лизоцимной активности судили по наличию и величине радиуса зоны лизиса тест-штамма вокруг выросшей исследуемой культуры: 1-3 мм - низкая активность, 4-7 мм - средняя активность и более 7 мм - высокая активность. Для определения антилактоферриновой активности микроорганизмов был использован метод И.В. Валышевой с соавт. (2005) на основе иммуноферментного анализа. Концентрацию лактоферрина в пробах определяли с использованием реагентов ЗАО «ВектОр-Бест». Для выявления гемолитической активности применялся чашечный метод (Биргер, 1982). Для изучения антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов использовали фотометрический метод, предложенный О.В. Бухариным с соавт. (1999). Культуры идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам. Для выделения использовали общепринятые методы. Образование биоплёнок оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах (O'Toole G., 2000). Уровень активности рассчитывали как отношение Амо опыт / А540 контроль, положительным считали значения более 1,1.

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с определением стандартной арифметической величины, стандартной ошибки средней арифметической в соответствии с рекомендациями Г.Ф. Лакина (1990). Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне вероятности ошибки р < 0,05. Схема исследования представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 — Схема исследований

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение биологических свойств пробиотических штаммов Е. coli, бактерий рода Lactobacillus spp., Bacillus. При выделении пробиотических штаммов Е. coli на среде Эндо получили плоские красные колонии средней величины с тёмным металлическим блеском. При изучении морфологических и тинкториальных свойств все исследуемые штаммы явились грамотрицательными, неспоро-образующими палочками.

На втором этапе работы были изучены такие биологические свойства пробиотических штаммов Е. coli, как лизоцимная, гемолитическая, антагонистическая активности. Также было проверено заявленное количество Е. coli в пробиотических препаратах.

Так, при подсчёте количественного содержания Е. coli S5/98 в препарате Микроцикол содержание микроорганизмов соответствовало заявленному - 106 КОЕ/г. Количество Е. coli Ml7 препарата Колибактерин и Бификол - 107 КОЕ/г, что на два порядка меньше, чем заявлено в инструкции к препаратам - 109 КОЕ/г. Выделенные на среде MRS бактерии образовывали мелкие, гладкие, слегка выпуклые белые колонии. Выделенные микроорганизмы являлись неподвижными, грамположительными, неспорообразующими, ката-лазонегативными палочками. При определении общей численности микроорганизмов в 1 г препаратов были получены следующие результаты. Численность пробиотических лактобацилл в 1 г препарата Лакгоферон составила 105 КОЕ/г, что соответствовало заявленному в инструкции к препарату. При подсчете численности L. acidophilus в посевах взвеси из препарата Лактобифадол получили 105 КОЕ/г, что не соответствует указанным в инструкции показателям - 106 КОЕ/г. Количество микроорганизмов L. amylovorum (№ 2054478) в 1 г препарата Лактоамиловорин составило 5 ■ 104/г, при указанных в инструкции 1 • 108 КОЕ/г. Таким образом, все выделенные пробио-тические штаммы Lactobacillus spp. обладали низкой лизоцимной активностью, так как наблюдаемая величина радиуса зоны лизиса тест-штамма вокруг выросшей исследуемой культуры составляла от 1 до 3 мм.

В работе исследовали четыре штамма бактерий рода Bacillus, выделенные из споровых пробиотиков Бактисубтил, Ветом 1.1, Споробактерин и Споровит.

При определении общей численности микроорганизмов в 1 г препаратов были получены следующие результаты. Численность В. subtilis в 1 г препарата Ветом 1.1 106 КОЕ/г, что соответствовало заявленному в инструкции к препарату. Численность В. cereus в 1 г препарата Бактисубтил (107 КОЕ/г) и В. subtilis в 1 г препарата Споробактерин (107 КОЕ/г) была в 100 раз ниже заявленного количества в инструкции к препарату - 109 КОЕ/г. При подсчете численности В. subtilis в 1 г препарата Споровит установили, что количество микробных клеток больше заявленного (106 КОЕ/г) в 10 раз и составляет 107.

Таким образом, количество микробных клеток В. subtilis в 1 г препарата Споробактерин и Споровит не соответствует заявленному в инструкции к препарату.

Антагонистическая активность микроорганизмов, входящих в состав ветеринарных пробиотиков, в отношении условно-патогенных микроорганизмов. При изучении антагонистической активности методом отсроченного антагонизма было выявлено, что все три пробиотических штамма Е. coli проявили антагонистическую активность только в отношении условно-патогенных Е. coli со средним значением коэффициента антагонистической активности: 2,1 ± 0,26 для пробиотического штамма из Микроцикола, 1,1 ± 0,18 - для Колибактерина и 1,1 ± 0,22 - для Бификола. В отношении Klebsiella spp. проявил антагонизм только штамм Е. coli, выделенный из Микроцикола со средним значением коэффициента 1,7 ± 0,35. Антагонистической активности в отношении Staphylococcus spp. и грибов рода Candida выявлено не было.

Наиболее выраженный антагонизм проявили штаммы лактобацилл, выделенные из Лактобифадола и Лактоферона в отношении бактерий рода Staphylococcus, снижая численность последних практически до О КОЕ/мл. Штамм L. acidophilus, выделенный из Лактобифадола, снижал численность бактерий рода Klebsiella с 2,8 ± 0,001 • 105 до 1,1 ± 0,29-105 КОЕ/мл, грибов рода Candida - с 3,1 ± 0,01-105до 1,3 ± 0,08 • 105 КОЕ/мл и Е. coli - с 3,1 ± 0,03 • 105 до 1,3 ± 0,23 • 105 КОЕ/мл.

Штамм L. acidophilus, выделенный из Лактоферона, снижал численность грибов рода Candida spp. и Е. coli в 6 и 4,5 раза, соответственно (до 0,6 ± 0,16 -103 и 0,7 ± 0,009-105 КОЕ/мл), бактерий рода Klebsiella spp. - в 1,5 раза (1,8 ± 0,22-105 КОЕ/мл).

Таблица 1 — Антагонистическая активность пробиотических штаммов

бактерий рода Lactobacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов, определенная методом отсроченного антагонизма

Микроорганизмы Микроцикол Колибактерин Бификол

Е. coli 2,1+0,26 1,1 ±0,18 1,1 + 0,22

Staphylococcus spp. - - -

Klebsiella spp. 1,7 ±0,35 - ' -

Candida spp. - - -

Таким образом, анализ полученных данных показал, что метод прямого антагонизма имеет качественные преимущества при оценке антагонистической активности Lactobacillus spp. В отношении условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с методом отсроченного антагонизма также пробиотические штаммы Е. coli антагонистически активны в отношении условно-патогенных Е. coli, а максимальная антагонистическая активность пробиотических Lactobacillus spp. отмечена в отношении бактерий рода Staphylococcus. Выявлено, что L. acidophilus антагонистически активнее, чем L. Amylovorum.

Антагонистическая активность стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов. При изучении антагонистической активности стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов было выявлено разнонаправленное действие.

Стимулировали рост бактерий рода Staphylococcus (0,151 ± 0,008 ОП) штаммы В. subtilis из препаратов Ветом 1.1 и Споробактерин в 1,5 раза (0,222 ± 0,007 ОП и 0,226 ± 0,002 ОП, соответственно) (р < 0,05), штамм В. cereus из препарата Бактисуб-тил - 1,2 раза (0,187 ± 0,003 ОП) (р < 0,05), штамм В. subtilis из препарата Споровит - в 1,1 раза (0,173 ± 0,006 ОП).

on

0,4

(IJS

Staphylococcus spp Kschcrichia spp Klebsiella spp Candid« spp

■ KOB'IPOJU, ■ b*KI Hivb IMA ■ BciOM * CuopuCiKIt'pHU В Сиоровш

Рисунок 2 — Антагонистическая активность стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов (*р < 0,05)

Наиболее выраженный антагонизм проявил штамм В. subtilis, выделенный из препарата Споровит в отношении грибов С. albicans, уменьшая значение оптической плотности бульонной культуры дрожжеподобных грибов в 1,3 раза (с 0,326 ± 0,011 ОП до 0,253 ± 0,005 ОП) (р < 0,05). Штамм В. cereus из препарата Бак-тисубтил угнетал рост С. albicans в 1,2 раза (0,281 ± 0,008 ОП) (р < 0,05). Штаммы В. subtilis из препаратов Ветом 1.1 (р < 0,05) и Споробактерин незначительно уменьшали рост грибов С. albicans (0,326 ± 0,011 ОП и 0,309 ± 0,013 ОП, соответственно). Так, штаммы В. subtilis из препаратов Споробактерин, Ветом 1.1 и Споровит стимулировали рост бактерий рода Klebsiella spp. (0,181 ± 0,005 ОП) на 26,5 (р < 0,05), 8,8 и 3,3%, соответственно (0,229 ± 0,004 ОП, 0,197 ± 0,017 ОП и 0,187 ± 0,008 ОП). В свою очередь штамм В. cereus из препарата Бактисубтил незначительно угнетал рост бактерий рода Klebsiella (0,177 ± 0,002 ОП). Штаммы В. subtilis из препаратов Ветом 1.1 и Споробактерин достоверно не изменяли численность Е. coli (0,244 ± 0,015 ОП и 0,247 ±0,019 ОП). Штамм

В. subtilis, выделенный из препарата Споровит (р < 0,05), и В. cereus, из препарата Бактисубтил, угнетали рост Е. coli (0,213 ± 0,008 ОП и 0,227 ± 0,006 ОП).

Таким образом, среди всех изученных пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus максимальной антагонистической активностью обладал штамм, выделенный из препарата Споровит в отношении грибов С. albicans.

Взаимное влияние на факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов и бактерий рода Lactobacillus, входящих в состав ветеринарных пробиотиков. Полученные результаты показали, что все изученные штаммы условно-патогенных микроорганизмов характеризовались способностью к инактивации как лизоцима, так и лактоферрина. Максимальное значение АЛфА установлено у Е. coli (2391,0 ± 368,01 нг/мл). При изучении влияния пробиотических штаммов бактерий рода Lactobacillus на перси-стентные свойства условно-патогенных микроорганизмов выявлено разнонаправленное воздействие на АЛА и снижение способности к инактивации лактоферрина у всех изученных штаммов, а также ингибирование роста стафилококков под воздействием/,, acidophilus, выделенной из препарата Лактобифадол. Так, антилактоферриновая активность Е. coli и S. aureus после их сокультивирования со штаммом L. amylovorum снизилась до 0 нг/мл. Отмечено также снижение данного признака под воздействием L. acidophilus из препарата Лак-тоферон у Е. coli на 92,4% от исходного уровня (182,5 ± 8,32 нг/мл), у S. aureus - на 96% (75,3 ± 4,73 нг/мл), а из препарата Лактобифадол у Е. coli - на 97% (67,7 ± 6,87 нг/мл). При этом грибы рода Candida достоверно не изменяли АЛфА под действием L. amylovorum (371,7 ± 49,42 нг/мл), в то же время у них отмечено увеличение данного признака при воздействии штамма L. acidophilus из препарата Лактобифадол на 92,7% (28,0 ± 4,54 нг/мл) и штамма/-, acidophilus из препарата Лакгоферон на 60,8% (151,7 ± 22,83 нг/мл). Максимальному снижению АЛфА у бактерий рода Klebsiella (до 8,0 ± 0,068 нг/мл) способствовало влияние на них штамма L. acidophilus из препарата Лактобифадол. Штамм L. acidophilus из препарата Лактоферон снижал признак на 78% (250,0 ± 9,74 нг/мл), a L. amylovorum - на 92,8% (85,0 ± 7,43 нг/мл).

Таблица 2 - Влияние условно-патогенных микроорганизмов на антилактоферриновую активность пробиотических штаммов бактерий рода Lactobacillus, нг/мл

Микроорганизмы Контроль Лактоферон Лактоамиловорин Лактобифадол

Е. coli 2391,0 ±368,01 182,5 ± 8,32*** - 67,7 + 6,87***

S. aureus 1908,0 + 22,92 75,3 ± 4,73*** - -

Klebsiella spp. 1157,0 + 23,43 250,0 ± 9,74*** 85,0 + 7,43*** 8,0 ± 0,068***

Candida spp. 3,85 + 0,54 151,7 + 22,83*** 371,7 + 49,42*** 28,0 + 4,54***

Примечание: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001, различия достоверны с данными группы сравнения.

Изучение влияния штаммов лактобацилл, выделенных из про-биотиков, на AJIA условно-патогенных микроорганизмов позволило установить, что все использованные в эксперименте лактобациллы стимулировали способность инактивировать лизоцим у Е. coli. Существенно не изменялась АЛА S. aureus: после воздействия штамма L. acidophilus из препарата Лактоферон и L. amylovorum из препарата Лактоамиловорин значения признака составляли 0,4i ± 0,01 мкг/мл и 0,38 ± 0,09 мкг/мл, соответственно. Штамм L. acidophilus из препарата Лактобифадол достоверно не изменял антилизоцимную активность грибов рода Candida (0,67 ± 0,09 мкг/мл), тогда как штамм L. amylovorum снижал признак на 57,1% (0,32 ± 0,01 мкг/мл), а штамм L. acidophilus из препарата Лактоферон — на 14,3% (0,56 ± 0,05 мкг/мл). Далее нами было изучено влияние условно-патогенных микроорганизмов на персистентные свойства лактобацилл, выделенных из пробиотиков. Установлено разнонаправленное влияние условно-патогенных микроорганизмов на АЛфА пробиотических штаммов бактерий рода Lactobacillus. В ходе исследования установлено, что лактобациллы из всех изученных пробиотиков обладают способностью к модификации персистентных свойств изученных условно-патогенных микроорганизмов. Они достоверно снижают АЛфА и разнонаправленно влияют на их АЛА. С другой стороны, показано, что все пробиотические штаммы лактобацилл обладают такими факторами персистенции, как АЛфА и АЛА, существенно не отличаясь между собой по уровню их экспрессии (исключение составляет АЛфА у L. acidophilus из препарата Лактоферон). При

этом условно-патогенные микроорганизмы также способны разнонаправленно влиять (снижение, повышение, индифферентный эффект) на персистентные свойства лактобацилл.

Таблица 3 — Влияние условно-патогенных микроорганизмов на антилизоцимную активность пробиотических штаммов бактерий рода Lactobacillus, Е. coli, кг/мл* ОП

Микроорганизмы До сокультивиро-вания Лакгоферон Лактоамило-ворин Лактобифадол

Е. coli 0,21 ± 0,01 0,64 ± 0,04* 0,44 ±0,05* 0,69 ± 0,08*

S. aureus 0,42 ± 0,01 0,41 + 0,01 0,38 ±0,09* -

Klebsiella spp. 0,60 ± 0,07 0,9 ± 0,08* 0,61 ±0,07 0,84 ± 0,06*

Candida spp. 0,64 ± 0,05 0,56 ± 0,05 0,32 ±0,01* 0,67 ± 0,09

До сокультивиро-вания Микроци-КОЛ Колибакгерин Бификол

Klebsiella spp. 0,62 ± 0,07 0,40 ±0,01 0,56 ± 0,03 0,67 ± 0,03

E. coli 0,23 ± 0,06 0,56 ± 0,08 0,58 ±0,07 0,65 ± 0,07

Staphylococcus spp. 0,41 ± 0,01 0,48 ± 0,06 0,59 ±0,04 0,63 ± 0,05

Candida spp. 0,60 ± 0,05 0,18 ±0,02 0,14 ±0,01 0,24±0,01

Примечание: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001, различия достоверны с данными группы сравнения.

Таким образом, установлено, что различные пробиотики по-разному влияют на персистентные признаки условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лактобацилл для создания биопрепаратов. При этом наиболее эффективным среди выбранных биопрепаратов оказался Лактоамило-ворин, снижающий АЛфА и АЛА у большинства изученных видов микроорганизмов.

Изучение влияния стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов. На следующем этапе исследования приступили к изучению изменения факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов под влиянием стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus.

Условно-патогенные микроорганизмы обладали высокими значениями антилактоферриновой активности. Максимальное значение АЛфА отмечено для Е. coli (2,39 ± 0,36 нг/мл) и убывало в ряду Staphylococcus spp. (1908,2 ± 22,91 нг/мл) —► Klebsiella spp. (1153,7 ± 22,86 нг/мл) С. albicans (3850,1 ± 54,32 нг/мл). После влияния стерильными фильтратами культуральной жидкости про-биотических штаммов бактерий рода Bacillus наблюдалось снижение АЛфА у Е. coli (р < 0,05). Так, антилактоферриновую активность Е. coli супернатанты бактерий рода Bacillus из пробиотиков Бак-тисубтил и Ветом 1.1 снижали в 1,2 раза (1953,2 ± 104,11 нг/мл и 1944,2 ± 112,10 нг/мл, соответственно), из препаратов Споробактерин и Споровит-в 1,3 раза (1907,2 ± 132,13 нг/мл и 1888,1 ± 137,12 нг/мл, соответственно).

Таблица 4 — Влияние стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на антилактоферриновую активность условно-патогенных микроорганизмов, нг/мл

Микроорганизмы АЛфА Пробиотики

до сокульти-вирования Бактисубтил Ветом 1.1 Споробактерин Споровит

Е. coli 2,39 + 0,36 1953,2 ± 104,11* 1944,3 + 112,11* 1907,2 + 132,13* 1888,1 + 137,11*

Staphylococcus spp. 1908,2 + 22,91 1907,1± 132,33 1720,2 + 115,40* 1860,1 + 133,10 1888,1 + 137,12*

Klebsiella spp. 1153,7 ± 22,86 1944,2 ± 112,40* 1773,3 ± 168,53* 1793,2 ± 152,11* 1793,2 ± 152,14

С. albicans 3850,1 + 54,32 1832,1 ± 137,72 1930,1 ± 121,82* 1860,3 + 140,10* 2002,3 ± 141,13*

Примечание: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001, различия достоверны с данными группы сравнения.

На следующем этапе работы изучалось влияние супернатантов бактерий рода Bacillus на способность условно-патогенных микроорганизмов к инактивации лизоцима (АЛА).

Все исследуемые условно-патогенные микроорганизмы обладали антилизоцимной активностью. Так, наименьшее значение АЛА отмечено у Е. coli (0,22 ± 0,06 мкг/мл* ОП) и увеличение признака

прослеживается в ряду Staphylococcus spp. (0,44 ± 0,02 мкг/мл* ОП) Klebsiella spp. (0,65 ± 0,01 мкг/мл* ОП) С. albicans (0,68 ± 0,05 мкг/мл* ОП). При изучении влияния стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов было выявлено разнонаправленное влияние.

Таблица 5 — Антилизоцимная активность микроорганизмов под действием стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов, мкг/мл* ОП

Микроорганизмы АЛА Пробиотики

до сокульти-вирования Споровит Ветом 1.1 Споробактерин Бактисубтил

Е. coli 0,22 + 0,06 0,42 + 0,05* 0,74 ± 0,034* 0,70 ± 0,06* 0,82 ±0,02*

Staphylococcus spp. 0,44 ± 0,02 0,90 + 0,02* 0,72 ± 0,004* 0,66 ±0,03* 0,51 ± 0,04*

Klebsiella spp. 0,65 ± 0,07 0,53 ± 0,04 0,53 ± 0,028 0,36 ±0,05* 0,34 ±0,03*

С. albicans 0,68 + 0,05 0,29 ±0,01* 0,21 ±0,044* 0,15 ±0,05* 0,07 + 0,01*

Примечание: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001, различия достоверны с данными группы сравнения.

После влияния стерильными фильтратами культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus наблюдалось достоверное (р < 0,05) повышение АЛА у бактерий рода Staphylococcus spp. и Е. coli. Так, антилизоцимную активность бактерий рода Staphylococcus spp. супернатант бактерий рода Bacillus из про-биотика Споровит увеличивал в 2 раза (0,90 ± 0,02 мкг/мл* ОП), из препарата Ветом 1.1 - в 1,6 раза (0,72 ± 0,02 мкг/мл* ОП), из пробиотика Споробактерин - в 1,5 раза (0,66 ± 0,03 мкг/мл* ОП) и из препарата Бактисубтил - в 1,1 раза (0,51 ± 0,04 мкг/мл* ОП).

Влияние бактерий рода Lactobacillus и Е. coli на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов. В результате проведенного эксперимента выявлено, что пробиоти-ческие штаммы лактобацилл неоднозначно влияют на способность условно-патогенных микроорганизмов формировать биопленки. Так, абсолютная потеря способности к биопленкообразованию отмечается

только в отношении Е. coli и грибов рода Candida после влияния L. acidophilus из Лактобифадола и незначительное снижение в 1,2 раза после L. amylovorus в отношении Staphylococcus (1,6 ± 0,07). L. acidophilus из Лактоферона и L. amylovorus достоверно не изменяли способность Е. coli к биопленкообразованию (1,2 ± 0,08 и 1,2 ± 0,06). В отношении бактерий рода Klebsiella все пробиотические штаммы вызывали увеличение способности формировать биопленки в среднем в 1,3 раза (2,7 ± 0,03). У бактерий рода Staphylococcus L. acidophilus из Лактоферона стимулировали биопленкообразование, увеличивая коэффициент в 1,7 раза (3,2 ± 0,14). L. acidophilus из Лактоферона и L. amylovorus достоверного изменения способности к биопленкообразованию у грибов рода Candida не вызывали (1,1 ± 0,04 и 1,1 ± 0,03).

Таблица 6 — Влияние бактерий рода Lactobacillus на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов, КБ

Микроорганизмы До сокульти-вирования Лактобифа-дол Лактоамиловорин Лакгоферон

Klebsiella spp. 2,1 ±0,02 2,7 ± 0,03* 2,7 ± 0,03* 2,7 ± 0,03

Staphylococcus spp. 1,9 ± 0,09 - 1,6 + 0,07 3,2 ±0,04

Candida spp. 1,2 + 0,03 - 1,1 + 0,03 1,1 + 0,04

E. coli 1,1 ±0,08 - 1,2 ±0,06 1,2 ±0,08

До сокульти-вирования Микроцикол Колибактерин Бификол

Klebsiella spp. 2,1 ±0,02 - 1,27 ± 0,08 1,1 ±0,06

Staphylococcus spp. 1,9 ±0,09 1,3 + 0,05 1,53 + 0,02 1,6 ±0,03

Candida spp. 1,2 ± 0,03 1,2 ±0,02 1,2 ±0,04 1,1 ±0,05

E. coli 1,1 ±0,08 1,1 ±0,06 1,1 ±0,05 1,3 ±0,04

Примечание: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001, различия достоверны с данными группы сравнения.

На способность к биопленкообразованию у бактерий рода Staphylococcus пробиотические штаммы Е. coli оказали угнетающее воздействие. Так, под воздействием супернатантов Микроцикол снижал коэффициент биопленкообразования в 1,5 раза (1,3 ± 0,05), а под воздействием супернатантов Колибактерин и Бификол - в 1,2 раза (1,5 ± 0,02 и 1,6 ± 0,03, соответственно).

Таким образом, коэффициент биопленкообразования после со-культивироваия штаммов грибов рода Candida с пробиотическими препаратами Е. coli достоверно не изменился.

Влияние стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов. В результате проведенного эксперимента выявлено, что стерильные фильтраты культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus снижают способность условно-патогенных микроорганизмов формировать биопленки. Так, абсолютная потеря способности к биопленкообразованию отмечалась у Е. coli и грибов С. albicans после влияния супернатантов бактерий рода Bacillus из препаратов Бактисубтил и Ветом 1.1 (р < 0,05), у бактерий рода Klebsiella — после воздействия супернатантом штамма В. subtilis из пробиотика Ветом 1.1 (р < 0,05).

У.Е.

Staphylococcus spp Escherichia spp Klebsiella spp Candida spp

■Контроль ■ LflKincyo i u.i 'Ветом ■ Спороолктсрмп ■ Споровнт

Рисунок 3 — Влияние стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на способность условно-патогенных микроорганизмов к биопленкообразованию (*р < 0,05)

Стерильные фильтраты культуральной жидкости бактерий В. subtilis из препарата Споробактерин и Споровит достоверно не изменяли способность к биопленкообразованию у Е. coli (1,2 ± 0,06 и 1,3 ± 0,01, соответственно), С. albicans (1,2 ± 0,05 и 1,3 ± 0,06, соответственно) и бактерий рода Staphylococcus (1,2 ± 0,03 и 1,3 ± 0,03, соответственно).

В отношении бактерий рода Klebsiella стерильные фильтраты культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus из пробиотиков Бактисубтил, Споробактерин и Споровит вызывали достоверное уменьшение (р < 0,05) способности формировать биопленки в 2 раза, 1,9 раз и 1,8 раз, соответственно (1,3 ± 0,01, 1,12 ± 0,03 и 1,19 ± 0,04).

Достоверное снижение способности к биопленкообразованию у бактерий рода Staphylococcus отмечалось после воздействия суперна-тантов бактерий рода Bacillus из пробиотиков Бактисубтил и Ветом 1.1 в 1,7 раз (1,2 ± 0,02 и 1,1 ± 0,07, соответственно) (р < 0,05).

Таким образом, при изучении влияния стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на способность условно-патогенных микроорганизмов к биопленкообразованию было установлено, что все изученные про-биотики вызывают снижение способности к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов вплоть до потери признака. Препаратом, наиболее эффективно снижающим способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов, является Бактисубтил.

ВЫВОДЫ

1. Метод прямого антагонизма имеет качественные преимущества при оценке антагонистической активности Lactobacillus spp. в отношении условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с методом отсроченного антагонизма. Пробиотические штаммы Е. coli антагонистически активны в отношении условно-патогенных микроорганизмов Е. coli, также!., acidophilus проявляет большую антагонистическую активность в сравнении с L. amylovorus, и максимальная антагонистическая активность пробиотических Lactobacillus spp.

отмечена в отношении бактерий рода Staphylococcus spp., а среди пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus - штамм, выделенный из препарата Споровит в отношении грибов С. albicans.

2. Установлено, что различные пробиотики по-разному влияют на персистентные признаки условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лактобацилл для создания биопрепаратов. При этом наиболее эффективным среди выбранных биопрепаратов оказался Лактоамиловорин, снижающий АЛфА и АЛА у большинства изученных видов микроорганизмов, а также снижают АЛА стерильные фильтраты культуральной жидкости пробиотических штаммов В. cereus из препарата Бактисубтил у бактерий рода Klebsiella и грибов С. albicans.

3. Пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus разнонаправленно влияют на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов, экзометаболиты пробиотических штаммов Е. coli вызывают снижение способности к биопленкообразованию у бактерий родов Klebsiella и Staphylococcus, также препарат Бакстисубтил снижал способность к биопленкообразованию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Лактоамиловорин, Лактоферон, Лактобифадол могут быть использованы для лечения и профилактики в ветеринарии и медицине инфекционно-воспалительных заболеваний, санации бактерионосителей, коррекции дисбиозов различной этиологии, так как штаммы, входящие в состав этих препаратов, сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени, устойчивы к условно-патогенным микроорганизмам,

2. Материал диссертационной работы может быть рекомендован для использования:

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на биологических, ветеринарных и микробиологических факультетах высших учебных заведений;

- при написании соответствующих разделов учебников, монографий, справочных руководств и пособий по ветеринарной микробиологии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаранкина, А.Ю. Регуляция способности условно-патогенных микроорганизмов к биопленкообразованию / А.Ю. Гаранкина, О.А. Капустина, O.JI. Карташова // Вестник ветеринарии: 1-я международная научно-практическая интернет-конференция «Современные направления в диагностике, профилактике и терапии заболеваний животных». - Ставрополь, 2011. - Выпуск № 59. - Ч. 4 - С. 61-63.

2. Гаранкина, А.Ю. Изучение антагонистической активности микроорганизмов, входящих в состав ветеринарных пробиотиков, в отношении условно-патогенных микроорганизмов / А.Ю. Гаранкина, О.А. Капустина, О.Л. Карташова, А.П. Жуков // Наука. Теория и практика. - Варшава, 2011. - С. 100-103.

3. Гаранкина, А.Ю. Регуляция факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов пробиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus spp. / А.Ю. Гаранкина, О.А. Капустина // Вестник ветеринарии: материалы международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии «Современные тенденции в ветеринарной медицине». - Ставрополь, 2012. - Выпуск № 63. -Ч. 4. - С. 47-49.

4. Гаранкина, А.Ю. Взаимное влияние на факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов и бактерий рода Lactobacillus spp., входящих в состав ветеринарных пробиотиков / А.Ю. Гаранкина, А.Ю. Капустина, О.Л. Карташова, Н.С. Пашинин. URL: http://vAvw.elmag.uran.ru. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. - 2012. - № 2.

Гаранкина Анна Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ПРОБИОТИКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 12.11.2013. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Печать трафаретная. Бумага офсетная. Заказ № 6743. Тираж 100 экз.

Издательский центр ОГАУ 460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18 Тел.: (3532) 77-61-43

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Гаранкина, Анна Юрьевна, Оренбург

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

042014=^4 Надравах рукописи

ГАРАНКИНА АННА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ПРОБИОТИКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Жуков А.П.

Оренбург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................... 5

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологические свойства кишечной микрофлоры............................ 9

1.2 Антагонистическая активность микроорганизмов в отношении условно-патогенных микроорганизмов, биопленкообразование.............

1.3 Фармакологическая характеристика пробиотиков........................ 23

1.4 Биологические аспекты пробиотикотерапии............................... 37

1.5 Практическая значимость применения пробиотиков в животноводстве........................................................................

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................... 47

III СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................... 60

3.1 Биологические свойства выделенных штаммов............................ 60

3.1.1 Изучение биологических свойств пробиотических штаммов Е. coli,

бактерий рода Bacillus, Lactobacillus............................................

3.2 Изучение регуляторного действия микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, на антагонистическую активность и персистентные 64 характеристики микроорганизмов.................................................

3.2.1 Антагонистическая активность микроорганизмов, входящих в состав ветеринарных пробиотиков в отношении условно-патогенных 64 микроорганизмов......................................................................

3.2.2 Антагонистическая активность стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода 67 Baccillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов...............

3.2.3 Взаимное влияние на факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов и бактерий рода Lactobacillus, входящих в состав 69 ветеринарных пробиотиков...........................................................

3.2.4 Изучение влияния стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на факторы

персистенции условно-патогенных микроорганизмов........................ 74

3.3 Регуляция способности условно-патогенных микроорганизмов к

77

биопленкообразованию...............................................................

3.3.1 Влияние бактерий рода Lactobacillus и Е. coli на способность к

77

биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов.............

3.3.2 Влияние стерильных фильтратов культуральной жидкости пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на способность к 81 биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов..............

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................84

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................95

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................................................96

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК....................................................................................97

Список сокращений

АЛА - антилизоцимная активность

АЛфА - антилактоферриновая активность

БАВ - биологически активные веществ

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕД - единица действия

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КРС - крупный рогатый скот

КОЕ - колониеобразующая единица

МП- миелопероксидаза

ОП - оптическая плотность

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время эффективное ведение животноводства и птицеводства просто немыслимо без применения пробиотиков. Предпосылкой являются уникальные качества этих препаратов, а именно способность одновременно интенсифицировать пищеварительные процессы, стимулировать неспецифическую резистентность - тем самым повышать продуктивные качества сельскохозяйственных животных и птиц (Лебедева И.А., 2008, Мирошников С.А., 2008, Ушакова Н.Ф., 2012).

Между тем, большая часть исследований посвящена определению эффективности воздействия пробиотиков на продуктивные качества сельскохозяйственных животных, при этом доля микробиологических экспериментов по данному направлению чрезвычайно мала. В данный момент пробиотики практически нефассматриваются как регуляторы антиоксидантного статуса макроорганизма, что, однако, не исключает их вероятную и эффективную роль в поддержании устойчивости организма к активным формам кислорода (Панин А.Н., Малик Н.И., 2006; Сидоренко О.Д., 2010).

Использование пробиотиков является одним из наиболее эффективных и физиологических путей профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, а также развивающихся вследствие этого вторичных расстройств не только пищеварительной, но и иммунной, эндокринной систем (Смирнова Т.А., 2010).

Для коррекции дисбиотических состояний наиболее рационально и физиологически обосновано использование пробиотиков - живых микробных культур, входящих в состав пищевых добавок. Изучение условий регулирующего воздействия на персистентные свойства микроорганизмов открывает возможности для поиска эффективных методов терапии и профилактики заболеваний (Stanton Т.В., 2013).

Часто возникает проблема постепенного снижения уровня антагонистической активности для препаратов, выпускаемых на основе давно известных производственных штаммов, что в конечном итоге отражается на

лечебно - профилактической эффективности пробиотика. Таким образом, необходимо изучение антагонистической активности подобных штаммов (Давыдов Д.С., 2007).

В последние годы отмечается возрастающая роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении острых кишечных инфекций. Однако факт выделения указанных микроорганизмов не всегда свидетельствует об их этиологической значимости при данных заболеваниях. В итоге эффективность препарата снижается, что вызывает нарекания со стороны специалистов. В связи с этим, актуальным и интересным является исследование, направленное на изучение регуляции пробиотиками персистентных характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. (Алешкин В.А., Тихонова Н.Т., 2002).

Целью работы явилось исследование антагонистической активности штаммов, входящих в состав пробиотиков, и их влияние на биологические свойства патогенных и условно - патогенных микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить антагонистическую активность микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- определить влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков на биологические свойства (персистентные характеристики) патогенных и условно - патогенных микроорганизмов;

- установить влияние микроорганизмов на способность патогенных и условно - патогенных микроорганизмов к биопленкообразованию.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна. Установлено, что различные пробиотики по разному влияют на персистентные признаки и способности к биопленкообразованию

условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лактобацилл при создании новых биопрепаратов. Установлено, что наиболее эффективным среди выбранных биопрепаратов оказался Лактоамиловорин, снижающий антилактоферриновую и антилизоцимную активности у большинства изученных видов микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в расширении представлений о влиянии производственных штаммов пробиотических микроорганизмов на биологические свойства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Полученные данные могут представлять интерес с точки зрения формирования колонизационного потенциала пробиотиков, поскольку известно, что штаммы микроорганизмов с высокими показателями персистентных признаков переживают в организме более длительное время. Полученные данные могут быть использованы в практике ветеринарного врача при коррекции дисбиотических нарушений с использование эффективных пробиотиков, отобранных под контролем биологических характеристик.

Реализация результатов исследования. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе и проведении научно-исследовательской работы в Оренбургском, Саратовском ГАУ, Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина, Самарской, Ижевской, Вятской ГСХА, в ГАУ Северного Зауралья, в Рязанском агротехнологическом университете им. П.А. Костычева, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены, одобрены и опубликованы в трудах итоговых научных конференций: VII международной научно-практической конференции «Наука. Теория и практика-2011» (Варшава, 2011); 1-й международной научно-практической Интернет-конференции (г. Ставрополь, 2011), Международной научно-практической Интернет- конференции (Ставрополь, 2012).

Публикации результатов исследований. Основные положения

диссертации изложены в четырех научных работах, в том числе две публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В изучении антагонистической активности метод прямого антагонизма имеет качественные преимущества при оценке антагонистической активности Lactobacillus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

2. Различные пробиотики не одинаково влияют на персистентные признаки условно-патогенной микрофлоры, что необходимо учитывать при отборе штаммов лактобацилл для создания биопрепаратов.

3.Пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus разнонаправленно влияют на способность к биопленкообразованию условно-патогенных микроорганизмов.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 118 страницах печатного текста; включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические рекомендации, библиографический список. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 11 таблицами. Библиографический список включает 219 источников, в том числе - 74 иностранных автора.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологические свойства кишечной микрофлоры

Сложный, динамичный комплекс, включающий в себя разнообразные по количественному и качественному составу ассоциации микроорганизмов й продукты их биохимической активности (метаболиты) в определенных условиях среды обитания, называют микроэкологической системой (Мазанкова Л.Н., Запруднова A.M., 1996).

Микрофлора пищеварительного тракта представляет собой экологическую систему, включающую, наряду с кишечными бактериями, слизистые оболочки хозяина, компоненты пищи, вирусы, грибы - всего более 400 видов. Основная масса микрофлоры фиксирована к специфическим рецепторам энтероцитов слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, формируя своеобразную биопленку, сбалансированную по видовому составу и функциональному распределению, и лишь незначительная часть ее находится в свободном состоянии в просвете кишки. Количество бактерий на поверхности слизистой оболочки тонкой кишки на шесть порядков превышает содержание их в полости кишки. В 1 мл внутрипросветного содержимого по мере продвижения от желудка к толстой кишке количество микроорганизмов колониеобразующих единиц (КОЕ) увеличивается с 102_3 до 1011-12. Вместе с этим увеличивается доля анаэробных микроорганизмов и снижается их окислительный потенциал (Алямкин Ю., 2005; Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Осипов Г.А., 2006; Шульпекова Ю.О., 2010, 2003; Лиминова О. А. и др., 2010; Яковенко Э.П. и др., 2010; Marteau Р., 2005; Gibson G.R., Macbarlane G.T., 1995; Vrese M., Schrezenmeir Y., 2008).

Способность микроорганизмов фиксироваться к строго определенным рецепторам эпитеальных клеток слизистой оболочки связана с тем, что состав кишечных бактерий каждого биотопа пищеварительного тракта является постоянным. В кишечном биоценозе у физиологически здорового, зрелого организма равномерно присутствуют многочисленные представители как

нормальной, так и условно-патогенной микрофлоры. Посредством сложных иммунных, гормональных и морфофункциональных реакций макроорганизм регулирует определенный баланс между ними (Панин А.Н., 1996; Сидоров М.А. и др., 2000; Шендеров Б.А.,1998; Meance S., 2003;Young K.D., 2006; тендеров Б.А., 2010).

При борьбе с заболеваниями инфекционной природы внимание специалистов в первую очередь обращено на патогенные микроорганизмы. В то же время известно, что в возникновении и развитии болезни играет немаловажную роль нормальная микрофлора, которая способствует или препятствует ее проявлению, а зачастую блокирует пути и возможности развития инфекционного процесса (Антипов В.А., 1991; Хабкин А.И., 2003; Тараканов Б.В., 2007).

Б.А. Шендеровым накопленные данные о метаболитдческой активности нормальной микрофлоры, позволяющие судить о ее значении для гомеостаза живого организма, побудили скандинавских ученых в 1985 году предложить два специальных термина, определяющих взаимоотношения хозяина и его микрофлоры: MAC - микроорганизм - ассоциированная характеристика и GAS - характеристика, не связанная с микроорганизмами. Для лучшего ориентирования во взаимоотношениях хозяина и его микрофлоры Б.А. Шендеров предложил помимо MAC и GAS ввести дополнительный термин - MAIF - микроорганизм - ассоциированная интегральная функция -параметр, являющийся конечным этапом каскадных реакций взаимодействия хозяина и его нормофлоры (Шендеров Б.А., 1998).

К представителям нормальной непатогенной кишечной микрофлоры относят бифидобактерии, лактобактерии, стрептококки, пропионовокислые бактерии, часть спорообразующей микрофлоры, некоторые дрожжи и грибы. Из нормальной микрофлоры кишечника человека и животных под действием лизоцима и других литических агентов образуются адъювантно-активные соединения, действующим началом которых является мурамилдипептид (МДП). Проникая в кровь, эти соединения стимулируют иммунную систему

организма, профилактируют возникновение аллергических реакций и даже предотвращают развитие рака (Trafalska Е. et al., 2004; Amit-Romach Е. et al., 2004).

Микрофлора кишечника стимулирует созревание механизмов общего и местного иммунитета, оказывая антигенное раздражение слизистой оболочки. Достаточную напряженность местного иммунитета, выработку иммуноглобулина А и высокую фагоцитарную активность обеспечивает присутствие постоянного микробного раздражителя и контакт с макрофагами и лимфоцитами в области пейеровых бляшек. В основе иммунологической толерантности лежит в то же время постоянный контакт с иммунными клетками. Таким образом, необходимую степень напряженности системного иммунитета поддерживают компоненты кишечных бактерий, которые проникают в системный кровоток (Косенко И.М., 2009; Mitsuoka Т., 1974; Hamid R. et al., 2006; Kabir S., 2009).

Желудочно-кишечный тракт плода стерилен в период внутриутробного развития. Желудочно-кишечный тракт новорожденного колонизируется микрофлорой через рот, во время прохождения по родовым путям матери. Бактерии Е. coli и стрептококки можно обнаружить в желудочно-кишечном тракте через несколько часов после рождения, причем они распространяются ото рта к анусу. Различные штаммы бифидобактерий и бактероиды появляются в желудочно-кишечном тракте спустя 10 дней после рождения (Каширская Н. Ю., 2000).

Три фазы микробного заселения кишечника в первый месяц после рождения выделяют A.M. Запруднов и J1.H. Мазанкова (2001):

1 этап (асептический) - длится 10-20 часов с момента рождения;

2 этап - длится первые 2-4 дня. На данном этапе происходит первичное заселение кишечного тракта новорожденного различными микроорганизмами, в первую очередь кокками;

3 этап - длится 1-1,5 месяца - это период, когда микрофлора кишечника становится такой, какой она будет свойственна данному организму.

Таблица 1 - Основные функции и нормальной микрофлоры

Функция Механизм реализации

Колонизационная резистентность Межмикробный антагонизм (продукция органических кислот, перекиси водорода, мурамидазы, бактерицинов, микроцинов и других антагонистически активных веществ). Активация иммунной системы, активация фагоцитоза, индукция синтеза иммуноглобулинов, лизоцима, интерферона, цитокинов

Детоксикационная Гидролиз продуктов метаболизма белков, липидов, углеводов, деконъюгация желчных и гидроксилирование жирных кислот, инактивация гистамина, ксенобиотиков и др.

Синтетическая Образование аминокислот, летучих жирных кислот, витаминов, гормонов, биоактивных аминов и других биологически активных веществ (БАВ)

Пище