Научное обоснование возможности применения штаммов пробиотических микроорганизмов и оценка их биологической активности при экспериментальной холере

Кругликов, Владимир Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Научное обоснование возможности применения штаммов пробиотических микроорганизмов и оценка их биологической активности при экспериментальной холере
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Научное обоснование возможности применения штаммов пробиотических микроорганизмов и оценка их биологической активности при экспериментальной холере"

На правах рукописи

КРУГЛИКОВ Владимир Дмитриевич

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ШТАММОВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОЦЕНКА ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХОЛЕРЕ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 О ИЮЛ 2014

Ростов-на-Дону 2014

005550396

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Ростов-ский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Официальные оппоненты:

Замараев Валерий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии с курсом клинической микробиологии

Швиденко Инна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Саяпина Лидия Васильевна, доктор медицинских наук, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава Российской Федерации, главный эксперт Ведущая организация:

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Защита состоится « 29 » октября 2014 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте

http://wwu".microbe.ru/main/disser/dissert/ Российского научно-исследовательского

противочумного института «Микроб».

Автореферат разослан ^'С/чР 2014 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Слудский A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная неблагополучная эпидемиологическая обстановка по холере в мире и реальная угроза завоза инфекции на территорию Российской Федерации обусловливают неблагоприятный прогноз по этому высоко контагиозному заболеванию [Онищенко Г.Г. с соавт., 2007; Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., 2010; Назаретян А.А., Москвитина Э.А., 2013]. Ведущая роль в этиологии холеры принадлежит генетически измененным токсигенным штаммам Vibrio cholerae El Тог, однако не утрачивает своего значения V.cholerae 0139. Нельзя исключать из числа возбудителей и V.cholerae classical [Смирнова Н.Н. с соавт., 2008, 2014; Alam М. et al., 2012; Hasan N.A. et al., 2012; Yu L. et al., 2012]. Заболеваемость диарейными инфекциями, вызванная холерными вибрионами, может быть связана с атоксигенными штаммами V.cholerae El Тог [Ерошенко Г. А. с соавт., 2008; Монахова Е.В., 2012, 2013] и с V.cholerae non01/non0139 [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001,2006; Авдеева Е.П. с соавт., 2006].

Существует серьезная проблема, обусловленная формированием и циркуляцией штаммов V.cholerae с множественной антибиотикорезистентностью, что осложняет использование регламентированных антибактериальных препаратов при профилактике и лечении этой инфекции [Рыжко И.В. с соавт., 2005; Дудина Н.А., 2007; Селянская Н.А. с соавт., 2012; Ghosh A., Ramamurthy Т., 2011 и др.]. По данным ВОЗ, «массовая химиопро-филактика» относится к неэффективным мерам борьбы с холерой в связи с возможностью формирования носительства, дисбиозов и дисбактериозов, а вопрос адекватности экстренной профилактики в очаге холеры продолжает оставаться предметом дискуссии [Савельев В.Н. с соавт., 2005; Онищенко Г.Г. с соавт., 1995, 2006]. Вышесказанное свидетельствует об актуальности проведения исследований, направленных на совершенствование схем экстренной профилактики и этиотропной терапии при холере. В связи с этим приобретают интерес разноплановые экспериментальные работы, ориентированные на поиск неантибиотических потенциальных лечебно-профилактических биологических средств (бактериофагов, бактериоцинов, пептидов животного и растительного происхождения, «антипатогенных» лекарственных препаратов и др.) [Вахитов Т.Я. с соавт., 2006; Андрусенко И.Т. с соавт., 2009; Jaiswal A. et al., 2013].

С нашей точки зрения, целесообразным является изучение биологической активности штаммов пробиотических микроорганизмов, или пробиотиков (синоним - эубио-

тиков [Ардатская М.Д., 2008]) по отношению к V.cholerae. К пробиотикам относятся

бактерии облигатной микрофлоры, сахаромицеты и апатогенные спорообразующие микроорганизмы, которые в различных сочетаниях могут входить в состав лекарственных препаратов, БАДов (биологически активных добавок), продуктов функционального питания и др. [Ливзан М.А., Костенко М.Б., 2008; Горелов A.B. с соавт., 2011; Dinleyici Е.С. et ed., 2012 и др.]. В отличие от пищевых продуктов и БАДов, для лечебных препаратов используются только те штаммы, терапевтическая эффективность которых доказана [Бондаренко В.М., Лиходед В.Т., 2008; Шульпекова Ю.О., 2012]. Пробиотические микроорганизмы повышают колонизационную резистентность (KP) слизистой кишечника, проявляют антагонизм по отношению к энтеропатогенным (ЭПМ) и условно-патогенным микроорганизмам (УПМ). Встречаются штаммы, обладающие антибиоти-корезистентностью [Алешкин A.B. с соавт., 2009; Савченко Т.Н., 2011; Петраков Е.С., 2010; Kim Y. et al., 2008; Kleerebezem M. et al., 2010 и др.]. В последнее время изучается эффективность аутопробиотикотерапии при экспериментальном дисбакгериозе [Чичерин И.Ю. с соавт., 2013]. Вместе с тем, основными показаниями к применению пробио-тических препаратов продолжают оставаться острые кишечные инфекции (ОКИ), а также дисбиозы различного генеза [Горелов A.B. с соавт., 2011; Воронин A.B. с соавт., 2013; Rohde C.L. et al., 2009; Grandy G. et al, 2010 и др.]. Пробиотики назначаются до, после или на фоне проведения курса этиотропной терапии, не исключая вариант «пробиотики без антибиотиков» [Терновская JLH. с соавт., 2005; Учайкин В.Ф. с соавт., 2012].

В течение последних лет в экспериментальных работах рассматривается возможность применения пробиотических бактерий и их метаболитов в комплексе с антибактериальными препаратами при лечении особо опасных инфекций (ООИ) бактериальной этиологии (чума, сибирская язва, туляремия) [Воробейчиков Е.В.с соавт., 2006; Добрынин В.М. с соавт., 2009; Шапошникова М.Ю. с соавт., 2009]. Данные литературы по этой проблеме в отношении холеры отсутствуют. Более того, сведения по действию пробио-тиков на холерный вибрион носят лишь фрагментарный характер. В частности, показана профилактическая активность живой культуры аэрококков на экспериментальной модели холерной инфекции [Божко Н.В., 1992]. В некоторых исследованиях in vitro продемонстрированы: ингибирующее действие на холерный токсин (XT) культуры дрожжевого грибка Saccharomyces boulardii [McFarland L.V., Bernasconi I.P., 1997]; антагонистическая активность энтерококков и лактобакгерий по отношению к ограниченному числу штаммов холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп и некоторых других представи-

телей рода Vibrio [Simonetta A.C. et al., 1997; Tetsuro К. et al., 1998]; подавление роста возбудителя холеры субстанциями, вырабатываемыми лактобактериями, входящими в состав фекальной микробиоты человека [Silva S.H. et al., 2001].

Таким образом, до начала наших исследований отсутствовало систематизированное представление по воздействию пробиотических микроорганизмов на холерный вибрион. Так, не изучена антагонистическая активность пробиотиков различной родовой и видовой принадлежности по отношению к V.cholerae. Не проведено сравнительное изучение антагонизма пробиотиков против штаммов в пределах вида V.cholerae. Не разработаны критерии целенаправленного отбора штаммов пробиотических микроорганизмов - антагонистов холерных вибрионов, как производственных, так и предлагаемых в качестве основ для разработки новых препаратов. Не решена проблема научно-экспериментального обоснования возможности и перспективности применения штаммов пробиотических микроорганизмов на моделях холерной инфекции, в том числе для предупреждения постинфекционных осложнений. Это определило актуальность и целесообразность проведения настоящего исследования.

Цель работы. Комплексное изучение биологической активности пробиотических микроорганизмов по отношению к Vibrio cholerae in vitro и на экспериментальных моделях холеры; отбор и характеристика антибиотикоустойчивого штамма - антагониста холерных вибрионов как основы разработки нового пробиотика.

Основные задачи исследования:

1. Отбор штаммов пробиотических микроорганизмов различной родовой и видовой принадлежности, как составляющих основу распространенных коммерческих препаратов, так и не являющихся производственными. Получение селекционным путем из производственной закваски «Симбиоз ацидофильных палочек. ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР» нового антибиотикорезистентного штамма лактобацилл - антагониста холерных вибрионов.

2. Фено- и генотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории России от больных и из объектов окружающей среды; подбор различных по происхождению, токсигенности и серологической принадлежности штаммов для использования при тестировании пробиотических микроорганизмов по параметру антагонизма к V.cholerae.

3. Сравнительное изучение испытуемых штаммов пробиотиков по антагонизму в отношении холерных вибрионов, адгезивности и кислотообразующей активности in vitro.

4. Разработка критериев отбора штаммов пробиотических бактерий, обладающих биологической активностью по отношению к холерным вибрионам in vitro и in vivo, и на основе этих критериев - способа комплексной оценки противохолерной активности пробиотиков in vitro. Отбор пробиотического штамма с оптимальным сочетанием параметров биологической активности.

5. Фено- и генотипическая характеристика отобранного пробиотического штамма, включая полногеномное секвенирование. Изучение его биологических свойств в соответствии с современными требованиями к штаммам, предлагаемых для разработки новых препаратов пробиотиков.

6. Лабораторно-экспериментальное изучение отобранного штамма пробиотика в расширенном диапазоне биологических свойств: антагонизма по отношению к штаммам V.cholerae, вызвавших эпидосложнения на территории России в последние десятилетия, и приживляемости в кишечнике лабораторных животных на фоне ангибиотико-терапии.

7. Разработка на основе отобранного штамма лабораторно-экспериментальных серий нового пробиотика в лиофилизированном и кисломолочном виде.

8. Оценка эффективности разработанного пробиотика при различных схемах его использования на экспериментальных моделях холеры, в том числе в сочетании с антибиотиками и с холерным бактериофагом, а также при дисбиозах.

Научная новизна и теоретическая значимость. Из производственной закваски (ПЭЗ ВНИИМ МММП СССР), разрешенной к использованию в пищевой промышленности, селекционным путем получен полиангибиотикорезистентный штамм Lactobacillus acidophilus В КМ В-2020 Д, обладающий антагонистической активностью в отношении холерных вибрионов, возбудителей других ОКИ и УПМ, превосходящий по биологическим параметрам все испытуемые штаммы пробиотиков. Приоритет подтвержден патентом на изобретение № 2063436 от 10.07.96 г. «Штамм Lactobacillus acidophilus -антибиотикорезистентный антагонист возбудителей кишечных инфекций».

Впервые проведен сравнительный анализ антагонистической активности пробиотических бактерий - представителей различных родов и видов по отношению к холер-

ным вибрионам разных биоваров, серогрупп и токсигенности, выделенных от людей, из водных объектов окружающей среды и охарактеризованных по фено- и генотипическим свойствам.

Впервые на основании комплексной оценки антагонистической активности по отношению к V.cholerae 01, 0139, non01/non0139 различного происхождения и эпидемической опасности, а также адгезивности и кислотообразующей активности пробиотиков разработаны и научно обоснованы критерии отбора наиболее перспективных штаммов пробиотических бактерий. Приоритет подтвержден патентом на изобретение № 2487943 от 20.07.13 г. «Способ оценки биологической активности лактобацилл и бифи-добактерий относительно холерных вибрионов in vitro». Получены данные по сравнительной характеристике биологической активности по отношению к V.cholerae штаммов пробиотических микроорганизмов, входящих в состав коммерческих пробиотиков или предлагаемых для производственного использования.

Показаны способность штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к приживлению в кишечнике лабораторных животных с сохранением жизнеспособности лактобактерий на фоне воздействия терапевтических доз антибиотиков, к которым данный штамм устойчив. Показано отсутствие влияния дополнительно наведенной устойчивости к рифампи-цину на стабильность биологических свойств штамма Lacidophilus ВКМ В-2020 Д.

Впервые в модельных опытах доказана эффективность использования нового пробиотика «Лактоацид-Р» на основе антибиотикорезистентного штамма Lacidophilus ВКМ В-2020 Д при экспериментальной холере в целях профилактики и на фоне лечения инфекции антимикробными препаратами, к которым устойчив пробиотик, но чувствителен возбудитель, а также в сочетании с холерным бактериофагом. Установлено, что ла-бораторно-экспериментальные серии препарата «Лактоацвд-Р» предотвращают постинфекционные осложнения (вибриононосительство и нарушения микробиоценоза кишечника лабораторных животных).

Инновационная составляющая проведенных исследований состоит в научном обосновании возможности и эффективности применения пробиотических бактерий, отобранных с использованием способа комплексной оценки биологической активности пробиотиков по отношению к V.cholerae, в качестве дополнительных средств экстренной профилактики, лечения на фоне этиотропной и фаготерапии, а также коррекции дисбио-тических состояний при экспериментальной холере. Впервые научно и эксперименталь-

но обоснована целесообразность и перспективность проведения дальнейших нормативно регламентированных испытаний коммерческих и вновь разрабатываемых препаратов (на основе штаммов пробиотических бактерий - ашагонистов У.Мегае) с целью расширения спектра противохолерных средств.

Практическая значимость работы. Штамм с исходным наименованием Ь.аааорУШш Р-1, полученный нами из «Симбиоза ацидофильных палочек» производственной закваски (ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР) путем селекции на популяционном уровне по признаку антагонизма к У.сИокгае, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской академии наук (ИБФМ РАН) под номером ВКМ В-2020 Д. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате полногеномного секвенирования ДНК Ь.асШорИИиз ВКМ В-2020 Д, депонированы в международных базах данных П0В1/ЕМВ170епВапк под общим номером доступа ШШОООООООО (номер в подразделе геномных проектов ВюРиуесЬ РШНА243251; номер организма в подразделе Вю8атр1е: 8АММ02713604) и дополняются по мере обработки данных. Показана 100% идентичность гена 168-рРНК таковому штамма Ь.аМорШи* РКЭР (КР548315.1). Штамм был использован в научно-исследовательской работе специалистами Ростовского-на-Дону государственного медицинского университета (РостГМУ) (акт внедрения от 12.03.09).

На основе штамма Ь.аЫс1орШ1из ВКМ В-2020 Д с использованием модифицированных нами методик разработан новый экспериментальный пробиотик «Лактоацид-Р», на который оформлена научно-техническая документация: «Инструкция по изготовлению и контролю препарата «Лактоацид-Р сухой» и «Отчет о лабораторно-экспериментальном испытании нового медицинского бактериального препарата «Лактоацида-Р», одобренная Ученым советом РостНИПЧИ и утвержденная директором института (протокол № 8 от 10.11.05).

Усовершенствована методика приготовления препаратов пробиотиков (эубио-тиков) в кисломолочном виде, что даёт возможность многократного стандартного воспроизводства циклов приготовления, гарантирует качественные и количественные характеристики в соответствии с требованиями к пищевым кисломолочным продуктам и увеличивает срок годности готовых пробиотиков до 21 сут. Разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и применению препаратов-эубиотиков в

кисломолочном виде в лечебно-профилактической практике», которые одобрены Ученым советом РостНИПЧИ и утверждены директором (протокол № 5 от 09.10.07). Методические рекомендации были апробированы в научно-исследовательской и практической работе с коммерческими препаратами, назначаемыми в лечебно-профилактических целях сотрудниками РостГМУ (акт внедрения от 12.03.09) и специалистами ФБУН «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» (ФБУН РостовНИИМП, акт внедрения от 11.02.13).

Разработаны, одобрены Ученым советом ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора и утверждены директором «Методические рекомендации по оценке противохолерной активности пробиотиков» (протокол № 2 от 27.03.12). Материалы были использованы в научно-исследовательской работе сотрудниками ФБУН РостовНИИМП (акт внедрения от 12.02.13), а также специалистами лаборатории холеры ФКУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» (акт внедрения от 22.02.13).

Методические подходы к выделению, фено- и генотипической характеристике штаммов холерных вибрионов вошли в состав МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 31.05.07, МУК 4.2.2870-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровня», утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 25.05.12, и практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (под редакцией акад. РАМН Г.Г. Онищенко и акад. РАМН В.В. Кутырева. М.: ЗАО «Шико», 2013).

Основные положении, выносимые на защиту: 1. Селекционным путем по параметру антагонистической активности по отношению к У.сИокгае получен новый антибиотикоустойчивый штамм Ь.аЫскзрИИш ВКМ В-2020 Д с наведенной дополнительной резистентностью к рифампицину. Экспериментально доказано, что по фено- и генотипической характеристикам штамм Ь.ас'к1орЫ1ш ВКМ В-2020 Д соответствует современным требованиям к отбору, проверке и хранению штаммов, предлагаемых в качестве производственных.

2. Использование модифицированной нами методики отсроченного антагонизма позволило впервые установить, что штаммы пробиотических микроорганизмов разной родовой и видовой принадлежности обладают антагонистической активностью по отношению к штаммам вида V.cholerae с различными фено- и генотипическими характеристиками, в том числе к эпидемически опасным. Наиболее сильными антагонистами являются представителями родов Lactobacillus и Bifidobacterium и вида L.acidophilus.

3. Впервые определены критерии отбора штаммов пробиотических бактерий, обладающих противохолерной активностью: антагонистическая активность по отношению к V.cholerae - высокая или средняя; адгезивность - только средняя; кислотообразующая активность - высокая или средняя.

4. На основе установленных критериев разработан способ оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий по отношению к холерным вибрионам. Способ позволяет целенаправленно выявлять наиболее активные пробиотики против V.cholerae среди известных производственных штаммов, а также осуществлять поиск штаммов, перспективных для использования при разработке новых препаратов. Доказано, что штамм ¿.acidophilus ВКМ В-2020 Д по сочетанию биологических свойств обладает преимуществом перед производственными.

5. На основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д - антагониста холерных вибрионов и с использованием модифицированных нами методик разработан новый экспериментальный пробиотик «Лакгоацид-Р» в лиофилизированном и кисломолочном виде, который соответствует предъявляемым требованиям системы предрегистрационного, доклинического изучения безопасности пробиотиков.

6. Впервые доказано, что использование лабораторно-экспериментальных серий про-биотика «Лактоацид-Р» повышает эффективность профилактики и лечения экспериментальной холеры, в том числе на фоне антибактериальной терапии или в сочетании с холерным бактериофагом. При этом предотвращаются постинфекционные осложнения, связанные с вибрионосительством, и оптимизируется микробиоценоз кишечника лабораторных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 1990); Всероссийской научно-практической конференция «Современные достижения биотехнологии» (Ставро-

ПОЛЬ, 1996); юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); юбилейной конференции Северо-Кавказского отделения Российского общества патофизиологов «Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинике» (Ростов-на-Дону, 1999); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Екатеринбург, 1999); юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 2000); международном конгрессе «Ninth International Congress for Culture Collections» (Brisbane, Australia, 2000); юбилейной научной конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очашвые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); второй межгосударственной научно-практической конференции по взаимодействию государств-участников СНГ в области санитарной охраны территории (Алматы, 2001); международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); XV, XVII, XIX Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2009, 2011, 2013); на заседаниях проблемной комиссии научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2000,2002,2003,2005-2011).

Исследования выполнены в рамках пяти плановых научных тем: «Изучение нового штамма лактобацилл для возможного использования при кишечных инфекциях» (№ 022-4-93, инициативный план); «Использование лактобацилл в лечении и профилактике холеры на экспериментальных моделях» (№ ГР 01 950 003709); «Новый бактерийный препарат для лечения и профилактики диарейных заболеваний» (№ ГР 01.9.70 009318); «Оценка биотерапевтического препарата (эубиотика) «Лактоацид-Р» в доклинических испытаниях» (№ ГР 01.20.03 11549), «Пробиотики: комплексная оценка сравнительной эффективности противохолерного действия» (№ ГР 0120.0 800417), в которых автор являлся руководителем или соруководителем.

Публикация результатов исследования. Материалы исследований отражены в 42 опубликованных работах, из них 17 - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образо-

вания и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.

Структура диссертации. Диссертация построена по традиционному плану, изложена на 284 страницах, состоит из введения, одной главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов, иллюстрирована 42 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит ссылки на 410 публикаций (240 отечественных и 170 зарубежных).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе было использовано 40 штаммов пробиотических бактерий, относящихся к 5родам {Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia, En-terococcus и Saccharomyces) и к 22 видам, полученных из ВКМ, из Тартуского государственного университета, выделенных из коммерческих препаратов, а также авторский штамм L acidophilus ВКМ В-2020 Д полученный селекционным путем; 108 штаммов V. cholerae различного происхождения, разных биоваров, серогрупп и эпидемической опасности; холерный бактериофаг К-1; по 20 штаммов энтеропатогенных (ЭПМ) и условно-патогенных (УПМ) микроорганизмов, предоставленных музеем живых культур, лабораторией бактериофагов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребна-даора, ФГБУ «ГИСК им. JI.A. Тарасевича» и Тартуским государственным университетом. При проведении исследований с пробиотиками использовали питательные среды МРС лабораторного приготовления, коммерческие среды производства ФГУН ГНЦПМиБ (г. Оболенск), HiMedia Laboratories Pvt Ltd. India и др., с V. cholerae - среды, рекомендованные МУК 4.2.2218-07. Генотипирование V. cholerae проводили с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров [Онищенко Г.Г. с соавт., 2007; Ерошенко Г.А. с соавт, 2008; Монахова Е.В., 2012]. Rif* мутант штамма L.acidophilus Р-1 получали методом одноступенчатого наведения устойчивости к рифампицину при посеве бактерий на плотную питательную среду МРС-1 с концентрацией антибиотика 200 мкг/мл. Изучение пробиотических штаммов по параметрам антагонизма, адгезивности и кислотообразующей активности проводили в соответствии с МУК 4.2.2602-10 с авторской модификацией методик. Результаты изучения биологических свойств пробиотиков оценивали по специально разработанным авторским полуколичественным шкалам, позволяющим поставить количественные значения активности штаммов (величины зон задержки роста тест-культур холерных вибрионов, средних показателей адгезивности (СПА) и кислотообразования) в со-

ответствие качественным показателям - низкая, средняя или высокая степень антагонистической, адгезивной и кислотообразующей активности. При разработке критериев и методики отбора штаммов, перспективных для применения при холере, использовали модели кроликов-сосунков и изолированных петель кишечника взрослых кроликов. Штамм L. acidophilus ВКМ В-2020 Д как основа нового экспериментального пробиотика «Лакто-ацвд-Р» был охарактеризован по фено- и генотипическим признакам в соответствии с МУК 4.2.2602-10. Идентификацию штаммов выделенных пробиотических бактерий проводили с использованием тест-системы API 50 СН (BIOMERIEUX) (FRANCE) REF 50 300СЕ. Нуклеотидный состав ДНК штамма определяли по содержанию ГЦ-пар в ДНК с помощью кривых термической денатурации, используя саморегулирующийся спектрофотометр «Pue Unicum SP 1800», степень гомологии ДНК штамма определяли методом ре-ассоциации в растворе. Полногеномное секвенирование осуществляли с помощью системы Miseq (Illumina, http://vvww.illumina.com). Штамм дополнительно идентифицировали по последовательности гена 16s-pPHK Установление наличия/отсутствия мобильной генетической информации осуществляли с помощью электрофореза ДНК в 0,8 % ага-розном геле и биоинформационного анализа генома Изучение безопасности препарата «Лактоацид-Р» проводили согласно требованиям СП 3.3.2.561-96 и МУК 4.2.2602-10, контаминацию посторонней микрофлорой определяли по ФС 42-252 ВС-89. Активность использования «Лактоацид-Р» при экспериментальной холере устанавливали с применением модифицированных нами различных моделей инфекции (белые мыши, «опечатанные» мыши, изолированные петли тонкого кишечника взрослых кроликов и кролики-сосунки). Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерных программ «STATISTIKA» (Stat Soft Russia) и «BIOSTAT».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выбор препаратов пробиотнков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий. Поскольку современная представленность пробиотиков весьма разнообразна, первым этапом работы явился подбор применяемых в практике здравоохранения препаратов, а также пробиотических штаммов, перспективных для производственного использования. Были отобраны и охарактеризованы по составу моно-, поли- и комбинированные препараты «Биобактон», «Лактобактерин сухой», «Кисломолочный лактобактерин», «Бифидумбактерин форте», «Колибактерин», «Бифиформ», «Бактисубтил», «Биоспорин», «Споробактерин жидкий» и «Энтерол». Из

перечисленных препаратов были выделены чистые культуры следующих видов: L.acidophilus 126, Lfermentum 90Т-С4, Lplantarum 8-РА-З, Bifidobacterium bifldum №1, Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium SF68, Bacillus cereus IP 5832, B.licheniformis, B.subtillus 534, Saccharomyces boulardii), которые использовались в числе испытуемых наряду с музейными и авторским штаммом [..acidophilus ВКМ В-2020 Д. Штамм был получен из разрешенной к применению производственной закваски «Симбиоз ацидофильных палочек «ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР» методом направленного отбора с селекцией на популяционном уровне по антагонизму по отношению к V.cholerae, идентифицирован по фенотипу и получил исходное наименование Lacidophilus Р-1. Нами впервые было показано наличие антагонистической активности лактобактерий по отношению к холерным вибрионам 01 и не01/не0139 серогрупп in vitro. В дальнейшем был выявлен антагонизм данного штамма по отношению к штаммам ЭГТМ и УПМ (табл. 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность штамма Lacidophilus Р-1

по отношению к штаммам V. cholerae и другим ЭПМ и УПМ

№ п/п Наименование и номера тест-штаммов Зона угнетения роста (в мм)* тест-штаммов

1. V.cholerae EL Tor 5879 31,5

2. V.cholerae classical 431 33,3

3. V.cholerae non01/non0139 P- 9741 32,0

4. S.dysenteriae 103-5000 30,1

5. E.coli ATCC 25922 30,4

6. P.vulgar is 19 30,0

7. S. typhi ATCC 19214 30,5

•приведены средние данные по результатам 3-х опытов

Установлен спектр хромосомной устойчивости штамма Ь.аа<1орЫ1ш Р-1 к следующим антибиотикам (МПК в мкг/мл): канамицин (500), полимиксин (4000), неомицин (100), невиграмон (2000), ципрофлоксацин (1). Учитывая тот факт, что рифампицин является эффективным препаратом при лечении холеры [Либинзон А.Е. с соавт., 1974; Хайтович А.Б. с соавт., 1996; ЗсгаЫа V. ег а!, 2003], нами был получен мутант Ъ.ас'^орЫЫ Р-1 с уровнем резистентности МПК 250 мкг/мл. Штамм был депонирован в ВКМ ИБФМ РАН под номером ВКМ В-2020 Д и защищен патентом на изобретение № 2063436.

Таким образом, в работе были использованы 40 штаммов пробиотических микроорганизмов, из них 29 музейных и 11 штаммов, дополнительно выделенных (и охарактеризованных) нами из препаратов пробиотиков, в т.ч. авторский штамм Ь.асик>рЫЬ№ ВКМ В-2020 Д.

2. Комплексное изучение in vitro штаммов пробиотических микроорганизмов по параметрам биологической активности по отношению к V.cholerae. Отобранные штаммы пробиотиков были изучены по следующим биологическим параметрам: антагонизму по отношению к V.cholerae, адгезивное™ и кислотообразующей активности, которые, с учетом особенностей биологии возбудителя холеры, патогенеза инфекции и литературных данных, являются наиболее адекватными для реализации цели и задач настоящей работы.

Для унифицированного изучения антагонистической активности пробиотических микроорганизмов по отношению к холерным вибрионам нами был модифицирован метод отсроченного антагонизма путем использования холерных питательных сред на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей (ХДС-Н и ХДС-агар), разработанных в ходе выполнения настоящей работы. В результате проведенного скрининга антагонистической активности пробиотических микроорганизмов по отношению к штаммам в пределах вида V.cholerae было доказано преимущество представителей рода Lactobacillus, которые превосходили на 1-2 порядка штаммы других пробиотиков (Bacillus, E.coli и Enterococcus) (рис. 1).

Антагонистическая активность лакгобашетл и других пробхеттическнх бактерий по отношению к холерным внбрнонам различных биоваров и серогрупп*

| ? О

s ^

V. choleras classical

I Lactobacillus 1 другие проб логические бактерии

V. ckoîerae V. cholerae V. cholerae El Tor 0139 пап01/поп01Ъ9

Степень

антагонистической активности : □ высокая йсре;шяя езнязкая

Рисунок 1. Результаты изучения антагонистической активности пробиотических бактерий по отношению к холерным вибрионам различных биоваров и серогрупп * в исследование были взяты по 10 штаммов холерных вибрионов различных биоваров и серогрупп. ** % штаммов с разной степенью выраженности антагонистической активности вычислялся от 40 взятых в исследование штаммов пробиотических бактерий.

У дрожжей Saccharomyces активность против V.cholerae зарегистрирована не была Определены межвидовые различия пробиотических бактерий по выраженности антагонистических свойств по отношению к V.cholerae. Полученные результаты показали преимущество видов L.acidophilus, Lplantarum и Bifidobacterium bifidum (р < 0,05).

При более детальном анализе выраженности антагонистической активности пробиотиков по отношению к холерным вибрионам было предварительно установлено, что токсигенные штаммы (ctxA\ tcpA*) V.cholerae Ol являлись более чувствительными к лакто- и бифидобактериям по сравнению с атоксигенными. Интересно отметить, что все штаммы V.cholerae 0139 отличались пониженной, а штаммы V.cholerae non01/non0139 различного происхождения - промежуточной чувствительностью к пробиотикам. Кроме того было показано, что один и тот же пробиоти-ческий штамм, мог проявлять антагонизм к штаммам V.cholerae различных серогрупп и биоваров разной степени выраженности. Только штаммы L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, 126, NK5; Lplantarum 8 RA-3 и B.bifidum №1 проявили стабильно высокую и среднюю степень антагонистической активности к представителям всех биоваров и серогрупп холерных вибрионов, причем авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д обладал преимуществом по данному биологическому параметру.

Адгезивность пробиотических бактерий рассматривалась нами как с точки зрения ее биологического значения в механизмах, обеспечивающих приживление микроорганизмов и формирование нормальной микрофлоры организма, так и участия в предотвращении начальных этапов развития инфекционного процесса, что особенно актуально в контексте патогенеза холеры. В результате изучения адгезивности 34 штаммов пробиотиков, отобранных по параметру антагонизма, было установлено, что они обладали разным уровнем адгезивности. Установлены межвидовые и межштам-мовые отличия и, наряду с этим, была подтверждена необходимость проведения комплексного изучения адгезивных свойств in vitro с использованием нескольких показателей (СПА - средний показатель адгезивности, ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма и СПАЭКК - средний показатель адгезивности эпителиальных клеток кишечника). При интерпретации полученных результатов мы учитывали тот факт, что высокая адгезивная способность некоторых бактерий может определять их патоген-ность в организме человека. Поэтому в трактовке результатов изучения степени адге-

зивности пробиотических бактерий (для отбора перспективных штаммов) мы исходили из требований МУК 4.2.2602-10: штаммы с высокой адгезивной активностью не следует рекомендовать для производственного использования.

Далее было проведено изучение 34 штаммов по показателю кислотообразующей активности, что имело существенное значение в связи с известным фактом кис-лоточувствительности V.cholerae. Установлено, что активность кислотообразования in vitro, равная или превышающая 100,0°Т, определялась у 19 штаммов, что составило 55,9% от общего числа взятых в исследование культур. Из них 18 относились к роду Lactobacillus и один штамм - к роду Bifidobacterium. В дальнейшее исследование, посвященное разработке критериев отбора, то есть определению наиболее оптимального сочетания показателей биологических свойств, характеризующих противохолерную активность, были включены 10 штаммов, проявляющих стабильный средний уровень адгезивной активности. Среди них были 5 штаммов (L.acidophilus КЗШ24, NK1, NK12, Ер 317/402 и NCIB 4504), проявившие высокую и среднюю кислотообразующую активность, но низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к штаммам V.cholerae-, и 5 штаммов (L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, 126, NK5; L.plantarum 8 RA-3 и B.bifidum №1), которые являлись высоко- или среднеактивными кислотообразователями и антагонистами всех взятых в исследование штаммов холерных вибрионов.

3. Разработка критериев отбора штаммов пробиотических бактерий, обладающих активностью по отношению к V.cholerae. В связи с тем, что результаты изучения биологической активности in vitro не всегда могут моделировать ситуацию организм-хозяин, отобранные 10 штаммов пробиотиков были использованы для проведения исследований в опытах in vivo на экспериментальных моделях холеры. В результате было установлено, что на модели кроликов-сосунков профилактическое действие штаммов L.acidophilus КЗШ24, NK1, NK12, Ер 317/402 и NCIB 4504 выражалось в низком уровне защиты лабораторных животных (10-20% — удельный вес выживших животных). Исключение составил штамм L.acidophilus Ер 317/402 (50%) (рис. 2). Лечебный эффект практически отсутствовал у всех этих штаммов (рис. 3). Вместе с тем, профилактическое действие штаммов L. acidophilus ВКМ В 2020Д 126, NK5; L. plantarum 8 RA-3 и В. bifidum №1 выражалось в защите лабораторных животных на 70-100% (рис. 4), а лечебное - на 20-50% (рис. 5.).

Профилактическое действие пробиотических бактерий- на модели кроликов-сосунков""

Эффективность I прфелактических

действий в Ч'о

I *

I. %

I 2

1о

КЗШ24

пивших животных

/-. «ел/. к >"СТВ 4504

Рисунок 2. Результаты изучения профилактического действия пробиотических бактерий на модели кроликов-сосунков * суточные культуры пробиотиков на обезжиренном молоке вводили внугрижелудочно (в/ж) в дозе 1,0 мл, концентрации (3,0 ± 0,3)107 м.к./мл, перед заражением в течение 7 суток, 1 раз ^ день. Контроль - стерильное обезжиренное молоко в той же дозе, кратности и режиме введения; ** заражали на 8-е сутки взвесью 18-ч агаровой культуры штамма У.скокгае Е1 Тог 5879 в 3% растворе соды в дозе 1,0 мл, в концентрации (1,0±0,1)10 м.к./мл.

е действие пробиотических бактерия* „а моде ли кроликов-сосунков"

ДО

1~аеШ. 1.ас1с1. Ь.ас!^. контроль

ХК12 Ер 317/402 ХСТВ 4504

эффектом

Рисунок 3. Результаты изучения лечебного действия пробиотических бактерий на модели кроликов-сосунков * суточные культуры пробиотиков на обезжиренном молоке вводили в/ж в дозе 1,0 мл, в концентрации (3,0 ± 0,3)10 м.к./мл. Троекратно - через 6, 12 и 24 ч после заражения взвесью 18-ч агаровой культуры^штамма У.сИо!егае Е1 Тог 5879 в 3% растворе соды в дозе 1,0 мл, в концентрации (1,0±0,1)10 м.к./мл. Контроль - стерильное обезжиренное молоко в той же дозе, кратности и режиме введения.

Профилактическое действие пробиотических бактерий" на модели кроликов-сосунков1"*

Эффективность прфелг

iMLX^LL

■R

■

павших животных

L.acid. L.acid.

ВКМ В- 126

2020 Д

L.acid. ¡..plant. B.bijidum контроль NK5 8-RA-3 JVsl

Рисунок 4. Результаты изучения профилактического действия пробиотических бактерий на модели кроликов-сосунков Примечание: см. подпись к рис. 2.

Лечебное действие пробиотических бактерий* на модели кроликов-сосунков ШТ 50 50 40 30 20 0

Эффективность ^ | лечебного

действия в °/о

Sit

ж :

ИВ

L.acid. L.acid. L.acid. L.planr. B.bipdum конгрол

ВКМ В- 126 NK5 8-RA-3 .Vsl

2020 Л

Рисунок 5. Результаты изучения лечебного действия пробиотических бактерий на модели кроликов-сосунков Примечание: см. подпись к рис. 3.

Следует особо подчеркнуть, что на данной модели холеры авторский штамм ¿.acidophilus ВКМ В-2020 Д был наиболее эффективным, причем не только в профилактике и лечении, но и в минимизации холерогенного эффекта у лабораторных животных.

Далее, на модели изолированных петель тонкого кишечника взрослых кроликов было изучено влияние отобранных пробиотиков на адгезивность токсигенного штамма

V.cholerae El Tor 5879. В перевязанных петлях кишечника кроликов, которые получали культуры штаммов L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, 126, NK5, L.plantarum 8 RA-3 и В. bifl-dum №1, существенно снижались средние показатели адгезии холерных вибрионов к эпителиоцитам (р <0,001) по сравнению с контролем. Коэффициенты активности были > 4,5. По-видимому, это косвенно свидетельствовало об антагонистическом действии штаммов пробиотических бактерий в полости кишечника и о наличии конкурентной адгезии. Наиболее высокое значение данного коэффициента (11,7) отмечалось при использовании штамма L. acidophilus ВКМ В-2020 Д (табл.2).

Таблица 2. Средние показатели и коэффициенты активности адгезии токсигенных холерных вибрионов в перевязанных петлях тонкого кишечника кроликов, получавших с профилактической целью кисломолочные пробиотики

Ms п/п Наименование штаммов-пробиотиков, которые получали лабораторные животные Средние показатели адгезии V.cholerae El Tor 5879* Коэффициент активности

1 L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 5,9±1,6 11,7

2 L.acidophilus 12 6 11,0±3,6 6,3

3 L.acidophilus NK5 13,5±2,7 5,1

4 L.plantarum 8-RA-3 15,5±2,7 4,5

5 B.bifidum №1 14,0±3,1 4,9

* средний показатель адгезии вибрионов в контроле составил 69,1± 5,3

Таким образом, на основе данных, полученных in vitro и in vivo, было установлено, что пробиотические бактерии, перспективные для использования при экспериментальной холере, должны соответствовать следующим критериям: антагонистическая активность по отношению к V.cholerae - высокая или средняя; адгезивность -только средняя; кислотообразующая активность - высокая или средняя.

По результатам проведенных исследований были разработаны «Методические рекомендации по оценке противохолерной активности пробиотиков» и способ комплексной оценки биологической активности пробиотиков, перспективных для использования при экспериментальной холере, новизна которого подтверждена патентом на изобретение.

По соответствию установленным критериям были отобраны как производственные штаммы, входящие в состав коммерческих препаратов - L.acidophilus 126

___

(«Биобактон»), L.acidophilus NK5 («Аципол»), L.plantarum 8 RA-3 («Лактобакте-рин»), B.bifidum №1 («Бифидумбактерин форте»), так и авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, полученный селекционным путем.

При сравнительном анализе данных комплексной оценки четко выявлено, что авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д превосходил производственные штаммы по биологической активности по отношению к V.cholerae. На этом основании указанный штамм был использован в дальнейших исследованиях в качестве основы экспериментальной разработки нового пробиотика под названием «Лактоацид-Р», поэтому, в соответствии с требованиями МУК 4.2.2602-10, следующий этап работы предусматривал проведение фено- и генотипической идентификации предлагаемого штамма.

4. Изучение биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д как основы для разработки нового экспериментального пробиотика «Лактоацид-Р». Результаты изучения фенотипа штамма по культурально-морфологическим свойствам и по биохимическому профилю с помощью тест-системы API 50 СН (BI-OMERIEUX) (FRANCE) REF 50 300СЕ доказали его принадлежность к роду Lactobacillus и виду acidophilus. Штамм ферментировал с образованием кислоты маннозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, амигдалин, фруктозу, салицин, трега-лозу, эскулин. Не ферментировал сорбит, рамнозу, маннит, арабинозу, ксилозу, рибо-зу, глюконат.

Рисунок 6. Электронные микрофотографии клеток штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д (ув. хЗОООО) 1 - клеточная стенка; 2 - ядерная область; 3 - цитоплазма с включениями рибосом

Первоначально генотипическая идентификация авторского штамма была проведена методом монопраймерной ПЦР с тремя универсальными праймерами №15, №

15/45 и № 115. Окончательно родовая и видовая принадлежность установлена по результатам изучения нуклеотидного состава, а также по гибридизации тотальной ДНК. Содержание ГЦ в ДНК испытуемого штамма составило 33,5 мол.%, что было близко к таковому эталонного штамма L.acidophilus ВКМ В-1660 (33,3 мол.%) и музейного штамма L.acidophilus NCIB 4504 (34,6 мол.%), уровень гомологии испытуемого штамма с ДНК эталонных штаммов L.acidophilus ВКМ В-1660 и NCIB 4504 составлял, соответственно. 89% и 82%. Принадлежность исследуемого штамма к виду L.acidophilus была также подтверждена результатами анализа полной последовательности его генома, которые показали 100% идентичности гена 16S-pPHK таковому штамма L.acidophilus PKSP (KF548315.1). Было доказано, что авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д не содержал внехромосомной ДНК в отличие от двух взятых в качестве контрольных музейных штаммов L. acidophilus 1214 и 1217, у которых отчетливо выявлялись плазмиды размером 3 и 1,8 т.п.н. соответственно (рис. 7). Отсутствие плазмидной и фаговой ДНК у авторского штамма было подтверждено результатами анализа нуклеотидных последовательностей, полученных при полногеномном секвенировании.

Тотальная ДНК Плюмилная ДНК

ДНК-маркеры. 1 2 3 1 2 3

п.н. тт'ыЗЯ&ш. м

21226 * * щ

5148 4268 3530 -

2027 1904

1375 ЩщШlllllfe -

947

831

Рисунок 7.

Электрофорез препаратов тотальной и плазмидной ДНК авторского штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д

1 -L.acidophilus 1214 (контроль);

2 - L.acidophilus 1217 (контроль);

3 - L.acidophilus ВКМ В-2020Д (опыт).

Линейные формы плазмид указаны стрелками.

Таким образом, по совокупности фено- и генотипической характеристик авторский штамм был определен как Lactobacillus acidophilus, не содержащий внехромо-сомных факторов наследственности.

Далее, по качественным показателям было установлено, что штамм обладал средней активностью лизоцимобразования, высокой степенью продукции перекиси водорода, являлся полиантибиотикорезистентным и характеризовался природной устойчивостью к следующим антибактериальным препаратам (в дополнение к раннее перечисленным): к аминогликозидам (амикацину); к фторхинолонам (офлоксацину, пефлоксацину, ломефлоксацину, норфлоксацину); а также к фуразолидону и метро-нидазолу. Вместе с тем, штамм проявил умеренную устойчивость к гентамицину, ази-тромицину, к доксициклину; был чувствителен к ампициллину, тетрациклину, стрептомицину, левомицетину, ванкомицину.

В результате расширенной характеристики антагонизма штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д нами была установлена антагонистическая активность высокой степени выраженности к штаммам V.cholerae El Тог Ogawa (ctx*,tcp+), выделенных во время эпидемии холеры в Республике Дагестан (1994 г.); средней степени - к штаммам V. cholerae El Тог Ogawa (ctx~, tcp+), которые вызвали вспышку холеры в Казани (2001 г.), а также к штаммам V.cholerae El Tor Ogawa (ctx, tcp*), изолированным во время вспышки в Каменском районе Ростовской области (2005 г.). Показано, что взятые в исследование 30 штаммов V.cholerae El Tot были чувствительны к основным антибиотикам, рекомендованным для этиотропной терапии холеры: к налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, доксициклину, азитромицину, левомицетину, то есть ко всем препаратам, кроме последнего, к которым был устойчив штамм лактобактерий.

С целью более точной характеристики штаммов холерного вибриона, включенных в исследования в качестве тест-культур для изучения антагонистической активности пробиотиков, в специально проведенных экспериментах была дана фено- и расширенная генотипическая характеристика по дополнительным факторам патогенности. В частности, установлено, что штаммы V.cholerae Ol и non01/non0139, циркулирующие в водных объектах окружающей среды, а также штаммы V.cholerae non01/non0139, выделенные от людей на территории Ростовской области в процессе мониторинга за холерой, не содержали СТХ-элемент и гены острова патогенности VPI, что свидетельствовало об их эпидемической безопасности. Тем не менее, вероятность приобретения генов

XT в составе СТХ нельзя считать равной нулю, поскольку, штаммы содержали сайт специфической интеграции профага СТХф attRS, а также гены Го/-кластера tolQRA, необходимые для его проникновения в бактериальную клетку. Кроме того, данные штаммы содержали в различных сочетаниях гены, имеющие непосредственное отношение к вирулентности, экспрессия которых может обусловить спорадические случаи и даже вспышки ОКИ.

Антагонистическая активность испытуемого пробиотического штамма по отношению к 9 штаммам V.cholerae El Tor, завезенным в 1998-2012 гг. на территорию Российской Федерации, оценивалась как средняя. Антагонизм сильной степени выраженности был отмечен по отношению к двум штаммам, завезенным из Индии в Москву в 2010 г. Как установлено, большинство штаммов холерных вибрионов проявляли чувствительность к рифампицину, ципрофлоксацину, доксициклину и гента-мицину, к которым испытуемый штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д был устойчив или умеренно устойчив.

Результаты, полученные в опытах in vitro, свидетельствовали о стабильности антагонистического действия штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в отношении широкого набора штаммов холерных вибрионов различного происхождения и эпидемической опасности. Эти данные определили целесообразность исследования эффективности сочетанного использования антибиотиков и пробиотика на экспериментальных моделях холеры.

Степень антагонистической активности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к ЭПМ и УПМ была оценена также как средняя. При дальнейшем изучении биологических свойств изучаемого штамма нами выявлена его устойчивость к низким значениям рН среды культивирования, к щелочной реакции среды, а также к желчи (15,0% концентрации в среде) и NaCl (4,0%). Интересно отметить, что исследуемый штамм продуцировал экзополисахариды, был способен выживать в верхних отделах ЖКТ. Наши результаты согласуются с данными Х.Ф. Хергет с соавт. (1997) о том, что бактерии вида L.acidophilus устойчивы к условиям желудочно-кишечного тракта человека.

В своей работе мы коснулись вопроса, связанного с активацией плазминогена штаммом ¿.acidophilus ВКМ В-2020Д, происходящей после его связывания на поверхности клетки бактерии со специфическими рецепторами, из которых у Lactobacil-

lus spp. наиболее изучена а-енолаза [Antikainen et al., 2007; Hurmalainen el al., 2007]. Нам удалось экспериментально впервые обнаружить активность а-енолазы у клеток L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, а также адсорбцию плазминогена и его активацию на их поверхности. Сравнительно невысокие цифры активации плазминогена лактобакте-риями после удаления свободного плазминогена скорее всего объясняются низкой активностью собственных протеаз и отсутствием в пробах активаторов типа урокиназы или тканевых активаторов макроорганизма. Полученные данные мы расцениваем как предварительные, которые могут иметь значение при дальнейшем сравнительном изучении роли систем плазминоген/плазмин в явлениях бактериального комменсализма, а также при продолжении изучения взаимодействия лактобакгерий и их хозяев в процессе колонизации тонкого кишечника.

Далее было установлено, что при однократном внутрибрюшинном и внутривенном введении максимально переносимой дозы изучаемого штамма (к концу срока наблюдения) у лабораторных животных отсутствовали признаки нарушения здоровья и потери массы тела. Не зарегистрирована также гибель животных при его перораль-ном приеме. Учитывая тот факт, что культура L.acidophilus ВКМ В-2020 Д была изолирована из производственной закваски, допущенной к применению в пищевой промышленности, и на основании полученных в настоящем исследовании результатов штамм L. acidophilus ВКМ В-2020 Д был охарактеризован как безвредный и не обладающий вирулентными, токсигенными или токсичными свойствами.

В опытах in vivo доказана принципиальная возможность приживления штамма L. acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей с сохранением жизнеспособности лактобактерий на фоне воздействия терапевтических доз антибиотиков, к которым данный штамм устойчив (табл.3).

Испытуемый штамм выделялся из кишечника белых мышей в течение 2 недель (срок наблюдения) после прекращения его введения на фоне антибиотиков. Кроме того, экспериментально показано, что приобретенная дополнительная устойчивость к рифам-пицину имела стабильный характер и не влияла на основные параметры биологической активности испытуемого штамма (способность приживляться в макроорганизме, интенсивность кислотообразования, адгезивность, природную антибиотикорезистентность и антагонизм к холерным вибрионам и к другим ЭПМ).

Таблица 3. Результаты изучения приживления лактобактерий в кишечнике ___лабораторных животных _

Наимено- Сро- Количественная характеристика (п-10" м.к./мл) культур лакто-

вание ки бактерий, выделенных от животных, которые получали тера-

штаммов вы- певтические дозы антибиотиков:

деле- поли- канами- ципро- нали- рифам- физ.

ния миксин цин флокса- диксо- пицин р-р

(сут) «М» цин вая кислота (контроль)

L.acidophi- 1 4,1±0,3 5,1±0,4 6,0±0,2 6,9±0,2 7Д±0,1 6,8±0,2

lus ВКМ В-

2020 Д 14 3,8 ±0,5 3,5+0,4 4,9+0,1 6,0+0,5 7,0+0,3 5,9±0,3

L.acidophi- 1 5,0+0,1 5,2+0,3 6,2±0,1 5,2±0,1 единич- 6,0+0,5

lus Р-1 ные ко-

(исходный) лонии

14 3,6±0,4 4,3±0,6 5,8+0,3 4,6±0,1 0 5,3+0,4

Результаты проведенного исследования подтвердили перспективность изучения биологической активности указанного штамма на экспериментальных моделях холеры.

5. Разработка лабораторных серий нового пробиотика «Лактоацид-Р» для применения на моделях холерной инфекции. Нами была отработана методика изготовления лабораторно-экспериментальных серий препарата «Лактоацид-Р» в лиофили-зированном виде с использованием отечественного сырья и реактивов. Препарат представлял собой микробную массу штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, лиофилизирован-ную в среде культивирования с добавлением защитной среды. Пробиотик имел следующий состав: Lacidophilus ВКМ В-2020 Д - 0,46 г ± 10%; желатоза по ФС 42-1466-80 -0,01 г ± 10%; сахароза по ГОСТ 5833-75 - 0,025 г ± 10%. Экспериментальные серии препарата изготавливались в пенфлаконах, содержащих по 0,5 г сухого препарата, который представлял собой аморфную гигроскопическую массу молочно-белого цвета с возможным слабым мраморно-желтым оттенком. Полностью растворялся в 5 мл дистиллированной воды за 5 мин; рН готового препарата - 6,0+0,5. В одном флаконе содержалось 1-2 дозы препарата. В одной дозе - не менее 1,5 млрд живых лактобактерий. Препарат хранился в сухом темном месте при температуре от 2° до 10°С. Срок годности - 2 года. К концу срока годности в одной дозе содержалось не менее 1 млрд живых клеток лактобактерий, активность кислотообразования — не ниже 200°Т. Посторонняя микрофлора в препарате (протей, гемолизирующие бактерии, грибы) отсутствовали. Данные по анта-

гонистической активности и антибиотикоустойчивости препарата были аналогичны полученным при изучении производственного авторского штамма Разработаны, одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ «Инструкция по изготовлению и контролю препарата «Лактоацид-Р сухой» и «Отчет о лабораторно-экспериментальном испытании нового медицинского бактериального препарата «Лактоацида-Р». Как известно, лиофилизированные пробиотики, по сравнению с кисломолочными, выигрывают по срокам годности, но проигрывают по активности и эффективности при использовании в прикладных аспектах [Горелов A.B. и др., 2001; Глушанова H.A., 2005; Горелов A.B., Усенко Д.В., 2006; Pham М. et al., 2008 и др.]. В связи с этим нами была разработана модифицированная методика получения лабораторно-экспериментальных серий кисломолочных пробиотиков (эубиотиков) с разными стартерньгми культурами. В качестве таковых мы применяли «Лактоацид-Р» и «Наринэ», приготовленные на основе штаммов L.acidophilus ВКМ В-2020 Д и Ер 317/402 (рис. 8).

0 24 48 72 96 110

Часы

- 6000 ——— Л а кто ацид-Р ---Нарпнэ

5000 4000

W / А 1 / ' \ V

^ 4.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Сутки

Рисунок 8. Концентрация живых клеток лактобактерий пробиотиков «Лактоацид-Р» и «Наринэ», приготовленных в кисломолочном виде по стандартной (8А) и по модифицированной (8Б) методике, в зависимости от срока хранения Нами были разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и при-

менению препаратов-эубиотиков в кисломолочном виде в лечебно-профилактической практике». В основе методики - предварительная фасовка, автоклавирование исходного молочного сырья, приготовление первичной закваски, снижение посевной дозы вдвое, что дало возможность многократного воспроизводства стандартных циклов приготовления, позволяло получать из 1 пенфлакона с препаратом «Лактоацид-Р сухой» до 28,030,0 л пробиотика в кисломолочном виде.

Использование данной методики гарантировало качественные и количественные характеристики готового кисломолочного препарата, соответствующие по физико-химическим, микробиологическим, радиологическим параметрам и по результатам исследования на ГМИ государственным санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативным требованиям к пищевым продуктам и позволяло увеличить срок годности препарата от 72 ч до 21 сут.

б. Оценка активности применения пробиотика «Лактоацид-Р» при экспериментальной холере. На данном этапе работы на различных экспериментальных моделях холеры с использованием штамма У.сИо1егаг Е1 Тог 5879 была доказана профилактическая и лечебная эффективность пробиотика «Лактоацид-Р». Так, на модели «опечатанных» мышей, зараженных штаммом У.с1ю1егае Е1 Тог 5879 (в дозе 1,0-108 м.к./мл в виде взвеси 18-ч агаровой культуры в 3% растворе пищевой соды в объеме 0,5 мл), коэффициент накопления жидкости (К) у контрольных животных имел значение 120-125, а количество живых клеток вибрионов составляло (3,0±0,1)105 м.к./мл, что свидетельствовало о наличии развивающегося инфекционного процесса и об интенсивности размножения возбудителя.

Опытная группа животных получала кисломолочный «Лактоацид-Р» в дозе (3,0±0,1)-108 м.к. в 0,5 мл перед в/ж заражением. Как было установлено, применение пробиотика обеспечивало предотвращение развития инфекционного процесса у 66,7% лабораторных животных (табл. 4). Коэффициент «К» у животных этой группы был равен нулю, при бактериологическом исследовании материала от выживших (20) мышей холерные вибрионы не обнаруживались, а число микробных клеток штамма Ь.аЫЫоркИш ВКМ В-2020 Д составляло 2,45-Ю2 м.к./г (р<0,05). Десять мышей погибли без видимых изменений в кишечнике или с небольшим скоплением жидкости (К=0).

Полученные данные мы интерпретировали в аспекте наличия конкурентных свойств штамма лактобактерий по отношению к холерным вибрионам на уровне стенки и полости тонкого кишечника. Бактериальные клетки пробиотика «Лактоацид-Р» активно адгезировались на энтероцитах, размножались в полости кишечника, создавая кислую среду, и тем самым препятствовали приживлению холерных вибрионов и инфицированию макроорганизма.

Таблица 4. Профилактический эффект пробиотика «Лактоацид-Р» на эксперимен-__тальной модели взрослых «опечатанных» мышей_

Группы животных Кол-во мышей Значение коэффициента «К» Кол-во вибрионов в 1,0 мл кишечного содержимого (п • 105 м.к./мл) Характер жидкости в кишечнике Эффект Кол-во лактобактерий в 1,0 мл кишечного содержимого (п • 102 м.к./мл)

зара ражен ных павших

Опытная 30 10 0 0** нехоле-роген-ный 2,3 ± 0,4

Контрольная 30 30 122,0 ± 3 3,0 ±0,1 прозрачная, серозная холеро-генный 0

* скопления жидкости в кишечнике не обнаруживалось; ** от 5 павших мышей высевалась культура V.cholerae 5879 EI Тог (1,0±0,2)-Ю' м.к./мл.

При оценке эффективности сочетанного использования антибиотиков и лиофили-зированного пробиотика при экспериментальной холерной инфекции на модели белых мышей для заражения применяли токсигенный штамм V.cholerae EI Тог Р-5879 в дозе 0,1 мл/мышь (в/ж) и в концентрации 1,0 109 м.к./мл. В опытных группах животных (по 15 особей) для профилактики и лечения холерной инфекции использовали в терапевтических дозах по одному из следующих антибиотиков (мг/мышь), к которым был чувствителен возбудитель; ципрофлоксацин - 2,5; рифампицин - 2,0; налидиксовую кислоту -10,0. Одновременно в качестве вспомогательного средства использовали пробиотик «Лактоацид-Р сухой» (на основе штамма L. acidophilus ВКМ В-2020 Д) после разведения, согласно инструкции, в физиологическом растворе (рН 7,0+0,1) в дозе 0,1 мл и концентрации (1,0 ± 0,1) -107 м.к./мл. Пробиотик вводили per os: при профилактике - один

раз в день в течение 5 сут до заражения, а при лечении однократно, сразу после введения возбудителя холеры. Материал (испражнения и проксимальный участок тонкой кишки) от выживших мышей, умерщвленных хлороформом, взвешивали, растирали в фарфоровой ступке с 10-кратным объемом стерильного физиологического раствора, высевали по 0,1 мл на селективную плотную среду МРС-4 (рН 5,1±0,1), среды Блоурокка (рН 7,2+0,2), Эндо (рН 7,2±0,2) и МПА (рН 7,7±0,2). Посевы инкубировали при 37±1°С в течение 44±4 ч (лакто-, бифидобактерии) и 16±2 ч (другая кишечная микрофлора). При оценке результатов исходили из факта выделения культур из кишечника животных, включая экзогенные лактобактерии, и их количественного учета (табл.5).

Таблица 5. Профилактический эффект сочетанного применения антибиотиков и пробиотика «Лактоацид -сухой» на экспериментальной модели белых мышей

Группы животных Группы животных (по 15 особей), которые Павшие после заражения животные Кол-во микроорганизмов (кроме У.сИо1егае) в 1,0 мл кишечного содержимого животных, выживших после заражения (п-102 м.к./мл)

получали в течение 5 сут до заражения: абс. кол-во уд. вес (%) лакто-бациллы бифидобактерии другая кишечная микрофлора

и ципрофлокса-цин + пробио-тик 5 33,3 1,9±0,1 2,91±0, 1 7,1±0,2

н § рифампицин + пробиотик 6 40,0 2,4±0,2 2,1±0,2 6,9±0,2

о налидиксовую кислоту + пробиотик 5 33,3 2,2±0,1 3,5±0,1 6,4±0,2

ципрофлокса-цин + физ. р-р 7 46,7 0,5±0,4 1,0±0,2 1,4±0,2

к рифампицин + физ. р-р 8 53,3 0,3±0,4 0 0,4±0,0

я л ч . о налидиксовую кислоту + физ. Р-Р 7 46,7 0 0,5±0,0 9,4±0,2

¡2 пробиотик 10 66,7 2,3±0,4 3,1±0,2 9,4±0,2

физ. р-р 15 100 0 0 0

Результаты опытов показали, что на данной экспериментальной модели холеры профилактическая активность антибиотиков выражалась в защите в среднем 51,1% животных, а применение только пробиотика предотвращало развитие инфекции у 33,3% белых мышей. В то же время, при использовании пробиотика в сочетании с антибактериальными препаратами этот показатель составил 64,5%, а количественные показатели содержания микрофлоры, составляющей микробиоценоз, были на порядок выше, чем при применении только антибактериальных средств, что свидетельствовало в пользу оптимизации микробиоценоза кишечника белых мышей. Следовательно, нам удалось установить, что активность действия антибиотиков в сочетании с про-биотиком повышается в среднем на 13,4% по сравнению с использованием только антибиотиков как профилактического средства при экспериментальной холере.

Вышеописанная модель была использована также для изучения активности со-четанного применения антибиотиков и пробиотика при лечении экспериментальной холеры. Отличие методики заключалось в том, что пробиотик на фоне антибактериальных препаратов применялся сразу после заражения холерой в течение последующих 5 сут. Полученные результаты практически повторили предыдущие: применение комбинации антибиотиков и пробиотика повысили эффективность лечения на 13,4% по сравнению с использованием одних антибиотиков.

При изучении профилактической активности кисломолочного пробиотика «Лактоацид-Р» на другой экспериментальной модели - кроликах-сосунках мы установили, что наиболее адекватным было предварительное (в/ж) введение пробиотика в течение 5-7 дней перед инфицированием животных УсИокгае, что обеспечивало 100% эффективность. При введении культуры за 4 ч до заражения был зарегистрирован 50% профилактический эффект (табл.6). При лечении экспериментальной холерной инфекции кроликов-сосунков достигался 50% терапевтический эффект при (в/ж) введении удвоенных доз (6,0107 м.кУмл) пробиотика через 6, 12 и 24 ч после заражения лабораторных животных культурой У.сИокгае 5879 (1,0-107 м.к./мл) (табл.7).

Результаты экспериментального исследования свидетельствовали о том, что «Лактоацид-Р» (кисломолочный) обладал противохолерной активностью, в механизме которой, по видимому, имеет место сочетание антагонистических свойств лакто-бактерий по отношению к У.сИокгае и адгезивности пробиотика, препятствующей прикреплению возбудителя холеры к клеткам стенки тонкого кишечника.

Таблица 6. Профилактический эффект кисломолочного пробиотика «Лактоацид-Р» _на экспериментальной модели кроликов-сосунков_

Группы животных Срок введения «Лакто- Способ Количество животных Кол-во микроорганизмов в содержимом тонкого кишечника (м.к./мл)

ацид-Р» ДО заражения холерой заражения У.сИо-1егае зара ражен ных павших с холе-роген-ным эффектом У.сИокгае Е1 Тог 5879 Ь. ас1с1орЫ1ш ВКМ В-2020 Д

7 сут в/к** 10 0 0 0 (2,0±0,5)-Ю"

Опыт- 5 сут в/к 10 0 0 0 (2,0±0,5) -104

ная 4ч в/ж * 10 5 5 (3,0±0,3) •10" 0

Кон- в/ж 10 10 10 (2,6±0,1)-103 0

трольные в/к 10 10 10 (3,4±0,4) •106 0

*- внутрижелудочное введение; **- внутрикишечное

Таблица 7. Лечебный эффект кисломолочного пробиотика «Лактоацид-Р» __на экспериментальной модели кроликов-сосунков_

Группы животных Кол-во кроликов-сосунков Кол-во бактерий в содержимом тонкого кишечника кроликов выживших/павших (м.к./мл)

зараженных (в/ж) павших** с холеро-генным эффектом

У.сИокгае Е1 Тог 5879 Ь.ас'и1орЫ1и$ ВКМ В -2020 Д

Опытная* 10 5 3 0 / (1,2±0,6) -105 (3,2±0,1)10'/0

Контрольная 10 10 10 (2,0±0,5) -105 0

* в/ж введение пробиотика; **животные пали на 2-3 сутки после заражения

Результаты экспериментального исследования свидетельствовали о том, что «Лактоацид-Р» (кисломолочный) обладал противохолерной активностью, в механизме которой, по видимому, имеет место сочетание антагонистических свойств лакто-бактерий по отношению к У.скокгаг и адгезивности пробиотика, препятствующей прикреплению возбудителя холеры к клеткам стенки тонкого кишечника.

Таким образом, в результате экспериментального моделирования холерной инфекции (белые мыши, «опечатанные» мыши и кролики-сосунки) установлена профилактическая эффективность от 33,3% до 100% (по удельному весу выживших животных на

разных моделях) пробиотнка «Лактоацид-Р» при предварительном (5-7 дневном) введении животным до заражения холерой.

Кроме того, показан определенный лечебный эффект: при трехкратном введении увеличенной дозы лактобацилл в течение суток после заражения возбудителем холеры выживало от 20% до 50% животных. Установлено, что действенность применения антибиотиков выше, чем пробиотика в среднем на 37,8%, а одновременное применение антибиотиков и пробиотика при лечении холерной инфекции повышает терапевтическую эффективность по сравнению с использованием только антибиотиков.

Впервые на модели белых мышей была экспериментально доказана лечебная эффективность сочетанного использования пробиотика «Лактоацид-Р» и холерного бактериофага К-1, который был получен после пассажей вирулентного мутанта фага с фагочувствительным штаммом. Титр фага составлял 9108-9-109 БОЕ/мл (табл.8).

Таблица 8. Результаты изучения эффективности сочетанного использования кисломолочного пробиотика «Лактоацид-Р» и холерного бактериофага _на модели экспериментальной холерной инфекции

№ п/п

Группы лабораторных животных, которым вводили:

У.сИокгае Е1 Тог 5879 (4,0±0,1)-107

_м.к./мышь — контроль I_

У.сИокгае Е1 Тог 5879 (4,0±0,1)-107 мх/мышь + холерный бактериофаг К-1 (титр фага 9,0-Ю8- 9,0-Ю9 КОЕ/мл) - контроль II

Количество V.cholerae El Тог 5879 (в м.к./мл),

выделенное после заражения через:

Зч

(7,5±0,4)-Юб

24 ч

(1,0±0,05)10б

V.cholerae EI Tor 5879 (4,0±0,1)-107

м.к./мышь + пробиотик (4,0±0,3)-10б м.к./мышь - контроль III

V.cholerae EI Tor 5879 (4,0±0,1)-107 м.к./мышь + холерный бактериофаг

К-1 (титр фага 9,0108- 9,0109 КОЕ/мл) + пробиотик (4,0±0,3)-10б _ м.к./мышь

(5,0±0,001)105

(6,7±0,01)-105

(3,6±0,001)104

(6,0±0,001)-105

(5,8±0,06)105

(5,0±0,00)-103

Через 3 ч после в/ж заражения культурой V.cholerae 5879 от животных 3 группы, которым вводили per os пробиотик, выделяли в 11,2 раза меньше вибрионов, чем от контрольных, а от животных 4 группы, которые получали одновременно парентерально фаг и перорально лактобактерии - в 208 раз меньше, то есть наблюдалось

снижение вибриотитра на 2 порядка. Через 24 ч после заражения от животных 2 и 3 группы, по сравнению с контролем I, количество выделенных вибрионов снизилось на 42,0%, а от белых мышей 4 группы — на 3 порядка.

Результаты, полученные в опытах in vivo, свидетельствовали об эффективности применения штамма L. acidophilus ВКМ В-2020Д в составе пробиотика «Лакто-ацид-Р» в качестве дополнительного средства профилактики и лечения экспериментальной холеры, что доказывает перспективность дальнейших регламентированных исследований по применению пробиотиков в качестве дополнительных средств для совершенствования схем профилактики и лечения холеры.

Известно, что перенесенная холерная инфекция приводит к постинфекционным осложнениям, связанным с носительством, формированием дисбактериозов и дисбио-зов [Бургасов П.Н., 1971; Покровский В.И. 1995]. С учетом этих данных, нами было проведено дополнительное исследование коррекционно-восстановительного воздействия ацидофильного пищевого продукта (на основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д) при дисбиозах. Следует особо подчеркнуть тот факт, что данный штамм получен из разрешенной к использованию производственной закваски «Симбиоза ацидофильных палочек». Кроме того, обоснованность данного этапа работы в период его проведения (01.2004-05.2009 гг.) была подтверждена наличием действующей разрешительной документации- - санитарно-эпидемиологических заключений (СЭЗ): о соответствии кисломолочного ацидофильного пищевого продукта государственным санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам, в том числе требованиям безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов, а также на изготовление продукта и на его предназначение для реализации больным, находившимся на стационарном лечении в лечебно-профилактических учреждениях г. Ростова-на-Дону. Поэтому разработанный ацидофильный кисломолочный пищевой продукт был использован в исследованиях по оптимизации микробиоценоза кишечника, которые проводились на базе БСМП № 1 им. Семашко г. Ростова-на-Дону. Ацидофильный кисломолочный пищевой продукт готовился на молочной кухне и применялся на фоне базисной терапии в группах больных острым сальмонеллезом, обусловленным S.typhimurium (табл. 9). Проведенное исследование показало, что на 7 день сочетанного лечения количество лакто- и бифидобактерий нормализовалось, отмечалось незначительное понижение количественного содержания лактозоположительной и наличие гемолитической кишечной

палочки. При этом в контрольной группе зарегистрировано увеличение, по сравнению с нормой, гемолитической кишечной палочки, стафилококков и дрожжеподобных грибов при сниженном количестве лакто- и бифицобактерий.

Таблица 9. Состояние микробиоценоза кишечника детей, больных сальмонеллезом, обусловленным БлурЫтипит, на 7 день лечения

Виды микроорганизмов Среднее количество микробных клеток в 1 г фекалий в норме и в результате лечения (М ±т):

норма (Митрохин С.Д., 2004) антибиотиками + ацидофильный кисломолочный продукт антибиотиками

Бифидобактерии Не меньше 9 9,0 ± 0,2 6,1 ±0,8

Лактобактерии Не меньше 7 6,8 ± 0,4 5,1 ±0,3

Кишечная палочка:

лактозоположительная, % Не меньше 8 7,9 ± 0,2 7,3 ±0,1

гемолитическая, % 2 9 32

Стафилококк золотистый Не больше 4 5,4 ± 0,7

Дрожжеподобные грибы Не больше 3 - 6,0 ± 0,4

* не выделялись

Таким образом, установлена эффективность применения ацидофильного кисломолочного продукта на фоне этиотропной терапии ОКИ, что выражалось в нормализации кишечной микрофлоры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пробиотические микроорганизмы - антагонисты энтеропатогенной микрофлоры [Савченко Т.Н., 2011; Kleerebezem М. et al., 2010] привлекают к себе особое внимание в связи с актуальностью экспериментальных исследований, ориентированных на поиск неантибиотических потенциальных профилактических и лечебных противохолерных средств [Андрусенко И.Т. с соавт., 2009; Jaiswal A. et al., 2013], что обусловлено устойчивостью возбудителя холеры к антибиотикам и риском негативных последствий их применения [Дудина Н.А., 2007; Ghosh A., Ramamurthy Т., 2011].

В экспериментальных работах последних лет рассматривается возможность использования пробиотиков в комплексе с антибактериальными препаратами при лечении ООИ бактериальной этиологии [Шапошникова М.Ю. с соавт., 2009 и др.], однако проблема холеры в данном аспекте не изучалась.

Результаты наших исследований указывают на то, что штаммы пробиотических бактерий, относящиеся к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia и Enterococcus, обладают антагонистической активностью по отношению к штаммам V.cholerae с различными фено- и генотипическими свойствами. Методом селекции по признаку антагонизма к V. cholerae из производственной закваски «Симбиоз ацидофильных палочек» получен антибиотикоустойчивый авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д с дополнительно наведенной резистентностью к рифампицину.

По результатам проведенной сравнительной характеристики (in vitro и in vivo) 40 различных пробиотических штаммов по таким биологическим параметрам, как антагонизм по отношению к холерным вибрионам, адгезивность и кислотообразующая активность, определены критерии отбора штаммов пробиотиков, обладающих противохолерной активностью: антагонистическая активность по отношению к штаммам в пределах вида V. cholerae - высокая или средняя; адгезивность - средняя; кислотообразующая активность - высокая. На основе установленных критериев разработан способ комплексной оценки биологической активности штаммов лакто- и бифидобакте-рий in vitro по отношению к холерным вибрионам, который позволяет проводить целенаправленный отбор перспективных пробиотиков, включающих как производственные, так и экспериментальные штаммы.

Доказано, что наиболее оптимальным сочетанием противохолерных свойств обладает штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д. Дополнительно установлен антагонизм штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д высокой и средней степени выраженности по отношению к штаммам V.cholerae EI Tor Ogawa (ctx \tcp ), вызвавших эпидосложне-ния по холере на территории Российской Федерации за последние 20 лет. В опытах in vivo доказана принципиальная возможность приживления штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей на фоне воздействия терапевтических доз антибиотиков, к которым данный штамм резистентен. Выявлена его устойчивость к низким значениям рН среды культивирования, к щелочной реакции среды, а также к желчи (15%) и NaCl (4,0%), способность к продукции экзополисахаридов. Установлено, что по своим фено- и генотипическим характеристикам исследуемый штамм соответствует современным требованиям к отбору, проверке и хранению штаммов, предлагаемых в качестве производственных. На основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д и с использованием модифицированных нами методик были разработаны лабора-

торно-экспериментальные серии нового пробиотика, названного «Лактоацид-Р». Модификация методики приготовления пробиотика в кисломолочном виде позволяет многократно воспроизводить стандартные циклы приготовления и увеличить срок годности препарата до 3 недель.

На различных моделях экспериментальной холеры (белые мыши, «опечатанные мыши», изолированные петли тонкого кишечника взрослых кроликов и кролики-сосунки) показано положительное действие штаммов пробиотических бактерий на течение и исход инфекции. Кроме того, показано, что сочетайте применение пробиотика «Лактоацид-Р» на фоне этиотропных препаратов повышает профилактическую и лечебную эффективность, предотвращает формирование вибриононоситель-ства и дисбиотических состояний микробиоценоза кишечника лабораторных животных. Применение пробиотических бактерий на фоне использования холерного бактериофага усиливало действенность фаготерапии, что выражалось в снижении в 1001000 раз вибриотитра у опытных животных по сравнению с контрольной группой.

Полученные данные доказывают возможность и эффективность применения штаммов пробиотических бактерий при экспериментальной холере, а также открывает перспективы целенаправленного отбора коммерческих и новых пробиотиков в качестве дополнительных безопасных этиотропных средств при холере, что особенно важно при проведении экстренной профилактики в очаге этой инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы пробиотических бактерий, относящиеся к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia и Enterococcus, обладают антагонистической активностью по отношению к штаммам V.cholerae с различными фено- и генотипическими свойствами. Представители рода Lactobacillus превосходят на 1-2 порядка штаммы других пробиотиков по выраженности данного свойства.

2. Пробиотические штаммы, относящиеся к одному и тому же роду и виду, могут проявлять разной степени выраженности антагонизм по отношению к штаммам V.cholerae различных серогрупп, биоваров и токсигенности. Только штаммы Lacidophilus 126, L.acidophilus NK5, L.plantarum 8 RA-3 и B.bifidum №1, а также полученный селекционным путем авторский антибиотикоустойчивый штамм Lacidophilus ВКМ В-2020 Д обладают стабильно высокой и средней степенью анта-

гонистической активности ко всем взятым в исследование штаммам в пределах вида V.cholerae.

3. В сравнительных исследованиях in vitro и in vivo определены критерии отбора штаммов пробиотических бактерий различной родовой и видовой принадлежности, которые обладают биологической активностью по отношению к холерным вибрионам: антагонистическая активность к штаммам в пределах вида V. cholerae - высокая или средняя; адгезивность - только средняя; кислотообразующая активность -высокая или средняя. На основе разработанных критериев предложен способ оценки биологической активности лакто- и бифидобактерий относительно холерных вибрионов in vitro.

4. Штаммы пробиотиков, входящие в состав коммерческих препаратов «Биобактон», «Аципол», «Лактобактерин» и «Бифидумбактерин», обладают оптимальным сочетанием биологических свойств, обеспечивающих антагонизм по отношению к V.cholerae. Однако наиболее выраженная противохолерная активность выявлена у авторского штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д.

5. Фено- и генотипические свойства штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д соответствуют современным требованиям к отбору и характеристике штаммов, предлагаемых для разработки новых препаратов. В опытах in vivo показано, что штамм безвреден и не является вирулентным, токсигенным, токсичным.

6. Штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д способен к приживлению в кишечнике лабораторных животных, в том числе на фоне антибиотикотерапии, имеет стойкий характер приобретенной устойчивости к рифампицину, которая не влияет на его биологическую активность (приживляемость в макроорганизме, интенсивность кисло-тообразования, адгезивность, антибиотикорезистентность и антагонизм к холерным вибрионам и некоторым другим возбудителям кишечных инфекций).

7. Штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д проявляет антагонистическую активность по отношению к холерным вибрионам 01 серогруппы, выделенным на территории Российской Федерации во время эпидосложнений по холере и при мониторинговых исследованиях объектов окружающей среды, а также к V.cholerae non01/non0139, вызвавших диарейные заболевания у людей.

8. На основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д разработаны лабораторно-экспериментальные серии нового пробиотика «Лактоацид-Р» (в лиофилизирован-

ном и кисломолочном виде) для использования в профилактических и лечебных целях при экспериментальной холере.

9. На различных моделях холерной инфекции (белые мыши, «опечатанные» мыши, изолированные петли тонкого кишечника взрослых кроликов и кролики-сосунки) доказана целесообразность применения пробиотика «Лактоацид-Р» на фоне этио-тропных препаратов при экспериментальной холере, что повышает профилактическую и лечебную эффективность в среднем на 13,4%, усиливает действенность лечения на фоне использования холерного бактериофага, предотвращает формирование вибриононосительства и способствует оптимизации микробиоценоза при дисбиотических состояниях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крупников В.Д., Рыжко И.В., Цураева Р.И., Дроботковская Н.В., Бардых И.Д., Пушкарева Н.Д. Изучение влияния приобретенной устойчивости к рифампицину на стабильность биологических свойств штамма Lactobacillus acidophilus В КМ В-2020 Д И Биотехнология. - 1996. - № 7. - С. 32-35. (Из Перечня ВАК)

2. Крутиков В.Д., Цураева Р.И., Рыжко И.В., Дроботковская Н.В., Кучин В.В., Бардых И.Д., Пушкарева Н.Д. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии // Жури, микробиол., эиидемиол. и иммунобиол. - 1997. - №1. - С. 67-69. (Из Перечня ВАК)

I. Рыжко И.В., Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Мишанькии Б.Н., Бардых И.Д., Мазрухо Б.Л. Перспективы применения пробиотиков в профилактике и лечении холеры II Эпидемиол. и инф. болезни. - 2000. - № 4 -С. 55-57. (Из Перечня ВАК)

Бардых И.Д., Кругликов В.Д., Мазрухо Б.Л., Рыжко И.В., Моеквитина Э.А., Цураева Р.И., Винокур Н.И., Дроботковская Н.В. Экспериментальная оценка эффективности использования лактобацилл для профилактики и лечения холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. - № 2. - С. 68-71. (Из Перечня ВАК)

Крутиков В.Д., Рыжко И.В., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д., Москвитина Э.А., Симованьян Э.Н., Шлоон Е.В., Ловердо Р.Г., Цураева Р.И., Марковская Е.И., Ишина Е.В., Авдеева Е.П., Хвацева С.С., Дроботковская Н.В. Устойчивость к антибиотикам штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д и эффективность его сочетанного использования с антибактериальной терапией при сальмонеллезе typhimurium у детей раннего возраста // Эпидемиол. и инф. болезни. -2003. -№ 1. - С. 29-31. (Из Перечня ВАК) Каминский Д.И., Мазрухо А.Б., Ломов Ю.М., Рожков К.К., Криваченко К.Б., Овсова JI.M., Монахова Е.В., Кругликов В. Д., Мазрухо Б.Л., Авдеева Е.П., Булахова О.Г. Оценка жидкой накопительной среды ХДС-Н для культивирования и выделения холерного вибриона // Биотехнология. - 2003. - № 4. -С. 70-74. (Из Перечня ВАК)

7. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Мншанькин Б.Н., Водопьянов С.О., Кругликов В.Д. Характеристика культур холерных вибрионов Ol, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2002 г. // Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. -№ 2. - С 3-6. (Из Перечня ВАК)

8. Кругликов В.Д. К вопросу экстренной профилактики холеры // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. — Т. 22, №2 - С. 118-120. (Из Перечня ВАК)

9. Кругликов В.Д., Монахова Е.В., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Авдеева Е.П., Божко Н.В., Смоликова Л.М. Характеристика штаммов холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, вызвавших заболевания людей в Ростовской области // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2011. -№ 5. - С. 18-22. (Из Перечня ВАК)

10. Кругликов В.Д., Ломов Ю.М. Пробиотические продукты и препараты-пробиотики: перспективы расширения противохолерных средств // Здравоохранение Российской Федерации. -2011. -№ 5. -С. 41. (Из Перечня ВАК)

11. Мазрухо А.Б., Каминский Д.И., Ломов Ю.М., Телесманич Н.Р., Рожков К.К., Овсова Л.М., Булахова О.Г., Кругликов В.Д., Пухов Ю.М., Прометной В.И., Пичурина H.JI. Новая питательная среда для диагностики холеры ХДС-агар как перспективный элемент мобилизационного резерва специализнро-

ванных противоэпидемических бригад ISSN 0321-3005 // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. -2011. - №3. - С.101-105. (Из Перечня ВАК)

12. Ломов Ю.М., Телесманич Н.Р., Кругликов В.Д., Авдеева Е.П., Ежова М.И., Шалу О.А., Агафонова В.В., Мазрухо А.Б., Архангельская И.В. Фенотипи-ческая и молекулярно-биологическая характеристика штаммов холерных вибрионов эль-тор, выделенных из водных объектов окружающей среды Ростова-на-Дону в 2003-2008 гг. // Эпидемиол. и инф. бол. - 2011. - №1. -С.24-28. (Из Перечня ВАК)

13. Иванова И.А., Телесманич Н.Р., Кругликов В.Д., Ломов Ю.М. Современное состояние вопроса и перспективы развития неспецифической профилактики холеры // Здоровье населения н среда обитания. - 2012. - №4. - С.15-17. (Из Перечня ВАК)

14. Кругликов В.Д. Разработка критериев отбора пробиотических бактерий для расширения спектра доступных противохолерных средств // Пробл. особо опасных инф. - 2012. - Вып.4(114). - С. 69-72 . (Из Перечня ВАК)

15. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Арешина О.А., Назаретян А.А., Кругликов В.Д., Иванова С.М., Козина Д.А. Характеристика эпидемиологической обстановки по холере в мире (2003-2013 гг.) и прогноз // Пробл. особо опасных инф. - 2013. - Вып.1(117). - С. 11-17. (Из Перечня ВАК)

16. Патент на изобретение № 2063436 от 10.07.1996 г. «Штамм Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д - антибиотикорезистентный антагонист возбудителей кишечных инфекций» // Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Кучин В.В., Рыжко И.В.

17. Патент на изобретение № 2487943 от 20.07.2013 г. «Способ оценки биологической активности лактобацплл и бифидобактернй относительно холерных вибрионов in vitro» / Кругликов В.Д.

18. Кругликов В.Д., Цураева Р.И., Рыжко И.В., Прометкой В.И., Дроботковская Н.В., Бардых И.Д., Пушкарева Н.Д. Антибиотикорезистентность штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д // Современные достижения биотехнол.: Матер. Всероссийской конф. - Ставрополь, 1996. - С. 335.

19. Кругликов В.Д., Бардых И.Д, Цураева Р.И., Москвитина Э.А. Рыжко HB., Мазрухо Б.Л., Дроботковская Н.В., Анисина ЛИ. Использование нового эубиотика как дополнительного средства лечения и профилактики холеры в эксперименте //Диагност., лечение и профилакт. опасн. инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. конф., посвящ. 70-лет. НИИ микробиологии МОРФ. - Киров, 1998. - С. 125-126.

20. Мазрухо Б.Л., Крутиков В.Д., Бардых И.Д., Рыжко И.В., Шлоон Е.В., Ловердо Р.Г., Цураева Р.И., Дроботковская Н.В., Винокур Н.И. Действия эубиотика на основе лактобацилл при экспериментальном моделировании холеры II Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинике: Тез. докл. юбил. науч. конф., посвящ. 70-лет. Б.А. Саакова. - Ростов н/Д 1999. - С. 254.

21. Кругликов В.Д., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д., Цураева Р.И., Москвитина Э.А., Рыжко И.В., Дроботковская Н.В., Кадетов В.В., Анисина Л.И. Разработка нового пробиотика для лечения и профилактики кишечных инфекций, включая холеру // Диагностика, леч. и проф. инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Матер. юбил. науч. конф., посвящ. 50-лет. Центра военно-техн. проблем биологической защиты НИИ микробиол. МОРФ. - Екатеринбург, 1999. - С. 111-112.

22. Кругликов В.Д., Рыжко И.В., Симованьян Э.Н., Мазрухо Б.Л., Цураева Р.И., Ловердо Р.Г., Бардых И.Д. Новый штамм лактобацилл - основа эубиотика лечебно-профилактического действия // Пробл. мед. и эколог, биотехнол.: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 25-лет. ГНЦ прикладной микробиологии. - Оболенск, 2000. -С.84.

23. Kruglikov V.D., Bardykh I.D., Mazrukho B.L., Ryzhko I.V., Moskvitina E.A., Tsu-raeva R.I., Drobotkovskaya N.V. Use of lactobacilli XII for prophylaxis and treatment of cholera investigated in experimental models // Ninth International Congress for Culture Collections, Brisbane, Australia. - 2000. - P. 135.

24. Кругликов В.Д., Рыжко И.В., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д, Москвитина Э.А., Цураева Р.И., Кучин В.В., Телесманич Н.Р., Марковская Е.И., Непомнящая Н.Б., Симованьян Э.Н., Ловердо Р.Г., Шлоон Е.В., Хвацева С.С. Перспективы разработки и применения нового пробиотика в лечебно-профилактических целях при холере и других кишечных инфекциях // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д 2000. - Вып. 13. - С.52-54.

25. Мазрухо А.Б., Каминский Д.И., Рожков К.К., Шестиалтынова И.С., Киреев Ю.Г., Долгова А.Б., Овсова Л.М., Криваченко К.Б., Крутиков В. Д., Авдеева Е.П. ХДС-агар - питательная среда для культивирования и выделения холерных вибрионов // Природно-очаговые ООИ на юге России, их профил. и лаборат. диагност.: Сб. науч. тр., посвящ. 100-лет. Астраханской противочумной станции. -Астрахань, 2001. - С. 192-193.

26. Кругликов В. Д., Рыжко И.В., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д., Цураева Р.И. Разработка нового подхода к профилактике холеры и ее последствий // Вторая межгосударственная науч.- практич. конф. по взаимодействию государств-участников СНГ в области санитарной охраны территории. - Алматы, 2001. - С. 132.

27. Кудрякова Т.А., Авроров В.П., Качкина Г.В., Шершенко Т.Е., Македонова Л.Д., Переседова Е.С., Кругликов В.Д., Мазрухо Б.Л., Пасюкова H.H. Использование бактериофага в сочетании с глюкосоланом и молочнокислой культурой штамма лактобацилл при лечении экспериментальной холеры // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2002. - Вып. 15. -С.111-113.

28. Кругликов В .Д., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д., Телесманич Н.Р., Ловердо Р.Г., Си-мованьян Э.Н., Шлоон Е.В., Марковская Е.И., Дроботковская Н.В., Микошино-вич З.И., Непомняшая Н.Б., Винокур Н.И., Хвацева С.С. Новый бактерийный препарат для лечения и профилактики диарейных заболеваний // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2002. -Вып. 15.-С. 140-141.

29. Кругликов В .Д., Мазрухо Б.Л., Бардых И.Д, Рыжко И.В., Ловердо Р.Г., Симова-ньян Э.Н., Крыжановская И.О., Шлоон Е.В, Лебеденко Е.Ю., Телесманич Н.Р., Микошинович З.И., Ишина Е.В., Марковская Е.И., Дроботковская Н.В., Качкина Г.В., Непомняшая Н.Б., Винокур Н.И. Итоги разработки нового препарата для профилактики и лечения холеры и других кишечных инфекций и для коррекции дисбиотических состояний // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д, 2003. - Вып. 16. - С. 213-216.

30. Кругликов В.Д., Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В., Марковская Е.И., Мазрухо А.Б., Бардых И.Д., Авдеева Е.П., Цураева Р.И., Непомняшая Н.Б., Дроботковская Н.В., Анисина Л.И. Сравнительная оценка биотерапевтических препаратов по основ-

ним параметрам биологической активности, включая противохолерное действие, и по эффективности коррекции микрофлоры кишечника // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2005. -Вып.18. - С. 141-144.

31. Крутиков В.Д., Мазрухо Б.Л., Авдеева Е.П., Монахова Е.В., Шестиалтынова И.С., Михась Н.К., Сухарь В.В., Кудрякова Т.А., Качкина Г.В., Мазрухо А.Б., Цедова Э.Г., Каминский Д.И. Генотипическая и фенотипическая характеристика холерных вибрионов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды во время эпидосложнения по холере в Каменском районе Ростовской области в 2005 году // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2006. - Вып. 19. - С. 37-39.

32. Кругликов В.Д., Мазрухо Б.Л., Телесманич Н.Р., Марковская Е.И. Оценка биотерапевтического препарата (эубиотика) «Лактоацида-Р» в доклинических испытаниях // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии.

- Ростов н/Д, 2007. - Вып. 20. - С. 131.

33. Кругликов В.Д., Рыжко И.В., Телесманич Н.Р., Авдеева Е.П., Малиновская Л.Г., Дроботковская Н.В., Цедова Э.Г. Совершенствование профилактики холеры // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, совещ. и пробл. комиссии.

- Ростов н/Д, 2008. - Вып. 21. - С. 119-121.

34. Кругликов В.Д., Ломов Ю.М., Телесманич Н.Р., Авдеева Е.П., Малиновская Л.Г., Григоренко Л.В., Ежова М.И., Ускова H.H., Архангельская И.В., Бондаренко Н.Г. Пробиотики, применяемые при заболеваниях ЖКТ: скрининг пробиотиче-ских бактерий по критериям возможности использования при холерной инфекции // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. -Ростов н/Д 2009. - Вып. 22. -С.141-144.

35. Монахова Е.В., Кругликов В.Д., Смоликова Л.М., Божко Н.В., Авдеева Е.П. Генотипическая характеристика возбудителей холеры, выделяемых на территориях СНГ и стран Юго-Восточной Азии // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инф. болезней: Тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2009. -С.149-152.

36. Кругликов В.Д, Малиновская Л.Г. Обоснование возможности использования нового пробиотика в лечебно-профилактических целях при холерной инфекции //

Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2009. - Т. XIX, № 5 (При-лож. №34, Матер. XV РГЭН). - С. 135.

37. Кругликов В.Д., Ломов Ю.М., Телесманич Н.Р., Авдеева Е.П., Григоренко Л.В., Малиновская Л.Г. Антагонистическая активность пробиотических бактерий по отношению к штаммам холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения// Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии. -Ростов-на-Дону, 2010. -Вып. 23. -С.132-135.

38. Иванова С.М., Титов Г.В., Безсмертный В.Е., Ломов Ю.М., Телесманич Н.Р., Москвитина Э.А., Кругликов В.Д., Мазрухо А.Б., Шестиалтынова И.С., Архангельская И.В., Григоренко Л.В., Ежова М.И. Информация о биологических свойствах холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп, изолированных от людей из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2010 году //Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, совещ. и пробл. комиссии. - Ростов-на-Дону, 2011. - Вып. 24. - С. 62-66.

39. Кругликов В.Д., Дуванова О.В., Шипко Е.С., Мишанькин Б.Н., Григоренко Л.В. Система активатор плазминогена/плазмин у лактобацилл-антагонистов холерных вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, совещ. и пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2011. - Вып. 24. - С. 140-143.

40. Кругликов В.Д. Характеристика пробиотиков как препаратов лечебно-профилактического действия при холере // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол, колопроктол. - 2011. - Т.XXI, №5 (Прилож. № 38, Матер. XVIIЗГЭН). - С. 43.

41. Архангельская И.В., Кругликов В.Д., Непомнящая Н.Б., Монахова Е.В., Водопьянов A.C. Холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп в этиологии острых кишечных инфекций в Ростовской области. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2013. - Т. XXIII, № 5 (Прилож. №42, Матер. IXX РГЭН). - С. 92.

42. Кругликов В.Д., Миронова Л.В., Гапон М.Н., Зубкова Д.А., Григоренко Л.В. Способ оценки противохолерного действия пробиотиков // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2013. - Т. XXIII, № 5 (Прилож. №42, Матер. IXX РГЭН). - С. 93.

Подписано к печати 19.06.2014 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 2,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ «Ростовский противочумный институт» Роспотребнадзора 344007, г. Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40

Информация о работе

Кругликов, Владимир Дмитриевич
доктора медицинских наук
Ростов-на-Дону, 2014
ВАК 03.02.03

Автореферат

Научное обоснование возможности применения штаммов пробиотических микроорганизмов и оценка их биологической активности при экспериментальной холере - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы