Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природная и экспериментальная вариабельность антибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп и обоснование выбора средств этиотропной терапии холеры

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Природная и экспериментальная вариабельность антибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп и обоснование выбора средств этиотропной терапии холеры"

На правах рукописи

ДУДИНА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

ПРИРОДНАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ У ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА 01 И 0139 СЕРОГРУПП И ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СРЕДСТВ ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ ХОЛЕРЫ

03 00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2007 г

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Рыжко Инна Васильевна

Официальные оппоненты*

доктор медицинских наук Павлович Наталья Владимировна

доктор медицинских наук, доцент Терновская Лариса Николаевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится мая 2007 г. в '' на заседании диссертационного

совета Д 208.082.01 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022 г Ростов-на-Дону, пер Нахичеванский 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Н Я Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Холера - антропонозная инфекция, VI] пандемия которой, начавшись в 1961 году, продолжается и до настоящего времени 58 сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения (А 58/55 от 23 мая 2005г) приняла "Международные медико-санитарные правила (2005)", в соответствии с которыми эта инфекция стоит первой в списке В как чрезвычайная ситуация международного значения в случаях явной угрозы ее международного распространения Это определяет приоритетность исследований, направленных на совершенствование подходов к осуществлению комплекса противоэпидемических мероприятий по ограничению и ликвидации очага холеры

Анализ эпидемиологической ситуации в мире по холере свидетельствует о сохранении высокого уровня заболеваемости во многих регионах и, прежде всего, в странах Южной Африки и в Индии (WER, 2001-2006)

7-ая пандемия холеры, по мнению отечественных специалистов, в настоящее время характеризуется тем, что эпидемические проявления могут быть обусловлены представителями вида V cholerae OI (классический и эльтор биовары) и Vcholerae 0139 серогруппы (ГГОнищенко и др , 2000, ГГОнищенко, 2001; В Б Зиатдинов, 2003) В период с 1994 по 2004гг зарегистрированы завозные случаи холеры в 19 регионах России (Г Г Онищенко и др , 2005) В 2005г в Российской Федерации выявлено 34 случая инфицирования людей холерными вибрионами OI серогруппы (В ЕБезсмертный и др, 2006, ЭАМосквитина и др, 2006) Неполнота и несвоевременность сообщений ВОЗ об эпидемических осложнениях по холере в разных регионах мира, а также отсутствие централизованного анализа антибиотикограмм штаммов, вызвавших эпидемические вспышки, затрудняют проведение адекватных противоэпидемических мер по их локализации

Несмотря на то, что патогенетическая терапия холеры высокоэффективна, ВОЗ относит эту инфекцию (независимо от тяжести заболевания) к тем острым кишечным инфекциям, при которых этиотропная терапия обязательна (WHO/CDC/CS R/EDC/1999) Неблагоприятный прогноз по холере усугубляется тем обстоятельством, что с конца 80-х и начала 90-х годов XX столетия резко увеличивается число выделяемых штаммов возбудителя с маркерами резистентности к широко применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры антибактериальным препаратам (тетрациклинам, хлорамфениколу, фуразолидо-ну, триметоприму/ сульфаметоксазолу, аминогликозидам, беталактамам) При этом все чаще регистрируется выделение культур с множественной лекарственной устойчивостью (В П.Савельев и др , 1999, Т В Хоменко, 2004, В V Krishna et al, 2006, L Shi et al, 2006)

Данные отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют об экспрессии у холерного вибриона различных r-детерминант антибиотикорезистентности, появлении одних и утрате других в относительно короткий промежуток времени даже в одном регионе Так, во время одной вспышки холеры в Аргентине в 1993гг были выделены штаммы холерного вибриона OI, имеющие детерминанты устойчивости к 7, 8 и 13 препаратам (A Petrom et al, 2002)

Расширение исследовательских работ, направленных на изучение молеку-лярно-генетических основ антибиотикорезистентности у возбудителя холеры,

приближает нас к пониманию такой вариабельности в проявлении устойчивости к антибактериальным препаратам у холерного вибриона

В 1980-2002гг была доказана плазмидная природа полиантибиотикоустой-чивости у штаммов Vcholerae eltor, выделенных в разных регионах мира R-плазмиды, отнесенные к тс С группе несовместимости, кодировали различные наборы r-детерминант резистентности (М J Finch et al, 1988, E Ferreira et a!, 1992, A Petroni et al, 2002 и др ) Сообщений об обнаружении Ä-плазмид других групп несовместимости у холерного вибриона мы не встретили, что вызывает необходимость решения вопроса о возможности их экспрессии в штаммах возбудителя с различными маркерами антибиотикоустойчивости для получения информации о возможности расширения спектра резистентности у холерного вибриона в ходе эпидемического процесса Это касается и появления антибиотикорези-стентных мутантов холерного вибриона, и возможности реверсии возбудителя от чувствительного к резистентному фенотипу О наличии «молчащих» генов резистентности к хлорамфениколу у холерного вибриона сообщают D A Rowe-Magnus et al (2002) Реверсибельный регуляторный трансмиссивный характер устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу и другим антибиотикам описан у некоторых бактерий (G J Barcak, R Р Barchard, 1985, J D Nelson, G H McCracken, 2004) На необходимость разделения штаммов чувствительных и штаммов с генетической потенцией к развитию устойчивости в силу наличия генов антибиоти-корезистентности указывают J S Lewis a J.H Jorgensen (2005)

В последние годы в штаммах холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп обнаружены интегроны, SAT-конъюгативный элемент (от англ sulfamethoxazole, trimethoprim) (Н И Смирнова, 2002, Т С.Ильина, 2003, Д В Викторов и др , 2006, J.W Beaber et al, 2004, М Ehara et al, 2004, M Iwanaga et al, 2004; L Shi et al, 2006) Несмотря на то, что в настоящее время интенсивно изучаются молекуляр-но-генетические механизмы антибиотикорезистентности у холерных вибрионов, у ряда штаммов, проявлявших устойчивость к антибиотикам, не обнаружено ни ' плазмид, ни интегронов, ни SAT-конъюгативного элемента (L C.Campos et al, 2004, М Ehara et al, 2004), что предполагает существование и других механизмов, обеспечивающих их устойчивость к антибиотикам

Развитие молекулярно-генетических исследований по изучению локализации и функционированию генов антибиотикорезистентности у бактерий и, в частности, у холерного вибриона расширяет наши знания о природе этого явления, но не прибавляет оптимизма Скорее наоборот, пластичность генома возбудителя холеры, вариабельность резистентности уменьшают шансы на предсказуемость спектра и степени резистентности возбудителя, вызвавшего конкретную вспышку инфекции. Тем важнее необходимость постоянного наблюдения за состоянием чувствительности/устойчивости эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры к антибактериальным препаратам Последнее осложняется отсутствием критериев интерпретации результатов определения чувствительности для бактерий семейства Vibrionaceae и контрольного (референтного) антибиотикочувствителъного тест-штамма соответствующего вида возбудителя (МУК 4 2 1890-04) В то же время применение средств антибиотикопрофилактики и этиотропной терапии должно основываться на строго стандартизированном достоверном определении антибио-тикограммы возбудителя, что согласуется с программным документом ВОЗ

(WHO/CDC/C'SR/DRS/ 2001,2) «Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам» и Постановлением №11 от 1 04 2005г Главного государственного санитарного врача РФ «Об усилении мероприятий по эпидемиологическому надзору за холерой»

Цель работы анализ природной и экспериментальной вариабельности ан-тибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, экспериментальные доказательства возможности расширения спектра устойчивости возбудителя в ходе эпидемического процесса и совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры Задачи исследования:

1 Дать сравнительную оценку чувствительности/устойчивости к 23 антибактериальным препаратам разных групп 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в разных регионах мира в период с 1927 по 2005гг

2 Оценить возможность появления устойчивости к тетрациклинам, левомицети-ну, ампициллину, стрептомицину, гентамицину у штаммов холерного вибриона биовара eltor при индукции антибиотиками т vitro с оценкой способности г-детерминант резистентности к трансмиссивной передаче другому хозяину

3 Изучить характер (трансмиссивный, нетрансмиссивный) антибиотикорези-стентности у экспериментальных штаммов и клинических изолятов холерного вибриона eltor и 0139 серогруппы

4 Провести сравнительное изучение частоты появления рифампицинорезистент-ных (Rif ) мутантов и вариантов, устойчивых к налидиксовой кислоте (Nat) с перекрестной резистентностью к фторхинолонам, у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп

5 Изучить способность к экспрессии /?-плазмид различных групп несовместимости в эпидемически значимых штаммах холерного вибриона eltor.

6 Оценить соответствие данных антибиотикограмм у коллекции штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп с результатами эффективности антибактериальных препаратов на модели генерализованной инфекции у белых мышей

7 Разработать подходы к оптимизации методов определения антибиотикограммы холерного вибриона и интерпретации ее результатов для выбора средств этиотропной терапии холеры

Научная новизна и теоретическая значимость В результате проведенных исследований впервые

- проведен анализ встречаемости маркеров антибиотикорезистентности и их сочетаний на основе антибиотикограмм (значения МПК 23 препаратов) 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005гг,

- доказан индуцибельный характер устойчивости к тетрациклинам, левомице-тину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, амикацину, канамицину, что является одной из причин вариабельности спектра и степени резистентности у возбудителя холеры,

- представлены данные о разнообразии набора трансмиссивных (к стрептомицину, тетрациклинам, левомицетину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину, аминогликозидам) и нетрансмиссивных (к рифампицину, хинолонам,

фуразолидону) маркеров антибиотикоустойчивости у штаммов холерного вибриона OI и 0139 серогрупп,

- показано, что трансмиссивная устойчивость к стрептомицину и тримето-приму/ сульфаметоксазолу и нетрансмиссивная - к рифампицину у холерного вибриона характеризуется стабильностью,

- представлены данные о высокой частоте (пхЮ"9 -108) появления Rifu Nalr мутантов холерного вибриона OI и 0139 серогрупп при однократном воздействии препаратов и снижении частоты их выделения более чем на 1-2 порядка в случае добавления в среду культивирования других антибиотиков в субингиби-рующих концентрациях, что свидетельствует о перспективности этиотропной терапии холеры рифампицином и хинолонами в синергидных комбинациях с другими препаратами,

- доказана возможность экспрессии Я-плазмид девяти групп несовместимости (тс С, J, S, N, M, Fil, FUI, W, К) в антибиотикочувствительном штамме V cholerae eltor Р-5879 и его Rif, Nalг мутантах, а также Л-плазмид тс С, J, S групп несовместимости - в клиническом изоляте с множественной антибиотикорези-стентностью,

- на основе сравнительных данных антибиотикограмм m vitro и эффективности антибактериальных препаратов w vivo предложены пограничные значения МПК и диаметров зон подавления роста для чувствительных и устойчивых штаммов холерного вибриона на трех питательных средах (агар Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агар Хотгингера рН 7,2+0,1, АГВ рН 7,4+0,2)

Научно-практическая ценность работы.

Сравнительная оценка активности антибактериальных препаратов m vitro и m vivo показала, что наличие антибиотикорезистентности (мутационной, трансмиссивной) к разным антибиотикам у штаммов холерного вибриона эльтор и 0139 приводит к неэффективности беталактамов (ампициллин, цефтриаксон, цефотак-сим и др ) при сохранении к ним чувствительности культур in vitro, что свидетельствует о возможности персистенции измененных форм возбудителя в макроорганизме Снижение эффективности m vivo фторхинолонов наблюдается уже при значениях МПК>0,5 мг/л, фуразолидона - при значениях МПК>16 мг/л, доксициклина - при значениях МПК>4 мг/л и это необходимо учитывать при назначении препаратов для экстренной профилактики и лечения холеры на основании оптимизированных подходов к определению антибиотикограммы возбудителя и ее интерпретации С этой целью нами предлагается использование в качестве контроля анти-биотикочувствительного референс-штамма холерного вибриона не OI Р-9741 (КМ162) (справка о депонировании в ГК института «Микроб» №70 от 4 03 2003), для которого отработаны допустимые колебания значений МПК и зон подавления роста на среде Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агаре Хотгингера рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4±0,2 Разработаны «Методические рекомендации по определению чувствительности/ устойчивости холерного вибриона к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и диско-диффузионным методом Интерпретация результатов исследования», одобренные Ученым Советом и утвержденные директором РостНИПЧИ (протокол №8 от 22 11 06)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Анализ антибиотикограмм 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серог-рупп, выделенных от людей за период с 1927 по 2005гг, показал, что устойчивость к 1-3 препаратам регистрировалась с 1983 по 1993гг, с 1993-1994гг все изученные штаммы характеризовались множественной антибиотикорезистентно-стыо с различным набором г-детерминант устойчивости (от 3х до 10т")

2 У изученных штаммов возбудителя холеры обнаружена нетрансмиссивная резистентность к рифампицину, хинолонам, фуразолидону и трансмиссивная - к стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, тетрациклинам, левомицети-ну, ампициллину, гентамицину, канамицину, амикацину в разных сочетаниях

3 В ходе эпидемического процесса у холерного вибриона может расширяться спектр антибиотикорезистентности за счет

а) индукции антибиотиком экспрессии трансмиссивной устойчивости к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, амикацину,

б) мутаций резистентности к рифампицину и хинолонам,

в) включения Д-плазмид 9 групп несовместимости с разным набором маркеров устойчивости

4 На основе сопоставления данных антибиотикограмм иггаммов холерного вибриона, полученных с использованием контрольного ангибиотикочувствительного референс-штамма V cholerae поп 01 КМ 162, и эффективности препаратов т vivo, а также клинических наблюдений предложены критерии интерпретации результатов определения антибиотикограмм для 3х питательных сред (агар Мюллера-Хинтона, Хотгингера, АГВ), способствующие адекватному выбору средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научных конференциях ФГУЗ РостНИПЧИ Ростпотребнадзора в 2001-2006гг, представлены на проблемных комиссиях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2001-2006гг), на научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002г ), на научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2002г), на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002г), на IV Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Сочи, 2003г), на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера" (Ростов-на-Дону, 2003г), на VII и VIII Международных конференциях MAKMAX/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2005,2006г)

Диссертационная работа выполнена в рамках двух государственных тем №ГР 01 9 90 002822 «Экспериментальное обоснование рациональных подходов к этиотропной терапии холеры», где автор являлась исполнителем и № ГР 0120 0 410671 «Разнообразие спектра маркеров антибиотикорезистеш-ности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона», где автор является ответственным исполнителем

Публикации результатов исследований

Основные материалы диссертации опубликованы в 20 научных работах, из которых 5 в центральной и 8 в региональной печати (Ростиздат)

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 174 машино-

писных страницах, содержит 43 таблицы, 3 рисунка Библиографический указатель содержит 338 литературных источников 134 отечественных и 204 иностранных

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материал и методы

В опытах использовали более 5000 беспородных белых мышей, массой 1820г, 44 взрослых кролика

Штаммы 390 штаммов холерного вибриона, выделенных от людей, полученных из музея живых культур РостНИПЧИ (№№ коллекции МЖК) - Vibrio cholerae cholerae (25) (Афганистан, Пакистан, Северная Корея, Индия, Индокитай, 1927-1966гг), Vcholerae eltor (34) (Афганистан, Пакистан, Индонезия, Филиппины, Тайвань, 1938-1978гг ), V cholerae eltor (132) (Россия, Украина, Азербайджан, Узбекистан, Болгария, Индия, Вьетнам, Япония, полученные из Швеции и Франции, предположительно выделенные в Индии, 1983-1993гг ), V cholerae eltor (71) (Дагестан, 1994г, 1998г), V cholerae eltor (70) (г.Казань, 2001г ), Vcholerae eltor (33) (г Каменск-Шахтинский, Ростовская область, 2005г ), один штамм Vcholerae eltor 18826 (г Тверь, 2005г), Vcholerae 0139 серогруппы (24) (РФ, Киргизия, Индия и полученные из Франции, 1993-1994гг), эталонный антибиотикочувствительный штамм V cholerae eltor Р-5879 ctxAB* tcpA*, (г Таганрог, 1972г ), а также штамм Vcholerae non OI Р-9741, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» в качестве антибиотикочувствительного референс-штамма под номером КМ162 Использовали штаммы Yersinia pestis EV НИИЭГ, Escherichia coh QDS003, E coh Саю, производные штамма E coh Kl2 - доноры /?-плазмид различных групп несовместимости (тс С, J, S, N, M, Fil, Fill, W, К) Коллекция штаммов-доноров R-плазмид любезно предоставлена профессором А Ф Мороз (институт им H Ф Гамалеи)

Питательные среды для выращивания холерных вибрионов использовали агар и бульон Хоттингера рН 7,8+0,1, для хранения - 0,7% агар Хоттингера рН 7,8+0,1 Изучение антибактериальной активности препаратов проводили на плотных питательных средах - агаре Мюллера-Хинтона рН 7,3+0,2 (Himedia, Индия), агаре Хоттингера рН 7,2+01, агаре АГВ рН 7,4+0,2

Антибактериальные препараты доксициклин, тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептомицин, гентамицин, амикацин, канами-цин, ампициллин, фуразолидон, эритромицин, полимиксин, налидиксовая кислота, ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин, триметоприм/ сульфаметоксазол, азитромицин, цефтриаксон, цефотаксим

Для определения диаметров зон задержки роста диско-диффузионным методом использовали проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов производства фирмы НИЦФ (Санкт-Петербург)

Чувствительность/ устойчивость штаммов холерного вибриона к антибак-

термальным препаратам определяли методом серийных разведений препаратов в плотной питательной среде и с помощью диско-диффузионного метода

Интерпретацию результатов проводили в соответствии с «Критериями чувствительности/ устойчивости к антибиотикам клинических штаммов неприхотливых бактерий», разработанными Европейским обществом микробиологов и инфекционистов (Statement CA - SFM, 1996)

Антибнотикорезистснтныс мутанты холерного вибриона (Rifr Nalr) получали методом однократного воздействия рифампицина и налидиксовой кислоты на плотной питательной среде с антибиотиком (100-250 мг/л) Частоту мутаций к антибиотикорезистентности подсчитывали отношением числа мутантов, выросших на среде с антибиотиком, к общему числу живых бактерий, использованных для высева

Индукцию т vitro антибиотикоустойчивости осуществляли методом многократных воздействий возрастающих концентраций препаратов в плотной пи" d-тельной среде

Изучение стабильности экспрессии устойчивости штаммов холерного вибриона к ампициллину, тетрациклинам, левомицетину, налидиксовой кислоте, фторхинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину), стрептомицину, гентамицину и триметоприму/ сульфаметоксазолу изучали путем определения значений МПК антибиотиков после поступления культур в лабораторию, в процессе хранения без контактов с препаратами, после их воздействия и последующего хранения в отсутствие антибиотиков в течение 3"*-6"™ месяцев

Конъюгативную передачу r-детерминант резистентности от штаммов-доноров клеткам штаммов-реципиентов осуществляли путем совместного культивирования в течение 3-4ч 18-часовых бульонных культур штамма-донора и штамма-реципиента при 37°С с последующим высевом на плотные питательные среды, содержащие антибактериальные препараты для селекции трансконъюган-тов и контрселекции донора Трансконыоганты отсевали на ту же селективную среду, проверяли чистоту культур и изучали их антибиотикограммы Частоту передачи подсчитывали отношением числа выросших трансконъюгантов к общему числу живых бактерий, использованных для высева

Для оценки эффективности антибактериальных препаратов использовали модель генерализованной формы холеры у беспородных белых мышей массой 1820г (Е И Коробкова, 1959, R Pollitzer, 1959, А Е Либинзон и др, 1974), которых заражали внутрибрюшинно взвесью 18-часовой агаровой культуры (37°С) холерного вибриона в 0,3% агаризованном 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 108 м к в объеме 0,2 мл Лечение антибактериальными препаратами начинали сразу после заражения и проводили в течение 3-х дней (один раз в сутки) Число животных в группе не менее 10, число опытов не менее двух Наблюдение за животными осуществляли в течение 10 дней Проводили бактериологический контроль заражения и эффективности лечения Опыт учитывали при 100% гибели контрольных (нелеченых) животных Дозы препаратов рассчитывали по формуле J Е Paget, J М Barnes (1964), исходя из среднесуточных человекодоз

Токсигенность культур холерного вибриона определяли на модели заражения перевязанной петли тонкого кишечника взрослых кроликов (S N De, DN Chattergee, 1953, SN De, 1961) Количественно интенсивность выхода жид-

кости в полость петли оценивали по формуле W Burrows, С M.Musteikis (1966)

Статистическую обработку результатов опытов на изолированной петле тонкого кишечника взрослых кроликов проводили по Р Б Стрелкову (1980) Для статистической обработки данных по сравнительному изучению эффективности антибактериальных препаратов использовали таблицы А Я Боярского (1955), вычисляя доверительный интервал I9S для р=0,05 при количестве белых мышей в группе - не менее 20 на каждый препарат

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первым этапом исследования явилось изучение антибиотикограмм 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в разных регионах мира в период с 1927 по 2005гг Чувствительность/ устойчивость культур к 23 препаратам изучали методом серийных разведений антибиотиков в агаре Мюллера-Хинтона с использованием в качестве контроля депонированного нами антибиотикочувствительного референс-штамма Vcholerae non OI Р-9741 (КМ 162) и антибиотикочувствительного высоковирулентного эталонного штамма V cholerae eltor Р-5879, использованного позже в опытах т vivo Интерпретацию результатов проводили в соответствии с «Критериями » (Statement СА -SFM, 1996)

Установлено, что все 25 изученных штаммов V cholerae cholerae (19271966гг) были чувствительны к антибактериальным препаратам У штаммов Vcholerae eltor, выделенных в 1938-1978гг, регистрировали природную устойчивость к полимиксину (91%) и повышенную - к эритромицину (64,7%) (табл 1) Среди 132 культур, выделенных в 1983-1993гг, встречались штаммы с резистентностью к ампициллину (11%), стрептомицину (8%), амикацину (5%), кана-мицину (5,5%), рифампицину (10%), триметоприму/ сульфаметоксазолу (4%), эритромицину (83,5%) Все культуры холерного вибриона eltor были резистентны к полимиксину (МПК=16,0-512,0 мг/л) Не было обнаружено штаммов, устойчивых к тетрациклину и левомицетину, хотя эти антибиотики в тот период времени широко применялись для профилактики и лечения холеры

У 100% изученных штаммов V cholerae eltor, выделенных от людей в 19942005гг, обнаружена множественная антибиотикорезистентность Для возбудителя, вызвавшего эпидемию холеры в Дагестане в 1994г и вспышку инфекции там же в 1998г., была характерна устойчивость к тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу и повышенные значения МПК фуразолидона 14% культур (1994г) были резистентны к рифампицину, устойчивость к которому возникла уже в ходе эпидемии (И Я Черепахина и др, 1994)

Все штаммы (70) холерного вибриона eltor, выделенные от людей во время эпидемии холеры в г Казани в 2001 году, были устойчивы к налидиксовой кислоте, стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, характеризовались повышенными значениями МПК левомицетина (4-8 мг/л) и фуразолидона (16-64 мг/л) (табл 1)

В 2005г в г Каменске-Шахтинском (Ростовская область) было выделено от людей 33 штамма V cholerae eltor, устойчивых к стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину и с повышенными значениями МПК цефтриак-сона, цефотаксима (8-32 мг/л), фуразолидона (32-64 мг/л)

Таблица 1

Количество (%) антибиотикорезистентных штаммов V сИокгае сИокгае, еНог, 0139 из числа изученных, выделенных от людей в период с 1927 по 2005гг

№ п/п Год, место выделения штаммов холерного вибриона Количество изученных иггам-мов Количество (%) штаммов, устойчивых к антибактериальным препаратам

Ар Sm Km 4m Te Cm f Nal Ттр'Ыгс Em

1 1927-66 Афганистан, Пакистан, Северная Корея Индия, Индонезия, Индокитай 25 Vibrio cholerae cholerae

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 1938-78 Афганистан, Пакистан, Индонезия, Филиппины, Тайвань 34 Vibrio cholerae elíor

0 0 0 0 0 0 0 0 0 64,7

3 1983-93 Россия, Украина, Азербайджан Узбекистан, Болгария, Франция*, Швеция*, Индия, Вьетнам, Япония 132 11 8 5,5 5 0 0 10 0 4 ¿3,5

4 1994,1998 Россия (Дагестан) 71 0 100 32-37 0 36-10C 56-10C 14-( 0 100 24-48

5 2001 Россия (г Казань) 70 0 100 0 0 0 0 0 100 100 0

6 2005 Россия (г Каменск-Шахтинский) 33 100 100 0 0 0 6,7 0 0 100 100

7 1993-94 Россия (г Азов), Киргизия, Франция*, Индия 24 Vibrio cholerae 0139

0 100 0 0 0 0 0 0 100 0

Примечание * - штаммы, полученные из Франции и Швеции, предположительно выделены в Индии Ар - устойчивость к ампициллину, Sm - стрептомицину, Кт - канамицину, Лт - амикацину, Тс- тетрациклину, Ст - левомицетину (хлорамфениколу), Rif ' - рифампицину, Nal ' - налидиксовой кислоте, Tmp/Smz - триметоприму/ сульфаметоксазолу, Ет - эритромицину

В том же 2005г от больного холерой в г Твери был выделен штамм холерного вибриона elíor с большим набором r-детерминант устойчивости к налидиксовой кислоте, фторхинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину и др), левомицетину, стрептомицину, ампициллину, цефапоспоринам III поколения, триметоприму/ сульфаметоксазолу, штамм характеризовался повышенными значениями МПК фуразолидона (32мг/л)

У штаммов холерного вибриона 0139, выделенных в 1993-1994гг (24) в разных регионах мира, обнаружена резистентность к стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу и повышенные значения МПК фуразолидона (до 32,0 мг/л)

Анализ зарегистрированных маркеров резистентности у возбудителя холеры (1983-2005гг) показал их высокую вариабельность У изученных штаммов холерного вибриона встречали от 1 до 10 r-детерминант устойчивости в разных сочетаниях (табл 2)

Одной из причин вариабельности спектра и степени антибиотикорезистент-ности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона может быть низкая стабильность экспрессии маркеров устойчивости к тетрациклину, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, отмеченная ранее рядом исследователей (Л.С Подосинникова, 2000, О П Фецайлова и др , 1996, V Falbo et al, 1999 и др )

Таблица 2

Вариабельность маркеров антибиот икорезистентности у штаммов холерного виб-__риона, выделенных в 1938-2005гг__

Число маркеров устойчивости -1абор маркеров устойчивости к антибактериальным препаратам

1 маркер Sm, Ар Ттр, Smz Ет

2 маркера Sm Ет, Rifr Ет, Ар Ет Ат Ет, Ар Ат

3 маркера Sm Ар Ет Sm Ат Ет Rifr Ттр Smz, Sm Ттр Smz

4 маркера Sm Km Ттр Smz, Nalr Sm Tmp Smz, Sm Cm Tmp Smz, Sm Km Am Em Sm Te Tmp Smz

5 маркеров Sm Ap Tmp Smz Em, Sm Cm Te Tmp Smz, Rifr Sm Cm Tmp Smz Rif Sm Te Tmp Smz Sm Km Te Tmp Smz

6 маркеров Rif Sm Te Tmp Smz Em, Rtfr Sm Cm Te Tmp Smz Sm Km Cm Te Tmp Smz, Sm Ap Cm Tmp Smz Em

7 маркеров Ri/r Sm Cm Te Tmp Smz Em, Sm Km Cm Te Tmp Smz Em, Sm Ap Tmp Smz Em (Ctx) (Clr)

8 маркеров Rif Sm Km Cm Te Tmp Smz Em, Sm Ap Cm Tmp Smz Em (Ctx) (Ctr)

10 маркеров Nal' Fqn r Sm Ap Tmp Smz (Ctx) (Ctr) Cm Em

Примечание то же. что к таОл 1, tan ' - устойчивость к фторхмнолонам (ципрофлоксацину офпоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину) (Си) - промежуточная устойчивость к цефотаксиму (Ог> цефтриаксону

В наших опытах хранение 50 штаммов УсИо1егае еИог (Дагестан, 1994) в течение 1-3-х месяцев приводило к снижению степени устойчивости к тетрациклину и левомицетину вплоть до ее утраты Однако даже однократный пересев на среде с антибиотиком способствовал восстановлению исходных значений МПК (32-64мг/л)

Для штаммов холерного вибриона, выделенных от людей в г Казани (2001г), была характерна промежуточная устойчивость к левомицетину (МПК=4-8мг/л), которая снижалась без контакта с антибиотиком (МПК=1-2мг/л) Для 16 штаммов, хранившихся на столбиках полужидкого агара (0,7%) с субингибирующими концентрациями левомицетина (4мг/л) в течение 3-х месяцев, значения МПК оказались равными 64-128 мг/л Хранение этих культур без контакта с антибиотиком вновь сопровождалось снижением экспрессии признака левомицетинорезистент-ности (МПК=4-8мг/л)

Детальное изучение колебаний значений МПК антибактериальных препаратов в процессе хранения без контактов с антибиотиками, после их воздействия и последующего хранения в отсутствие препаратов, проведенное на штаммах, выделенных в г Казани (2001г), Каменске-Шахтинском (2005г), г.Твери (2005г), подтвердило зависимость экспрессии устойчивости к ампициллину, левомицетину от контакта с антибактериальными препаратами Установлено также, что и резистентность к налидиксовой кислоте у V сИо1егае еИог 18377 (г Казань, 2001г) проявляла тенденцию к снижению без селективного давления препарата В то же время 3-4 пересева на средах, содержащих налидиксовую кислоту или фторхинолоны, приводило к значительному повышению МПК налидиксовой кислоты (до 800-1600 мг/л) и проявлению резистентности (МПК>2 мг/л) к фторхинолонам, которая не регистрировалась при МПК налидиксовой кислоты, равной 128 мг/л Хранение культур, устойчивых к хинолонам, без контакта с препаратами вновь приводило к снижению степени экспрессии признака

Необходимо подчеркнуть, что у культур возбудителя холеры (1994-2005гг) стабильно наследовались признаки устойчивости к стрептомицину и триметопри-му/ сульфаметоксазолу Эта особенность была характерна и для культуры холерного вибриона 18826, выделенной от больного в г Твери в 2005г (рис 1)

Значение

Т 2~ 3 ~ Д 5 6

Рисунок L - Колебания значений МПК антибиотиков для штамма V cholerae eltor 1 8826, выделенного в г Твери в 2005г в зависимости от наличия или отсутствия контакта с антибиотиками

1,2 - хранение, пересевы на средах без антибиотиков 3,4 - воздействие антибактериальных препаратов

5 ,6 - хранение, пересевы на средах после воздействия антибиотиков in vitro

-- стрептомицин fSm/ ■ тр и м его п р и м /сул ь ф а м ето КС€ 30 Л Sm í

* налидиксовая кислота (Uat 1 ■■ ципрофлоксацин (£pf j '

"-левомицетин (Cm) Л. доксициклин (De)

——ампициллин (4 pi —• гентамицин (Gm)

Что касается устойчивости этого штамма к налидиксовой кислоте, фторхи-нолонам, ампициллину, левомицетину, то МПК препаратов снижались в течение 3-х месяцев наблюдения вплоть до показателей (фторхинолоны, левомицетин, ампициллин), соответствующих чувствительности После контактов с препаратами резистентность восстанавливалась, а затем вновь снижалась без воздействия антибиотиков Дополнительно показано, что 3-4 пересева этой культуры на агаре с возрастающими концентрациями тетрациклинов и гентамицина приводило к экспрессии трансмиссивной устойчивости к этим препаратам у штамма, ранее к ним чувствительного

Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что расширение спектра и повышение МПК препаратов у варианта возбудителя, вызвавшего вспышку инфекции, может наблюдаться в ходе эпидемического процесса при использовании для экстренной профилактики и лечения антибиотиков, резистентность к которым закреплена в геноме V cholerae даже в случае отсутствия ее экспрессии у первых выделенных культур

Сразу же возник вопрос о длительности сохранения такой способности Для его решения было отобрано 8 штаммов V cholerae eltor со сроком хранения 14-20 лет Доказано, что многократные пересевы на плотной питательной среде с возрастающими концентрациями тетрациклина, левомицетина, ампициллина, стрептомицина обеспечивали проявление антибиотикорезистентного трансмис-

сивного фенотипа Четыре штамма из восьми в опытах конъюгации оказались способны передавать Е coli С6Во Rifr, Е coli QD¡003 Nal', Ypestis EV с частотой nxl0~8-107 маркеры индуцированной in vitro резистентности к тетрацикли-ну+ампициллину, ампициллину, левомицетину+ампициллину, стрептомицину +ампициллину При этом устойчивость к ампициллину возникала дополнительно при контакте культур с тетрациклином, левомицетином, стрептомицином и при переносе другому хозяину носила сцепленный характер Два штамма из четырех до начала опыта имели чувствительный фенотип (21 антибактериальный препарат) Контрольный антибиотикочувствительный штамм V cholerae Р-5879 (1972г) в тех же условиях опыта не изменял чувствительности к тетрациклину, ампициллину, левомицетину

Результаты исследований свидетельствуют о способности холерного вибриона изменять свой фенотип от антибиотикорезистентного к чувствительному и обратно в зависимости от наличия или отсутствия контакта с антибактериальным препаратом, что свидетельствует об индуцибельном характере антибиотико-устойчивости Показано, что наличие у возбудителя генетической потенции к реверсии антибиотикоустойчивого фенотипа (к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину) у фенотипически чувствительных штаммов обеспечивает возможность экспрессии r-детерминант резистентности, способных к самопереносу другому хозяину

Таким образом, нестабильность экспрессии устойчивости к антибактериальным препаратам и ее индуцибельный характер может быть одной из причин вариабельности обнаруживаемых у холерного вибриона маркеров антибиотикоре-зистентности Это вызывает необходимость проведения бактериологического контроля выделения культур на фоне лечения со своевременной заменой средств этиотропной терапии

Далее было установлено, что рифампицино- и хинолонорезистентные мутанты Vcholerae Ol и 0139 серогрупп могут возникать с частотой пх и сохраняют токсигенность, что показано на модели изолированной петли тонкого кишечника у взрослых кроликов Эти наблюдения подтверждаются выделением Rif мутантов возбудителя в Дагестане (1994г), Nal г - в г Казани (2001 г), в г Твери (2005г ) Необходимо отметить, что частота появления Rif и Nalг мутантов снижается более чем на 1-2 порядка при добавлении в среду культивирования субингибирующих концентраций других антибиотиков, что свидетельствует о перспективности применения рифампицина и хинолонов в синергидных комбинациях с другими препаратами

Дальнейшими экспериментами было показано, что у изученных нами клинических изолятов V cholerae eltor и 0139 устойчивость к тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину носила трансмиссивный характер (табл 3) При этом, независимо от селектируемого маркера реципиентам Е coli С60о R\fr, Е coli QDS003 Nalr, Ypestis EV и в обратных кроссах - V cholerae eltor Р-5879 и его Rif, Nalr мутантам с частотой пхЮ'МО"5 происходила передача всех маркеров, характерных для штамма-донора

Индуцированная in vitro устойчивость к тетрациклину, доксициклину, левомицетину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, амикацину, ампициллину

передавалась Е coli С600 Rifr с частотой пх 10'8-10"7 (табл 3)

Таблица 3

Экспрессия маркеров резистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139

Коли Маркеры резистентности

№ оп ы та Штамм микроорганизма чест- во культур Донор Реци пи-ент 1 ранскокъюгант

1онор Vcholerae ellor 17385 5 Rif Тс Cm Sm Tmp/Smz - -

1 Реципиен Е coli QDsm Nal' 5 - Nal' -

Гракконжган EcoliQDmeNaf Rnss 32 - - Naf Tc Cm Sm Tmp/Smz

Донор V cholerae ellor 17827 1 Тс Cm Sm Tmp/Smz - -

2 'еципиен £ coli QDjm Mal' 5 - Nal' -

Трансконьюган EcoliQDmiNafRntv 6 - Naf Tc Cm Sm Tmp/Smz

Донор Vcholerae ellor 18377 1 Nal' Sm Tmp/Smz - -

3 ^еципиент E coli Сто Rif 1 Rif -

Грансконьюгант E coli CwoRif Rniv 18 - Rif Sm Tmp/Smz

Донор V cholerae eltor 18377 (Л) 1 Nal' Sm Cm Tmp/Smz - -

4 Реципиент E coli CeoaRif' 1 - Rif -

Грансконьюгант E coli Cr/joRif ЯшлСЛ) 16 - Rif Sm Cm Tmp/Smz

Донор V cholerae 0139 16077 1 Sm Tmp/Smz - -

5 Реципиен E coli QDsooi Naf 1 - Nalr -

Трансконьюгант E coli QDsooiNal' R]sm 12 - - Naf Sm Tmp/Smz

Донор Vcholerae eltor P-18775 1 Ap Sm Cm Tmp/Smz -

6 Реципиен E coli Cm Rif 1 Rif -

Граясконьюганг E coli Сер Rif Roms 12 - - Rif Ap Sm Cm Tmp/Smz

Донор Vcholerae eltor 18826 исх 1 Nal' Ftiq'Ap&nCm Tmp/Smz - -

7 Реципиен E coli Сш Rif 1 - Rif -

Гранскмгыоганг£со//Сйв/й/' Riskx 18 - Rif Ap Sm Cm Tmp/Smz

Донор Vcholerae eltor 18826 (Д) 1 Naf DxTcApSm Cm Тщр/Stru - -

8 Реципиен E coli Ceoo R'f 1 - R'f -

Грансконьюгагг E. coli C(ooRffRissxiSl 6 - - Rf DxTcApSmCmTrrf&rc

Донор V cholerae eltor 18826 (T) 1 Nd Dx TcApSm Cm Тпф/Smz - -

9 Реципиен E coli Сш Rif 1 - Rif -

Грансконьюгшгг E coli Сою Rif Rissis(T) 6 - RtfDxTcApSnCmTrrvSm

Донор Vcholerae eltor 18826 (Г) 1 ШОпКгпЛпАрЭпСтТггфгЕ - -

10 Реципиент E coli Cm Rif 1 - -

Грансконьюгант Ecoh Сою Rif Rissx (П 1 - RfChiKm/tm^i'ir&nTnpSrz

Примечание то же, что к таблице 2,Dx- устойчивость к доксициклину

В опытах конъюгации не было отмечено передачи маркеров резистентности к рифампицину, хинолонам, фуразолидону

До настоящего времени у холерного вибриона идентифицированы только R-плазмиды тс С группы несовместимости (S Kuwahara, 1980, М J Finch et al, 1988, E.Ferreira et al ,1992) Решению вопроса о возможности экспрессии у возбудителя холеры R-плазмид и других тс групп был посвящен следующий раздел работы

В результате проведенных исследований было установлено, что помимо двух /?-плазм ид (RS7k Rjt>a) те С группы несовместимости в штамме холерного вибриона Р-5879 и его Rifr, Nalг мутантах возможна экспрессия R-плазмид еще

восьми групп несовместимости (тс J, S, N, К, М, W, Гц, hш) с разным набором г-детерминант устойчивости, донорами которых может оказаться микрофлора (в частности, энтеробактерии) кишечника (табл 4)

Таблица 4

Экспрессия Л-плазмид различных групп несовместимости в клетках V cholerae Р-5879 _и его Rifr и Nal 'мутантах_

№ оп ьгг а Штамм микроорганизма Группа несовме стимо-сти {отчест- Маркеры резистентности

во иссле юванньк культур Донор ^еци-тиент ft- факконыегап

Цонор Е coli j 5-3Rs7b IncC 1 Gm Km Cm Ар Tmp/Smz - -

1 Реципиент i cholerae P-5879 - 1 - РоГ -

R+трансконьюгант V cholerae P-5879 Rijb - 18 - Gm Km Cm Ap TmpSmz

2 Реципиент Vcholerae P-5879 Rif' - 1 - w -

R+трансконьюгант Vcholerae P-5879 RifR^b - 18 - Rif Gm Km Cm Ар Tmp/Smz

Реципиент V choleiae P-5879 Nal' - 1 - Nal" -

3 R+трансконьюганг Vcholerae P-5879 Naf Rs7b - 18 - Nalr Nal Gm Km Cm Ар Tmp/Smz

[Донор Е coli / 5-3 R391 IncJ 1 Km - -

4 k+трансконъюгант V cholerae Р-5879 R;gi - 6 - Pol' Km

5 К+трансконьюганг V cholerae Р-5879 Rif Ryu - 6 - Rif Rif Km

6 К+трансжоньюгант V cholerae Р-5879 NafRm - 6 - Nal' NaT Km

Донор £ cohi5-3Ri78 IncS 1 Тс Cm Km - -

7 h+трансконъюгант V cholerae P-5879 Rj7« - 12 - Pol' TcCmKm

8 К+трансконьюганг V cholerae P-5879 Rif Rjth - 6 - Rif Rif Tc Cm Km

9 К+трансконьюгант Vcholerae P-5879 NafRps - 12 - Nalr NaT TcCmKm

Донор E coli 1 5-3 Rtoa IncC 1 Ар Km - -

iofe+трансконъюгант V cholerae P-5879 R40a - 6 - РоГ ApKm

111К+трансконыога)гг Vcholerae P-5879 Naf Rm, - 6 - Nalr NaT Ap Km

(Донор E coli 1 5-3 RN-3 IncN 1 Sm Tc - -

12К+трансконьюгант V cholerae P-5879 RN-3 - 6 - Pol' Sm Tc

Донор E coll 1 5-3 Rigj IncK 1 Sm Cm - -

13И+трансконьюгант V cholerae P-5879 Rmi - 12 - РоГ SmCm

Донор E colt 1 5-3 Ru6b Irte M 1 Sm Tc - -

14К+транскоиьюгант Vcholerae P-5879 RifR-ua - 6 - R,f RifSmTc

Донор E colt ] 5-3 RS-A Inc W 1 SnCmKmTnpSrE - -

15ртрансконыоганг Vcholerae P-5879 Rif RS-A - 12 - Rif Rif Sm Cm Km Tmp/Smz

Донор E coli / 5-3 Ri Inc Fu 1 SnOn/lpTnpSrc

16К+трансконьюганг V cholerae P-5879 NaT R/ - 12 - Nal NaT Sm Cm Ap Tmp/Smz

Донор E coli 15-3 C0IBR3 Inc F¡,¡ 1 SnOnTnpStE - -

17К+трансконьюганг Vcholerae P-5879 NafCol ВКл 12 - Nal' Nal'Sm Cm Tmp/Smz

Примечание То же, что к табл 1 РоГ - природная устойчивость к полимиксину

Возможность расширения спектра антибиотикорезистентности эпидемически значимого штамма холерного вибриона еког за счет включения Л-плазмид показана на примере штамма 18377 (г Казань, 2001) Наряду с устойчивостью к хинолонам, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, левомицетину дополнительно в результате конъюгативного переноса Л-плазмид тс С, J, 5, в

трансконъюгантах экспрессировались маркеры резистентности к гентамицину, ампициллину, канамицину, тетрациклину

Как указано ранее, для оценки чувствительности/ устойчивости штаммов холерного вибриона были использованы «Критерии », разработанные Европейским обществом микробиологов и инфекционистов для неприхотливых бактерий (Statement CA-SFM, 1996), так как критерии для семейства Vibnonaceae до настоящего времени не разработаны Адаптация вышеуказанных критериев для интерпретации результатов определения антибиотикограммы холерного вибриона не могла быть осуществлена без сравнительного анализа соответствия данных in vitro и т vivo

Для изучения активности антибактериальных препаратов в опытах т vivo была использована модель генерализованной инфекции у беспородных белых мышей, предложенная ранее (Е И Коробкова, 1959, R Pollitzer, 1959, А Е Либинзон и др, 1974) Эффективные на этой модели препараты с успехе м применялись и для лечения холеры у людей (А Б Черномордик, 1988, D Gilbert et al, 1999,1 A Memon, G Murtazq, 2002 и др)

Соответствие чувствительности т vitro к 17 антибактериальным препаратам и их эффективности ш vivo при инфекции, вызванной Vcholerae eltor Р-5879, позволило проследить изменение терапевтической активности антибактериальных препаратов у мышей, инфицированных Rif, Nalr, Cpfr мутантами этого штамма и его вариантом с сочетанной хромосомной (Rifr) и плазмидной (Ä574) резистентностью

Сравнение чувствительности in vitro и эффективности антибактериальных препаратов т vivo было проведено также с использованием клинических изоля-тов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных в 1994-2005гг Опыты показали следующее

В отношении инфекции, вызванной антибиотикочувствительным штаммом холерного вибриона eltor Р-5879, все 17 препаратов были эффективны

Наличие резистентности или повышение значений МПК препаратов в отношении культур холерного вибриона eltor и 0139 серогруппы сопровождалось их неэффективностью.in vivo

Беталактамь; (ампициллин, цефалослорины Ш поколения) резко снижали свою эффективность при инфекции, вызванной антибиотикорезистентными штаммами возбудителя, даже при сохранении к ним чувствительности т vitro, что может свидетельствовать о персистенции измененных форм холерного вибриона в макроорганизме

Штаммы холерного вибриона, устойчивые к налидиксовой кислоте (МПК>128 мг/л), но чувствительные in vitro к фторхинолонам, вызывали инфекционный процесс, при котором снижалась эффективность ципрофлоксацина, оф-локсацина, пефлоксацина

При инфекции у мышей, вызванной экспериментальными и природными фторхинолонорезистентными культурами холерного вибриона (МПК>2 мг/л), утрачивалась эффективность не только фторхинолонов, но и рифампицина, хотя чувствительность к последнему in vitro сохранялась

Повышение значений МПК фуразолидона (16-32 мг/л) в отношении культур

возбудителя холеры оказывается значчым для утраты его эффективности in vivo, что подтверждается клиническими нападениями о его применении в Дагестане (1994г), сопровождавшемся большим числом бактериальных рецидивов (до 28,6%) (Г Л Карбышев и др , 1995, М X 'урьянов и др , 1996)

Необходимо отдельно остановитьс на опытах с использованием в качестве инфицирующего штамма V с holerае ello) выделенного от больного в г Твери в 2005г В соответствии с резистограммой ^эффективны оказались стрептомицин, триметоприм/ сульфаметоксазол, налидиксВая кислота, фторхинолоны, беталак-тамы, фуразолидон (табл 5) Эффективное^ сохраняли тетрациклины и аминог-ликозиды (кроме стрептомицина) Однако, ицуцированная in vitro устойчивость к тетрациклинам, гентамицину, амикацину, кан.чицину исключала эффективность и этих антибиотиков Опасность включения тацх штаммов в эпидемический процесс очевидна

Таблица 5

Эффективность этиотропной терапии генералиованной формы холеры у белых мышей, вызванной антибиотикоустойчивыми шаммами Vcholerae eltor Р-18775 (Каменск-Шахтинский, 2005), 18826 (Тверь, 2005)ч их вариантами с расширенным

спектром антибиотикорезисентности

Антибакте- Штамм V cholerae Суточная дозг препарата Тло- Заражающий штамм V cholerae

риальный препарат Р- Р-18773.ЙЯ0, 187751 (Л)* I18826 18826 (О* 18826 (Д)* мг/ мышь/ сут «г/кг/ сут** зй веде- Р- 8775 '-18775 (Л)* 18826 18826 (Г)* 18826 (Д)*

Значение МПК, мг/л Выжившие животные, %+19,

Доксишпслин 0,5 0,5 2,0 2,0 32,0 2,0 8,0 3tyipi 100 100 90+14 90+14 0

Тетрациклин 2,0 2,0 1,0 1,0 64,0 10,0 40,0 Токе ¡0+18 100 70+21 90±14 0

Левомицегин 1,0 32,0 64,0 32,0 32,0 10,0 40,0 ■4- 70+21 0 50±23 20+18 10

Налидиксовая кислота 1,0 1,0 512,0 256,0 256,0 15,0 60,0 ■//< 80±18 70±21 10 20±18 10

Ципрофлоксацин 0,0015 0,0015 2,0 2,0 2,0 2,0 8,0 41- 100 100 50+23 0 20+18

Офлоксацин 0,003 0,003 2,0 2,0 1,0 2,0 8,0 41- 100 100 30+21 20+18 10

Пефлоксацин 0,02 0,02 4,0 2,0 2,0 3,0 12,0 41- 100 90±14 40+23 0 10

Яорфлоксашш 0,02 0,02 4,0 4,0 2,0 3,0 12,0 41- 1W 80±18 20+18 0 0

Гентамицин 1,0 1,0 4,0 64,0 4,0 1,0 4,0 Ш" 100 100 100 0 80+18

Канамицин 16,0 16,0 16,0 128,0 8,0 2,0 8,0 Тоже 100 М±14 100 0 70±21

Стрептомицин 64,0 64,0 512,0 512,0 256,0 2,0 8,0 41- 0 6 0 0 0

Амикацин 2,0 2,0 4,0 64,0 16,0 2,0 8,0 41- нд нд 90±14 60±23 нд

Рифампицин 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 5,0 20,0 Внуцл 70+21 70+21 40+23 60+23 30±21

Ампициллин 64,0 64,0 128,0 64,0 64,0 10,0 40,0 В\Г 0 0 0 0 0

Цефтриаксон 8,0 8,0 16,0 16,0 4,0 10,0 40,0 Тоже 0 0 20+18 0 20+18

Цефотаксим 8,0 8,0 16,0 8,0 4,0 10,0 40,0 41- 0 0 10 0 10

Фуразолидон 16,0 16,0 32,0 16,0 16,0 4,0 16,0 Внугр 10 0 10 0 10

Гримегогрим/ :ульфамегоксазот 16,0/ 80,0 16,0/ 80,0 128,0 640,0 11 128,0/ 640,0 1,65/ 8,35 6,7/ 33,3 То ио 0 0 0 0 0

Контроль без лечения 0 0 0 | 0 0

Примечание * (Л), (Г), (Д) - штамм V cholerae eltor после 3-4-х пересевов на агаре с возрастающими

концентрациями левомицетина, гентамицина, доксициклина, ** - соответствующая суточная человекодоза, ** * - внутримышечное введение нд- нет данных

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости поиска новых подходов к разработке средств и методов профилактики холеры, ориентированных на

разработку антибиотиков, сохраняющих эффективность в условиях широкой распространенности множественной устойчивости у бактерий, а также препаратов, альтернативных антибиотикам бактериофагов, пробиотиков, бактериоцинов, пептидов животного и растительного происхождения и веществ, блокирующих активность поверхностных структур бактерий (Е Р Корвякова, 2000, И А Дятлов, 2006,Э А Светоч и др , 2006) Одним из альтернативных вариантов этиотропной терапии, приводящей к гибели или остановке роста возбудителей, является использование лекарственных препаратов, подавляющих экспрессию генов вирулентности микроорганизмов (Т Я Вахитов и др , 2006, Т С Ильина и др , 2006, И А Хмель, А 3 Метлицкая, 2006)

Однако до настоящего времени основой выбора средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры остается антибиотикограмма холерного вибриона, и требования к ее определению должны быть повышены Сравнивая данные антибиотикограмм штаммов холерного вибриона и эффективность препаратов ш vivo, мы предприняли попытку оптимизировать и стандартизировать исследования по определению антибиотикограммы возбудителя и ее интерпретации

В результате

а) подобраны питательные среды помимо агара Мюллера-Хинтона предлагается использовать агар Хоттингера pH 7,2+0,1 (1,2-1,4 г/л аминного азота, 1,5-2% агара), агар Гивенталя-Ведьминой (АГВ) pH 7,4±0,2 с учетом экономических возможностей обеспечения, прежде всего, Специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ),

б) предложены контрольные штаммы референтный штамм Ecoli АТСС 25922, Vcholerae поп Ol КМ 162 (депонирован как референс-штамм в ГК института «Микроб») с данными о предельно допустимых колебаниях значений МПК и зон ингибиции роста на вышеуказанных питательных средах,

в) отработаны посевные дозы для метода серийных разведений и диско-диффузионного метода с учетом получения результатов в кратчайшие сроки,

г) предложены антибиотики первого и второго ряда с диапазоном необходимых концентраций в агаре для метода серийных разведений,

д) определены пограничные значения МПК и зоны подавления роста (для трех питательных сред) для отнесения изучаемых культур к разряду чувствительных и устойчивых на основе сравнительных данных активности антибиотиков in vitro и in vivo (табл 6),

е) дополнительно представлены диапазоны значений МПК и зон ингибиции роста для 50 антибиотикочувствительных штаммов холерного вибриона

В предлагаемых для VcholetaeOl и 0139 серогрупп критериях чувствительности/ устойчивости в сравнении с таковыми для неприхотливых бактерий повышены требования в отношении отнесения штаммов к разряду устойчивых к фторхинолонам, доксициклину, фуразолидону, ампициллину и цефапоспоринам LLI поколения

Все вышеизложенное нашло отражение в "Методических рекомендациях по определению чувствительности/ устойчивости холерного вибриона к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и диско-диффузионным ме-

тодом Интерпретация результатов исследования», одобренных Ученым Советом (протокол №8,22 11 06г ) и утвержденных директором РостНИПЧИ

Разработанные нами критерии оценки чувствительности/ устойчивости холерного вибриона, адаптированные применительно к этому виду возбудителя, должны способствовать как адекватному выбору средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры, так и ограничению дальнейшего развития и распространения устойчивости к антибактериальным препаратам, которые могут явиться альтернативными традиционно применяемым для лечения этой нозологической формы инфекции

Таблица 6

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности V сЪокгае О! и 0139 серогрупп пограничные значения МПК (мг/л) и зон подавления роста

(мм) антибактериальных препаратов

Антибактериальный препарат Содержание в диске мкг Диаметры зон ннгибиции, мм Значение М11К, мг/л

р,**

Доксициклин 10 >19 ' <17 <2,0 >4,0

Тетрациклин 30 >19 <14 <4,0 >8,0

Левомицетин 30 " >20 <15 <4,0 >16,0

Налидиксовая кислота 30 >19 <19 <4,0 «6,0

Т(ипрофлоксащш 5 >25 <15 <0,1 ¿1,0

Офлоксацин 5 >25 <15 <0,1 ¿1,0

Пефлоксацин 10 >22 <16 <0,1 ¿1,0

Норфлоксацин 10 >22 <19 <0,1 ¿1,0

Ломефлоксацин 10 >22 <19 <0,1 ¿1,0

Левофлоксацин 5 >22 <19 50,1 ¿1,0

Рифампицин 5 >20 <13 <4,0 >16,0

Стрептомицин 30 >15 <11 <16,0 >32,0

Гентамицин 10 >15 <11 <4,0 >8,0

Канамицин 30 >17 <15 <16,0 >32,0

Амикацин 30 >17 <15 ¿8,0 >16,0

Тобрамицин 10 >17 <12 <4,0 ¿16,0

Негилмицин 30 >19 <17 <4,0 >8,0

Ампициллин 10 >17 <13 <4,0 ¿16,0

Цефотаксим 30 ¿25 <15 <1,0 ¿8,0

Цефтриаксон 30 >25 <15 <1,0 ¿8,0

Фуразолидон 300 >18 <15 £4,0 ¿16,0

Гриметоприм/сульфаметоксазол 1,25/23,75 ¿20 <15 <2,0/38,0 >8,0/152,0

Примечание *5-чувствительные,* *Л-устойчивые

В настоящее время назрела необходимость разделения штаммов возбудителей инфекционных заболеваний на чувствительные и штаммы с генетической потенцией к экспрессии устойчивости в силу наличия генов антибиотикорезистент-ности В РостНИПЧИ с нашим участием начаты исследования по экспрессной детекции генов хинолонорезистентности у холерного вибриона на основе полиме-разной цепной реакции и анализа полиморфизма ДНК (Б8СР -анализа)

ВЫВОДЫ

1 Изучение чувствительности 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей за период с 1927 по 2005 гг , к 23 антибактериальным препаратам показало, что устойчивость к 1-3 антибиотикам регистрировалась у культур, изолированных в 1983-1993гг, все изученные штаммы, выделенные в 1993-1994гг (0139) и в 1994-2005гг (еНог) имели от 3 до 10 маркеров резистентности в разных сочетаниях

2 Низкая стабильность экспрессии признаков устойчивости холерного вибриона к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, хинолонам может быть одной из причин регистрируемой у возбудителя вариабельности наборов г-детерминант резистентности 3. Спектр и степень антибиотикорезистентности холерного вибриона может изменяться в ходе эпидемического процесса в результате индукции этиотроп-ным препаратом экспрессии трансмиссивной устойчивости к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, ами-кацину

4 Мутация резистентности к рифампицину и налидиксовой кислоте (при перекрестной устойчивости к фторхинолонам) возникает у Vcholerae OI и OI 39 серогрупп с частотой пх10'9-10"8, что свидетельствует об опасности монотерапии холеры этими препаратами

5 У клинических изолятов и экспериментальных штаммов возбудителя холеры OI и 0139 серогрупп установлено наличие трансмиссивных (тетрациклины, левомицетин, ампициллин, стрептомицин, гентамицин, канамицин, амикацин, триметоприм/ сульфаметоксазол) и нетрансмиссивных (рифампицин, хиноло-ны, фуразолидон) маркеров антибиотикорезистентности

6 В холерном вибрионе с частотой пхЮ"8-10"5 могут экспрессироваться firm азм иды девяти групп несовместимости (шс С, J, S, N, М, FII, FUI, W, К) с разным набором r-детерминант антибиотикорезистентности, возможность передачи которых возбудителю от кишечной микрофлоры реальна при легких, среднетяжелых формах инфекции и вибриононосительстве.

7 На основе сопоставления данных чувствительности холерного вибриона OI и 0139 серогрупп к антибактериальным препаратам in vitro и их эффективности т vivo предложены критерии интерпретации результатов определения анти-биотикограммы с использованием контрольного штамма Vcholerae non OI КМ 162 на трех питательных средах (агар Мюллера-Хинтона, рН 7,3+0,2, агар Хоттингера, рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4±0,2)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Цураева Р И , Рыжко И В , Шутько А Г, Ломов Ю М, Гаевская Н Е , Ду-дина Н.А, Скалыга Е Ю Активность антибактериальных препаратов различных групп т vitro и т vivo в отношении штаммов холерного вибриона 0139 серогруп-пы // Холера и патоген для чел вибрионы Матер пробл комиссии - Ростов н/Д, 2001 -Вып 14 - С 92-93

2 Шутько А Г, Цураева Р.И, Рыжко И.В , Ломов Ю М , Гаевская Н Е, Дудина Н.А, Скалыга Е Ю Изучение влияния субингибирующих концентраций антибактериальных препаратов на частоту появления мутантов Vibrio cholerae eltor, устойчивых к рифампицину и налидиксовой кислоте // Холера и патоген для чел вибрионы. Матер пробл комиссии -Ростов н/Д,2001 -Вып 14 - С 65

3 Дудина Н.А, Шутько А Г, Цураева Р И, Гаевская Н Е., Молдаван И А Активность in vitro и т vivo антибактериальных препаратов в отношении V cholerae 0139 серогруппы // Матер VIII Всерос съезда эпидемиол, микробиол и паразитол Сб статей - М ООО «Росинэкс», 2002 -Т 4 - С 86

4 Шутько А Г , Цураева Р И , Дудина Н.А , Скапыга Е Ю , Молдаван И А Антибиотикограмма штаммов холерного вибриона 01 серотипа Огава, выделенных от людей и из внешней среды во время вспышки инфекции в г Казани в 2001 г // Матер VIII Всерос съезда эпидемиол , микробиол и паразитол Сб статей-М ООО «Росннэкс»,2002 -Т4 - С 130

5 Мишанькин Б Н , Водопьянов С О, Водопьянов А С , Рыжко И В , Романова Л В , Дудина H.A. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вибрионов, выделенных в г Казани во время вспышки холеры летом 2001 г //Холера и патоген для чел вибрионы Матер пробл комиссии - Ростов н/Д, 2002-Вып 15-С 39-41

6 Рыжко И В , Цураева Р И , Ломов Ю М , Шутько А Г, Мишанышн Б Н , Дудина Н.А, Молдаван И А Трансмиссивная и хромосомная устойчивость штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных на территории Дагестана в 1994, 1998гт и в г Казани в 2001г // Эпидемиол безопасн на Кавказе Итоги и перспект Матер юбилейн науч -практ конф - Ставрополь, 2002 - С 220-223

7 Рыжко И В , Шутько А Г, Ломов Ю М , Цураева Р И , Дудина Н.А, Щер-банюк А И, Молдаван И А Устойчивость к напидиксовой кислоте штаммов холерного вибриона эльтор, вызвавших вспышку холеры в г Казани в 2001г // Ок-руж среда и здоровье Матер науч-практ конф - Саратов, 2002 -С 119-120

8 Дудина H.A., Рыжко И В , Ломов Ю М , Цураева Р И , Шутько А Г Активность антибактериальных препаратов различных групп т vitro и in vivo в отношении штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных в г Казани в 2001г // Успехи совр естесгвознан. - 2003 - №6 - С 48-49

9 Рыжко И В , Цураева Р И, Ломов Ю М, Мишанькин Б Н, Шутько А Г, Дудина H.A. Антибиотикограмма холерного вибриона практические подходы к ее определению и интерпретация // Холера Матер VIII Российской науч -практ конф - Ростов на/Д, 2003 -С 143-147

10 Мазрухо Б Л, Кругликов В Д, Ишина Е В , Авдеева Е П , Мазрухо А Б , Водопьянов С О , Шутько А Г , Дудина H.A. Динамика выделения и биологические свойства культур холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп, выделенных из поверхностных водоемов и сточных вод на территории г Ростова-на-Дону // Журн микробиол ,эпидемиол ииммунобиол.-2003 -№2.-С 12-16

11 Кудрякова Т А , Ломов Ю М , Мишанькин Б Н , Рыжко И В , Качкина Г В , Македонова Л Д., Гаевская Н Г, Дудина H.A., Алиева А А Применение бактериофагов при лечении экспериментальной холеры // Холера Матер VIII Российской науч-практ конф - Ростов на/Д, 2003 -С 216-219.

12 Рыжко И В , Шутько А Г, Дудина Н.А, Цураева Р И , Щербанюк А И, Молдаван И А , Люкшина Е Ю Влияние нетрансмиссивных и трансмиссивных маркеров резистентности холерного вибриона биотипа эльтор на экспрессию R-плазмид тсС и incJ групп несовместимости // Холера Матер IX Российской науч -практ конф - Ростов на/Д, 2004 - С 75-77

13 Дудина Н.А , Шутько А Г, Рыжко И В , Цураева Р И, Молдаван И А Сравнительная оценка активности антибактериальных препаратов in vitro и при экспериментальной холере у белых мышей, вызванной штаммами холерного вибриона Ol и 0139 серогруппы II Антибиотики и химиотерапия - 2004 - №11. - С 23-27

14 Рыжко И В , Дудина Н.А , Ломов Ю М , Шутько А Г , Цураева Р И ,

Анисимов Б И Антибактериальная активность 22 препаратов в отношении штаммов холерного вибриона 01 и Ol39 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005гг. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005 - №8-9 - С 38-42

15. Дудина H.A., Шутько А Г, Рыжко И В Динамика появления антибиоти-корезистентности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2001гг // Клин микро-биол и антимикроб химиотер - 2005 - Т 7, №2, приложение 1 - С 24

16 Мишанькин Б Н , Рыжко И В , Атарова Г Т, Дудина Н.А, Шутько А Г , Дуванова О В Некоторые особенности механизма трансмиссивной устойчивости к левомицетину (хлорамфениколу) у клинических изолятов холерных вибрионов эльтор и R*- трансконъюгантов с плазмидами тсС и incS групп несовместимости // Холера и патоген, для чел вибрионы Матер пробл комиссии - Ростов на/Д, 2005-Вып 18-С 82-85

17 Рыжко И В , Шутько А Г Ломов Ю М, Дудина Н.А, Цураева Р И, Железняк Н Г Индукция т vitro трансмиссивной устойчивости к тетрациклину, левомицетину, ампициллину, стрептомицину у культур Vibrio cholerae eltor, выделенных от людей в 1986-1992гг. // Холера и патоген для чел вибрионы Матер пробл комиссии - Ростов на/Д, 2006 -Вып 19 -С 73-78

18 Шутько А.Г, Дудина H.A., Рыжко И В , Ломов Ю М, Цураева Р И Ин-дуцибельная трансмиссивная резистентность к тетрациклинам и гентамицину у множественноустойчивого штамма Vibrio cholerae eltor, выделенного от больного в 2005г // Антибиотикорезист и антимикроб химиотер Матер Всерос науч -практ конф - Махачкала, 2006 - С 99-100

19 Дудина H.A. Множественная лекарственная устойчивость штаммов холерного вибриона eltor, выделенных от людей в России в 2005г // Клин микро-биол и антимикроб, химиотер -2006 -Т 8, №2, приложение 1 - С. 16-17

20 Шутько А Г., Дудина Н.А, Рыжко И В , Ломов Ю М, Цураева Р.И Экспрессия Л-плазмид различных групп несовместимости в клетках штаммов холерного вибриона eltor II Новые технол в профилакт, эпиднадзоре и леч инфекц забол Матер науч конф Под ред проф Е И. Ефимова, Н Новгород Изд-во ННГУим Н И Лобачевского, 2006 - С 140-141

Формат 84x108 1/16 Печать лазерная Гарнитура Тайме

Объем 1,0 уел п л Тираж 100 экз

Отпечатано в компьютерном центре РостНИПЧИ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дудина, Надежда Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современное состояние заболеваемости холерой.

1.2. Этиотропная терапия холеры.

1.3. Антибиотикорезистентность эпидемически значимых штаммов холерного вибриона.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы.

2.2. Питательные среды.

2.3. Антибактериальные препараты.

2.4. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

2.5. Получение антибиотикорезистентных мутантов холерного вибриона.

2.6. Индукция in vitro устойчивости к антибактериальным препаратам.

2.7. Изучение стабильности экспрессии антибиотикорези-стентности.

2.8. Изучение способности маркеров антибиотикоустойчи-вости к самопереносу другим хозяевам.

2.9. Использование экспериментальных моделей холеры на животных.

2.10. Статистическая обработка результатов экспериментов

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИУ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

И 0139 СЕРОГРУПП, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЛЮДЕЙ В РАЗНЫХ РЕГИОНАХ МИРА В ПЕРИОД С 1927 ПО 2005 ГТ.

3.1. Антибиотикограммы штаммов холерного вибриона биовара cholerae, выделенных от людей в период с 1927 по 1966 гг.

3.2. Антибиотикограммы штаммов холерного вибриона биовара eltor, выделенных от людей в период с 1938 по 2005 гг.

3.3. Антибиотикограммы штаммов холерного вибриона

013 9 серогруппы, выделенных от людей в 1993-1994 гг.

3.4. Частота встречаемости штаммов холерного вибриона, резистентных к различным антибактериальным препаратам, в разные годы и вариабельность маркеров устойчивости

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИНДУКЦИИ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ IN VITRO И ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ V. CHOLERAE 01 И 0139 СЕРОГ-РУПП, УСТОЙЧИВЫХ К РИФАМПИЦИНУ И ХИНОЛОНАМ

4.1. Нестабильность проявления антибиотикорезистентно-сти как одна из причин вариабельности маркеров устойчивости у холерного вибриона.

4.2. Индукция in vitro устойчивости к тетрациклину, левоми-цетину, ампициллину, стрептомицину у штаммов

V. cholerae eltor, выделенных от людей в 1986-1992 гг.

4.3. Перекрестная устойчивость к хинолонам у штаммов холерного вибриона eltor (г.Казань, 2001г.) после селективного давления in vitro налидиксовой кислотой и фторхинолонами.

4.4. Получение рифампицино- и хинолонорезистентных мутантов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп.

4.4.1. Частота появления Rif, NaT мутантов холерного вибриона и их антибиотикограммы.

4.4.2. Изучение токсигенности Rif, Nalr мутантов холерного вибриона на модели внутрикишечного заражения изолированных петель тонкого кишечника взрослых кроликов

4.4.3. Оценка влияния субингибирующих концентраций антибактериальных препаратов на частоту появления мутантов V.cholerae eltor, устойчивых к рифампицину и налидиксовой кислоте.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ МАРКЕРОВ АН-ТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ У КЛИНИЧЕСКИХ ИЗО-ЛЯТОВ V.CHOLERAE 01 И 0139 СЕРОГРУПП К ТРАНСМИССИВНОМУ САМОПЕРЕНОСУ ДРУГОМУ ХОЗЯИНУ. 89 5.1. Использование в качестве доноров штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1993 по 2005гг.

5.2. Использование в качестве доноров штаммов холерного вибриона eltor (1986-1992 гг.) с индуцированной in vitro устойчивостью к тетрациклину, левомицетину, ампициллину, стрептомицину.

ГЛАВА 6. ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ К ЭКСПРЕССИИ Д-ПЛАЗМИД РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП НЕСОВМЕСТИМОСТИ В ЭПИДЕМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММАХ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА И В ИХ RIF И NALr МУТАНТАХ.

6.1. Изучение экспрессии ^-плазмид inc С, J, S, N, М, FII, Fill, W, Kb клетках V. cholerae eltor Р-5879 и его Rif и ЫаГ мутантах.

6.2. Изучение экспрессии 7?-плазмид inc С, J, S групп несовместимости в клинических изолятах холерного вибриона eltor с трансмиссивными и нетрансмиссивными маркерами устойчивости к антибактериальным препаратам.

ГЛАВА 7. ОЦЕНКА СООТВЕТСТВИЯ ДАННЫХ АНТИБИОТИКОГРАММ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА И ЭФФЕКТИВНОСТИ

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VIVO.

7.1. Эффективность (неэффективность) антибактериальных препаратов при генерализованной форме холеры у мышей, вызванной антибиотикочувствительным штаммом V.cholerae eltor Р-5879 и его вариантами, устойчивыми к антибактериальным препаратам.

7.2. Изучение эффективности антибактериальных препаратов in vivo при инфекции, вызванной клиническими изолятами возбудителя холеры (1993-2005 гг.).

ГЛАВА 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ V.CHOLERAE К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природная и экспериментальная вариабельность антибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп и обоснование выбора средств этиотропной терапии холеры"

Актуальность проблемы. Холера — антропонозная инфекция, VII пандемия которой, начавшись в 1961 году, продолжается и до настоящего времени. 58 сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения (А 58/55 от 23 мая 2005г.) приняла "Международные медико-санитарные правила (2005)", в соответствии с которыми эта инфекция стоит первой в списке В как чрезвычайная ситуация международного значения в случаях явной угрозы её международного распространения. Это определяет приоритетность исследований, направленных на совершенствование подходов к осуществлению комплекса противоэпидемических мероприятий по ограничению и ликвидации очага холеры.

Анализ эпидемиологической ситуации в мире по холере свидетельствует о сохранении высокого уровня заболеваемости во многих регионах и, прежде всего, в странах Южной Африки и в Индии (WER, 2001-2006).

7-ая пандемия холеры, по мнению отечественных специалистов, в настоящее время характеризуется тем, что эпидемические проявления могут быть обусловлены представителями вида V. cholerae Ol (классический и эль-тор биовары) и V.cholerae 0139 серогруппы (Г.Г.Онищенко, 2001; В.Б.Зиатдинов, 2003; Г.Г.Онищенко и др., 2006). В период с 1994 по 2004гг. зарегистрированы завозные случаи холеры в 19 регионах России (Г.Г.Онищенко и др., 2005). В 2005г. в Российской Федерации выявлено 34 случая инфицирования людей холерными вибрионами Ol серогруппы (В.Е.Безсмертный и др., 2006; Э.А.Москвитина и др., 2006). Неполнота и запоздание сообщений ВОЗ об эпидемических осложнениях по холере в разных регионах мира, а также отсутствие централизованного анализа антибио-тикограмм штаммов, вызвавших эпидемические вспышки, затрудняют проведение адекватных противоэпидемических мер по их локализации.

Несмотря на то, что патогенетическая терапия холеры высокоэффективна, ВОЗ относит эту инфекцию (независимо от тяжести заболевания) к тем острым кишечным инфекциям, при которых этиотропная терапия обязательна (WHO/CDC/CSR/EDC/1999). Неблагоприятный прогноз по холере усугубляется тем обстоятельством, что с конца 80-х и начала 90-х годов XX столетия резко увеличивается число выделяемых штаммов возбудителя с маркерами резистентности к широко применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры антибактериальным препаратам (тетрациклинам, хлорамфениколу, фуразолидо-ну, триметоприму/ сульфаметоксазолу, аминогликозидам, беталактамам). При этом всё чаще регистрируется выделение культур с множественной лекарственной устойчивостью (А.С.Марамович и др., 2001; С.Н.Давиденко и др., 2004; Т.В.Хоменко, 2004; L.C.Campos et al., 2004; M.Ehara et al., 2004; M.Iwanaga et al., 2004; D.Ceccarelli et al., 2006; B.V.Krishna et al., 2006; L.Shi et al., 2006).

Данные отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют об экспрессии у холерного вибриона различных r-детерминант антибиотикорези-стентности, появлении одних и утрате других в относительно короткий промежуток времени даже в одном регионе. Так, во время одной вспышки холеры в Аргентине в 1993гг. были выделены штаммы холерного вибриона Ol, имеющие детерминанты устойчивости к 7, 8 и 13 препаратам (A.Petroni et al., 2002).

Расширение исследовательских работ, направленных на изучение мо-лекулярно-генетических основ антибиотикорезистентности у возбудителя холеры, приближает нас к пониманию такой вариабельности в проявлении устойчивости к антибактериальным препаратам у холерного вибриона.

В 1980-2002 гг. была доказана плазмидная природа полиантибиотико-устойчивости у штаммов V.cholerae eltor, выделенных в разных регионах мира. Я-плазмиды, отнесенные к inc С группе несовместимости, кодировали различные наборы г-детерминант резистентности (S.Kuwahara et al., 1980; M.J.Finch et al., 1988; E.Ferreira et al., 1992, A.Petroni et al., 2002 и др.). Сообщений об обнаружении i^-плазмид других групп несовместимости у холерного вибриона мы не встретили, что вызывает необходимость решения вопроса о возможности их экспрессии в штаммах возбудителя с различными маркерами антибиотикоустойчивости для получения информации о возможности расширения спектра резистентности у холерного вибриона в ходе эпидемического процесса. Это касается и появления антибиотикорезистентных мутантов холерного вибриона, и возможности реверсии возбудителя от чувствительного к резистентному фенотипу. О наличии «молчащих» генов резистентности к хлорамфениколу у холерного вибриона сообщают D.A.Rowe-Magnus et al. (2002). Индуцибельная реверсируемая устойчивость к тетрациклину, хлорамфениколу и другим антибиотикам описана у разных видов бактерий (G.J.Barcak, R.P.Barchard, 1985; J.D.Nelson, G.H.McCracken, 2004). На необходимость разделения штаммов чувствительных и штаммов с генетической потенцией к развитию устойчивости в силу наличия генов антибиотикорези-стентности указывают J.S.Lewis a. J.H.Jorgensen (2005).

В последние годы в штаммах холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп -обнаружены интегроны, ЖГ-конъюгативный элемент (Н.И.Смирнова, 2002; Н.П.Ковалевская, 2002; Т.С.Ильина, 2003; Д.В.Викторов и др., 2006; B.Hochhut, M.K.Waldor, 1999; A.Dalsgaard et al., 2000; Amita et al., 2003; J.W.Beaber et al., 2004; V.Burrus, M.K.Waldor, 2004; M.Ehara et al., 2004; M.Iwanaga et al., 2004; L.Shi et al, 2006). Несмотря на то, что в настоящее время интенсивно изучаются молекулярно-генетические механизмы антибиотикорезистентности у холерных вибрионов, однако у ряда штаммов, проявлявших устойчивость к антибиотикам, не обнаружено ни плазмид, ни интегронов, ни 5ЖГ-конъюгативного элемента (L.C.Campos et al, 2004; M.Ehara et al., 2004), что предполагает существование и других механизмов, обеспечивающих их антибиотикорезистентность.

Развитие молекулярно-генетических исследований по изучению локализации и функционированию генов антибиотикорезистентности у бактерий и, в частности, у холерного вибриона расширяет наши знания о природе этого явления, но не прибавляет оптимизма. Скорее наоборот, пластичность генома возбудителя холеры, вариабельность резистентности уменьшают шансы на предсказуемость спектра и степени резистентности возбудителя, вызвавшего конкретную вспышку инфекции. Тем важнее необходимость постоянного наблюдения за состоянием чувствительности/устойчивости эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры к антибактериальным препаратам. Последнее осложняется отсутствием критериев интерпретации результатов определения чувствительности для бактерий семейства Vibrionaceae и контрольного (референтного) антибиотикочувствительного штамма соответствующего вида возбудителя (МУК 4.2.1890-04). В то же время применение средств антибиотикопрофилактики и этиотропной терапии должно основываться на строго стандартизированном достоверном определении антибиоти-кограммы возбудителя, что согласуется с программным документом ВОЗ (WHO/CDC/CSR/DRS/2001,2) «Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам» и Постановлением №11 от 1.04.2005г. Главного государственного санитарного врача РФ «Об усилении мероприятий по эпидемиологическому надзору за холерой».

Цель исследования: анализ природной и экспериментальной вариабельности антибиотикорезистентности у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп; экспериментальные доказательства возможности расширения спектра устойчивости возбудителя в ходе эпидемического процесса и совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры.

Задачи исследования:

1. Дать сравнительную оценку чувствительности/устойчивости к 23 антибактериальным препаратам разных групп 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в разных регионах мира в период с 1927 по 2005гг.

2. Оценить возможность появления устойчивости к тетрациклинам, левомицети-ну, ампициллину, стрептомицину, гентамицину у штаммов холерного вибриона биовара eltor при индукции антибиотиками in vitro с оценкой способности г-детерминант резистентности к трансмиссивной передаче другому хозяину.

3. Изучить характер (трансмиссивный, нетрансмиссивный) антибиотикорезистентности у экспериментальных штаммов и клинических изолятов холерного вибриона eltor и 0139 серогруппы.

4. Провести сравнительное изучение частоты появления рифампицинорези-стентных (Rif) мутантов и вариантов, устойчивых к налидиксовой кислоте

NaP) с перекрестной резистентностью к фторхинолонам у штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп.

5. Изучить способность к экспрессии 7?-плазмид различных групп несовместимости в эпидемически значимых штаммах холерного вибриона eltor.

6. Оценить соответствие данных антибиотикограмм у коллекции штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп с результатами эффективности антибактериальных препаратов на модели генерализованной инфекции у белых мышей.

7. Разработать подходы к оптимизации методов определения антибиотико-граммы холерного вибриона и интерпретации её результатов для выбора средств этиотропной терапии холеры.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые:

- проведен анализ встречаемости маркеров антибиотикорезистентности и их сочетаний на основе антибиотикограмм (значения МПК 23 препаратов) 390 штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005гг.;

- доказан индуцибельный характер устойчивости к тетрациклинам, левоми-цетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, амикацину, канамицину, что является одной из причин вариабельности спектра и степени резистентности у возбудителя холеры;

- представлены данные о разнообразии набора трансмиссивных (к стрептомицину, тетрациклинам, левомицетину, триметоприму/ сульфаметоксазо-лу, ампициллину, аминогликозидам) и нетрансмиссивных (к рифампицину, хинолонам, фуразолидону) маркеров антибиотикоустойчивости у штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп;

- показано, что трансмиссивная устойчивость к стрептомицину и триметоприму/ сульфаметоксазолу и нетрансмиссивная - к рифампицину у холерного вибриона характеризуется стабильностью; о о „

- представлены данные о высокой частоте (п*10" -10" ) появления Rif и Nalr мутантов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп при однократном воздействии препаратов и снижении частоты их выделения более чем на 1-2 порядка в случае добавления в среду культивирования других антибиотиков в субингибирующих концентрациях, что свидетельствует о перспективности этиотропной терапии холеры рифампицином и хинолонами в синергидных комбинациях с другими препаратами;

- доказана возможность экспрессии ^-плазмид девяти групп несовместимости (inc С, J, S, N, М, FII, Fill, W, К) в антибиотикочувствительном штамме V. cholerae eltor Р-5879 и его Rif, NaT мутантах, а также 7?-плазмид inc С, J, S групп несовместимости — в клиническом изоляте с множественной антибио-тикорезистентностью;

- на основе сравнительных данных антибиотикограмм in vitro и эффективности антибактериальных препаратов in vivo предложены пограничные значения МПК и диаметров зон подавления роста для чувствительных и устойчивых штаммов холерного вибриона на трех питательных средах (агар Мюллера-ХинтонарН 7,3±0,2, агар Хотгингера рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4±0,2).

Практическая значимость работы.

Сравнительная оценка активности антибактериальных препаратов in vitro и in vivo показала, что наличие антибиотикорезистентности (мутационной, трансмиссивной) к разным препаратам у штаммов холерного вибриона эльтор и 0139 приводит к неэффективности беталактамов (ампициллин, цефтриаксон, цефотаксим и др.) при сохранении к ним чувствительности культур in vitro, что свидетельствует о возможной персистенции изменённых форм возбудителя в макроорганизме. Снижение эффективности in vivo фторхинолонов наблюдается уже при значениях МПК>0,2 мг/л, фуразолидона - при значениях МПК>16 мг/л, доксициклина - при значениях МПК>4 мг/л и это необходимо учитывать при назначении препаратов для экстренной профилактики и лечения холеры на основании оптимизированных подходов к определению антибиотикограммы возбудителя и её интерпретации. С этой целью нами предлагается использование в качестве контроля антибиотикочувствительного рефе-ренс-штамма холерного вибриона не 01 Р-9741 (КМ162) (справка о депонировании в ГК РосНИПЧИ «Микроб» №70 от 4.03.2003), для которого отработаны допустимые колебания значений МПК и диаметров зон подавления роста на среде Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агаре Хоттингера рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4+0,2 («Методические рекомендации по определению чувствительности/ устойчивости холерного вибриона к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и диско-диффузионным методом. Интерпретация результатов исследования» (протокол № 8 от 22.11.06)). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анализ антибиотикограмм 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей за период с 1927 по 2005гг., показал, что устойчивость к 1-3 препаратам регистрировалась с 1983 по 1993гг.; с 1993 (0139) и с 1994гг. {eltor) все изученные штаммы характеризовались множественной антибиотикорезистентностью с различным набором г-детерминант устойчивости (от 3х до 10тн).

2. У изученных штаммов возбудителя холеры обнаружена нетрансмиссивная резистентность к рифампицину, хинолонам, фуразолидону и трансмиссивная - к стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, тетрацик-линам, левомицетину, ампициллину, гентамицину, канамицину, амикаци-ну в разных сочетаниях.

3. В ходе эпидемического процесса у холерного вибриона может расширяться спектр антибиотикорезистентности за счет: а) индукции антибиотиком экспрессии трансмиссивной устойчивости к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, амикацину; б) мутаций резистентности к рифампицину и хинолонам; в) включения 7?-плазмид 9 групп несовместимости с разным набором маркеров устойчивости.

4. На основе сопоставления данных антибиотикограмм штаммов холерного вибриона, полученных с использованием контрольного антибиотикочув-ствительного референс-штамма V.cholerae поп 01 КМ 162, и эффективности препаратов in vivo предложены критерии интерпретации результатов определения антибиотикограмм для 3х питательных сред (агар Мюллера-Хинтона, Хоттингера, АГВ), что способствует адекватному выбору средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научных конференциях ФГУЗ РостНИПЧИ Ростпотребнадзора в 20012006гг.; представлены:

- на проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону, 2001-2006гг.

- на научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ, «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы». - Ставрополь, 2002г.;

- на научно-практической конференции, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии, «Окружающая среда и здоровье». - Саратов, 2002г.;

- на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2002г.;

- на IV Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс". - Сочи ОК "Дагомыс", 2003г.;

- на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера" - Ростов-на-Дону, 2003 г.;

- на VII и VIII Международных конференциях MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. - Москва, 2005, 2006г.

Диссертационная работа выполнена в рамках двух государственных тем: №ГР 01.9.90 002822 «Экспериментальное обоснование рациональных подходов к этиотропной терапии холеры», где автор являлась исполнителем и № ГР 0120.0 410671 «Разнообразие спектра маркеров антибиотикорезистент-ности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона», где автор является ответственным исполнителем.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 20 научных работах, из которых 5 в центральной и 8 в региональной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 машинописных страницах, содержит 43 таблицы, 3 рисунка, 338 литературных источников: 134 отечественных и 205 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дудина, Надежда Александровна

145 ВЫВОДЫ

1. Изучение чувствительности 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей за период с 1927 по 2005 гг., к 23 антибактериальным препаратам показало, что устойчивость к 1-3 антибиотикам регистрировалась у культур, изолированных в 1983-1993 гг.; все изученные штаммы, выделенные в 1993-1994 гг. (0139) и в 1994-2005 гг. {eltor) имели от 3 до 10 маркеров резистентности в разных сочетаниях.

2. Низкая стабильность экспрессии признаков устойчивости холерного вибриона к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, хинолонам может быть одной из причин регистрируемой у возбудителя вариабельности наборов r-детерминант резистентности.

3. Спектр и степень антибиотикорезистентности холерного вибриона может изменяться в ходе эпидемического процесса в результате индукции этио-тропным препаратом экспрессии трансмиссивной устойчивости к тетрациклинам, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, амикацину.

4. Мутация резистентности к рифампицину и налидиксовой кислоте (при перекрестной устойчивости к фторхинолонам) возникает у V.cholerae 01 и

9 8

0139 серогрупп с частотой пхЮ" -10", что свидетельствует об опасности монотерапии холеры этими препаратами.

5. У клинических изолятов и экспериментальных штаммов возбудителя холеры 01 и 0139 серогрупп установлено наличие трансмиссивных (тетрацик-лины, левомицетин, ампициллин, стрептомицин, гентамицин, канамицин, амикацин, триметоприм/ сульфаметоксазол) и нетрансмиссивных (рифампицин, хинолоны, фуразолидон) маркеров антибиотикорезистентности.

6. В холерном вибрионе с частотой пх10"8-10"5 могут экспрессироваться R-плазмиды девяти групп несовместимости {inc С, J, S, N, М, FII, Fill, W, К) с разным набором r-детерминант антибиотикорезистентности, возможность передачи которых возбудителю от кишечной микрофлоры возможна при легких, среднетяжелых формах инфекции и вибриононосительстве. 7. На основе сопоставления данных чувствительности холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп к антибактериальным препаратам in vitro и их эффективности in vivo предложены критерии интерпретации результатов определения антибиотикограммы с использованием контрольного штамма V.cholerae поп Ol КМ 162 на трех питательных средах (агар Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2, агар Хоттингера рН 7,2±0,1, АГВ рН 7,4±0,2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO/CDC/CSR/EDC/1999) все заболевшие холерой независимо от тяжести инфекционного процесса должны проходить курс этиотропной терапии. Выбор эффективных средств экстренной профилактики и лечения холеры серьезно осложняется распространением среди возбудителей холеры множественной устойчивости к антибактериальным препаратам. В связи с этим очевидна необходимость четкого представления о встречающихся у эпидемически значимых штаммов маркерах антибиотикорезистентности и различных наборах r-детерминант устойчивости; степени их экспрессии; а также оценка возможности расширения спектра устойчивости: за счет индукции антибиотиком устойчивого фенотипа; за счет мутаций к рифампицино- и хинолонорезистентности; за счет включения i^-плазмид разных групп несовместимости. Необходима также оптимизация подходов к определению антибиотикограммы возбудителя холеры - основы выбора средств этиотропной терапии холеры.

Первым этапом исследования явилось изучение антибиотикограмм 390 штаммов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп, выделенных от людей в разных регионах мира в период с 1927 по 2005гг. Чувствительность/ устойчивость культур к 23 препаратам изучали методом серийных разведений антибиотиков в агаре Мюллера-Хинтона с использованием в качестве контроля депонированного нами антибиотикочувствительного референс-штамма V.cholerae поп 01 Р-9741 (КМ 162) и высоковирулентного чувствительного к антибиотикам эталонного ctxAB+ tcpA+ штамма V.cholerae eltor Р-5879. Для интерпретации результатов пользовались «Критериями. для неприхотливых бактерий» (Statement СА - SFM, 1996), разработанными Европейским обществом микробиологов и инфекционистов.

Установлено, что все штаммы V.cholerae cholerae (1927-1966гг.) и V.cholerae eltor (1938-1978гг.) были чувствительны к 21 взятому для исследования антибиотику. 91% культур V.cholerae eltor, выделенных в указанный период времени, были высокоустойчивы к полимиксину (МПК=256,0мг/л) и 64,7% - к эритромицину (МПК=8,0мг/л).

Среди 132 штаммов V.cholerae eltor (1983-1993гт.) 8% были устойчивы к стрептомицину, 5% - к амикацину, 5,5% - к канамицину, 11% - к ампициллину, 10% -к рифампицину, 4% - к триметоприму/ сульфаметоксазолу и 83,5% - к эритромицину; 100% штаммов были в разной степени (МПКМ 6,0-512,0 мг/л) устойчивы к полимиксину. Не было обнаружено культур, устойчивых к тетрациклину и левомицетину.

Для 100% взятых для исследования штаммов V.cholerae eltor, выделенных от людей во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994г. (50 штаммов) и вспышки инфекции там же в 1998г. (21 штамм), была характерна множественная резистентность к антибактериальным препаратам, используемым для профилактики и лечения инфекции: тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, у 14% штаммов - дополнительно - к рифампицину (1994г.), у 32-37% - к канамицину, у 24-48% -к эритромицину; все штаммы были высокоустойчивы к полимиксину и имели повышенные значения МПК фуразолидона (16,0 мг/л).

Во время эпидемии холеры в г.Казани в 2001г. все 70 штаммов, выделенных от людей, были устойчивы к налидиксовой кислоте, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, характеризовались повышенными значениями МПК левомицетина (4,0-8,0 мг/л) и фуразолидона (16,0-64,0 мг/л).

В 2005г. в г.Каменске-Шахтинском (Ростовская область) было выделено от людей 33 штамма V.cholerae eltor с устойчивостью к стрептомицину, ампициллину, триметоприму/сульфаметоксазолу и с повышенными значениям МПК цефтри-аксона (8,0-16,0 мг/л), цефотаксима (8,0-32,0 мг/л) и фуразолидона (16,0 мг/л). Две из числа исследованных культур сразу после поступления в РостНИПЧИ дополнительно имели маркер резистентности к левомицетину (32,0 мг/л).

В том же 2005г. в г.Твери от больного была выделена культура V.cholerae eltor с большим набором г-детерминант устойчивости: к налидиксовой кислоте, фторхинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину), стрептомицину, ампициллину, цефалоспоринам Ш поколения, левомицетину, триметоприму/ сульфаметоксазолу и с повышенными значениями МПК (до 32,0 мг/л) фуразолидона. Ограничение и ликвидация эпидемических осложнений, вызванных подобным множественнорезистентным возбудителем холеры, могут быть серьезно затруднены из-за резкого ограничения в выборе средств экстренной профилактики и лечения холеры.

Изучение антибиотикограмм 24 штаммов холерного вибриона 0139 серогруппы, выделенных от людей в разных регионах мира, включая РФ, в 1993-1994гг., показало, что все они имели одинаковый спектр резистентности: к стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу и повышенные значения МПК фуразолидона (до 32,0 мг/л), что соответствует данным литературы (T.Ramamurthy et al., 1993; N.Vijaylakshmi et al., 1997).

Проведенная серия экспериментов подтверждает наблюдения других исследователей (Е.А.Ведьмина др., 1997; S.Kuwahara et al., 1980; S.Matsushita et al., 1985 и др.), свидетельствующие о редкой встречаемости антибиотико-резистентности у возбудителя холеры до 1983 года. С 1993-1994гг. все изученные нами штаммы холерного вибриона Ol и 0139 серогруппы характеризовались множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам.

Анализ зарегистрированных маркеров резистентности у возбудителя холеры (1983-2005гг.) показал их высокую вариабельность. Показано, что у изученных штаммов холерного вибриона встречали от 1 до 10 г-детерминант устойчивости и, при этом, с 1994 года все культуры были устойчивы к стрептомицину и триметоприму/ сульфаметоксазолу, в то время как резистентность к другим препаратам варьировала. Использование стрептомицина (Е.И.Коробкова, 1959; R.Pollitzer, 1959; S.Ghosh et al., 1992) и комбинаций пролонгированных сульфаниламидов с триметопримом (WHO/COS/ CSR/ EDC,1999) для целей профилактики и лечения холеры в свете полученных данных представляется малоперспективным.

Одной из причин вариабельности маркеров антибиотикорезистентности у эпидемически значимых штаммов холерного вибриона может быть низкая стабильность экспрессии маркеров устойчивости к тетрациклину, левомицетину, ампициллину, стрептомицину, отмеченная ранее рядом исследователей

Л.С.Подосинникова, 2000; О.П.Фецайлова и др., 1996; V.Falbo et al., 1999 и др.)

В наших опытах хранение 50 штаммов V.cholerae eltor (Дагестан, 1994) в течение 1-3-х месяцев приводило к снижению степени устойчивости к тетрациклину и левомицетину вплоть до её утраты. Однако даже однократный пересев на среде с антибиотиком способствовал восстановлению исходных значений МПК (32,0-64,0мг/л).

Для штаммов холерного вибриона, выделенных от людей в г.Казани (2001г.), была характерна промежуточная устойчивость к левомицетину (МПК=4,0-8,0 мг/л), которая снижалась без контакта с антибиотиком (МПК=1,0-2,0 мг/л). Для 16 штаммов, хранившихся на столбиках полужидкого агара (0,7%) с субингибирующими концентрациями левомицетина (4,0 мг/л) в течение 3-х месяцев, значения МПК оказались равными 64,0-128,0 мг/л. Хранение этих культур без контакта с антибиотиком вновь сопровождалось снижением экспрессии признака (МПК=4,0-8,0 мг/л).

Детальное изучение колебаний значений МПК антибактериальных препаратов в процессе хранения без контактов с антибиотиками, после их воздействия и последующего хранения в отсутствие препаратов было проведено на штаммах, выделенных в г.Казани (2001г.), Каменке-Шахтинском (2005г.), г.Твери (2005г.). Установлено, что устойчивость у V.cholerae eltor 18377 (г.Казань, 2001г.) к налидиксовой кислоте проявляет тенденцию к снижению без селективного давления препарата. В то же время 3-4 пересева на средах, содержащих налидиксовую кислоту или фторхинолоны, приводит к значительному повышению МПК налидиксовой кислоты (до 800,0-1600,0 мг/л) и проявлению резистентности (МГПС>2,0 мг/л) фторхинолонов, которая не регистрируется при МПК налидиксовой кислоты 128 мг/л. Хранение культур, устойчивых к хинолонам, без контакта с препаратами вновь приводит к снижению степени проявления резистентности.

Аналогичные наблюдения отмечены и в отношении устойчивости штаммов холерного вибриона, выделенных от людей в г.Каменске-Шахтинском (2005г.), к левомицетину и ампициллину, т.е. устойчивость к вышеперечисленным антибиотикам носит индуцибельный характер.

Необходимо подчеркнуть, что у культур возбудителя холеры (19942005гг.) стабильно наследовались признаки устойчивости к стрептомицину и триметоприму/ сульфаметоксазолу.

Эта особенность была характерна и для культуры холерного вибриона 18826, выделенной от больного в г.Твери в 2005г. Что касается устойчивости этого штамма к налидиксовой кислоте, фторхинолонам, ампициллину, левомицетину, то МПК препаратов снижались в течение 3-х месяцев наблюдения вплоть до показателей, соответствующих чувствительности (фторхинолоны, ле-вомицетин, ампициллин). После контактов с препаратами резистентность восстанавливалась, а затем вновь снижалась без воздействия антибиотиков. Дополнительно показано, что 3-4 пересева культур на агаре с возрастающими концентрациями тетрациклинов и гентамицина приводило к экспрессии трансмиссивной устойчивости у ранее чувствительного к этим препаратам штамма 18826.

Результаты исследований свидетельствуют о способности холерного вибриона изменять свой фенотип от антибиотикочувствительного к резистентному и обратно в зависимости от наличия или отсутствия контакта с антибактериальным препаратом. Показано, что наличие у возбудителя генетической потенции к проявлению антибиотикоустойчивого фенотипа (к тетрациклинам, гентамицину) у фенотипически чувствительного штамма обеспечивает возможность экспрессии r-детерминант резистентности, способных к самопереносу другому хозяину.

Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что расширение спектра устойчивости и повышение МПК препаратов в отношении варианта возбудителя, вызвавшего вспышку инфекции, может наблюдаться в ходе эпидемического процесса при использовании для экстренной профилактики и лечения антибиотиков, резистентность к которым закреплена в геноме V.cholerae даже в случае отсутствия её экпрессии у первых выделенных культур.

Сразу же возник вопрос о длительности сохранения такой способности. Для его решения было отобрано 8 штаммов V.cholerae eltor со сроком хранения 14-20 лет. Доказано, что многократные пересевы на плотной питательной среде с возрастающими концентрациями тетрациклина^ левомицетина, ампициллина, стрептомицина обеспечивали реверсию антибиотикорези-стентного трансмиссивного фенотипа. Четыре штамма из восьми в опытах • конъюгации оказались способны передавать Е. coli C600 Rifr, Е. coli OD5003 Nalr, Y.pestis EVc частотой nxl О"8-10"7 маркеры- индуцированной in vitro резистентности к тетрациклину+ампициллину, ампициллину, левомицети-. ну+ампициллину, стрептомицину+ампициллину. При этом устойчивость к ампициллину возникала дополнительно при контакте культур с тетрациклином, левомицетином, стрептомицином и при переносе другому хозяину носила сцепленный характер: Два штамма из четырех до начала опыта имели полностью чувствительный фенотип (2 Г антибактериальный препарат).

Таким образом, низкая стабильность экспрессии устойчивости к антибактериальным препаратам и её индуцибёльный характер может быть одной из причин вариабельности обнаруживаемых у холерного вибриона маркеров антибиотикорезистентности и возможного расширения; спектра, степени, её проявления в ходе эпидемического процесса.

Далее было установлено, что рифампицино- и хинолонорезистентные мутанты V.cholerae 01 и 0139 серогрупп могут возникать с частотой nxl О"9-10"8 и сохраняют токсигенность, что показано на модели изолированной петли тонкого кишечника у взрослых кроликов Эти наблюдения подтверждаются выделением./?//^ мутантов в Дагестане (1994г.), Nalr - в г.Казани (2001г.) и в г.Твери (2005г.);. Необходимо отметить, что частота появления Rifr и Nal г мутантов снижается более чем на 1-2 порядка при добавлении в. среду культивирования субингибирующих концентраций других антибиотиков, что свидетельствует о перспективности применения рифампицина и хинолонов в синергид-ных комбинациях с другими препаратами.

Дополнительными экспериментами было показано, что у изученных нами клинических изолятов V. cholerae eltor и 013 9 устойчивость к тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину носила трансмиссивный характер. При этом независимо от селектируемого маркера, реципиентам E.coli Сбоо Rifr, E.coli OD5003 Nalr, Y.pestis EV и в обратных кроссах V.cholerae eltor P-5879 и его Rif, Nalr мутантам с частотой nxl0~9-10"5 происходила передача всех маркеров, характерных для штамма-донора.

Индуцированная in vitro устойчивость к тетрациклину, доксициклину, левомицетину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, амикацину, ампи

8 7 циллину передавалась E.coli Сбоо Rif с частотой пхЮ" -10" .

В опытах конъюгации не было отмечено передачи маркеров резистентности к рифампицину, хинолонам, фуразолидону.

До настоящего времени у холерного вибриона идентифицированы только R-плазмиды inc С группы несовместимости (S.Kuwahara, 1980; MJ.Finch et al., 1988; E.Ferreira et al.,1992). Решению вопроса о возможности экспрессии у возбудителя холеры Я-плазмид и других inc групп был посвящен следующий раздел работы.

В результате проведенных исследований было установлено, что помимо двух Я-плазмид (.R57b, R40^) inc С группы несовместимости в штамме холерного вибриона Р-5879 и его Rif, Nalг мутантах возможна экспрессия R-плазмид еще восьми групп несовместимости (inc J,S,N,K, М, W, Fu, Fin) с разным набором г-детерминант устойчивости, донорами которых может быть микрофлора кишечника (в частности, энтеробактерии).

Возможность расширения спектра антибиотикорезистентности эпидемически значимого штамма холерного вибриона eltor за счет включения Я-плазмид показано на примере штамма V.cholerae eltor 18377 (г.Казань, 2001). Наряду с устойчивостью к хинолонам, стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, левомицетину дополнительно в результате конъюгативного переноса iJ-плазмид inc С, J, S в трансконъюгантах штамма 18377 экспрессировались маркеры резистентности к гентамицину, ампициллину, канамицину, тетрациклину.

Вышеприведенные наблюдения свидетельствуют о потенциальной возможности увеличения набора r-детерминант устойчивости у возбудителя холеры в ходе эпидемического процесса за счет индукции антибиотиками экспрессии генов резистентности, появления рифампицино- и хинолонорези-стентных мутантов, включения ^-плазмид не только inc С, но и, как минимум, ещё восьми других групп несовместимости.

Как указано ранее, для оценки чувствительности/ устойчивости штаммов холерного вибриона были использованы критерии чувствительности/ устойчивости, разработанные Европейским обществом микробиологов и инфекционистов для неприхотливых бактерий (Statement CA-SFM, 1996), так как критерии для семейства Vibrionaceae до настоящего времени не разработаны. Адаптация вышеуказанных критериев для интерпретации результатов определения антибиотикограммы холерного вибриона не может быть осуществлена без сравнительного анализа соответствия данных in vitro и in vivo.

Для изучения активности антибактериальных препаратов в опытах in vivo была использована модель генерализованной инфекции у беспородных белых мышей, предложенная ранее (Е.И.Коробкова, 1959; R.Pollitzer, 1959; А.Е.Либинзон и др., 1974). Эффективные на этой модели препараты с успехом применялись и для лечения холеры у людей (А.Б.Черномордик, 1988; P.Grados et al., 1996; D.Gilbert et al., 1999; I.A.Memon, G.Murtaza, 2002 и др.).

Экспериментально доказанное соответствие чувствительности in vitro к 17 антибактериальным препаратам и их эффективности in vivo при инфекции, вызванной V.cholerae eltor Р-5879, позволило проследить далее изменение терапевтической активности антибактериальных препаратов у мышей, инфицированных Rif, Nalr, Cpf мутантами этого штамма и его вариантом с сочетанной хромосомной (Rif) и плазмидной (Rs7b) резистентностью. Было показано, что Rifr мутант вызывает заболевание, при котором теряет эффективность не только рифампицин, но и беталактамы (ампициллин, цефалоспорины Ш поколения), к которым чувствительность in vitro сохраняется. При инфекции, обусловленной инфицированием мышей Nalг мутантом (МПК= 160,0 мг/л), была утрачена терапевтическая активность налидиксовой кислоты, резко снижалась эффективность офлоксацина, норфлоксацина при значениях МПК препаратов, равных 0,1-0,2 мг/л; при сохранении in vitro чувствительности к беталактамам терапевтическая активность ампициллина и цефотаксима также была утрачена. V.cholerae eltor Р-5879 Cpf вызывал инфекционный процесс у мышей, который излечивался тетрациклинами, левомицетином, аминогликозидами, фуразолидо-ном, триметопримом/ сульфаметоксазолом так же, как и при инфекции, обусловленной V.cholerae eltor Р-5879 Nalг, но дополнительно к утрате эффективности хинолонов, беталактамов регистрировалась неэффективность рифампицина (30% выживших) при сохранении к нему чувствительности in vitro. Штамм V.cholerae eltor Р-5879 RifrR57b был устойчив к рифампицину, левомицетину, гентамицину, канамицину, ампициллину, триметоприму/ сульфаметоксазолу и вызывал у мышей инфекцию, не поддающуюся излечению не только этими препаратами, но и цефалоспоринами Ш поколения (цефтриаксон, цефо-таксим), к которым культура возбудителя сохраняла чувствительность in vitro. Эффективны были тетрациклины, хинолоны, стрептомицин и фуразолидон.

Дальнейшая серия экспериментов была посвящена оценке эффективности антибактериальных препаратов при инфекции у мышей, вызванной клиническими множественнорезистентными изолятами холерного вибриона 01 и 0139 серог-рупп (1993-2005гг.) и их вариантами с расширенным спектром резистентности.

Как было указано ранее, все выделенные в этот период культуры имели повышенные значения МПК фуразолидона (16,0-32,0 мг/л), которые в соответствии с «Критериями.» (Statement С А - SFM, 1996) не могли быть отнесены к разряду устойчивых (МПК>100 мг/л) и тем не менее вызывали инфекцию, не поддающуюся излечению фуразолидоном. Низкая эффективность фуразолидона при таких значениях МПК была установлена и во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994г., когда количество бактериальных рецидивов при использовании препарата достигало 28,6% (Г.Л.Карбышев и др., 1995; М.Х.Турьянов и др., 1996).

Таким образом, эффективность фуразолидона можно ожидать при значениях МПК этого препарата, равных или меньше 4,0 мг/л, неэффективность - при МПК >16 мг/л.

Все изученные штаммы (1993-2005гг.) 01 и 0139 серогрупп были резистентны к стрептомицину и триметоприму/сульфаметоксазолу, что сопровождалось их неэффективностью in vivo.

Так же, как экспериментальный штамм V.cholerae eltor Р-5879 Nalг с невысокой степенью устойчивости к налидиксовой кислоте (МПК=160,0 мг/л), клинический изолят (МПК=128,0 мг/л), вьщеленный в г.Казани в 2001г., вызывал инфекцию, при которой неэффективной оказалась не только налидиксовая кислота, но и снижалась эффективность фторхинолонов, к которым в соответствии с «Критериями.» сохранялась чувствительность (МГЖ=0,1-0,2 мг/л) in vitro. Это вызывает необходимость пересмотра пограничных значений МПК для чувствительных и устойчивых штаммов холерного вибриона к фторхинолонам и нецелесообразности их использования для экстренной профилактики и лечения холеры при регистрации у возбудителя резистентности к налидиксовой кислоте.

Во всех опытах со штаммами 01 серогруппы, выделенными в Дагестане (1994, 1998гг.), в г.Казани (2001г.), и с культурами V.cholerae 0139 (19931994гг.), чувствительными in vitro к беталактамам, не установлено их высокой эффективности in vivo, что вызывает серьезные сомнения в целесообразности применения беталактамов для целей профилактики и этиотропной терапии инфекции на современном этапе развития VII пандемии холеры.

Необходимо отдельно остановиться на результатах изучения* эффективности in vivo антибактериальных препаратов в отношении инфекции у мышей, вызванной штаммами холерного вибриона, выделенными в 2005г.

Все культуры V.cholerae eltor, выделенные в г.Каменске-Шахтинском (Ростовская область, РФ), характеризовались устойчивостью к стрептомицину, триметоприму/ сульфаметоксазолу, ампициллину, имели повышенные значения МПК фуразолидона (16,0 мг/л), цефтриаксона, цефотаксима (8,0 мг/л), два штамма из 33 дополнительно имели маркер резистентности к левомицетину. Препараты, к которым культура была устойчива или имела повышенные значения МПК, были неэффективны.

Особую тревогу вызывает штамм, выделенный от больного в г.Твери. Широкий спектр антибиотикорезистентности исключал эффективность левомицетина, налидиксовой кислоты, фторхинолонов, стрептомицина, триметоприма/ сульфаметоксазола, беталактамов, фуразолидона. Культуры возбудителя с индуцированной in vitro устойчивостью к тетрациклинам и аминогликозидам (гентамицину, канамицину, амикацину) определяли дополнительно неэффективность и этих антибиотиков. Угроза включения таких вариантов возбудителя в эпидемический процесс заставляет серьезно задуматься о дополнительных подходах к экстренной профилактике и лечению холеры, ориентированных на разработку антибиотиков, сохраняющих эффективность в условиях широкой распространенности множественной устойчивости у бактерий, а также препаратов, альтернативных антибиотикам: бактериофагов, пробиотиков, бактериоцинов, пептидов животного и растительного происхождения и веществ, блокирующих активность поверхностных структур бактерий (Е.Р. Корвякова, 2000; И.А.Дятлов, 2006;Э.А.Светоч и др., 2006). Одним из альтернативных вариантов этиотропной терапии, приводящей к гибели или остановке роста возбудителей, является использование лекарственных препаратов, подавляющих экспрессию генов вирулентности микроорганизмов (Т.Я.Вахитов и др., 2006; Т.С.Ильина и др., 2006; И.А.Хмель, А.З.Метлицкая, 2006). Все эти исследования находятся на стадии научных разработок.

Антибиотикограмма холерного вибриона до настоящего времени остается основой выбора средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры. Требования к определению чувствительности бактерий семейства Vibrionaceae к антибактериальным препаратам не отработаны. Использованные нами критерии для неприхотливых бактерий (Statement СА - SFM, 1996) нуждаются в адаптации применительно к возбудителю холеры.

В ходе настоящего исследования подобраны: а) питательные среды: помимо агара Мюллера-Хинтона рН 7,3±0,2 предлагается использовать агар Хоттингера рН 7,2±0,1 (1,2-1,4 г/л аминного азота, 1,5-2% агара), агар Гивенталя-Ведьминой (АГВ) рН 7,4±0,2 с учетом экономических возможностей обеспечения, прежде всего, Специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ); б) контрольные штаммы: референтный штамм E.coli АТСС 25922, V.cholerae поп 01 КМ 162 (депонирован как референс-штамм в Государственной Коллекции патогенных бактерий института «Микроб») с данными о предельно допустимых колебаниях значений МПК и диаметров зон ингиби-ции роста на вышеуказанных питательных средах; в) посевные дозы для метода серийных разведений и диско-диффузионного метода с учетом получения результатов в кратчайшие сроки; г) определены антибиотики первого и второго ряда с диапазоном необходимых концентраций в агаре для метода серийных разведений; д) и, наконец, предложены пограничные значения МПК и диаметры зон подавления роста (для трех питательных сред) для отнесения изучаемых культур к разряду чувствительных и устойчивых на основе сравнительных данных активности антибиотиков in vitro и in vivo.

В предлагаемых для штаммов холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп критериях чувствительности/ устойчивости в сравнении с таковыми для неприхотливых бактерий повышены требования в отношении фторхинолонов, доксициклина, фуразолидона, ампициллина, цефалоспоринов III поколения.

Вышеизложенное нашло отражение в «Методических рекомендациях по определению чувствительности холерного вибриона к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и диско-диффузионным методом. Интерпретация результатов исследования», утвержденных директором РостНИП-ЧИ (протокол № 8 от 22.11.06).

Разработанные нами критерии оценки чувствительности/ устойчивости холерного вибриона, адаптированные применительно к этому виду возбудителя, должны способствовать как адекватному выбору средств экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры, так и ограничению дальнейшего развития и распространения устойчивости к антибактериальным препаратам, которые могут явиться альтернативными традиционно применяемым для лечения этой нозологической формы инфекции.

В настоящее время назрела необходимость разделения штаммов возбудителей инфекционных заболеваний на чувствительные и штаммы с генетической потенцией к экспрессии устойчивости в силу наличия генов антибиотикорезистентности. В РостНИПЧИ с нашим участием начаты исследования по экспрессной детекции генов хинолонорезистентности у холерного вибриона на основе полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма ДНК (SSCP -анализа).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дудина, Надежда Александровна, Ростов-на-Дону

1. Акар Ж.Ф. Распространение бета-лактамаз среди патогенных микроорганизмов, антибактериальное действие комбинированного препарата ампициллин-сульбактама (уназина) //Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т.36, №6. - С.5-8.

2. Актуальные проблемы холеры /под редакцией В.И.Покровского, Г.Г.Онищенко. —М., 2000. 384с.

3. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина, 1971.-255с.

4. Березин А.Г., Ромашов О.М., Яковлев С.В., Сидоренко С.В. Характеристика и клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, №7. - С.5-11.

5. Богданов М.Б., Черненькая Т. Алгоритмы и организация антибиотикотерапии. Руководство для врачей -М.: Издательский дом Видар М, 2004.-223с.

6. Богданова М.И., Лебедева С.А., Либинзон А.Е. Передача фактора множественной лекарственной устойчивости от кишечной палочки вибриону эль-тор //Антибиотики. 1972. - Т.17, №4. - С.333-335.

7. Богданова М.И., Мишанькин Б.Н., Лебедева С.А. Эписомная резистентность холерного вибрионак пенициллину // Антибиотики.-1971.-№7.-С.630-632.

8. Бондарева Н.С., Буданов С.В. Новые фторхинолоны: особенности антимикробного действия и фармакокинетика //Антибиотики и химиотерапия. -1998. №8. - С.28-33.

9. Боярский А.Я. Статистические методы в экспериментальных медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1955. - 262 с.

10. Брюханова Г.Д., Грижебовский Г.М., Бейер А.П. Неожиданно возникшие и вновь появляющиеся инфекционные заболевания как причина чрезвычайных ситуаций // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001.- №6 (Приложение). - С.9-14.

11. Буданов С.В. Цефтибутен (цедекс1) новый цефалоспорин Ш поколения для приема внутрь: значение в терапии бактериальных инфекций//Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - №4. - С.33-39.

12. Бургасов ПН. Холера Эль-Тор /руководство для врачей. М.: Медицина, 1971.-264с.

13. Вакуленко СБ. Бактериальные ферменты, инактивирующие аминогликозидрые антибиотики, и кодирующие их гены//Антибисгшки и химиотерапия-1992- Т37., №4. С.49-53.

14. Варпгересян ИИ, ГеворкянЗ.У. Саркисян Н.Н. и др. Конъюгативные плазмиды ангабио-тикорезисгешных штаммов сальмонелл// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002.- №1. С.78-79.

15. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе «чувства.кворума» у бактерий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол 2006. - №3. - С. 105-113.

16. Ведьмина Е.А., Горелов A.JI., Шендерович В.А., Хайтович А.Б. Динамика изменения антибиотикочувствительности холерных вибрионов // Матер. VH съезда Все-рос.Общ-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. М;, 1997.- Т.2. - С.334-335.

17. Викторов Д.В, 11ивень Н.Н. Активный мембранный транспорт: и множественная антибиотикорезистентность бактерийУ/Мол.генет., микробиол. и вирусол. -2001.-jYO3.-C.3-7.

18. Вильяме Д. Резистентность к беталактамным препаратам // Антибиотики и химиотерапия.- 1997. №10. - С.5-9.

19. Говорун В.М:, Гущин А.Е., Ладыгина В.Г. и др. О формировании резистентности к фторхинолонам у M.hominis и A.laidlawii II Мол.генет, микробиол. и вирусол.-.1998.-№3.-С.16-19. .

20. Горелов А.В., Малеев В.В., Милютина Л.Н., Воротынцева Н.В. Эмпирическая ан-тибиотикотерапия острых кишечных инфекций у детей (методическое пособие для врачей)//Антибиотики и химиотерапия.-2001.-Т.46, №10.-С.19-24.

21. Грачева Н.М., Щетинина И.Н. Холера //Клин, химиотер. инфекцион. болезней.- Л: Медицина, 1991. С.75-80.

22. Давиденко С.Н., Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А. и др. Мониторинг чувствительности к антибиотикам холерных вибрионов 01, выделенных в Украине // Пробл.комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы»- Ростов-на-Дону,-2004.-Вып.17.- С.77-80.

23. Данилкина Е.Б., Смоликова Л.М., Миронов А.В., Санамянц Е.М. Изучение чувствительности патогенных для человека вибрионов к антибактериальным препаратам // Холера: Матер.Рос.науч.-практ.конф. по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 1995.- С.162-165.

24. Дмитровский A.M., Курмангазин М.С., Мусабеков А.А., Сыздыков Д.М. Клиника и лечение современной холеры в Казахстане //Пробл.комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы»- Ростов-на-Дону, 2003.-Вып.- G.247-250.

25. Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Тетрациклины: прогресс фундаментальных иссле-дований//Антибиотики и химиотерапия.-2004.-Т.49, №8-9.-С.5-7.

26. Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Реальность нового направления комбинированной химиотерапии. Скрининг ингибиторов эффлюксных помп // Антибиотики и химиотерапия. 2001. - №4.- С.3-5.

27. Зубов Л.А., Богданов Ю.М. Современные проблемы антибиотикорезистентности в педиатрической клинике// Антибиотики и химиотерапия. 1998. - №4. - С.43-49.

28. Иванов К.С., Фисун В.В., Ходжаев Г.А., Цой В.В. Особенности диагностики и лечения холеры ЭльТор и её сочетаний с другими инфекционными заболеваниями при вспышке кишечной полиинфекции//Воен.-мед.жур. 1992. - №6. - С.60-64.

29. Искандеров Т.И., Хакимов М.М., Шавахабов Ш.Ш. Экология, эпидемиология и профилактика холеры Ташкент, 1996. - 121с.

30. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий //Мол. генет., микробиол. и виру-сол. -2003.-№4.-С.З-10.

31. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2006. - №3. - С.22-29.

32. Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий. — М., 1995.- 190с.

33. Карбышев Г.Л., Ломов Ю.М., Терентьев А.Н. и др. Этиотропная терапия в условиях вспышки холеры в Дагестане // Холера: Матер. Россйск. науч.-пракг. конф. по пробл. «Холера». -Ростов-на-Дону, 1995. С.191-194.

34. Ковалевская Н.П. Мобильные генные кассеты и интегроны // Молекулярнаябиология. 2002. - Т.36, №2. - С.261-267.

35. Кокушкин A.M., Федоров Ю.М., Омариева Э.Я. и др. Особенности эпидемиологии и профилактики холеры на современном этапе седьмой пандемии//Деп.в ВИНИТИ 12.04.00, №1004-В. (Медицина катастроф. Информ.сб., 2002, №1, Реф.02.01-04А10.116ДЕП).

36. Корвякова Е.Р. Применение «ударных» доз бифидумбактерина форте для лечения больных острым кишечными инфекциями // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №6. - С.58-62.

37. КоробковаЕ.И. Микробиология и эпидемиология холеры.-М.: Медгиз.-1959.-304с.

38. Кузнецова С.М. Ломефлоксацин гидрохлорид (максаквин) фторхинолон пролонгированного действия//Антибиотики и химиотерапия-1998.-Т.43,№2.-С.40-41.

39. Кузнецова С.М. Амикацин полусинтетический аминогликозид Ш поколения // Антибиотики и химиотерапия.-2002.-№5.-С.30-41.

40. Кюрегян А.А., Иванова С.М., Титов Г.В. и др. Характеристика культур холерных вибрионов, выделенных в 1998 г. в России из водоемов и от людей // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999.-Вып.12.-С.22-28.

41. Марамович А.С., Погорелов В.И., Урбанович Л.Я., Шкаруба Т.Т. Холера Эльтор в Латинской Америке // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол 2001.-№5.- С.82-90.

42. Мартиниевский ИЛ., Айкимбаев AM., Аубакиров СА. Пандемия холеры в Латинской

43. Америке: течение и меры борьбы с нею//Вторая Межгослауч.-пракг.конф. по взаимод. государств-участников СНГ в обл. сан. охр. территорий. Алматы, 2001. - С.147-148.

44. Международные медико-санитарные правила. ВОЗ. Женева, 2005.

45. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Подосинникова Л.С. и др. Некоторые актуальные вопросы холеры в современный период //Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы»- Ростов-на-Дону, 2006.-Вып.19.- С.12-16.

46. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Федоров Ю.М. и др. Оценка эпидемиологической ситуации по холере в мире, странах СНГ и России в XXI веке. Прогноз. // Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы»- Ростов-на-Дону, 2004. Вып.17. - С.9-13.

47. Мухамедов С.М., Инжеватова И.В., Середин В.Г., Иногамова И.А. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992.- №9-10.- С.34-37.

48. Нефедов К.С., Осин А.В. Смирнова НИ. Генетическое разнообразие пандемических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2005. - С.46-51.

49. Онищенко Г.Г. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др. Холера в начале ХХЕ века. Прогноз // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №3. - С .4448.

50. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Кологоров А.И. и др. Вспышка холеры в Казани в 2001 году//Проблемы ООН. Саратов, 2001. - С. 15-25.

51. Онищенко Г.Г. Об обеспечении эпидемиологического надзора за холерой в 2001 г. // ЗНиСО 2001. - №6 (99) - С.26-27.

52. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н. и др. Характеристика холерных вибрионов эльтор, выделенных в г.Казань в 2001г. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002.-№2. - С.3-6.

53. Падейская Е.И., Яковлев В.П. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. М.: 1998. - 351с.

54. Падейская Е.Н. Антимикробный препарат широкого спектра действия — ломефлоксацин (Максиквин): итоги 10-летнего применения в клиниках Рос-сии//Антибиотики и химиотерапия. 2000. - Т.45, №1. - С.39-43.

55. Падейская Е.Н. Фторхинолоны: значение, развитие исследований, новые препараты, дискуссионные вопросы // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - №11. - С.38-44.

56. Падейская Е.Н. Основные итоги исследований в ряду антимикробных препаратов класса хинолонов к началу XXI века; успехи и неудачи в разработке высокоэффективных фторхинолонов // Антибиотики и химиотерапия. 2001. - Т.46, №8. - С.32-39

57. Падейская Е.Н. Фторхинолоны в педиатрии. Состояние проблемы к началу XXI века//Антибиотики и химиотерапия.-2004.-Т.49, №7.-С.34-44.

58. Петров В.А. Опыт применения цифрана при холере//Человек и лекарство: VI Рос.науч.конгресс: тез.докл. М., 1997. - С.202.

59. Подосинникова JI.C. Значение антибиотиков в экологии холерных вибрионов // Антибиотики. 1977. - №4. - С.371-376.

60. Подосинникова JI.C. Чувствительность к антибиотикам вибрионов Эль-Тор, выделенных в СССР в период УП пандемии //Холера в СССР в период VII пандемии / под ред. В.И. Покровского. М.: Медицина, 2000 - С. 237-245.

61. Подосинникова JI.C., Домарадский И.В. Приобретение холерными вибрионами in vivo множественной устойчивости к антибиотикам //Антибиотики. -1973. №5.-С.449-452.

62. Подосинникова Л.С., Домарадский ИВ., Либинзон АЕ. и др. Множественная устойчивость холерных вибрионов Эль-Тор к антибиотикам // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1973. №4. - С.9-13.

63. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Кудрякова Т.А. и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в России и некоторых странах СНГ в 90-е годы //Холера: Ма-тер.Рос.науч.-пракг.конф. по пробл. «Холера». Ростов-на-Дону, 1995. С.76-79.

64. Покровский В.И. Лечение холеры // Рус.мед.журн.-1995-Т.1, Ж2.-С.26-27.

65. Покровский В .И., Малеев В.В. Холера. -М.: Медицина, 1978. 232 с.

66. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры. Саратов: Изд-во Саратов, ун-та, 1988. - 272с.

67. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.А. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке М. Медицина, 2003. - 664 с.

68. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

69. Об усилении мероприятий по эпидемиологическому надзору за холерой». -2005. -№11.

70. Постовит В.А. Инфекционные болезни: Руководство. Часть 1. Кишечные инфекции. Холера. С-Пб.: СОТИС.,Л997. - С. 135-156.

71. Райкова С.В., Шуб Г.М. Новые оригинальные соединения из группы нитрофу-ранов как потенциальное средство химиотерапии стафилококковых инфекций // Медицинская микробиология XXI век. Мат-лы Всеросс. науч.-практ. конф. -Саратов, 2004. - С.191-192.

72. Решедько Г.К. Особенности резистентности грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к аминогликозидам в России // Антибиотики и химиотерапия. 2004. - Т.49, №5. - С. 11-23.

73. Руднов В.А. Сепсис: современный взгляд на проблему // Клиническая антимикробная химиотерапия. 2000. - Т.2, №1. - С.4-10.

74. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М. и др. Экспериментальная устойчивость холерного вибриона биотипа Эльтор к налидиксовой кислоте и фторхино-лонам//Антибиотики и химиотерапия. -2000. N9.-C.7 -12.

75. Савельев В.Н., Грижебовский Г.М., Бабенышев Б.В., Курбанов Ш.Х. К вопросу об экстренной профилактике холеры//Пробл.комиссия «Холера и патоген.для челов.вибрионы»-Ростов-на-Дону, 2005.-Вып. 18.-С. 144-147.

76. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1086-02. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. - 85с.

77. Светоч Э.А., Stern N., Ерусланов Б.В. и др. Новое поколение антимикробных препаратов бактериоцины и перспективы их применения // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях

78. Санкт-Петербургского саммита «группы восьми» и санитарная охрана территории государств-участников Содружества независимых государств. Мат-лы науч.-практ. конф. Оболенск, 2006. - С.241-242.

79. Сидоренко С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое значение и методы детекции/ТИнфекции и антимикробная терапия.-2002-Т.4, №6.-С.164-170.

80. Сидоренко С.В. Лекарственные формы фторхинолонов с замедленным вы-свобождением//Антибиотики и химиотерапия.-2004.-Т.49,№12.-С.36-40.

81. Сидоренко С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия // Рус. мед. журн. 1998. - Т.6, №11.- С.717-725.

82. Сидоренко С.В., Кривицкая Н.С. Применение ципрофлоксацина в ступенчатой анти-биотикотерапии //Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Т.47, №7. - С.25-29.

83. Сидоренко С.В., Березин А.Г., Иванов В.В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobakteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. 2004. - Т.49, №3. - С.6-16.

84. Сидоренко С.В., Резван С.П, Макарова РА. Механизмы устойчивости к хинолонам и современный уровень чувствительности клинически значимых микроорганизмов к офлоксацину // Антибиотики и химиотерапия. -1996. Т.41, №9. - С.33-38.

85. Сидоренко С.В., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. 2004. - Т.44. - с.263-306.

86. Сидоренко С.В., Яковлев С.В. Бета-лактамные антибиотики // Рус. мед. журн. -1997. Т.5, №21. - С.1367-1381.

87. Ю9.Сидоренко С.В. Роль хинолонов в антибактериальной терапии. Часть П. Клиническое применение // Рус. мед. журн. 2003. - Т. 11, №18. - С.98-102.

88. Сидоренко С.В. Левофлоксацин сегодня // Антибиотики и химиотерапия. — 2006. Т.51, №1. - С.28-37.

89. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры 0139 серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение //Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002 - №3.- С.23-33.

90. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. и др. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в изменении экспрессии хромосомных генов вирулентности // Мол. генет., микробиол. и вирусол.-1999. -№1.-С.З-9.

91. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А. Эволюция патогенности возбудителя холеры // Матер. VIII Российской науч.-практ. конф. по проблеме «Холера» Ростов-на-Дону, 2003. - С.101-104.

92. Статистические таблицы для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала: Методические рекомендации /Сост. Р.Б. Стрелков. -Обнинск, 1980. 19 с.

93. Страчунский JI.C. (3-лакгамазы расширенного спектра быстро растущая и плохо осознаваемая угроза// Клин.микробиол. и антимшфоб.химиотер. - 2005. - Т.7, №1. - С.2-6.

94. Страчунский JI.C., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии М.: Боргес, 2002. - 384с.

95. Страчунский JI.C., Розенсон O.JI. Ступенчатая терапия: новый подход к применению антибактериальных препаратов// Клиническая фармакология и терапия. 1997. - №6(4). - С.20-24.

96. Турьянов М.Х., Царегородцев А.Д., Петров В.А. и др. Организация медицинских мероприятий по ликвидации крупного очага холеры в Дагестане // Эпи-демиол. и инф. болезни. 1996. - №3. - С.15-17.

97. Фомина И.П. Современные аминогликозиды, значение в инфекционной атологии, особенности действия//Рус. мед. журн. —1997-T.5,№21.-C.l382-1391.

98. Хайтович А.Б. Биологические свойства Vibrio cholerae как составная часть эпи-днадзора за холерой // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001.- №1.-С.5-9.

99. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Шендерович В.А., Горелов АЛ. Динамика изменений антибиотикочувствительности холерных вибрионов Ol, выделенных из объектов окружающей среды // Антибиотики и химиотерапия. -1996. №6. - С.29-33.

100. Хайтович А.Б. Чувствительность к антибиотикам холерных вибрионов Ol, выделенных от людей//Антибиотики и химиотерапия.-1998.-Т.43,№3.-С.14-18.

101. Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А., Пидченко Н.Н. Биологическая характеристика холерных вибрионов 01, циркулирующих в Украине в 2000г.// Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы»- Ростов-на-Дону, 2001.-Вып.14.- С.30-32.

102. Хмель И.А., Метлицкая А.З. Quorum sensing регуляция экспрессии генов — перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий // Молекулярная биология. -2006. -Т.40, №2. С. 195-210.

103. Черномордик А.Б. Применение антибиотиков и других хими-отерапевтических препаратов: Справочник. Киев, 1988. - 320с.

104. Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов // Рус. мед. журн. 1997. - Т.5, №21. - С. 1405-1413.

105. Яковлев В.П., Светухин A.M., Блатун Л.А., Ухин С.А. Современные фтор-хинолоны (ципрофлоксацин, левофлоксацин) в лечении инфекций кожи и мягких тканей//Антибиотики и химиотерапия-2004.-Т.49,№ 8-9-С.57-65.

106. Яковлев С.В. Место фторхинолонов в лечении бактериальных инфекций // Рус. мед. журн. 2003. - Т.11, №8. - С. 434-437.

107. Яковлев В.П. Настоящее и будущее цефалоспорина IV поколения цефепима //Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, №7. - С.3-5.

108. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Изучение цефепима в России //Антибиотики и химиотерапия. 2004. - Т.49, №10. - С.30-33.

109. Ahmed А.М., Shinoda S., Shimamoto Т. A variant type of Vibrio cholerae SXTelement in multidrug-resistant strain of Vibrio flicvialis II FEMS Microbiol. Lett. — 2005. Vol.242, №2. - P.241-247.

110. Aidara A. Grimont P.A., Grimont F et al. Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae isolates from a recent cholera outbreak in Senegal: comparison with isolates from Guinea-Bissau//AmerJ.Trop.Med. Hyg.-1998. -Vol.58, №2.-P. 163-167.

111. Alam A.N., Alam N.H., Ahmed Т., Sack D.A. Randomized double blind trial of single dose doxycycline for treating cholera in adults // Brit.Med.J.-1990.-Vol.300, №6740-P. 1619-1622.

112. Albert M.J., Rahman M., Ansaruzzaman M. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal // J.Clin.Microbiol.-1997.-Vol.35, №10.-P.2588-2592.

113. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. et al. Large outbreak of clinical cholera due to V.cholerae non Ol in Bangladesh//Lancet.-1993.-Vol.341,№8846.-P.704.

114. Amita, Chowdhury S.R., Thungapathra M. et al. Class I integrons and STX elements in ElTor strains isolated before and after 1992 Vibrio cholerae 0139 outbreak, Calcutta, India//Emerg.Infec.Dis 2003- Vol.9, №4. - P. 15018-20.

115. Amyes S.G.B. The succes of plasmid-encoded resistance genes in clinical bacteria. An examination of plasmid-mediated ampicillin and trimethoprim resistance genes and their resistance mechanisms//J.Med.Microbiol.-1989.-Vol.28, №2 P.73-83.

116. Baranwal S., Dey K., Ramamurthy T. et al. Role of active efflux in association with target gene mutations in fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Vibrio cholerae II Antimicrob. Agents and Chemother.-2002.-Vol.46, №8.-P.2676-2678.

117. Barcak G.J., Barchard R.P. Induction of chloramphenicol and tetracycline resistance inFlexibacter sp. strain FS-l//J.Bacteriol.-1985.-№161. -P.810-812.

118. Barza M., Ioannidis J.P.A., Cappelleri J.C., Lau J. Single or multiple daily doses of aminoglycosides: a meta-analysis //Brit. Med. J. 1996. - № 312. - P. 338-345.

119. Basak J., Mukherjee U., Chatterjee S.N. Adaptive response of Vibrio cholerae and Escherichia coli to nitrofurantoin//Environ.Mol.Mutagenes.-1992.-Vol.20,№l.-P.53-60.

120. Baucheron S., Tyler S., Boyd D. et al. AcrAB-TolC directs efflux-mediated multidrug resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium DTI04 // Antimicrob. Agents and Chemother. 2004. - V.48, №10. -P.3729-3735.

121. Beaber J.W., Hochhut В., Waldor M.K. SOS response promotes horizontal dissemination of antibiotic resistance genes//Nature.-2004.-Vol.427, №6969.-P.72-74.

122. Bhattacharya M.K., Bhattacharya S.K., Garg S. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non-01 in India and Bangladesh//Lancet.-1993.-Vol.341, №8856.-P.1346-1347.

123. Bhattacharya M.K., Dutta D., Ramamurthy T. et al. Azithromycin in the treatment of cholera in children // Acta Paediatr. 2003 .-Vol.92, №6. - P.676-678.

124. Bhattacharya S.K., Dutta P., Dutta D. et al. Relative efficacy of trimethoprime -sulfamethoxazole and nalidixic acid for acute invasive diarrhea // Antimicrob. Agents and Chemother. 1987. - Vol.31, №5. - P.837.

125. Bik E.M., Mooi F.R., Gouw R.D., Bunschoten A.E. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis//EMBO J.-1995.-Vol. 14, №2-P.209-216.

126. Bishagratna K. An English translation of the Sushruta Samhita Chavkhamba sanscrit series office. Varanas, India, 1963. - P.352-356.

127. Bougoudogo F., Fournier J.M., Gastellu-Etchegorry M. et al. Resistance de V.cholerae 01 au compose 0/129 et multiresistance aux antibiotigues // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1992. - Vol.85, №12. - P.136-141.

128. Bora D., Sharma R.S., Datta K.K. et al. V.cholerae 01 outbreak in remote villages of Shimla distriot, Himschal Pradesh, 1994//J.Commun.Dis.-1997.-Vol.29rNb2.-P.121-125.

129. Bryan L.E. Two forms of antimicrobial resistance:bacterial persistence and positive functions resistance//!.Antimicrob.Chemother.-1989.-Vol.23,№6.-P.817-823.

130. Burrows W., Musteikis C.M. Cholera infection and toxin in the rabbit ileal loop // J. Infect. Dis. 1966. - Vol. 116, №2. - P. 183-190.

131. Burrus V., Waldor M.K. Formation of SXT tandem arrays and SXT-R391 hybrids//!. Bacteriol. 2004. - Vol.186, №9. - P.2636-2645.

132. Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements //Plasmid. 2006. - Vol.55, №3. - P.173-183.

133. Burrus V., Quezada-Calvillo R., Marrero J., Waldor M.K. SXT-related integrating conjugative element in New World Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. -2006. Vol.72, №4. - P.3054-3057.

134. Calia K., Waldor M.K., Calderwood S. Use of representational difference analysis to identify genomic differences between pathogenic strains of Vibrio cholerae!/Infect. Im-mun. 1998. - Vol.66, №2. - P.849-852.

135. Campos L.C., Zahner V., Avelar K.E. et al. Genetic diversity and antibiotic resistance ofclinical and environmental Vibrio cholerae suggests that many serogroups are reservoirs of resistance/ZEpidemiol Jnfect.-2004.-Vol. 132, №5.-P.985-992.

136. Cavallo J.D., Dubrous P., Talarmin A., Niel L. Antibiotic sensitivity to epidemic strains of Vibrio cholerae and Shigella dysenteriae 1 isolated in Rwandan refugee camps in Zaire // Med.Trop. 1995. - Vol.55, №4. - P.351-353.

137. Chakrabarty A.N., Balganesh T.S., Dastidar S.G., Ganguly M. Transfer of antibiotic resistances from Bacillus spp. To Staphylococcus aureus and Vibrio cholerae // Indian J. Exp. Biol. 1988. - Vol.26, №1. -P.18-21.

138. Chakrabarty M.K., Bhattacharya M.K., Sinha A.K. et al. Evaluation of the efficacy of different antibiotics in inhibiting colonization of Vibrio cholerae Ol in the rabbit intestine//Zbl.Bakt. 1993. -Bd.278, H.l. - S.69-72.

139. Chakraborty S., Deokule J.S., Gard P. et al. Concomitant infectoin of ehterotoxigenic Escherichia coli in an outbreak of cholerae caused by Vibrio cholerae 01 and 0139 in Ah-medabad, India//J.Clin.Microbiol.-2001 .-Vol.39,№9.-P.3241-3246.

140. Chen Y.C., Chuang Y.C., Chang C.C., Jeang C.L., Chang M.C. A K+ uptake protein, TrkA, is required for serum, protamin, and polymyxin В resistance in Vibrio vulnificus!/Infect. Immun. 2004. - Vol.72, №2. - P.629-636.

141. Chhotray G.P. Incidence and molecular analysis of Vibrio cholerae associated with cholera outbreak subsequent to the super cyclone in Orissa, India// Epidemiol. Infect.- 2002.-Vol.128, №2-P.131-138.

142. Chopra I., Raberts M. Tetracycline antibiotics: a mode of action, application, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance//Microbiol.Mol. Biol. Rev — 2001 .-№65 -P.232-260.

143. Colombo M.M., Francisco M., Ferreira B.D. et al. The early stage of the recurrent cholera epidemic in Lianda, Angola//EurJ.Epidemiol.-1993-Vol.9, N5.-P.563-565.

144. Colwell R. R. Global climate and infectious disease: the cholera paradigm// Science. -1996. Vol.274, №5295. - P.2025-2031.

145. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. et al. The capsule and О antigen in Vience.- 1996.-Vol.274, №5295.-Р.2025-2031.

146. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. et al. The capsule and О antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 //Infect.Immun. 1995. - Vol.63, №1. -P.317-323.

147. Cook W.L.,Wachsmuth K., Feeley J., Huq I. The question of classical cholera// Lancet.-1983. Vol.l(8329). - P.879 - 880.

148. Damian M., Koblavi S., Carle I. et al. Molecular characterization of Vibrio cholerae Ol strains isolated in Romania//Res.Microbiol.-1998.-Vol.l49, №10.-P.745-755.

149. De S.N., Chattergee D.N. An experimental study of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane I I J.Pathol. Bacterid.-1953. -Vol.66, №2.- P.559-562.

150. De S.N. Cholera: Its pathology and pathogenesis. London, 1961. - 141 p.

151. De S., Chaudhuri A., Dutta P. et al. Доксициклин при лечении холеры // Бюл. ВОЗ. 1977. - Т.54, №2. - С.730-732.

152. Dette G.A., Knothe Н. In vitro Bewertung von Lomefloxacin// Arzneimittelfor-schung. 1989. - Vol.39, №8. -P.832-835.

153. Dutta D., Nair G.B., Mukhopadhyay A.K. et al. Efficacy of norfloxacin and doxy-cycline for treatment of Vibrio cholerae 0139 infection // J. Antimicrob. Chemother. -1996. Vol.37, №3.-P.575-581.

154. Ehara M., Nguyen B.M., Nguyen D.T. et al. Drug susceptibility and its geneticbasis in epidemic Vibrio cholerae 01 in Vietnam//Epidemiol. Infect. 2004. - Vol.132, №4. - P.595-600.

155. Falbo V., Carattoli A., Tosini F. et al. Antibiotic resistance conferred by a con-jugative plasmid and a class I integron in Vibrio cholerae 01 El Tor strains isolated in Albania and Italy//Antimicrob.Agents and Chemother-1999.-Vol.43, №3.-P.693-696.

156. Faruque S.M., Alim A.R. M.A., Rahman M.M. et al. Clonal relationships among classical Vibrio cholerae 01 strains isolated between 1961 and 1992 in Bangladesh // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31, №9. -P.2513-2516.

157. Faruque S.M., Alim A.R. M.A., Roy S.K. et al. Molecular analysis of rRNA and cholera toxin genes carried by the new epidemic strain of toxigenic Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal//J.Clin.Microbiol.-1994.-Vol.32, №4.-P. 1050-1053.

158. Faruque S.M., Chowdhury N., Kamruzzaman M. et al. Reemergence of epidemic Vibrio cholerae 0139, Bangladesh // Emerg.Infect.Dis.-2003.-Vol.9, №9.-P.l 116-1122.

159. Faruque S.M., Sack D.A., Sack R.B. et al. Emergence and evolution of Vibrio cholerae 0139//Proc.Nat.Acad.Sci. USA.-2003.-Vol.100, №3.-P.1304-1309.

160. Faruque S.M., Siddique A.K., Saha M.N. et al. Molecular characterization of a new ribotype of Vibrio cholerae 0139 Bengal associated with an outbreak of cholera in Bangladesch//J. Clin. Microbiol. 1999.-Vol.37, №5.-P.1313-1318.

161. Felsenfeld O. Review of recent trends in research and control of cholera. WHO /Geneva, 1965.-P. 1-73.

162. Ferreira E., Costa M., Vaz Pato M.V. Resistance aux antibiotiques de souches de Vibrio cholerae isolates en Angola//Pathol.Biol.-1992.-Vol.40, №5.-P.561-565.

163. Finch M.J., Morris J.G., Kaviti J. et al. Epidemiology of antimicrobial resistant cholera in Kenya and east Africa //Amer.J.Trop.Med.Hyg.-1988.-Vol.39, №5.-P.484-490.

164. Fisher-Hoch S.P., KJhan A., Inam-ul-Haq et al. Vibrio cholerae 0139 in Karachi, Pakistan // Lancet. 1993. - Vol.342, №8884. - P. 1422-1423.

165. Folgosa E., Mastrandrea S., Cappuccinelli P. et al. Molecular identification of pathogenicity genes and ERIC types in Vibrio cholerae Ol epidemic strains from Mozambique // Epidemiol.Infect. 2001. - Vol.127, №1. - P. 17-25.

166. Francis T.I., Lewis E.A., Oyediran A.B. et al. Effect of chemothertapy on the duration of diarrhoea, and on vibrio excretion by cholera pastients // J. Trop. Med. Hyg. -1971. -№74. P.172-176.

167. Gabastou J.M., Pesantes C., Escalante S. et al. Characteristics of the cholera epidemic of 1998 in Ecuador during El Nino//Rev.Panam.Salud Publica. 2002. - Vol.12, №3.-P. 157-164.

168. Garfield E. Mapping cholera research and the impact of Shambu Nath De of Calcutta//Curr.Cont. 1986. - Vol.29, №14. -P.3-11.

169. Garg P., Chakraborty S., Basu I. et al. Expanding multiple antibiotic risistance among clinical strains of Vibrio cholerae isolated from 1992-7 in Calcutta, India // Epidemiol. Infect. 2000. - Vol.124, №3. - P.393-399.

170. Garrigue G.P. et al. Resistance aux antibiotiques des souches de Vibrio cholerae eltor isolees a Douala (Cameroun)//Bull.Soc.pathol.exot.-1986.-Vol.79, №3.-P.305-312.

171. Ghosh S., Sengupta P.G., Gupta D.N., Sirkar B.K. Chemoprophylaxis studies in cholera: A review of selective works // J. Commun. Dis. 1992 .- Vol.24, №1 -P.55-57.

172. Gilbert D ., Moellering R., Sande M. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy //Antimicrob. Therapy, Inc., 1999. - 141 p.

173. Goldstein F., Gerbaud G., Courvalin F. Transposable resistance to trimethoprim and 0/129 in Vibrio cholerae //J. Antimicrob. Chemother- 1986. Vol.17, №5-P.556-569.

174. Gootz T.D., Briqhty K.E. Fluoroquinolone antibacterials: SAR, mechanism of action, resistance, and clinical aspects//Med.Res. 1996. - Vol.16. - P.433-486.

175. Gould I.M. Determinants of response to antibiotic therapy // J. Chemother.1998. Vol. 10, № 5. - P. 347 - 353.

176. Gould J.M., Wise R. Third generation cephalosporins// Brit .Med. J.-1985. -Vol.290, №6472.-P.878-879.

177. Grados P., Battilana C., Bravo N. Comparative effectiveness of co-trimoxazole and tetracycline in the treatment of cholera// Bull. Pan. Am. Health Organ. 1996. -Vol.30, №l.-P.36-42.

178. Haider K., Hug M.I. A transferable resistance plasmid in Vibrio cholerae and Escherichia coli isolated from the same patient // J.Diarrhoeal Dis.Res. 1986. - Vol.4, №2. -P.91-93.

179. Haldar S., Bhattacharyya A., Basu A., Chakravarty K. Amino acid transport system in normal and nitrofurantoin resistant Vibrio e/tor//Indian J.Microbiol. 1984. -Vol.24, №3-4. - P.259-263.

180. Hawkey P.M. Mechanisms of quinolone action and microbial response//J. Antimicrob. Chemother. 2003. - Vol.51, №1. - P.29-35.

181. Heddle J., Maxwell A. Quiriolone-binding pocket og DNA gyrase: role of Gyr В // Antimicrob.Agents and Chemother. 2002. - Vol.46 - P.1805-1815.

182. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio c/w/erae//Nature.-2000.-Vol.406,№6795-P.477-483.

183. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections // J. Clin. Invest. 2003. - Vol.112, №9 - P.l 300-1307.

184. Highlights of 1997 // Glimpse. 1998. -Vol.20, №2. -P.8.

185. Hirata Т., Saito A., Nishino K. et al. Effects of efflux transporter genes on susceptibility of Escherichia coli to tigecycline (gar-936) // Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 2004. - Vol.48, №6. - P.2179-2184.

186. Hirschhorn N., Pierce N., Kobari K., Carpenter Ch. The treatment of cholera// Cholera / Eds.D.Barua, W.Burrows Philadelphia, 1974 - Ch.12. - P.235-252.

187. Hochhut В., Waldor M.K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC// Mol. Microbiol. 1999.- Vol.32, №1. - P.99-110.

188. Hofer E.,QuintaesB.R., dos Reis E.M. et al. Emergencia da multipla resistencia a antimicrobianos em Vibrio cholerae isolados de pacientes com gastroenterite no Ceara, Brasil // Rev.Soc.Bras.Med.Trop. 1999. - Vol.32, №2. - P. 151-156.

189. Hossain M.S., Salam M.A., Rabbani G.H. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal: a descriptive study// J.Health Popul. Nutr. 2000. - Vol. 18, №1.- P.27-32.

190. Huang J., O'Tolle P.W., Shen W. et al. Novel Chromosomally rncoded multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus //Antimicrob. Agents and Chemother. 2004. - Vol.48, №3. - P.909-917.

191. Islam M.R. Single dose tetracycline in cholera // Gut. 1987.-Vol.28, №8. -P. 1029-1032.

192. Iwanaga M., Toma C., Miyazato T. et al. Antibiotic resistance conferred by a class I integron and< SXT constin in Vibrio cholerae Ol strains isolated in Laos//Antimicrob. Agents and Chemother. 2004. - Vol.48, №7. - P.2364-2369.

193. Jesudason M.V., Saaya R. Resistance of Vibrio cholerae 01 to nalidixic • acid//Indian.J.Med.Res.-1997. -Vol. 105.-P. 153-154.

194. Kabir I., Alam A.N., Mitra A.K. et al. Erythromycin and trimethoprim sul-phamethxazole in the treatment of cholera in children // J. DiarrKoeal. Dis. Res. -1996. -Vol.14, №4.-P. 243-247.

195. Kam K.M., Luey C.K., Tsang Y.M. et al. Molecular subtyping of Vibrio cholerae Ol and 0139 by pulsed-field gel electrophoresis in Hong Kong: correlation with epidemiological events from 1994 to 2002//J.Clin.Microbiol. -2003. Vol.41, №10. - P.4502-4511.

196. Kanoh Т., Yokota Т., Yamamoto Т., Kuwahara S. Two conjugative R plasmids obtained from Vibrio (biotype eltor) isolated in Nigeria/ZProc.of the 14th Joint Conf., US-Japan Cooperative Medical Science Program, cholera Panel. Tokyo, 1979. -P.200-206.

197. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Reives P.R. Comparison- of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth and seventh pandemic strains// Infect. Immun. 2001. — Vol.69, N3.-P.1947-1952.

198. Karchmer A.W., Curlin G.T., Hug M.I., Hirschorn N. Лечение холеры у детей фуразолидоном//Бюл.ВОЗ. 1971. - Т.43, №3. - С.400-406.

199. Krishna B.V., Patil А.В., Chandraseklar M.R. Fluoroquinolone-resistant Vibrio cholerae isolated during a cholera outbreak in India // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2006. - Vol. 100, №3. - P.224-226.

200. Kuwahara S., Yokota Т., Kanoh T. Recent trend of drug-resistance plasmids (R) in Vibrio cholerae //Proc. of the 15th Joint Conf. US Japan Cooperative Medical Science Program, cholera Panel. - Bethesda, 1980. - P. 237-241.

201. Lalitha M.K., Nisha A.K., Bhattacharya S.S. et al. Susceptibility pattern of bacterial isolates to lomefloxacin/Andian J.Med.Res. -I990.-Vol.91.-P.l82-184.

202. LesmanaM., Subekti D., Simanjuntak C.H. et al. Vibrioparahaemolyticus associated with cholera-like diarrhea among patients in North Jakarta, Indonesia // Di-agn.Microbiol.Infect.Dis. 2001. - Vol.39, №2. - P.71-75.

203. Levy S.B. Evolution and spread of tetracyclin resistance determinants// J.Antimicrob.Chemother. 1989. - Vol.24, №1. - P. 1-7.

204. Lewis J.S., Jorgensen J.H. Inducible clindamycin resistance in Staphylococci: Should Clinicians and Microbiologists be concerned? // Clin. Infect. Dis.-2005 — Vol.40.-P.280-285.

205. Li M., Shimada Т., Morris J.G. et al. Evidence for the emergence of non-Ol and non-0139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions // Infect.Immun.-2002.-Vol.70, №5-P.2441-2453.

206. Li X.Z., Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria//Drug.-2004-Vol.64, №2.-P. 159-204.

207. Li X.Z., Zhang Li, Nikaido H. Efflux pomp-mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis II Antimicrob. Agents and Chemother. 2004—Vol.48, №7.-P.2415-2423.

208. Li X.Z.Quinolone resistance in bacteria: emphasis on plasmid-mediated mechanisms // International J. Antimicrob. Agents 2005. - Vol.25. - P.453-463.

209. Lontie M. Les nouvelles quinolones//J.Pharm.Belg.-1989.-Vol.44,№4.-P.292-301.

210. Mac Donald D., Demarre G., Bouvier M. et al. Structural basis for broad DNA-specificity in integron recombination //Nature. 2006. - Vol.440, №88. - P.l 157-1162.

211. Maggi P., Pastore G., Sforza E. Epidemioligical clinical and therapeutic evalution of the Italian cholera epidemic in 1994//Eur. J.Epidemiol. 1997.-Vol.l3,№l.-P.95-97.

212. Mahalanabis D., Faruque A.S.G. Albert M.J. et al. An epidemic of cholera due to Vibrio cholerae 0139 in Dhaka, Bangladesh: clinical and epidemiological features // Epidemiol.Infect. -1994.-Vol.112, №3. P.463-473.

213. Maimone F., Cappo A., Pazzani C. et al. Clonal spread of multiply resistant straingof Vibrio cholerae 01 in Somali//S.Infect.Dic-1986.-Vol.153, №4.-P.802-803.

214. Marsh T.D. The cephalosporin antibiotic agents III. Third generation cephalosporins // Infect. Contr. - 1985. - Vol.6, №2. - P.78-83.

215. Martinez- Martinez L., Pascual A., Jacoby G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid // Lancet. 1998. - №351. - P.797-799.

216. Materu S.F., Lema O.E., Mukunza H.M. et al. Antibiotic resistance pattern of Vibrio cholerae and Shigella causing diarrhoea outbreaks in the eastern Africa region: 1994-1996 see comments.//East Afr.Med.J.-1997.-Vol.74,№3.-P.193-197.

217. Matsushita S., Ohta K., Tsuno M. et al. Antibiotic resistance of Vibrio cholerae recently isolated from human sources in Japan and other countries//Adv. Res. On cholera and related diarrheas: Proc. 18th joint conf. on cholera-Tokyo, 1985.-P.173-178.

218. Mayer K.H. Review of epidemic aminoglycoside resistance worldwide // Amer. J. Med. 1986. - Vol.80, №6B. - P.56-64.

219. Mekalanos J.J., Rubin E.U., Waldor M.K. Cholera: Molecular basis for emergence and pathogenesis//FEMS Immunol.Med.Microbiol.-1997.-Vol.18.-P.241-248.

220. Memon I.A., Murtaza G. Drug sensitivity pattern of cholera in children// J.Pak.Med.Assoc. -2002.- Vol.52, №8.- P.347-348.

221. Mizunaga S., Kamiyama Т., Fukuda Y. et al. Influence of inoculum, size of Staphilococcus aureus and Pseadomonas aeruginosa on in vitro activities and in vivo efficacy of fluorqinolones and carbapenems //J. Antimicrob. Chemother. 2005. -Vol.56-P.91-96.

222. Mooi F.R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol.- 1997.-Vol.5, №4.-P.161-165.

223. Moolasart P.Eampokalap В., Supaswadikul S. Canparison of the efficacy of tetracycline and norfloxacin in the treatment of acute severe watery diarrhea// Southeast Asian J.Trop.Med.Publ,Health. 1998.- Vol.29, №1.- P.108-111.

224. Mukherjee U., Bhattacharya R., Chatterjee S.N. Effects of nitrofurantoin on viability, DNA synthesis and morphology of Vibrio cholerae cells//Indian J.Esp.Biol. -1993. Vol.31, №10. - P.808-812.

225. Munshi М.Н., Sack D.A., Haider К. et al. Plasmid-mediated resistance to nalidixic acid in Shigella dysenteriae type I // Lancet. 1987. - №8556. - P.419-421.

226. Mwansa J.C.L., Mwaba J., Lukwesa C. et al. Multiply antibiotic-resistant Vibrio cholerae Ol biotype El Tor strains emerge during cholera outbreaks in Zambia // Epidemiol. Infect. 2006. - P. 1-7.

227. Naidoo A., Patric K.J. Cholera: A continuous epidemic in Africa // Roy. Soc. Pro-mot. Health. 2002. - Vol.122, №2. - P.89-94.

228. Nelson J.D., McCracken G.H. MRSA in Dallas // Pediatr. Infect. Dis. J. 2004. -Vol.23, №12.-P.12-13.

229. New H.C. Pathophysiologic basis for the use of third-generation cephalosporins // Amer. J. Med. 1990. - Vol.88, №4A. -P.3-12.

230. Nguen Van J.C., Goldstein F.W. Low-level resistance to fluoroquinolones among Salmonella and Shigella II Clin.Microbiol.Infect.-2000.-Vol.6.-P.231.

231. Nijssen S., Florijn A., Top J. et al. Unnoticed spread of integron carrying En-terobacteriacae in intensive care units// Clin.Infect.Dis. - 2005. - Vol.41. -P. 10-11.

232. Opal S.M., Medeiros A.A. Molecular mechanisms of antibiotic resistance in bacteria. In: Mandell G.L., Bennet J.E., Dolin R., editors. Principles and Practice of Infectious Diseases. 6th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2004. -P.253-70.

233. O'Ryan M., Prado V., Pickering L.K. A millenium update on pediatric diarrheal illness in the developing world // Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2005. - Vol.16, №2. - P.125-136.

234. Ouelette M., Gerbaud G., Courvalin P. Genetic, biochemical and molecular characterization of strains of Vibrio cholera multiresistant to antibiotics // Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. -1988. Vol.139, №1. - P.105-114.

235. Paget J.E., Barnes Y.M. Toxicity tests // Evaluation of drug activities phar-macometric. London, 1964. - Vol. 1. - P. 135-167.

236. Pallet A.P., Smyth E.G. Clinicians guide to antibiotics. Tetracycline // Brit. J. Hosp. Med. 1988. - Vol.40, №5. - P.385-390.

237. Parveen S., Farrah S.R., Gonzalez-Bonilla C. et al. Caracterization of a clinical Vibrio cholerae 0139 isolate from Mexico // Can. J. Microbiol. 2003.-Vol.49, №l.-P.65-70.

238. Petroni A., Corso A., Melano R. et al. Plasmidic extended-spectrum beta-lactamases in Vibrio cholerae Ol ElTor isolates in Argentina // Antimicrob. Ag.

239. Chemother. 2002. - Vol.46, №5.- P.1462-1468.

240. Phantouamath В., Sithivong N., Sisavath L. et al. Transition of drug suscepti-bilbties of Vibrio cholerae Ol in Lao people's Democratic Republic// Southeast Asian J.Trop.Med.Publ.Heath.- 2001.- Vol.32, №1,- P.95-99.

241. Phillips J., King A., Shannon K. Prevalence and mechanisms of aminoglycide resistance. A ten-year study//Amer. J. Med.-1986.- Vol.80, №>6B.-P.38-55.

242. Phukan A.C., Borah P.K., Biswas D., Mahanta J. A cholera epidemic in a rural area of northeast India//Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.-2004.-Vol.98,№9.-P.563-566.

243. Pierce N.F., Banwell J.G., Mitra R.C. et al. Controlled comparison of tetracycline and furazolidone in cholera//Brit.Med.J.-1968.-№5613.-P.277-280.

244. Piddock L .J.V., Wise R. Mechanisms of resistance to quinolones and clinical perspectives //J.Antimicrob.Chemother- 1989,- Vol.23, №4. -P.475-483.

245. Pollitzer R. Cholera. Ch. 9. Symptomatology, diagnosis,prognosis and treatment // WHO, Geneva. 1959. - P.66-781.

246. Prescott L.M., Datta A., Datta G. C. Patterns of in vitro sensitivity in Calcutta strains of Vibrio cholerae!/Bell. WHO. -1968.-Vol.39, №6. P. 967-970.

247. Prieur D. Actualite des Sephalosporines//Concours med.-1982.-Vol.104, №l/2.-P.65-72.

248. Qu M., Xu J., Ding Y. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 0139 in China: polymorphism of ribotypes and CTX elements // J.Clin.Microbiol. 2003. -Vol.41, №6. -P.2306-2310.

249. Rabbani G.H., Butler Т., Shahrier M. et al. Efficacy of a single dose of furazolidone for treatment of cholera in children // Antimicrob. Agents and Chemother. 1991. - Vol.35, №9. - P.1864-1867.

250. Rabbani G.H., Islam M.R., Butler T. et al. Single-dose treatment of cholera with furazolidone or tetracycline in a double-blind randomized trial // Antimicrob. Agents and Chemother. 1989. - Vol.33, №9. -P.1447-1456.

251. Rahal K. Comparative activities in vitro of 4 quinolones (nalidixic acid, peflox-acin, norfloxacin, ofloxacin) on 13 bacterial species // Arch. Inst. Pasteur. Algerie. -1992.- Vol.58. -P.41-84.

252. Ramamurthy Т., Gard S., Sharma R. et al. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India//Lancet.-1993.-Vol.341, №8846.-P.703-704.

253. Rolinson G.N. Beta-lactamase induction and resistance to beta-lactam antibiotics //J.Antimicrob.Chemother. 1989. - Vol.23, №1. - P. 1-2.

254. Ronald A.R., Turek M., Petersdorf R.Y. A critical evalution of nalidixic acid in urinarytract infections //New Eng. J. Med. 1986. - Vol.275. -P.l81.

255. Rosenstiel N., Adam D. Quinolone antibacterials. An Update of their pharmacology and therapeutic use // Drugs. 1994. - Vol.47. - P.872-902.

256. Rowe-Magnus P.A., Guerout A.M., Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruit-mend of super-integron gene cassettes // Mol. Microbiol. 2002. - Vol.43, №6-P. 1657-1669.

257. Roy S.K., Islam A., Ali R. et al. A randomized clinical trial to compare the efficacy of erythromycin, ampicillin and tetracycline for the treatment of cholera in children // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1998.-Vol.92, №4.- P.460-462.

258. Ruiz J. Mechanisms of resistance to quinolones: target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection // J. Antimicrob. Chemother. 2003. - Vol.51. - P. 1109.

259. Saha D., Khan W.A., Karim M.M. et al. Single-dose ciprofloxacin versus 12-dose erythromycin for childhood cholera: a randomized controlled trial // Lancet. 2005. -Vol.366, №9491. - P. 1085-1093.

260. Scrascia M., Forcillo M., Maimone F., Pazzani C. Succeptibility to rifaximin of Vibrio cholerae strains from different geographical areas//J.Antimicrob. Chemother. -2003.-Vol.52, №2. P.303-305.

261. Segreti J., Goodman L.G., Nelson J. et al. Comparative in vitro activity of te-mafloxacin and difloxacin against bacterial enteric pathogens // Rev. Infect. Dis. -1989.-Vol.11, Suppl.5. P. 13 80-1381.

262. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et al. Molecular analysis of of Vibrio cholerae 01, 0139, поп-Ol, and non-0\2>9 strains: Clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol.67, №2.-P.910-921.

263. Singh J., Sachdeva V., Bhatia R. et al. Endemic cholera in Delhi, 1995: analysis of data from a sentinel centre//J.Diarrh.Dis.Res.-l 998-Vol. 16,№2.-P.66-73.

264. Sinha S., Chakraborty R., De K. et al. Escalating association of Vibrio cholerae outbreaks in India//J. Clin. Microbiol. 2002.-Vol.40, №7.-P.263 5-2637.

265. Smith C.A., Baker E.N. Aminoglycoside antibiotic resistance by enzymatic deactivation //Curr.Drug Targets Infect.Disord. -2002.-Vol.2, №2.-P.143-160.

266. Soler Bisture A.J., Martin F.A., Petroni A. et al. Vibrio cholerae InVl 17, a class 1 integron harboring aac (6")-Ib and blaCTX-M-2, is linked to transposition genes // An-timicrob. Agents and Chemother.-2006.-Vol.50,№5. -P. 1903-1907.

267. Sow A.I., Komo A., Dia N.M. et al. Bacterial diversityduring the cholera epidemic in Dakar, Senegal ( 1995-1996) //Bull. Soc. Pathol. Exot. 1997. - Vol.90, №3. - P.160-161.

268. Stahlmann R., Kemmerich В., Lode H. Fluoroquinolone. 1. Chrmische Struktur, Wirkungs-mechanismus und antibacterielle Aktivitat // Dtsch. Med. Wschr. 1988. -Bd.113, H.16. - S.648-651.

269. Statement 1996 CA SFM. Zone sizes and MIC breakpoints for non-fastidious organisms // Clin. Microbiol. Infect.- 1996.-Vol.2, №1. - P.46-49.

270. Stefani S., Agodi A. Molecular epidemailogy of antibiotic resistance // International J. Antimicrob. Agents 2000. - Vol.13, №3. - P. 143-153.

271. Steinberg E.B., Greene K.D., Ворр C.H. et al. Cholera in the United States, 1995-2000: trends at the end of the twentieth centuiy// J.Infect. Dis. 2000.- Vol.184, №6.- P.799-802.

272. Stpeher U. H., Jedani K.E., Manning P.A. Genetic organization of the regions associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae Ol, 0139 and Vibrio anguillarwn Ol and 02: a review// Gene.-1998.-Vol.223,№l-2.-P.269-282.

273. Sur D., Sengupta P.G., Mondal S.K. et al. A localised outbreak of Vibrio cholerae 0139 in Kolkata, West Bengal/Indian J.Med.Res.-2002.-Vol.l 15, Apr.-P.149-159.

274. Swerdlow D.L., Ries A.R. Vibrio cholerae non-Ol the eighth pandemic?// Lancet. —1993. - Vol. 342, №8868. -P.382-383.

275. Tanabe K., Nakamura S., Kunii O. Bacteriological survey of diarrheal epidemics inthe 1998 Bangladesh floods // Kansenshogaku Zasshi. 1999. - Vol.73, №9. - P.918-922.

276. TanejaN., Mohan В., Khurana S., Sharma M. Antimicrobial resistance in selected bacterial enteropathogens in north India//Indian J.Med.Res.-2004.-Vol.120, №1. P.39-43.

277. Threlfall E.I., Said В., Rowe B. Emergence of multiple drug resistance in Vibrio cholerae Ol El Tor from Ecuador/ZLancet. 1993. - №8880. - P.l 173.

278. Vandepitte J. La prevention et le traitement de la diarrhee des voya-geurs//Rev.med.Liege.-1988.-Vol.43, №3.-P.93-97.

279. Verghese S.I. A protracted outbreak of cholera at Porur a suburb of Madras City // J. Commun. Dis. - 1993. - Vol.25, №4. - P.207-209.

280. Vijayalakshmi N., Badrinath S., Rao R.S. Minimum inhibitory concentration (MIC) of some antibiotics against Vibrio cholerae 0139 isolates from Pondi-cherry//Epidem. Infect. 1997. - Vol.119, №1. - P.25-28.

281. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-Ol strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera// InfectJmmun. 1994. — Vol.62, №l.-P.72-78.

282. Walther-Rasmussen J., Hoiby N. Cefotaximases (CTX-M-ases), an expanding family of extended-spectrum beta-lactamases//Can. J. Microbiol. 2004. - Vol.50, №3. - P.137-165.

283. Wang M., Tran J.H., Jacoby G.A. et al. Plasmid mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai, China // Antimicrob. Agents and Chemother. - 2003. - Vol.47, №7. - P.2242-2248.

284. Weekly Epidemiological Record. Cholera in 1992// WHO, Geneva. 1993. -Vol.68, №21.-P.149-155.

285. Weekly Epidemiological Record. Cholera in 1993. Part II // WHO, Geneva. -1994. Vol.69, №29. - P.213-216.

286. Weekly Epidemiological Record. // WHO, Geneva. 2001. - Vol.76, №1-52.

287. Weekly Epidemiological Record. Cholera, 2001//WHO,Geneva.-2002.-Vol.77, №31. P.253-260.

288. Weekly Epidemiological Record. Implementing integrated disease surveillance and response // WHO, Geneva. 2003. - Vol.78, №27. - P.232-240.

289. Weekly Epidemiological Record. Cholera, 2003//WHO,Geneva.-2004.-Vol.79, №31.-P.281-288.

290. Weekly Epidemiological Record. Cholera, 2004//WH03Geneva.-2005.-Vol.80, №31. P.261-268.

291. Weekly Epidemiological Record. Cholera, Southern Sudan/AVHO, Geneva. -2006.-Vol.81, №10.-P.89.

292. West P.A. The human pathogenic vibrios. A. public health update with environmental perspectives // Epidemiol. Infect. - 1989. - Vol.103. - P.1-34.

293. WHO/CDC/CSR/EDC/1999. Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera. Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia. - 1999. - P.61-74.

294. WHO/CDC/CSR/DRS/2001.2. Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance. WHO, Geneva, 2001.

295. Wiedemann В., Heisig P. Mechanisms of quinolone resistance // Infection. 1994. -Vol.22, №2.-P.73-79.

296. Wolley R.C., Vediyappan G., Anderson M. et al. Characterization of the Vibrio cholera VCE CAB multiple-drug resistance efflux operon in Escherichia coli II J. Bacteriol. -2005. Vol.187, №15. -P.5500-5503.

297. Yamamoto Т., Nair G.B., Albert M.J. et al. Survey of in vitro susceptibilities of Vibrio cholerae Ol and 0139 to antimicrobial agents//Antimicrob. Agents and Chemother. 1995. - Vol.39, №1. -P.241-244.

298. Yilmaz Coban A., Ekinci В., Durupinar B. A multidrug efflux pump inhibitor reduced fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeroginosa isolated // Chemotherapy. 2004. - Vol.50, №1. - P.22-26.

299. Young H.K., Amyes S.G.B. Plasmid trimethoprim reristance in Vibrio cholerae: migration of the type I dihydrofolate reductase gene out of the Enterobacteriaceae // J.Antimicrob.Chemother. 1986. - Vol.17, №6. - P.697-703.

300. Yuen Kwok-yung, Yam Wing-choeong, Wong S. Sai-yin et al. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal in Hong Kong // Clin. Infect. Dis. 1994. - Vol. 19, №3. - P.312-321.

301. Zhanel G.G., Hoban D.J., Schurek K., Karlowsky J.A. Role of efflux mechanisms on fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa // International J. Antimicrob. Agents. 2004. - Vol.24. - P.529-535.