Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры

Шутько, Анжела Георгиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры"

На правах рукописи

РГб 01

ШУТЬКО АНЖЕЛА ГЕОРГИЕВНА J ^ Д£Ц дорч

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПОДХОДОВ К ЫБОРУ СРЕДСТВ ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ

ХОЛЕРЫ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕ PAT

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2000 г.

Работа выполнена в Ростовском-ка-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Рыжко И.В.

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Самойлова Л.В. доктор медицинских наук

Шульднков А.А.

Ведущая организация:

Саратовский медицинский университет

Защита состоится « 5 » декабря 2000 г. на заседании диссертационного совета Д0743201 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г. Саратов, Университетская ул., 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института

"Микроб"

Автореферат разослан « 3 » ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Г. А. Корнеев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Анализ современного состояния развития седьмой пандемии холеры (Москвитина Э.А., 1998; Ломов Ю.М. и др., 1999 и др.), сведения о вспышках холеры в различных регионах в 1998т 99гг. (Wkly Epidemiol. Rec., 1999), сообщения о регистрации 15652 случаев холеры в мире только за несколько месяцев 2000 г. (Ломов Ю.М. и др., 2000) делают прогноз на дальнейшие годы весьма неутешительным. Постоянные заносы холеры на территорию России и в страны Содружества (Кологоров А.И. и др., 1998; Голубинский Е.П. и др., 2000; Хайтович А.Б., 2000 и др.) требуют постоянной готовности медслужбы страны к возникновению очагов этой инфекции. В.И. Покровский и Б.Л. Черкасский (1999) подчеркивают, что в настоящее время обостряется проблема борьбы с инфекциями в связи с изменением биологических свойств микроорганизмов, включая широкое распространение антибиотикоустойчивости. Это в полной мере относится и к возбудителю холеры, в связи, с чем вопросы, связанные с профилактикой и лечением холеры, постоянно сохраняют свою актуальность.

Признано, что полноценная патогенетическая терапия холеры может обеспечивать клиническое выздоровление больных даже без применения средств этиотропной терапии, но она не гарантирует освобождения макроорганизма от возбудителя и не препятствует формированию вибриононоси-тельства. Использование в лечении холеры антибактериальных препаратов способствует уменьшению объема теряемой жидкости, сокращению сроков диареи, вибрионовыделения, общей продолжительности клинических симптомов инфекции (Покровский В.И. и др., 1988).

Однако с началом этиотропной терапии инфекции начали появляться сообщения о выделении от людей антибиотикоустойчивых вариантов возбудителя. Уже в 1965 году среди штаммов холерного вибриона S. Kuwahara et al. (1967) обнаружили изоляты, устойчивые к тетрациклину, хлорамфенико-лу, эритромицину, стрептомицину, канамицину и ампициллину. Множест-веннорезистентные штаммы выделялись (до 6 %) в период 1962-1967 гг. в Калькутте (Prescott L.M. et al., 1968). К этому времени стало очевидным, что в формировании полиантибиотикорезистентности у холерного вибриона ведущая роль принадлежит R-плазмидам. Было доказано, что R-плазмиды, детерминирующие мультирезистентность, принадлежат к inc С группе несовместимости (Kanoh Т. et al., 1979; Kuwahara S. et al., 1980; Finch MJ. et al., 1988 и др.). До 1977 г. частота встречаемости множественноустойчивых штаммов холерного вибриона оставалась довольно низкой.

С конца 80-х и начала 90-х годов резко возрастает число сообщений о выделении множественноустойчивых штаммов Vibrio cholerae 01 в различных регионах мира (Ramamurthy Т. et al., 1992; Materu S.F. et al., 1997; Falbo V.etal., 1999 и др.).

О выделении полирезистентных штаммов холерного вибриона от.людей на территории бывшего СССР во время вспышки холеры в г.Одессе в 1970 г. впервые сообщила З.В. Ермольева с соавт. (1971) и в Нижнем Поволжье в 1970-71 гг. — С.Л. Бородько (1972). Повсеместное появление множест-веннорезистентных штаммов холерного вибриона можно отнести к 90-м го-

дам (Подосинникова JI.C. и др., 1995; Савельев В.П. и др., 1999). Серьезные эпидосложнения, связанные с резким снижением эффективности тетрациклина, левомицетина, а также доксициклина и фуразолидона, наблюдали во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994г. (Ломов Ю.М. и др., 1994; Савельев В.Н. и др., 1994; 1995; 2000; Карбышев Г.Л. и др., 1995; Турьянов М.Х. и др., 1996 и др.). Неоднократные завозы инфекции с выделением полирезистентных штаммов возбудителя имели место в:России и в последующие годы.

Вышеизложенное вызывает настоятельную необходимость:

1) усиления эпидемиологического надзора за чувствительностью/устойчивостью выделяемых от людей и из объектов окружающей среды эпидзначимых штаммов холерного вибриона с максимально возможной стандартизацией методов оценки;

2) обязательного изучения корреляции между, значениями минимальных подавляющих концентраций препаратов (МПК) в отношении возбудителя и эффективностью этиотропной терапии данной нозологической формы заболевания;

3) расширения набора средств этиотропной терапии холеры с серьезным экспериментальным обоснованием перспективности их клинического применения не только на основе определения чувствительности возбудителя in vitro, но и на модели экспериментальной инфекции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Сравнительное изучение активности антибактериальных препаратов разных групп in vitro и in vivo в отношении Vibric cholerae eltor, чувствительных и устойчивых (природных и экспериментальных) к действию этиотропных агентов, и оптимизация подходов к определению антибиотикограммы эпидзначимых штаммов возбудителя холеры.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) показать, что модель генерализованной формы инфекции у белых мышей, вызванной антибиотикочувствительным vct+ tcp+ штаммом V. cholerae eltor Р-5879 (выделен от больного в 1972г.), является достаточно адекватной для оценки терапевтической активности антибактериальных препаратов при холере;

2) изучить антибиотикограммы штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных в Дагестане в 1994 и 1998 гг., с использованием стандартной среды Мюллера-Хинтона и Критериев оценки чувствительности/устойчивости для неприхотливых бактерий Международного Европейского общества микробиологов и инфекционистов (Statement 1996 CA-SFM);

3) создать коллекцию природных множественноустойчивых штаммоЕ холерного вибриона и экспериментально полученных вариантов штаммг V.cholerae eltor Р-5879 с плазмидной устойчивостью к антибиотикам, а также мутантов, резистентных к рифампицину (Rif), налидиксовой кислоте (Nalr) фторхинолонам;

4) изучить корреляцию между значениями минимальных подавляющи)

концентраций антибактериальных препаратов in vitro и их активностью в экспериментах in vivo с использованием коллекции штаммов холерного вибриона с разным фенотипом;

5) оценить возможные последствия Nal1" мутации у природного множе-ственнорезистентного штамма V. cholerae eltor Р-17385 (Дагестан, 1994 г.) для эффективности/неэффективности этиотропной терапии в экспериментах на белых мышах;

6) разработать подходы к повышению достоверности результатов определения антибиотикограммы возбудителя не только для оптимизации выбора эффективного средства этиотропной терапии холеры, но и для использования как значимого эпидемиологического маркера штаммов, выделяемых, в очаге инфекции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Впервые дана сравнительная оценка активности 25 антибактериальных препаратов различных групп в экспериментах in vitro и их эффективности на модели генерализованной инфекции у белых мышей. Установлена корреляция между чувствительностью штамма V. cholerae eltor Р-5879 vct+ tcp+ (выделен от больного в 1972 г.) к тетрациклинам, левомицетину, фуразолидону, триметоприму/сульфаметоксазолу, аминогликозидам, рифампицину, цефо-таксиму, цефчрчаксону, налидиксовой кислоте, фторхинолонам (ципрофлок-сацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину, ломефлоксацину) и их высокой эффективностью при экспериментальной генерализованной форме холеры у белых мышей, что соответствует наблюдениям в клинике. Модель генерализованной формы инфекции у белых мышей можно считать достаточно адекватной для оценки перспективности применения антибактериальных препаратов для этиотропной терапии холеры, а штамм Р-5879 — эталонным инфицирующим.

На стандартной питательной среде Мюллера-Хинтона определены антибиотикограммы штаммов холерного вибриона 01 серогруппы, выделенных на территории Дагестана в 1994 и 1998 гг. (антибиотикочувствительных штаммов не обнаружено), и показана плазмидная природа их устойчивости к стрептомицину, тетрациклину, левомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу. Аналогичный набор маркеров устойчивости у штаммов, выделенных в Дагестане в 1994 и 1998 гг., может служить одним из дополнительных эпидемиологических критериев для ретроспективной оценки эпидситуации в 1998 г.

Впервые показано, что при экспериментальной инфекции, вызываемой одним из дагестанских штаммов (V. cholerae Р-17385), оказываются неэффективными или менее эффективными не только антибиотики, к которым регистрируется устойчивость в соответствии с «Критериями ...»(Statement 1996 CA-SFM), но и некоторые препараты (фуразолидон, ампициллин, цефалоспо-рины III поколения), значения МПК которых не позволяют отнести этот штамм к разряду устойчивых.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фторирован-

ные производные хинолонов в настоящее время являются наиболее, перепек тивной группой препаратов для этиотропной терапии холеры, свидетельст вом тому является высокая чувствительность к ним всех исследованных да гестанских штаммов и отсутствие (в наших опытах) фторхинолонорезистент ных мутантов при однократном воздействии препаратов.

Мутация устойчивости к налидиксовой кислоте при МПК= 160,0 мг/. не сопровождается в соответствии с «Критериями ...» (Statement 1996 CA SFM) резистентностью к фторхинолонам, но при экспериментальной инфек ции, вызванной Nalr мутантом V. cholerae eltor Р-5879, регистрируется сни жение эффективности норфлоксацина, офлоксацина, ломефлоксацина. Опас ность монотерапии холеры налидиксовой кислотой, к которой с достаточн высокой частотой возникают Nalr мутанты холерного вибриона, усугубляете тем, что даже низкий уровень устойчивости к этому препарату (МПК = 40, мг/л)у природного множественноустойчивого, штамма возбудителя (Р-17385 приводит к тому, что "эта культура вызывает экспериментальную инфекции не поддающуюся излечению фторхинолонами (МПК=0,4-0,8 мг/л). Десятр кратные пересевы V. cholerae eltor Р-5879 на средах с возрастающими ког центрациями фторхинолонов позволяют получать мутанты возбудителя с р< зистентностью ко всем взятым для исследования хинолонам. Культур V.cholerae eltor Р-5879 СрГ , полученная на среде с ципрофлоксацином, вь зывала у белых мыс1ей инфекционный процесс, не поддающийся излеченш налидиксовой кислотой и фторхинолонами, а также рифампицином и бет; лактамами (ампициллин, цефотаксим, цефтриаксон), чувствительность к кс торым in vitro сохранялась.

При экспериментальной инфекции, вызванной V. cholerae eltor Р-587 Rir R57 (с сочетанной хромосомной и плазмидной устойчивостью к антибис тикам), утрачивается эффективность не только препаратов, входящих спектр резистентности инфицирующего штамма возбудителя (рифампицш левомицетин, канамицин, гентамицин, триметоприм/сульфаметоксазол, а.\ пициллин), но и терапевтическая активность цефалоспоринов III поколени: к которым штамм сохраняет чувствительность in vitro.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о высоко вероятности формирования инфекционного процесса при холере, вызываем« го антибиотикорезистентными штаммами возбудителя как с устойчивостьк регистрируемой in vitro, так и с "персистирующей" (Bryan L.E., 1989) pe3i стентностью, которая не выявляется обычными лабораторными методами i vitro, но определяет неэффективность препаратов в клинике.

Оптимизированы методы изучения, критерии оценки и интерпретаци результатов определения антибиотикограммы штаммов холерного вибрион Предложен контрольный штамм V. cholerae поп 01 Р-9741, чувствительны ко всем исследованным препаратам, разработаны "Методические рекоменд; ции по определению антибиотикограммы холерного вибриона", одобреннь Ученым Советом (протокол №6 от 5.06.2000) и утвержденные директоро Ростовского НИПЧИ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Модель генерализованной формы инфекции у белых мышей, вызванной антибиотикочувствительным vct+ tcp+ штаммом V. cholerae eltor Р-5879 со стабильными биологическими свойствами, является достаточно адекватной для оценки терапевтической активности антибактериальных препаратов и может служить контролем при изучении эффективности этиотропных агентов на модели инфекции, вызванной как антибиотикочувствительными, так и устойчивыми штаммами холерного вибриона.

2. Фторированные производные хинолонов являются высокоэффективными антибактериальными препаратами в настоящий период развития седьмой пандемии холеры, однако для предотвращения распространения устойчивости к ним необходимо строгое соблюдение схем и сроков их применения, разработанных для других кишечных инфекций (5-7-10 дней).

3. При экспериментальной холере, вызванной антибиотикорезистент-ными формами возбудителя с плазмидным и хромосомным типом устойчивости, утрачивается или резко снижается эффективность не только препаратов, к которым регистрируется устойчивость in vitro, но и некоторых других средств этиотропной терапии, МПК которых не позволяет отнести возбудитель к разряду устойчивых. В связи с этим представляется целесообразным проводить бактериологический контроль на фоне этиотропной терапии со своевременной заменой препарата с случае выделения культуры возбудителя.

4. Основой выбора эффективного средства этиотропной терапии холеры является антибиотикограмма, которая к тому же может использоваться в качестве одного из эпидемиологических маркеров для анализа вспышки инфекции. Для повышения достоверности определения антибиотикограммы предлагается использование в качестве контроля антибиотикочувствительно-го штамма V. cholerae non 01 Р-9741; предлагаются оценочные таблицы для интерпретации результатов исследования с адаптированными для холерного вибриона пограничными значениями МПК антибактериальных препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основное содержание диссертации отражено в 12-ти опубликованных работах. Материалы диссертации докладывались на конференциях молодых ученых Ростовского НИПЧИ, на проблемной комиссии 46.04 "Холера и патогенные для человека вибрионы" (1998, 1999, 2000), на Ученом Совете Ростовского НИПЧИ, на международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000г.).

Отчет по теме "Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры", где автор является одним из ответственных исполнителей, представлен в ГКСЭН в 1998 году. В настоящее время выполняется плановая тема № 159-4-99 "Экспериментальное обоснование рациональных подходов к этиотропной терапии холеры", в которой автор является ответственным исполнителем.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Монография изложена на 190 страницах, состоит из введения, обзор: литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 34 таблицы. Библиография представлена 109 отечественными и 135 зарубежными источниками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В опытах использовали более 4 ООО беспородных белых мышей, Maccoi 18-20г, 30 взрослых кроликов, 20 кроликов-сосунков.

Для изучения были взяты из музея живых культур Ростовской НИГТЧИ детально охарактеризованный ранее, высоковирулентный и высоко токсигенный (vct+ tcp+) штамм Ol группы Vibrio cholerae eltor Р-5879 (Ина ба), выделенный от больного в 1972 г.; 50 штаммов, выделенных от больны: во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994г; 21 штамм V. cholerae elto (Инаба),..изолированный там же во время вспышки инфекции в 1998 г. и 1: штаммов V. cholerae поп Ol. Также использовали штаммы Yersinia pestis 23 (708), Y. pestis EV 129.0, Escherichia coli QD5003.

Для выращивания холерных вибрионов использовали агар и бульо] Хоттингера, pH 7,8+0,1, для хранения — 0,7% агар Хоттингера. Изучение ан тибактериальной активности препаратов проводили на плотных питательны: средах — агаре Мюллера-Хинтона, pH 7,4 (Difco, США); агаре Хоттингерг pH 7,1+0,1 и pH 7,8+0,1; агаре АГВ, pH 7,4 (Дагестанский НИИПС).

В работе использовали 25 антибактериальных препаратов: доксицик лин, тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептоми цин, гентамицин, амикацин, канамицин, ампициллин, фуразолидон, эритро мицин, сульфамонометоксин — препараты отечественного производстве тобрамицин (бруламицин, Биогал, Венгрия), налидиксовую кислоту (неви грамон, Chinoin, Венгрия), ципрофлоксацин (квинтор, Торрент Фармасьюте келс Лтд, Индия), офлоксацин (таривид, Höchst, Германия), пефлоксаци: (перти, Dr.Reddy S, Laboratories Ltd., Индия), норфлоксацин (нолициь KRKA, Словения), ломефлоксацин (максаквин, Searle, Франция), цефопера зон (лоризон, Atral, Португалия), цефтазидим (фортум, Glaxo Wellcome, Анг лия), цефтриаксон (офрамакс, Ranbaxy, Индия), цефотаксим (клафоран, Рус сель Иберика, Испания), азитромицин (сумамед, Плива, Хорватия), триметс прим/ сульфаметоксазол (бикотрим, Agio, Индия).

Чувствительность/устойчивость штаммов холерного вибриона к aim бактериальным препаратам определяли методом серийных разведений прс паратов в плотной питательной среде. Посевная доза взвесей 16-18-часовы агаровых культур составляла п.Ю6 м.к. по отраслевому стантдартному обра; цу ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86 П). Интерпретацию резул! татов проводили в соответствии с Критериями ... (Statement 1996 CA - SFM)

Антибиотикорезистентные мутанты холерного вибриона (Rif, Nal получали методом однократного воздействия препарата на плотной пит;

тельной среде с антибиотиком (100,0-250,0 мг/л) и методом многократных воздействий возрастающих концентраций фторхинолонов.

Конъюгативную передачу R-плазмид клеткам холерного вибриона осуществляли путем совместного культивирования в течение 3-4ч 18-часовых бульонных культур штамма-донора и штамма-реципиента при 37°С с последующим высевом на плотные питательные среды, содержащие антибактериальные препараты для селекции 11+-трансконъюгантов и контрселекции донора.

Свойства штаммов холерного вибриона и антибиотикорезистентных мутантов изучали в соответствии с рекомендациями "Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий" (1995).

Сравнительное изучение токсигенности субкультур исходного штамма холерного вибриона Р-5879, его Rif, Nalr, Cpf мутантов проводили на перевязанных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов (Burrows W., Musteikis С.М., 1966).

Для оценки эффективности антибактериальных препаратов in vivo использовали генерализованную модель холеры на беспородных белых мышах, которых заражали внутрибрюшинно взвесью 18-часовой агаровой культуры (37 °С) холерного вибриона в 0,3% агаризованчом 0,9% растворе хлорида рч-трия в дозе 108 м.к. в объеме 0,?. мл (Либинзон А.Е. и др., 1974). Лечение антибактериальными препаратами начинали сразу после инфицирования. Курс терапии составлял 3 дня (один раз в сутки). Наблюдение за жиьотными осуществляли в течение 10 дней. Проводили бактериологический контроль заражения и эффективности лечения. Опыт учитывали при 100% гибели контрольных (нелеченых) животных. Дозы препаратов рассчитывали по формуле J.E. Paget, J.M.Barnes (1964), исходя из среднесуточных человекодоз.

Статистическую обработку результатов опытов на изолированной петле тонкого кишечника взрослых кроликов проводили по таблицам B.C. Гене-са (1964) и по Р.Б. Стрелкову (1980). Статистическую обработку данных эффективности антибактериальных препаратов осуществляли по таблицам А.Я. Боярского (1955), вычисляя доверительный интервал I?s для р~0,05 при количестве белых мышей в группе — не менее 20 на каждый препарат.

Результаты исследования и их обсуждение.

Наши исследования были начаты со сравнительной характеристики 25 антибактериальных препаратов разных групп in vitro и in vivo в отношении высоковирулентного, высокотоксигенного (vct+ tcp+), наиболее стабильного по своим свойствам штамма V. cholerae eltor Р-5879.

Холера является' строго антропонозным заболеванием и поэтому использование любых моделей инфекции на экспериментальных животных всегда представляло серьезные трудности. Модель генерализованной формы инфекции, избранная нами для изучения эффективности антибактериальных препаратов, отвечает следующим требованиям: а) позволяет оценивать терапевтическую активность одновременно на одном поголовье животных большого количества препаратов (в нашем случае — 25); б) в связи с относитель-

ной экономичностью позволяет иметь необходимое число повторных опыто (не менее 2) и проводить статистическую обработку результатов; в) испол! зовать в экспериментах все необходимые препараты, не имея ограничений токсичности для белых мышей (например, для морских свинок токсичны бе талактамы, рифампицин и др.).

Штамм V. cholerae eltor Р-5879 был высокочувствителен к хинолона\ тетрациклинам, левомицетину, фуразолидону, аминогликозидам, беталакп мам, рифампицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, эритромицину и азит ромицину -— представителю нового поколения макролидов, активному н только в отношении грам (+), но и некоторых видов грам (-) бактерий. В экс периментах на генерализованной модели холеры неэффективными оказание сульфамонометоксин, эритромицин и азитромицин. Невысокой оказалас эффективность цефтазидима, ампициллина, цефоперазона (45-65-75% вь живших, соответственно). Вызывает сомнение целесообразность применени макролидов, ампициллина, цефтазидима, цефоперазона при холерной инфе! ции. Следует подчеркнуть, что наблюдалась полная корреляция данных, пс лученных на модели генерализованной инфекции у мышей (80-100% вь живших животных), и эффективностью клинического применения хинолоно (включая фторхинолоны), тетрациклинов, левомицетина (хлорамфеникола триметоприма/сульфаметоксазола, аминогликозидов, фуразолидона, рифаг» пицина при лечении холеры у людей в случае антибиотикочувствительног возбудителя, в связи с чем используемая нами модель инфекции может бьп признана в значительной степени адекватной для оценки перспективное применения средств этиотропной терапии холеры. Штамм V. cholerae eltor I 5879 в дальнейшем использовался нами в качестве контрольного инфищ рующего, чувствительного ко всем испытанным препаратам.

Определив методы и средства экспериментальных исследований, Mi предприняли изучение антибиотикограмм штаммов холерного вибриона бис типа эльтор, выделенных в Дагестане в 1994г. (50 штаммов) и в 1998г. (2 штамм). При анализе активности 25 антибактериальных препаратов in vitr (среда Мюллера-Хинтона) оказалось, что антибиотикочувствительны штаммов среди изученных обнаружено не было, а 96-100% штаммов был устойчивы к тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметопрг му/сульфаметоксазолу. Эта резистентность имела плазмидную природу, чт было показано путем конъюгативной передачи R-плазмиды от дагестански штаммов клеткам Е. coli QD5003 Nalr (частота п. и от кишечной п;

лочки — клеткам Y. pestis 231 Rif, Y.pestis EV Rif (частота n,10"6-10"s) и обратных кроссах — V. cholerae eltor P-5879 Rif (частота n.10"5).

Все исследованные штаммы холерного вибриона были высокочувств* тельны к налидиксовой кислоте, фторхинолонам, гентамицину, тобрамицин; амикацину.

В районе действия Ростовской СПЭБ (г. Хасавюрт) в 1994 г. выделг лись рифампицинорезистентные штаммы холерного вибриона, хотя офит альные сведения о применении этого антибиотика для лечения холеры отсу] ствовапи. Не исключено, что появление рифампициноустойчивых мутанто

связано с инфицированием холерой больных туберкулезом, получавших препарат по поводу основного заболевания.

Для изучения эффективности антибактериальных препаратов в опытах in vivo из культур, выделенных во время эпидемии в Дагестане в 1994 г., была отобрана одна (Р-17385), устойчивая к рифампицину, тетрациклину, лево-мицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу и стрептомицину, которая вызывала у белых мышей инфекцию, не поддающуюся лечению не только этими препаратами, но и фуразолидоном (МПК=16,0 мг/л), ампициллином (МПК=4,0 мг/л), при этом снижалась также эффективность цефалоспоринов III поколения, хотя чувствительность к ним in vitro сохранялась (МПК=0,01-0,16 мг/л). Излечивали инфекцию фторхинолоны, напидиксовая кислота, аминогликозиды (исключая стрептомицин), доксициклин. Таким образом, при инфекции, вызванной штаммом возбудителя, измененным по признаку чувствительности к антибактериальным препаратам, могут снижать эффективность препараты, значения МПК которых не позволяют отнести возбудитель к разряду устойчивых.

Данные о выделении Rif штаммов холерного вибриона во время вспышки в Дагестане в 1994 году побудили нас к изучению этого феномена в условиях эксперимента. Опыты показали, что мутация к рифампицинорези-стентности у V. cholerae eltor Р-5879 возникала с частотой п.10"9-10"8. Rif мутанты стабильно сохраняли высокий уровень устойчивости (200,0-400,0 мг/л) в условиях хранения на питательных средах и при пассировании через организм экспериментальных животных; сохраняли свои биологические свойства, включая агглютинабельность и токсигенность в опытах на изолированной петле взрослых кроликов. Мутация к рифампициноустойчивости у холерного вибриона не сопровождалась значимым повышением значений МПК других антибактериальных препаратов, хотя in vivo снижалась активность ампициллина, цефалоспоринов III поколения.

Оказалось, что Rif мутанты с большей частотой (п.10"9-10"8) воспринимали плазмиду inc С группы несовместимости RS7b, чем клетки исходного штамма V. cholerae eltor Р-5879 (n.l0"n-10"10), при условии использования рифампицина для контрселекции донора. Повышенная реципиентная способность Rif вариантов холерного вибриона, описанная ранее (Рыжко И.В. и др., 1978) для возбудителей других инфекций, видимо, является общебиологическим явлением, способным оказать существенное влияние на дальнейшее распространение антибиотикоустойчивости среди вибрионов, в связи с чем монотерапия холеры рифампицином представляется нецелесообразной. Однако использование комбинаций рифампицина с триметопримом, аминог-ликозидами, цефалоспоринами III поколения (цефотаксимом, цефтриаксоном и др.), имеющими синергидный характер взаимодействия, представляется весьма перспективным.

Экспрессия плазмиды Rs7b в клетках холерного вибриона Р-5879 Rif сопровождалась появлением резистентности к гентамицину, канамицину, ле-вомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу и ампициллину. При генерализованной инфекции у белых мышей утрачивалась эффективность не только

этих препаратов, но и цефалоспоринов III поколения (цефотаксима и цефтри-аксона), хотя чувствительность к ним in vitro сохранялась.

Аналогичные факты были описаны и ранее в отношении неэффективности клинического применения хинолонов при других инфекциях (включая фторхинолоны), аминогликозидов, беталактамов, тетрациклина и рифампи-цина (Bryan L.E., 1989; Levy S.B., 1989; Piddock L.J.V., Wise R., 1989; Rolinson G.N., 1989; Piddock L.J.V., 1995). L.E. Bryan (1989) определил такую форму устойчивости как "персистирующую", подчеркивая, что она обнаруживается только в процессе проведения курса антимикробной терапии и не выявляется в пробах клинического материала. .

Фторхинолоны в настоящий период развития 7-ой пандемии холеры следует считать наиболее перспективными, однако их целесообразно рассматривать как препараты резерва. Вопрос о возникновении устойчивости к налидиксовой кислоте и фторхинолонам у холерного вибриона и ее влиянии на эффективность применения различных антибиотиков при инфекции, вызываемой измененными штаммами возбудителя, нуждается в специальном изучении, чему и были посвящены следующие разделы работы.

Мутации устойчивости к налидиксовой кислоте возникали у V. cholerae eltor Р-5879 с частотой п.10"1О-10"9. Уровень резистентности при однократном воздействии препарата составлял ~ 200,0 мг/л и не сопровождался значимым (в соотаетстЕи:'. с Критериями...) повышением значений 'ЛПК фторхиноло-нов. Только при МПК налидиксовой кислоты, равной 400,0-300,0 мг/л, появлялась перекрестная резистентность к ципрофлоксацину, офлоксацину, пеф-локсацину, норфлоксацину, ломефлоксацину. Изменения биологических свойств у Nalr мутантов не наблюдали.

Степень резистентности к налидиксовой кислоте имела тенденцию к снижению уже в течение одного месяца наблюдения. Тем не менее, при генерализованной форме холеры у белых мышей (МПК препарата для заражающего штамма составляла 160,0 мг/л с повышением значений МПК фторхино-лонов в 10-40 раз) наблюдалась неэффективность не только налидиксовой кислоты, но и снижался терапевтический эффект офлоксацина, ломефлокса-цина и особенно норфлоксацина (50% выживших мышей), что необходимс учитывать при регистрации у выделенных штаммов даже невысокого повышения устойчивости к налидиксовой кислоте. Уже имеются сообщения о появлении Nalr вариантов холерного вибриона, в клинике (Cavallo J.D. et al., 1995; Jesudason M.V., Saaya R., 1997). Обращают на себя внимание сообщения некоторых авторов (Bhatia R.S., 1992; Rowe В. et al., 1992; Umasankar S. et al., 1992; Le Lostec Z. et al., 1996; Launay O. et al., 1997; Willke A. et al. 1999; Nguyen Van J.-C., Goldstein F.W., 2000) о неэффективности клинического применения фторхинолонов при сальмонеллезной и шигеллезной инфекции, вызванной штаммами, для которых МПК ципрофлоксацина и офлоксацина составляли всего 0,5-1,0 мг/л, что по Критериям... не позволяет отнести эти штаммы к устойчивым.

Фторхинолонорезистентные мутанты V. cholerae eltor Р-5879 методом однократного воздействия препарата получить не удавалось, что повышает

перспективность применения этих антибактериальных средств для лечения холеры. Однако такие варианты возбудителя были изолированы методом последовательного воздействия возрастающих концентраций фторхинолонов на плотной питательной среде. Мутанты оказались устойчивы ко всем исследованным хинолонам, включая налидиксовую кислоту. Эта группа препаратов была неэффективной при инфекции белых мышей, вызванной мутантом, полученным при воздействии ципрофлоксацина. Несмотря на то, что фторхи-нолонорезистентные варианты сохраняли чувствительность к антибактериальным препаратам других групп, инфекция, вызванная мутантом холерного вибриона Р-5879 СрГ, не излечивалась беталактамами (ампициллин, цефа-лоспорины III поколения) и рифампицином. Сохраняли эффективность тет-рациклины, триметоприм/сульфаметоксазол, левомицетин, аминогликозиды, фуразолидон.

Очевидна опасность возникновения устойчивости к хинолонам у мно-жественнорезистентных штаммов холерного вибриона, т.к. она может сопровождаться снижением эффективности не только фторхинолонов, но и дополнительно — рифампицина, беталактамов (включая цефапоспорины III поколения). Для доказательства этого положения были получены Nalr мутанты дагестанского штамма V. cholerae eltor Р-17385, один из которых использовали для заражения белых мышей. Оказалось, что даже низкий уровень устойчивости к налндиксовой кислоте (МПК=40,0 мг/л) у измененного штамма холерного вибриона обеспечивал возбудителю способность вызывать инфекционный процесс, не поддающийся этиотропной терапии налидиксовой кислотой и фторхинолонами при значениях МПК последних, равных 0,4-0,8 мг/л, что по Критериям... не позволяет отнести этот штамм к устойчивым. Выбор средств этиотропной терапии ограничивается в этом случае практически одними аминогликозидами (гентамицин, амикацин, канамицин, тобрамицин) и доксициклином. Если учесть, что к настоящему времени уже описан (Кюре-гян A.A. и др., 1999; Mukhopadhyay A.K. et al, 1998) факт выделения от больных фторхинолонорезистентных мутантов холерного вибриона, то проблема эффективной этиотропной терапии холеры вызывает большую озабоченность. Настораживающими, на наш взгляд, являются наблюдения об утрате или снижении эффективности некоторых антибактериальных препаратов in vivo при одновременном сохранении к ним чувствительности или незначительном повышении значения МПК препарата in vitro, что вызывает необходимость введения дополнительного бактериологического контроля на фоне лечения (на 2-3 день) со своевременной заменой этиотропного средства в случае выделения культуры возбудителя.

Для предупреждения развития устойчивости эпидемически значимых штаммов холерного вибриона к фторхинолонам необходимо использовать оптимальный курс этиотропной терапии, рекомендованный для лечения других кишечных инфекций, под строжайшим бактериологическим контролем излеченности.

Налидиксовая кислота так же, как и рифампицин, на наш взгляд, не может служить средством монотерапии холеры. Однако эти препараты могут

применяться в комбинации с другими, обеспечивающими синергидный характер действия.

Антибиотикограмма эпидзначимых* штаммов холерного вибриона остается основой для выбора наиболее эффективного препарата для этиотроп-ной терапии холеры. Однако, как показали наши эксперименты, чувствительность in vitro к антибактериальным препаратам не может считаться абсолютным критерием их терапевтической активности при лечении инфекции. Для повышения достоверности получаемых результатов необходима оптимизация условий определения антибиотикограммы, критериев оценки полученных результатов и их интерпретации.

Для получения адекватных данных при определении антибиотикограммы микроорганизмов необходимо выполнение основных условий:

а) использование стандартных питательных сред; б) стандартных условий определения; в) использование контрольного (референтного) антибиоти кочувствительного тест-штамма именно этого вида возбудителя; г) примене^ ние для интерпретации результатов Критериев оценки чувствительно сти/устойчивости, адаптированных для данной нозологической формы.

Учитывая, что на разных сериях одной и той же питательной средь значения МПК одного штамма могут колебаться в 4-8 раз (наши наблюде ния), нами отобран в качестве контрольного заведомо чувствительны! штамм V. cholerae non OI Р-9741, рекомендуемый также и для проверки пи тательных сред (Инструкция по организации и проведению противохолерные мероприятий, 1995). Использование его в опытах одновременно с клиниче скими изолятами холерного вибриона на нестандартных питательных среда; позволяет повысить достоверность результатов при определении антибиоти кограммы.

Зарегистрированное в наших экспериментах снижение терапевтиче ской активности некоторых антибактериальных препаратов или полная утра та их эффективности in vivo при повышении значений МПК до уровня, н< позволяющего отнести исследуемые штаммы к разряду устойчивых (Сидо ренко C.B., Колупаев В.Е., 1999; Statement CA-SFM, 1996), заставило на адаптировать пограничные значения МПК некоторых препаратов (фторхино лонов, фуразолидона, цефалоспоринов III поколения, тетрациклинов, триме топрима/сульфаметоксазола) применительно к холерному вибриону. Разра ботаны оценочные таблицы с пограничными значениями МПК 21 препарат для разграничения чувствительных и устойчивых штаммов возбудителя, которых также даны значения МПК для чувствительного штамма V. cholera non OI Р-9741 на среде Мюллера-Хинтона, рН 7,4; агаре Хоттингера, рН 7, и агаре АГВ + 1% пептона рН 7,8.

Для определения антибиотикограммы холерного вибриона оптималь ' ным является метод серийных разведений, который при сравнительном из> чении антибиотикочувствительности контрольного штамма V. cholerae по 01 Р-9741 и коллекции штаммов холерного вибриона (чувствительных и ус тойчивых) позволял на трех питательных средах с использованием oueHOt ных таблиц разделять штаммы чувствительные, устойчивые и штаммы с пс

вышенными значениями МПК (промежуточные). Выявление штаммов с промежуточной устойчивостью требует внимания бактериологов, инфекционистов и эпидемиологов, т. к. неадекватная терапия в этом случае может привести к формированию выраженной устойчивости к антибиотику. Диско-диффузионный метод может быть использован только в качестве ориентировочного.

Совместно с Государственным научным центром по антибиотикам (Сидоренко C.B.) и Российской медицинской академией последипломного образования (Ведьмина Е.А.) нами разработаны "Методические рекомендации по определению антибиотикограммы холерного вибриона", одобренные Ученым Советом (протокол №6 от 5 июня 2000г.) и утвержденные директором Ростовского НИПЧИ.

Оптимизация методов исследования и критериев оценки чувствительности/устойчивости холерного вибриона должна способствовать как сохранению традиционно применяемых средств этиотропной терапии холеры, так и предотвращению развития и распространения устойчивости к другим, внедряемым в клиническую практику антибактериальным препаратам, в частности, к фторхинолонам, которые по возможности должны оставаться препаратами резерва.

ВЫВОДЫ

1. Показана корреляция между чувствительностью эталонного штамма V. cholerae eltor Р-5879 к хинолонам, аминогликозидам, тетрациклинам, ле-вомицетину, фуразолидону, рифампицину, триметоприму/сульфаметоксазолу на среде Мюллера-Хинтона, их эффективностью на модели генерализованной инфекции у белых мышей и наблюдениями в клинике, что позволяет использовать эту модель для оценки перспективности применения средств этиотропной терапии холеры. Штамм V. cholerae eltor Р-5879 может быть рекомендован в качестве эталонного инфицирующего.

2. Выявлено совпадение наборов r-детерминант плазмидной устойчивости (тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, триметоприм/сульфамето-ксазол) у штаммов холерного вибриона, выделенных во время эпидемии в Дагестане в 1994 г. и при вспышке инфекции там же в 1998 г., что может служить одним из эпидемиологических маркеров для ретроспективного анализа вспышки 1998 г.

3. При генерализованной форме холеры, вызванной одним из дагестанских штаммов (Р-17385) с устойчивостью к рифампицину, тетрациклину, ле-вомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу, стрептомицину оказались неэффективны не только препараты, входящие в спектр его резистентности, но и фуразолидон, ампициллин, снижалась эффективность цефалоспоринов III поколения, к которым возбудитель был чувствителен in vitro. Эффективность сохраняли доксициклин, аминогликозиды (кроме стрептомицина), на-лидиксовая кислота и фторхинолоны.

4. Создана коллекция экспериментально полученных вариантов штам-

ма V. cholerae eltor P-5879 с хромосомной устойчивостью к рифампицину, налидиксовой кислоте, фторхинолонам (Cpf, Oflr, N0/, Pef) и сочетанной хромосомной (Rif) «и плазмидной (R57b) резистентностью к антибактериальным препаратам.~

5. Фторированные производные хинолонов (ципрофлоксацин, офлок-сацин, норфлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин) являются наиболее перспективной группой препаратов для этиотропной терапии холеры, однако их целесообразно рассматривать как препараты резерва. Для предупреждена развития устойчивости фторхинолоны следует назначать в оптимальных дозах и курсах терапии, рекомендуемых для других кишечных инфекций. Из-зг высокой частоты возникновения мутаций резистентности у холерного виб риона к рифампицину и налидиксовой кислоте их не следует использоват! для монотерапии холеры.

6. Особенностью экспериментальной инфекции, вызванной устойчи выми (природными и экспериментальными) штаммами холерного вибриона является отсутствие эффективности не только препаратов, к которым устой чива инфицирующая культура возбудителя, но также снижение или утрат: терапевтической активности других средств этиотропной терапии (в зависи мости от фенотипа штамма), к которым in vitro регистрируется чувствитель ность. Это определяет необходимость введения дополнительного бактерио логического контроля на фоне лечения (на 2-3 день) со своевременной заме ной препарата.

7. Мутация резистентности к налидиксовой кислоте у множественноре зистентного природного штамма V. cholerae eltor Р-17385 (Дагестан, 1994г. даже при низком уровне устойчивости (40,0 мг/л) сопровождалась повыше нием показателей МПК фторхинолонов в 100-200-400 раз. Инфекционньи процесс у белых мышей, вызванный таким вариантом возбудителя, излечи вался только доксициклином и аминогликозидами (исключая стрептомицин) Из 23 препаратов — 18 были неэффективны, включая фторхинолоны..

8. Оптимизированы методы определения и интерпретации результата антибиотикограммы холерного вибриона: предложен контрольный антибио тикочувствитёльный штамм V. cholerae поп 01 Р-9741; разработаны оценоч ные таблицы пограничных значений МПК для чувствительных и устойчивы: штаммов холерного вибриона, адаптированных к данному виду возбудителя и даны значения МПК штамма Р-9741 на среде Мюллера-Хинтона рН 7,4 агаре Хоттингера рН 7,8, агаре АГВ + 1% пептона рН 7,8. Усовершенствова ние подходов к определению антибиотикограммы холерного вибриона долж но способствовать не только адекватному выбору средств этиотропной тера пии холеры, но и использованию спектра антибиотикорезистентности в каче стве достоверного эпидемиологического маркера для выявления источнико и отслеживания путей распространения инфекции в динамике эпидемическо го процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Самоход-:ина Э.Д., Королева Н:С., Шутько А.Г., Шариков A.M. Возможные осложне-1ия этиотропной терапии холеры при появлении штаммов возбудителя, ус-ойчивьгх к хинолонам // Пробл. сан.-эпид. охраны территории стран СНГ: Гез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов,. 1998. - С. 161-163.

2. Цураева Р.И., Рыжко И.В., Ломов Ю.М., Шариков A.M., Самоходки-m Э.Д., Щербанюк А.И., Королева Н.С., Шутько А.Г. Антибактериальная ак-ивность in vitro и in vivo широкого набора препаратов в отношении штам- ¡, лов холерного вибриона, выделенных от больных в Дагестане в 1994г // При-, юдно - очаг. инф. в России: Совр. эпид., диагност., тактика защ. насел.: Тез. юкл. Всерос. науч. - практ. конф. - Омск, 1998. - С. 209-210.

3. Кудрякова Т.А., Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Шутько' ; \.Г. Мутант холерного вибриона Эльтор, устойчивый к фторхинолонам тест-, итамм для выявления феномена лизогении и размножения холерных бактериофагов 0139 серогруппы // "Разраб. и произвол, диагн. сухих питат. сред и ликро-тестсистем: Матер. Междунар. науч. конф., посвящ. 70-лет. НПО "Пи-гат. среды". - Махачкала, 1998. - С. 126-127.

4. Рыжко И.В, Цураева Р.И., Ломов Ю М., Шутько А.Г., Мишанькин 5.Н., Королева Н.С., Самоходкина Э.Д., Щербанюк А.И. Полиантибиотико-эезистентность холерного вибриона биотипа Эльтор и проблема выбора эффективных средств этиотропной терапии холеры // Пробл. комиссия "Холера * патоген, для человека вибрионы" - Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 2851.

5. Рыжко И.В, Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Шутько А.Г., Королева Н.С., Замоходкина Э.Д., Щербанюк А.И. Устойчивость к налидиксовой кислоте у юлиантибиотикорезистентных штаммов холерного вибриона биотипа Эль-гор, обусловливающая неэффективность фторхинолонов // Совр. технологии хиагност. и терапии инф. бол.: Тез. докл. науч. конф. - С.- Пб., 1999. - С. 260-»61.

6. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Самоход-шна Э.Д., Шутько А.Г., Королева Н.С. Экспериментальные аспекты этио-гропной терапии холеры // Диагн., леч. и проф. инф. забол. Биотехнология. ?етеринария: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 50-лет. центра военно-гехнич. пробл. биол. защиты НИИ микробиол. МО РФ. - Екатеринбург, 1999. •С. 216-217.

7. Цураева Р.И., Мишанькин Б.Н., Шутько А.Г., Ломов Ю.М., Рыжко Д.В. Использование антибиотикочувствительного тест-штамма Vibrio :holerae non OI для повышения достоверности определения антибиотико--рамм возбудителя холеры на нестандартных питательных средах // Пробл. сомиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы" - Ростов-на-Дону, 1999.-Вып. 12.-С. 86-87.

8. Шутько А.Г., Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Королева rl.C., Самоходкина Э.Д., Щербанюк А.И. Этиотропная терапия холеры, вы-

званной штаммами биотипа Эльтор с плазмидной устойчивостью к антиба1 териальным препаратам на модели инфекции у белых мышей // Актуал. воп| инфек. патол.: Тез. науч.-практ. конф. - Ростов-на-Дону, 1999. - С. 32-33.

.9. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Шутьк А.Г., Мишанькин М.Б. Мутация устойчивости к налидиксовой кисло,те (Nal у полиантибиотикорезистентного штамма Vibrio cholerae eltor и ее влияш-на эффективность этиотропной терапии экспериментальной холеры // Проб, биол. и экол. безопасности: Матер, науч. конф. - Оболенск, 2000. - С. 80.

10. Рыжко И.В, Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Сидоре! ко C.B., Ведьмина Е.А., Шутько А.Г., Королева Н.С. Оптимизация методе оценки чувствительности холерного вибриона к антибактериальным преп; ратам И Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человека вибрионы" - Poi тов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 50-52.

11. Рыжко И.В, Цураева Р.И., Ломов Ю.М., Шутько А.Г., Мишаньки Б.Н., Королева Н.С., Самоходкина Э.Д., Щербанюк А.И. Результаты оценк активности антибактериальных препаратов in vitro и in vivo эпидемическ значимых штаммов холерного вибриона биотипа Эльтор // Эпидемиология инф. бол. - 2000. г № 3. - С. 21-25.

12. Рыжко И.В, Цураева Р.И., Ломов Ю.М., ДПутько А.Г., Мишаньки Б.Н., Королева Н.С., Самоходкина Э.Д., Щербанюк А.И. Экспериментальн» устойчивость холерного вибриона биотипа Эльтор к налидиксовой кислоте фторхинолонам // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - № 9. - С. 7-12.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шутько, Анжела Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА.1. QB30P ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Этиотропная терапия холеры в период распространения полиантибиотикоустойчи-вых форм возбудителя.

1.1.1. Антибактериальные препараты, применяемые для этиотропной терапии холеры в период 7-ой пандемии.

1.1.2. Появление и распространение антибио-тикоустойчивых форм возбудителя холеры.

1.1.3. Некоторые сведения об антибактериальных препаратах, использованных в настоящем исследовании.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы.

2.2. Питательные среды.

2.3. Антибактериальные препараты.

2.4. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

2.5. Получение антибиотикорезистентных мутантов холерного 2.6. Получение штамме вибриона. в холерного вибриона с плазмидной устойчивостью к антибактериальным препаратам

2.7. Изучение биологических свойств холерного вибриона в экспериментах in vitro.

2.8. Использование экспериментальных моделей холеры на животных.

2.9. Статистическая обработка результатов экспериментов.

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO И IN VIVO ПРЕПАРАТОВ ГРУППЫ ТЕТРАЦИКЛИНОВ, ХИН0Л0Н0В, АМИНОГЛИКО-ЗИДОВ, БЕТАЛАКТАМОВ, НИТРОФУРАНОВ, СУЛЬФАНИЛАМИДОВ, МАКРОЛИДОВ, РИФАМПИЦИНА И ЛЕВОМИЦЕ-ТИНА В ОТНОШЕНИИ ШТАММА V.CHOLERAE ELTOR Р-5879 (VCT+TCP+).

3.1. Чувствительность in vitro.

3.2. Эффективность in vivo.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ВО ВРЕМЯ ЭПИДЕМИИ ХОЛЕРЫ В ДАГЕСТАНЕ В 1994 И 1998 ГГ., К ПРЕДСТАВИТЕЛЯМ РАЗНЫХ ГРУПП АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ IN VITRO И IN VIVO .'.•.

4.1. Чувствительность in vitro.

4.2. Эффективность in vivo.

4.3. Изучение природы антибиотикоустойчивос-ти у штаммов холерного вибриона эльтор, выделенных в Дагестане в 1994 и 1998 гг.

ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ХРОМОСОМНАЯ И Ш1АЗМИДНАЯ

УСТОЙЧИВОСТЬ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ.

5.1. Получение Rifr мутантов V.cholerae eltor Р-5879 и изучение их чувствительности к антибактериальным препаратам.

5.1.1. Характеристика некоторых биологических свойств Rifr мутантов.

5.1.2. Изучение токсигенности Rifr мутантов холерного вибриона на модели внутри-кишечного заражения (изолированная петля тонкого кишечника) взрослых кроликов.

5.1.3. Стабильность сохранения устойчивости у Rifr мутантов холерного вибриона в условиях хранения и при пассажах через организм экспериментальных животных

5.1.4. Эффективность антибактериальных препаратов при генерализованной инфекции у белых мышей, вызванной V.cholerae eltor Р-5879 Rifr.

5.2. Получение штаммов холерного вибриона эль тор Р-5879 с плазмидной устойчивостью к антибактериальным препаратам.

5.2.1. Изучение эффективности антибактериальных препаратов при генерализованной форме инфекции у белых мышей, вызванной V.cholerae eltor Р-5879 Rifr R57.

5.3. Мутанты холерного вибриона эльтор Р-5879, устойчивые к налидиксовой кислоте (Nalr).

5.3.1. Получение Nalr мутантов холерного вибриона, характеристика степени их устойчивости к хинолонам.

5.3.2. Характеристика некоторых биологических свойств Nalr мутантов холерного вибриона.

5.3.3. Оценка токсигенности Nalr мутантов холерного вибриона на модели внутри-кишечного заражения кроликов.

5.3.4. Стабильность устойчивости к хинолонам у Nalr мутантов холерного вибриона.

5.4. Мутанты холерного вибриона эльтор Р-5879, устойчивые к фторхинолонам.

5.4.1. Получение мутантов холерного вибриона, устойчивых к фторхинолонам, характеристика перекрестной резистентности.

5.4.2. Изучение токсигенности фторхинолоно-резистентных мутантов и стабильности признака устойчивости к хинолонам в опытах in vivo.

5.4.3. Эффективность этиотропной терапии при генерализованной инфекции у белых мышей, вызванной Nalr и Cpfr мутантами V.cholerae е 1 tor Р-5879.

5.5. Влияние Nalr мутации у природного мно-жественноустойчивого штамма холерного вибриона эльтор р-17385 (Дагестан, 1994г.) на эффективность этиотропной терапии экспериментальной инфекции у белых мышей.

ГЛАВА 6. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ИНТЕРПРЕТАЦИИ ДАННЫХ АНТИБИОТИКОГРАММЫ У ЭПИДЗНА

ЧММЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ.

6.1. Отбор антибиотикочувствительного штамма

V. cholerae поп 01.

6.2. Оценка чувствительности/устойчивости коллекции штаммов холерного вибриона.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры"

Актуальность проблемы. Анализ современного состояния развития седьмой пандемии холеры (Москвитина Э.А., 1998; Ломов Ю.М. и др., 1999 и др.), сведения о вспышках холеры в различных регионах в 1998-99гг. (Wkly Epidemiol. Rec., 1999), сообщения о регистрации 15652 случаев холеры в мире только за несколько месяцев 2000г. (Ломов Ю.М. и др., 2000) делают прогноз на дальнейшие годы весьма неутешительным. Постоянные заносы холеры на территорию России и в страны Содружества (Кологоров А.И. и др., 1998; Голу-бинский Е.П. и др., 2000; Хайтович А.В., 2000 и др.) требуют постоянной готовности медслужбы страны к возникновению очагов этой инфекции. В.И. Покровский и Б.Л. Черкасский (1999) подчеркивают, что в настоящее время обостряется проблема борьбы с инфекциями в связи с изменением биологических свойств микроорганизмов, включая широкое распространение антибиотикоустойчивости. Это в полной мере относится и к возбудителю холеры, в связи с чем вопросы, связанные с профилактикой и лечением холеры, постоянно сохраняют свою актуальность.

Признано, что полноценная патогенетическая терапия холеры может обеспечивать клиническое выздоровление больных даже без применения средств этиотропной терапии, но она не гарантирует освобождение макроорганизма от возбудителя и не препятствует формированию вибриононосительства. Использование в лечении холеры антибактериальных препаратов способствует уменьшению объема теряемой жидкости, сокращению сроков диареи, вибрионовыделения, общей продолжительности клинических симптомов инфекции (Покровский В.И. и др., 1988).

К началу 7-ой пандемии холеры перспективы сочетанного применения патогенетической и этиотропной терапии были настолько очевидны, что применение антибактериальных препаратов для лечения холеры на фоне патогенетической терапии становится повсеместным. Об успешном применении тетрациклина, левомицетина (хлорамфенико-ла), стрептомицина, мономицина (паромомицина) в сочетании с ре-гидратационной терапией сообщали многочисленные авторы (Бароян О.В., 1971; Бургасов П.Н., 1971; Покровский В.И. и др., 1988; Carpenter С.С. et al., 1964; Greenough W.B. et al., 1965; Leon F. et al., 1997 и др.). Доказана высокая эффективность фуразолидона (Hirschhorn N. et al.,1974). Использование для этиотропной терапии эритромицина, налидиксовой кислоты , нитрофуранов, фиксированной комбинации триметоприма /сульфаметоксазола, рифампицина, гентамицина, ампициллина, доксициклина было также успешным при лечении больных холерой (Покровский В.И. и др., 1988; Черномордик А.Б., 1988 и др.).

Последнее "Руководство по борьбе с холерой" (1994) регламентирует использование доксициклина, тетрациклина, фуразолидона, триметоприма/сульфаметоксазола, эритромицина и хлорамфеникола. Еще в 80-х годах появились сообщения (Phillips J., King А., 1988; Dette G.А., Knothe H., 1989; Lalitha M.K. et al., 1990; Butler T. et al., 1993) о высокой чувствительности холерного вибриона к фторированным хинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину, ломефлок-сацину,флероксацину и др.) и их высокой эффективности при лечении холеры у людей.

Однако с применением этиотропной терапии инфекции стали появляться сообщения о выделении от людей антибиотикоустойчивых вариантов возбудителя.

- is

Впервые о выделении от людей стрептомициноустойчивых штаммов холерного вибриона сообщил O.Felsenfeld (1965).В том же 1965 году среди штаммов холерного вибриона S.Kuwahara et al. (1967) обнаружили изоляты, устойчивые к тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину, стрептомицину, канамицину и ампициллину. Множественноре-зистентные штаммы выделялись (до 6 %) в период 1962-1967 гг. в Калькутте (Prescott L.M. et al., 1968).К этому времени стало очевидным, что в формировании полиантибиотикорезистентности у холерного вибриона ведущая роль принадлежит R-плазмидам. До 1977 г. частота встречаемости множественноустойчивых штаммов холерного вибриона оставалась довольно низкой. Во время вспышек холеры в Нигерии в 1977 г., в Танзании - 1978 г., в Тайланде - 1979 г., в Бангладеш - 1980 г. уже с высокой частотой обнаруживали изоляты Vibrio cholerae 01 с плазмидоопосредованной множественной лекарственной устойчивостью к широко применяемым антибактериальным препаратам (Mhalu F.S. et al.,1979; Towner K.I. et al., 1979 ).Было доказано, что R-плазмиды, детерминирующие мультирезистентность, принадлежат к inc С группе несовместимости (Kanoh Т. et al., 1979; Kuwahara S. et al., 1980; Finch M.J. et al., 1988 и др.).

С конца 80-х и начала 90-х годов резко возрастает число сообщений о выделении множественноустойчивых штаммов V. cholerae 01 в различных регионах мира (Ouelette М. et al.f 1988; Amyes S.G.B., 1989; Tabtieng R. etal., 1989; Jesudason M.V., John T.J., 1990; Ferreira E. et al., 1992; Ramamurthy T. et al., 1992; Materu S.F. et al., 1997; Falbo V.et al., 1999 и др.).

0 выделении полирезистентных штаммов холерного вибриона от людей на территории бывшего СССР во время вспышки холеры в г.Одессе в 1970 г. сообщила З.В.Ермольева с соавт. (1971) ив

Нижнем Поволжье в 1970-71 гг. - С.Л. Бородько (1972). Повсеместное появление множественнорезистентных штаммов холерного вибриона можно отнести к 90-м годам (Подосинникова Л.С. и др. ,1995) .Серьезные эпидосложнения, связанные с резким снижением эффективности тетрациклина, левомицетина, а также доксициклина и фуразолидона, наблюдали во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994г. (Ломов Ю.М. и др. 1994; Савельев В.Н. и др., 1994; 1995; 2000; Карбышев Г.Л. и др., 1995; Турьянов М.Х. и др., 1996 и др.).

Данные Госсанэпиднадзора за 1999г. свидетельствуют о том, что в течение августа-сентября этого года в Россию осуществлялись неоднократные завозы инфекции, и при этом выделяемые штаммы оказывались устойчивыми к тетрациклину (90-100%), доксициклину (84%) левомицетину (90%).ампициллину (91%), фурадонину (100%), гентами-цину (45%) (Кюрегян А.А. и др., 2000; Подосинникова Л.С. и др., 2000).

Вышеизложенное вызывает настоятельную необходимость:

2) обязательного изучения корреляции между значениями минимальных подавляющих концентраций препаратов в отношении возбудителя и эффективностью этиотропной терапии данной нозологической формы заболевания;

Цель исследования. Сравнительное изучение активности антибактериальных препаратов разных групп in vitro и in vivo в отношении Vibrio cholerae eltor, чувствительных и устойчивых (природных и экспериментальных) к действию этиотропных агентов, и оптимизация подходов к определению антибиотикограммы эпидзначимых штаммов возбудителя холеры.

Цель исследования определила необходимость решения следующих задач:

1) показать, что модель генерализованной формы инфекции у белых мышей, вызванной антибиотикочувствительным vct+ tcp+ штаммом V.cholerae eltor Р-5879 (выделен от больного в 1972г.), является достаточно адекватной для оценки терапевтической активности антибактериальных препаратов при холере;

2) изучить антибиотикограммы штаммов холерного вибриона эль-тор, выделенных в Дагестане в 1994 и 1998 гг., с использованием стандартной среды Мюллера-Хинтона и "Критериев оценки чувствительности/устойчивости для неприхотливых бактерий Международного Европейского общества микробиологов и инфекционистов (Statement 1996 CA-SFM);

3) создать коллекцию природных множественноустойчивых штаммов холерного вибриона и экспериментально полученных вариантов штамма V. cholerae eltor Р-5879 с плазмидной устойчивостью к антибиотикам, а также мутантов,резистентных к рифампицину, налидиксовой кислоте, фторхинолонам;

4) изучить корреляцию между значениями минимальных подавляющих концентраций антибактериальных препаратов in vitro и их активностью в экспериментах in vivo с использованием коллекции штаммов холерного вибриона с разным фенотипом;

5) оценить возможные последствия мутации устойчивости к на-лидиксовой кислоте у природного множественнорезистентного штамма V.cholerae eltor Р-17385 (Дагестан, 1994 г.) для эффективности/неэффективности этиотропной терапии в экспериментах на белых мышах;

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые дана сравнительная оценка активности 25 антибактериальных препаратов различных групп в экспериментах in vitro и их эффективности на модели генерализованной инфекции у белых мышей. Установлена корреляция между чувствительностью штамма V.cholerae eltor Р-5879 vct+ tcp+ (выделен от больного в 1972 г.) к тетрациклинам, левоми-цетину, фуразолидону, триметоприму/сульфаметоксазолу, аминогликозидам, рифампицину, цефотаксиму, цефтриаксону, налидиксовой кислоте, фторхинолонам ( ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину, ломефлоксацину) и их высокой эффективностью при экспериментальной генерализованной форме холеры у белых мышей, что соответствует наблюдениям в клинике. Модель генерализованной формы инфекции у белых мышей можно считать достаточно адекватной для оценки перспективности применения антибактериальных препаратов для этиотропной терапии холеры, а штамм Р-5879 - эталонным инфицирующим.

2. На стандартной питательной среде Мюллера-Хинтона определены антибиотикограммы штаммов холерного вибриона 01 се-рогруппы, выделенных на территории Дагестана в 1994 и 1998 гг., и показана плазмидная природа их устойчивости к стрептомицину, тетрациклину, левомицетину, триметопри-му/сульфаметоксазолу. Аналогичный набор маркеров устойчивости у штаммов, выделенных в Дагестане в 1994 и 1998 гг., может служить одним из эпидемиологических маркеров для ретроспективной оценки зпидситуации в 1998 г.

3. Впервые показано, что при экспериментальной инфекции, вызываемой одним из дагестанских штаммов (V. cholerae Р-17385), оказываются неэффективными или снижающими эффективность не только препараты, к которым регистрируется устойчивость в соответствии с Критериями чувствительности/устойчивости для неприхотливых бактерий (Statement 1996 CA-SFM), но и некоторые антибиотики (фуразолидон, ампициллин, цефалоспорины III поколения), значения МПК которых не позволяют отнести этот штамм к разряду устойчивых.

4. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фторированные производные хинолонов в настоящее время являются наиболее перспективной группой препаратов для этиотропной терапии холеры, свидетельством тому является высокая чувствительность к ним всех исследованных дагестанских штаммов и отсутствие (в наших опытах) фторхинолонорезистентных мутантов при однократном воздействии препаратов.

5. Мутация устойчивости к налидиксовой кислоте при МПК = 160,0 мг/л не сопровождается в соответствии с Критериями .(Statement 1996 CA-SFM) резистентностью к фторхиноло-нам,но при экспериментальной инфекции, вызванной Nalr мутантом V.cholerae eltor Р-5879, регистрируется снижение эффективности норфлоксацина, офлоксацина, ломефлоксацина. Опасность монотерапии холеры налидиксовой кислотой, к которой с достаточно высокой частотой возникают Nalr мутанты холерного вибриона, усугубляется тем, что даже низкий уровень устойчивости к этому препарату (МПК = 40,0 мг/л) у природного множеств енноустойчивого штамма возбудителя (Р-17385) приводит к тому, что эта культура вызывает экспериментальную инфекцию, не поддающуюся излечению фторхи-нолонами (МПК = 0,4 - 0,8 мг/л).

6. Десятикратные пересевы V.cholerae eltor Р-5879 на средах с возрастающими концентрациями фторхинолонов позволяют получать мутанты возбудителя с резистентностью ко всем взятым для исследования хинолонам. Культура ципрофлокса-цинорезистентного мутанта V.cholerae eltor Р-5879 Cpfr вызывала у белых мышей инфекционный процесс, не поддающийся излечению налидиксовой кислотой, ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, норфлоксацином, ломефлокса-цином, а также рифампицином и беталактамами (ампициллин, цефотаксим, цефтриаксон), чувствительность к которым in vitro сохранялась.

7. При экспериментальной инфекции, вызванной V.cholerae eltor P-5879 Rifr R57 (с сочетанной хромосомной и плазмид-ной устойчивостью к антибиотикам), утрачивается эффективность не только препаратов, входящих в спектр резистентности инфицирующего штамма возбудителя (рифампицин, лево-мицетин, канамицин, гентамицин, триметоприм/сульфаметок-сазол, ампициллин), но и терапевтическая активность цефа-лоспоринов III поколения, к которым штамм сохраняет чувствительность in vitro.

8. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о высокой вероятности формирования инфекционного процесса при холере, вызываемого антибиотикорезистентными штаммами возбудителя как с устойчивостью, регистрируемой in vitro, так и с "персистирующей" (Bryan L.E., 1989) резистентностью, которая не определяется обычными лабораторными методами in vitro, но определяет неэффективность препарата в клинике.

9. Оптимизированы методы определения, критерии оценки и интерпретации результатов определения антибиотикограммы штаммов холерного вибриона. Предложен контрольный антиби-отикочувствительный штамм V. cholerae поп 01 Р-9741. Разработаны "Методические рекомендации по определению антибиотикограммы холерного вибриона", одобренные Ученым Советом (протокол N б от 5.06.2000) и утвержденные директором Ростовского НИПЧИ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показать, что модель генерализованной формы инфекции у белых мышей, вызванной антибиотикочувствительным vct+ tcp+ штаммом V.cholerae eltor Р-5879 со стабильными биологическими свойствами, является достаточно адекватной для оценки терапевтической активности антибактериальных препаратов и может служить контролем при изучении эффективности этиотропных агентов на модели инфекции, вызванной как антибиотикочувствительными, так и устойчивыми штаммами холерного вибриона.

2. Фторированные производные хинолонов являются высокоэффективными антибактериальными препаратами в настоящий период развития 7-ой пандемии холеры, однако для предотвращения распространения устойчивости и к этой группе антибактериальных средств этиотропной терапии инфекции необходимо строгое соблюдение схем и сроков их применения, разработанных для других кишечных инфекций (5-7-10 дней).

3. При экспериментальной холере, вызванной антибиотикорезис-тентными формами возбудителя с плазмидным и хромосомным типом устойчивости, утрачивается или резко снижается эффективность не только препаратов, к которым регистрируется устойчивость in vitro, но и некоторых других средств этиотропной терапии (в зависимости от фенотипа вызвавшего инфекцию штамма возбудителя), МПК которых не позволяет отнести возбудитель к разряду устойчивых. В связи с этим представляется целесообразным проводить бактериологический контроль на фоне этиотропной терапии со своевременной заменой препарата.

4. Основой выбора эффективного средства этиотропной терапии холеры является антибиотикограмма, которая к тому же может использоваться в качестве одного из эпидемиологических маркеров для анализа вспышки инфекции и прогноза. Для повышения достоверности определений предлагается использование в качестве контроля антибиотикочувствительного штамма V. cholerae поп 01 Р-9741; предлагаются оценочные таблицы для интерпретации результатов исследования с адаптированными для холерного вибриона пограничными значениями МПК антибактериальных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференциях молодых ученых Ростовского НИПЧИ, на проблемной комиссии 46.04 "Холера и патогенные для человека вибрионы" (1998, 1999, 2000), на Ученом Совете Ростовского НИПЧИ, на международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000г.).

Отчет по теме "Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры", где автор является одним из ответственных исполнителей, представлен в ГКСЭН. В настоящее время выполняется плановая тема N 159 - 4 - 99 "Экспериментальное обоснование рациональных подходов к этиотропной терапии холеры", в которой автор является ответственным исполнителем.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертации. Монография изложена на 190 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 34 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шутько, Анжела Георгиевна

ВЫВОДЫ

1. Показана корреляция между чувствительностью эталонного штамма V.cholerae eltor Р-5879 к хинолонам, аминогликозидам, тет-рациклинам, левомицетину, фуразолидону, рифампицину, триметоприму/сульфаметоксазолу на среде Мюллера-Хинтона и их эффективностью на модели генерализованной инфекции у белых мышей, а также наблюдениями в клинике, что позволяет использовать эту модель для оценки перспективности применения средств этиотропной терапии холеры. Штамм V.cholerae eltor Р-5879 может быть рекомендован в качестве эталонного инфицирующего.

2. Выявлено совпадение наборов г-детерминант плазмидной устойчивости (тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, триметоп-рим/сульфаметоксазол) у штаммов холерного вибриона, выделенных во время эпидемии в Дагестане в 1994 г. и при вспышке инфекции там же в 1998 г., что может служить одним из эпидемиологических маркеров для ретроспективного анализа вспышки 1998 г.

3. При септической форме холеры, вызванной одним из дагестанских штаммов (Р-17385) с устойчивостью к рифампицину, тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, оказались неэффективны не только препараты, входящие в спектр его резистентности, но и фуразолидон, ампициллин, снижалась эффективность цефалоспоринов III поколения, к которым возбудитель был чувствителен in vitro. Эффективность сохраняли докси-циклин, аминогликозиды (кроме стрептомицина), налидиксовая кислота и фторхинолоны.

4. Создана коллекция экспериментально полученных вариантов штамма V.cholerae eltor Р-5879 с хромосомной устойчивостью к рифампицину (Rifr), налидиксовой кислоте (Nalr), фторхинолонам (Cpfr, Oflr, Norr, Pefr) и сочетанной хромосомной (Rifr) и плазмидной (R57b) резистентностью к антибактериальным препаратам.

5. Фторированные производные хинолонов (ципрофлоксацин, оф-локсацин, норфлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин) являются наиболее перспективной группой препаратов для этиотропной терапии холеры, однако их целесообразно рассматривать как препараты резерва. Для предупреждения развития устойчивости фторхинолоны следует назначать в оптимальных дозах и курсах терапии, рекомендуемых для других кишечных инфекций. Из-за высокой частоты возникновения мутаций резистентности у холерного вибриона к рифампицину и налидиксовой кислоте их не следует использовать для монотерапии холеры.

6. Особенностью экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми (природными и экспериментальными) штаммами холерного вибриона, является отсутствие эффективности не только препаратов, к которым устойчива инфицирующая культура возбудителя, но также снижение или утрата терапевтической активности других средств этиотропной терапии (в зависимости от фенотипа штамма), к которым in vitro регистрируется чувствительность. Это определяет необходимость введения дополнительного бактериологического контроля на фоне лечения (на 2-3 день) со своевременной заменой препарата.

7. Мутация резистентности к налидиксовой кислоте у множест-веннорезистентного природного штамма V.cholerae eltor Р-17385 (Дагестан, 1994г.) даже при низком уровне устойчивости (40,0 мг/л) сопровождалась повышением показателей МПК фторхинолонов в 100-200-400 раз. Инфекционный процесс у белых мышей, вызванный таким вариантом возбудителя, излечивался только доксициклином и

- 160 аминогликозидами (исключая стрептомицин). Из 23 препаратов - 18 (включая фторхинолоны) были неэффективны.

8. Оптимизированы методы определения и интерпретации результатов антибиотикограммы холерного вибриона: предложен контрольный антибиотикочувствительный штамм V.cholerae поп 01 Р-9741; разработаны оценочные таблицы пограничных значений МПК для чувствительных и устойчивых штаммов холерного вибриона, адаптированных к данному виду возбудителя, и даны значения МПК штамма Р-9741 на среде Мюллера-Хинтона рН 7,4, агаре Хоттингера рН 7,8, агаре АГВ + 1% пептона рН 7,8. Усовершенствование подходов к определению антибиотикограммы холерного вибриона должно способствовать не только адекватному выбору средств этиотропной терапии холеры, но и использованию спектра антибиотикорезистентности в качестве достоверного эпидемиологического маркера для выявления источников и определения путей и факторов распространения инфекции, динамики и прогнозирования эпидемического процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патогенетическая терапия холеры приводит к клиническому выздоровлению больных даже без применения средств этиотропной терапии, однако она не гарантирует освобождение макроорганизма от возбудителя, что может способствовать формированию вибриононоси-тельства и дальнейшими эпидосложнениями (Мединский Г.М., Москви-тинаЭ.А., 1974; Москвитина Э. А., 1978; Мединский Г.М. и др., 1989). Седьмая пандемия холеры в настоящее время осложнилась распространением штаммов холерного вибриона с клинически значимыми уровнями резистентности к традиционно применяемым для лечения этой инфекции антибактериальным препаратам, выделяются штаммы возбудителя преимущественно с множественной лекарственной устойчивостью, что в значительной степени осложняет выбор средств этиотропной терапии и санации вибриононосителей. В то же время В. И. Покровский и В.В. Малеев (1999), касаясь актуальных проблем инфекционной патологии и подчеркивая роль антибиотикорезистентности возбудителей в снижении эффективности терапии, с сожалением отмечают, что лечение инфекционных больных в большей мере строится на использовании наиболее модного или доступного антибиотика на основе, в лучшем случае, однократного микробиологического обследования. Это в полной мере можно отнести и к этиотропной терапии холеры.

Учитывая настоятельную необходимость совершенствования рациональных подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры, основной целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение активности 25 антибактериальных препаратов разных групп в экспериментах in vitro и in vivo в отношении штаммов V. cholerae eltor, чувствительных и устойчивых к действию этиотропных агентов (как природных, так и полученных нами экспериментальным путем), а также оптимизация подходов к определению антибиотикограммы эпидз-начимых штаммов холерного вибриона.

Наши исследования были начаты со сравнительной характеристики in vitro и in vivo препаратов группы тетрациклинов, хинолонов, аминогликозидов, беталактамов, нитрофуранов, сульфаниламидов, макролидов, рифампицина и левомицетина в отношении штамма V.cholerae eltor Р-5879. Этот штамм был выделен от больного в 1972 г. и после длительного изучения сотрудниками РПЧИ рекомендован для использования в различных экспериментальных исследованиях как высоковирулентный, высокотоксигенный (vct+ tcp+), однородный по составу популяции и наиболее стабильный по своим свойствам из числа изученных при различных воздействиях.

Изучение антибактериальной активности препаратов проводили на стандартной среде Мюллера-Хинтона (Difco, США) и отношение штаммов к разряду чувствительных или устойчивых по значениям МПК определяли в соответствии с Критериями для клинических штаммов неприхотливых бактерий (Statement 1996 CA-SFM), разработанных Европейским обществом микробиологов и инфекционистов с применением именно этой питательной среды. В опытах in vivo использовали септическую модель холеры на беспородных белых мышах, инфицированных внутрибрюшинно, применявшуюся и ранее для оценки эффективности различных антибактериальных препаратов при экспериментальной холере и эффективности фаготерапии (Ермольева З.В., 1964; Хунданов Л.Е., 1965; Либинзон А.Е. и др., 1974; Griffits J.J., 1942; Nagao I., 1953).

Штамм V.cholerae eltor Р-5879 был высокочувствителен к хинолонам, тетрациклинам, левомицетину, фуразолидону, аминогликози-дам, беталактамам, рифампицину, триметоприму/сульфаметоксазолу, эритромицину и азитромицину - представителю нового поколения мак-ролидов, активному не только в отношении грам+, но и некоторых видов грам- бактерий. В экспериментах на септической модели холеры неэффективными оказались сульфамонометоксин, эритромицин и азитромицин. Невысокой оказалась эффективность цефтазидима, ампициллина, цефоперазона (45-65-75% выживших, соответственно). Вызывает сомнение целесообразность применения макролидов, ампициллина, цефтазидима, цефоперазона при холерной инфекции. Следует подчеркнуть, что наблюдалась полная корреляция данных, полученных на модели холерной септицемии у мышей (80-100% выживших животных), и эффективностью клинического применения хинолонов (включая фторхи-нолоны), тетрациклинов, левомицетина (хлорамфеникола), триметоп-рима/сульфаметоксазола, аминогликозидов, фуразолидона, рифампицина при лечении холеры у людей в случае антибиотикочувствительного возбудителя, в связи с чем используемая нами модель инфекции может быть признана в значительной степени адекватной для оценки перспективности применения средств этиотропной терапии холеры.

Холера является строго антропонозным заболеванием, и поэтому использование любых моделей инфекции на экспериментальных животных всегда представляло серьезные трудности. Модель генерализованной формы инфекции, избранная нами для изучения эффективности антибактериальных препаратов, отвечает следующим требованиям: а) позволяет оценивать терапевтическую активность одновременно на одном поголовье животных большого количества препаратов (в нашем случае - 25); б) в связи с относительной экономичностью позволяет иметь необходимое число повторных опытов (не менее 2) и проводить статистическую обработку результатов; в) использовать в экспериментах все необходимые препараты, не имея ограничений в токсичности для белых мышей (для морских свинок, например, токсичны бе-талактамы, рифампицин и др.).

Штамм V.cholerae eltor Р-5879 в дальнейшем использовался нами в качестве контрольного инфицирующего, чувствительного ко всем испытанным препаратам.

Определив методы и средства экспериментальных исследований, мы предприняли изучение антибиотикограмм штаммов холерного вибриона биотипа эль тор, выделенных в Дагестане в 1994г. (50 штаммов) и в 1998г. (21 штамм).

При анализе активности 25 антибактериальных препаратов In vitro (среда Мюллера-Хинтона) оказалось, что 96-100% штаммов были устойчивы к тетрациклину, левомицетину, стрептомицину, триметоп-риму/сульфаметоксазолу. Эта резистентность имела плазмидную природу, что было показано путем конъюгативной передачи R-плазмиды от дагестанских штаммов, выделенных в 1994 и 1998 гг., клеткам Е. coli QD5003 Nalr (частота п-10"9-Ю-7) и от кишечной палочки -клеткам Y.pestis 231 Rifr, Y.pestis EV Rifr (частота п'10"6-10"5) и в обратных кроссах - V.cholerae eltor Р-5879 Rifr (частота п-10~5).

Все исследованные штаммы холерного вибриона были высокочувствительны к налидиксовой кислоте, фторхинолонам, гентамицину, тобрамицину, амикацину.

В районе действия Ростовского НИПЧИ (г.Хасавюрт) в 1994 г. выделялись рифампицинорезистентные штаммы холерного вибриона, хотя сведения о применении этого антибиотика для лечения холеры отсутствовали. Не исключено, что появление рифампицинорезистентных

Rifr) мутантов связано с инфицированием холерой больных туберкулезом, получавших препарат по поводу основного заболевания.

Идентичные по большинству маркеров антибиотикограммы штаммов холерного вибриона, выделенных в 1994 и 1998 гг. от больных в Дагестане, были использованы в качестве одного из эпидемиологических маркеров при ретроспективном анализе "родственных связей" у штаммов, вызвавших инфекцию в республике Дагестан в эти годы. На основании изучения фенотипических признаков, ПЦР-типирования, фа-голизабельности, лизогенности и спектров антибиотикочувствитель-ности Б.Н. Мишанькин и др. (1999) предполагают, что вспышка в Дербентском и Хивском районах Дагестана в 1998г. вызвана клоном холерного вибриона, сохранившимся в межэпидемический период с 1994 года.

Для изучения эффективности антибактериальных препаратов в опытах in vivo методом случайной выборки нами была отобрана одна из культур, выделенных во время эпидемии в Дагестане в 1994 г. Культура дагестанского штамма Р-17385, устойчивая к рифампицину, тетрациклину, левомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу и стрептомицину, вызывала у белых мышей холерную септицемию, не поддающуюся лечению не только этими препаратами, но и фуразолидо-ном (МПК=16,0 мг/л) и ампициллином (МПК=4,0 мг/л), снижалась также эффективность цефалоспоринов III поколения, хотя чувствительность к ним in vitro сохранялась (МПК=0,01-0,16 мг/л) . Излечивали инфекцию фторхинолоны, налидиксовая кислота, аминогликозиды (исключая стрептомицин), доксициклин. Таким образом, при инфекции, вызванной штаммом возбудителя, измененным по признаку чувствительности к антибактериальным препаратам, могут снижать эффективность препараты, значения МПК которых не позволяют отнести возбудитель к разряду устойчивых.

Данные о выделении Rifr штаммов холерного вибриона во время вспышки в Дагестане в 1994 году побудили нас к изучению этого феномена в условиях эксперимента. Опыты показали, что мутация к ри-фампицинорезистентности у V.cholerae eltor Р-5879 возникала с частотой rrl09-10""8. Rifr мутанты стабильно сохраняли высокий уровень устойчивости (200,0-400,0 мг/л)в условиях хранения на питательных средах и при пассировании через организм экспериментальных животных, сохраняли свои биологические свойства, включая агглютинабельность и токсигенность в опытах на изолированной петле взрослых кроликов.

Мутация к рифампициноустойчивости у холерного вибриона не сопровождалась значимым повышением значений МПК других антибактериальных препаратов, хотя in vivo снижалась активность ампициллина, цефалоспоринов III поколения.

Оказалось, что Rifr мутанты с большей частотой (п-10~9-10~8) воспринимали плазмиду inc С группы несовместимости Rs7b, чем клетки исходного штамма V. cholerae eltor Р-5879 (п-Ю~11-Ю~10), при условии использования рифампицина для контрселекции донора. Повышенная реципиентная способность Rifr вариантов холерного вибриона, описанная ранее (Рыжко И.В. и др., 1978) для возбудителей других инфекций, видимо, является общебиологическим явлением, способным оказать существенное влияние на дальнейшее распространение антибиотикоустойчивости среди вибрионов, в связи с чем монотерапия холеры рифампицином представляется нецелесообразной. Однако использование комбинаций рифампицина с триметопримом, ами-ногликозидами, цефалоспоринами III поколения (цефотаксимом, цефт-риаксоном и др.), имеющими синергидный характер взаимодействия, представляется весьма перспективным.

Экспрессия плазмиды Rs7b в клетках холерного вибриона Р-5879 Rifr сопровождалась появлением резистентности к гентамицину, ка-намицину, левомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу и ампициллину. При генерализованной инфекции у белых мышей утрачивалась эффективность не только этих препаратов, но и цефалоспоринов III поколения (цефотаксима и цефтриаксона), хотя чувствительность к ним in vitro сохранялась, а беталактамаза ОХА-3, кодируемая этой плазмидой, обычно не инактивирует цефалоспорины. В данном случае, по-видимому, имеет место перераспределение пенициллинсвязывающих белков в мембране, вызванное ДНК-мембранными взаимодействиями, обусловленными включением в клетку R-плазмиды и дополнительной мутацией к рифампицинорезистентности.

Аналогичные факты были описаны и ранее в отношении неэффективности клинического применения хинолонов (включая фторхинолоны), аминогликозидов, беталактамов, тетрациклина и рифампицина (Bryan L.Е., 1989; Levy S.В., 1989; Piddock L.J.V., Wise R.-, 1989; Rolinson G.N., 1989; Piddock L.J.V., 1995). L.E.Bryan (1989) определил такую форму устойчивости - как "персистирующую", подчеркивая, что она обнаруживается только в процессе проведения курса антимикробной терапии и не выявляется в пробах клинического материала.

Фторхинолоны в настоящий период развития 7-ой пандемии холеры следует считать наиболее перспективными, но по возможности использовать в качестве резерва. Вопрос о возможности возникновения устойчивости к налидиксовой кислоте (хинолон первого поколения) и фторхинолонам у холерного вибриона и ее влиянии на эффективность применения различных антибиотиков при инфекции, вызываемой измененными штаммами возбудителя, нуждается в специальном изучении.

Мутации устойчивости к налидиксовой кислоте (Nalr) возникали у V.cholerae eltor Р-5879 с частотой гг 10~10-1СГ9. Уровень резистентности при однократном воздействии препарата составлял ^ 200,0 мг/л и не сопровождался значимым (в соответствии с Критериями.) повышением значений МПК фторхинолонов. Только при МПК налидиксовой кислоты, равной 400,0 - 800,0 мг/л, появлялась перекрестная резистентность к ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину, ломефлоксацину. Изменения биологических свойств у Nalr мутантов не наблюдали.

Степень резистентности к налидиксовой кислоте имела тенденцию к снижению уже в течение одного месяца наблюдения. Тем не менее, при септической форме холеры у белых мышей (МПК препарата для заражающего штамма составляла 160,0 мг/л с повышением значений МПК фторхинолонов в 10-40 раз) наблюдалась неэффективность не только налидиксовой кислоты, но и снижался терапевтический эффект офлоксацина, ломефлоксацина и особенно норфлоксацина (50% выживших мышей), что необходимо учитывать при регистрации у выделенных штаммов даже невысокого повышения устойчивости к налидиксовой кислоте. Уже имеются сообщения о появлении Nalr вариантов холерного вибриона в клинике (Cavallo J.D. et al., 1995; Jesudason M.V., Saaya R., 1997). Обращают на себя внимание сообщения некоторых авторов (Bhatia R.S. ,1992; Rowe В. et al., 1992; Umasankar S. et al., 1992; Le Lostec Z. et al., 1996; Launay 0. et al., 1997; Willke A. et al., 1999; Nguyen Van J.-C., Goldstein F.W., 2000) о неэффективности клинического применения фторхинолонов при сальмонеллезной и шигеллезной инфекции, вызванной штаммами, для которых МПК ципрофлоксацина и офлоксацина составляли 0,5-1,0

МГ/Л.

Фторхинолонорезистентные мутанты V.cholerae eltor Р-5879 методом однократного воздействия препарата получить не удавалось, что повышает перспективность применения этих антибактериальных средств для лечения холеры. Однако такие варианты возбудителя были изолированы методом последовательного воздействия возрастающих концентраций фторхинолонов на плотной питательной среде. Мутанты оказались устойчивы ко всем исследованным хинолонам, включая на-лидиксовую кислоту. Эта группа препаратов оказалось неэффективной при инфекции белых мышей, вызванной мутантом, полученным при воздействии ципрофлоксацина (Cpfr). Несмотря на то, что фторхинолонорезистентные варианты сохраняли чувствительность к антибактериальным препаратам других групп, инфекция, вызванная мутантом холерного вибриона Р-5879 Cpfr, не излечивалась беталактамами (ампициллин, цефалоспорины III поколения) и рифампицином. Сохраняли эффективность тетрациклины, левомицетин, аминогликозиды, триме-топрим/сульфаметоксазол, фуразолидон.

Очевидна опасность возникновения устойчивости к хинолонам у множественнорезистентных штаммов холерного вибриона, т.к. она может сопровождаться снижением эффективности не только фторхинолонов, но и дополнительно - рифампицина, беталактамов (включая цефалоспорины 111 поколения). Для доказательства этого положения были получены Nalr мутанты дагестанского штамма V.cholerae eltor Р-17385, один из которых использовали для заражения белых мышей. Оказалось, что даже низкий уровень устойчивости к налидиксовой кислоте (МПК=40,0 мг/л) у измененного штамма холерного вибриона обеспечивал возбудителю способность вызывать инфекционный процесс, не поддающийся этиотропной терапии налидиксовой кислотой и фторхинолонами при значениях МПК последних, равных 0,4-0,8 мг/л, что по Критериям. не позволяет отнести этот штамм к устойчивым. Выбор средств этиотропной терапии ограничивается в этом случае практически одними аминогликозидами (гентамицин, амикацин, кана-мицин, тобрамицин) и доксициклином. Если учесть, что к настоящему времени уже описан (Кюрегян А.А. и др., 1999; Mukhopadhyay А.К. et al., 1998) факт выделения от больных фторхинолонорезистентных мутантов холерного вибриона, то проблема эффективной этиотропной терапии холеры вызывает большую озабоченность. Настораживающими, на наш взгляд, являются наблюдения об утрате или снижении эффективности некоторых антибактериальных препаратов in vivo при одновременном сохранении к ним чувствительности или незначительном повышении значения МПК препарата in vitro, что вызывает необходимость введения дополнительного бактериологического контроля на фоне лечения (на 2-3 день) со своевременной заменой этиотропного средства.

Налидиксовая кислота так же, как и рифампицин, на наш взгляд, не может служить средством монотерапии холеры. Однако эти препараты могут применяться в комбинации с другими, обеспечивающими синергидный характер действия.

Антибиотикограмма эпидзначимых штаммов холерного вибриона остается основой для выбора наиболее эффективного препарата для этиотропной терапии холеры. Однако, как показали наши эксперименты, чувствительность in vitro к антибактериальным препаратам не может считаться абсолютным критерием их терапевтической активности при лечении инфекции. Необходимость повышения достоверности получаемых результатов требует оптимизации условий определения антибиотикограммы, критериев оценки полученных результатов и их интерпретации.

Для получения адекватных данных при определении антибиотикограммы микроорганизмов необходимо выполнение основных условий: а) использование стандартных питательных сред (за рубежом это среда Мюллера - Хинтона); б) стандартных условий определения; в) использование контрольного (референтного) антибиотикочувствитель-ного тест - штамма именно этого вида возбудителя; г) применение для интерпретации результатов Критериев оценки чувствительности/устойчивости, адаптированных для данной нозологической формы.

Учитывая, что бактериологические лаборатории ЦГСЭН и бактериологические группы Специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ), к сожалению, не могут быть обеспечены стандартными питательными средами, а на разных сериях питательных сред значения МПК могут колебаться в 4 - 8 раз (наши наблюдения), нами отобран в качестве контрольного заведомо чувствительный штамм V. cholerae поп 01 Р - 9741, рекомендуемый также и для проверки питательных сред (Инструкция по организации и проведению противохолерных мероприятий, 1995). Использование его в опытах одновременно с клиническими изолятами холерного вибриона позволяет повысить достоверность результатов при определении антибиотикограммы.

Зарегистрированное в наших экспериментах снижение терапевтической активности некоторых антибактериальных препаратов или полная утрата их эффективности in vivo при повышении значений МПК до уровня, не позволяющего отнести исследуемые штаммы к разряду устойчивых (Сидоренко С.В., Колупаев В.Е., 1999; Statement CA-SFM, 1996), заставило нас адаптировать пограничные значения МПК некоторых препаратов (фторхинолонов, фуразолидона, цефалоспоринов III поколения, тетрациклинов, триметоприма/сульфаметоксазола) применительно к холерному вибриону. Разработаны оценочные таблицы с пограничными значениями МПК 21 препарата для разграничения чувствительных и устойчивых штаммов возбудителя, в которых также даны значения МПК для чувствительного штамма V.cholerae поп 01 Р -9741 на среде Мюллера-Хинтона рН 7,4, агаре Хоттингера рН 7,8 и агаре АГВ + 1% пептона рН 7,8.

Для определения антибиотикограммы холерного вибриона оптимальным является метод серийных разведений, который при сравнительном изучении антибиотикочувствительности контрольного штамма V. cholerae поп 01 Р 9741 и коллекции штаммов холерного вибриона (чувствительных и устойчивых) позволял на трех питательных средах с использованием оценочной таблицы разделять штаммы чувствительные, устойчивые и штаммы с повышенными значениями МПК (промежуточные). Выявление штаммов с промежуточной устойчивостью требует внимания бактериологов, инфекционистов и эпидемиологов, т. к. неадекватная терапия в этом случае может привести к формированию выраженной устойчивости к антибиотику. На необходимость использования именно метода серийных разведений препаратов в плотной питательной среде для определения антибиотикограммы холерного вибриона указывала еще З.В. Ермольева с соавт. (1968, 1971); диско -диффузионный метод может быть использован только в качестве ориентировочного.

Совместно с Государственным научным центром по антибиотикам

С.В.Сидоренко) и Российской медицинской академией последипломного образования (Е.А. Ведьмина) нами разработаны "Методические рекомендации по определению антибиотикограммы холерного вибриона", одобренные Ученым Советом (протокол N 6 от 5 июня 2000г.) и утвержденные директором Ростовского НИПЧИ.

Оптимизация методов определения антибиотикограммы эпидзначи-мых штаммов холерного вибриона, критериев оценки их чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам, интерпретация результатов в сравнении с контрольным чувствительным штаммом V.cholerae поп 01 Р - 9741 может способствовать не только оптимальному выбору средств этиотропной терапии, но и использованию антибиотикограммы в качестве более достоверного эпидемиологического маркера для выявления источника инфекции, путей и факторов ее распространения в динамике эпидемического процесса (Методическое руководство ., 1991; Габрилович И.М. и др., 1998; Решедько Г.Н., 1999 и др.).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шутько, Анжела Георгиевна, Ростов-на-Дону

1. Авроров В.П., Саямов P.M., Илюхин В.И. и др. К вопросу о факторах, способствующих развитию экспериментальной холеры у щенков // Бюл. экспер. биол. и мед. 1972. - N 6. - С. 18-20.

2. Авроров В.П., Саямов P.M., Илюхин В.И. и др. Экспериментальная модель холеры на щенках // Пробл. особо опасн. инф. -Саратов, 1972. N 6(28). - С. 91-96.

3. Алиханян С.И., Товмасян К.Н., Северина И.А. Генетическое и физиологическое исследование рифампициноустойчивых РНК-по-лимеразных мутантов E.coli К-12 // Генетика. 1972. - N 10. - С. 112-119.

4. Антимикробная терапия. Карманный справочник / Дж. Сэн-форд, Д. Гилберт, Дж. Гербердинг, М. Сэнде. М.: Практика, 1996. - 220с.

5. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина, 1971.255с.

6. Белобородова Н.В., Падейская Е.Н., Бирюков А.В. Фторхи-нолоны в педиатрии за и против // Педиатрия. - 1996. - N 2. -С.76-84.

7. Бондарева Н.С., Буданов С.В. Новые фторхинолоны: особенности антимикробного действия и фармакокинетика // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - N 8. - С. 28-33.

8. Бородько С.Л. Чувствительность к антибиотикам вибрионов, выделенных в одном из очагов Нижнего Поволжья в 1970-1971гг. // Вопр. противоэпидем. защиты. М., 1972. - Вып. 21. - С. 264-270.

9. Боярский А. Я. Статистические методы в экспериментальных/медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1955. - 262 с.

10. Буданов С.В. Цефтибутен (цедекск) новый цефалоспорин III поколения для приема внутрь: значение в терапии бактериальных инфекций // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - N 4. - С. 33-39.

11. Бургасов П.Н. Холера Эль-Тор /руководство для врачей. -М.: Медицина, 1971. 264с.

12. Ведьмина Е.А., Горелов A.JI., Шендерович В.А., Хайтович А.Б. Динамика изменения антибиотикочувствительности холерных вибрионов // Матер. VII съезда Всерос. об.-ва эпидемиол., микроби-ол. и паразитол.-М., 1997.-Т.2.-С.334-335.

13. Габрилович И.М., БаковаФ.Г., Накова Л. В., Цуканова A.M. Эпидемиологические маркеры возбудителей госпитальных инфекций // Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии: Тез. докл. науч. конф. С.- Петербург, 1998. - С. 17.

14. Генес B.C. Таблицы достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям / Пособие по стат. обработке результатов наблюдений и опытов в медицине и биологии. -М.: Медицина,1964. 80 с.

15. Говорун В.М., Гущин А.Е., Ладыгина В.Г. и др. 0 формировании резистентности к фторхинолонам у M.hominis и A.laidlawii // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. - N 3. - С. 16-19.

16. Данилкина Е.Б., Смоликова Л.М., Миронова А.В., Санамянц Е.М. Изучение чувствительности патогенных для человека вибрионов к антибактериальным препаратам // Холера: Матер. Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера". Ростов-на-Дону, 1995. - С. 162-165.

17. Ермольева З.В., Ведьмина Е.А. Холера / Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней М., 1964. - Т.VI. - С. 211-254.

18. Ермольева 3.В., Ведьмина Е.А., Гивенталь Н.И. и др. Методы определения чувствительности к антибиотикам холерных вибрионов // Антибиотики. 1968. - Т. 13, N 3. - С. 227-235.

19. Ермольева 3.В., Ведьмина Е.В., Подосинникова Л. С. и др. Чувствительность холерных вибрионов к антибиотикам // Антибиотики. 1969. - Т. 14, N 4. - С. 330-336.

20. Ермольева З.В., Жуков-Вережников Н.Н., Подосинникова Л. С. и др. Чувствительность к антибиотикам вибрионов эль тор, выделенных в 1970г. в различных очагах холеры // Вопр. противоэпи-дем. защиты. М., 1971. - Вып.20. - С. 136-145.

21. Иванов К.С., Фисун В.В., Ходжаев Г.А., Цой В.В. Особенности диагностики и лечения холеры Эль Тор и ее сочетаний с другими инфекционными заболеваниями при вспышке кишечной полиинфекции // Воен.- мед. жур. 1992.- N 6.- 0. 60-64.

22. Инструктивно-методические указания по профилактике, лабораторной диагностике, лечению и борьбе с холерой.- М.:Медицина, 1975.- 168 с.

23. Инструкция по экстренной профилактике и лечению опасных инфекционных заболеваний. М., 1984. - 84 с.

24. Инструкция по организации и проведению противохолерныхмероприятий. М., 1995.-190 с.

25. Карбышев Г. Л., Ломов Ю.М., Терентьев А.Н. и др. Особенности антибактериальной терапии холеры в Дагестане // Журн. мик-робиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - N 2, Приложение. - С. 71-74.

26. Касаткина И.В., Щербанюк А.И., Макаровская Л.Н., Падейская Е.Н. Хромосомная устойчивость чумного микроба к хинолонам // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - N 8. - С. 35-37.

27. Коробкова Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры. -М.: Медгиз, 1959.-304 с.

28. Кузнецова С.М. Ломефлоксацин гидрохлорид (максаквин) -фторхинолон пролонгированного действия (информация для специалистов) //Антибиотики и химиотерапия. 1998. - N 2. - С. 40-41.

29. Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Подосинни-кова Л.С. Характеристика современного этапа в развитии 7 пандемии холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - N 6.- С. 39-42.

30. Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А. и др. Эпидемиологическая обстановка по холере в 90-е годы в мире, странах СНГ и России // Эпидемиол. и инф. бол-ни. 1999. - N 3. - С. 17-21.

31. Лоскутов И.А. Антибактериальные средства // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 13. - С. 853-856.

32. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков: Тор-синг, 1998. - Т. 2. - С. 257-258.

33. Мединский Г.М., Москвитина Э.А. Результаты длительного наблюдения и обследования лиц, перенесших заболевания холерой и вибрионосительство // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1974. -N 2(36). - С. 85-88.

34. Методические рекомендации по выявлению нехолерогенных вибрионов эльтор экспресс-методом in vitro. Ростов-на-Дону,1986. 5 с.

35. Москвитина Э.А. Влияние антибиотиков на длительность выделения холерных вибрионов эльтор у больных холерой и вибрионо-носителей // Вопр. противоэпидем. защиты. М., 1978. - Вып. 28.- С. 408-414.

36. Москвитина Э.А. Некоторые аспекты прогнозирования эпидемиологической ситуации по холере // Диагност., лечение и проф. инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 70-лет. НИИ микробиол. МО РФ. Киров, 1998. - С. 382-383.

37. Навашин С.М., Фомина И.П. Аминогликозиды // Итоги науки и техники. Фармакология. Химиотерапевт.средства. 1978. - Т. 10.- С. 29-54.

38. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотера-пия. М.: Медицина, 1982. - 494 с.

39. Навашин С.М., Сазыкин Ю.О. Антибиотики: новые механизмы передачи резистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1998. -N 6. - С. 3-6.

40. Нью Г.С. Применение новых фторхинолонов // Антибиотики и химиотерапия. 1993. - N 2-3. - С. 8-14.

41. Омариева Э.А., Грижебовский Г.М., Махмудова П.К. и др. Эпидемиологические особенности вспышки холеры в республике Дагестан в 1998г. // Пробл. комиссия "Холера и патоген, для человекавибрионы". Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 34-36.

42. Онищенко Г. Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и др. Холера на Украине и в Молдове в период седьмой пандемии // Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - N 2. - С. 52-57.

43. Орлов В.А., Соколова В.И., Навашин С.М. и др. Эффективность применения отечественного антибиотика рифаметоприма в лечении острых бактериальных пневмоний и хронического бронхита // Тер. архив. 1992. - N 3. - С.26-29.

44. Падейская Е.Н. Фтор-хинолоны и их значение в современной химиотерапии инфекционных заболеваний // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - N 7. - С. 514-521.

45. Падейская Е.Н. Комбинированные антибактериальные препараты на основе производных сульфаниламида и диаминопиримидина // Новые лекарственные препараты. М., 1991. - С. 94-104.

46. Падейская Е.Н. Некоторые вопросы антимикробной терапии кишечных инфекций // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 24. - С. 1602-1609.

47. Падейская Е.Н. Антимикробные препараты в ряду производных сульфаниламида, диаминопиримидина, 5-нитроимидазола, ди-N~окиси хиноксалина // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 21. -С. 1414-1423.

48. Падейская Е.Н. Фторхинолоны: значение, развитие исследований, новые препараты, дискуссионные вопросы // Антибиотики ихимиотерапия. 1998. - N 11. - С. 38-44.

49. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Дифторхинолон ломефлоксадин антимикробный препарат широкого спектра действия // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - N 2. - С. 30-39.

50. Падейская Е.Н. Антимикробные препараты группы фторхинолонов: токсичность, безопасность, побочные реакции, противопоказания // Рус. мед. журн. 1999. - Т. 7, N 10. - С. 470-476.

51. Падейская Е.Н. Антимикробный препарат широкого спектра действия ломефлоксацин (максаквин): итоги 10-летнего применения в клиниках России // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - N 1. -С. 39-44.

52. Парфенов А.И. Микробная флора кишечника и дисбактериоз // Рус. мед. журн.-1998.-Т.6, N 18.- С.1170-1173.

53. Петров В. А. Опыт применения цифрана при холере // Человек и лекарство: VI Рос. науч. конгресс: Тез. докл. М., 1997. -С. 202.

54. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Кудрякова Т. А. и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в России и некоторых странах СНГ в 90-е годы //Холера: Матер. Рос. науч.- практ. конф. по пробл. "Холера". Ростов-на-Дону, 1995. - С.76-79.

55. Поздняков В.П., Быкова М.А., Петрова М.А. и др. Рифам-пицин полусинтетический антибиотик широкого спектра действия // Новые лекарственные препараты. - 1981. - N 8. - С. 2-8.

56. Покровский В.И., Малеев В.В. Холера.- М.: Медицина, 1978. 232с.

57. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры. Саратов: Изд-во Саратов, ун-та, 1988.- 272с.

58. Покровский В.И. Лечение холеры // Рус. мед. журн. -1995. Т. 1, N 2. - С. 26-27.

59. Покровский В.И., Малеев В.В. Актуальные проблемы инфекционной патологии // Эпидемиология и инф. бол-ни. 1999. - N 2.- С. 17-20.

60. Покровский В.И., Черкасский Б. Л. Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней // Эпидемиология и инф. бол-ни. 1999. - N 2 . - С. 12-16.

61. Принципы и практика борьбы с холерой. Женева, ВОЗ, 1971. - 148с.

62. Постников С. С., Семыкин С.Ю., Ефременкова О.В., и др. К вопросу о безопасности офлоксацина // Антибиотики и химиотерапия.- 1999. N 10. - С. 20-21.

63. Постников С.С., Семыкин С.Ю., Капранов Н.И. и др. Эффективность и безопасность ципрофлоксацина при лечении детей с муковисцидозом // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - N 4. - С. 14-17.

64. Постовит В.А. Инфекционные болезни: Руководство. Часть 1. Кишечные инфекции. Холера. С-Петербург: СОТИС, 1997. - С. 135-156.

65. Решедько Г.К. Определение чувствительности к антибиотикам: методы, результаты, оценка // Клиническая антимикробная терапия. 1999. - Т. 1, N 3. - С. 113-115.

66. Руководство по борьбе с холерой /ВОЗ. М: Медицина, 1994. - 72 с.

67. Руководство по противоэпидемическому обеспечению населения в чрезвычайных ситуациях. М., 1995. - 439с.

68. Рыжко И.В, Щербанюк А.И., Мишанькин В.Н., Шишкина С.А. Влияние антибиотикоустойчивости хромосомного типа у чумного микроба на частоту выявления R-трансконъюгантов // Вопр. противоэпи-дем. защиты. М., 1978. - Вып. 28. - С. 34-44.

69. Рыжко И.В., Щербанюк А.И., Самоходкина Э.Д. и др. Вирулентность устойчивых к рифампицину и хинолонам мутантов из штаммов чумного микроба с Fra+ и Fra~ фенотипом // Антибиотики и химиотерапия. 1994. - N 4. - С. 32-36.

70. Рыжко И. В. Экспериментальное обоснование этиотропной терапии чумы // Человек и лекарство: II Рос. науч. конгресс: Тез. докл. М., 1995. - С. 255.

71. Савельев В.Н., Беляев Е.Н., Монисов А.А. и др. Вспышка холеры в одном из центральных районов Дагестана // Журн. микробиол. , эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - N 2, Приложение. - С. 52-56.

72. Сидоренко С.В., Резван С.П., Макарова Р.А. и др. Механизмы устойчивости к хинолонам и современный уровень чувствительности клинически значимых микроорганизмов к офлоксацину // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - N 9. - С.33-38.

73. Сидоренко С.В., Резван С.П., Макаров А.Н., Макарова Р.А. Характеристика антимикробных свойств цефпирома // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - N 12. - С. 7-13.

74. Сидоренко С.В. Ципрофлоксацин в лечении кишечных инфекций бактериальной этиологии // Антибиотики и химиотерапия. -1997. N 6. - С. 26-33.

75. Сидоренко С.В., Яковлев С.В. Бета-лактамные антибиотики // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 21. - С. 1367-1381.

76. Сидоренко С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия // Рус. мед. журн. 1998. - Т. 6, N 11. -С. 717-725.

77. Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. М.: Арина, 1999. - 32 с.

78. Статистические таблицы для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала: Методические рекомендации / Сост. Р.Б. Стрелков. Обнинск, 1980. - 19 с.

79. Страчунекий Л.С., Козлов С.Н. Клиническая фармакология макролидов // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 21. - С. 1392-1404.

80. Страчунский Л.С., Розенсон О.Л. Ступенчатая терапия: новый подход к применению антибактериальных препаратов // Клиническая фармакология и терапия.-1997.-N 6(4).-С. 20-24.

81. Страчунский Л. С. Проблемы и перспективы антибактериальной терапии //Рос. мед. вестн. 1998. - N 1. - С. 23-27.

82. Таисова А. С. Ферменты, инактивирующие аминогликозиды: современное состояние проблемы // Антибиотики и химиотерапия. -1990. N 6. - С. 51-55.

83. Турьянов М.Х., Царегородцев А.Д., Петров В.А. и др. Организация медицинских мероприятий по ликвидации крупного очага холеры в Дагестане // Эпидемиология и инф. бол-ни. 1996. - N 3. - С. 15-17.

84. Тынкевич Н.К., Павлович Н.В., Рыжко И.В. Сравнительное изучение эффективности амикацина и стрептомицина при экспериментальной туляремии // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - N 8. -С. 35-37.

85. Ухин А. В. Значение аминогликозидных антибиотиков в современной терапии инфекционно-воспалительных заболеваний // Антибиотики и химиотерапия. -1991. N 11. - С. 42-45.

86. Фомина И.П. Современные аминогликозиды. Значение в инфекционной патологии, особенности действия // Рус. мед. журн.-1997. Т. 5, N 21.- С. 1382-1391.

87. Хайтович А.Б., Ведьмина Е.А., Шендерович В.А., Горелов А.Л. Динамика изменений антибиотикочувствительности холерных вибрионов 01, выделенных из объектов окружающей среды // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - N б. - С. 29-33.

88. Хайтович А.Б. Чувствительность к антибиотикам холерных вибрионов 01, выделенных от людей // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - N 3. - С. 14-18.

89. Хайтович А.Б. Распространение 7-ой пандемии холёры на Украине // Пробл. комиссия " Холера и патоген, для человека вибрионы". Ростов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 32-35.

90. Черномордик А.Б. Применение антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов: Справочник. Киев, 1988. - 320 с.

91. Эпидемиологический надзор за лекарственной устойчивостью основных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний и тактика антибактериальной терапии (методическое руководство). М., 1991. - 72 с.

92. Эпидемиологический надзор за холерой в СССР / Г.М Мединский, М.И. Наркевич, В.П. Сергиев, А.К. Адамов.- М.: Медицина, 1989. 144 с.

93. Яковлев В.П. Антибактериальная химиотерапия в неинфекционной клинике: новые бета-лактамы, монобактамы и хинолоны // Итоги науки и техники. Фармакология. Химиотерапевт, средства. -М.: ВИНИТИ, 1992. Т.20. - 202 с.

94. Яковлев В.П. Антибактериальные препараты группы фторхинолонов// Рус. мед. журн. 1997. - Т.5, N 21. - С. 1405-1413.

95. Яковлев С.В.,Яковлев В.П. Краткий справочник по антимикробной химиотерапии. М.: Медицина, 1998. - 97 с.

96. Acocella G., Scotti R. Kinetic studies on the combination rifampicin trimethoprim in man // J. Antimicrob. Chemother. - 1976. - Vol. 2, N 3. - P. 271-277.

97. Alam A.N., Alam N.H., Ahmed Т.,Sack D.A. Randomized double blind trial of single dose doxycycline for treating cholera in adults // Brit. Med. J. 1990. - Vol.300, N 6740. - P. 1619-1622.

98. Aldighieri S., Pesantes C., Vela E. The status of antibiotic sensitivity of Vibrio cholerae 01 in Ecuador (letter) // Med. Trop. 1997. - Vol. 57, N 1. - P. 98.

99. Amyes S.G.B. The success of plasmid -encoded resistance genes in clinical bacteria. An examination of plasmid-mediated ampicillin and trimethoprim resistance genes and their resistance mechanisms // J. Med. Microbiol. 1989. - Vol. 28, N 2. - P. 73-83.

100. Bergan Т., Lolekha S., Cheong M.K. et al. Effect of recent antibacterial agents against bacteria causing diarrhoea // Scand. J. Infect. Dis. 1988. - Vol. 56, Suppl. - P. 7-10.

101. Bhatia R.S. Typhoid fever not responding to ciprofloxacin therapy // Assoc. Physicians India. 1992. - Vol. 40. - P. 705-706.

102. Bhattacharya S.K., Dutta P., Dutta D. et al. Relative efficacy of trimethoprime sulfamethoxazole and nalidixic acid for acute invasive diarrhea // Antimicrob. Ag. Chemother. - 1987. - Vol. 31, N 5. - P. 837.

103. Bhattacharya S.K., Bhattacharya M.K., Dutta P. et al. Double-blind, randomized, controlled clinical trial, of norfloxacin for cholera // Antimicrob. Ag. Chemother. 1990. - Vol. 34, N 5. - P. 939-940.

104. Bougoudogo F., Fournier J.M., Gastellu-Etchegorry M. et al. Resistance de Vibrio cholerae 01 au compose 0/129 et multire-sistance aux antibiotiques // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1992. -Vol. 85, N 2. - P. 136-141.

105. Bryan L.E. Two forms of antimicrobial resistance: bacterial persistence and positive functions resistance // J. Antimicrob. Chemother. 1989. - Vol. N 23, N 6. - P. 817-823.

106. Bryan J.P., Waters C., Sheefield J. et al. In vitro activities of tosufloxacin and A-56620 against pathogens of diarrhea // Antimicrob. Ag. Chemother. 1990. - Vol. 34, N 2. - P. 368-370.

107. Burrows W., Musteikis C.M. Cholera infection and toxin in the rabbit ileal loop // J. Infect. Dis. 1966. - Vol. 116, N 2. - P. 183-190.

108. Burrows W., Sack R.B. Animal models of cholera // Cholera. Ch. 9 / Eds. D. Barua, W. Burrows. - Philadelphia, London, Toronto, 1974. - P. 189-205.

109. Busto R. An overview of of the newer antibiotics // Henry Ford Hosp. Med. J. 1984. - Vol. 32, N 2. - P. 90-98.

110. Butler Т., LolekhaS., Rasidi C. et al. Treatment of acute bacterial diarrhea: a multicenter international trial comparing placebo with fleroxacin given as a single dose or once daily for 3 days // Amer. J. Med. 1993.- Vol. 94, N ЗА. - P. 187-194.

111. Carpenter C.C., Sack R.B., Wells S.A. et al. Clinical evaluation of fluid requirements in asiatic cholera // Lancet. -1965. N 7388. - P. 726-727.

112. Cavallo J.D., Dubrous P., Talarmin A., Niel L. Antibiotic sensitivity to epidemic strains of Vibrio cholerae and Shigella dysenteriae 1 isolated in Rwandan refugee camps in Zaire // Med. Trop. 1995. - Vol. 55, N 4. - P. 351-353.

113. Chakrabarti M.K., Bhattacharya M.K., Sinha A.K. et al. Evaluation of the efficacy of different antibiotics in inhibiting colonization of Vibrio cholerae 01 in the rabbit intestine // Zbl. Bakt. 1993. - Bd. 278, H. 1.- S.69-72.

114. Davis R., Markham A., Balfour J.A. Ciprofloxacin: An updated review of its pharmacology, therapeutic efficacy and to-lerability // Drugs. 1996. - Vol. 51 . - P. 1019-1074.

115. De S.N., Chattergee D.N. An experimental study of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane // J. Pathol. Bacteriol. 1953. - Vol. 66, N 2. - P. 559-562.

116. De S.N. Cholera: Its pathology and pathogenesis. London, 1961. - 141 p.

117. De S., Chaudhuri A., Dutta P. et al. Доксициклин при лечении холеры // Бюл. ВОЗ. 1977. - Т. 54, N 2. - С. 730-732.

118. De Pina J.J., Rault J.P., Boutin J.P. et al. Deductions epidemiologiques et prophylactiques des etudes bacteriologiques de souches de Vibrio cholerae 01 isolees au Rwanda // Med. Trop. 1994. - Vol. 54, N 3. - P. 277.

119. Dette G.A., Knothe H. In vitro Bewertung von Lomefloxa-cin // Arzneimittelforschung. 1989. - Vol. 39, N 8. - P. 832-835.

120. Doganci L., Gun H., Baysallar M. et al. Short-term qui-nolones for successful eradication of multiple resistant Vibrio cholerae in adult patients // Scand. J. Infect. Dis. 1995. -Vol. 27, N 4. - P. 425-426.

121. Dragunsky E.M., Rivera E., Aaronson W. et al. Experimental evaluation of antitoxic protective effect of new cholera vaccines in mice // Vaccine. 1992. - Vol. 10, N 11. - P. 735-736.

122. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemohterapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - Vol. 10, N 1. - P. 153-159.

123. Dutta D., Nair G.B., Mukhopadhyay A.K. et al. Efficacy of norfloxacin and doxycycline for treatment of Vibrio cholerae 0139 infection // J. Antimicrob. Chemother. 1996. - Vol. 37, N 3. - P. 575-581.

124. Felsenfeld 0. A review of recent trends in cholera research and control // Bull. WHO. 1966. - Vol. 34, N 2. - P. 161-165.

125. Ferreira E., Costa M., Vaz Pato M.V. Resistance aux an-tibiotiques de souches de Vibrio cholerae isolees en Angola // Pathol. Biol. 1992. - Vol. 40, N 5. - P. 561-565.

126. Finch M.J., Morris J.G., Kaviti J. et al. Epidemiology of antimicrobial resistant cholera in Kenya and east Africa // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1988. Vol. 39, N 5. - P. 484-490.

127. Fisher-Hoch S.P., Khan A., Inam-ul-Haq et al. Vibrio cholerae in Karachi, Pakistan // Lancet. 1993. - Vol. 342, N 8884. - P. 1422- 1423.

128. Francis T.I., Lewis E.A., Oyediran A.B. et al. Effect of chemotherapy on the duration of diarrhoea, and on vibrio excretion by cholera patients // J. Trop. Med. Hyg. 1971. - N 74. - P.172- 176.

129. Freter R. Experimental enteric Shigella and Vibrio infections in mice and guinea pigs // J. Exp. Med. 1956. - Vol. 104, N 3. - P. 411-418.

130. Gootz T.D., Briqhty K.E. Fluoroquinolone antibacteri-als: SAR, mechanism of action, resistance, and clinical aspects // Med. Res. 1996. - Vol. 16. - P. 433-486.

131. Gotuzzo E., Seas C., Echevarria J. et al. Ciprofloxacin for the treatment of cholera: a randomized, double-blind, controlled clinical trial of a single daily dose in Peruvian adults

132. Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol. 20, N 6. - P. 1485-1490.

133. Gould J.M., Wise R. Third generation cephalosporins // Brit. Med. J. 1985. - Vol. 290, N 6472. - P. 878-879.

134. Ghosh S., Sengupta P.G., Gupta D.N., Sirkar B.K. Che-moprophylaxis studies in cholera: A review of selective works // J. Commun. Dis. 1992. - Vol. 24, N 1. - P. 55-57.

135. Gilbert D., Moellering R., Sande M. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy // Antimicrobial Therapy, Inc., 1999.- 141 p.

136. Graninger W., Burgmann H., Laferl H., Zedtwitz-Liebens-tein K. Quinolones in gastrointestinal infections // Chemotherapy. 1996. - Vol. 42, Suppl. 1. - P. 43-53.

137. Green S., Tillotson G. Use of ciprofloxacin in developing countries // Pediatr. Infect. Dis. J. 1997. - Vol. 16, N 1.- P. 150-159.

138. Greenough W.B., Gordon R.S., Rosenberg I.S. et al. Tetracycline in the treatment of cholera // Lancet. 1964. - P. 355-357.

139. Griffits J.J. Laboratory studies of the effect of sulfonamide drugs on Vibrio cholerae // Publ. Hlth. Rep. 1942. -Vol. 57. - P. 814.

140. Groot de R. Место новых антибиотиков в лечении бактериальных инфекций у детей // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, N 1. -С. 14-19.

141. Gruneberg R., Emmerson A. Prevention of emergence of bacterial resistance by combination of two antibiotics: rifampi-cin and trimethoprim // J. Antimicrob. Chemother. 1980. - Vol. 6, N 3. - P. 349-356.

142. Habiyaremye I., Yerbist L., Vandepitte J. Activite com-paree in vitro de dix nouvelles 4-quinolones sur les bacteries enteropathogenes // Pathol. Biol. 1987. - Vol. 35, N 5 BIS. -P.860-864.

143. Herbert D. Streptomycin in experimental plague // Lancet. 1947. - Vol. 252, N 6454. - P. 626-630.

144. Hirschhorn N., Pierce N., Kobari K., Carpenter C.C. The treatment of cholera // Cholera. Ch. 12 / Eds. D. Barua, W. Burrows.- Philadelphia, London, Toronto, 1974. - P. 235-252.

145. Hooper D.C., Wolfson J.S. Fluoroquinolone antimicrobial agents // New Engl. J. Med. -1991. Vol.324. - P. 384-394.

146. Islam M.R. Single dose tetracycline in cholera // Gut.- 1987. Vol. 28, N 8. - P. 1029-1032.

147. Jesudason M.V., John T.J. Transferable trimethoprim resistance of Vibrio cholerae 01 encountered in southern India // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol. 84, N 1. - P. 136-137.

148. Jesudason M.V., Saaya R. Resistance of Vibrio cholerae 01 to nalidixic acid // Indian. J. Med. Res. 1997. - Vol. 105.- P. 153-154.

149. Jones K., Felmingham D., Ridgway G. In vitro activity of azithromycin (CP-62, 993), a novel macrolide, against enteric pathogens // Drugs Exp. Clin. Res. 1988. - Vol. 14, N 10. - P.613.615.

150. Kabir I., Alam A.N., Mitra A.K. et al. Erythromycin and trimethoprim sulphamethoxazole in the treatment of cholera in children // J. Diarrhoeal. Dis. Res. - 1996. - Vol. 14, N 4. - P. 243-247.

151. Kaper J.В., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 8, N 1. - P. 48-86.

152. Karchmer A.W., CurlinG.T., HuqM. I., Hirschhorn N. Лечение холеры у детей фуразолидоном // Бюл. ВОЗ. 1971. - Т. 43, N 3. - С. 400-406.

153. Kerry D.W., Hamilton-Miller J.M.T., Brumfitt W. Trimethoprim and rifampicin: in vitro activities separately and in combination // J. Antimicrob. Chemother. 1975. - Vol.1, N 4. - P. 417-427.

154. Kruse H., Olsvik 0., Tenover F.C., Sorum H. A transferable multiple drug resistance plasmid from Vibrio cholerae 01 // Microb. Drug Resist. 1995. - Vol. 1, N 3. - P. 203-210.

155. Kuwahara S., Goto M., Kimura M., Abe H., Drug sensitivity of El Tor Vibrio strains isolated in the Philippines in 1964 and 1965 // Bull. WHO. 1967. - Vol. 37, N 5. - P. 763-771.

156. Kuwahara S., Yokota Т., Kanoh T. Recent trend of drug-resistance plasmids (R) in Vibrio cholerae // Proc. of the 15th Joint Conf. US Japan Cooperative Medical Science Program,cholera Panel. Bethesda, 1980. - P. 237-241.

157. Lalitha M.K., Nisha A.K., Bhattacharya S.S. et al. Susceptibility pattern of bacterial isolates to lomefloxacin // Indian J. Med. Res. 1990. - Vol. 91. - P. 182-184.

158. Lamanna A., Orsi A. In vitro activity of rifaximin and rifampicin against some anaerobic bacteria // Chemioterapia. -1984. N 3. - P. 365-367.

159. Launay 0., Nguyen Van J.C., Buu-Hoi A., Acar J.F. Typhoid fever due to a Salmonella typhi strain of reduced susceptibility to fluoroquinolones // Clin. Microbiol. Infect. 1997. -Vol. 3. - P. 541-544.

160. Leon F., Calleja C., Mirillo H. et al. Cholera and myocarditis a case report // Angiology. - 1997. - Vol. 48, N 6. -P. 545-549.

161. Levy S.B. Evolution and spread of tetracyclin resistance determinants // J. Antimicrob. Chemother. 1989. - Vol. 24, N 1. - P. 1-7.

162. Limon L. Ciprofloxacin: a fruoroquinolone antimicrobial. Part 2 // Amer. Pharm. 1989. - Vol. 29, N 7. - P. 60-63.

163. Lontie M. Les nouvelles quinolones // J. Pharm. Belg. -1989. Vol. 44, N 4. - P. 292-301.

164. Maggi P., Carbonara S., Fico C. et al. Epidemiological, clinical and therapeutic evaluation of the Italian cholera epidemic in 1994 // Eur. J. Epidemiol. 1997. - Vol. 13, N 1. - P. 95-97.

165. Mahalanabis D., Faruque A.S.G., Albert M.J. et al. An epidemic of cholera due to Vibrio cholerae 0139 in Dhaka, Bangladesh: clinical and epidemiological features // Epidemiol. Infect. 1994. - Vol. 112, N 3. - P. 463-473.

166. March T.D. The cephalosporin antibiotic agents III. Third generation cephalosporins // Infect. Contr. - 1985. - Vol. 6, N 2. - P. 78-83.

167. MateruS.F., LemaO.E., Mukunza H.M. et al. Antibiotic resistance pattern of Vibrio cholerae and Shigella causing diarrhoea outbreaks in the eastern Africa region: 1994-1996 see comments. // East Afr. Med. J. 1997. - Vol. 74, N 3. - P. 193-197.

168. Mayer K.H. Review of epidemic aminoglycoside resistance worldwide // Amer. J. Med. 1986. - Vol. 80, N 6B. - P. 56-64.

169. Mhalu F.S., Mmari P.W., Io'umba J. Rapid emergence of El Tor Vibrio cholerae resistant to antimicrobial agents during first six months of fourth cholera epidemic in Tanzania // Lancet. 1979. - N 8112. - P. 345-347.

170. Moellering R.C. Norfloxacin: a fluoroquinolone carboxy-lic acid antimicrobial agent // Amer. J. Med. 1987. - Vol. 82, N 6B. - P. 1-2.

171. Mukhopadhyay A.K., Basu I., Bhattacharya S.K. et al.

172. Emergence of fluoroquinolone resistance in strains of Vibrio cholerae isolated from hospitalized patients with acute diarrhea in Calcutta, India // Antimicrob. Ag. Chemother.-1998. Vol. 42, N 1. - P. 206-207.

173. Munshi M.H., Sack D.A., Haider K. et al. Plasmid-media-ted resistance to nalidixic acid in Shigella dysenteride type I // Lancet 1987. - N 8556. - P. 419-421.

174. Murray B.E. Quinolones and the gastrointestinal tract // Eur. J. Clin. Microbiol. Infec. Dis. 1989. - Vol. 8, N 12. -P. 1093- 1102.

175. Nagao I. Comparative study of roseomycin, streptomycin, chloramphenicol and homosulfanilamide on the effect of experimental cholera infections // Tohoku J. Exp. Med. 1953. - Vol. 58, N 2. - P. 191.

176. New H.C. Pathophysiologic basis for the use of third-generatoin cephalosporins // Amer. J. Med. 1990. - Vol. 88, N 4A. - P. 3-12.

177. Nguen Van J.-C., Soldstein F.W. Low-level resistance to fluoroquinolones among Salmonella and Shigella // Clin. Microbiol. Infect. 2000. - Vol. 6. - P. 231.

178. Nicolic S., Vuo'osevic M., Dulovic 0., Sasic M. Current role of cefotaxim in treatment bacterial infections // 6th International Congress for Inf. Dis. Prague, 1994. - P. 62.

179. Ouelette M., Gerbaud G., Courvalin P. Genetic, biochemical and molecular characterization of strains of Vibrio cholera multiresistant to antibiotics // Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. -1988. Vol. 139, N 1. - P. 105-114.

180. Paget J.E., Barnes Y.M. Toxicity tests // Evaluation ofdrug activities pharrnacometric. London, 1964. - Vol. 1. - P. 135-167.

181. Pallett A.P., Smyth E.G. Clinicians guide to antibiotics. Tetracycline // Brit. J. Hosp. Med. 1988. - Vol. 40, N 5. - P. 385-390.

182. Phillips J., King A., Shannon K. Prevalence and mechanisms of aminoglycide resistance. A ten-year study // Amer. J. Med. 1986. - Vol. 80, N 6B. - P. 38-55.

183. Phillips J., King A. Comparative activity of the 4-qui-nolones // Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol. 10, N 1. - P. 70-76.

184. Piddock L.J.V., Wise R. Mechanisms of resistance to qu-inolones and clinical perspectives // J. Antimicrob. Chemother.-1989. Vol. 23, N 4. - P. 475-483.

185. Piddock L.J.V. Mechanisms of resistance to fluoroquinolones: State-of-theart 1992-1994 // Drugs. 1995. - Vol. 49, Suppl. 2. - P. 29-35.

186. Pierce N.F., Banwell J.G., Mitra R.C. et al. Controlled comparison of tetracycline and furazolidone in cholera // Brit. Med. J. 1968. - N 5613. - P. 277-280.

187. Pollitzer R. Cholera. Ch. 9. Symptomatology, diagnosis, prognosis and treatment // WHO, Geneva. 1959. - P. 766-781.

188. Prescott L.M., Datta A., Datta G.C. Patterns of in vitro sensitivity in Calcutta strains of Vibrio cholerae // Bull. WHO. 1968. - Vol. 39, N 6. - P. 967-970.

189. Prieur D. Actualite des Sephalosporines // Concours med. 1982. - Vol. 104, N 1/2. - P. 65-72.

190. Rabbani G.H., Islam M.R., Butler T. et al. Single-dose treatment of cholera with furazolidone or tetracycline in a double-blind randomized trial // Antimicrob. Ag. Chemother. 1989. -Vol. 33, N 9. - P. 1447-1456.

191. Rabbani G.H., Butler Т., Shahrier M. et al. Efficacy of a single dose of furazolidone for treatment of cholera in children // Antimicrob. Ag. Chemother. 1991. - Vol. 35, N 9. -P.1864-1867.

192. Rahal K. Comparative activities in vitro of 4 quinolo-nes (nalidixic acid, pefloxacin, norfloxacin, ofloxacin) on 13 bacterial species // Arch. Inst. Pasteur. Algerie. 1992. - Vol. 58. - P. 41-84.

193. Rolinson G.N. Beta-lactamase induction and resistance to beta-lactam antibiotics // J. Antimicrob. Chemother. 1989. -Vol. 23, N 1. - P. 1-2.

194. Ronald A.R., Turek M., Petersdorf R.Y. A critical evaluation of nalidixic acid in urinarytract infections // New Eng. J. Med. 1986. - Vol. 275. - P.181.

195. Rosenstiel N., Adam D. Quinolone antibacterials. An Update of their pharmacology and therapeutic use // Drugs. 1994. - Vol. 47. - P. 872-902.

196. Rowe В., Ward L.R., Threlfall E.J. Ciprofloxacin and typhoid fever // Lancet. 1992. - Vol. 339. - P. 740.

197. Roy S.K., Islam A., Ali R. et al. A randomized clinical trial to compare the efficacy of erythromycin, ampicillin andtetracycline for the treatment of cholera in children // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1998. - Vol. 92, N 4. - P. 460-462.

198. Sack R.B., Carpenter C.C. Experimental canine cholera. I. Development of the model // J. Infect. Dis. 1969. - Vol. 119, N 2. - P. 138-149.

199. Sack R.B., Miller C.E. Progressive changes in vibrio serotypes in germ-free mice infected with Vibrio cholerae // J. Bacterid. 1969. - Vol. 99. - P. 688-695.

200. Sal am M. A., KanW.A., Begum M. et al. Antimicrobial treatment of cholera // Drugs. 1995. - Vol. 49, Suppl. 2. -P.466-469.

201. Sanders C.C. Ciprofloxacin: in vitro activity, mechanism of action and resistance // Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol-. 10, N 2. - P. 516-527.

202. Segreti J., Goodman L.G., Nelson J. et al. Comparative in vitro activity of temafloxacin and difloxacin against bacterial enteric pathogens // Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol. 11, Suppl. 5. - P. 1380-1381.

203. Seijo A.C., Martino O.A., Torres M.F. et al. Norfloxacin monodose use in patients with cholera in Salta Argentina // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo.-1996. Vol. 38, N 3. - P. 217-219.

204. Sow A. I., Komo A., Dia N.M. et al. Bacterial diversity during the cholera epidemic in Dakar, Senegal ( 1995-1996) // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1997. - Vol. 90, N 3. - P. 160-161.

205. Stahlmann R., Kemmerich В., Lode H. Fluoroquinolone. 1. Chemische Struktur, Wirkungs-mechanismus und antibacterielle Ak-tivitat // Dtsch. Med. Wschr. -1988. Bd. 113, H. 16. - S.648.651.

206. Statement 1996 CA SFM. Zone sizes and MIC breakpoints for non-fastidious organisms // Clin. Microbiol. Infect.- 1996.-Vol. 2, Suppl. 1. - P. 46-49.

207. Steward D., Ebee J.N. Interaction between rifampicin and trimethoprim // J. Antimicrob. Chemother. 1979. - Vol. 5, N 1. - P. 114-115.

208. Swerdlow D.L., Ries A.R. Vibrio cholerae non-01 the eighth pandemic? // Lancet. - 1993.- Vol. 342, N 8868. - P. 382-383.

209. Thomson T.D., Quay J.F., Webber J.A. Cephalosporin group of antimicrobial drugs // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1984. -Vol. 185, N 10. - P. 1109-1114.

210. Todd P.F., Faulds D. Ofloxacin. A reappraisal of its antimicrobial activity, pharmacology and therapeutic use // Drugs. 1991. - Vol. 42. - P. 825-876.

211. Towner К. I., Pearson I., 0'Grady F. Resistant Vibrio cholerae el tor in Tanzania // Lancet. 1979. - P. 147-148.

212. Tsukamura M. The pattern of resistance development to rifampicin in Mycobacterium tuberculosis // Tubercle. 1972. -Vol. 53, N 2. - P. 111-117.

213. Umasankar S., Wall R. A., Berger J. A case of ciproflo-xacin-resistant typhoid fever Communicable Disease Report // CDR

214. Rev. 1992. - N 2. - R. 139-140.

215. Usubutun S., Turkyilmaz R., Diri C., Agalar C. Single dose ciprofloxacin in cholera // Eur. J. Emerg. Med. 199?. -Vol. 4., N 3. - P. 145-149.

216. Vandepitte J. La prevention et le traitement de la di-arrhee des voyageurs // Rev. med. Liege. 1988. - Vol. 43, N 3.- P. 93-97.

217. Venturini A.P., Marchi E. In vitro and in vivo evaluation of L/105, a new topical intestinal rifamycin // Chemiotera-pia 1986. - N 5. - P. 257-262.

218. Verghese S.I. A protracted outbreak of cholera at Porur- a suburb of Madras City // J. Commun. Dis. 1993. - Vol. 25, N4. P. 207-209.

219. Vijayalakshmi N., Badrinath S., Rao R.S. Minimum inhibitory concentration (MIC) of some antibiotics against Vibrio cholerae 0139 isolates from Pondicherry // Epidemiol. Infect. -1997. Vol. 119, N 1. - P. 25-28.

220. Watanakunakorn C., Kauffman C.A. In vitro susceptibility of gentamicin and/or tobramycin resistant gram-negative bacilli to seven aminoglycosides // Infection. 1978. - Vol. 6, N 3.- P. 111-115.

221. Wiedemann B., Heisig P. Mechanisms of quinolone resistance // Infection. 1994. - Vol. 22, Suppl. 2. - P. 73-79.

222. Willke A., Arman D., Cokca F. et al. Resistance of Salmonella and Shigella // Clin. Microbiol. Infect. 1999. - Vol.5. P. 588-590.

223. Weekly Epidemiological Record // WHO, 6enewa. 1999. -Vol. 74, N 14-46.- 190

224. Yamamoto Т., Nair.B., Albert M.J. et al. Survey of in vitro susceptibilities of Vibrio cholerae 01 and 0139 to antimicrobial agents // Antimicrob. Ag. Chemother. 1995. - Vol. 39, N 1. - P. 241-244.

225. Young L.S., Hindler J. Aminoglycoside resistance: a worldwide perspective // Amer. J. Med. 1986. - Vol. 80, N 6B.- P. 15-21.

Информация о работе

Шутько, Анжела Георгиевна
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Совершенствование подходов к выбору средств этиотропной терапии холеры - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы