Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета

Омельченко, Наталья Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета"

На правах рукописи

ОМЕЛЬЧЕНКО НАТАЛЬЯ ДМИТРИЕВНА

ВЛИЯНИЕ СПОСОБА ВВЕДЕНИЯ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА И ЕГО ТОКСИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ И ЦИТОКИНОВУЮ РЕГУЛЯЦИЮ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА

03.00.07 — микробиологи» 14.00.36 — аллерголога ■ ююуяолопн

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

г. Ростов-на-Дону

2005 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском — на — Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Васильева Галина Ивановна доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Козловский Виктор Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Тервовская Лариса Николаевна доктор биологических наук, профессор Алексеева Людмила Павловна

Ведущая организация: ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится «f4 » октября_2005 г. в И30 часов

на заседании диссертационного совета Д 208. 082. 01 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, Ростов-на-Дону, пер. Нахиче-ванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « 13 » сентября_2005г.

Учёный секретарь диссертационного совета, профессор

Н.Я Корганов

Актуальность проблемы. Прошло более века после первой попытки вакцинации против холеры в Испании, но до настоящего времени нет достаточно эффективной и безопасной вакцины (Fournier J.M., 1998).. Даже открытие холерного токсина (XT) - основного антигена (Аг) Vibrio choleras - не обеспечило решения этой проблемы (Finkelstein R.A., 1995), которая продолжает оставаться актуальной, так как ежегодно в ВОЗ приходят сообщения о заболевании этой инфекцией.

Искусственно приобретенный иммунитет в результате специфической профилактики холеры современными препаратами является кратковременным (3-6 месяцев), не обладает противоэпидемической эффективностью и нередко сопровождается вторичным иммунодефицитом (ИД) (Сомова А.Г. с соавт., 1980; Герасимова К.И. с соавт., 1991; Woogen S.D. et al., 1987; Elson C.O. et al., 1995). Это подтверждают исследования многих учёных, в том числе ростовской школы—Сомовой А.Г. и саратовской— Герасимовой К.И.

Одной из возможных причин слабой эффективности противохолерных вакцин является неадекватный способ иммунизации. Известно, что наиболее оптимальным способом применения вакцин является их введение через входные ворота инфекции (Манько В.М. с соавт., 2002; Saito Н. et al., 1998; Liang W. et al., 2003; Uren Т.К. et al., 2005). Именно этим объясняется то, что большинство противохолерных препаратов нового поколения вводится перорально(Тау1ог D.N. et al., 2000; Kim В.О. et al., 2001; Hafid J. et al., 2005). Однако и этот способ, хотя и вызывает более адекватный иммунный ответ, по сравнению с парентеральным введением, не является оптимальным, так как может приводить к формированию оральной толерантности (Kato Н. et al., 2001; Lycke N., 2005).

Вместе с тем напряженный и длительно сохраняющийся иммунитет против холеры возможен, так как заболевание холерой приводит обычно к формированию эффективного иммунизационного процесса, завершающегося развитием местного и системного, антитоксического и антибактериального иммунитета, обеспечивающего защиту от повторного заражения в течение 3-5 лет (Levine М.М. et al., 1983; Filkenstein R.A. et al., 1995). Следовательно, возможно и создание такого же поствакцинального иммунитета.

В связи с этим ученые многих стран мира, в том числе и России, занимаются проблемой совершенствования специфической профилактики холеры. Решение этой проблемы требует всестороннего изучения тонких механизмов формирования местного противохолерного иммунитета и его особенностей при разных способах введения препаратов, а также выявления иммуномодулирую-щих эффектов отдельных Аг холерного вибриона.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — вьиснение влияния способа введения холерного вибриона и его токрина на адекватность формирования клеточного и гуморального звеньев местного противохолерного иммунитета в слизистой оболочке тонкого кишечника п мышей и особенности

f ОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I

БИБЛИОТЕКА

С1

о»

»t* -- -

ЯЛММ1 ¡

зМ

его регуляции цитокинами.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1 Сравнить влияние разных способов иммунизации на формирование местного клеточного противохолерного иммунитета по показателям количественного состава и функциональной активности популяций и субпопуляций лимфоцитов (Лф) пейеровых бляшек (ГГБ) тонкого кишечника.

2 Изучить особенности формирования гуморального местного иммунитета при разных способах иммунизации по параметрам антител ообразования, итоги -повому спектру и функциональной активности продуцируемых иммуноглобулинов (1§).

3 Изучить динамику изменения продукции важнейших цитокинов иммуно-компетентными клетками (ИКК) ПБ при разных способах иммунизации и оценить регуляторное воздействие этих медиаторов на функциональную активность Т- и В-Лф ПБ и клеток их микроокружения (кишечных макрофагов (Мф) и энтероцитов тонкого кишечника).

4 Выявить возможные механизмы формирования транзиторного поствакцинального ИД при иммунизации противохолерными препаратами.

5 Рекомендовать на основании анализа полученных результатов оптимальный для создания эффективного местного иммунитета способ введения Аг V. сЬо1-егае с целью изучения возможности его применения для профилактики холеры.

6 Наметить перспективные пути коррекции нарушений иммунитета, возникающих в результате вакцинации против холеры, с целью предотвращения развития транзиторного посгв акции ального ИД.

Научная новизна: впервые установлено, что:

- подкожная иммунизация, особенно ХТ, вызывает формирование неадекватного местного иммунного ответа, что обусловлено дисбалансом в системе цитокинов, выражающимся в подавлении продукции Лф слизистой кишечника интерлейкина-2 (ИЛ-2) на фоне усиленного синтеза ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6;

- непарентеральные способы иммунизации Аг холерного вибриона, по сравнению с их парентеральным введением, обеспечивают более адекватный клеточный и гуморальный местный иммунитет;

- самая адекватная иммунная реакция с нормальным балансом цитокинов, обеспечивающим оптимальное функционирование РИСК и предотвращающим развитие поствакцинального ИД, наблюдается при интраназальном введении микробных клеток (м.к.) V. сЬо1егае и ХТ;

- пероральное введение, особенно ХТ, значительно уступает по своей эффективности интраназальной иммунизации и требует для полноценного иммунного ответа многократного применения Аг;

- пероральная иммунизация, так же как и подкожная, вызывает дисбаланс в

системе регуляторных цитокинов, но в менее выраженной форме;

- интерферон-гамма (ИФ-у) или его индукторы могут быть использованы для иммунокоррекции задержки пусковых механизмов иммунного ответа при подкожной иммунизации благодаря своей способности стимулировать продукцию ИЛ-1 кишечными Мф и ингибировать стимуляцию синтеза/продукции ИЛ-6 эн-тероцитами тонкого кишечника;

- интраназальная граунд-иммунизация субиммунизирующими дозами ХТ обеспечивает благоприятный фон для пероральиой вакцинации как убитыми м.к. У.с1ю1егае, так и ХТ, так как способна потенцировать секреторный гуморальный ответ на пероральное введение Аг холерного вибриона.

Теоретическая ценность и практическая значимость. Получена принципиально новая информация, расширяющая наши представления о механизмах развития противохолерного клеточного и гуморального мукозального иммунитета, его регуляции цитокинами и особенностях, обусловленных разными способами введения м.к. холерного вибриона и ХТ.

Результаты исследований позволяют рекомендовать как наиболее оптимальный — интраназальный способ введения иммуногенов, обеспечивающий адекватный иммунный ответ и предотвращающий развитие поствакцинального транзиторного ИД благодаря сбалансированной работе цитокинов, регулирующих взаимодействие ИКК.

Выявлены причины неадекватной реакции иммунной системы на подкожную и, в меньшей степени, пероральную иммунизации, связанные с дисбалансом цитокинов: подавление продукции Лф слизистой кишечника ИЛ-2 на фоне усиленной секреции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, снижение стимулированной продукции ИЛ-1 и ИФ-у кишечными Мф и избыточный синтез ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника.

Намечены подходы к коррекции иммунопатологических реакций, вызывающих формирование поствакцинальных транзиторных ИД при специфической профилактике холеры.

Материалы исследований легли в основу «Методических рекомендаций по оценке препаратов для коррекции иммунного ответа, индуцированного антигенами холерного вибриона, на модели энтероцитов», утвержденных Учёным Советом Ростовского НИПЧИ 10 ноября 2004г., и используются при чтении лекций на курсах специализации врачей при РНИПЧИ.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Парентеральная иммунизация м.к. У.сЬо!егае и ХТ вызывает неадекватные реакции клеточного и гуморального мукозального иммунитета,- сопровождающиеся формированием иммунопатологических реакций, в том числе транзиторного поствакцинального ИД.

2 Неадекватность иммунного ответа при парентеральной иммунизации

обусловлена дисбалансом в системе цитокинов: ингибицией продукции Лф слизистой кишечника ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ими ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, снижением продукции кишечными Мф ИЛ-1 и снижением/отсутствием антигенстимулированной секреции ими ИФ-у, а также избыточным синтезом ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника.

3. Оптимальным способом введения противохолерных препаратов является интраназальная иммунизация, обеспечивающая эффективное взаимодействие ИКК благодаря нормальному балансу цитокинов, предотвращающему формирование иммунопатологических реакций.

4. Пероральная иммунизация против холеры является более адекватной по сравнению с парентеральной, но уступает по эффективности интраназаль-ному введению Аг. Недостаточная адекватность этого способа нивелируется на фоне интраназальной граунд-иммунизации субиммунизирующими дозами XT.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых РостНИПЧИ (1999-2002 гг.), на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону (2003 г.), на проблемных комиссиях «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону (2000 - 2002,2004,2005 гг.), на научных конференциях «Актуальные аспекты природно-очаговых инфекций», Омск (2001), «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003) «Гомеостаз и инфекционный процесс», Кисловодск (2004), 10th European Congress of Clinical Microbiology (Stockholm, 2000); AAAI Joint Meeting (San Francisco, 2000).

Публикации: основные материалы диссертации опубликованы в 14 научных работах, в том числе 2 — в зарубежной печати.

Структура и объём работы: диссертация изложена на 164 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 142 работы отечественных и 211 - зарубежных авторов. Работа содержит 17 таблиц и иллюстрирована 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на S32 беспородных белых мышах весом 16-20 г в возрасте 6-10 недель. Иммунизацию осуществляли парентерально (подкожно) и непарентерально (перорально, интраназально) суспензией инактивированных кипячением м.к вирулентного, типичного по биологическим характеристикам штамма V.cholerae eltor 5879 серотипа Инаба (2,5-5x107 м.к.) и/или XT (С 8052) фирмы Sigma (США) (2,5 мкг). Продолжительность постиммунизационного наблюдения составляла 28 суток. Оценка протективного иммунитета осуществля-

лась на 3 вирулентных штаммах, синтезирующих О-Аг и продуцирующих XT: V.cholerae eltor 5879, V.cholerae eltor 1310, V.cholerae 569B.

Материалом для исследования служили: суммарный пул Лф ПБ мышей, Т- и В-субпопуляции Лф ПБ, разделённые методом пэннинга, промывные воды тонкого кишечника мышей, подвергшиеся центрифугированию при 1000 g в течение 10 мин., первичная культура мышиных перитонеальных Мф (для изучения цитокининдуцирую щей активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), монослойная культура перевиваемых овариальных клеток китайского хомяка СНО-К1, полученная из Всероссийской коллекции перевиваемых клеток РАМН (г. Санкт-Петербург) (для определения антитоксических антител (Ат)), первичная культура энтероцитов тонкой кишки (для оценки адгезивной активности живых холерных вибрионов).

В работе использовались следующие фармакологические препараты: человеческий рекомбинантный ИФ-у («Pharmingen», США), вводимый в системы Мф или энтероцитов для стимуляции синтеза ИЛ-1(1 мг/мл или 100 МЕ/мл); индуктор ИФ-у - циклоферон («Полисан», Санкт-Петербург) (0,05 мг/мл).

Общий пул противохолерных Ig и их изотиповый спектр в ПБ и в промывных водах тонкого кишечника определяли методом ИФА (Tijesen Р., 1985). Каждая проба оценивалась в 4 повторностях. Подложкой служил общевидовой конъюгат антимышиных кроличьих Ат. Для дифференцировки Ат в лунки вносили моноспецифические кроличьи антимышиные Ат против разных классов Ig, после чего добавляли общевидовые козьи антикроличьи Ат, меченные пе-роксидазой.

Определение общего пула А г-специф ических антителообразующих клеток (АОК) в ПБ осуществляли методом иммуноферментных зон ELISPOT (Russell Р.Н. et а]., 1987).

Антитоксические Ат определяли биологическим методом на модели овариальных клеток китайского хомяка СНО-К1, на которые XT оказывает специфическое цитотоническое действие (Guernmt R.L. et al., 1974).

Антиадгезивную активность изучали под микроскопом по уменьшению числа прикрепившихся м.к. на 100 энтероцитов в сравнении с контролем не менее чем в 2 раза под влиянием двукратных разведений общего пула противохолерных Ig, осаждённых из промывных вод тонкого кишечника 50% сульфатом аммония.

Пролиферативную активность Лф изучали в РБТЛ (Хоробрых В.В. с со-авт.,1983), которую оценивали по включению 3Н- тимидина в ДНК клеток (имп/мин) на ß-счетчике Mark П (США). За индекс стимуляции (ИС) принимали отношение числа импульсов в минуту в опытных культурах к таковому в культурах без добавления стимуляторов. Положительным контролем служили коммерческие митогены конканавалин А (Кон А) и ЛПС Escherichia coli (Sigma,

США) в дозах 2,5-5 мкг/мл и 25-50 мкг/мл, соответственно.

Определение цитокинов (ИЛ-1, -2, -4, -5, -6) проводили методом ИФА (двойной сэндвич) (Стоккер Д. С соавт., 1983; Tijesen Р., 1985) с антицитокино-выми МкАт («Caltag», «Serotec», «Pharmingen», USA, Canada). Контролем служили рекомбинантные ИЛ, прилагаемые к наборам для их определения.

Статистическую обработку материалов исследования осуществляли путем вычисления средней арифметической (М), ее ошибки (т) и t-критерия Стьюденга (Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1968; ГланцС., 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из задач нашего исследования являлось изучение влияния разных способов иммунизации м.к. V.cholerae и XT на количественный состав и функциональную активность Лф ПБ (табл.1), в результате которого установлено, что наиболее оптимальным способом введения препаратов является интраназаль-ный, поскольку он обеспечивает существенное увеличение числа В-Лф в ПБ мышей и, не влияя на общее количество Т-Лф, повышает уровень Т-хелперов (Th) (7-28 сут.). Пероральное введение м.к., и особенно XT сопровождалось менее адекватной ответной реакцией: на фоне статистически достоверного снижения количества Th наблюдалось существенное повышение уровня Т-супрессоров (Ts) (7-21 сут.). Самая неадекватная ответная реакция развивалась на подкожное введение м.к., и особенно XT: отмечалось уменьшение числа В-Лф (CD21+). При этом наблюдалось значительное уменьшение количества Ts на фоне повышения числа Th.

Аналогичные результаты получены при анализе функциональной активности клеток ПБ мышей. Установлено, что способность этих клеток к пролиферации при подкожной иммунизации как м.к., так и XT не изменяется на протяжении всего срока исследования, что свидетельствует о слабой вовлечённости ПБ в процесс иммуногенеза (табл.2). При интраназальной иммунизации м.к. V. cholerae, наоборот, отмечалась активная антигенспецифическая трансформация Лф ПБ, наиболее выраженная на 14 сутки. Следует отметить, что на 28 сутки сохранялись достаточно высокие показатели пролиферации, свидетельствующие об эффективности этого способа иммунизации. В ответ на пероральное введение убитых м.к. интенсивность антигенспецифической пролиферации клеток ПБ при стимуляции убитыми м.к., хотя и превышала эффект парентерального введения, была в то же время в 1,2-1,8 раз меньше, чем при интрана-зальном введении Аг. Таким образом, интраназальная иммунизация обеспечивает наиболее высокую степень активации ИКК кишечника. Сравнительное изучение пролиферативной активности клеток ПБ мышей, иммунизированных XT, при разных способах его введения выявило, что интраназальная иммунизация XT вызывает наиболее высокую степень активации местного иммунного ответа. При этом уровень антигенспецифической бласттрансформации клеток ПБ повторял тенденцию, отмеченную при интраназальном введении убитых м.к., но был более выражен.

Таблица 1

Количество Т - и В - лимфоцитов пейеровых бляшек и их субпопуляци-онный состав при парентеральной и непарентеральных иммунизациях мышей

м.к. и XT V. cholerae 5879

Показатели Срок Количество клеток %

после подкожная ннтраназальная пероральная

имму- м.к. ХТ м.к. ХТ М.К. XT

низации

CD3 3 43,1+1,9 45,1+1,9 41,4+1,7 40,9+2,1 41,1+1,3 41,3+1,3

(общие Т- 7 45,2+2,1 48,4+1,8 42,1+1,3 41,0+1,9 41,0+1,3 41,3+1,3

пимфоциты) 14 44,3+2,3 50,8+2,3 42,1+1,3 42,3+1,8 41,3+1,5 40,9+1,7

21 46,1+1,7 53,2+1,8 41,7+1,1 42,4+1,6 41,1+1,5 41,7+1,7

28 43,4+2,1 51,2+1,6 41,3+1,1 41,9+1,8 41,3+1,3 41,3+1,3

Контроль 41,2+2,1

CD4 3 30,0+1,7 31,3+1,1 29,6+1,1 30,7+1,3 28,7+1,3 26,7+1,5

(Т-хелперы 7 30,8+1,3 34,0+1,3 32,0+1,1 32,6+1,1 28,3+1,3 26,0+1,5

-Th) 14 31,4+1,7 35,9+1,1 33,6+1,1 33,4+1,5 27,8+1,1 25,(¿1,3

21 33,0+1,5 35,9+1,7 33,9+1,3 35,9+1,5 27,5+1,5 23,7+1,7

28 28,9+2,1 30,7+1,9 32,4+1,5 34,2+1,5 27,7+1,5 26,0+1,7

Контроль 28,9+13

CD8 3 9,8+1,1 8,4+1,7 11,8+1,1 11,7+1,3 14,1+1,3 14,9+1,5

(Т- 7 8,9+1,1 7,2+1,7 12,1+1,1 11,9+1,3 15,0+1,3 16,1+1,7

суп рессоры - 14 8,1+1,3 6,1+1,3 12,1+1,1 12,1+1,3 15,4+1,5 18,0+1,7

Ts) 21 6,9+1,1 6,6+1,5 11,7±1,3 11,6+1,1 16,1+1,4 19,8+1,5

28 8,1+1,3 6,9+1,5 11,4+1,1 11,8+1,2 15,5+1,3 19,1+1,5

Контроль 11,6+1,1

CD21 3 37,3+1,3 33,4+1,3 39,3+1,1 41,5+1,7 39,3+1,1 38,5+1,3

(общие В- 7 33,5+1,3 30,5+1,5 49,3+1,1 53,6+1,5 50^+1,1 47,8+1,1

лямфоцнты) 14 31,5+1,1 28,7+1,5 51Д±1,3 56^+1,5 50,4+1,2 43,4+1,1

21 30,3±1,3 25,3+1,7 51,0+1,3 56,4+1,8 51.4+1Д 45,3+1,5

28 31,4+1,5 33,8+1,3 50,6+1,3 55,8±U 50,2+1,2 42,3+1,3

Контроль 39,4+1,7

Обнаруженные изменения пролиферативной активности общего пула иммуноцитов ГТБ мышей при разных способах введения м.к. и экзотоксина явились основанием для изучения этой активности у отдельных популяций Лф, фракционированных из суспензии лимфоидных клеток. Результат исследований показали, что в ответ на подкожное введение ХТ развивается функциональная недостаточность Т-Лф, которая проявляется временным снижением пролиферации Т-Лф ГТБ в ответ на Кон А с 3 по 14 сутки после иммунизации. При интраназальном и пероральном способах введения ХТ нарушений пролиферативной активности Т-Лф в ответ на Т-митоген не наблюдалось.

Таблица 2

Пролиферативиая активность лимфоцитов ПБ мышей, иммунизированных _м.к. и ХТ холерного вибриона, в антигенспецифической РБТЛ_

Срок после Индекс стимуляции

иммунизации (сут) подкожная интраназальная пероральная

иммунизация иммунизация иммунизация

Контроль интактн. 1 1 1

м.к.

3 23 2,2 2Л

7 2,5 3,4 2,8

14 2,5 6,7 3,6

21 2,3 5,3 3,8

28 2,3 4,7 2,8

ХТ

3 3,4 4Д 4,4

7 3,6 5,6 5,0

14 3,3 7,8 6,4

21 3,4 6,2 5,2

28 3,4 4,8 4,0

Функциональную активность Т-Лф оценивали не только по пролифера-тивному ответу клеток на митоген (КонА), но и на гетерологичный Аг, в качестве которого были использованы убитые микробные клетки РгапздзеИа Ш1агеп-$¡8 15 НИИЭГ. Проведенные исследования показали, что подкожное введение ХТ приводит к его подавлению в первые 3 недели поствакцинального периода. Тенденция к восстановлению пролиферативного ответа до контрольного уровня отмечалась только на четвертой неделе после введения ХТ. Нарушений проли-феративной активности Т-Лф при интраназальном и пероральном введении ХТ во все сроки исследования не отмечалось.

Другой важной задачей нашего исследования явилось изучение особенностей формирования гуморального местного иммунитета при разных способах иммунизации по параметрам антителообразования, изотиповому спектру и функциональной активности продуцируемых Проведённые исследования (рис.1) показали, что количественное распределение Лф по классам мембранных представлялось в виде

При этом парентеральная иммунизация оказалась значительно менее продуктивной, чем непарентеральная. Наибольшее количество ХТ- специфических было зарегистрировано в результате интраназальной иммунизации. Подобная закономерность отмечалась и в отношении количества Лф, несущих 1§0. Оценка степени выраженности вторичного иммунного ответа показала, что повторные введения ХТ обеспечивали увеличение количества ХТ- специфических

1§А+ клеток в ПБ в сравнении с однократной иммунизацией при обоих способах введения препарата (рис.2).

Количество [£С+ клеток также увеличивалось, а количество 1§М+ клеток было незначительным, но в случае непарентеральной иммунизации статистически больше, чем при однократном введении ХТ, что обеспечивает формирование более выраженной защиты слизистой оболочки тонкого кишечника за счет дополнительного рекрутирования новых популяций ИКК и вовлечения их во вторичный иммунный ответ.

Нормализация иммунного ответа при многократном применении ХТ явилась основанием для изучения закономерностей формирования вторичного иммунного ответа на бустерное пероральное введение м.к. У.сЬо1егае животным, однократно иммунизированным ХТ различными способами. Интраназальная иммунизация ХТ после бустерного введения целых м.к. У.с1ю1егае приводила к существенно большему накоплению 1§А+ клеток в ПБ, чем парентеральная, что свидетельствует о развитии выраженного местного иммунитета.

Анализ продукции антигенспецифических АОК и уровня специфических Ат показал (рис.3), что при интраназальной иммунизации как м.к., так и ХТ наблюдалось их более раннее образование (4-е сут.), чем при подкожной (14-е сут.). К 21 суткам количество АОК и титров специфических противохолерных Ат при интраназальном способе введения как м.к., так и ХТ становилось статистически достоверно выше, чем при парентеральной иммунизации.

Учитывая важную роль 1§А при формировании резистентности к холере, мы исследовали уровень этих Ат в промывных водах тонкого кишечника (рис.4) и установили, что при подкожной иммунизации в кишечном секрете 1£А практически отсутствуют. В отличие от подкожной, при интраназальной иммунизации м.к. и ХТ наблюдалось раннее появление ^А в кишечных смывах (5-е сут.) и высокие титры этих Ат на всех этапах поствакцинального периода. Появление через 2 недели после подкожной'иммунизации в промывных водах тонкого кишечника Ат класса свидетельствует о том, что защиту слизистой оболочки тонкой кишки выполняют в этом случае транссудирующие в кишечный секрет из кровеносного русла.

Сравнительное изучение продукции антитоксических Ат при различных способах введения м.к. и ХТ (табл.3) показало, что интраназальное введение препаратов вызывает, в отличие от подкожного, местную продукцию нейтрализующих Ат в более ранние сроки поствакцинального периода и обеспечивает более высокий уровень этих При парентеральной иммунизации ХТ высокие титры антитоксических Ат наблюдались только в случае его многократного введения (3-5 инъекций).

Рис. 1. Изотиповый спектр мембранных лимфоцитов ПБ мышей, иммунизированных ХТ, при первичном иммунном ответе. А - при интраназальном введении ХТ; Б - при подкожном введении ХТ.

4 V

Рис. 2. Изотиповый спектр мембранных ^ лимфоцитов ПБ мышей, иммунизированных ХТ, при вторичном иммунном Ответе. А - при интраназальном введении ХТ; Б - при подкожном введении ХТ.

Рис. 3. Количество антигенспецифических АОК и титры противохолерных формирующихся в ПБ в результате иммунизации мышей м.к. V. сЬо1егае. А -количество АОК; Б - титры ^

Таким образом, при парентеральной иммунизации, в отличие от непарентеральной, не в полной мере действуют механизмы местного иммунитета. Кроме того, основная масса Ат в промывных водах кишечника при этом способе введения скорее всего представлена транссудирующими из кровотока.

Учитывая, что антиадгезивная активность является одним из основных показателей антибактериального иммунитета, мы исследовали наличие антиад-гезинов и обнаружили (рис.5), что при подкожной иммунизации м.к. в течение 2-3 недель поствакцинального периода формируется незначительный пул таких Ат, что свидетельствует о малой эффективности парентеральных путей введения Аг, поскольку основной патогенетический механизм — колонизация кишечника — в результате вакцинации не контролируется. Определяемые титры антиадгезинов невысоки, и в случае массивной бактериальной нагрузки их защитная функция может не проявиться. При интраназальном введении м.к. отмечается значительно более выраженная и более ранняя продукция антиадгезинов, которая сохраняется в достаточных титрах и в постпродуктивном периоде, свидетельствуя о формировании определенного количества клеток иммунологической памяти, ответственных за синтез антиадгезивных Ат.

Таблица 3

Наличие антитоксических антител в смывах из тонкого кишечника мышей после иммунизации м.к. и ХТ. У.сЬо1егае

Срок после иммунизации (суг) Тигры 'антитоксических антител у мышей, иммунизированных

м.к. Улкокпс

янтраназально подкожво

3 2 0

7 16 0

14 32 4

21 40 16

28 8 0

ХТ

3 4 0

7 16 0

14 64 2

21 128 4

28 32 2

*- титр антитоксина выражен в виде последнего разведения антител, при котором отсутствуют визуальные изменения клеточного монослоя (обратные значения) при внесении в культуру 0,1 нг ХТ

Рис. 4. Титры противохолерных в промывных водах тонкого кишечника при иммунизации м.к. V. сИокгае.

А - при подкожном введении м.к.; Б - при интраназальном введении м.к.

Рис. 5. Антиадгезивная активность противохолерных в смывах слизистой тонкого кишечника мышей, иммунизированных м.к. V. с)ю1егае

Третьим этапом в нашем исследовании было изучение динамики продукции важнейших цитокинов ИКК пейеровых бляшек и энтероцитами тонкого кишечника при разных способах иммунизации. Проведённые исследования важнейшего ростового фактора — ИЛ-2 (рис.6) в супернатантах межэпителиальных Лф (МЭЛ) мышей выявили существенное подавление спонтанной и ми-тогенстимулированной продукции ИЛ-2 на всех этапах поствакцинального периода при подкожном и пероральном введении ХТ. Восстановления синтеза ИЛ-2 до контрольного уровня не происходило даже к концу 4 недели после введения Аг. Интраназальное введение ХТ, наоборот, сопровождалось умеренной активацией стимулированной продукции ИЛ-2 этими клетками. Превышение контрольного уровня сохранялось до конца 4 недели поствакцинального периода.

В экспериментах по исследованию сохранности клеточной рецепции путём введения экзогенного рекомбинантного ИЛ-2 (рИЛ-2) в реакционную смесь с находящимися там Т-Лф мышей, иммунизированных перорально целыми м.к. и ХТ, было обнаружено, что рецепция цитокина при иммунизации целыми м.к. угнетается далеко не полностью, а подавление митогениндуцированной пролиферации связано, главным образом, с ингибированием продукции/секреции этого лимфокина Т-клетками при воздействии Аг холерного вибриона. Перо-ральная иммунизация ХТ практически подавляет рецепцию ростового фактора в течение первой недели поствакцинального периода. Только на 28 сутки пока-

затель пролиферативной активности Лф практически приблизился к таковым при использовании м.к., оставаясь статистически значимо меньше контрольного уровня. Аналогичная картина отмечалась при введении экзогенного ИЛ-2 в реакционную смесь с находящимися там Т-клетками мышей, иммунизированных целыми м.к. или ХТ.

Таблица 4

Активность некоторых цитокинов в супернатантах лимфоцитов пейеровых бляшек мышей, иммунизированных ХТ

Срок после иммунизации (сут) Титры интерлейкинов в ИФА с антицитокиновыми МКА*

ИЛ-4 ИЛ-5 ИЛ-6 ИФ-у

Подкожно

3 800 400 400 0

5 800 400 400 0

7 400 400 400 0

14 400 200 400 5

21 400 200 200 10

28 400 200 200 10

Перорально

3 3200 1600 800 0

5 3200 1600 400 0

7 3200 1600 400 5

14 1600 800 200 10

21 400 200 200 10

28 200 ,100 200 10

Интраназально

3 200 100 200 40

5 200 100 200 40

7 200 200 100 20

14 200 200 100 30

21 200 200 100 20

28 200 100 100 20

контроль 100 50 100 10

* - представлены обратные значения титров исследованных супернатантов в ИФА с антиинтерлейкиновыми моноклональными антителами фирм CaItag и РИапш^еп (Канада, США), в которых отмечалось двукратное повышение контрольных показателей экстинк-ции В качестве сенситина для панелей использованы эти же антитела, не конъюгированные с ферментной меткой

Кмпрмь 3 5 7 14 21 2»

Сутки

14,"

Контроль 3 5 7 14 21 28

Сутки

Рис. 6. Активность ИЛ-2 в супернатантах МЭЛ мышей, иммунизированных ХТ: А - подкожно; Б - перорально; В - интраназально

Оценка продукции других цитокинов, наиболее значимых в формировании местного иммунитета (табл.4) показала, что подкожное и пероральное введение как м.к., так и ХТ, сопровождалось резким увеличением спонтанной продукции ИЛ-4 и ИЛ-5 в супернатантах ИКК ПБ, наиболее выраженным при пе-роральном введении токсина, т.к. приводило к 32-х кратному увеличению их титров по сравнению с контролем. Аналогичная картина наблюдалась и при оценке спонтанной продукции ИЛ-б: пероральная и парентеральная иммунизации сопровождаются гиперпродукцией ИЛ-6. В то же время при интраназаль-ной иммунизации наблюдалось адекватное повышение уровня этих цитокинов. Синтез ИФ-у при подкожной и перорапьной иммунизации ХТ был подавлен до конца первой недели, а в последующие сроки титры его не отличались от контрольных значений. Интраназальное введение ХТ, наоборот, характеризовалось активной продукцией этого медиатора, особенно в начале постиммунизационного периода.

Учитывая участие ИЛ-1 и ИЛ-6 в регуляции местного иммунитета, мы изучили продукцию этих провоспалительных цитокинов в супернатантах энте-роцитов тонкого кишечника мышей (табл.5), иммунизированных подкожно м.к., ХТ и ЛПС холерного вибриона и выявили угнетение (в 2 — 4 раза) продукции ИЛ-1 после иммунизации м.к. и ХТ на всём протяжении исследования. ЛПС подавлял продукцию ИЛ-1 в 2 раза по сравнению с контролем на 2 сутки после иммунизации. Продукция ИЛ-6 энтероцитами мышей, иммунизированных подкожно исследуемыми препаратами, наоборот, резко увеличивалась по сравнению с контролем— в 16-32 раза. В отличие от подкожного введения препаратов интраназальная иммунизация обеспечивает адекватный иммунный ответ с нормальным балансом этих цитокинов.

Таблица 5

Уровень продукции ИЛ-1 и ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника мышей, иммунизированных подкожно антигенами холерного вибриона

Энтероциты мышей, иммунизированных антигенами холерного вибриона ИЛ-1 ИЛ-6

2 сутки 3 сутки 5 сутки 2 сутки 3 сутки 5 сутки

м.к. 80 80 80 640 640 320

ХТ 40 80 80 640 640 640

ЛПС' 80 160 160 640 640 320

Контроль (энтероциты интактных мышей) 160 20

использовался ЛПС V. cholerae Ol серотипа Инаба 569 В (L 5262) фирмы Sigma (США) в дозе 25-50 мкг/мл

Учитывая, что подкожная иммунизация сопровождается угнетением продукции ИЛ-1 и гиперпродукцией ИЛ-6, на наш взгляд, при этом способе введения препаратов целесообразна иммунокоррекция для восстановления нормального баланса цитокинов.

Наши исследования показали, что введение в модельную систему энтеро-цитов от иммунизированных препаратами холерного вибриона мышей ИФ-у в дозе 1 мкг/мл и 10 мкг/мл (табл. 6) приводило к существенному повышению синтеза ИЛ-1 (в 2-4 раза), а титры ИЛ-6, наоборот, значительно снижались (в 2—4 раза). При этом наблюдается восстановление нормального соотношения тигров ИЛ-1/ИЛ-6: оно возрастает от 1:8—1:4 до 2:1—4:1 и приближается к наблюдаемому при интраназальной иммунизации, обеспечивающей наиболее адекватный иммунный ответ. Аналогичные результаты были получены при введении в модельную систему индуктора ИФ-у — циклоферона в дозе 0,05 мг/мл.

Таблица 6

Влияние ИФ-у на синтез ИЛ-1 и ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника мышей, иммунизированных подкожно антигенами холерного вибриона

Энтероциты мышей, иммунизированных антигенами холерного вибриона Доза ИФ-у мкг/мл ИЛ-1 ИЛ-6

2 сутки 3 сутки 5 сутки 2 сутки 3 сутки 5 сутки

м.к. 0,1 160 160 320 320 160 160

1 160 160 320 160 80 80

10 160 160 320 160 80 80

ХТ 0,1 80 80 160 640 320 320

1 160 320 320 160 160 160

10 160 320 320 160 160 160

лпс 0,1 80 160 80 320 320 160

1 320 640 640 160 160 160

10 320 640 640 160 160 160

Контроль энтероциты интактных мышей од 40 80 80 80 160 160

1 80 160 160 160 320 320

10 80 160 160 160 320 320

(США) в дозе 25-50 мкг/мл

Показано также, что совместное культивирование предобработанных ИФ-у энтероцитов тонкого кишечника с кишечными Мф иммунизированных подкожно ХТ животных приводило к увеличению спонтанной и стимулированной ЛПС Е.соП продукции макрофагами ИЛ-1. Одновременно под влиянием ИФ-у в системе «Мф + энтероциты иммунных мышей» наблюдалось повышение бактерицидной активности фагоцитов, что можно объяснить их активацией ИЛ-1, индуцированной введением в систему ИФ-у.

Таким образом, наши исследования наметили возможный подход к им-мунокоррекции вторичного поствакцинального ИД при холере с помощью препаратов ИФ-у или его индукторов.

Резюмируя результаты всех наших исследований, можно сделать вывод о том, что интраназальная иммунизация — самый адекватный способ введения иммуногенов для формирования противохолерного иммунитета. При этом способе введения Аг наблюдается активная антигенспецифическая трансформация лимфоцитов ПБ, нормальная пролиферативная активность Т- и В-Лф в ответ на митогены и гетерологичный Аг, более ранняя и более активная пролиферация антигенспецифических АОК в ПБ и слизистой кишечника, более высокие титры антигенспецифических в том числе антиадгезивных и антитоксических непосредственно в кишечнике, где и происходит их взаимодействие с возбудителем холеры и, самое главное, интраназальная иммунизация обеспечивает нормальный баланс цитокинов, создающий оптимальные условия для взаимодействия ИКК, что предотвращает развитие иммунопатологических реакций, в том числе транзиторных поствакцинальных ИД.

Исследование формирования протекгивного иммунитета подтвердило наш вывод. В результате интраназального способа введения препаратов, в отличие от подкожного и перорального способов, у мышей сформировался выраженный протекгивный иммунитет, который защищал от гибели практически 100% экспериментальных животных.

Выводы:

1. Подкожная иммунизация против холеры, особенно ХТ, вызывает неадекватное изменение соотношения Т- и В-Лф и приводит к формированию функциональной недостаточности Т-Лф.

2. При парентеральной иммунизации обнаружен дисбаланс в системе цитокинов, более выраженный при введении ХТ: ингибиция продукции Лф слизистой кишечника важнейшего ростового фактора — ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, что приводит к задержке пусковых механизмов иммунного ответа.

3. Непарентеральная иммунизация А г холерного вибриона, по сравнению с их парентеральным введением, вызывает более адекватный иммунный ответ:

наблюдаются активная антигенспецифическая пролиферация Т- и В-Лф ПБ, максимальное накопление в них антигенспецифических АОК, несущих мембранные IgA и IgG, высокие титры антиадгезивных и антитоксических Ат, а также адекватный ответ на митогены и гетерологичные Аг.

4. Пероральная иммунизация значительно уступает по эффективности интра-назальной иммунизации и требует для полноценного иммунного ответа многократного применения Аг;

5. Менее адекватная иммунная реакция при пероральной иммунизации Аг холерного вибриона, особенно XT, по сравнению с интраиазальной, объясняется дисбалансом в системе регуляторных цитокинов. Он проявляется ингибицией синтеза и рецепции ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6 Лф, а также снижением стимулированной продукции ИЛ-1 кишечными Мф мышей, обусловленным гиперсекрецией ИЛ-6 и снижением/отсутствием антигенстиму-лированной продукции ИФ-у.

6. ИФ-у или его индукторы могут быть использованы в качестве иммунокор-ректоров на этапе привлечения и активации клеток СМФ благодаря своей способности индуцировать синтез ИЛ-1 макрофагами и ингибировать стимуляцию синтеза/продукции ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника.

7. Адекватная иммунная реакция с нормальным балансом цитокинов, обеспечивающим оптимальное функционирование ИКК и предотвращающим развитие поствакцинального транзиторного ИД, наблюдается только при интрана-зальном введении м.к V.cholerae и XT.

8. Интраназальная граунд-иммунизация субиммунизирующими дозами XT обеспечивает благоприятный фон для пероральной вакцинации как убитыми м.к. V.cholerae, так и XT, поскольку способна потенциировать секреторный гуморальный ответ на пероральное введение Аг холерного вибриона.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kozlovsky V.N., Mishankin B.N., Vasilieva G.I., Mishankin M.B., Omel-chenko N.D. Cholerae toxin ability to cause the polyclonal activation of T-lymphocytes//AIlergy, Clinical, Immunology International -2000.-Suppl.l.-p.52.

2. Kozlovsky V.N., Vasilieva G.I., Mishankin M.B., Doroshenko E.P., Omel-chenko N.D. Mucosal immunity at the administration of cholerae toxin//Clinical Microbiol., Infect.-2000.-Vol 6, Suppl. 1.-P.40.

3. Васильева Г.И., Козловский B.H., Омельченко Н.Д., Дорошенко Е.П. Ци-токиновый механизм вторичного иммунодефицита при холере//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2000. -Вып.13. -С.103-104."

4. Козловский В.Н., Васильева Г.И., Мишанькин М.Б., Омельченко Н.Д., Мишанькин Б.Н. Динамика изменения уровня ИЛ-2 в процессе формирования противохолерного иммунитета//Актуальные аспекты природно-очаговых ин-

фекций: Матер, межрегион, науч.-практ. конф., посвящ.80 -лет. Омского НИПЧИ. - Омск.-2001 .-С.261-263.

5. Козловский В.Н., Васильева Г.И., Омельченко Н.Д. Динамика регулятор-ных цитокинов в процессе формирования противохолерного иммунитета при интраназальной иммунизации//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы».- Ростов-на-Дону, 2001 .-Вып.14. - С.72-73.

6. Козловский В.Н., Васильева Г.И., Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н., Киселёва А.К., Омельченко Н.Д. Спектр и интенсивность синтеза индуцированных холерным токсином цитокинов, участвующих в регуляции апопто-за//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов -на -Дону, 2002. - Вып.15. -С. 122 - 123.

7. Омельченко Н.Д., Козловский В.Н., Васильева Г.И. Изучение динамики изменения уровня ИЛ-2, участвующего в регуляции противохолерного иммунитета при непарентеральном введении препаратов//Материалы VIII Российской науч.-практ. конф. по проблеме «Холера». - Ростов-на-Дону, 2003.- С.275-278.

8. Омельченко Н.Д., Козловский В.Н., Васильева Г.И. Закономерности развития вторичного иммунного ответа в пейеровых бляшках тонкого кишечника мышей при парентеральных и непарентеральных способах введения антигенов/Материалы VIII Российской науч.-практ. конф. по проблеме «Холера». -Ростов-на-Дону, 2003,- С.274-275.

9. Омельченко Н.Д. Продукция IL-1 и IL-6 энтероцитами тонкого кишечника при воздействии антигенов холерного вибриоиа//Мед. иммунология. - 2003. - №3-4. - С.428.

10. Васильева Г.И., Омельченко Н.Д., Дорошенко Е.П., Киселёва А.К. Сравнительная оценка формирования местного иммунного ответа при разных способах аппликации ХТ//Фундам. исследования. - 2004. - С.41-42.

11. Омельченко Н.Д., Васильева Г.И., Козловский В.Н., Дорошенко Е.П. Особенности формирования гуморального местного противохолерного иммунитета при разных способах иммунизации убитыми микробными клетками холерного вибриона и холерным токсином//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2004. - Вып.17,- С.110-112.

12. Васильева Г.И., Омельченко Н.Д., Дорошенко Е.П. Особенности формирования клеточного местного противохолерного иммунитета при разных способах иммунизации//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2005. - Вып.18. -С.111-113.

13. Омельченко Н.Д., Васильева Г.И., Дорошенко Е.П. Оценка пролифера-тивной активности общего пула и отдельных популяций лимфоцитов пейеровых бляшек мышей, иммунизированных микробными клетками и экзотоксином холерного вибриона, при взаимодействии с митогенами и гетерологичными ан-

тигенами//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону, 2005. - Вып.18. - С.115-118.

14. Омельченко Н.Д., Васильева Г.И., Дорошенко Е.П. Сравнительная оценки динамики изменения уровня ИЛ-2 в процессе формирования противохолерного иммунитета при разных способах введения препаратов//Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2005. - Вып.18. -С.113-115.

Сдано в печать 10.09.2005 г. Подписано к печати 10.09.2005 г. Формат 84x108 1/16 Печать лазерная. Гарнитура Тайме. Объем 1,0 ус. пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в компьютерном центре Ростовского НИПЧИ.

Р16 6 10

РНБ Русский фонд

2006-4 12907

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Омельченко, Наталья Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Местный иммунитет (современная концепция).

1.2. Особенности формирования противохолерного иммунитета.

1.3. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства холерного токсина

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и антигены.

2.2. Животные.

2.3. Клеточные линии и клетки.

2.4. Иммунологические тесты.

2.4.1. Определение противохолерных иммуноглобулинов и антителообразующих клеток.

2.4.2. Оценка изотипового спектра противохолерных антител.

2.4.3. Определение антитоксических антител.

2.4.4. Изучение антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов.

2.4.5. Постановка реакции бласттрансформации лимфоцитов.

2.4.6. Оценка цитокининдуцирующей активности микробных клеток и холерного токсина V. cholerae.

2.5. Статистический анализ.4В

Глава 3. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО МЕСТНОГО ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ РАЗНЫХ СПОСОБАХ ИММУНИЗАЦИИ.

3.1. Характеристика количественного состава и функциональной активности лимфоцитов пейеровых бляшек иммунизированных мышей при взаимодействии с гомологичным антигеном.

3.2. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов пейеровых бляшек мышей, иммунизированных микробными клетками и экзотоксином холерного вибриона, при взаимодействии с митогенами и гетерологичными антигенами

3.3. Характеристика функциональной активности отдельных популяций лимфоцитов мышей при разных способах аппликации холерного вибриона и его токсина.

Глава 4. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО МЕСТНОГО ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ РАЗНЫХ СПОСОБАХ ИММУНИЗАЦИИ.

4.1. Определение изотипового спектра мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов пейеровых бляшек мышей, иммунизированных холерным токсином, при первичном и вторичном иммунном ответе.

4.2. Определение количества антигенспецифических антителообразующих клеток и уровня продукции противохолерных иммуноглобулинов.

4.3. Оценка изотипового спектра противохолерных иммуноглобулинов

4.4. Изучение продукции антитоксических антител к холерному токсину

4.5. Исследование антиадгезивной активности противохолерных. иммуноглобулинов.

Глава 5. ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА

ПРИ ХОЛЕРЕ.

Глава 6. ОЦЕНКА ИНТЕНСИВНОСТИ ФОРМИРУЮЩЕГОСЯ ПРОТЕКТИВНОГО ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ

РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ АППЛИКАЦИИ АНТИГЕНОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета"

Актуальность проблемы. Прошло более века после первой попытки вакцинации против холеры в Испании, но до настоящего времени нет эффективной и безопасной вакцины (Fournier J.M., 1998). Даже открытие холерного токсина (XT) — основного антигена (Аг) Vibrio cholerae — не обеспечило решения этой проблемы (Finkelstein R.A., 1995). Искусственный приобретенный иммунитет в результате специфической профилактики холеры современными препаратами является кратковременным (3-6 месяцев), не обладает противоэпидемической эффективностью и нередко сопровождается вторичным иммунодефицитом (Сомова А.Г. с соавт., 1980; Герасимова К.И. с соавт., 1991; Woogen S.D. et al., 1987; Elson C.O. et al., 1995).

В связи с этим многие страны отказались от вакцинации против холеры. По мнению ВОЗ, имеющиеся в настоящее время противохолерные препараты создают чувство ложной безопасности у вакцинированных и представителей медицинской службы и этим вредны.

Вместе с тем проблема создания эффективной вакцины является очень актуальной, так как ежегодно в ВОЗ приходят сообщения о холере, в том числе из стран Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки. Участились случаи завоза этой инфекции в другие страны, включая Россию, из государств ближнего и дальнего зарубежья, так как существующие меры эпидемиологического надзора не позволяют своевременно выявить вибрионосителей, людей, находящихся в инкубационном периоде инфекционного процесса или с легкой формой заболевания, а также лиц, скрывающих свою болезнь (Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Кологоров А.И. с соавт., 2001; Москвитина Э.А. с соавт., 2004).

В связи с этим ученые многих стран мира, в том числе и России, занимаются проблемой совершенствования специфической профилактики холеры, сложность которой связана с необходимостью формирования одновременно системного и местного иммунитета, обеспечивающего защиту сразу против нескольких детерминант вирулентности V. cholerae. Созданы препараты нового поколения — живые вакцины на основе рекомбинантных штаммов, полученные с использованием генно-инженерных технологий, в том числе КМ-184 (Ледванов М.Ю. с соавт., 1998; Щуковская Т.Н. с соавт., 2003) и CVD 103 Hg R V. cholerae 01 (Fournier J.M. et al., 1998; Galderwood E. Т., 2000; Liang W. et al.,

2003).

Однако живые вакцины не всегда безопасны (Анисимова Т.И. с соавт., 2002), поэтому они не нашли широкого применения, несмотря на высокую им-муногенность.

Безопасные в этом плане инактивированные цельноклеточные бактериальные вакцины менее эффективны (не более 50 %), реактогенны и требуют как минимум двухкратного введения с интервалом 7-28 дней (Weir Е., Haider S.,

2004).

Учитывая вышеизложенное, при конструировании препаратов нового поколения предпочтение следует отдавать молекулярным (химическим) вакцинам, над которыми работают как отечественные, так и зарубежные авторы (Смирнова Н.И. с соавт., 2000; Джапаридзе М.П. с соавт., 2002; Щуковская Т.Н. с соавт., 2003; Galderwood Е.Т. et al., 2000; Eko F.O. et al., 2003). В настоящее время наибольшее практическое применение получила химическая оральная вакцина WC/BS, разработанная шведскими учеными, эпидемиологическая эффективность которой позволила специалистам ВОЗ рекомендовать ее для профилактики холеры у путешественников. Однако и она не решает всех проблем специфической профилактики холеры из-за кратковременности создаваемого иммунитета.

Вместе с тем напряженный и длительно сохраняющийся иммунитет против холеры возможен, так как заболевание приводит обычно к формированию эффективного иммунизационного процесса, завершающегося развитием местного и системного, антитоксического и антибактериального иммунитета, обеспечивающего защиту от повторного заражения в течение 3-5 лет (Levine М.М. et al., 1983; Filkenstein R.A. et al., 1995), а следовательно, возможно и создание такого же поствакцинального иммунитета.

Одной из возможных причин создавшейся ситуации является неадекватный способ введения Аг. В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения, что парентеральная иммунизация противохолерными препаратами себя не оправдала, что закономерно, тогда как наиболее эффективным способом является введение вакцин через входные ворота инфекции (Сомова А.Г. с соавт., 1975; Ляшенко В.А., 1997; Манько В.М. с соавт., 2002; Saito Н. et al., 1998; Liang W. et al., 2003; Uren Т.К. et al., 2005).

Именно этим объясняется тот факт, что большинство вакцин нового поколения вводится перорально (Taylor D.N. et al., 2000; Kim В.О. et al., 2001; Hafid J. et al., 2005). Однако и этот способ иммунизации, хотя и вызывает более адекватный иммунный ответ по сравнению с парентеральным введением (Сомова А.Г. с соавт., 1980), не является оптимальным, так как может приводить к формированию оральной толерантности (Kato Н. et al., 2001; Lycke N., 2005).

В последние годы показана перспективность интраназального использования для большинства мукозальных вакцин (Elson С.О. et al., 1990; Kikuta К. et al., 1990; Rudin A., 1999; Sabirov A et al., 2001; Brandtzaeg P., 2003; Li X. et al., 2004; Stevceva L, Ferrari MG., 2005; Kurohane K. et al., 2005; Kobayashi R. et al., 2005). Рассматривается также возможность накожной аппликации Аг, в том числе и XT, для индукции системного и местного иммунитета (Glenn G.M. et al., 1998; Baca-Estrada М.Е. et al., 2002; Maeba S., 2005).

Принимая во внимание вышеизложенное, понятно, что для совершенствования иммунопрофилактики холеры необходимо всестороннее изучение тонких механизмов формирования местного противохолерного иммунитета и его особенностей при разных способах введения препаратов, а также выявление иммуномодулирующих эффектов отдельных Аг холерного вибриона. Так, при конструировании вакцин нового поколения следует учитывать, что А - субъединица XT является суперантигеном (СА), обусловливающим формирование иммунопатологических реакций (Васильева Г.И. с соавт., 2001, 2002; Мишань-кин М.Б. с соавт., 2004), в связи с чем её присутствие в составе вакцин нежелательно.

Учитывая ведущую роль цитокинов в пато- и иммуногенезе инфекций, в том числе и холеры (Abbas abul К. et al., 1996; Lavelle E.C. et al., 2004; Arce S. et al., 2005), при исследовании механизмов формирования противохолерного им-, мунитета особое внимание должно уделяться изучению цитокинопосредован-ной регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток (ИКК).

Исследование перечисленных выше вопросов позволит наметить перспективные подходы к управлению реакциями противохолерного иммунного ответа и конструированию эпидемиологически эффективных препаратов нового поколения с целью создания напряженного поствакцинального иммунитета.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — выяснение влияния способа введения холерного вибриона и его токсина на адекватность. формирования клеточного и гуморального звеньев местного противохолерного иммунитета в слизистой оболочке тонкого кишечника мышей и особенности его регуляции цитокинами.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:

1. Сравнить влияние разных способов иммунизации на формирование местного клеточного противохолерного иммунитета по показателям количественного состава и функциональной активности популяций и субпопуляций лимфоцитов пейеровых бляшек (ПБ) тонкого кишечника.

2. Изучить особенности формирования гуморального местного иммунитета при разных способах иммунизации по параметрам антителообразования, изотиповому спектру и функциональной активности продуцируемых иммуноглобулинов (Ig).

3. Изучить динамику изменения продукции важнейших цитокинов ИКК ПБ при разных способах иммунизации и оценить регуляторное воздействие этих медиаторов на функциональную активность Т- и В-лимфоцитов ПБ и клеток их микроокружения (кишечных макрофагов (Мф) и энтероцитов тонкого кишечника).

4. Выявить возможные механизмы формирования транзиторного поствакцинального иммунодефицита при иммунизации противохолерными препаратами.

5. Рекомендовать на основании анализа полученных результатов оптимальный для создания эффективного местного иммунитета способ введения Аг V. cholerae с целью изучения возможности его применения для профилактики холеры.

6. Наметить перспективные пути коррекции нарушений иммунитета, возникающих в результате вакцинации против холеры, с целью предотвращения развития транзиторного поствакцинального иммунодефицита.

Исследования выполнены в соответствии с планом НИР Ростовского — на -Дону научно-исследовательского противочумного института (№ темы 01. 9; 70. 00. 9312)

Научная новизна. В результате комплексного исследования особенностей формирования клеточного и гуморального местного противохолерного иммунитета и его регуляции в зависимости от способа иммунизации микробными клетками (м.к.) V. cholerae и XT впервые установлено, что:

- подкожная иммунизация против холеры, особенно XT, вызывает формирование неадекватного местного иммунного ответа, что обусловлено дисбалансом в системе цитокинов, выражающимся в подавлении продукции лимфоцитами слизистой кишечника ИЛ-2 на фоне усиленного синтеза ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6;

- самая адекватная иммунная реакция с нормальным балансом цитоки-нов, обеспечивающим оптимальное функционирование ИКК и предотвращающим развитие поствакцинального иммунодефицита, наблюдается при интраназальном введении м.к. V. cholerae и XT;

- пероральное введение, особенно XT, значительно уступает по своей эффективности интраназальной иммунизации и требует для полноценного иммунного ответа многократного применения Аг;

- пероральная иммунизация, также как и подкожная, вызывает дисбаланс в системе регуляторных цитокинов, но в менее выраженной форме;

- интерферон-гамма (ИФ-у) или его индукторы могут быть использованы для иммунокоррекции задержки пусковых механизмов иммунного ответа при подкожной иммунизации благодаря своей способности стимулировать продукцию ИЛ-1 кишечными Мф и ингибировать стимуляцию синтеза/продукции ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника;

- интраназальная граунд-иммунизация субиммунизирующими дозами XT обеспечивает благоприятный фон для пероральной вакцинации как убитыми м.к. V.cholerae, так и XT, так как способна потенцировать секреторный гуморальный ответ на пероральное введение Аг холерного вибриона.

Результаты исследований позволяют рекомендовать как наиболее оптимальный — интраназальный способ введения иммуногенов, обеспечивающий адекватный иммунный ответ и предотвращающий развитие транзиторного поствакцинального иммунодефицита благодаря сбалансированной работе цито-кинов, регулирующих взаимодействие ИКК.

Выявлены причины неадекватной реакции иммунной системы на подкожную и, в меньшей степени, пероральную иммунизации, связанные с дисбалансом цитокинов: подавление продукции лимфоцитами слизистой кишечника ИЛ-2 на фоне усиленной секреции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, снижение стимулированной продукции ИЛ-1 и ИФ-у кишечными Мф и избыточный синтез ИЛ-6 эн-тероцитами тонкого кишечника.

Намечены подходы к коррекции иммунопатологических реакций, вызывающих формирование транзиторного поствакцинального иммунодефицита при специфической профилактике холеры.

Материалы исследований легли в основу «Методических рекомендаций по оценке препаратов для коррекции иммунного ответа, индуцированного антигенами холерного вибриона, на модели энтероцитов», утверждённых Учёным Советом Ростовского НИПЧИ 10 ноября 2004г., и используются при чтении лекций на курсах специализации врачей при РНИПЧИ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Парентеральная иммунизация м. к. V.cholerae и XT вызывает неадекватные реакции клеточного и гуморального мукозального иммунитета, сопровождающиеся формированием иммунопатологических реакций, в том числе транзиторного поствакцинального иммунодефицита.

2. Неадекватность иммунного ответа при парентеральной иммунизации обусловлена дисбалансом в системе цитокинов: ингибицией продукции лимфоцитами слизистой кишечника ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ими ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, снижением продукции кишечными Мф ИЛ-1 и снижением/отсутствием актигенстимулированной секреции ими ИФ-у, а также избыточным синтезом ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника.

4. Пероральная иммунизация против холеры является более адекватной по сравнению с парентеральной, но уступает по своей эффективности ин-траназальному введению Аг. Недостаточная адекватность этого способа нивелируется на фоне интраназальной граунд-иммунизации субиммуни-зирующими дозами XT.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института (1999-2002 гг.), на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону (2003 г.), на проблемных комиссиях «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону (2000, 2001, 2002, 2004, 2005 гг.), на научных конференциях «Актуальные аспекты природно-очаговых инфекций», Омск (2001); «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003); «Гомеостаз и инфекционный процесс», Кисловодск (2004); 10th European Congress of Clinical Microbiology, Stockholm, (2000); AAAI Joint Meeting, San Francisco, (2000).

Публикация результатов исследований.

Основные материалы диссертации опубликованы в 14 научных работах, в том числе 2 — в зарубежной печати.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 142 работы отечественных и 211 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Омельченко, Наталья Дмитриевна

ВЫВОДЫ

1. Подкожная иммунизация против холеры, особенно XT, вызывает неадекватное изменение соотношения Т- и В- лимфоцитов и приводит к формированию их функциональной недостаточности.

2. При парентеральной иммунизации обнаружен дисбаланс в системе цитокинов, более выраженный при введении XT: ингибиция продукции лимфоцитами слизистой кишечника важнейшего ростового фактора — ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6, что приводит к задержке пусковых механизмов иммунного ответа.

3. Непарентеральная иммунизация Аг холерного вибриона, по сравнению с их парентеральным введением, вызывает более адекватный иммунный ответ: наблюдаются активная антигенспецифическая пролиферация Т- и В-лимфоцитов пейеровых бляшек, максимальное накопление в них антигенспецифических АОК, несущих мембранные IgA и IgG, высокие титры антиадгезивных и антитоксических Ат, а также адекватный ответ на митогены и гетерологичные антигены.

4. Пероральная иммунизация значительно уступает по эффективности интраназальной и требует для полноценного иммунного ответа многократного введения антигенов.

5. Менее адекватная иммунная реакция при пероральной иммунизации Аг холерного вибриона, особенно XT, по сравнению с интраназальной, объясняется дисбалансом в системе регуляторных цитокинов. Он проявляется ингибицией синтеза и рецепции ИЛ-2 на фоне усиленной продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6 лимфоцитами, а также снижением стимулированной продукции ИЛ-1 кишечными Мф мышей, обусловленным гиперсекрецией ИЛ-6 и снижением/отсутствием антигенстимулированной продукции ИФ-у.

6. ИФ-у или его индукторы могут быть использованы в качестве иммунокорректоров на этапе привлечения и активации клеток СМФ благодаря своей способности ингибировать стимуляцию синтеза/продукции ИЛ-6 энтероцитами тонкого кишечника.

7. Адекватная иммунная реакция с нормальным балансом цитоки-нов, обеспечивающим оптимальное функционирование ИКК и предотвращающим развитие транзиторных поствакцинальных иммуно-дефицитов, наблюдается только при интраназальном введении м.к V.cholerae и XT.

8. Интраназальная граунд-иммунизация субиммунизирующими дозами XT обеспечивает благоприятный фон для пероральной вакцинации как убитыми микробными клетками V.cholerae, так и XT, так как способна потенциировать секреторный гуморальный ответ на пероральное введение антигенов холерного вибриона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Существование эпидемических очагов холеры в Азии и Африке, проникновение её в Латинскую Америку (Москвитина Э.А. с соавт., 2004; SharmaR., 2001), появление в 1992 г. новой 0139 серогруппы возбудителя этой инфекции (Weir Е., Haider S., 2004), а также возможность завоза холеры в любую страну мира, являются причиной сохранения актуальности проблемы совершенствования специфической профилактики холеры (Ломов Ю.М. с соавт., 2000; Кологоров А.И. с соавт., 2001; Анисимова Т.И., 2002). Стремление к получению «идеальной» вакцины определяет стратегию разработки противохолерных препаратов нового поколения. Однако, несмотря на все попытки создать такую вакцину в течение более чем 100 лет, задача эта не решена. Неэффективность специфической профилактики холеры существующими вакцинами связана с формированием кратковременного иммунного ответа с невыраженной иммунологической памятью, а также с возникновением вторичных поствакцинальных иммунодефицитов.

Анализ литературы свидетельствует о том, что одним из подходов к совершенствованию иммунопрофилактики холеры является поиск эффективных путей стимуляции местного иммунитета слизистых оболочек с минимальным включением механизмов системного иммунитета, сопровождающихся нарушениями иммуногомеостаза макроорганизма. В связи с этим представляются актуальными изучение роли отдельных Аг V. chol-erae в формировании местного иммунитета и его цитокинопосредованной регуляции, а также поиск оптимального способа введения профилактических препаратов против холеры.

Целью настоящей работы явилось выяснение влияния способа введения холерного вибриона и его токсина на адекватность формирования клеточного и гуморального звеньев местного противохолерного иммунитета в слизистой оболочке тонкого кишечника мышей и особенности его регуляции цитокинами.

Одна из задач, решение которой было необходимо для достижения поставленной цели, заключалась в сравнении показателей местного иммунного ответа в ПБ при разных способах применения Аг.

Проведенные исследования показали, что подкожная иммунизация не обеспечивает эффективной защиты слизистой оболочки тонкого кишечника от холерного вибриона, поскольку сопровождается слабой индукцией синтеза IgA в ПБ. Защитную функцию в просвете кишки выполняют только IgG, транссудирующие из кровеносного русла. Образуясь в организме, как правило, только на высоте иммунного ответа (примерно на 10-12 сутки от начала заболевания) или при вторичном иммунном ответе, Ат этого класса обладают, главным образом, антитоксическим действием и не являются первым иммунологическим барьером на пути холерного вибриона.

Кроме того, подкожная иммунизация, особенно XT, неблагоприятно влияет на начальные этапы иммуногенеза в тонком кишечнике мышей. При этом происходит формирование функциональной недостаточности Ти В-лимфоцитов, выражающееся во временном нарушении их пролиферации в ответ на поликлональные митогены.

Вероятной причиной нарушений иммуногенеза при парентеральной иммунизации, ведущей к задержке пусковых механизмов иммунного ответа в тонком отделе кишечника мышей, является, обнаруженный нами дисбаланс в системе цитокинов, наиболее выраженный при использовании XT. Он проявляется в подавлении продукции важнейшего ростового фактора — ИЛ-2 на фоне усиленного синтеза ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6.

Более адекватный иммунный ответ на Аг холерного вибриона, по нашим данным, индуцирует непарентеральная иммунизация (пероральная и интраназальная) при очевидном преимуществе интраназального способа введения.

Непарентеральные виды иммунизации сопровождаются быстрым развитием местного иммунного ответа, о чём свидетельствует активная ан-тигенспецифическая трансформация лимфоцитов ПБ мышей. Так, при ин-траназальной иммунизации м.к. V. cholerae и в особенности XT даже на 28 сутки сохранялись достаточно высокие показатели пролиферации этих клеток. Пероральное введение убитых м.к. и XT запускает иммуногенез менее интенсивно: показатели антигенспецифической трансформации клеток ПБ при стимуляции обоими препаратами хотя и превышали эффект парентерального введения, однако оказались слабее по сравнению с интра-назальным путём воздействия Аг.

При непарентеральных способах иммунизации наблюдается также нормальный пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов на митогены и ге-терологичный Аг, что свидетельствует об адекватности реагирования иммунной системы на антигенное раздражение.

Выраженная пролиферация В-лимфоцитов при непарентеральном введении Аг сопровождается накоплением в ПБ мышей антигенспецифических АОК, несущих мембранные IgA и IgG, что указывает на развитие местного иммунного ответа. Следует отметить, что образование их отмечалось уже на четвёртый день после интраназального введения Аг, в то время как при подкожной иммунизации эти клетки находили в ПБ мышей только с 14 суток. К 21 суткам количество антигенспецифических АОК при интраназальном способе введения м.к. холерного вибриона становилось статистически достоверно выше, чем при подкожной инъекции, что, по-видимому, свидетельствует о формировании большего количества клеток иммунологической памяти непосредственно в лимфоидных образованиях кишечника мышей. Аналогичная тенденция формирования мукозаль-ного иммунитета отмечается при анализе результатов иммунизации XT в случае интраназальной иммунизации.

Об адекватном развитии местного иммунного ответа при интраназальном введении обоих препаратов можно судить по изотиповому спектру Ig в промывных водах тонкого кишечника. Однако наилучшие показатели наблюдались в результате интраназальной иммунизации м.к., которая сопровождается ранним появлением IgA в кишечных смывах (на 5 сутки) с титром 1:64. Высокие титры IgA (1:160, 1:320, 1:1280) регистрируются на всех этапах поствакцинального периода. В этом случае можно предполагать формирование более существенного базиса иммунологической памяти, поскольку и на 28 сутки после иммунизации титр IgA сохранялся на достаточно высоком уровне — 1:320.

При интраназальном введении токсина наблюдаются также высокие уровни IgA, превышающие таковые при подкожной иммунизации.

Преимущество непарентеральной иммунизации перед парентеральной очевидно и при анализе токсиннейтрализующей активности смывов тонкого кишечника. Так, интраназальное введение м.к. холерного вибриона сопровождается, в отличие от подкожного, более ранней местной продукцией нейтрализующих Ат (с 3 дня поствакцинального периода). При интраназальном введении м.к. накопление этих Ig было выражено в большей степени.

Введение XT сопровождалось аналогичной динамикой антителооб-разования, но в несколько больших титрах, чем при введении целых м.к. При этом интраназальная иммунизация приводила к накоплению в смывах тонкого кишечника наибольших титров антитоксических Ат.

Продукция антитоксических нейтрализующих Ат, более выраженная при введении XT, по сравнению с м.к. объясняется, вероятно, меньшим количеством XT в составе целых м.к. по сравнению с применяемой нами для иммунизации дозой XT, а также наличием в м.к. холерного вибриона дополнительных иммуногенных молекул, модулирующих ответ на токсин.

Следует отметить, что при подкожной иммунизации XT нейтрализующие титры антитоксина в смывах тонкого кишечника определялись только в случае его многократного введения (3-5 инъекций) в отличие от таковых, полученных при однократной интраназальной иммунизации XT.

Наряду с наличием высоких титров антитоксических Ат при интраназальной иммунизации более выражен и антибактериальный иммунитет. Так, при этом способе введения Аг отмечается более ранняя продукция антиадгезинов в высоких титрах, которая сохраняется и в постпродуктивном периоде, свидетельствуя о формировании определенного количества клеток иммунологической памяти, ответственных за синтез антиадгезивных Ат.

Таким образом, по параметрам антителообразования, изотипового спектра Ig и их функциональной активности (антиадгезивной и антитоксической) непарентеральные способы введения Аг, и, в особенности, интра-назальная иммунизация, обеспечивают существенный уровень защиты слизистой оболочки тонкого кишечника, сопровождаясь накоплением антигенспецифических Ig в наиболее высоких титрах.

Пероральная иммунизация значительно уступает по эффективности интраназальной, поскольку недостаточно полно задействует механизмы местного иммунитета. Введение препаратов per os, особенно XT, требует многократного применения Аг для накопления адекватных количеств как IgA-AOK, так и IgM-AOK. При однократном пероральном введении Аг развивается функциональная недостаточность Т-клеток разной степени выраженности, проявляющаяся в снижении их митогениндуцированной пролиферативной активности и продукции цитокинов.

Неадекватная иммунная реакция при пероральной иммунизации, по сравнению с интраназальной, объясняется выявленным нами дисбалансом в системе регуляторных цитокинов. При этом пероральная иммунизация XT приводит к более выраженным нарушениям иммунного статуса, чем при использовании целых м.к., т.к. ингибирует не только синтез ИЛ-2 лимфоцитами ПБ, но и рецепцию его ИКК. В то же время имеет место, как и при парентеральной иммунизации, чрезмерное усиление продукции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6.

Кроме того, наблюдается снижение продукции ИЛ-1 кишечными Мф мышей, обусловленное гиперсекрецией ИЛ-6 и снижением/отсутствием антигенстимулированной продукции ИФ-у, запускающего иммунный ответ.

Свой вклад в цитокиновый дисбаланс вносят также энтероциты тонкого кишечника, продуцируя избыточные количества ИЛ-6, способного, как известно, нарушать инициальные фазы иммунного ответа.

Аналогичная направленность изменений уровня регуляторных цитокинов, но с более выраженным дисбалансом в их системе наблюдается при парентеральной иммунизации.

В отличие от этих способов введения Аг, их интраназальное применение обеспечивает адекватную иммунную реакцию с нормальным соотношением цитокинов.

Наши исследования показали, что одним из способов преодоления последствий дисбаланса цитокинов, регулирующих формирование местного противохолерного иммунитета, является введение ИФ-у или индукторов его синтеза.

Нами обнаружено также, что интраназальная граунд-иммунизация субиммунизирующими дозами XT обеспечивает благоприятный фон для пероральной вакцинации м.к. V.cholerae и XT, так как в этом случае формируется эффективный и адекватный иммунный ответ, что может иметь несомненное прикладное значение.

Результаты наших исследований, свидетельствуют о том, что интраназальная иммунизация — самый адекватный способ введения иммуноге-нов в целях формирования противохолерного иммунитета, так как обеспечивает нормальный баланс цитокинов, создающий оптимальные условия для взаимодействия ИКК, что предотвращает развитие иммунопатологических реакций, в том числе транзиторных поствакцинальных иммунодефи-цитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Омельченко, Наталья Дмитриевна, Ростов-на-Дону

1. Авроров В.П., Глянько Е.В., Оленичева Л.С. Модель для изучения местного иммунитета при экспериментальной холере//Вопр. имму-нол. и мол. биол. Нальчик, 1981. - Т. 1. - С. 14.

2. Адамов А.К., Щуркина И.И., Бугоркова С.А. с соавт. Иммуноген-ность холерных структурных антигенов и ферментов//Матер. VII Всерос. съезда эпидем., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т. 1. - С. 405-406.

3. Адамов А.К. Молекулярные механизмы специфического иммунитета к холере//Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры: Тез. докл. Всесоюз. конф. Саратов, 1980. - С. 147 - 151.

4. Адамов А.К. Эффекторные механизмы иммунитета к возбудителям холеры и антигены, вызывающие образование антител//Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагн.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов- на -Дону, 1992. - С. 188-189.

5. Адамов А.К., Щуркина И.И., Алексеева Л.П. с соавт. О связи вирулентности с антигенной структурой холерных вибрио-новЮпидемиол. и клин.-иммунолог. аспекты профилакт. важнейших инф. заболеваний: Матер, конф. — Астрахань, 1996. С. 69.

6. Алексанян Ю.Т., Арутюнян В.М., Давтян Т.К., Акопян Г.С. Роль суперантигенов в регуляции воспаления и местного иммунитета при периодической болезни//Иммунология. 1999. - №2. - С. 9-13.

7. Астахин А.В., Левитан Б.Н., Афанасьев С.С. с соавт. Уровень фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-4 в сыворотке крови больных хроническим гепатитом//Журн. микробиол., эпидемиол., иммуноби-ол. 2004. - №2. - С. 46-50.

8. Афанасьев Ю.И, Ноздрин В.И., Волков Ю.Т., Квачёв В.Г. Сгруппированный лимфоидный узелок кишечника//Успехи современ. биологии. 1987. - Т. 104. - Вып. 1(4). - С. 79-88.

9. Ю.Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медгиз. - 1968. - 180 с.

10. Бардых И.Д. Экспериментальные модели в патогенезе холеры: Авто-реф. дис.канд. мед. наук. 1993. - 18 с.

11. Бархина Г.Г. Молекулярные механизмы мембранных взаимодействий токсинов и ферментов//Теор. и практ. аспекты мол. биол.: II Все-союз. симп.: Тез докл. М., 1991.- С. 25.

12. Беляков И.М. Иммунная система слизистых//Иммунология. 1997. -№4.-С. 7-13.

13. Бережная Н.М. Интерлейкины и формирование иммунологического ответа при злокачественном росте//Аллергол. иммунол. 2000. - Т.1, №1. - С. 45-61.

14. Богдашин И.В., Дыгай A.M., Шерстоба Е.Ю. с соавт. Роль тимуса в регуляции синтеза цитокинов клетками костного мозга при стрес-се//Иммунология. 1991. - №5. - С. 30-32.

15. Бондаренко В.М., Агапова О.В., Виноградов Н.А. Роль бактериальной протеазы, деградирующей секреторный иммуноглобулин А, в персистенции клебсиелл//Журн. микробиол., эпидемиол., иммуноби-ол. 2000. - №4. - С. 1216.

16. Бугоркова С.А., Исупов И.В. Анализ компенсаторных возможностей организма при противохолерной иммунизации//Пробл. ООИ. 2001. - Вып.2 (82).-С. 141-147.

17. Бурмистрова A.J1. Распределение иммунорегуляторных лимфоцитов у больных с поражениями слизистой оболочки толстой киш-ки//Иммунология. 1988. - №6. - С. 64-67.

18. Васильева Г.И., Козловский В.Н., Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н. Суперантигенная активность холерного токсина//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. -Вып. 15.-С. 73-75.

19. Васильева Г.И., Киселёва А.К., Козловский В.Н. с соавт. Влияние холерного токсина на макрофаги мышей//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 15. - С. 121-122.

20. Васильева Г.И., Козловский В.Н., Мишанькин Б.Н., Мишанькин М.Б. Холерный токсин суперантиген Vibrio сЬо1егае//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 2002. - №2. - С. 50-55.

21. Вершигора А.Е., Овод В.В. Клеточные и молекулярные основы местного иммунитета//Успехи современ. биологии. 1981. - Т.91. -Вып.З. - С. 393-408.

22. Воробьёв А.А. Физиологические пути введения антигенов и других биологически активных веществ в организм//Иммунология. 2002. -№3. - С. 138-142.

23. Вядро М.М. Цитокины и их роль в патогенезе и терапии инфек-ций//Антибиотики и химиотер. 1990. - Т. 35. - №9.- С. 12-14.

24. Герасимова К.И., Ледванов М.Ю., Адамов А.К. с соавт. Комплексная оценка поствакцинальных нарушений иммунного статуса людей с помощью метода бактериального розеткообразова-ния//Иммуноконкуренция при инф. патологии. Л., 1988. - С. 14-16.

25. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. с соавт. Применение метода генного зондирования для выявления эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов//Мол. генетика, микробиол., вирусол.-1987. -№11. С. 9-13.

26. Душкин В.А. Попытки моделирования холеры человека на безмикробных животных//Пробл. ООИ. Саратов, 1979. - Вып.З. - С. 58-58.

27. Зб.Здановский А.Г., Здановская М.В., Янковский Н.К. Бактериальные токсины и их применение//Мол. биология. 2000. - Т.34. - №2. - С. 193-200.

28. Зорин Н.А., Зорина В.Н., Зорина P.M. Универсальный модулятор цитокинов а2-макроглобулин//Иммунология. 2004. - №5. - С. 302-304.

29. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлянский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных//Иммунология. 2004. - №5. -С. 288-290.

30. Зубова С.Г., Окулов В.Б. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухолей а и трансформирующего фактора роста |3 в процессе ответа макрофага на активацию//Иммунология. 2001. -№5. - С. 18-22.

31. Ивашкин В.Т., Мамаев С.Н., Лукина Е.А. с соавт. Система цитокинов у больных хроническими диффузными заболеваниями печешь/Иммунология. 2001. - №1. - С. 46-49.41 .Иммунология//Под редакцией У. Пола. 1987.- Т.1. - С. 216-222.

32. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., ГеронинаС.А. с соавт. Спонтанный и липополисахарид-индуцированный синтез цитокинов клетками крови человека в норме и при аллергопатологиях//Иммунология. 1999. - №5. - С. 37-39.

33. Калугина А.П. Морфологические основы устойчивости кишечника к действию холерного токсоида//Арх. анат., гистол. и эмбриол. 1988. - Т.94. - №3. - С. 69-72.

34. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность (лекция)//Клин. лаб. диагн. 1998. -№11. -С. 21-32.

35. Кетлинский С.А, Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета//Иммунология. 1995. -№3.- С. 30-44.

36. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьёв А.А. Эндогенные им-муномодуляторы. С. - Петербург: Гиппократ, 1992. - 256 с.

37. Киселевский М.В., Казанова Г.В., Варфоломеева С.Р. с соавт. Опыт применения ИЛ-2 и лимфокинактивированных клеток-киллеров в терапии онкогематологических заболеваний у детей//Иммунология. -2002.-№1.-С. 56-59.

38. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная им-мунокоррекция//Иммунология. 1995. - №1. - С. 4-7.

39. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Соколова Е.В., Титовец Р.Е. Цитокины в регуляции противоопухолевой активности макрофагов; экспериментальное обоснование адаптивной макрофаготерапии при злокачественом росте//Иммунология. 1995. - С. 52-54.

40. Кологоров А.И., Фёдоров Ю.М., Васеиии А.С. с соавт. Современное состояние вопроса иммунопрофилактики холеры//Пробл. ООИ. Саратов, 2001.-Вып. 1 (81).-С. 136-140.

41. Король В.В., Гофман E.JI. Факторы, влияющие на гемагглютини-рующую активность холерных вибрионов//Матер. VII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 1997. - Т.1. - С. 182-184.

42. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса колонизация и пути её предотвращения//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1989.- №9.- С. 103 - 110.

43. Котенок Я.Ф., Ураков Н.Н. Экспериментальная холера у морских свинок. Сообщ.1. Разработка метода заражения//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1976. - №11. - С. 84-87.

44. Кривицкая В.З., Александрова Н.А., Орлов А.В., Походзей И.В. Реакция иммуноглобулина класса А на респираторно-сенцитиальную вирусную инфекцию у детей и взрослых с различными формами острого и хронического бронхита//Иммунология. 1999. - №2. - С. 5155.

45. Ларионов Г.И., Беляков В.Д. Стратегия жизни и механизмы саморегуляции популяций возбудителей сапронозов (на примере Pseudomo-nas pseudomallei)//OKypH. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. -1990.- №1.- С. 13-16.

46. Ларионов Г.М., Тихонов С.Н. Об эндемичности холеры в местностях умеренного климатического пояса//Матер. науч.-практ. конф., по-свящ. 100-лет. образов, противочумн. службы России: Тез. докл. -Саратов, 1997. Т.1. - С. 92-93.

47. Ледванов М.Ю., Адамов А.К., Кравцов А. Л., Наумов А.В. Влияние иммунизации холерной вакциной на синтез ДНК в лимфоци-тах//Механизмы формирования иммунитета к особо опасным инфекциям. Саратов, 1986. - С. 76-85.

48. Ледванов М.Ю., Резников Ю.Б., Стукова Н.Ю. Живая вакцина против холеры/Лг^егп. J. Immunorehabilitation. 1998. - №8. - Р. 193.

49. Ледванов М.Ю., Резников Ю.Б., Стукова Н.Ю. Живая вакцина против xonepbi//Intern. J. Immunorehabilitation.- 1998.-.№8. P. 193.

50. Лоцманова Е.Ю., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В. с соавт. Оценка иммунологической эффективности оральных холерных вакцин при помощи метода ШТА1Ш//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов - на - Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 100102.

51. Ляшенко В.А. Мукозальные вакцины//Иммунология. 1997.- №6.-С.4-7.

52. Мазрухо А.Б., Михась Н.К., Монахова Е.В., Рожков К.К. Определение оптимальных условий продукции ряда факторов патогенности холерных вибрионов//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. -2000.-№1.-С. 21-24.

53. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспекти-вы//Иммунология. 2002. - №6. - С. 132-138.

54. Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., Маянский Н.А. Проблемы управления фагоцитарными механизмами иммунитета//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1995. - №3. - С. 21-26.

55. Маянский Д.Н. Проблемы хронического воспаления в современной патофизиологии//Пат. физиол. 1994. - №2. - С. 51-55.

56. Маянский А.Н., Маянская И.В. Реактивность и медиаторные функции интестинальных эпителиоцитов в системе мукозального гомеостаза//Иммунология. 2004. - №3. - С. 185-192.

57. Медуницин Н.В. Где находится иммунологическая память? Роль антигена в поддержании иммунологической памяти//Иммунология. -2001. №6. - С. 19-24.

58. Медуницин Н.В. Цитокины и аллергия, опосредованная IgEZ/Иммунология. 1993. - №5. - С. 11-12.

59. Медуницын Н.В. Цитокины и аллергия//Иммунология. 1999. - №5. -С.5-8.

60. Мишанькин М.Б., Васильева Г.И., Мишанькин Б.Н. Сравнительная характеристика суперантигенных свойств холерного токсина//Пробл.комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004. - Вып. 17. - С. 51-55.

61. Москвитина Э.А., Беспалов И.А., Прометной В.И. Эндемичные очаги холеры в странах Африки: оценка природно-климатических усло-вий//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону, 2001. Вып. 15. - С. 14-17.

62. Москвитина Э.А., Ломов Ю.М., Фёдоров Ю.М. с соавт. Оценка эпидемиологической ситуации по холере в мире, странах СНГ и России в XXI веке. Прогноз//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону. - 2004. - Вып. 17. - С. 9-13.

63. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение и изучение свойств регуляторных пептидов иммунной системы//1 Всесоюз. съезд иммунол.: Тез. докл. М., 1989. - Т.1. - С. 72.

64. Наумов А.В., Белов Л.Г Биоценотические механизмы инфекционной резистентности слизистой оболочки кишечника//Матер. науч.- практ. конф., посвящ. 100 лет. образов, противочумн. службы России. -Саратов, 1997. -Т.1. - С. 233-234.

65. Панков Ю.А.О фундаментальной эндокринологии//Биохимия. -1997.-Т. 62, Вып. 10. -С. 1373-1375.

66. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Толстов Д.В., Ковальчук Л.В. Система лимфоидной ткани пищеварительного тракта животных и перорально индуцированная иммунная толерантность//Иммунология. 2001. -№6.-С. 10-19.

67. Петров Р.В. Вклад иммунологии в развитие медико-биологических дисциплин//Иммунология. 1999. - №1. - С. 4-9.

68. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Адгезины энтеротоксигенных кишечных палочек: роль в патогенезе диарей и генетический кон-троль//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1990. - №5. - С. 110-116.

69. Покровский В.И., Пак С.Г., Брико Н.И., Данилкин А.Б. Инфекционные болезни и эпидемиология. М., 2000. - 384 с.

70. Потапнев М.П., Зобнин В.Д., Рукша Е.В. Иммуномодулирующее действие рекомбинантного интерлейкина-2 человека на реакции гуморального и клеточного иммунитета у мышей//Иммунология. -1991. -№3. С. 23-26.

71. Резников Ю.Б., Ледванов М.Ю. Живая холерная вакцина//Матер. науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочумн. службы России: Тез. докл. Саратов, 1997.- Т.1.- С. 237.

72. Семёнова И.Б., Акатов А.К. Иммуномодулирующие свойства бактериальных экзотоксинов и анатоксинов//Актуал. вопросы мед. биотехнологии Томск, 1991 (а). - С. 99-101.

73. Семёнова И.Б., Акатов А.К. Бактериальные экзотоксины и анатоксины как антигеннеспецифические иммуномодуляторы//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1991 (б). - №12. - С. 69-73.

74. Сенников С.В., Силков А.Н., Козлов В.А. Аллельные варианты и изоформы цитокинов в диагностике и патогенезе иммунопатологических состояний/ТИммунология. 2002. - №4. - С. 243-247.

75. Сергеев В.А., Алипер Т.И., Рухадзе Т.Е., Бахуташвили В.И. Иммунная система слизистых: концепция общности и механизмы функцио-нирования//Вопр. вирусологии. 1988. - №4. - С. 393-402.

76. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг ctx, кодирующий холерный токсин и «остров патогенности»//Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1999. -№4. - С. 3.

77. Симбирцев А.С. Клиническое применение препаратов цитоки-нов//Иммунология. 2004. - №4. - С. 247-251.

78. Смирнова Н.И. Холерные вакцины: безопасность, иммуногенность, протективность//Матер. науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов. противочумн. службы России: Тез. докл. Саратов, 1997.- Т. 1. -С. 240.

79. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В. с соавт. Штаммы Vibrio cholerae 01 и 0139 продуценты основных протективных анти-генов//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 2000. - №3. - С. 47-51.

80. Соболев С.М., Степанова Т.Н. Гормоны тимуса и моделирование приобретённого иммунодефицита холерогеном/ЛП Всесоюз. конф. «Актуал. вопр. теорет. и прикл. инф. иммунол.; механизмы противо-инф. иммунитета: Тез докл. М., 1987. - С. 99.

81. Соколов Д.И., Котова А.Ю., Симбирцев А.К., Фрейдлин И.С. Сравнение цитокинов по способности влиять на уровень секреции интер-лейкина 8 эндотелиальными клетками//Иммунология. 2002. - №1. -С. 32-37.

82. Сомова А.Г., Петров P.M., Гриценко А.Н. с соавт. Иммунный ответ экспериментальных животных на холерную вакцину//Спец. профи-лакт. холеры: Тез докл. на Всесоюз. симпозиуме. Саратов, 1975. - С. 80-83.

83. Стоккер Д., Малаваси Ф., Трукко М. Определение продуктов, синтезируемых гибридомами, с помощью иммуноферментного мето-да//Иммунология. Методы исследований/Под ред. И. Лефковитса и др. М.: Мир. 1983. - С. 329-338.

84. Суслов А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет//Итоги науки и техники/Онкология. М.:ВИНИТИ, 1990. - Т. 19.-С. 56-60.

85. Суслов А.П. Фактор некроза опухолей (ФНО) структура и функ-ции//Итоги науки и техники/Онкология. - М.: ВИНИТИ, 1990. - Т.19. - С. 84-88.

86. Телесманич Н.Р., Непомнящая Н.Б., Винокур Н.И. Гемолизины холерных вибрионов как липогликопротеиновые поливалентные ком-плексы//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. №14. - С. 53-54.

87. Телешева Л.Ф., Долгушина В.Ф., Долгушин И.И. Механизмы проти-воинфекционой защиты репродуктивного тракта женщин// Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1998. - №4. - С. 85-90.

88. Титенко Б.М. Современные представления об иммунитете при холере (Аналитический обзор)//Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагностики и профилакт. холеры: Тез. Всесоюз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988.-С. 191-198.

89. Тихонов Н.Т. Биохимические механизмы активирующего действия холерного токсина на систему аденилатциклазы//Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагностики, и профилакт. холеры: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988. - С. 60-67.

90. Тополян А.А. Роль хемокинов и их регуляторов в иммунорегуля-ции//Иммунология. 2001. - №5. - С. 7-15.

91. Туманов А.В. Развитие вторичных лимфоидных орга-нов//Иммунология. 2004. - №2. - С. 120-128.

92. Фрейдлин И.С. Загадки тимуса. Возраст и иммунитет//Соросовский образоват. журнал, 2001. №5. - С. 26-29.

93. Фрейдлин И.С. Ключевые позиции макрофагов в цитокиновой регуляторной сети//Иммунология. 1995. - №3. - С. 44-48.

94. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции//Иммунология. 2001. - №5. - С. 4-7.

95. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии//Иммунология. 1997. - №5. - С. 4-7.

96. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции//Иммунология. 1999 (а). - №2. - С. 61-64.

97. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Вторичные иммунодефицита: клиника, диагностика, лечение//Иммунология. 1999 (б). - №1. - С. 14-17.

98. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина. - 2000. - С. 177-189.

99. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека/УИммунология. 2001. - №3. -С. 4-12.

100. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии//Иммунология. 2001. - №4. - С. 4-6.

101. Холера в СССР в период VII пандемии//Под ред. В.И. Покровского. -М.: Медицина, 2000. 472 с.

102. Хоробрых В.В., Пронин А.В., Киркин А.Ф. с соавт. Методы постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов в микромодифика-ции//Иммунология. 1983. - №3. - С. 76-79.

103. Челядинова А.В. Изучение биологических свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы: Автореф. дис. канд. мед. наук. 2000. -18 с.

104. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Развитие патогенетического принципа оценки иммунной системы человека//Журн. микробиол., эпиде-миол., иммунобиол. 1997. - №6. - С. 89-92.

105. Чернохвостова Е.В. Местный иммунитет и микробные IgA-протеазы//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1984. - №6.-С. 104-111.

106. Шальнев Б.И. Иммунопатология и иммуномодуляция. М., 1989. -80 с.

107. Шварцман Я.С., Хазенсон Л.Б. Местный иммунитет. Л.: Медицина, 1978.- 221 с.

108. Шевченко Л.А., Филякина Е.С., Гончаров Е.К., Мишанькин Б.Н. Выделение, очистка и характеристика щелочных фасфатаз холерного вибриона//Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 58-59.

109. Щуковская Т.Н., Корсуков В.Н. Характеристика популяций Т- и В-лимфоцитов в организме экспериментальных животных в процессе формирования иммунитета к холере//Пат. физиол., иммунол. и ал-лергол. ООИ. Саратов, 1984. - С. 70-76.

110. Щуковская Т.Н., Дятлов И.А., Смирнова Н.И. Основы иммунологической безопастности холерных вакцин нового поколения//Матер. VIII Росс, науч.-практ. конф. по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 2003.- С. 219-223.

111. Щуркина И.И., Адамов А.К., Бугоркова Т.В. Новые антигены и перспективы их использования в иммунологических исследованиях//! съезд иммунологов России: Тез.докл.

112. Нрвоинбйр4к,Сй^&маСцй6@кинов и принципы её функционирования в норме и при патологии//Иммунология.- 1997. №5.- С. 7-13.

113. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа//Иммунология. 1999. - №1. - С. 17-24.

114. Ярилин А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы//Иммунология. 2001. - №4. - С. 16-20.

115. Abbas abul К., Murphy К.М., Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes//Nature. 1996. - Vol. 383, №6603. - P. 787-793.

116. Albert M.J, Qadri J., Bhuiyan N.A. et al. Phagocytosis of Vibrio cholerae 0139 bengal by human polymorphonuclear leukocytes//Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1999. Vol.6, №2. - P. 276-278.

117. Anastassion E.D., Yanada H., Trancis M.L. et al. Effect of cholera toxin on human В cells: cholera toxin induces B-cell surface DR expression and inhibits anti-mu antibody-induced cell proliferation//.!. Immunol.- 1990. -Vol. 145, №8.-P. 2375-2380.

118. Aspord C., Thivolet C. Nasal administration of CTB-insulin diabetic (NOD) mice//Clin. Exp. Immunol. 2002. - Vol. 130, №2. - P. 204-211.

119. Baca-Estrada M.E., Ewen C., Mahony D. et al. The haemopoietic growth factor, Flt3L, alters the immune response induced by transcutaneous im-munization//Immunology. 2002. - Vol.107, №1. - P. 69-76.

120. Bachert C. Immunologic und Immunopathologie der Nasenscheim-haut//Wien. Med. Wochenschr. 1989. - Vol. 139, №17. - P. 70-71.

121. Balkwill F.Cytokines in health and disease//Immunol. Today. 1993.-Vol. 14, №4. - P. 149-150.

122. Beneditti R., Lev P., Massouh E., Flo F. Oral administration of one dose of cholera toxin induces a systemic immune response prior to a mucosal immune response by a dirict presentation in the spleen//Immunol. Zett.-1998. Vol. 60, №2-3. - P. 149-156.

123. Bienenstock J., Befus D. Mucosal immunology//Immunology. 1980. -Vol.41, №2. - P. 249-270.

124. Bienenstock J., Ennst P.B., Unclerdonn B.J. The gastrointestinal tract as an immunologic organstate of the art//Ann. Allergy.-1987. Vol. 59, №5. -P. 17-20.

125. Beck N.A., Krukonis E.S., Dirita VJ. TepH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibiting degradation of the transcription activator TepP//J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, №24. - P.

126. Dziejman M. et al. ToxR regulon of Vibrio cholerae and its expression in vibrios shed by cholera patients//Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2003. - Vol. 100, №5. - P. 2801-2806.

127. Boyaka P.N., Tafaro A., Fischer R. et al. Therapeutic manipulation of the immune system: enhancement of innate and adaptive mucosal immu-nity//Curr. Pharm. Des. 2003. - Vol. 9, №24. - P. 1965-1972.

128. Bowman C.C., Clements J.D. Differential biological and adjuvant activities of heat-labile enterotoxin hybrids//Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №3. - P. 1528-1535.

129. Burrows W., Sack R.B. Animal models of cholera//Cholera/Ed. D. Barua, W. Burrows. Philadelphia, 1974. - Ch.9. - P. 189-205.

130. Brandtzaeg P. Research in gastrointestinal immunology state of the art//Scand. J. Gastroenterol. 1985. - Vol. 20, №114. - P. 137-156.

131. Brandtzaeg P. Role of secretory antibodies in the defence against infections/Ant J.Med. Microbiol. 2003. - Vol. 293, №1. - P. 3-15.

132. Brayden D.J. Oral vaccination in man using antigens in particles: current status//Eur. J. Pharm. Sci. 2001. - Vol.14, №3. - P. 183-189.

133. Bromander A., Holmgren J., Lycke N. Cholera toxin stimulates IL-1 production and enhances antigen presentation by macrophages in vi-tro//J.Immunol. 1991. - Vol. 146, №9. - P. 2904-2914.

134. Campbell K., Fucks B.A., Munson A.E. The T-lymphocyte is the primary cellular target for potentiation of the in vitro T-dependent IgM antibody response by the B-subunit of cholerae toxin/Ant. J. Immunopharmacol. -1992.-Vol. 14, №2.-P. 111-120.

135. Campbell K.S., Munson A.E. Potentiation of the in vitro T-dependent antibody response by the В subunit of cholera toxin//J. Pharmacol. Exp. Med. 1987. - Vol. 242, №3. - P. 895-904.

136. Carpenter С.С. Pathogenesis and pathophysiology of cholera//Principles and practice of cholera control. WHO. - Geneva, 1970. - P. 53-55.

137. Chotani M.A., Mitra S., Eid A.H. et al. Distinct camp signaling pathways differentially regulate alpha-2-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells//J. Bacteriol. 2004. -Vol. 186, №24. - P. 8254-8266.

138. Codeco C.T. Endemic and epidemic dynamics of cholera: the role of the aquatic reservoir//BMC Infect. Dis. 2001. - Vol. 1, №1. - P. 1.

139. Cooper G.N., Narendranathan R. Antibacterial immunity to Vibrio cholerae in rats//J. Med. Microbiol. 1986. - Vol. 22. - P. 133-141.

140. Cosman D. The hematopoietin receptor superfamily//Cytokine. 1993. -Vol. 5.-№1,-P. 95-106.

141. Csencsits K.L., Walters N., Pascual D.W. Dichotomy of homing receptor dependence by mucosal effector В cells: alpha (E) versus L selectin//J. Immunol. 2001. - Vol. 167, №5. - P. 2441-2445.

142. Dalseg R., Wedege E., Haugen I.L. et al. Group В meningococcal vaccine as a mucosal immunogen//Clin. Immun. Immunopathol.- 1995. Vol. 76, №1.- P. 93.

143. Dalseg R., Wedege E., Hoist J. et al. Outer membrane vesicles from group P meningococci are strongly immunogenic when given intranasally to mice/TVaccine. 1999. - Vol. 17, №19. - P. 2336-2345.

144. De Jong E.C., Vieira P.L., Kalinski P. et al. Microbial compounds selectively induce Thl cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells invitro with diverse the cell-polarizing signals//J. Immunol. 2002. - Vol. 168, №4. -P. 1704-1709.

145. Dieterich C. Bouzourene H., Blum A.L., Cortnesy-Theulaaaz I.E. Urease-based mucosal immunization against Helicobacter heilmannii infection induces corpus atrophy in mice//Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, №11. -P. 6206-6209.

146. Dinarello C.A. Interleukin-l//Adv.Pharmacol.-1994.- Vol. 25. P. 21-51.

147. Doe W. Immunology of the gastrointestinal tract//Med. Int. 1986. Vol.25.-P. 1044- 1048.

148. Douce G., Fontana M., Pizza M. et al. Intranasal immunogenicity and adjuvanticity of site-directed mutant derivatives of cholera toxin//Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, №7. - P. 2821-2828.

149. Dugas В., Paul-Eugene N., Genot E. et al. Effect of bacterial toxins on human В cell activation. II mitogenic activity of the В subunit of cholera toxin//Eur. J. Immunol. 1991. - Vol. 21, №2. - P. 495-500.

150. Durum S.K., Oppenheim J.J. Proinflammatory cytokines and immu-nity//Fundamental Immunology/Eds. W. Paul.-New York, 1993. P. 801835.

151. Eko F.O., Schukovskaya Т., Lotzmanova E.Y. et al. Evaluation of the protective efficacy of Vibrio cholerae ghost (VCG) candidate vaccines in rabbits//Vaccine. 2003. - Vol.21, №25-26. - P. 3663-3674.

152. Ekstrom J., Hu K.F., Bengtsson K.L. et al. Iscom and iscom-matrix enhance by intranasal route the IgA responses to OVA and r CTB in local and remote mucosal secretions//Vaccine. 1999. - Vol. 17, №20-21. - P. 2690-2701.

153. El-Ghorr A.A., Williams R.M., Heap C., Norval M. Transcutaneous immunization with herpes simplex virus stimulates immunity in mice//FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 29, №4. - P. 255261.

154. Elson C.O. Induction and control of gastrointestinal immune sys-tem//Scand. J. Gastroenterol. 1985. - Vol. 114, №20. - P. 1-15.

155. Elson C.O., Solomon S. Activation of cholera toxin-specific T-cells in vi-tro//Infect. Immun. 1990. - Vol. 58, №11. - P. 3711-3716.

156. Elson Gh.O., Holland S.P., Dertzbaugh M.T. et al. Morphologic and functional alteration of mucosal T cells by cholera toxin and its В subunit//J. Immunol. 1995. - Vol. 154, №3. - P. 1032-1040.

157. Eriksson K., Fridriksson M., Nordstrom I., Holmgren J. Cholera toxin and its В subunit promote dendritic cell vaccination with different influences on Thl and Th2 development//Infect. Immun. 2003. - Vol.71, №4. - P. 1740-1747.

158. Externest D., Meckelein В., Schmidt M.A. et al. Correlation between antibody immune responses at different mucosal effector sites are controlled by antigen type and dosage//Infect. Immun. 2000. - Vol.68, №7. - P. 3830-3839.

159. Fan E., Merritt E.A., Zhang Z. et al. Exploration of the GMj receptor-binding site of heat-labile enterotoxin and cholera toxin by phenyl-ringcontaining galactose derivatives//Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. -2001. Vol. 57, №2. - P. 201-212.

160. Fasano A. The genome of the smartest pathogen decoded: is the cholera war over?//J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr.- 1990. Vol. 32, №1. - P. 1-3.

161. Finkelstein R.A. Why do we not yet have a suitable vaccine against chol-era?//Advances in mucosal immunology/Ed. J. Mestesky et al., Plenum Press, New Jork. 1995. - P. 1633-1640.

162. Fort L.R., Tharne P.K., Eber S.L. et al. Stimulation of intestinal СГ transport by heat-stable enterotoxin; activation of camp-dependent protein kinase by cGMF//Amer. J. Physiol. 1992. - Vol. 263, №3. - P. 607-615.

163. Foss D.L., Zilliox M.J., Murtaugh M.P. Differential regulation of macrophage interleukin-l(IL-l), IL-12, and CD80-CD86 by two bacterial tox-ins//Infect. Immun. 1999. - Vol.67, №10. - P. 5275-5281.

164. Fournier J.M. Etat actuel des recherches sur le vaccin antichole-rigue//Bull. Soc. Pathol. Exot. 1998. - Vol. 91 (Pt. 1-2) - P. 412-415.

165. Freytag L.C., Clements J.D. Mucosal adjuvants//Vaccine. 2005. - Vol. 23, №15.-P. 1804-1813.

166. Fujihashi K., Kato H., van Ginkel F.W. et al. A revisit of mucosal IgA immunity and oral tolerance//Acta Odontol. Scand. 2001.- Vol.59, №5.-P. 301-308.

167. Gagliardi M.C., Sallusto F., Mariano M. et al. Cholera toxin induces maturation of human dendritic cells and licences them for Th2 prim-ing//Eur. J. Immunol. 2000. - Vol. 30, №8. - P. 2394-2403.

168. Gallichan N.S., Rosenthal K.L. Intranazal immunization with a recombinant adenovirus induces specific secretory immune responses in the female genital tract//Clin. Immunol. Immunophatol.- 1995.- Vol.76, №1. -P. 43.

169. Galderwood E.T. Cholera vaccines//Clin. Infect. Dis. 2000. - Vol. 31, №2.-P. 561-565.

170. Gastello Branco L.R.R., Griffin G.E., Poulton T.A., Lewis D.J.M. T cell responses after oral immunization of humans with cholera toxin В sub-unit//Clin. Sci. - 1993. - Vol. 84, №3. - P. 68.

171. Gerdts V., Vwiera R.R., Mutwiri G.K. et al. Multiple intestinal loops provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses//J. Immunol. Methods. 2001. - Vol. 256, №1-2. - P. 19-33.

172. Ghen D., Colditz I.G., Glenn G.M., Tsonis C.G. Effect of transcutaneous immunization with co-administered antigen and cholera toxin on systemic and mucosal antibody responses in sheep//Vet. Immunol. Immunopathol. -2002.-Vol. 86, №3-4.-P. 177-182.

173. Glenn G.M., Rao M., Matyas G.R., Alving C.R. Skin immunization made possible by cholera toxin//Nature.- 1998. Vol. 391. - №6670. - P. 851.

174. Goeddell D.V. Signal transduction by TNF receptors// Tolerance and Autoimmunity. Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. -Keystone, Colorado. 1997. - P.7.

175. Gorter A., Hiematra P.S., Klar-Mohamad N. et al. Binding internalization and degradation of soluble aggregates of human secretory IgA by resident rat peritoneal macrophages//Immunology. 1988.- Vol. 64, №4. - P. 703 -708.

176. Grago S.S., Prince S.J., Kulhavy R., Mestecky J. Molecular-cellular interactions in the secretory Ig A system//Secretory immunity and infection. -New York London. - 1978. - P.209 - 217.

177. Graves P., Deeks J., Demicheli V. et al. Vaccines for preventing chol-era//Cochrane Database Syst. Rev. 2000. - №2. - CD000974.

178. Gripps AW., Kyd J.M. Mucosal immunization for protection against nontypable Haemophilus influenzae respiratory infection//Clin. Immunol. Immunophathol. -1995. Vol. 76, №1. - P. 83.

179. Gunter H. Intestinales immunsystem//Zbc. Hyg. und Umweltmed. 1991. -Vol. 191, №2-3 .-P. 216-231.

180. Gupta R.K., Taylor D.N., Bryla D.A. et al. Phase 1 evaluation of Vibrio cholerae 01, serotype Inaba, Polysaccharide-Cholera Toxin conjugates in adult volunteers//Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, №7. - P. 3095-3099.

181. Hafid J., Vincent N., Flori P. et al. Production of antibodies in murine mucosal immunization with Toxoplasma gondii excreted/secreted anti-gens//Vet. Parasitol. 2005. - Vol. 128, №1-2. - P. 23-28.

182. Hagiwara Y., Mc Ghee J.R., Fujihashi K. et al. Protective mucosal immunity in aging is associated with functional CD4+ T-cells in nasopharyn-geal-associated lymphoreticular tissue//J. Immunol. 2003. - Vol. 170, №4. - P. 1754-1762.

183. Hamilton J.A., Whitty G.A., Kola J., Hertzog P.J. Endogenous IFN-оф suppresses colony-stimulating factor (CSF)-l stimulated macrophage DNA synthesis and TNF-a//J. Immunol. 1996. - Vol. 156, №7. - P. 2553-2557.

184. Henderson B. Interleukin-l/Text book of immunopharmacology/Eds. M. Dale, J.Foreman, T.-P.Fan.-Oxford, 1994. P. 193-199.

185. Henderson B. Therapeutic modulation of cytokines//Ann. Rheum. Dis. -1995. Vol. 54, №8. - P. 519-523.

186. Hiroshi H. Mucosal defense mechanism in health and disease. Role of the mucosal immune system//Acta Pathol. 1992. - Vol.42, №6. - P. 387-400.

187. Hirst Т. Novel immunologic aspects of bacterial toxins//Clin. Microbiol. Infect. 1999. - Vol. 5. - №3. - P. 25.

188. Hodge L.M., Marinaro M., Jones H.P. et al. Immunoglobulin A (IgA) responses and IgE-associated inflammation along the respiratory tract after mucosal but not systemic immunization//Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №4. - P. 2328-2338.

189. Holmgren J., Svennerholm A.-M. Cholera and the immune re-sponse/ZProg. Allergy. 1983. - Vol. 33. - P. 106-119.

190. Iijima H., Takahashi I., Kiyono H. Mucosal immune network in the gut for the control of infections diseases//Rev. Med. Virol. 2001. - Vol. 11, №2. - P. 117-133.

191. Jacgueline W.L., William A.B. The membranous epithelial cell and the mucosal immune system//Annu. Rev. Med. Selec. Jop. Clin. Sci. 1984. -Vol. 35.-P. 95-112.

192. Jackson R. J., Fujihashi K., Kiyono H., Mc Ghee J.R. Luminometric guantitation of mucosal immune responses employing bioluminescent aeguorin derivatives//Clinical. Immunol. Immunopathol. 1995. - Vol. 76, №1.-P. 123.

193. Jerborn M., Nordstrom I., Kilander A. et al. Local and systemic immune responses to rectal administration of recombinant cholera toxin В subunit in humans//Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №6. - P. 4125-4128.

194. Johansson E.L., Rask C., Fredriksson M et al. Antibodies and antibody-secreting cells in the female genital tract after vaginal or intranasal immunization with cholera toxin В subunit or conjugates//Infect. Immun. -1998. Vol. 66, №2. - P. 514-520.

195. Jonson G., Soennerholm A.-M., Holmgren J. Vibrio cholerae expresses cell suprace antigens during intestinal infection which are not expressed diring in vitro culture//Infect. Immun. 1989. - Vol.57, №6. - P. 18091815.

196. Kabir S. Comparition and immunochemical properties of the cell surface proteins of Vibrio cholerae//J. Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 22352242.

197. Kalambaheti Т., Chaisre U., Srimanote P. et al. Immunogenicity and protective role of three formulations of oral cholera vaccine//Vaccine. -1998. Vol.16, № 2-3. - P. 201-207.

198. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth and seventh pandemic strains//Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №3. - P. 1947-1952.

199. Kato H., Fujihashi К., Kato R. et al. Oral tolerance revisited: prior oral tolerization abrogates cholera toxin-induced mucosal IgA responses//.!. Immunol. 2001. - Vol. 166, №5. - P. 3114-3121.

200. Kaper J.B., Moseley S.L., Falkow S. Molecular characterisation of environmental and nontoxigenic strains of Vibrio cholerae//Infect. Immun. 1981. - Vol. 32, №2. - P. 661-667.

201. Kerneis S., Bogdanova A., Kraehenbuhl J.-P., Pringault E. Conversion by Peyers patch lymphocytes of human enterocytes in vitro M-cells that transport bacteria//Science. 1997. - Vol.277, №5328. - P. 949-952.

202. Kikuta K., Kurata H., Naganine T. et al. Enhancement of DTH response by cholera toxin В subunit inoculated intranasally together with influenza HA vaccine/ZMicrobiol. Immunol. 1990. - Vol. 34, №3. - P. 337-346.

203. Kilian M., Mestecky J., Russell M.W. Defense mechanisms in volving Fc-dependent functions of immunoglobulin A and their supression by bacterial immunoglobulin A proteases//Microbiol. Rev. 1988. - Vol.52, №2. - P. 296-303.

204. Kim R.-H., Erkmann L., Lec W. et al. Cholera toxin and Cholera Toxin В subunit induce IgA switching through the action of TNf~pi//J. Immunol. -1998.-Vol. 160, №3,-P. 1198-1203.

205. Kim B.O., Shin S.S., Yoo Y.H., Pyo S. Peroral immunization with Helicobacter pylori adhesin protein genetically linked to cholera toxin A2B subunits//Clin. Sci (London). 2001. - Vol. 100, №3. - P. 291-298.

206. Kiyohura Т., Watanabe M., Jchinose A. et al. Cytotoxic activities of lym-phokine-activated killer cells and chemotherapy-activated killer cells are inhibited by cholera toxin//Trop. Med. 1992. - Vol.34, №1. - P. 21-27.

207. Klimpel G., Asuncion M., Haithcoat I., Niesel D. Cholera toxin and Salmonella typhimurium induce different cytokine profiles in the gastrointestinal tract//Infect. Immun. 1995. - Vol.63, №3. - P. 1134-1137.

208. Kurohane К, Kobayashi С, Imai Y. et al. Facilitated production of secretory IgA against Shiga toxin В subunits by intranasal application of antigen-coated polystyrene microspheres//Microbiol. Immunol. Infect. Immun. 2005. - Vol.49, №2. - P. 149-154.

209. Kurono Y., Kodama S., Shigemi H., Mogi G. Nasopharyngeal clearance by mucosal vaccination//Clin. Immunol, lmmunophatol. 1995,- Vol.76, №1. - P. 83.

210. Kobayashi R., Kohda Т., Kataoka K. et al. A novel neurotoxoid vaccine prevents mucosal botulism//J. Immunol. Microbiol. 2005. - Vol.174, №4.-P. 2190-2195.

211. Kweon N.M., Yamamoto M., Watanabe F. et al. A nontoxic chimeric en-terotoxin adjuvant induces protective immunity in both mucosal and systemic compartments with reduced IgE antibodies//J. Infect. Dis. 2002. -Vol. 186,№9.-P. 1261-1269.

212. Lankford Ch.E. Factors of virulence of V.cholerae//Annu.N.-Y.Acad.Sci.-1960. Vol. 88, №5. - P. 1203-1212.

213. Lavelle E.C., Jarnicki A., Mc Neeta E. Effects of cholera toxin on innate and adaptive immunity and its application as an immunomodulatory agent//J. Leucoc. Biol. 2004. - Vol. 160, №1. - P. 311-322.

214. Leal-Berumen I., Snider D.P., Barajas -Lopez, Marshall G.S. Cholera toxin increases IL-6 synthesis and decreases TNF-a production by rat peritoneal mast cells//J. Immunol. 1996. - Vol. 156, №1. - P. 316-321.

215. Lee C.K., Weltzin R., Soman G. et al. Oral administration of polymeric immunoglobulin A prevents colonization with Vibrio cholerae in neonatal mice//Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, №3. - P. 887-891.

216. Levine M.M., Kaper J.B., Black R.E., Clemento M. L. Neu knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine devel-opment//Microbiol. Rev. 1983. - Vol. 47, №4. - P. 510-550.

217. Liang W., Wang S., Yu F., Zhang L. et al. Construction and evaluation of a safe, live, oral Vibrio cholerae vaccine candidate, IEM108//Infect Immun. 2003. - Vol. 71, №10. - P. 5498-5504.

218. Lycke N., Holmgren J. Strong adjuvant properties of cholera toxin on gut mucosal immune responses to orally presented antigens//Infect. Immun. -1986.- Vol.59, №2. P. 301-308.

219. Lycke N., Bromander A., Ekman L. et al. Cellular basis of immunomodulation by cholera toxin in vitro with possible association to the adjuvant function in vivo//J. Immunol. 1989. - Vol. 142, №1. - P. 20

220. E^cke N., Erlandsson L., Ekman L. et al. Lack of J chain inhibits the transport of gut IgA and abrogates the development of intestinal antitoxic protection//.!. Immunol. 1999. - Vol. 163, №2. - P. 913-919.

221. Lycke N., Holmgren J. Intestinal mucosal memory and presence of memory cells in lamina propria and Peyer's patches in mice 2 years after oral immunization with cholera toxin//Scand. J. Immunol. 1986.- Vol.23, №5.-P. 611-616.

222. Lycke N., Holmgren J. Adoptive transfer of gut mucosal antitoxin memory by isolated В cells 1 year after oral immunization with cholera toxin//Infect. Immun. 1989. - Vol. 57, №4. - P. 1137-1141.

223. Lycke N. From toxin to adjuvant: basic mechanisms for the control of mucosal IgA immunity and tolerance// Immunol. Lett. 2005.- Vol.97, №2. - P. 193-198.

224. Ma D., Wolvers D., Stanisz A.H., Bienenstock J. Interleukin-10 and nerve growth factor have reciprocal upregularity effects on intestinal epithelial cells//Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 2003. - Vol.284, №5.-P. 1323-1329.

225. Marinaro M., Staats H.F., Hiroi T. et al. Mucosal adjuvant effect of cholera toxin in mice results from induction of T helper 2 (Th2) cells and IL-4//J. Immunol. 1995. - Vol. 155, №10. - P. 4621-4629.

226. Marinaro M., di Tommaso A., Urraus P. et al. Zonula occludens toxin is a powerful mucosal adjuvant for intranasally delivered antigens//Infect. Immun. 1999.- Vol.67, №3. - P. 1287-1291.

227. Martensen H., Haslov K., Mansa В., Bentzon M. W. Production, assay and partial characterization of guinea pig interleukin 2//J. Immunol. Meth. -1987. Vol.104, №1-2. - P. 209 - 217.

228. Martin M., Metzger D.J., Michalek S.M. et al. Distinct cytokine regulation by cholera toxin and type II heat-labile toxins involves differential regulation of CD40 ligand on CD4(+) T cells//Infect. Immun. 2001. -Vol.69, №7. - P. 4486-4492.

229. Martinez-Moczygemba M., Huston D.P. Biology of common beta receptor-signaling cytokines: IL-3, IL-5, and GM-CSF//J. Allergy Clin. Immunol. 2003. - Vol. 112, №4. - P. 653-665.

230. Mazanec M.B., Nedrud J.G., Kaetzel Ch.S., Lamm M.E. A three-fiered view of the role of IgA in mucosal defense//Immunol. Today. 1993. -Vol.14, №9.-P. 430-435.

231. Mbawuike J.N., Pacheco S., Acuna C.L. et al. Mucosal immunity to influenza without IgA: an IgA knockout mouse model//J. Immunol. 1999. -Vol. 162, №5. - P. 2530-2537.

232. Mc Dormott M.R., Bienenstock J. Evidence for a common mucosal immunologic system. Migration of В immunoblasts into intestinal, respiratory, and genital tissues//! Immunol.- 1979. Vol. 122, №5. - P. 18921898.

233. Moreau J.L., Chastanger P., Tanaka T. et al. Control of the IL-2 responsiveness of В lymphocytes by IL-2 and IL-4//J. Immunol. 1995. - Vol. 155, №7.-P. 3401-3408.

234. Murtaugh M.P., Foss D.L. Inflammatory cytokines and antigen presenting cell activation//Vet. Immunol. Immunopathol. 2002. - Vol.87, №3-4. - P. 109-121.

235. Neumeyer G. Die intestinale Immunabwehr//Biomodul. und Biother. Krebs Bds. Heidelberg, 1986. - P. 179-185.

236. Oka M., Iisuka N., Yamamoto K. et al. The influence of IL-6 on the growth of human esophageal cancer cell lines//J. Interfer. Cytokine Res. -1996.-Vol. 16.-P. 209-217.

237. Owen R.L. et al. M-cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration//J. Infect. Dis. 1986.- Vol. 153, №6. - P. 1108-1118.

238. Owen R.L. Mid-life crisis for M-cells//Gut. 1998. - Vol. 25, №1. - P. -11-12.

239. Pacheco S.E., Mbawuike I.N., Harriman G.R. Influenza haemagglutinin induces a strong systemic and mucosal immune response in mice immunized by the intragastric or intranasal routes//Clin. Immunol. Immunopa-thol. 1995. - Vol. 76, №1. - P. 97.

240. Piancatelli D., Romano P., Schastiani A. et al. Local expression of cytokines in human colorectal carcinoma: evidence of specific interleukin-6 expression//Infect. Immun. 1999. - Vol. 22, №1. - P. 25-32.

241. Pincus S.H., Rosa P.A., Spangrude G.J. et al. The interlay of microbes and their hosts//Immunol. Today.- 1992. Vol. 13, №12. - P. 471-473.

242. Ploix C., Bergerot I., Durand A. et al. Oral administration of cholera toxin B-insulin conjugates protects NOD mice from autoimmune diabetes by inducing CD4+ regulatory T-cells//Diabetes. 1999. - Vol. 48, №11. - P. 2150-2156.

243. Pollitzer R. Problemes d'immunologie//Bull.WHO. 1955. - Vol.12. - P. 945-1107.

244. Pollitzer R. Исследования по холере. Клиническая патология. //Bull.WHO. 1957. - Vol. 16. - P. 123-199.

245. Powrie F., Menos S., Coffman R. Interleukin-4 and IL-10 synergize to inhibit cell-mediated immunity in vivo//Eur. J. Inter. Immunol. 1993. -Vol. 23.-P. 2223 -2229.

246. Procopio D.O., Teixeira M.M., Camargo M.M. et al. Differential inhibitory mechanism of cyclic AMP on TNF-alpha and IL-12 synthesis by macrophages exposed to microbial stimuli//Brit. J. Pharmacol. 1999. -Vol.127,№5.-P. 1195-1205.

247. Qadri F, Makela P.H., Holmgren J. et al. Enteric infections in an endemic area induce a circulating antibodysecreting cell response with homing potentials to both mucosal and systemic tissues//! Infect. Dis. 1998.- Vol. 177, №6.-P. 1594-1599.

248. Qadri F. , Ragib R., Ahmed F. et al. Increased levels of inflammatory mediators in children and adults infected with Vibrio cholerae 01 and 0139//Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002. - Vol. 9, №2. - P. 221-229.

249. Richards C.M., Aman A.T., Hirst T.R. et al. Protective mucosal immunity to ocular herpes simplex virus type 1 infection in mice by using Escherichia coli heat-labile enterotoxin В subunit as an adjuvant//J. Virol. -2001. Vol. 75, №4. - P. 1664-1671.

250. Richardson S.H., Giles S.C., Kruger K.S. Sealed adult mice: new model for enterotoxin evaluations//Infect. Immun. 1984. - Vol. 43, №2. - P. 482-486.

251. Richardson S.H., Michalski J., Kaper J. Haemolysin production and cloning of two haemolysin determinants from classical Vibrio chol-erae//Infect. Immun. 1986. - Vol. 54, №2. - P. 415-420.

252. Rodrigues B.L., Rojas A., Beniter T.A. Cholera toxin differentially regulates nitric oxide synthesis tumor necrosis factor-alpha production and respiratory burst in murine macrophages//FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 22, №3. - P. 193-198.

253. Rocha M.F., Aguiar J.E., Sidrim J.J. et al. Role of mast cells and proinflammatory mediators on the intestinal secretion induced by cholera toxin//Toxicol. 2003. - Vol. 42, №2. - P. 183-189.

254. Rothkotter H.T., Kirchholff Т., Rabst R. Gewinnung und Charakterierung von Lymphozyten aus dem Epithel und der Lamina propria der Dunn-darmsch leimhaut//Ann.Anat. 1992. - Vol. 174, №2. - P. 170-171.

255. Rudin A., Riise G.C., Holmgren J. Antibody responses in the lower respiratory tract and male urogenital tract in humans after nasal and oral vaccination with cholera toxin В subunit//Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, №4. - P. 2884-2890.

256. Ruede G., Rieser C., Kofler N. et al. Antigen-specific immune responses folloing oral immunization with cholera toxin and E.coli heat labile en-terotoxin//Clin. Immunol, Immunopath. 1995. - Vol. 76, №1-3. - P. 92.

257. Russell P.H., Mackay D.K.J., Ozdemir I. A rapid enzyme-linked semi-microwell assay for the enumeration of antibody-forming cells to viral and bacterial antigens in domestic animals//J.Immunol. Meth. 1987.-Vol.l01,N2.-P. 229-233.

258. Ryan E.T., Butterton J.R., Smith R.N. et al. Protective immunity against Clostridium difficile toxin A induced by oral immunization with a live, attenuated Vibrio cholerae vector strain//Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, №7.-P. 2941-2949.

259. Ryan E.T., Bridges E.A., Crean T.I. et al. Local production of anti-Vibrio cholerae mucosal antibody in reproductive tract tissues after cholera//J. Infect Dis. 2001. - Vol. 184, №5. - P. 643-647.

260. Saini M.S., Liberati D.M., Diebel L.N. Sequential changes in mucosal immunity after haemorrhagic shock//Amer. Surg. 2001. - Vol. 67, №8. -P.-797-801.

261. Saito H., Kanamori Y., Takemori et al. Generation of intestinal T-cells from progenitors residing in gut cryptopatches//Science. 1998. - Vol. 280, №5361.-P. 275-278.

262. Saito M., Otake S., Ohmura M. et al. Protective immunity to Streptococcus mutans induced by nasal vaccination with surface protein antigen and mutant cholera toxin adjuvant/AI. Infect. Dis. 2001. - Vol. 183, №5. - P. 823-826.

263. Sanchez J., Johansson S., Lowenadler B. et al. Recombinant cholera toxin В subunit and gene fusion proteins for oral vaccination//Rev. Med. Microbiol. 1990. - Vol. 141, №7-8. - P. 971-979.

264. Sarsfiold P., Jones D.B., Rinne A., Wright D.H. The organization of accessory cells in mucosal lymphoid tussue//J. Pathol. 1993. - Vol. 170. -Supp. l.-P. 341.

265. Sharma R. Pneumonia cholera and dysentery feared after earthquake//Brit. Med. J. 2001. - Vol. 10. - P. 317-322.

266. Shigemi H., Kurono Y., Kodama S., Mogi G. Mucosal immunity and turnover of nontypeable Haemophilus influenzae in the nasophar-ynx//Clin. Immunol. Immunopathol. 1995. - Vol. 76, №1. - P. 60.

267. Slavin A.Y., Spahn Th.W., Komagata Y. et al. The role of IL-4 in the induction of oral tolerance//Tolerance and Autoimmunity. Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. Keystone, Colorado. - 1997. -P.90.

268. Smith R.S. The cytokine theory of headache//Med. Hypotheses. 1992. -Vol. 39, №2.-P. 168-174.

269. Spira W.M., Sack R.B. Kinetics of early cholera infection in the removable intestinal tie-adult rabbit diarrhea model//Infect. Immun. 1982. -Vol.35, №3.-P. 952-957.

270. Stevceva L., Ferrari M.G. Mucosal adjuvants//Curr. Pharm. Des. 2005. -Vol. 11,№6. -P. 801-811.

271. Takahashi Т., Yoshida Y., Hatano S. et al. Reactivity of secretory IgA antibodies in breast milk from 107 Japanese mothers to 20 environmental antigens//Biol. Neonate. 2002. - Vol. 82, №4. - P. 238-242.

272. Taylor D.N., Cardenas Y., Sancher J.L. et al. Two-year study of the protective efficacy of the oral whale cell plus recombinant В subunit cholera vaccine in Peru//J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181, №5. - P. 1667-1673.

273. Tamura S-I., Miyata K., Matsuo K. et al. Acceleration of influenza virus clearance by nasal Thl cells in mice immunized intranasally with adjuvant-combined nucleoprotein//Clin. Immunol. Immunopathol. 1995. -Vol. 76, №1.-P. 100.

274. Tijesen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. Amsterdam, 1985.-549 p.

275. Teter K., Jobling M.G., Holmes R.K. Vesicular transport is not required for the cytoplasmic pool of cholera toxin to interact with the stimulatory alpha subunit of heterotrimeric G protein// Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, №12.-P. 6826-6835.

276. Uren Т.К., Wijburg O.L., Simmons С. et al. Vaccine-induced protection against gastrointestinal bacterial infections in the absence of secretory an-tibodies//Eur. J. Immunol. 2005. - Vol. 35, №1. - P. 180-188.

277. Van Laethem Y. Vaccination for the traveler//Rev . Med. Brux. 2002. -Vol. 23, №4. - P. А 251-A255.

278. Vezys V., Lefrancois L. Inflammatory signals drive organ-specific autoimmunity to normally cross-tolerizing endogenous antigen//J. Immunol. -2002. Vol. 169, №12. - P. 6677-6680.

279. Wapnir R.A., Teichberg S. Regulation mechanisms of intestinal secretion: implications in nutrient absorption//! Nutr. Biochem. 2002. - Vol. 13, №4. - P. 190-199.

280. Wassen L, Jertborn M. Kinetics of local and systemic immune responses after vaginal immunization with recombinant cholera toxin В subunit in humans// Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - Vol. 12, №3. - P. 447-452.

281. Weaver E.A., Jsuda H., Goldblum R.M. et al. Relationschip between phagocytosis and immunoglobulin A release from human colostral macro-phages//Med. Int. 1982. - Vol. 25. - P. 1044 - 1048.

282. Weir E., Haider S. Cholera outbreaks continue//! Amer. Microbiol. Soc. -2004. Vol. 170, №7. - P. 1092-1093.

283. Weiss G., Bogdan C., Hentze M. Pathways for the regulation of macrophage iron metabolism by the anti-inflammatory cytokine IL-4 and IL-13//J. Immunol. 1997. - Vol. 158, №1. - P. 420-425.

284. Williams N. T cells on the mucosal frontline//Science. 1998. - Vol. 280, №5361.-P. 198-200.

285. Williamson E., Westrich G.M., Viney I.L. Modulating dendritic cells to optimize mucosal immunization protocols//J. Immunol. 1999. - Vol. 163, №7.-P. 3668-3675.

286. Wilson A.D, Bailey M., Williams N.A. The in vivo production of cytokines by mucosal lymphocytes immunized by oral administration of keyhole limpet hemorianin using cholera toxin as an adjuvant//Eur. J. Immunol. 1991. - Vol. 21, №10. - P. 2333-2339.

287. Wilson A.D., Williams N., Clark C.I., Stokes C.R. Antigen specific responses of lamina propria cells after oral priming using cholera toxin as an adjuvant//Eur. Ted. Immunol. Soc. 10 th Meet.: Abstr Edinburgh, 1990.-P. 49.

288. Woogen S.D., Ealding W., Elson C.O. Inhibition of murine lymphocyte proliferation by the В subunit of cholera toxin//J.Immunol. 1987. - Vol. 139, №11.-P. 3764-3770.

289. Wu H.-Y, Nikolova E.B., Beagley K.W. et al. Development of antibody secreting cells and antigen-specific Tcells in cervical lymph nodes after intranasal immunization//Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, №1. - P. 227235.

290. Wu J.Y., Wade W.F., Taylor R.K. Evaluation of cholera vaccines formulated with toxin-coregulated pilin peptide plus polymer adjuvant in mice//Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №12. - P. 7695-7702.

291. Yamamoto K., Takieda L., Miwatani Т., Graig LP. Purification and some properties of a non 01 Vibrio cholerae enterotoxin that is identical to cholera enterotoxin//Infect. Immun. 1983. - Vol. 39, №3. - P. 11281135.

292. Yamamoto S., Kiyono H., Yamamoto M. et al. A nontoxic mutant of cholera toxin elicits Th2-type responses for enhanced mucosal immu-nity//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, №10. - P. 5267-5272.

293. Yamamoto Т., Flbert M.J., Bradley S.R. et al. Adherence to human small intestines of capsulated Vibrio cholerae 0139//FEMS Microbiol. Lett.-1994. Vol. 119, №1-2. - P. 229-235.

294. Yuta M., Takahashi 1., Terawaki S. et al. Nasal administration of cholera toxin (CT) suppreses clinical signs of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)//Vaccine. 2001. - Vol. 20, №1-2. - P. 134-139.

295. Zerler B. The soluble interleukin-2 receptor as a marker human neoplasia and immune status//Cancer Cells. 1991. - Vol. 3, №12. - P. 471.

296. Zhang Y., Pacheco S., Acuna CI. et al. Immunoglobulin A-deficient mice exhibit altered T helper 1-type immunity to influenza virus//Infect. Immun. 2002. - Vol. 105, №3. - P. 286-294.

297. Zidek Z. Role of cytokines in the modulation of nitric oxide production by cycles AMP//Eur. Cytokine Netw. 2001. - Vol. 12, №1. - P. 22-32.

298. Zimecki M., Cytokiny wregulacji odpowiedzi immunologicznej//Kosmos (RP). 1992. - Vol. 41, №4. - P. 439-449.

Информация о работе

Омельченко, Наталья Дмитриевна
кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы