Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Индикация факторов вирулентности энтеробактерий, дифференциальная диагностика эшерихиоза птиц

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Индикация факторов вирулентности энтеробактерий, дифференциальная диагностика эшерихиоза птиц"

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ИНДИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗА ПТИЦ

06.02.02 — Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

4 АЕК 2014

МОСКВА 2014

005556329

005556329

Работа выполнена на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ленченко Екатерина Михайловна,

доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», профессор кафедры «Ветеринарная медицина»

Скляров Олег Дмитриевич,

доктор ветеринарных наук, ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), заведующий лабораторией качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств

Маннапова Рамзия Тимергалеевна,

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева (ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА), профессор кафедры «Микробиология и иммунология»

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)

Защита состоится «23» декабря 2014 г. в «12.30» часов на заседании диссертационного совета Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан У/ 2014 г.

Автореферат размещен на официальном сайте _

Министерства образования и науки РФ http://vak.ed.ni/ V6 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета^.

доктор ветеринарных наук, профессор Андрианова Т.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. При содержании на ограниченных площадях, искусственный микроклимат, поточная система выращивания птицы обусловливают развитие и распространение инфекционных болезней, в том числе, вызываемых патогенными энтеробактериями (Бессарабов Б.Ф., 1980; Стрельников А.П., 1987; Тугаринов O.A., 1987; Шустер Б.Ю., 1987; Каврук Л.С., 1994; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Ленев C.B., 1996; Смирнова Л.И., 1996; Капустин A.B., 2001; Вершняк Т.В., 2003; Артемьева Т.Н., 2004; Салаутин В.В., 2004; Степаненко И.П., 2005; Крупальник В.Л., 2005; Коровин В.И., 2005; Хатько Н.Ф., 2005; Гусев В.В.. 2006; Бедоева З.М., 2006; Павлова И.Б. и соавт., 2007; Субботин В.В., 2007; Панасенко A.C., 2008; Рождественская Т.Н., 2011; Кононенко А.Б. и соавт., 2011; Маннапова Р.Т., 2012; Пименов Н.В., 2012; Костенко Ю.Г. и соавт., 2012; Алиев A.C., Алиева А.К., 2013; Ирза В.Н., 2014; Панин А.Н., Куликовский A.B., 2014; Collins M.D., 2001; Krysta H.R., 2006). В структуре инфекционных болезней птиц в 2012 г. заболеваемость эшерихиозом составила 53,9 %, падеж — 92,0 %; в 2013 г. массовая доля сальмонеллеза - 12,0 %, эшерихиоза - 40,0 % (Венгеренко Л.А., 2012; Фисинин В. И., 2013; Бобылева Г.А., 2013; Джавадов Э.Д., 2014). При персистенции микроорганизмов в организме бактерионосителей может происходить контаминация пищевого сырья энтеробактериями, в том числе E.coli 0157:Н7, циркулирующими в птицеводческих хозяйствах и выделенных из мяса бройлеров (Бондаренко В.М., Шаманова М.А., 2004; Степаншин Ю.Г. и соавт., 2005; Doute МО., Schoeni J.L., 1987; Bitzan M., Ludwig К., 1993; Thomm В., 2000). Распространенность энтерогеморрагических штаммов среди поголовья кур и индеек составила 9,3 % из общего числа изолятов (Онищенко И.С., 2008). При изучении видового состава изолятов, циркулирующих среди поголовья птицы, наряду с сальмонеллами и патогенными эшерихиями, выделены бактерии K.pneumonia, P.vulgaris, Y.pseudotuberculosis, C.jejuni, P.aeruginosa (Куликовский A.B., 1998; Ленченко E.M., 2000, 2014; Борисенкова A.H., 2008; Вашин И., Стоянчев Т., 2008; Шуляк Б.Ф., 2008; Ольховик О.П., 2009; Скляров О.Д. и соавт., 2010; Козак С.С., 2014; Suhimaran S.K., 2003; Westermark L., 2013). При инфицировании восприимчивых видов реализация патогенных свойств энтеробактерий обеспечивается факторами вирулентности, кодируемыми хромосомными, плазмидными генами и интегрированными в хромосому бактериофагами (Светоч Э.А., 1992; Молофеева Н.И., 2004; Орлова К.А., 2004; Пирожков М.К., 2002, 2011; Letarov A.V., 2010; Goodridge L.D., 2011; Sulakvelidze А., 2011; Pasmans F., 2012; Berghaus R. D., 2013). Для оптимизации схемы бактериологической диагностики, характеризующейся трудоемкостью, продолжительностью, ретроспективностью идентификации и дифференциации эпизоотических штаммов, целесообразно изучение этиологической значимости факторов вирулентности в патогенезе и иммуногенезе инфекционного процесса при диссеминации микроорганизмов в тканях и органах птиц, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Цель работы: изучить видовой состав и патогенные свойства изолятов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, динамику развития патологических процессов при диссеминации в ткани и органы птиц для совершенствования индикации факторов вирулентности энтеробактерий и дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц

Задачи исследований:

- изучить этиологическую структуру болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями;

- изучить факторы вирулентности и фенотипические признаки, связанные с плазмидами вирулентности энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов;

апробировать и изыскать эффективные дифференциально-диагностические среды, лабораторные модели, молекулярно-генетические экспресс-методы идентификации ДНК патогенных бактерий;

- изучить дифференциально-диагностические признаки патогенных энтеробактерий при диссеминации в ткани и органы птиц;

- изучить влияние токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов в тканях и органах птиц

Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность применения тест-системы «Ампли-Сенс Эшерихиозы-FL», основанной на методе полимеразной цепной реакции, что позволяет в составе комплекса видовой идентификации и дифференциации сходных видов энтеробактерий идентифицировать ДНК патогеипых E.coli в течение 3 ч, с чувствительностью 250 бактериальных клеток в исследуемом образце, корреляцией результатов исследований с применением лабораторных моделей (г=0,89). При экстравазации витального красителя коэффициент проницаемости кровеносных сосудов составляет 1,02±0,09-1,37±0,17, термостабильные токсины прод5'цировали 75,0 % культур микроорганизмов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов. При трансовариальном и интраназальном заражении птиц диссеминация энтеробактерий в ткани и органы наблюдается через 24^)8 ч. Динамика развития патологических процессов при действии цитотоксинов E.coli 0157:Н7 характеризуется дифференциальными признаками, обусловленными дистрофическими и некротическими процессами гепатобиллиарной системы и нефротоксическим синдромом, проявляющимся застойным геморрагическим инфарктом, некрозом эпителия канальцев иефронов почек птиц.

Практическая значимость работы. На основе апробации и подборе эффективных диагностических сред, тест-систем для идентификации патогенных бактерий разработаны «Методические рекомендации по индикации энтеробактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах», утвержденные академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины

Россельхозакадемии Смирновым A.M. (протокол № 7 от «16» октября 2013 г.).

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни», «Ветеринарная медицина» ФГБОУ

ВПО «МГУПП» (М., 2011-2014 гг.); на IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2011); на Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов «День науки IV» (М., 2014).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения этиологической структуры болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями;

- результаты изучения факторов вирулентности и фенотипических признаков, связанных с плазмидами вирулентности энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов;

- результаты изучения дифференциально-диагностических признаков патогенных энтеробактерий при диссеминации в ткани и органы птиц, на основе апробации и подборе эффективных питательных сред, лабораторных моделей, молекулярно-генетических экспресс-методов идентификации ДНК патогенных бактерий;

- результаты изучения влияния токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов для усовершенствования схемы видовой идентификации эпизоотических штаммов в составе комплекса дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, 2 приложений. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 27 таблиц, 30 рисунков. Библиографический список включает 218 источников, из них 98 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с 2011 по 2014 гг. на кафедре «Ветеринарная медицина» ФГБОУ ВПО «МГУПП», в опытах были использованы паспортизированные штаммы: Escherichia coli 0157:Н7 (Stxl), №43890; Escherichia coli 0157:H7 (Stx2), №161; Escherichia coli OJ38.K81, № 723; Salmonella enteritidis, № 204; Salmonella typhimurium №, 5715; Klebsiella pneumonia, №24; Proteus vulgaris H2091; Yersinia enterocolitica S- и Ä-формы №383; Staphylococcus aureus №123. Эпизоотологические, клинические, патологоанатомические исследования проводили общепринятыми методами (Жаров А. В., 1981; Бакулов И. А. и соавт., 1982; Джупина С. И., 1991; Сидорчук А. А., и соавт., 2005; Макаров В. В., и соавт., 2009). Бактериологические исследования проводили в соответствии с методическими указаниями: «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды» (М., 1990); «Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (М.,

2000); «Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (М., 1999). При ретроспективном анализе этиологической структуры болезней птиц в птицеводческом хозяйстве ФГУП ППЗ «Птичное» Россельхозакадемии учитывали первичные данные: «Отчет о заразных болезнях животных» форма 1-вет; «Отчет о противоэпизоотических мероприятиях» форма 1-вет А; «Отчет о незаразных болезнях животных» форма 2-вет; «Журнал для регистрации результатов патологоанатомического вскрытия птиц» форма 5-вет; «Журнал записи эпизоотического состояния соседних птицеводческих хозяйств» форма б-вет. Дифференциально-диагностические свойства сред изучали в соответствии с «Рекомендациями по организации и проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных лабораторий» (М., 2011). Количественный и видовой состав энтеробактерий учитывали в 1,0 г исследуемого материала (я=100): цыплят кросса «Шейвер Уайт» и «Шейвер Браун»; утят породы «Пекинская»; фазанов «Chrysolophus piclus»; павлинов «Pavo cristatus»; страусов «Rheidae», «Dromaius novaehollandiae». Для изучения вторичной контаминации энтеробактериями исследовали пробы продукции птицеводства (и=60). Индикацию и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами (Биргер М.О., 1973; Герхардт Ф. и соавт., 1984; Лабинская A.C., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). Серогрупповую принадлежность определяли О-коли сыворотками и антиадгезивными сыворотками (ФГУП «Армавирская биофабрика», ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии»). При изучении факторов вирулентности бактерий учитывали адгезивные, инвазивные, токсигенные свойства (Вартанян Ю.П. и соавт., 1978; Тимченко Н.Ф. и соавт., 2004; Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 2010). Патогенные свойства микроорганизмов изучали на лабораторных моделях: белые беспородные мыши («=250); эмбрионы птиц отряда Куриные породы «Белый леггорн», отряда Гусиные породы «Пекинская» («=60), цыплята породы «Белый леггорн», «Австралорп голубой» («=75). Экстракцию ДНК бактерий проводили набором «Ветбиохим», индикацию ДНК патогенных E.coli с применением тест-системы «Ампли-Сенс Эшерихиозы-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии) на приборе «Rotor-Gene Q» (Qiagen, Германия), в соответствии с «Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах» (М., 2011). Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «Statistika» для PC Microsoft Excel 2007.

Выражаем благодарность академику РАН Панину А.Н. (ФГБУ «ВГНКИ») за предоставленную возможность выполнения части опытов на экспериментальной базе «Манихино», доктору биологических наук, профессору Гребенниковой Т.В. (ФГУ «НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского») за консультативную помощь при освоении молекулярных методов исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Этиологическая структура болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями

При ретроспективном анализе этиологической структуры болезней птиц за период 2010—2013 гг., в соответствии с первичными данными ветеринарной отчетности, смертность птиц составила 2,4—3,4 %; в 2010 г. - 2,7 %, в том числе молодняка до 105 суток - 1,2 %; 2011 г. - 2,8 % и 0,8 %; 2012 г. - 2,4 % и 0,9 %; 2013 г. - 3,4 % и 0,9 %, соответственно. Летальность птиц колебалась в пределах от 1,5 до 2,7 %; 2010 г. - 2,2 %; 2011 г. - 2,4 %; 2012 г. - 1,5 %; 2013 г. - 2,7 %. В общей структуре патологии птиц доля болезней органов пищеварения составляла 21,0 - 25,0 %, в частности, в 2010 г. было зарегистрировано 3787 больных птиц, что составляло 25,0 % от общего числа болезней, в том числе молодняка до 105 суток - 2425 (64,0 %), в 2011 г. - 2919 (21,0 %) и 897 (30,72 %); в 2012 г. - 2304 (24,0 %) и 1529 (66,36 %); в 2013 г. -3011 (22,0 %) и 1115 (37,03 %), соответственно. При изучении колонизационной резистентности кишечника учитывали индекс колонизации — отношение количества микроорганизмов (КОЕ) в 1,0 г исследуемого материала клинически здоровых птиц (контроль) и выделенных при болезнях органов пищеварения (опыт) (табл. 1).

Таблица 1

Результаты изучения колонизационной резистентности кишечника птиц

Группа птиц Количество бактерий (КОЕ, Ig/r) Индекс колонизации, %

Контроль Опыт

5-ти суточные 4,69±0,13 5,84±0,15 0,803

10-ти суточные 5,69±0,24 6,77±0,11 0,840

15-ти суточные 5,95±0,19 7,07±0,21 0,841

Для первичной идентификации родов семейства учитывали отношение количества идентифицированных культур микроорганизмов от общего числа типичных для вида колоний (специфичность, %), выросших на средах: «Эндо», «Плоскирева», «Висмут сульфит агар» - «ВСА», Агар Мак Конки с сорбитом «Sorbit-Мас Сопку agar» («Smac agar»); «Дезоксихолат-цитратный агар с лактозой и сахарозой» («Deoxycholate Citrate Lactose Sucrose agar» - «DCLS agar»)-, «Бриллиантовый зеленый агар» («Brilliant green agar» - «Brilliant agar»); «Триптоно-желчный-Х-глюкуронидный агар» («Tryptone bile X-Glucoronidae medium agar» - «ТВХ agar»); «Хромокульт колиформ агар» («Chromocult Coliform agar» — «Chrom agar»); «Ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар» («Xylose lysine deoxycholate agar» — «XLD agar») «Селективный агар для иерсиний» «Yersinia selective agar» («YS agar»). При видовой идентификации типичных для семейства Enterobacteriaceae изолированных колоний, исследовали морфологические и тинкториальные

свойства микроорганизмов. При наличии грамотрицательных палочек оксидазаотрицательные, каталазаположительные культуры микроорганизмов пересевали в пробирки со скошенным МПА для изучения ферментативных свойств. При идентификации культур микроорганизмов специфичность среды «Эндо» относительно невысокая от 22,2 до 78,1 %, за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза), что не позволяло дифференцировать колонии сходных видов энтеробактерий. Для дифференциации энтеробактерий специфичность «ТВХ agar» несколько выше по сравнению с предыдущей средой, от 28,1 до 89,5 %, за счет выявления специфического фермента - ß-глюкуронидаза. За счет наличия хромогенных субстратов, расщепляющихся под воздействием двух специфических ферментов бактерий, специфичность среды «Chrom agar» от 80,0 до 94,8 % (табл. 2).

Таблица 2

Результаты исследований дифференциальных признаков энтеробактерий

Среды Дифференциальные признаки энтеробактерий при 37 °С, 18 ч

Колонии Е. coli К. pneumonia P. vulgaris

«Эндо» Лактоза «+» красные 55 \ 43 37 \ 14 -

78,1 37,8

Лактоза «-» бесцветные — ~ 54 \ 12

22,2

«ТВХ agar» Р-глюкуронидаза «+» фиолетовые 48 \ 43 25 \ 7 -

89,5 28,1

Р-глюкуронидаза «-» бесцветные - - 63 \ 18

28,5

«Chrom agar» Р-глюкуронидаза «+» Р-галактозидаза «+» фиолетовые 39 V 37

94,8

Р-глюкуронидаза «-» Р-галактозидаза «-» бесцветные 15 \ 12

80,0

Р-глюкуронидаза «-» Р-галактозидаза «+» красные 18 \ 16 -

88,8

Примечание: числитель - типичные колонии; знаменатель - специфичность (%)

При идентификации изолятов, выделенных при болезнях органов пищеварения птиц, 95 культур микроорганизмов были отнесены к семейству Enterobacteriaceae: E.coli 52 (54,7 %), K.pneumonia 24 (25,2 %); P.vulgaris 19 (20,0 %). Для серологической идентификации определяли серогрупповую принадлежность О-коли сыворотками, идентифицировали 38 (73,0 %) культур микроорганизмов Е.coli, серогруппа 01 - 12 (31,5 %), 02 - 8 (23,0 %), 078 - 7 (18,4 %), 015 - 7 (18,4 %), OI 11 - 2 (5,2 %), 26,9 % типировать не удалось. Из 52 культур микроорганизмов 15 (28,8 %) продуцировали адгезивные антигены: 01:К99; 01:F41; 01:K99:F41; 02:К88; 02:K99:F41; 078:К88; 078:К99; 015:K88:F41 (табл.3).

Таблица 3

Результаты серологической идентификации Е. coli

Антигенная структура E.coli Количество, % положительных результатов

I II III IV V

Абс. | % Абс. I % Абс. | % Абс. | % Абс. I %

О-коли агглютинирующие поливалентные сыворотки

Группа 1 12 38,7 8 25,8 3 9,6 6 19,3 2 6,4

Группа 2 - - - - 1 14,2 3 42,8 3 42,8

Группа 3 - - - - - - - - - -

Группа 4 - - - - - - - - - -

О-коли агглютинирующие моновалентные сыворотки

01 4 33,3 8 100,0 - - - - - -

02 5 41,6 - - 1 25,0 1 11,1 - -

078 3 25,0 - - 2 50,0 5 55,5 - -

Olli - - - - - - - - 2 40,0

015 - - - - 1 25,0 3 33,3 3 60,0

Адгезивные агглютинирующие сыворотки

К88 - - - - 1 50,0 2 40,0 - -

К99 - - 2 25,0 1 50,0 - - 3 50,0

F41 2 50,0 3 37,5 - - 1 20,0 - -

Примечание: ¡-цыплята; ¡¡-утята; Ш-фазаны; IV- павлины; V-страусы

При изучении вторичной контаминации бактериями продукции птицеводства, для подбора эффективных дифференциально-диагностических сред проводили опыты с чистыми и смешанными суспензиями микроорганизмов S.enteritidis, E.coli OI57H7, E.coli OI38, K.pneumonia, Y.enterocolitica, содержащими 1 млрд бакт. клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Для выделения чистой культуры микроорганизмов исследуемый материал высевали по 0,1 мл на поверхность дифференциально-диагностических сред и культивировали при 37 °С 24 ч. Для видовой идентификации сальмонелл установлена эффективность среды «XLD agar», клебсиелл - «Brilliant agar», иерсиний - «YS agar», позволяющие дифференцировать сальмонеллы, не ферментирующие лактозу, сахарозу, образующие сероводород, клебсиеллы, ферментирующие лактозу, сахарозу, иерсинии ферментирующие маннит. Специфичность указанных сред для видовой идентификации микроорганизмов - 80,0-94,8 %. Для дифференциации патогенных штаммов эффективными являются среды «Smac agar», aChrom agar» за счет отсутствия способности расщеплять сорбитол и продуцировать фермент ß-глюкуронидазу, микроорганизмы E.coli 0157:Н7 формировали колонии, отличающиеся от колоний типичных для эшерихий, тогда как на среде «Эндо» формировали сходные с лактозоположительными эшерихиями (рис. 1).

E.coli 0157:H7 E.coli0138 E.coli 0157:H7 E.coli 0138

а б

Рис.1. Дифференциально-диагностические признаки колоний бактерий: а - на среде «.Chrom agar»; б - на среде «Эндо»

Для идентификации изолятов, выделенных при изучении вторичной контаминации бактериями продукции птицеводства, исследуемые пробы (мясо птицы, фарш из мяса птицы, субпродукты) т=25,0 г, помещали в пептоннуш воду в соотношении 1:5. Из числа выросших три типичные для вида колонии пересевали в пробирки со скошенным МПА, культивировали 16-20 ч при 37 0 С, одновременно изучали морфологию бактерий в мазках, окрашенных по Граму. Биохимическую идентификацию и ферментативные свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса, антигенную структуру бактерий изучали в реакции агглютинации на стекле с О-агглютинирующими диагностическими сыворотками. Из числа идентифицированных культур микроорганизмов, отнесенных к семейству Enterobacteriaceae, 42,8 % составляли E.coli'. серогруппы Ol 11 (33,3 %), 015 (50,0 %), 041 (16,6 %), 35,7 % P.vulgaris-, 14,2 % К.pneumonia", 7,1 % E.aerogenes (табл. 4).

Таблица 4

Результаты изучения видового состава энтеробактерий

Видовой состав энтеробактерий Количество идентис жцированных микроорганизмов

Мясо птицы (п=20) Фарш из мяса птицы (п=20) Субпродукты (п=20)

Абс. % Абс. % Абс. 1 %

КМАФАнМ 32±0,15 xl0J 79±0,06 xl0J 38±0,12 xl0J

БГКП 9 26,4 19 55.8 6 17,7

E.coli 5 55,5 6 40,0 3 50,0

Klebsiella 2 22,2 3 31,5 - -

Enterobacter - - 3 31,5 - -

Proteus 2 22,2 7 36,8 3 50,0

На основе изучения сравнительных характеристик дифференциально-диагностических сред при индикации изолятов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, всего идентифицировано 129 культур микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Е. coli (51,1 %) Ol:К99; 01:F41; 01:K99:F41; 02:К88; 02:K99:F41; 078:К88; 078:К99; 015:K88:F41; K.pneumonia (22,5 %); P.vulgaris (24,0 %); E. aerogenes (1,3 %).

3.2. Результаты изучения факторов вирулентности энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов

3.2.1. Результаты изучения адгезивных, инвазивных свойств, устойчивости энтеробактерий к фагоцитозу

Адгезивные, инвазивные, цитотоксические свойства, устойчивость микроорганизмов к фагоцитозу изучали при взаимодействии с клетками крови птиц, культурой клеток «Vero». При взаимодействии с клетками крови птиц 38 (88,3 %) культур микроорганизмов являлись адгезивными, в том числе, высокоадгезивные - 15 (39,4 %), среднеадгезивные - 23 (60,5 %). Фагоцитарный индекс (количество лейкоцитов, поглотивших микроорганизмы), составил от 12,3±0,39 до 42,0±1,8. фагоцитарное число (количество микроорганизмов, поглощенных каждым лейкоцитом) — от 1,2±0,12 до 6,3±0Д2 (табл. 5).

Таблица 5

Результаты изучения адгезивных, инвазивных свойств, устойчивости энтеробактерий к фагоцитозу

Виды бактерий Результаты взаимодействия с клетками крови, М±т

Средний показатель адгезии Фагоцитарный индекс, 24 ч Фагоцитарное число, 24 ч

30 мин 24 ч

S. enteritidis 3,5±0,14 4,8±0,35 42,0±1,8 6,3±0,12

Е. coli Ol 6,2±0.13 6,6±0,21 19,0±0,6 1,5±0,14

Е. coli 0157:Н7 3,5±0,17 3,6±0,75 18,3±1,02 1,2±0,12

K.pneumonia 5,5±0,14 5,8±0,19 17,0±1,2 2,4±0,22

P. vulgaris 2,5±0,14 3,7±0,29 12,3±0,39 1,2±0,16

Y.enterocolitica S 3,7±0.15 4,4±0,85 29,0±1,2 1,6±0,21

Y.enterocolitica R 2,6±0,75 2,9±0,14 31,6±0,42 2,2±0,14

Примечание: р<0,01

Для изучения адгезивных и инвазивных свойств микроорганизмов культуру клеток «Vero» культивировали в питательной среде Игла MEM с 10,0 % телячьей сыворотки в объеме 2,0 cmj на покровных стеклах размером 8,0 х 24,0 мм в 12-ти луночных планшетах при 37 °С в течение 24 ч. Исследуемую взвесь микроорганизмов вносили в лунки планшета в дозе ЗхЮ7 бактерий/см3. Из 43 изученных культур микроорганизмов адгезивными были 39 (90,6 %). Средний показатель адгезии S.enteritidis - 18,0±0,2; E.coli - 28,6±0,1-40,2±0,4; K.pneumonia - 25,2±0,2; P.vulgaris - 14,2±0,2: Y.enterocolitica 5-форма -22,3±0,14, тогда как Я-форма - 18.6±0,2. Коэффициент корреляции между показателями адгезии на эритроцитах птиц и клетках «Vero» г=0,4. Средний показатель инвазии Y.enterocolitica 5-форма - 19,7±0.12. Для оценки цитотоксичности бактериальную массу центрифугировали при 6000 об\мин, в течение 30 мин, в лунки вносили надосадочную жидкость. Цитопатическое действие веротоксинов (цитотоксинов) характеризовалось вакуолизацией цитоплазмы и кариопикнозом 85,6±2,2 % пораженных клеток (рис. 2).

>.. А

а б в

Рис. 2. Взаимодействие энтеробактерий с клетками «Vero»: а - контроль; б - адгезия бактерий; в - цигопатическое действие токсинов. Азур-эозин. Ок. 10, Об. 100

3.2.2. Результаты изучения токсигенных свойств

При изучении вирулентных свойств, установлено, что средняя величина LD50 S.enteritidis - 154,0; E.coli - 398,0; К.pneumoniae - 698,0; P.vulgaris -457,5 млн. бактериальных клеток, соответственно. Для изучения наличия термолабильных и термостабильных токсинов (LT/ST) на лабораторной модели «эдематозный тест», учет результатов проводили через 24 ч, оценивая реакцию клеточного иммунитета в виде гиперчувствительности замедленного типа, 40 (93,0 %) культур микроорганизмов имели коэффициент достоверности различий средних величин td>5,8, что соответствовало достоверности разницы показателей р<0,01, следовательно, продуцировали токсины (табл. 6).

Таблица 6

Результаты изучения токсигенных свойств энтеробактерий

Виды микроорганизмов Токсигенные свойства микроорганизмов, М±т

LT/ST LT ST/VT LT VT

S.enteritidis 33,33±3,86 0,071±0,007 1,07±0,12 «-» «-»

Е. coh 01:F41 61,66±7,73 0,112±0,008 1,02±0,09 «+»

Е. coli 078:К88 63,33±9.68 0,110±0,005 0,98±0.09

Е. coli 0157:Н7 46,66±3,87 0,062±0,008 1,37±0,17 «+++»

К.pneumonia 40,0±2,90 0,106±0,008 1,26±0,12

К.pneumonia 41,66±3,92 0,096±0,003 1,29±0,17

P. vulgaris 25,0±2,90 0,121±0,004 1,08±0,12

К(+)£•. coli 0138:К81 56,66±4,83 0,123±0.005 1,08±0,12 «+»

К(-) бульон Хоттингера 6,66±4,41 0,061±0,005 0,17±0,07

При изучении продукции термолабильных токсинов (ЬТ) на лабораторной модели «тест дилатации кишечника», средние показатели коэффициента расширения кишечника находились в пределах от 0,071 ±0,007 до 0,123±0,005 (опыт) и от 0,061 ±0,005 до 0,071±0,007 (контроль).

При витальном исследовании продукции термостабильных токсинов (БТ) и веротоксинов (УТ) на лабораторной модели «легочный тест» учитывали степень экстравазации витального красителя «синего Эванса». Через 24^18 ч наблюдали

острую катаральную пневмонию, воспалительный процесс с образованием серозно-геморрагического экссудата, десквамацию альвеолярного эпителия, лейкоцитарную инфильтрацию и пролиферацию фибробластов перибронхиальной и периваскулярной рыхлой волокнистой соединительной ткани. Коэффициент проницаемости кровеносных сосудов составил 1,02±0,09-1,37±0,17, р<0,01. Из числа изученных культур микроорганизмов 32 (75,0 %) продуцировали термостабильные токсины.

Для оценки продукции термолабильных токсинов и веротоксинов с применением метода обратной пассивной латексной агглютинации, в лунки микропланшета вносили по 25 мкл растворителя, затем в первую лунку добавляли по 25 мкл надосадочной жидкости исследуемых образцов. Начиная с первой лунки каждого ряда, переносили по 25 мкл образца и буферного раствора в следующую лунку до седьмой включительно, после чего добавляли в каждую лунку антитела, адсорбированные на частицах латекса, в лунки последнего ряда вносили положительный контроль. Микропланшеты культивировали при 20-22 °С, через 24 ч учитывали результат: при наличии токсина, латексные частицы соединялись, образуя комплекс специфического антигена с антителами, из числа изученных 19 (44,7 %) культур микроорганизмов продуцировали термолабильные токсины.

Микроорганизмы S.enteritidis продуцировали термостабильные токсины; E.coli - термолабильные и термостабильные токсины 28 (65,0 %); K.pneumonia - термостабильные токсины 6 (85,7 %); P.vulgaris - термолабильные токсины 5 (62,5%). Умереннотоксигенными являлись 18 (41,8 %) бактерий, слаботоксигенными - 25 (58,1 %), термостабильные токсины продуцировали 32 (75,0 %) культур микроорганизмов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов.

3.2.3. Результаты изучения фенотипических признаков энтеробактерий, связанных с плазмндамн вирулентности

При изучении гемолитической активности культуры микроорганизмов K.pneumonia (71,4 %) продуцировали а-гемолизины; P.vulgaris: 12,5 % — а-гемолизины, 62,5 % - ^-гемолизины. Выделенные культуры E.coli ингибировали рост изученных культур микроорганизмов (табл. 7).

Таблица 7

Результаты изучения колициногенных свойств E.coli

Вид бактерий Колициногенные свойства E.coli, зона заде зжки роста, мм

1 2 3 M±m t td

S. enteritidis 23,0 21,0 17,0 20,3±1,9 10,68 2,4

S. typhimurium 16,0 18,0 15,0 16,3±0,9 18,11 1,5

P. vulgaris 16,0 19,0 23,0 19,3±2,2 8,7 4,4

Y.enterocoiitica 9,0 12,0 11,0 10,6±1,02 10,39 3,7

Примечание: / - Ооверительный коэффициент: tJ коэффициент Оостоверности различии среоних величин

Установлено, что 36 (83,7 %) культур микроорганизмов были чувствительными к препаратам группы фторхинолонов (офлоксацин, ципрофлоксацин; норфлоксацин); 28 (65,1 %) - аминогликозидов (амикацин, неомицин; сизомицин); 37 (86,0 %) - цефалоспоринов (цефазолин, цефатоксим); 34 (79,0 %) - карбапенемов (имипенем); 25 (58,1 %) -полимиксину, диаметр зоны задержки роста бактерий к данным антибиотикам составили 1,4±0,2-3,3±0,4 мм; 36 (83,7 %) культур микроорганизмов были устойчивыми к группе макролидов (эритромицин, олеандомицин); 35 (81,4 %) -к антибиотикам группы природных и полусинтетических пенициллинов (ампицилин, оксациллин, карбенциллин), 6 (14,0 %) - к антибиотикам группы цефалоспоринов, зоны задержки роста микроорганизмов составили 0,8±0,2-1,0±0,2 мм (табл. 8).

Таблица 8

Результаты изучения чувствительности энтеробактерий к антибиотикам

Аптибиотнкц Чувствительность энтеробактерий

S.enteritidis E.coli K.pneumonia P.vulgaris

I II I II I II I II

Офлоксацин - 66.6 - 96,4 - 85,7 - 87,5

Ципрофлоксацин 66.6 - 89,2 - ■ 100,0 75,0 -

Норфлоксацин - 33,3 - 96,4 - 85,7 - 87,5

Амикацин - 33,3 - 78,5 - 85,7 - 75.0

Неомицин - 66.6 - 89,2 - 100,0 - 75,0

Сизомицин - 33,3 - 75,0 - 85,7 - 75,0

Цефазолин - 66,6 - 89,2 - 100,0 - 87,5

Цефатоксим - 66,6 - 89,2 - 100,0 - 87,5

Полимиксин - 66,6 - 42,8 - 85,7 - 87,5

Имипенем - 33,3 - 42,8 - 14,2 87,5 -

Эритромицин 66,6 - 57,1 - 71,4 - 37,5 -

Олеандомицин 66,6 - 75,0 - 71,4 - 87,5 -

Ампицилин 66,6 - 96,4 - 71,4 - 87,5 -

Оксациллин 66,6 - 96,4 - 100,0 - 100,0 -

Карбенциллин - 33,3 - 42,8 - 42,8 37,5 -

Примечание: 1*-% резистентных микроорганизмов; II* - % чувствительных микроорганизмов

3. 3. Результаты исследования дифференциально-диагностических признаков патогенных энтеробактерий при днссеминации в ткани и органы птиц

При изучении патогенных свойств из 129 изученных культур микроорганизмов 33,3 % энтеробактерий, выделенных при болезнях органов пищеварения птиц, являлись патогенными, в том числе E.coli 28 (65,0 %), K.pneumonia 7 (16,2 %), P.vulgaris 8 (18,6 %), 66,6 % - непатогенными (табл.9).

Таблица 9

Результаты изучения патогенных свойств энтеробактерий

Культуры микроорганизмов Патогенные свойства

Лабораторные мыши* Эмбрионы птиц** Цыплята***

S.enteritidis №8 3/3 3/3 -

Е. col i OI №12 3/3 3/1 -

E.coli 078 №7 3/3 3/2 -

£.co/;0138:K81,№723 3/3 3/3 5/1

E.coli OI 57:H7, №4389 3/3 3/1 -

E.coli 0157:H7, №161 3/3 3/3 5/3

E.coli OI 5 №17 3/1 - -

K.pneumonia №3 3/3 3/2 5/1

P. vulgaris № 18 3/3 3/3 5/2

Примечание: *- внутрибрюшинное; ** - трансоварнальное; ***- интраназальное заражение; числитель - число зараженных животных; знаменатель - число погибших

Для изучения влияния токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов в тканях и органах птиц 12-ти суточных эмбрионов птиц отряда Куриные породы «Белый леггорн», отряда Гусиные породы «Пекинская», заражали в аллантоисную полость, цыплят породы «Белый леггорн», «Австралорп голубой» 5-,10-,15-суточного постинкубационного онтогенеза - интраназально культурами микроорганизмов в дозе 0,2 см3 и 1,0 см3, соответственно. При заражении энтеробактериями летальность эмбрионов составляла до 100,0 %, цыплят - 20,0-60,0 % (табл. 10).

Таблица 10

Результаты исследований при заражении энтеробактериями

Виды Течение болезни Заболеваемость Летальность

бактерий Острое Подострое

Абс. % Абс. % Абс. % %

£.со// 0138:К81, №723 2 40 3 60 5 100 40

£.со// 0157:Н7, №161 3 60 2 40 5 100 60

K.pneumonia, №3 1 20 4 80 5 100 20

Р.vulgar is, №18 1 20 4 80 5 100 40

Острое течение болезни характеризовалось внезапным падежом цыплят через 24^48 часов и отсутствием клинических признаков. При подостром течении через 5-6 суток наблюдали отставание в развитии, депрессию, отсутствие аппетита, жажду, цианоз слизистых оболочек, взъерошенное оперение, из носовых отверстий выделялась пенистая слизь, выделения из клоаки были водянистыми, с примесью слизи и крови. Для изучения диссеминациии энтеробактерий в ткани и органы птиц из исследуемого материала выделяли чистые культуры микроорганизмов, для дифференциации патогенных штаммов - идентифицировали ДНК бактерий методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (рис. 3).

Исследуемый материал

Оксидаза

Катал аза «+» «+» «+» «+» «+»

Лактоза «+» «+»

Индол «+» «+» «+»

Сорбит «+» «+» «+»

Сероводород «+» «+»

Цитрат «+» «+» «+»

Мочевина «+» «+»

Желатин «+»

Реакция Фогес-Проскауэра «-» «+» «+»

Учет результатов (72-96 ч) Salmonella Klebsiella Proteus E.coli 0157:H7

Рис. 3. Схема индикации и идентификации эптеробактерий

При изучении диссеминации бактерий микроорганизмы K.pneumonia через 24-48 ч, выделялись из feces, 5-6 суток - крови, легких, тонкого кишечника, печени, почек, 11-12 суток - крови, селезенки и почек; P.vulgaris через 24—48 ч - feces, 94 ч - патматериала и feces; E.coli 0138 через 24-120 ч -feces, 12 суток - из легких, кишечника и почек, 20 суток - из всех внутренних органов; E.coli 0157:Н7 (VT2) через 24-48 ч - легких, кишечника, печени, почек, feces, 5 суток - крови, почек, 7 суток - селезенки (табл. 11).

Таблица 11

Результаты исследований диссеминации энтеробактерий в ткани и органы птиц

Культуры микроорганизмов Частота выделения культур микроорганизмов, %

Сердце Легкие Кишечник Печень Селезенка Почки

E.coli 0138:К81 79,25 100 100 80,25 64,9 34,7

E.coli 0157:Н7 87,12 100 100 79,65 58,5 72,4

K.pneumonia 52,8 100 100 62,85 62,85 7,5

P.vulgar is 81,3 100 100 83,65 68,75 61,4

Для экстракции ДНК патогенных штаммов пробы тканей и органов птиц переносили в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл, измельчали, готовили 10,0 % суспензию в лизирующем растворе. Для определения чувствительности тест-системы исследовали бактериальную взвесь, штаммы эшерихий (контроль) культивировали на МПА при 37 °С в течение 18-24 ч, смывали 0,85 %-ным раствором №С1, доводили концентрацию бактерий до 2,5 млн. бактериальных клеток в 1 мл, в соответствии с оптическим стандартом мутности ГИСК им Тарасевича, из полученной суспензии готовили серию десятичных разведений (до 25 б.к./мл) в пробирках, содержащих 9 мл 0,85 % 1МаС1. Амплификация специфических участков ДНК: 1 цикл - 15 мин - 95 °С; 45 циклов: 10 с - 95 °С; 25 с - 65 °С; 10 с - 72 °С, результаты учитывали на основании регистрации флуоресцентного сигнала (рис. 4).

Контроль

16 21 26 31 36

-

/ /

/ У

1S 10 IS 20 25 30 35 40 45

IS <0 15

Опыт

Рис. 4. Результаты изучения диссеминашш микроорганизмов в ткани и органы эмбрионов (а), цыплят (б)

Пересечение линий зависимости флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, определяло наличие или отсутствие для данных проб значений порогового цикла (Ct). Результат считали положительным: линии флуоресценции преодолевали пороговые линии при значении порогового цикла Ct < 38, отрицательным - не преодолевали пороговые линии или Ct > 38, с учетом методов преобразования данных накопления флуоресценции и результатов положительных и отрицательных контрольных образцов. При исследовании бактериальной взвеси патогенных штаммов, значение порогового цикла находилось в пределах от 10,41±0,03 до 30,43±0,02, при минимальной концентрации 250 бактериальных клеток в 1,0 мл. В положительных пробах тканей и органов птиц, значение порогового цикла находилось в пределах от 10,43±0,01 до

17

33,91±0,02, при исследовании объединенных проб легких, сердца и печени 29,34±0,01. Установлено, что при индикации ДНК патогенных штаммов целесообразно исследовать кровь, суспензию патматериала эмбрионов птиц и цыплят отдельно или в виде объединенных образцов, что позволяет в составе комплекса дифференциальной диагностики болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями, идентифицировать ДНК патогенных Е.соИ с корреляцией результатов исследований с применением лабораторных моделей (1=0,89), в течение 3 ч (табл. 12).

Таблица 12

Результаты изучения диссеминации Е.соИ 0157:Н7 в ткани и органы цыплят

Исследуемый материал Значение порогового цикла по каналу Hex (Ct)

I 2 3 M±m

Сердце* 14,32 14,35 14,3) 14,32±0,01

Легкие* 11,48 11,46 11,44 11,46±0,01

Печень* 10,44 10,45 10,42 10,43±0,01

Сердце** 29,28 29.31 29,31 29,30±0,01

Легкие** 30.29 30.34 30,32 30,31±0,02

Селезенка** 20,76 20,73 20,72 20,73±0,02

Печень** 29,52 29,55 29,57 29,54±0,03

Тонкий кишечник** 33,93 33.89 33,91 33,91±0,02

Толстый кишечник** 32,10 32,15 32,16 32,14±0,03

Почки** 33,45 33,40 33,43 33,42±0,02

Объединенные пробы** 29,31 29,25 29,46 29,34±0,01

Чувствительность тест-системы «Амплн-Сеис Эшерихиозы-FL»

Концентрация, тыс.б.к./мл 1 2 3 М±т

2500 10.45 10,38 10,42 10,41±0,03

250 20,42 20,46 20,44 20,44±0,02

25 24,15 24,15 24,12 24,14±0,01

2,5 28,86 28,89 28,91 28,88±0,02

0,25 30,46 30,43 30,42 30,43±0,02

0,025 - - - -

Положительный контроль 9,15 9,18 9,14 9,15±0,01

Отрицательный контроль - - - -

Примечание: *-органы эмбрионов; **- органы цыплят

Для видовой идентификации сальмонелл установлена эффективность среды «XLD agar», клебсиелл — «Brilliant agar», иерсиний - «YS agar», для дифференциации патогенных штаммов - среды «Smac agar», «Chrom agar» и индикация ДНК патогенных штаммов, на основе результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по индикации энтеробактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах», утвержденные академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. (протокол № 7 от «16» октября 2013 г.).

3.4. Результаты изучения влияния токсигенных энтеробактерий на динамику развития патологических процессов в тканях и органах птиц

При диссеминации микроорганизмов S.enteritidis, E.coli 0138.К81, E.coli 0/57:Н7, К.pneumonia, P.vulgaris в ткани и органы птиц выявляли гиперемию, цианоз, кровоизлияния сосудов зародышевых оболочек, фибринозный перикардит, катаральную пневмонию, фибринозный аэросаккулит, перигепатит, катарально-фибринозный энтерит, кровоизлияния в почках, атрофию фабрициевой бурсы, тимуса, гиперплазию селезенки. Установлена кореллятивная зависимость изменений, развивающихся по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующихся застойной гиперемией сосудов, токсической дистрофией кардиомиоцитов, массовым распадом лимфоцитов, макрофагальной реакцией, периваскулярным отеком тканей, образовавшимся вследствие выхода плазмы и форменных элементов крови, диссеминированным тромбозом, признаками акцидентальной трансформации тимуса и септической селезенки. Дифференциально-диагностические признаки, обусловленные диссеминацией микроорганизмов, продуцирующих цитотоксины (VT2), характеризовались дистрофическими и некротическими процессами гепатобиллиарной системы и нефротоксическим синдромом, проявляющимся застойным геморрагическим инфарктом, некрозом эпителия канальцев нефронов почек, в паренхиме коркового и мозгового слоев отмечали микроабсцессы, некроз эпителия канальцев, вследствие действия на ткань веротоксинов, воспалительную гиперемию сосудов, с лейкоцитарной инфильтрацией некротических участков, канальцы и капсулы клубочков были заполнены лейкоцитами, просветы не различались в результате распада эпителиальных клеток (рис. 6).

а б в

Рис. 6. Почка цыпленка при заражении E.coli 0157:Н7: а — контроль; б, в — опыт.

Гематоксилин и эозин. Ок. 10, об.10-40

Динамика патологических процессов при диссеминации бактерий, продуцирующих термолабильные токсины и гемолизины, характеризовались кровоподтеками кожных покровов, некротическими очагами в сердце и легких, геморрагическим энтеритом (табл. 13).

Таблица 13

Результаты исследований динамики патологических процессов при диссеминации микроорганизмов в ткани и органы птиц

Впд бактернй Факторы патогенности

Адгезивные, Токсигенные Гемоли- Бактерио- Патологи-

инвазивные свойства тические циногенные ческие

свойства свойства свойства процессы*

СПА ST LT VT Н1у Со1

S.enleritidis 4,8±0,35 «-» «-» «-» 20,3±1,9 1,5-2.0

Е. coli 0138:К81 2,8±0,16 «+» «-» 1,5-2,0

Е. coli 0157:Н7 3,6±0,75 «+» 3,0-3,5

K.pneumonia 2,5±0,14 «+» «а» «-» 2,5-3.0

P.vulgaris 3,5±0,17 «+» «ß» 19,3±2,2 2,5-3,0

Примечание: *1,0 - 1,5 (поражение органов дыхания, умеренны!! перикардит, перигепатшп): 1,5 - 2,0 (перикардит, перигепатшп, энтерит); 2,5 — 3,0 (пневмония, фибринозный перикардит, перигепатшп, энтерит); 3,0-3,5 (нефротоксическии синдром)

При изучении дифференциально-диагностических признаков изолятов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, установлена этиологическая значимость факторов вирулентности бактерий, при развитии патологических процессов в тканях и органах птиц; на основе апробации и подборе эффективных дифференциально-диагностических сред, лабораторных моделей, молекулярно-генетических экспресс-методов идентификации ДНК, в составе комплекса дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц, оптимизирована схема видовой идентификации и дифференциации штаммов, продуцирующих адгезивные антигены, бактериоцины, гемолизины, термолабильные, термостабильные токсины.

ВЫВОДЫ

1. При идентификации энтеробактерий, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, выделено и идентифицировано 129 культур микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. в том числе Е. coli (51,1 %) 01:К99; 01:F41; 01:K99:F41; 02:К88; 02:K99:F41; 078:К88; 078:К99; 015:K88:F41; K.pneumonia (22,5 %); P.vulgaris (24,0 %); Е. aerogenes (1,3 %).

2. Установлена эффективность применеиия тест-системы «Ампли-Сенс Эшерихиозы-FL», основанной на методе полимеразной цепной реакции в реальном времени, что позволило идентифицировать ДНК токсигенных E.coli в течение 3 ч, с чувствительностью 250 бактериальных клеток в исследуемом образце, корреляцией результатов исследований с применением лабораторных моделей (г=0,89).

3. При трансовариальном и интраназальном заражении птиц диссеминацию энтеробактерий в ткани и органы птиц наблюдали через 24-48 ч, культуры микроорганизмов выделяли из легких, тонкого кишечника, сердца, печени, почек.

4. Установлено, что средний показатель адгезии S.enteritidis через 24 часа составляет 18,0±0,2; E.coli - 28,6±0,1-40,2±0,4; K.pneumonia - 25,2±0,2; P.vulgaris - 14,2±0,2; Y.enterocolitica ^-форма - 22,3±0,14; Y.enterocolitica R-форма - 18,6±0,2, средний показатель инвазии Y.enterocolitica 5-форма -19,7±0,12

5. При оценке токсигенных свойств энтеробактерий установлено, что умереннотоксигенными являлись 41,8 % бактерий, слаботоксигенными -58,1 %, термостабильные токсины продуцировали 75,0 % культур микроорганизмов, коэффициент проницаемости кровеносных сосудов при экстравазации витального красителя - 1,02±0,09-1,37±0,17.

6. Установлено, что изоляты E.coli продуцировали термолабильные и термостабильные токсины 65,0 %; K.pneumonia - термостабильные токсины (85,7 %), а-гемолизины (71,4 %); P.vulgaris - термолабильные токсины (62,5 %), а-гемолизины (12,5 %), /?-гемолизины (62,5 %).

7. При заражении бактериями S.enteritidis, Kpneumonia, P.vulgaris, E.coli установлена коррелятивная зависимость изменений, развивающихся в сердечно-сосудистой и иммунной системе12-ти суточных эмбрионов, цыплят 5-,10-,15-суточного постинкубационного онтогенеза, обусловленных застойной гиперемией сосудов, токсической дистрофией кардиомиоцитов, массовым распадом лимфоцитов, макрофагальной реакцией, периваскулярным отеком тканей, образовавшимся вследствие выхода плазмы и форменных элементов крови, инфильтрацией рыхлой волокнистой соединительной ткани мононуклеарными лейкоцитами и псевдоэозинофилами.

8. Динамика патологических процессов при диссеминации E.coli 0157:Н7 в ткани и органы 12-ти суточных эмбрионов, цыплят 5-,10-,15-суточного постинкубационного онтогенеза в результате действия цитотоксинов характеризовалась дифференциально-диагностическими признаками, обусловленными дистрофическими и некротическими процессами гепатобиллиарной системы и нефротоксическим синдромом, проявляющимся застойным геморрагическим инфарктом, некрозом эпителия канальцев нефронов почек птиц.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

•Для видовой идентификации и дифференциации таксономически сходных видов энтеробактерий рекомендуется использовать среды «XLD agar», «Brilliant agar», «YS agar», «Chrom agar», для дифференциации E.coli 0157:Н7 - схему бактериологического исследования с применением среды «Smac agar», специфичность идентификации 80,0-94,8 %. •При индикации ДНК патогенных штаммов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, целесообразно исследовать кровь, суспензию патматериала эмбрионов птиц и цыплят отдельно или в виде объединенных образцов, что позволяет в составе комплекса

дифференциальной диагностики болезней органов пищеварения птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями, идентифицировать ДНК патогенных E.coli с чувствительностью 250 бактериальных клеток в исследуемом образце, в течение 3 ч.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Плотникова Е.М. Характеристика факторов патогенности Y.pseudotuberculosis // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых. -М.: МГУПП, 2011. - С. 287-289.

2. Ленченко Е.М. Антигенная структура и патогенные свойства штаммов E.coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях животных / Е.М. Ленченко, A.B. Моторыгин, Е.М. Плотникова // Ветеринария. - 2013. - №2. -С. 21-25.

3. Плотникова Е.М. Патогенные свойства энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях птиц / Е.М. Плотникова, Е.М. Ленченко // Ветеринария. - 2014. - № 2. - С. 27 - 31.

4. Плотникова Е.М. Этиологическая структура и патогенетические аспекты энтеротоксемии птиц // «День науки IV»: Материалы Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов. - М.: МГУПП, 2014. — С. 166-167.

5. Ленченко Е.М. Гистохимическая характеристика органов иммунитета птиц при эшерихиозе / Е.М. Ленченко, Е.М. Плотникова // Ветеринария. - 2014. — № 8. - С. 25-28.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 12.11.2014г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печл. 1,38. Тираж 100. Заказ 701.

WWW.FRANTERA.COM