Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воздействие загрязнения почвы нефтепродуктами на генетическое здоровье детей Чеченской Республики

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Воздействие загрязнения почвы нефтепродуктами на генетическое здоровье детей Чеченской Республики"

На правах рукописи

МОЛОЧАЕВА ЛУИЗА ГЕЛАНИЕВНА

ВОЗДЕЙСТВИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ НА ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗДОРОВЬЕ ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

03.02.08 - экология (биология) - биологические науки 03.02.07 - генетика (биология) - биологические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ОКТ 2013

005534087

Махачкала - 2013

005534087

ФГБОУВПО «Чеченский государственный университет»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор.

Сычева Людмила Петровна

кандидат биологических наук, доцент. Джамбетова Петнмат Махмудовна

Официальные оппоненты: Викторова Татьяна Викторовна

Доктор биологических наук, профессор,

Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, лаборатория

физиологической генетики, главный научный сотрудник.

Реутова Нина Васильевна

Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Кабардино-Балкарский научный центр РАН, Центр географических исследований, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

«Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана»

Защита диссертации состоится «16» октября в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.053.03 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Дагестанском государственном университете по адресу: г. Махачкала, ул. Дахадаева, 21.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дагестанского государственного университета.

Автореферат разослан «16» сентября 2013 г.

Отзывы, заверенные печатью, можно направлять по адресу:

367025, РФ, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 21. факс:

8(8722) 674651. e-mail: ecodag@rambler.ru

Ученый секретарь Диссертационного совета,

К.Г.Н., ДОЦ61ГТ

Ахмедова Г. А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В настоящее время все более актуальной становится проблема оценки влияния загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в районах добычи и переработки нефти на здоровье людей и биологические сообщества. Повсеместная распространенность и негативное воздействие нефти и нефтепродуктов на почвенно-растительный покров, атмосферный воздух, поверхностные и подземные воды, экологические системы и здоровье населения отмечаются на всех стадиях освоения нефтяных месторождений - от бурения до промышленной переработки, ликвидации оборудования и доставки потребителю. Хищническое использование невосполнимых природных ресурсов и малоэффективная их переработка с образованием огромного количества отходов, загрязняющих атмосферный воздух, воду и почву вызывает стремительное возрастание экологически обусловленных нарушений здоровья населения, и особенно, наиболее уязвимых групп: детей, людей пожилого возраста [Русаков Н.В., Рахманин Ю.А., 2004].

Среди комплекса экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами, особое место занимает прогноз возможных генетических последствий. Наиболее опасными загрязнениями с этой точки зрения являются продукты горения и низкотемпературной переработки нефти. Генотоксичными свойствами обладают многие полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), образующиеся при низкотемпературном горении нефтепродуктов, в том числе, бенз(а)пирен, бензин, дизельное топливо, бутан, стирол, бензол, хлороформ и другие.

Данные о влиянии нефтепродуктов на здоровье населения, проживающего в условиях загрязнения окружающей среды, в настоящее время единичны и получены, в основном, при обследовании рабочих нефтяных компаний или персонала автозаправочных станций [Roma-Torres J. et al., 2006; Paz-y-Miño С. et al., 2008; Krishnamurthi К. et al., 2008]. Отмечено повышение общего числа микроядер и снижение частоты пролиферации клеток у лиц, участвовавших в ликвидации последствий разлива нефтяного танкера Prestige на северо-западе Испании (2002 г.), а также у жителей, проживающих на прилегающих территориях, зависящее от возраста и времени нахождения на данной территории [Pérez-CadahíaB.atal., 2008].

Имеются данные, что на территориях с техногенным химическим загрязнением у детей наблюдается увеличение числа врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ). Развитие ВМГВ обусловлено действием тератогенов и мутагенов окружающей среды, приводящее к изменению пролиферативной активности ткани и/или апоптоза и нарушению морфогенеза того или иного органа [Бочков Н.П. и др., 1994, Котышева E.H., 2007]. Можно предположить, что такие изменения, возникающие при действии нефтепродуктов на ранние этапы эмбриогенеза, могут привести к формированию ВМГВ. В настоящее время ВМГВ рассматривают как биомаркер неблагоприятного действия факторов окружающей среды на

эмбриогенез, в том числе формирование врожденных пороков развития, в частности нарушений развития нервной системы, патологии других органов и систем. У детей с 5 и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленной патологии и снижению адаптационных возможностей организма [Котышева E.H., 2007].

Важным аспектом этой проблемы является достоверная информация о степени влияния разного рода загрязнений на живые системы и, непосредственно человека. Однако это влияние практически не изучено при обследовании населения, проживающего на территориях, загрязненных нефтепродуктами, и, особенно, наиболее уязвимой группы - детей младшего возраста.

Проведенные в 2002-2004 гг. на территории Чеченской республики исследования генотоксического действия продуктов переработки нефти на различные виды природной флоры и растительные тест-системы показали, что почвы, загрязненные нефтью, вызывают значительное увеличение уровня мутабильности у видов растений дикорастущей флоры, принадлежащих к различным семействам. Эти химические факторы снижают фертильность и индуцируют повреждения ДНК, что может приводить к онкопатологии [Джамбетова П.М. и др., 2005; Джамбетова П.М., Реутова Н.В., 2006].

Учитывая эти результаты, мы высказали гипотезу о возможном повышенном уровне генетических нарушений у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами.

Для оценки генетического здоровья детей мы использовали два инновационных подхода: кариологический анализ на клеточном уровне и учет ВМГВ на уровне целого организма. Информативность этих подходов для оценки влияния факторов окружающей среды и характеристики некоторых заболеваний показана в ряде исследований [Бочков Н.П. и др., 1994; Субботина Т.Н., 1994; Сычева Л.П. и др., 2005; 2008; 2011].

В связи с этим целью исследования является оценка цитогенетического статуса и врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами.

Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Установить характер и уровни загрязнения почв нефтепродуктами и продуктами горения нефти в изучаемых районах Чеченской республики;

2. Провести сравнительный анализ цитогенетического статуса, показателей пролиферации и апоптоза детей, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами или его отсутствия, с использованием кариологического анализа клеток буккального эпителия.

3. Провести диагностику ВМГВ у детей с учетом пола и локализации ВМГВ.

4. Сравнить частоты ВМГВ у детей, проживающих в населенных пунктах с разным уровнем загрязнения почв нефтепродуктами.

5. Определить возможность и особенности применения кариологического анализа буккального эпителия и анализа ВМГВ как неинвазивных

методов исследования для оценки влияния нефтепродуктов на генетическое здоровье детей.

Научная новизна. Впервые в Чеченской республике проведены исследования по влиянию загрязнения почвы нефтепродуктами на генетическое здоровье детей. Установлено неблагоприятное действие факторов среды на организм человека: статистически достоверное повышение частоты клеток с цитогенетическими нарушениями в буккальном эпителии в 3 и 3,4 раза соответственно; интегрального показателя деструкции ядра (апоптического индекса) в 2,8 и 3,1 раза; показателя пролиферации (частоты клеток с двумя и более ядрами) - в 1,6 раза по отношению к контролю, у детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт, в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами на уровне приблизительно 1%.

Впервые показано, достоверное повышение частоты среднего количества ВМГВ на 1 ребенка в 1,8 и 1,7 раза, а также доли детей с высоким уровнем ВМГВ в загрязненных нефтепродуктами населенных пунктах при сравнении с условно чистым районом, что характеризует неблагоприятное действие загрязнения почв нефтепродуктами на здоровье на этапе формирования организма.

Практическая значимость. Апробированный в работе подход к оценке генетического здоровья детей с использованием двух объективных высокоинформативных неинвазивных методов исследования на клеточном и организменном уровне с оценкой большого числа показателей может быть рекомендован для проведения других исследований по оценке неблагоприятного влияния разного рода факторов окружающей среды на здоровье населения.

Внедрение результатов исследования. Работа выполнена в Чеченском государственном университете на кафедре клеточной биологии, морфологии и микробиологии под руководством к.б.н., доцента П.М.Джамбетовой, д.б.н., профессора Л.П.Сычевой.

Материалы исследования используются в учебном процессе на лекциях и семинарских занятиях при подготовке студентов по специальности «Биология» и «Экология» в Чеченском государственном педагогическом институте (Справка о внедрении № 340 от 25.09.2012 г.); в Чеченском государственном университете при подготовке студентов по специальностям «Биология» и «Микробиология» (Справка о внедрении №1273-0-19 от 24.09.2012 г.). Материалы используются при проведении научно-исследовательских работ в области экологии человека и гигиены окружающей среды в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАН (Справка о внедрении №02-10/615 от 28.09.2012 г.)

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Автором собраны пробы почв для исследования, проведена подготовка и анализ цитогенетических препаратов от всех детей, участвующих в обследовании. Автор принимал личное участие в осмотре детей на предмет наличия врожденных морфогенетических вариантов. Проведена статистическая обработка и представление данных в диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

Дети, проживающие в условиях значительного загрязнения почвы нефтепродуктами (8000-10000 мкг/кг), находятся в зоне высокого риска нарушений состояния здоровья, связанного с повышенным уровнем цитогенетических нарушений и сдвигов клеточной кинетики.

Загрязнение почвы нефтепродуктами на уровне 8000-10000 мкг/кг приводит к образованию повышенного уровня врожденных морфогенетических вариантов в популяции, что характеризует неблагоприятное действие загрязнения почв нефтепродуктами на здоровье детей на этапе формирования организма.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии наук Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (г. Грозный, 28 ноября 2011 г.); на круглом столе «Экология и дети» на неделе Науки в Чеченском государственном педагогическом институте (г.Грозный, 10 июня 2012); на научно-практической конференции «Наука и образование в Чеченской республике», посвященной 10-летию со дня основания Комплексного научно-исследовательского института РАН, (г.Грозный, 7 апреля 2011 г.), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (г.Ростов-на-Дону, 15-19 декабря 2010 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, включая «Объекты и методы», обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения и список сокращений. Текст изложен на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирован 15 таблицами и 6 рисунками. Библиографический список содержит 307 источников, из них 130 отечественных и 177 иностранных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Приведен обзор литературных источников по изучению генотоксичного и мутагенного воздействия нефти и нефтепродуктов на живые системы. Охарактеризованы методы эколого-генетического мониторинга населения, проживающего в условиях нефтезагрязнения окружающей среды.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве загрязненных нефтепродуктами территорий были выбраны два села, где более 15 лет производили первичную переработку нефти на кустарных нефтеперегонных установках: Долинск (Грозненский район) и Мескер-Юрт (Шалинский район). Они располагаются в одном природно-климатическом районе, обладают одинаковыми ландшафтными характеристиками и имеют одинаковый растительный покров. В качестве условно чистой зоны было выбрано село Гойты (Урус-

Мартановский район), в котором, подобного производства не было, и которое также относится к данному природно-климатическому району.

В проведенном комплексном обследовании ВМГВ участвовали школьники начальных классов средних школ Чеченской республики в возрасте 7-10 лет. В целом обследовано 173 ребенка, в том числе в селе Долинск - 64, в селе Мескер-Юрт - 59, в селе Гойты - 50 (табл.1).

Таблица I.

Половые и возрастные характеристики групп детей _Чеченской республики _

Характеристика с. Гойты (условно контрольная группа) с.Долинск с.Мескер-Юрт

Число обследованных 50 64 59

в том числе, мальчиков 25 34 30

девочек 25 30 29

Средний возраст детей (хср± ш) 8,72±0,09 9,08±0,65 8,35±0,09

Средний возраст матери (хср±ш) 28,5±0,99 26,72±0,76 25,54±0,84

Средний возраст отца (хср ± ш) 33,66±0,94 32,46±0,85 30,50±1,02

Характеристика обследованных групп представлена в таблице 1. Средний возраст детей одинаков во всех группах. В обследовании участвовали только дети из семей коренных жителей района, все они относятся к одной национальности -чеченцы.

Метод определения загрязнения почв. Для определения загрязнения почвы нефтью, нефтепродуктами и продуктами горения нефти проводили химические анализы почв. Пробы почв отбирали из верхнего горизонта 0-20 см в пятикратной повторности на расстоянии 100±20 м от нефтеперегонных установок в летний период в сухую погоду. Из 5 кг составляли индивидуальный смешанный образец (1 кг) для анализов. Пробы помещали в герметично закрываемую полиэтиленовую посуду. Для проведения химического анализа почвы высушивали до воздушно-сухой массы. Анализы проб почвы на содержание нефтепродуктов и бенз(а)пирена проводили совместно с лабораторией химии гумуса почвенного стационара факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Содержание бенз(а)пирена является индикатором наличия в почве других ПАУ, являющихся канцерогенными и мутагенными веществами.

Для определения нефтепродуктов использовали методику ускоренного определения содержания нефтепродуктов в различных природных средах

(водах, почвах) методом инфракрасной спектроскопии [Орлов Д.С., Гришина JI.A.,1981; МУК 4.1.1956-05].

Для определения содержания бенз(а)пирена использовали метод, предложенный Э.В. Шпольским (спектро-флуориметрический анализ при низких температурах) [Шпольский Э.В., 1959; Шпольский Э.В. и др., 1968].

Метод оценки цитогенетического статуса детей. Цитогенетический статус детей оценивали с помощью расширенного микроядерного теста (кариологического анализа) буккальных клеток. Отбор материала, приготовление и анализ препаратов проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» [2005]. У каждого ребенка шпателем собирали клетки со слизистой оболочки щеки, наносили на предметное стекло, готовили мазок клеток буккального эпителия. От каждого человека готовили по 2 препарата. Препараты фиксировали этанолом и уксусной кислотой в соотношении 3:1, помещали на 1 час в 2,5% раствор ацетоорсеина (orcein Merck) при 37°С для окраски хроматина, затем докрашивали цитоплазму 1% раствором светлого зеленого (light green, ICN Biomedicals Inc.) при комнатной температуре в течение 1 мин. На шифрованных препаратах в соответствии с классификацией Л.П.Сычевой [2007] учитывали следующие показатели: цитогенетические - частоту клеток с микроядрами, протрузиями, ядерными мостами и ядром атипичной формы; показатели пролиферации: клетки с двумя, тремя и более ядрами, и сдвоенными ядрами (иначе: ядра с перетяжкой, ядра с насечкой); в качестве показателей ранней деструкции ядра учитывали клетки с вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, началом кариолизиса; поздней деструкции ядра -клетки с кариорексисом, кариопикнозом, полным кариолизисом. От каждого человека анализировали по 1000 буккальных эпителиоцитов. Рассчитывали интегральные показатели: сумму цитогенетических нарушений (сумма клеток с микроядрами, протрузиями и мостами в промилле), суммарный показатель пролиферации (сумма всех клеток с двумя и более ядрами и сдвоенными ядрами в промилле), апоптический индекс (сумма клеток на поздней стадии деструкции ядра в промилле).

Методы выявления, учета и оценки врожденных морфогенетических вариантов у детей. Для изучения ВМГВ использовали перечень, разработанный на кафедре клинической генетики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова [Бочков Н.П. и др., 1994; Субботина Т.Н., 1994]. Анализ проведен автором совместно с педиатром высокой квалификации, профессором кафедры педиатрии Чеченского государственного университета Махтиевой А.Б., имеющим сертификат по медицинской генетике. Во время полного наружного осмотра (ребенок в положении по «стойке смирно») регистрировали наличие каждого из 87 ВМГВ, которые четко распознаются согласно международным критериям [Spranger J. et al., 1982].

При анализе полученных данных проводили объединение ВМГВ в группы: редкие признаки с популяционной частотой, не превышающей 1%

(28 из 87 - 32,2%); альтернативные ВМГВ (17 из 87 - 19,5%) с наиболее четкой регистрацией; малые пороки развития (25 из 87 - 28,7%) - формируются в период органогенеза; феногенетические варианты (26 из 87 - 29,9%) -формируются в ранний фетальный период [Trixler М. et al., 1997]. У мальчиков учитывали признаки «шалевидная мошонка» и «паховая грыжа», отсутствующие у девочек. Для объективного сравнения общего числа ВМГВ в соответствии с полом и при объединении подвыборок данные два признака исключались. Группы мальчиков и девочек осматривали отдельно или в разных помещениях.

Для проверки точности диагностики ВМГВ дважды проводили повторный осмотр 100 детей, выбранных слепым методом, с периодичностью в 1 год. Для регистрации ВМГВ во время исследования заполняли анкеты, которые включали данные на каждого обследованного (порядковый номер, фамилия, имя, пол, дата рождения, дата обследования, возраст на момент обследования, номер дошкольного образовательного учреждения, адрес, национальность). Родители каждого ребенка заполняли анкету со сведениями о ребенке и сопутствующими факторами среды проживания.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA for Windows. Межгрупповые сравнения проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Сравнение распределения детей в соответствии с числом ВМГВ оценивали с использованием Различия считали значимыми при Р<0,05.

ГЛАВА 3. ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ В ИЗУЧАЕМЫХ НАСЕЛЕННЫХ ПУНКТАХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ И БЕНЗ(А)ПИРЕНОМ

Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами на цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей. Полученные в исследовании данные указывают на неблагоприятную тенденцию в отношении состояния здоровья детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт, характеризующихся повышенным загрязнением почв нефтепродуктами. Следует отметить, что к моменту обследования (2007 г.; табл. 2.) содержание нефтепродуктов в почвах этих районов снизилось, но все еще составляло 8100-10020 мкг. Общепризнанным критерием эколого-гигиенической оценки безопасности воздействия факторов окружающей среды на условия проживания и здоровье населения являются их ПДК, а при отсутствии норматива - фоновые значения изучаемых веществ. Н.В.Русаков и соавторы [2007] рассматривая эту проблему, указывают, что для нефти в настоящее время отсутствуют как научно обоснованная ПДК, так и единое мнение об их фоновом содержании в почве. Эти авторы определили в качестве фонового значения содержание нефтяных углеводородов на уровне 29,1±2,7 мг/кг, характерное для территории вне зоны влияния промышленного и сельскохозяйственного загрязнения в 45 км от г.Москвы. Однако в самой Москве загрязнение нефтяными углеводородами вблизи московского нефтеперерабатывающего завода достигало 12990 мкг. Учитывая эти

значения, можно отметить, что содержание нефтепродуктов в почвах села Гойты немного выше, чем фоновый уровень для Москвы (100 мг/кг), а эти же показатели в селах Долинск и Мескер-Юрт близки к значению наиболее высокого содержания нефтепродуктов в почве вблизи нефтеперерабатывающего завода (8100-10200 мкг; табл.2).

По данным Н.В. Русакова и соавторов [2006], нефтезагрязнения почвы характеризуются значительной устойчивостью и стабильностью. В диапазоне концентраций 1000-10000 мкг нефть в дерново-подзолистой, суглинистой почве с рН 4,4 сохраняется более двух лет. Процессы биодеградации нефти идут в двух противоположных направлениях. Наряду с уменьшением содержания предельных, непредельных, циклических и ароматических углеводородов, идентифицированы образующиеся в результате трансформации углеводородной составляющей токсичные кислородсодержащие продукты (альдегиды, кетоны, спирты и органические кислоты). Концентрация нефти 1000-10000 мкг вызывает общее ухудшение физико-химических свойств почвы и процессов самоочищения. Значительно более низкие концентрации нефти в почвах приводят к снижению урожайности ряда пищевых культур: редиса (пороговая концентрация уже 500 мкг), салата (1000 мкг), картофеля (1500 мкг).

Таблица 2.

Содержание нефтепродуктов и бенз(а)пиреиа в почвах изучаемых населенных пунктов

№ пункта Объект исследования Содержание нефтепродуктов в почве, мкг Концентрация бенз(а)пирена, мг/кг ПДК бенз(а) пирена в почвах, мг/кг

2002 г. 2007 г. 2002 г. 2007 г.

1 Гойты 200 100 0,03 <0,001 0,02

2 Долинск 15600 10200 0,15 0,066

3 Мескер-Юрт 11000 8100 1,83 0,548

Крайне опасным является повышенное содержание в нефтепродуктах, а следовательно и в загрязненной почве, ПАУ, в частности бенз(а)пирена, уровень которого превышает ПДК в 3 раза в Долинске и приблизительно в 27 раз в Мескер-Юрте. Поскольку природные условия в этих населенных пунктах и в условно чистом селе Гойты приблизительно одинаковы, кроме того обследованы организованные группы детей, близкие по социальному статусу, выявленные изменения в состоянии здоровья можно с большой долей вероятности связать с воздействием загрязнения окружающей среды нефтепродуктами.

ГЛАВА 4. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС, ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА У ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ

Для определения влияния загрязнения среды нефтепродуктами на клеточные структуры мы использовали кариологический анализ, позволяющий учитывать цитогенетические показатели, показатели пролиферации и апоптоза (табл.3). Сравнивая полученные данные с результатами проведенных ранее исследований можно отметить, что частота клеток с микроядрами (0,5 %о) у детей, проживающих на условно чистой территории, хорошо соответствует данным литературы.

Выявлено достоверное в 3 и 3,4 раза повышение частоты клеток буккального эпителия с цитогенетическими нарушениями у детей сел Долинск и Мескер-Юрт, причем в Мескер-Юрте, где содержание бенз(а)пирена в почвах было выше, также выше и частота отмеченных нарушений.

Прямого подтверждения полученных данных о значительно более высоком уровне цитогенетических нарушений у детей, проживающих в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами, мы не нашли. Небольшое число исследований такого рода выполнено в последние 5 лет при обследовании рабочих нефтяных компаний и автозаправочных станций. Почти во всех случаях, у таких групп обследуемых установлено повышение уровня цитогенетических нарушений в лимфоцитах периферической крови или буккальных эпителиоцитах. Подобные работы при обследовании населения, а тем более детей, по-видимому, до настоящего времени не проводились.

Кроме основного показателя - частоты клеток с микроядрами, мы анализировали весь спектр состояния ядра клеток, т.е. дополнительно показатели пролиферации и деструкции ядра клеток. Только в трех других исследованиях (СеНкА. еЬа1, 2003; ВегМеБСЛ. йа!., 2006; МагипэН.А. йаК, 2010), кроме работ Л.П.Сычевой с соавторами, дополнительно учитывали протрузии, двуядерные клетки или показатели деструкции ядра. Направленность изменений в этих исследованиях такая же, как и у нас, что свидетельствует о корректности полученных нами данных и позволяет рассмотреть общую картину клеточной кинетики в ответ на постоянное действие нефтезагрязнений.

Показатели деструкции ядра (рис.1) являются нормальными событиями при созревании эпителиальных клеток, но их частоты могу возрастать в ответ на возрастающее воздействие генотоксикантов и мутагенов. При обследовании детей все показатели ранней деструкции ядра были достоверно в 1,6-2,8 раза выше в группах воздействия по отношению к условному контролю.

Таблица 3.

Цитогенетические показатели буккального эпителия у детей, проживающих в изучаемых населенных пунктах

Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями в промилле

Долинск (И = 59) Мескер-Юрт (N = 52) Гойты (N = 50)

Доля клеток с микроядрами 2,4 ± 0,24*** 2,5 ±0,26*** 0,5 ± 0,09

Доля клеток с протрузиями 2,6 ±0,51* 3,3 ± 0,56** 1,1 ±0,24

Доля клеток с межьядерными мостами 0,22 ± 0,6 0,23 ± 0,08 0,28 ± 0,09

Суммарная доля клеток с цито генетическими нарушениями 5,2 ±0,69*** 6,1 ±0,89*** 1,8 ±0,58

Доля клеток с ядром атипичной формы 19,0 ± 1,8** 11,6 ± 1,4** 4,6 ± 0,67

* Р< 0,05; ** Р< 0,01; *** Р< 0,001 - значимые отличия от условно контрольной группы при сравнении данных по критерию Стьюдента; N — число обследованных детей.

Более выраженные изменения отмечены при анализе показателей поздней деструкции ядра и, особенно, кариорексиса и кариопикноза. Все эти показатели в группах детей, проживающих в загрязненных районах достоверно выше, чем в контрольной, причем доля клеток с кариорексисом и кариопикнозом в селе Долинск в 4,5 и 6 раз выше, чем в контрольной группе, а в селе Мескер-Юрт в 6 и в 26 раз выше, чем в контроле. Апоптотический индекс в среднем на группу детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт, повысился по сравнению с контролем примерно во столько же раз (в 2,8 и в 3,1 раза), что и уровень цитогенетических нарушений. В данном случае апоптоз выполняет свою функцию удаления из популяции генетически неполноценных клеток эпителия (клеток с генетическими нарушениями).

В условиях усиленной гибели клеток резонно ожидать активации пролиферативной активности для восполнения утраченных, что мы и наблюдаем в слизистой оболочки щеки детей обследованных групп (рис.2).

Суммарный показатель пролиферации повысился у детей из сел Долинск и Мескер-Юрт в 1,6 раза по сравнению с контролем. Нужно отметить, что темпы восстановления клеток при этом ниже, чем утраты, т.е. наблюдается дисбаланс клеточной кинетики. Если прогнозировать наблюдаемые процессы на другие ткани и органы, можно предполагать развитие патологических процессов. Таким образом, данные проведенного исследования подтверждаются данными литературы и указывают на неблагоприятное действие загрязнения почв нефтепродуктами на уровне приблизительно 1% на

здоровье детей, что выражается в повышении частоты эпителиальных клеток с цитогенетическими нарушениями, показателями пролиферации и апоптоза.

Гойты

Долинск

Мескер-Юрт

Конденсация Вакуолизация Кариолизис Кариорексис Кариопикноз "-значимые отличия от контроля при Р<0,05 по критерию хи-квадрат.

Рис.1. Показатели деструкции ядра в клетках буккального

Гойты

Долинск

Мескер-Юрт

Полиядерные

Двуядерные Со сдвоенным ядром

-значимые отличия от контроля при Р<0,05 по критерию хи-квадрат.

Рис. 2. Показатели пролиферации буккального эпителия у детей

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ВРОЖДЕННЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ У ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ

Учет ВМГВ у детей, проживающих в условиях разной нагрузки среды нефтепродуктами, как показателя, характеризующего генетическое здоровье на уровне целого организма, также показывает неблагоприятные изменения. Число ВМГВ на 1 ребенка в селах Долинск и Мескер-Юрт приблизительно в 1,8 раза выше и достоверно отличается от уровня этого показателя в условно чистом селе Гойты (табл.4).

Таблица 4.

Среднее число ВМГВ на 1 ребенка у детей, проживающих в

изучаемых населенных пунктах

Статистические характеристики с. Гойты (N=50) с.Долинск (N=62) с.Мескер-Юрт (N=59) Чеченская республика*

Среднее число ВМГВ (М±ш) 1,84±0,15 3,35±0,26** 3,14±0,21** 2,64±0,21

Доверительный интервал (±95%) 1,52-2,10 2,93-3,67 2,87-3,41 2,32-2,96

♦Данные из статьи Джамбетовой П.М. и соавторов [2011]; **3начимые различия по отношению к условному контролю по ^критерию Стьюдента при р<0,001.

Распределение детей по количеству ВМГВ на 1 ребенка в изучаемых населенных пунктах представлено в табл. 5. Число ВМГВ на одного ребенка варьирует от 0 до 7. В условно чистом селе Гойты дети, в основном, (66%) имели не более 2 ВМГВ, у 56% детей отмечается 2-3 ВМГВ, в то время как в загрязненных селах более 70% детей имели 3 и более ВМГВ; приблизительно половина детей в этих селах имела 3-4 ВМГВ: в Долинске 46,88 % детей, в Мескер-Юрте 52,53%.

В основе развития ВМГВ лежит либо действие мутантного гена, либо тератогенное влияние каких-либо факторов на ранних сроках эмбриогенеза, приводящее к изменению пролиферативной активности ткани и/или апоптоза и нарушению морфогенеза того или иного органа [Бочков Н.П. и др., 1994, Котышева E.H., 2007].

Повышенная частота цитогенетических нарушений и сдвиги клеточной кинетики выявлены нами у детей, проживающих на загрязненных нефтепродуктами территориях. По-видимому, комплекс химических соединений, входящих в состав нефтепродуктов и присутствующих в виде летучей фракции в воздухе загрязненных территорий, может воздействовать на плод и приводить к формированию ВМГВ. Среди таких химических соединений ранее уже упоминались ПАУ, в том числе бенз(а)пирен, присутствие которого определено в

почвах на момент осмотра детей на наличие ВМГВ, и особенно в высокой концентрации он определен на момент формирования плода.

Таблица 5.

Распределение детей по общему числу врожденных ВМГВ у детей, _проживающих в изучаемых населенных пунктах_

Кол-во ВМГВ на 1 ребенка с. Гойты с.Долинск с.Мескер-Юрт Чеченская республика в целом***

абс % абс % абс % абс %

0-2 32 66,0 19 29,7 17 28,81 205 0

3-4 17 32 30 46,88 31 52,53 173 40,52

5-7 1 2,0 13 21,88 11 18,63 49 11,48

Всего 50 100 62 100 59 100 427 100

Значимость различий* X2 =16,09 р< 0,001 X2 =16,38 р<0,001

Значимость различий** Х2=6,61р<0,05 Х2=8,22 р<0,05 X2 = 8,12 р<0,05

*по сравнению с условным контролем (с.Гойты); **по сравнению с данными по Чеченской республике в целом. Данные для сравнения приведены из статьи Джамбетовой П.М и соавторов [2011].

В проведенном во Вьетнаме обследовании [Сычева Л.П. и соавт., 2008] рассмотрен вопрос о связи ВМГВ, которые в настоящее время считаются проявлением нейтральных мутаций, и цитогенетическими повреждениями клеток у детей. У этих детей выявлена статистически достоверная связь количества ВМГВ на одного ребенка и суммы клеток с цитогенетическими нарушениями. Наши данные подтверждают эту зависимость. По-видимому, это вызвано повышением апоптоза в ответ на цитогенетическое действие фактора, поскольку нормальное развитие плода определяется пролиферативной активностью клеточных популяций, их миграцией и апоптозом некоторых выполнивших свои функции клеток. Изменение любого из этих процессов приведет к неправильному формированию того или иного органа. При низких уровнях воздействия могут формироваться ВМГВ, при более высоких - ВПР, еще более интенсивное воздействие приводит к гибели и резорбции плода

Развитие тератогенных эффектов при действии ПАУ, и в том числе бенз(а)пирена, показано во многих экспериментальных исследованиях [Lambert G.H., Nebert D.W. 1977; Zasadowski A., Wysocki А., 2002; Verma N., 2012] Эмбриотоксическое и тератогенное действие суспензии нефти отмечено при нанесении ее накожно беременным самкам [Hoberman A.M.etal., 1995; Feuston М.Н., Mackerer C.R., 1996]. Косвенно о влиянии нефтезагрязнений на генетическое здоровье людей можно судить по исследованию частот ВМГВ у детей, проживающих в городе Ярославле, имеющего на своей территории

15

нефтехимические и нефтеперерабатывающие предприятия [Бочков и др., 1994]. Среднее число ВМГВ на одного ребенка в Ярославле составляет 2,63, что значительно выше, чем в условно чистой зоне - селе Гойты, но ниже, чем в селах Долинск и Мескер-Юрт.

Анализ данных распределения ВМГВ у девочек и мальчиков (рис.3) не выявил достоверно значимых различий по их количеству в зависимости от половой принадлежности, что соответствует данным подобных исследований, проведенных в разных городах [Ревазова Ю.А. и др., 2001; Бочков Н.П. и др.,1994; Жученко H.A. и др., 2006].

6С 50

0-1

2-4 ■ 5-7

Мальчики; Девочки

с.Гойты

Мальчики

Девочки

I

с.^ескерт-Юрт

С.ДОЛИИСК

Рис. 3. Распределение детей по числу ВМГВ на 1 ребенка в соответствии с полом

В исследовании также проведен сравнительный анализ распределения детей по отдельным признакам, среднему числу ВМГВ на одного ребенка в зависимости от половой принадлежности и локализации ВМГВ. Сравнительный анализ ВМГВ в группах детей изучаемых сел не выявил особенностей ВМГВ в зависимости от пола и локализации ВМГВ.

В целом, для оценки влияния различных факторов среды на процессы морфогенеза можно рекомендовать использование двух показателей ВМГВ: среднего числа ВМГВ на 1 ребенка и долю детей с 5 и более ВМГВ.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ литературы показывает, что влияние загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами на здоровье населения мало изучено. Общепринятое представление о том, что сырая нефть не представляет особой опасности для здоровья, подвергается в настоящее время значительному пересмотру. Вычленить действие каких-либо компонентов нефти или нефтепродуктов и оценить риск для здоровья населения, связанный с их отдельным действием в реальных условиях загрязнения окружающей среды практически невозможно. Однако такую возможность дают биомаркеры эффекта, например, на клеточном уровне генетические повреждения оценивают

путем учета микроядер, протрузий, межъядерных мостов, а на уровне целого организма таким биомаркером являются ВПР и ВМГВ. Примененный в данном исследовании подход, включающий их комбинацию позволил объективно оценить влияние конкретного загрязнения территорий нефтепродуктами на генетическое здоровье населения.

Данный подход имеет определенные преимущества:

- Неинвазивное исследование. Требуется только соскоб слизистой оболочки щеки (без забора крови) и осмотр детей педиатром.

- Простая подготовка препаратов для исследования. Готовится мазок клеток из соскоба со слизистой оболочки щеки.

- Метод экономичен. Из оборудования необходим только бинокулярный микроскоп с хорошей оптикой. Для приготовления препаратов - термостат для окраски и недорогой набор реактивов.

- Время приготовления препаратов - не более суток, для микроскопического анализа препарата от каждого обследуемого требуется 1 рабочий день.

- Препараты можно хранить несколько лет, и они доступны для повторного анализа и верификации [Методические рекомендации, 2005].

- Неинвазивный анализ позволяет проводить оценку влияния фактора непосредственно на людях, и именно на наиболее чувствительной популяции - детях. Значительная чувствительность детей связана с тем, что количество действующего вещества на единицу массы (доза) у ребенка всегда больше, чем у взрослого из-за меньшей массы. Кроме того, организм ребенка -растущий, количество делящихся клеток больше, чем у взрослого, а такие клетки более чувствительны к действию факторов среды. В связи с этим одним из достоинств детской группы населения как индикатора антропогенного влияния загрязнения являются короткие, по сравнению со взрослыми, сроки проявления негативных эффектов. Также важно отсутствие действия сопутствующих факторов - вредных привычек (алкоголь, курение), факторов связанных с производственной деятельностью. Можно обследовать организованные группы детей, находящие в приблизительно равных условиях по большинству факторов с отличием только по проживанию. Все это повышает достоверность исследований, позволяя делать более объективные выводы об экологическом благополучии среды.

- Высокая информативность исследования, связанная с получением большого объема данных. В проведенном исследовании учитывали 4 показателя цитогенетического действия, 3 показателя, характеризующих пролиферацию, 6 показателей деструкции ядра и 3 интегральных показателя, т.е. всего 16 показателей кариологического анализа, а также ВМГВ у каждого ребенка с качественной характеристикой каждого типа ВМГВ. Это позволило доказать влияние исследуемого фактора на организм детей учитывая количественные показатели, а также предположить и описать возможные механизмы действия исследуемого фактора с учетом качественных особенностей исследуемых показателей. В большом числе приведенных в обзоре литературы исследований учитывался, как правило, один цитогенетический показатель.

Сложность использования данного подхода связана с необходимостью высокой квалификации специалиста-генотоксиколога и врача-педиатра, поскольку микроскопический анализ, и тем более, учет ВМГВ требует определенных навыков и знаний в данной области исследований.

В России данный подход разработан и применяется в последние годы в ФГБУ "НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации совместно с 1 Московским государственным медицинским университетом им. И.М.Сеченова. Исследования проведены во Вьетнаме, городах Чапаевске и Коряжме [Сычева Л.П. и др., 2011]. Однако при оценке влияния загрязнения почв нефтепродуктами на генетическое здоровье населения этот подход, как комплекс неинвазивных методов, использован впервые в России и в мире.

Таким образом, впервые проведен анализ широкого спектра кариологических показателей буккального эпителия и ВМГВ у детей и получены доказательства неблагоприятного воздействия высоких уровней содержания нефтепродуктов в почве на здоровье детей.

ВЫВОДЫ

1. На период обследования детей в исследуемых населенных пунктах Гойты (условно чистый район), Долинск и Мескер-Юрт загрязнение почвы нефтепродуктами составили 100 мкг/кг, 10020 мкг/кг и 8100 мкг/кг, а по содержанию бенз(а)пирена - <0,001 мг/кг почвы, 0,07 мг/кг и 0,55 мг/кг соответственно. ПДК по бенз(а)пирену была превышена в Долинске в 3 раза, в Мескер-Юрте - в 27 раз.

2. У детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами, отмечено достоверное повышение частоты клеток с цитогенетическими нарушениями в буккальном эпителии в 3 и 3,4 раза соответственно, интегрального показателя деструкции ядра (апоптического индекса) в 2,8 и 3,1 раза, показателя пролиферации (частоты клеток с двумя и более ядрами) - в 1,6 раза по отношению к контролю, что характеризует неблагоприятное действие факторов среды на клеточные популяции человека.

3. У детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами, отмечено достоверное повышение частоты среднего количества ВМГВ на 1 ребенка в 1,8 и 1,7 раза, а также доли детей с высоким уровнем ВМГВ в загрязненных населенных пунктах при сравнении с условно чистым районом, что характеризует неблагоприятное действие нефтезагрязнений на здоровье на этапе формирования организма.

4. Частота ВМГВ не зависела от пола обследуемых детей. Специфика локализации ВМГВ у детей, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами, по сравнению с действием других факторов (данные литературы) также не выявлена.

5. Использованный в исследовании инновационный методический подход оказался высокоинформативным (позволил оценить большой набор

показателей на клеточном и организменном уровнях), объективным (оценка показателей была количественная и качественная, позволяла верифицировать данные), доказательным (полученные данные позволили выявить достоверные различия исследуемых показателей в сравниваемых группах детей) и экономически доступным, что позволяет рекомендовать его для проведения подобных исследований в других регионах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Джамбетова, П.М. Оценка влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус и показатели апоптоза в клетках буккального эпителия у детей. /П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, А.Б. Махтиева, Л.П. Сычева//Экологическая генетика. -2009. - Том 7. -№4.-С.34-40.

2. Джамбетова, П.М. Анализ врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами. /П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, А.Б. Махтиева, Л.П. Сычева // Экологическая генетика,- 2011 .-№ 3.-С.89-94.

3. Молочаева, Л.Г. Влияние загрязнения почв нефтепродуктами на кариологические показатели здоровых детей. /Л.Г. Молочаева, П.М. Джамбетова., Л.П. Сычева //Известие Кабардино-Балкарского научного центра РАН,- 2011.-№5,- С.32-37

4. Молочаева, Л.Г. Зависимость цитогенетических показателей детей от ландшатфно-экологических условий проживания. /Л.Г. Молочаева, Л.Х. Биткаева, П.М. Джамбетова, З.М. Оздыханова //Известие Кабардино-Балкарского научного центра РАН. - 2011. - №6. С.302-306.

Публикации в других изданиях

1. Молочаева, Л.Г. Исследование влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус детей. /Молочаева Л.Г., Джамбетова П.М, Сычева Л.П.//Труды КНИИ РАН,- 2010,- № 3,- С. 159-164

2. Джамбетова, П.М. Популяционно-генетический анализ врожденных морфогенетических вариантов у детей ЧР./П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, Л.П.Сычева, А.Б. Махтиева //Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков.15-19.12.2010.г.Ростов-на-Дону.-2010,- С.54

3. Молочаева, Л.Г. Цитогенетический статус детей, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами./Л.Г. Молочаева, П.М Джамбетова., Л.П. Сычева //Материалы научно-практической конференции «Наука и образование в Чеченской республике», посвященной 10-летию со дня основания КНИИ РАН. Грозный, 07.04.2011. -2011. С.

Подписано в печать 03.09.2013г. Формат 60x841/16. Печать ризографная. Бумага офсетная.

Гарнитура «Тайме». Усл. п. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в издательско-типографском участке ИПЭРД г. Махачкала, Дахадаева 21.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молочаева, Луиза Геланиевна, Махачкала

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ЧЕЧЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МОЛОЧАЕВА ЛУИЗА ГЕЛАНИЕВНА

ВОЗДЕЙСТВИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ НА ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗДОРОВЬЕ ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

03.02.08 - экология (биология) - биологические науки 03.02.07 - генетика (биология) - биологические науки

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА

БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201362656

Научные руководители: Д.б.н., проф. Л.П.Сычева К.б.н., доцент П.М.Джамбетова

Грозный - 2013

Введение

Оглавление

4

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1 .Загрязнение среды обитания человека нефтью и 11

нефтепродуктами

1.2.Влияние нефти и нефтепродуктов на живые системы 15

1.3. Использование расширенного микроядерного теста (кариологического анализа) при обследовании людей 31

1.4. Учет врожденных морфогенетических вариантов в эколого-генетических исследованиях 52

Глава 2. Объекты и методы исследования 59

2.1. Объекты исследования 59

2.1.1. Анализ загрязнения нефтепродуктами территорий проживания обследуемых детей Чеченской республики 59

2.1.2. Характеристика обследованных групп детей 63

2.2. Методы исследования 64

2.2.1. Методика определения загрязнения почв 64

2.2.2. Методы оценки цитогенетического статуса

детей 65

2.2.3. Методы выявления, учета и оценки врожденных морфогенетических вариантов у детей 67

2.2.4.Статистическая обработка данных 69

Результаты исследований 72

Глава 3. Анализ загрязнения почв изучаемых населенных пунктах нефтепродуктами и бенз(а)пиреном 72

Глава 4. Цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей, проживающих в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами 74

Глава 5. Анализ врожденных морфогенетических вариантов у детей, проживающих в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами 81

Глава 6. Обсуждение результатов исследования 87

6.1. Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами на цитогенетический статус, показатели

пролиферации и апоптоза у детей 87

6.2. Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами на формирование врожденных морфогенетических вариантов у детей 91

6.3. Особенности использования инновационного подхода, включающего кариологический анализ и учет врожденных морфогенетических вариантов у детей для оценки влияния загрязнения окружающей среды нефтепродуктами 95

Выводы 99

Литература 101

Приложения 138

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время все более актуальной становится проблема оценки влияния загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в районах добычи и переработки нефти на здоровье людей и биологические сообщества. Нефть и продукты ее переработки или трансформации становятся ведущими загрязнителями окружающей среды. Повсеместное распространение нефтепродуктов в результате хозяйственной деятельности человека и их воздействие на атмосферу, поверхностные и подземные воды, почву и живые объекты отмечаются на всех стадиях добычи, переработки использования нефти. Образуется огромное количество загрязняющих окружающую среду отходов, которые вызывают появление экологически обусловленных патологий у населения.

Среди комплекса экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами, особое место занимает прогноз возможных генетических последствий. Большое значение этой проблемы предопределено тем, что многие вещества, введенные в окружающую среду, обладают мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием. Генотоксические вещества, поступающие в окружающую среду, представляют для человека реальную онкогенную опасность, которая многократно возрастает в силу того обстоятельства, что действию мутагенных химических соединений подвергаются не отдельные индивидуумы, а целые популяции [Белицкий и др., 1989].

Наиболее опасными загрязнениями с этой точки зрения являются

продукты горения и низкотемпературной переработки нефти.

Генотоксичными свойствами обладают многие полициклические

ароматические углеводороды (ПАУ), образующиеся при

низкотемпературном горении нефтепродуктов, в том числе, бенз(а)пирен, а

также бензин, дизельное топливо, бутан, стирол, бензол, хлороформ и

другие. Проведенные в 2002-2004 гг. на территории Чеченской республики

4

исследования генотоксического действия продуктов переработки нефти на различные виды природной флоры и растительные тест-системы показали, что почвы, загрязненные нефтью вызывают значительное увеличение уровня мутабильности у видов растений дикорастущей флоры, принадлежащих к различным семействам [Джамбетова и др., 2005, Джамбетова, Реутова, 2006]. Эти химические факторы снижают фертильность и индуцируют повреждения ДНК, что может приводить к онкопатологии.

Следует отметить, что эффективная защита здоровья людей обусловлена защитой окружающей среды, в которой они проживают от разного рода загрязняющих факторов. Важным аспектом этой проблемы является достоверная информация о степени влияния разного рода загрязнений на живые системы и, непосредственно человека. Однако это влияние практически не изучено при обследовании населения, проживающего на территориях, загрязненных нефтепродуктами, и, особенно, наиболее уязвимой группы - детей младшего возраста.

Данные о влиянии нефтепродуктов на здоровье населения, проживающее в условиях загрязнения окружающей среды, в настоящее время единичны и получены, в основном, при обследовании рабочих нефтяных компаний или персонала автозаправочных станций. Достоверно более высокий уровень хромосомных аберраций по сравнению с условным контролем выявлен у рабочих нефтяных компаний в Эквадоре [Paz-y-Miño et al., 2008], Индии [Krishnamurthi et al., 2008] и Португалии [Roma-Torres et al., 2006]. Отмечается повышение общего числа микроядер и снижение частоты пролиферации клеточных популяций у лиц, участвовавших в ликвидации последствий разлива нефтяного танкера Prestige (северо-запад Испании, ноябрь 2002 г.), а также у жителей, проживающих на прилегающих территориях. Отмечена зависимость цитогенетического статуса обследованных лиц от возраста и времени нахождения на данной территории [Pérez-Cadahía at al., 2008].

Имеются данные, что у детей, проживающих на территориях с техногенным химическим загрязнением, наблюдается увеличение числа врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ). Развитие ВМГВ обусловлено действием тератогенов и мутагенов окружающей среды, приводящее к изменению пролиферативной активности ткани и/или апоптоза и нарушению морфогенеза того или иного органа [Бочков и др., 1994, Котышева, 2007]. Можно предположить, что такие изменения, возникающие при действии нефтепродуктов на ранние этапы эмбриогенеза, могут привести к формированию ВМГВ. В настоящее время ВМГВ рассматривают как биомаркер неблагоприятного действия факторов окружающей среды на эмбриогенез. В связи с этим, ВМГВ могут быть биомаркером врожденных пороков развития, в частности нарушений развития нервной системы, патологии других органов и систем. У детей с 5 и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленной патологии и снижению адаптационных возможностей организма [Котышева E.H., 2007].

Учитывая результаты исследований П.М.Джамбетовой и соавторов [2005, 2006] о повышенных уровнях мутагенных эффектов в природных популяциях растений Чеченской республики и данные других авторов по оценке генотоксического действия нефтепродуктов на живые системы, мы высказали гипотезу о возможном повышенном уровне генетических нарушений у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами.

Для решения этих вопросов необходимо комплексное обследование детей с проведением углубленных лабораторных исследований. Однако следует учесть, что трудно получить материал при использовании инвазивных методов. В ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» разработан и апробирован неинвазивный метод, позволяющий оценить цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза при исследовании эксфолиативных клеток буккального эпителия человека [Сычева, Журков, Рахманин, Ревазова, 2007; Юрченко и др., 2007].

Информативность этого метода для оценки влияния факторов окружающей среды и характеристики некоторых заболеваний показана в ряде исследований [Сычева и др., 2005; 2008; 2011]. Мы предположили, что использование этого подхода даст объективную оценку состояния генетического здоровья детей, проживающих на загрязненных территориях, на клеточном уровне. Для оценки генетического здоровья на уровне целого организма можно использовать также новый, но уже хорошо апробированный подход, разработанный под руководством академика РАМН

H.П.Бочкова и сотрудников кафедры клинической генетики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по оценке врожденных морфогенетических вариантов [Бочков и др., 1994; Субботина, 1994].

Целью настоящего исследования является оценка цитогенетического статуса и врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

I. Установить характер и уровни загрязнения почв нефтепродуктами и продуктами горения нефти в изучаемых районах Чеченской республики;

2. Провести сравнительный анализ цитогенетического статуса, показателей пролиферации и апоптоза у детей, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами, и в условно экологически чистом селе с использованием кариологического анализа клеток буккального эпителия.

3. Провести диагностику ВМГВ у детей с учетом пола и локализации ВМГВ.

4. Сравнить частоты ВМГВ у детей, проживающих в населенных пунктах с разным уровнем загрязнения почв нефтепродуктами.

5. Определить возможность и особенности применения кариологического анализа буккального эпителия и анализа ВМГВ как неинвазивных методов исследования для оценки влияния нефтепродуктов на генетическое здоровье детей.

Научная новизна. Впервые в Чеченской республике проведены исследования по влиянию загрязнения почвы нефтепродуктами на генетическое здоровье детей. Установлено неблагоприятное действие факторов среды на организм человека: статистически достоверное повышение частоты клеток с цитогенетическими нарушениями в буккальном эпителии в 3 и 3,4 раза соответственно; интегрального показателя деструкции ядра (апоптического индекса) в 2,8 и 3,1 раза; показателя пролиферации (частоты клеток с двумя и более ядрами) - в 1,6 раза по отношению к контролю, у детей, проживающих в селах Долинск и Мескер-Юрт в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами на уровне приблизительно 8000-10000 мг/кг.

Впервые показано, достоверное повышение частоты среднего количества ВМГВ на 1 ребенка в 1,8 и 1,7 раза, а также доли детей с высоким уровнем ВМГВ в загрязненных нефтепродуктами населенных пунктах при сравнении с условно чистым районом, что характеризует неблагоприятное действие нефтезагрязнений на здоровье на этапе формирования организма.

Практическая значимость. Апробированный в работе подход к оценке генетического здоровья детей с использованием двух объективных высокоинформативных неинвазивных методов исследования на клеточном и организменном уровне с оценкой большого числа показателей может быть рекомендован для проведения других исследований по оценке неблагоприятного влияния разного рода факторов окружающей среды на здоровье населения.

Внедрение результатов исследования. Работа выполнена в Чеченском государственном университете на кафедре клеточной биологии, морфологии и микробиологии под руководством к.б.н., доцента П.М.Джамбетовой, д.б.н., профессора Л.П.Сычевой.

Материалы исследования используются в учебном процессе на

лекциях и семинарских занятиях при подготовке студентов по специальности

«Биология» и «Экология» в Чеченском государственном педагогическом

8

институте (Справка о внедрении №340 от 25.09.2012 г.); в Чеченском государственном университете при подготовке студентов по специальностям «Биология» и «Микробиология» (Справка о внедрении №1273-0-19 от 24.09.2012 г.); в научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина при проведении научно-исследовательских работ по экологии человека и гигиене окружающей среды, направленных на оценку влияния факторов окружающей среды на здоровье человека (Справка о внедрении №02-10/615 от 28.09.2012 г.).

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Автором собраны пробы почв для исследования, проведена подготовка и анализ цитогенетических препаратов, от всех детей, участвующих в обследовании. Автор совместно с квалифицированным врачом-педиатром принимал личное участие в осмотре детей на предмет наличия врожденных морфогенетических вариантов. Проведена статистическая обработка и представление данных в диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

Дети, проживающие в условиях значительного загрязнения почвы нефтепродуктами (8000-10000 мкг/кг), находятся в зоне высокого риска нарушений состояния здоровья, связанного с повышенным уровнем цитогенетических нарушений и сдвигов клеточной кинетики.

Загрязнение почвы нефтепродуктами на уровне 8000-10000 мкг/кг приводит к образованию повышенного уровня врожденных морфогенетических вариантов в популяции, что характеризует неблагоприятное действие загрязнения почв нефтепродуктами на здоровье детей на этапе формирования организма.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии наук Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (г. Грозный, 28 ноября 2011 г.); на круглом столе «Экология и дети» на неделе Науки в Чеченском государственном педагогическом институте (г.

9

Грозный, 10 июня 2012); на научно-практической конференции «Наука и образование в Чеченской республике», посвященной 10-летию со дня основания Комплексного научно-исследовательского института РАН, (г.Грозный, 7 апреля 2011 г.); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (г.Ростов-на-Дону, 15-19 декабря 2010 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них - 4 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включая «Объекты и методы», обсуждение результатов, выводов, списка литературы, приложений. Текст изложен на 146 страницах машинописи, иллюстрирован 15 таблицами и 6 рисунками. Указатель литературы содержит 307 источника, из них 130 отечественных и 177 иностранных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами

Нефтяные углеводороды являются широко распространены в окружающей среды, что, в основном, связано с деятельностью человека. При добыче, транспортировке, переработке и использовании теряются десятки миллионов тонн нефти и нефтепродуктов в год. Главные источники загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами приведены в таблице 1.1. [Пиковский, 1993].

Почвы загрязняются путем разливов или выбросов пластовой жидкости, состоящей из сырой нефти, газа, нефтяных вод; газа из газовых шапок нефтяных залежей; подземных вод и буровых растворов, нефтепродуктов, вследствие аварий на нефтепроводах и различных нарушений хранения и применения нефтепродуктов.

Загрязнение почв нефтью - совершенно особый вид загрязнения, который приводит к глубокому изменению практически всех характеристик почвы: морфологических, физических, химических и биологических, что обуславливает потери плодородия и отторжению их из сельскохозяйственного землепользования и негативным воздействиям на живые организмы [Катченков, 1979; Пиковский, 1993; Кураков и др., 2003].

При нефтяном загрязнении взаимодействуют три основных фактора, которые приходится учитывать при оценке последствий загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами:

1) сложность, поликомпонентность состава нефти, находящейся в процессе постоянного изменения, наличие в ее составе токсичных веществ-спутников;

2) сложность, гетерогенность состава и структуры самой почвенной экосистемы, находящейся в процессе эволюционного развития;

3) многообразие и изменчивость внешних факторов (температура, влажность, состояние атмосферы, количество осадков и др.) [Пиковский и др., 2003].

Таблица 1.1

Главные источники загрязнения природной среды нефтью

и нефтепродуктами [Временные методические рекомендации..., 1984].

Предприятия сооружени Источники загрязнения Основные причины загрязнения Вещества, загрязняющие природную среду

Нефтедобывающая промышленность Скважины Стравливание во время эемонт