Генетические последствия загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в Чеченской Республике

Джамбетова, Петимат Махмудовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические последствия загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в Чеченской Республике
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические последствия загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в Чеченской Республике"

На правах рукописи

Джамбетова Петимат Махмудовна

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ В ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 4 АПР 2014

Уфа-2014

005547395

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Чеченский государственный университет"

Научные консультанты: Сычева Людмила Петровна, д.б.н.,

профессор

Рубанович Александр Владимирович, д.б.н.

Официальные оппоненты:

Гераськин Станислав Алексеевич зав. лабораторией экотоксикологии доктор биологических наук, растений ГНУ ВНИИ профессор сельскохозяйственной радиологии и

агроэкологии РАСХН

Бахтиярова Клара Закиевна профессор кафедры неврологии с

доктор биологических наук курсами нейрохирургии и

профессор медицинской генетики ФГБОУ ВПО

Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России Кузьмина Людмила Павловна зав. лабораторией медико-доктор биологических наук, биологических исследований ФГБУ профессор «Научно-исследовательский институт

медицины труда» РАМН

Ведущая организация: Институт гигиены, токсикологии

пестицидов и химической безопасности ФБУН «Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится » 0^-^-92014 г. в « часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.133.01 при ФГБУН Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу:

450054, Уфа, просп. Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН (ibg.anrb.ru/dissov.html) и в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, просп. Октября, д. 71), с авторефератом - на сайте ВАК РФ e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «¿7/» РУ 2014 г. Ученый секретарь

диссертационного совета <-"" С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время все более актуальной становится проблема оценки влияния загрязнения окружающей среды, в частности, нефтепродуктами в районах добычи и переработки нефти на здоровье людей и биологические сообщества. Продукты горения нефтескважин, утечки из нефтепроводов и нефтехранилищ, химические отходы, загрязняющие атмосферу, земельные угодья и водные источники, являются опасными факторами, влияющими как на свойства почв (Халимов, 1996; Захарова и др., 2007), почвенную микробиоту (Назаров, Иларионов, 2005; Киреева и др., 2009), растения (Седых, 2002; Мифтахова, 2005; Чугунова и др., 2011) так и на здоровье человека (Онжценко, 2002; Ревич, 2007). Особая роль среди комплекса проблем, связанных с загрязнением окружающей среды, отводится изучению генетических последствий воздействия различных компонентов нефти на организм человека. Показано, что нефть и продукты ее переработки, попадающие в различные объекты окружающей среды, проявляют токсический (Киреева и др., 2004; Чугунова и др., 2011), генотоксичный (Аниськина и др., 2001), анеугенный и кластрогенный эффекты (Фединяк и др., 2002; Lerne et al., 2008; 2009).

На территории Чеченской Республики, которая является одним из важнейших нефтедобывающих и нефтеперерабатывающих регионов Кавказа, в последние десятилетия сохраняется неблагоприятная экологическая обстановка (Ахмадова, 2012), в связи с широко распространившейся практикой бесконтрольной кустарной добычи нефти и ее переработки, в том числе, вблизи мест проживания населения. У населения, находящегося непосредственно на территории или вблизи зон экологической напряженности, выявляется большое количество хронических патологий внутренних органов, новообразований, врожденных патологий новорожденных (Муслуева, Куценко, 2006).

Для решения вопросов сохранения здоровья тех категорий населения, которые трудятся или проживают в зонах риска,' а также их детей, проводятся комплексные исследования с использованием различных подходов. В ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» разработан и апробирован неинвазивный метод, позволяющий дать объективную оценку состояния генетического здоровья человека на клеточном уровне (цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза) при исследовании эксфолиативных клеток буккального эпителия (Сычева и др., 2007; Юрченко и др., 2007).

Для оценки генетического здоровья на уровне целого организма эффективно применяется метод учета различных аномалий в развитии

врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ, Бочков и др., 1994; Субботина, 1994), разработанный на кафедре клинической генетики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова. В настоящее время ВМГВ рассматривают как биомаркеры неблагоприятного действия факторов окружающей среды на эмбриогенез. У детей с пятью и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленных патологий и снижению адаптационных возможностей организма (Котышева, 2007).

Генотоксический эффект действия различного рода загрязнителей на здоровье работников вредных производств, в том числе, контактирующих с нефтепродуктами, позволяет выявить использование микроядерного теста (Gattas et al., 2001; Norppa et al., 2003; Roma-Torres et al., 2006; Krishnamurthi et al., 2008; Sellappa et al., 2010; Ильинских, 2011).

В настоящее время во всем мире изучается связь генетического полиморфизма с индивидуальной чувствительностью генома человека к действию мутагенных факторов окружающей среды (Сидорова и др., 2004; Georgiadis et al., 2005; Ревазова и др., 2009; Волков и др., 2009). Считается, что потенциально они могут оказывать наиболее заметное негативное воздействие не на все население, а только на ту часть популяции, которая имеет определенную генетическую предрасположенность, в частности, к экологически обусловленным заболеваниям (Баранов и др., 2000,2004; Беспалова и др., 2001; Спицын и др., 2005). Большая часть таких исследований посвящены изучению полиморфизма генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (Викторова, 2011), защитных систем репарации ДНК (Кочетова, 2011), контроля клеточного цикла и антиоксидантной защиты (Засухина, Кузьмина, 2007), являющихся показателями наследственной индивидуальной чувствительности. Связь генетического полиморфизма с ответом организма на мутагенные воздействия факторов среды является крайне важной областью исследований в экологии человека и экологической генетике, изучающих проблему реализации генотипа в определенных условиях и направленных на выявление комплекса генов, отвечающих за возникновение патологических состояний при контакте с повреждающими факторами. Это позволяет исследовать механизмы возникновения экологически обусловленной патологии в зависимости от особенностей генотипа и предлагать конкретные решения, направленные на защиту здоровья людей.

окружающей среды на здоровье детей дошкольного и школьного возраста (Котышева, 2007; Сычева, 2007; Дружинин, 2009). Кроме того, большой интерес представляет изучение возможных фенотипических и цитогенетических изменений у представителей дикорастущей флоры, произрастающих на территориях, загрязненных отходами нефтедобычи и ее переработки.

Целью настоящего исследования является комплексная оценка влияния загрязнения почвы нефтепродуктами на некоторые виды дикорастущей флоры, модельные растительные и бактериальные тест-системы, а также на здоровье детей ряда районов Чеченской Республики с учетом данных о цитогенетическом статусе, частоте врожденных морфогенешческих вариантов и полиморфизме генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и антиоксидантной защиты.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить характер и уровни загрязнения почв нефтепродуктами и продуктами горения нефти в изучаемых районах Чеченской Республики.

2. Изучить генотоксическое действие загрязнений почвы нефтепродуктами с использованием бактериального теста Эймса и тест-системы на модельных растениях «Соя Glycine Max (L) Merrill».

3. Изучить влияние загрязнений почвы нефтепродуктами на фертильность, всхожесть и уровень цитогенетических нарушений у четырех видов дикорастущей флоры — Matricaria recutita L (ромашка непахучая), Rumex confertus Willd (конский щавель), Taraxacum officinale Wigg. s. I (одуванчик лекарственный) и Plantago major L. (подорожник большой).

4. Провести сравнительный анализ цитогенетического статуса, показателей пролиферации и апоптоза у детей, проживающих в условиях загрязнения почв нефтепродуктами и в условно экологически чистом районе, с использованием кариологического анализа клеток буккального эпителия.

5. Провести анализ частоты врожденных морфогенешческих вариантов с учетом пола и их локализации у детей, проживающих в населенных пунктах с разным уровнем загрязнения почв нефтепродуктами.

6. Определить возможность и особенности применения кариологического анализа буккального эпителия и анализа врожденных морфогенетических вариантов как неинвазивных методов исследования для выявления групп риска по предрасположенности к патологии, обусловленной генетическими нарушениями, среди детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды.

7. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 rs2606345, rs4646903, rsl048943, CYPIB1 rsl056836, GSJT1, GSTM1); генов репарации ДНК (XRCC1

rsl799782, rs25487, XPDrsl799793, rsl3181, ERCC1 rsl 1615, APEX1 rsll30409, ATM rs664143, 0GG1 rsl052133, ADPRT nsl 136410, ABCB 7rel045642) и генов оксидативного ответа (SOD2 rs4880, СИГ rs7943316, GCLC rsl7883901), а также гена-триггераMTHFRrsl80l 133 у детей чеченской популяции, проживающих на исследованных территориях.

8. Провести поиск ассоциаций полиморфных маркеров изучаемых генов с частотой цитогенетических нарушений в буккальных эпителиоцитах и частотой ВМГВ в обследуемых группах лиц.

Научная новизна. Впервые на видах дикорастущей флоры Matricaria recutita L., Rumex confertus WillcL, Taraxacum officinale Wigg. s. /., Plantago major L., растительной тест-системе - соя Glycine max. (L) Merill. и бактериальном тесте Эймса показан токсический, цитотоксический и мутагенный эффект нефтезагрязнений при содержании нефтепродуктов в почве свыше 45 мкг/кг. С использованием растительной тест-системы Glycine max. (L) Merill показано, что загрязнение почвы компонентами нефти индуцирует в клетках растений широкий спектр генетических эффектов: прямые и обратные мутации, соматический кроссинговер и нерасхождение хромосом.

Впервые при исследовании групп детей Чеченской Республики использован кариологический анализ буккального эпителия с целью изучения влияния загрязнения почвы нефтепродуктами на генетическое здоровье детей. Выявлено статистически значимое повышение частоты всех изученных кариологических показателей: клеток с микроядрами, клеток с протрузиями, клеток с двумя и более ядрами, частоты клеток в апоптозе. При высоком уровне загрязнения нефтепродуктами выявлена статистически значимая ассоциация между уровнем цитогенетических нарушений (доля клеток с микроядрами и протрузиями) и частотой минорных аллелей генов репарации OGG1 и антиоксидантной защиты SOD2, CAT.

Показано достоверное повышение среднего числа врожденных морфогенетических вариантов в расчете на одного ребенка у детей, проживающих на территориях с содержанием нефтепродуктов выше 45 мкг/кг почвы, ассоциированное с уровнем загрязнения и носительством минорного аллеля GCLC* 129Т.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные нами ассоциации между уровнем кариологических нарушений (долей клеток с микроядрами и протрузиями) и частотой аллелей генов репарации и антиоксидантной защиты при высоком уровне загрязнения нефтепродуктами территорий проживания указывают на весомый вклад экзогенных факторов в развитие патологических состояний и могут послужить основанием для дальнейших исследований данного вопроса.

очередь, на виды дикорастущей флоры in situ и растительные тест-системы с учетом вклада всего комплекса опасных соединений, затем на здоровье населения, что позволяет провести первичный эколого-генетический мониторинг окружающей среды с целью выявления территорий с повышенной опасностью. Достоинством способа оценки генетического здоровья населения является использование неинвазивных и высокоинформативных методов - кариологического анализа буккального эпителия и учета врожденных морфогенетических вариантов.

Определена прогностическая ценность индекса накопления цитогенетических нарушений 1ас(0,87) у детей, проживающих на загрязненных нефтепродуктами территориях. Данный показатель может быть рекомендован для использования в других исследованиях по оценке генетического здоровья населения для формирования групп высокого риска и последующего проведения оздоровительных мероприятий. Апробированный в работе подход к оценке генетического здоровья детей с использованием высокоинформативных методов исследования на клеточном и организменном уровне с оценкой большого числа показателей может быть рекомендован для проведения других исследований по оценке неблагоприятного влияния разного рода факторов окружающей среды на здоровье населения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Токсическое и мутагенное действие продуктов переработки и горения нефти на изученные дикорастущие виды растений усиливается в ряду: Matricaria recutita L. - Taraxacum officinale Wigg. s.l. - Rumex confertus Willd - Plantago major L.

2. Загрязнение почвы нефтепродуктами индуцирует широкий спектр генетических повреждений клеток в тест-системе соя Glycine max (L) Мег ill.

3. Доказана прогностическая значимость применения кариологического анализа буккального эпителия и врожденных морфогенетических вариантов для выявления групп риска по предрасположенности к патологии, обусловленной генетическими нарушениями, среди проживающих в загрязненных районах детей.

4. Уровень кариологических нарушений ассоциирован с носительством минорных аллелей генов репарации OGG1 и антиоксидантной защиты SOD2, CAT у детей, проживающих в районах с высоким уровнем загрязнения почвы нефтепродуктами.

5. Загрязнение почвы нефтепродуктами оказывает гено- и цитотоксическое действие на организм детей, которому в большей степени подвержены дети с минорными аллелями генов репарации OGG1 и антиоксидантной защиты SOD2, CAT,

6. Высокий уровень загрязнения почвы нефтепродуктами

вызывает увеличение среднего числа врожденных морфогенетических вариантов на одного ребенка, ассоциированное с носительством минорного аллеля GCLC* 129Т.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии и природопользования в условиях посткризисного восстановления экономики и социальной сферы Чеченской Республики» (Грозный, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Естественные науки в решении проблем производства, экологии и медицины» (Грозный, 2006); III международной конференции «Моделирование устойчивого регионального развития». (Нальчик, 2009); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров. (Москва. 2009); научно-практической конференции к 35-летию образования биолого-химического факультета и факультета геоэкологии Чеченского государственного университета (Грозный, 2010); Объединенном пленуме научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих (Москва, 2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков ч(Ростов-на-Дону, 2010); Всероссийской конференции «Наука и образование в Чеченской Республики: состояние и перспективы» (Грозный, 2011); научно-практической конференции «Наука и образование в Чеченской Республике», посвященной 10-летию со дня основания Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН, (Грозный, 2011); круглом столе «Экология и дети» на неделе Науки в Чеченском государственном педагогическом институте (Грозный, 2012); международном симпозиуме "Устойчивое развитие: проблемы, концепции, модели", посвященном 20-летию Кабардино-Балкарского научного центра РАН (Нальчик, 2013); I Кавказском международном экологическом форуме (Грозный, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 работа, из них 15 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография, методические рекомендации.

Личный вклад. Все результаты, представленные в работе, получены в период с 2002 по 2012 год при непосредственном участии автора при постановке проблемы диссертационного исследования, формулировке целей и задач, в планировании и проведении экспедиций по сбору материала; лабораторные эксперименты проводились лично или под руководством автора; автор лично проводила сбор литературных данных, создание баз данных, анализ полученных результатов, написание статей; под руководством консультантов проведены статистическая обработка результатов, обсуждение ряда разделов и оформление рукописи диссертации и автореферата.

Внедрение результатов работы. Материалы исследования используются в учебном процессе в Чеченском государственном

университете при подготовке студентов по специальности «Биология» и «Экология». В результате проведенной автором работы в ЧГУ создана научно-исследовательская лаборатория экологического мониторинга под руководством Джамбетовой П.М. Авторские методические рекомендации «Использование видов дикорастущей флоры для определения генотоксичности загрязнения окружающей среды», утвержденные Министерством природных ресурсов и охраны окружающей среды Чеченской Республики, используются для проведения эколого-генетического мониторинга территорий ЧР. Материалы диссертационной работы используются при проведении научно-исследовательских работ в области экологии человека и гигиены окружающей среды в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАН.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 340 источников, из них - 175 отечественных и 165 зарубежных авторов, приложения. Работа иллюстрирована 47 таблицами и 28 рисунками.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь в проведении совместных исследований и обсуждении результатов работы своим научным консультантам д.б.н., проф. Сычевой Л.П. (НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАН) и д.б.н. Рубановичу А.В. (ИОГен им.НИ.Вавилова РАН); особую признательность д.б.н., проф. Абилеву С.К (ИОГен им Н.И. Вавилова РАН); Д.6.Н. Реутовой Н.В. (КБНЦ РАН), д.б.н., проф. Хуснугдиновой Э.К. (ИБГ УНЦ РАН); д.м.н., проф. Викторовой Т.В. (БГМУ); а также дб.н., проф. Керефовой МК. (КБГУ им. Х.М.Бербекова), к.б.н. Солтаевой А.М.-Х. и всем коллегам лаборатории экологического мониторинга ЧГУ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Комплексное эколого-генетическое исследование, проведенное на территории Чеченской республики, включает изучение влияния нефтепродуктов на дикорастущие виды природной флоры, растительные и бактериальные тест-системы и детское население. Для исследования влияния загрязнения почвы нефтепродуктами на различные виды растений были отобраны несколько населенных пунктов, где более 15 лет производится первичная переработка нефти: села Долинск (Грозненский район), Алхан-Юрт (Урус-Мартановский район), Мескер-Юрт (Шалинский р-н), Цоцан-Юрт (Шалинский р-н), Гельдеген (Курчалоевский р-н). В качестве условно чистой зоны было выбрано село Гойты (Урус-Мартановский р-н), в котором подобного производства не было. Территории для проведения исследований характеризуются значительным сходством, а различия в основном связаны с уровнем загрязнения почв продуктами переработки нефти.

Методы определения загрязнения почв

Отбор проб почвы. Для определения уровня загрязнения почвы нефтью, нефтепродуктами и продуктами ее горения отбирали пробы почв на расстоянии 100 ± 20 м от нефтеперегонных установок в летний период в сухую погоду из верхнего горизонта 0-20 см в пятикратной повторности. Из 5 кг составляли индивидуальный смешанный образец (1 кг) для анализов и высушивали до воздушно-сухой массы для проведения химического анализа.

Анализ проб почвы на содержание нефтепродуктов и тяжелых металлов проводили совместно с лабораторией химии гумуса почвенного стационара факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Для определения состава нефтепродуктов использовали метод инфракрасной спектроскопии; содержание тяжелых металлов определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе 5100РС фирмы Perkin Elmer по стандартной методике фирмы изготовителя.

Анализ проб на содержание бенз(а)пирена в исследуемых образцах почвы проводили совместно с испытательной лабораторией почв, кормов, сельскохозяйственной и пищевой продукции, природных вод AHO НПЦ «Эконорма» при МГУ им. М.В.Ломоносова методом, предложенным Э.В. Шпольским (1968) - спектрофлуориметрический анализ при низких температурах.

Формирование групп детей для обследования

Эколого-генетические исследования влияния загрязнения окружающей среды на детей проведены в 2007 году в 6-ти населенных пунктах Чеченской Республики, характеризующихся различным уровнем загрязнения почвы нефтепродуктами: в селах Долинск и Мескер-Юрт, где более 15 лет производилась первичная переработка нефти, а также в условно чистых селах Гойты, Червленая, Зандак и Шатой, в которых подобного производства не было. Исследование проведено у 317 школьников начальных классов средних школ 4P в возрасте 7-10 лет. В обследовании участвовали дети из семей только коренных жителей региона, относящиеся к одной национальности - чеченцы. Родители всех детей, участвующих в обследовании, подписали формы информированного согласия.

Исследование фитотоксичности загрязненных нефтепродуктами почв

Для изучения фитоксичности почв в окрестностях населенных пунктов были выбраны 4 вида дикорастущей флоры: ромашка непахучая (Matricaria recutita L), конский щавель (Rumex confertus Willd), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg. s. I) и подорожник большой {Plantago majorL). Использованные виды широко распространены и хорошо описаны (Атлас ареалов и ресурсов, 1976).

Отбор растений проводили в окрестностях населенных пунктов, где располагались мини-заводы по переработке нефти. Визуально отмечали на одинаковом расстоянии от мини-заводов площадь (примерно 10000 ± 200 м2) покрытия почв избранными для исследования видами растений. Всю площадь разбивали по диагонали на участки в 50 м2 в четырехкратной повторности, в каждой их которых отбирали по 30 растений одного вида примерно одинакового габитуса в фазу цветения и созревания семян.

Анализируемые признаки растений: общую высоту, число боковых побегов, число цветков во всех соцветиях отмечали в фазу цветения растений. В фазу созревания семян отмечали общее число семян с растения с последующим вычислением числа семян в среднем на один цветок. Общую высоту растений измеряли (в см) от субстрата до первого соцветия у Matricaria recutita L., от розетки до верхушки стрелки у Taraxacum officinale fVigg. s. I. и Plantago major L. У Rumex confertus Willd. общую высоту измеряли от субстрата до верхушки метелки. Для определения процента всхожести, семена помещали в стеклянные чашки Петри по 100 штук и проращивали на фильтровальной бумаге с добавлением водопроводной воды в четырехкратной повторности в термостате при температуре +26°С.

Анализ хромосомных аберраций в клетках растений

Хромосомные нарушения в клетках отобранных видов растений определяли с использованием анафазно-телофазного метода (Дубинина, 1978). Исследования проводили на проростках корешков семян выбранных видов растений. Материал окрашивали ацетокармином (2%-й раствор кармина в 45%-й уксусной кислоте). Готовили временные давленые препараты по общепринятой методике (Дубинина, 1978). Проводили анализ не менее 1000 анафаз в норме и с цитогенетическими нарушениями. Учитывали одинарные и двойные «мосты», отставшие хромосомы, фрагменты хромосом.

Исследование соматических мутаций на модельной системе соя Glycine max (L) Merill

Для изучения мутагенного действия загрязнения окружающей среды продуктами нефтепереработки и горения нефти семена растительной тест-системы соя Glycine max (L) Merill (Vig, Paddock, 1968) проращивали в теплицах на почвах, взятых на участках, где отбирались растения природной флоры. Растения поливали водопроводной водой. Семена проращивали по 50 штук в четырехкратной повторности в течение 3-4 недель до появления двух простых и одного сложного листа. Одновременно определяли всхожесть семян. Мутагенное действие изучаемого фактора определяли путем учета и анализа пятен,

появляющихся на листьях. На каждом растении анализировали по пять листовых пластинок. Данные приводили в виде числа пятен на лист и анализировали как общее их количество, так и частоту каждого отдельного типа пятен по каждому типу листа.

Тестирование мутагенности исследуемых образцов почв в тесте Эймса

Тестирование исследуемых образцов почв на мутагенность проводили с использованием стандартного теста Эймса Salmonella/ижросошл (Arnes et al., 1975). Нами были использованы индикаторные штаммы Salmonella typhimurium ТА 98, ТА 100 (Arnes et al., 1975; Levin et al., 1982). Наличие мутагенного эффекта учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 3 чашки. Результаты учитывали при наличии мутагенного эффекта во всех вариантах позитивного контроля.

Методы оценки цитогенетического статуса детей

Оценку цитогенетического статуса детей проводили с помощью расширенного микроядерного теста буккальных клеток. Материалом для исследования являлись клетки слизистых оболочек полости рта 317 детей. Исследования (отбор материала, приготовление и анализ препаратов) проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (Сычева и др., 2005). У каждого ребенка шпателем собирали клетки со слизистой оболочки щеки, наносили на предметное стекло, готовили мазок клеток буккального эпителия по 2 препарата на каждого исследуемого. Препараты фиксировали этанолом и уксусной кислотой в соотношении 3:1, помещали на 1 час в 2,5% раствор ацетоорсеина (orcein Merck) при 37°С для окраски хроматина, затем докрашивали цитоплазму 1% раствором светлого зеленого (lightgreen, ICN Biomedicals Inc) при комнатной температуре в течение 1 мин. На готовых препаратах в соответствии с классификацией Л.П. Сычевой (2007) учитывали цитогенетические показатели: частоту клеток с микроядрами, протрузиями, ядерными мостами и ядром атипичной формы; показатели пролиферации: клетки с двумя, тремя и более ядрами, и сдвоенными ядрами (иначе: ядра с перетяжкой, ядра с насечкой); в качестве показателей ранней деструкции ядра учитывали клетки с вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, началом кариолизиса; поздней деструкции ядра - клетки с кариорексисом, кариопикнозом; с полным кариолизисом.

Методы выявления, учета и оценки врожденных морфогенетических

вариантов у детей

Выявление, учет и оценку ВМГВ у детей проводили, основываясь на перечне врожденных морфогенетических вариантов, разработанном на кафедре клинической генетики Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (Бочков и др., 1994; Субботина, 1994). Во время полного наружного осмотра регистрировали наличие каждого из 87 ВМГВ, которые четко распознаются согласно международным критериям (Spranger et al., 1982). Для проверки точности диагностики ВМГВ дважды проводили повторный осмотр 100 детей, выбранных произвольно. Во время исследования родители каждого ребенка заполняли анкеты, которые включали данные на каждого обследованного и сопутствующие факторы среды проживания. Рассчитывали среднее число ВМГВ на одного ребенка как отношение общего числа ВМГВ на количество исследованных детей данного населенного пункта.

Анализ генов-кандидатов

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови (200 мкл крови) в эппендорфы с К2 ЭДТА, и хранили при -18°С. Выделяли ДНК с помощью универсальной пробоподготовки Diatom ™ DNAPrep 200 («Изоген», Москва). Генотипирование проводили методом аллель-специфической тетрапраймерной ПЦР. Амплификацию проводили в амплификаторах Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700. Праймеры подбирали с использованием программы Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primerBA. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SubCell GT System SE-2 (Helicon, Германия) в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий, и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете 312 нм (транссилшоминатор X-F20.N, Luber Varmat, Франция).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS Statistics 17.0. Для сравнения количественных признаков использовали непараметрический тест Манна-Уитни. Для сравнения частот использовали двусторонний точный тест Фишера. Анализ таблиц сопряженности 2x2 проводили с помощью пакета программ WinPePi (http://www.brixtonhealth. com/pepi4windows.html). Для оценки сопряженности двух бинарных признаков использовали показатель OR (отношение шансов). Анализ ассоциации полиморфных генетических вариантов с кариологическими показателями проводили методами многомерного регрессионного анализа, которые реализованы в программе SPSS Statistics 17.0. Для поиска значимых генетических

ассоциаций был использован алгоритм с пошаговым включением/исключением предикторов. ROC-анализ (Zweig et al., 1993) прогностической эффективности кариологических показателей при использовании их в качестве биоиндикаторов нефтехимического загрязнения проводили с помощью пакета SPSS Statistics 17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эколого-географическая характеристика региона

Окружающая среда в Чеченской Республике за последнее столетие испытывала непрерывно возрастающий антропогенно-техногенный пресс, связанный с интенсивным промышленным развитием данного региона, которое еще в советское время проводилось без учета состояния окружающей среды и ее защиты, что неуклонно вело к нарушению экологического равновесия. В начале XXI века основными источниками загрязнения окружающей среды на территории республики были пожары на нефтяных скважинах, магистральных нефте- и газопроводах, нефтепарках, сжигание газа и кубового остатка на установках по переработке нефти и конденсата, сжигание мусора на стихийных свалках и пр. Усугубление экологической обстановки в ряде населенных пунктов 4P в последние десятилетия связано с широко распространившейся практикой бесконтрольной кустарной добычи нефти в данном регионе и ее переработки на мини-установках, общее число которых в этот период доходило до 15 тыс. (Шахтамиров и др., 2010).

Особое значение при эколого-генетическом исследовании живых объектов, обитающих на загрязненных нефтепродуктами территориях, приобретает оценка генетического последствия воздействия генотоксичных и мутагенных компонентов нефти. Известно, что продуктами низкотемпературной переработки и сжигания нефти являются полициклические ароматические углеводороды - известные мутагены и канцерогены, которые очень медленно метаболизируются микроорганизмами и растениями (Platt et al., 2008). Как было отмечено выше, нефть и продукты ее переработки обладают токсическим, анеугенными и кластрогенными эффектами. Многие исследования посвящены изучению воздействия нефти и продуктов ее переработки на растения в лабораторных условиях или с использованием растительных тест-систем (Rossi et al., 1995; Grant, 1998; Kong et al., 1999; Хомякова, 2003; Фахрудинов, 2005; Ибрагимова и др., 2009).

Данное исследование проведено с целью комплексного изучения влияния продуктов переработки и сжигания нефти на кустарных мини-заводах как на здоровье детей, проживающих в прилегающих к ним населенных пунктах Чеченской Республики, так и на отдельных представителей дикорастущей флоры в естественной среде обитания.

Уровень загрязнения почвы в изучаемых населенных пунктах Чеченской Республики

По результатам химического анализа почв в зоне обследования на содержание нефтепродуктов, тяжелых металлов и бенз(а)пирена, выявлено повышенное содержание углеводородов и нефтепродуктов в почвах исследуемых сел Долинск, Алхан-Юрт, Мескер-Юрт, Цоцан-Юрт, Гельдеген и Гойты. Максимальное количество их отмечено в Долинске, где содержание углеводородов превышает их наличие в почве условно чистой зоны в 57 раз, а нефтепродуктов - в 78 раз. В остальных населенных пунктах содержание нефтепродуктов превышено по сравнению с условно чистой зоной в десятки раз. Содержание тяжелых металлов Cd, Сг, Со и Мп, обладающих генотоксичностью, не превышает ПДК.

К 2012 г. практически на всей территории ЧР были ликвидированы мини-заводы по кустарной переработке нефти, которые являлись основными источниками попадашм нефтепродуктов во внешнюю среду изученных территорий. За этот период произошло снижение уровня нефтезагрязнения, однако, содержание бего(а)пирена в почве превышает значение ПДК в Долинске в 3 раза и в Мескер-Юрте в 4,8 раз . Учитывая, что содержание нефтепродуктов значительно ниже ПДК, основными факторами, вызывающими мутации, вероятно, являются полициклические ароматические углеводороды и, в частности, бенз(а)пирен, которые разрушаются микроорганизмами очень медленно и долгое время сохраняется в почве.

Определение фитотоксичности почвы, загрязненной нефтепродуктами

Известно, что у растений нефть вызывает замедление роста, нарушает фотосинтез и дыхание, изменяет структуру хлоропластов и вызывает ряд морфологических изменений. При этом реакция растений на нефть зависит так же и от их биоморфы и систематической принадлежности. Фитотоксичность почвы, загрязненной нефтепродуктами, находится в прямой зависимости от интенсивности и длительности загрязнения (Киреева и др., 2001; Магомедова и др., 2003; Назаров и др., 2005; Чугунова и др., 2011).

В качестве показателей фитотоксичности учитывали высоту цветоножки, количество соцветий, количество семян и всхожесть семян. На нефтезагрязненных территориях у исследуемых видов растений -Matricaria recutita L., Rumex confertus Willd., Taraxacum officinale Wigg. s.l., Plantago major L. по сравнению с растениями условно-чистой территории наблюдалось увеличение высоты стебля в 1,2-1,6 раза; снижение количества соцветий в 1,3-1,8 раза; уменьшение количества семян на одно соцветие в 1,2-1,9 раз и снижение всхожести семян на 19,658,0% (табл. 1).

Таблица 1. - Влияние нефтезагрязнения почвы на рост и продуктивность видов дикорастущей флоры (сводные данные исследований 2002 и 2012 гг)

Виды растений Год Учитываемые признаки

высота цветоножки (см) количество соцветий *(шт) количество семян** (шт) всхожесть семян (%)

условно чистая зона загряз ненная зона условно чистая зона загрязн енная зона условно чистая зона загрязне иная зона условно чистая зона загрязн енная зона

Taraxacum officinale Wigg.s. 1. 2002 20,8 ± 1,9 32,9 ± 2,7 11,4 ± 1,5 6,9 ± 0,6 204,6 ± 22,9 109,4± 6,4 78,4 ± 6,1 20,4 ± 2,1

2012 18,8 ± 1,9 24,9 ± 1,4 12,1 ± 0,81 9,2 ± 0,8 186,9 ± 9,5 144,6 ± 6,8 74,9 ± 5,9 54,2 ± 2,4

Matricaria recutita L. 2002 52,2 ± 4,8 70,2 ± 5,3 107,3 ± 7,6 73,7 ± 6,8 215,1 ± 9,2 123,7 ± 5,1 88,5 ± 3,8 53,7 ± 2,6

2012 46,3 ± 3,1 50,9 ± 6,5 79,5 ± 3,1 65,2 ± 6,8 201,3 ± 8,9 168,5± 8,7 79,9 ± 6,3 61,4 ± 2,8

Rumex confertus Willd. 2002 90,8 ± 11,6 136,7 ± 4,9 8,6 ± 0,3 4,4 ± 0,6 3247,9 ± 113,4 2174,1 ± 51,1 82,5 ± 3,1 59,8 ± 2,7

2012 - - - - - - - -

Plantago Major L. 2002 34,7± 1,7 41,7 ± 1,6 9,4 ±0,5 5,3 ± 0,8 2065,6 ± 101,8 1421,1 ± 31,5 96,6 ± 2,7 68,5 ± 2,1

2012 34,1 ± 2,3 40,3 ± 1,8 10,2± 0,4 7,9 ± 0,6 2102,5 ± 61,2 1501,2 ± 26,9 92,1 ± 3,5 72,5 ± 2,4

* - количество соцветий на одно растение; ** - количество семян на одно соцветие

Наблюдаемое усиление роста у растений, выросших на загрязненных нефтепродуктами почвах, происходит, предположительно, за счет увеличения общего азотного питания. Однако, стимулирующее действие нефтепродуктов наблюдается только при невысоких концентрациях их в почве (Киреева и др., 2006; 2007; Чугунова и др., 2011), причем, такой эффект зависит от также дозы нефти и характеристик почвенного состава (Зильберман и др., 2005).

В 2012 г. было проведено повторное исследование изученных показателей в условно чистом селе Гойш и нефтезагрязненных селах Долинск и Мескер-Юрт видов Plantago major L., Taraxacum officinale Wigg.s. /., Matricaria recutita L. Можно отметить, что в с. Гойты изменения изученных показателей по сравнению с 2002 г. незначительны.

У растений, собранных на загрязненных территориях, учитываемые показатели фитотоксичности в 2012 г. были ниже, чем в 2002 г., что согласуется с результатами химического анализа, показавших снижение содержания нефтепродуктов и бенз(а)пирена в образцах почвы по сравнению с 2002 г.

Таким образом, результаты биологического мониторинга территорий с различными уровнями нефтепродуктов в почве с помощью 4-х видов дикорастущей флоры показали снижение уровня

фитоксических эффектов с уменьшением концентрации нефти и продуктов их переработки в почве. Изученные виды растений показали высокую чувствительность к загрязнению почвы нефтепродуктами и могут использоваться для первичного мониторинга загрязнения окружающей среды различными загрязняющими веществами. Наиболее удобным объектом для проведения мониторинга оказался одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.s. I).

Исследование генотоксичности нефтезагрязнений на растительных объектах методом ана-телофазного анализа

Необходимость оценки генотоксичности компонентов среды обитания человека предполагает их выявление с помощью различных генетических тест-систем. В настоящее время для этой цели разработаны и применяются тест-системы, в которых в качестве индикатора используются микроорганизмы, растения, клеточные культуры и млекопитающие (Гераськин и др., 2010). Нами для выявления мутагенного действия загрязняющих среду веществ были использованы растения, находящиеся в непосредственном контакте с загрязненной почвой, водой и воздухом, что позволяет проведение исследований in situ. Экотоксикогенетическое исследование проводили с использованием ана-телофазного анализа, позволяющего выявить определенные типы хромосомных нарушений в клетках растений. Проведенный анализ отобранных нами растительных объектов Matricaria recutita L., Rumex confertus Willd., Taraxacum officinale Wigg. s. I, Plantago major L. показал, что число клеток с хромосомными аберрациями в корешках семян, собранных из растений на загрязненных территориях, значительно выше, чем в корешках семян, собранных на условно чистой территории (табл. 24).

Таблица 2 - Уровень мутабельности в меристемных клетках корешков

семян растений из условно-чистой и загрязненных зон

Виды растений Место сбора (зона) Всего анафаз Всего мутаций % Р

Taraxacum officinale Wize.s.l. Условно чистая 1056 24 2,27 ±0,45

Загрязненная 1027,8 112,2 10,92 ± 0,97 <0,001

Matricaria recutita L. Условно чистая 1164 18 1,55 ±0,36 <0,001

Загрязненная 1046,8 106,4 10,17 ±0,89

Rumex confertus Willd. Условно чистая 1002 17 1,69 ±0,13

Загрязненная 1037,2 98,2 9,48 ±0,92 <0,001

Plantago major L. Условно чистая 1018 9 0,89 ± 0,09

Загрязненная 1038,6 57,6 5,54 ±0,71 <0,001

Таким образом, у всех изученных видов растений отмечено значительное превышение уровня мутабельности в районах загрязнения по сравнению с условно чистой зоной. Самый высокий уровень хромосомных аберраций наблюдается у растений из села Долинск, которое расположено на самой загрязненной территории.

Повторные исследования 2012 г., проведенные с использованием одуванчика лекарственного, показали снижение уровня мутаций во всех изученных населенных пунктах (табл. 3).

Таблица 3. - Уровень хромосомных аберрации в клетках корешков семян _растений Taraxacum officinale Wigg. s. I. (2002 и 2012 гг.)_

Населенный пункт Год исследования Всего ана -телофаз В т. ч. с хромосомными аберрациями *Р

абс. %

Гойты 2002 1056 24 2,27 ±0.49

(у. ч. 3) 2012 1141 24 2,10 ±0,42

Мескер-Юрт 2002 1012 204 10,28 ±0,95 <0,001

2012 1376 101 7,37 ±0,49 <0,001

Долинск 2002 1044 126 12,07± 1,01 <0,001

2012 1241 88 7,09 ±0,43 <0,001

Примечание: *р - преобразование Фишера

В условно чистой зоне различия в уровне мутаций за 2002 г. (2,27%) и 2012 г. (2,1%) статистически не значимы, что позволяет предполагать, что эти данные отражают спонтанный уровень эффектов генотоксичности почв.

У растений Taraxacum officinale Wigg. s.i, выросших в загрязненных населенных пунктах Долинск и Мескер-Юрт, уровень мутаций остался достоверно выше, по сравнению с показателем в условно чистом селе Гойты (р < 0,001) и в 2002, и в 2012 году (табл. 4).

Полученные результаты по отдельным типам хромосомных аберраций показывают, что уровень мутабельности Taraxacum officinale Wigg.s. I, произрастающего в условно чистой зоне (с. Гойты), практически не изменился. Предположительно, полученные данные отражают средний уровень спонтанных хромосомных аберраций в условно чистой зоне. В клетках корешков семян растений из загрязненных нефтепродуктами территорий сел Долинск и Мескер-Юрт за 2012 год выявлен достоверно высокий уровень всех типов хромосомных нарушений: фрагментация хромосом - 5,52% и 5,88%; «мосты» - 1,31% и 0,97%, «двойные мосты» - 0,44% и 0,44%, соответственно (р< 0,001).

Таблица 4. - Типы хромосомных аберраций клеток корешков семян одуванчика лекарственного Taraxacum officinale Wigg. s. I,

Населен ный пункт Год иссле дования Всего ана -телофаз Хромосомные аберрации

фрагменты мосты двойные мосты

абс % абс % абс %

Гойты 2002 1056 19 1,78 ±0,41 4 0,38 ± 0,04 1 0,09 ±0,01

2012 1141 20 1,75 ±0,39 4 0,35 ±0,03 0 0,0

Мескер-Юрт 2002 1012 79 7,81±0,81 21 2,07 ±0,36 4 0,39±0,05

2012 1376 77 5,52±0,38 18 1,31 ±0,19 6 0,44 ±0,04

Долинск 2002 1044 91 8,72±0,87 27 2,59 ±0,48 8 0,77 ±0,12

2012 1241 73 5,88±0,41 12 0,97 ±0,27 3 0,24 ±0,03

Таким образом, проведенный нами анализ показал, что нефтезагрязнения почв оказывают достоверный генотоксический эффект и увеличивают частоту хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы проростков семян растений; цитогенетическое действие проявляется в способности вызывать образование «мостов» в анафазе и телофазе, отставание хромосом, при этом преобладающим типом ХА является фрагментация хромосом.

Использование различных видов растений для экогенетического мониторинга показало, что наиболее удобным для этих целей оказался одуванчик лекарственный Taraxacum officinale Wigg.s.l, который показал себя чувствительным не только к нефтепродуктам и ПАУ, в частности, к бенз(а)пирену, но и к высоким концентрациям тяжелых металлов, являющихся сильными мутагенами (Джамбетова, Реутова 2006). Как известно, именно данные агенты являются основными генотоксичными загрязнителями окружающей среды, накапливающиеся в результате хозяйственной деятельности человека.

Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием растительной тест-системы соя

(Glycine max (L) MeriU) Соя Glycine max (L) Merill. в качестве тест-системы была предложена еще в 1968 году для обнаружения мутагенов загрязнителей окружающей среды (Vig, Paddock, 1968). Данная тест-система дает возможность определять специфичность действия мутагенов и позволяет дифференцировать типы генетических нарушений: соматический кроссинговер, хромосомные делеции, точковые мутации и нерасхождения хромосом (Биттуева, 2007). Тест основан на учете и анализе различных типов пятен, появляющихся на листьях сои при выращивании их на почве, взятой из загрязненных зон. Из результатов, приведенных в табл. 5., видно, что на листьях проростков, выращенных на загрязненной почве,

увеличивается число пятен на 1 лист. При сопоставлении отдельных типов пятен можно сделать выводы о специфичности действия загрязнителей, поступающих в почву при переработке нефти, а так же судить о механизмах их генотоксического действия.

Таблица 5. - Влияние нефтезагрязнений на сою Glycine max (L) Merill: распределение типов пятен по типам листьев (пятен на лист).

№ Зоны Всего листьев (шт) Всхо жесть семян (%) Светло-зеленые листья Желтые листья Темно-зеленые листья Общее число пятен

желтые потна темно-зеленые пятна парные пятна светло-зеленые пятна светло-зеленые пятна

1 Гойты (у.ч.з) 795 96,0 0,16 0,05 0,01 0Д9 0,06 0,182

2 Цоцан-Юрт 614 80,5 0,46 0,21 0,04 1,43 0,27 0,678

3 Гельдеген 638 70,5 0,41 0,24 0,03 1,41 0,37 0,683

4 Мескер-Юрт 623 77,3 0,43 0,22 0,04 1,28 0,31 0,893

5 Алхан-Юрт 607 77,4 0,49 0Д7 0,05 1,48 0,36 0,797

6 Долинск 601 69,5 0,62 0,30 0,06 1,48 0,40 0,943

у.ч.з. - условно чистая зона

Так, при выращивании сои на почве, взятой из окрестностей с. Долинск, число пятен на 1 лист у растений увеличивалось в 5,2 раз; при использовании в качестве субстрата почвенных образцов из остальных населенных пунктов превышение данного показателя составляло 3,7-4,9 раз, по сравнению с результатами, полученными у проростков, выращенных на почве из условно чистой зоны.

Данные об относительном возрастании различного типа пятен более информативны для определения возможной специфичности действия мутагена.

Во всех загрязненных зонах на светло-зеленых листьях увеличивается число всех типов пятен, по сравнению с растениями из условно чистой зоны. Количество желтых пятен, являющихся результатом прямых генных мутаций или делеций, увеличивается в 2,7— 3,9 раз. Количество темно-зеленых пятен (обратные генные мутации) возрастает в 4,5-6,0 раз, количество парных пятен (митотический кроссинговер) - в 3,5—6,0 раз. На желтых листьях во всех загрязненных населенных пунктах примерно одинаково (в 4,4 - 5,1 раз) увеличивается количество светло-зеленых пятен, которые могут быть вызваны обратными генными мутациями. На темно-зеленых листьях могут появиться два типа пятен: светло-зеленые и очень темно-зеленые. Второй тип пятен при проведении эксперимента не выявлен. Светло-зеленые пятна — результат прямых генных мутаций или делеций — проявляются во всех зонах. Наблюдается увеличение их количества в загрязненных зонах в 4,6-6,7 раза.

Таким образом, полученные результаты показали, что продукты кустарной переработки нефти (в т.ч., бенз(а)пирен), загрязняющие почвы, обладают мутагенным действием. Равномерное увеличение количества всех типов пятен на листьях всех типов окраски указывает на то, что данный тип загрязнения почвы индуцирует в соматических клетках сои широкий спектр генетических эффектов: прямые и обратные мутации, соматический кроссинговер и нерасхождение хромосом.

Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с использованием теста Эймса

Известно, что многие канцерогены являются промутагенами и индуцируют мутации в живых системах только после метаболической активации (Ames et al., 1973). Тест Эймса Salmonella/микросомы (Ames et al., 1975) позволяет определить способность испытуемого соединения и/или его метаболитов индуцировать генные мутации у тест-штаммов S. typhimurium ТА 100 и ТА 98 в присутствии активирующей смеси -микросомных монооксигеназ, содержащихся в S-9 фракции гомогената печени крыс, под действием которых происходит биотрансформация с образованием веществ, являющихся сильными мутагенами.. Данный тест был использован нами для определения мутагенной активности экстрактов различных образцов почвы исследуемых районов ЧР, и было установлено, что мутагенную активность обнаруживает только экстракт почвы из с. Долинск, который индуцировал появление мутаций у обоих штаммов. Это свидетельствует о том, что в экстракте содержатся ПАУ, метаболиты которых повышали уровень мутабельности в 4 и более раз (данные представлены в диссертации).

Таким образом, показано, что в условиях первичной перегонки нефти на кустарных мини-установках происходит образование продуктов переработки и горения нефти, обладающих токсическими и мутагенными свойствами, что проявляется как повышение уровня мутабельности у различных видов растений и тест-систем, при этом отмечается отсутствие специфичности действия нефтезагрязнений и установлено их общее генотоксичное действие. Последнее подтверждено также и на растительной тест-системе соя Glycine max. (L) Merill, т.к. данный тип загрязнения вызывал разные типы мутаций - прямые и обратные, митотический кроссинговер (Джамбетова и др., 2005; Джамбетова, Реутова , 2006). Предположительно, это связано с наличием в почвах широкого спектра полициклических ароматических углеводородов, большая часть которых являются промутагенами, для активации которых необходимы ферменты детоксикации, выделенные из печени крысы. В нашем эксперименте с модельной системой также получен эффект в экстрактах почв только в присутствии активирующей смеси, что подтверждает наличие в них бенз(а)пирена и ПАУ.

Сравнительный анализ показал, что тест-система соя Glycine max. (L) Мег ill линии Т 219 является значительно более чувствительной по сравнению с тестом Эймса и в случае анализа загрязнений почвы продуктами переработки нефти более удобная в работе, так как мутагенное влияние ксенобиотиков обнаруживалось и в менее загрязненных населенных пунктах. Поэтому можно полагать, что для исследования генотоксичности почв предпочтительнее использовать растительные тест-системы.

Исследование цитогенетического статуса организма детей методом кариологического анализа буккалыюго эпителия

Второй этап данной работы, посвященный исследованию состояния генетического здоровья детей, проживающих как на загрязненных, так и условно-чистых территориях, проведен с использованием двух подходов, которые в настоящее время активно применяются в России и в мире. Первый — кариологический анализ эпителиоцитов с учетом цитогенетических показателей, показателей пролиферации и апоптоза - оценивает воздействие загрязнений окружающей среды на организм на уровне клетки (Ильин и др., 2006; Holland et al., 2008; Bonassi et al., 2011; Мейер, 2012;.Сычева, 2012). Второй подход - это учет наличия и частоты врожденных морфогенетических вариантов у каждого ребенка, оценивающий генотоксические эффекты на уровне целого организма (Cohen, 1997; Gao et al., 2000; Бочков, 2004; Zarandy et al., 2005; Mines et al., 2006; Котышева, 2007).

Детская популяция является наиболее репрезентативной группой для проведения подобных исследований, т.к. дети младшего школьного возраста, как правило, не отягощены такими возможными сопутствующими факторами, как курение, алкоголь, контакт с вредными производственными загрязнителями, длительное использование лекарственных препаратов. В проведенном нами исследовании мы учитывали следующие возможные сопутствующие факторы: частота инфекционных, желудочно-кишечных и аллергических заболеваний у детей в среднем за год, условный уровень обсемененности ротовой полости микроорганизмами, лекарственная терапия. Однако их анализ не выявил какой-либо ассоциации с кариологическими показателями и генетической изменчивостью, а также с уровнем загрязнения территорий проживания обследованных детей нефтепродуктами, в связи с чем данные показатели были исключены из дальнейшего исследования.

Установлено, что цитогенетический мониторинг позволяет получить информацию как о состоянии здоровья населения обследуемой территории, так и о наличии в среде проживания генотоксических факторов (Сычева, 2012). Для изучения генетических последствий влияния. загрязнения окружающей среды на организм человека, нами

проведен расширенный кариологический анализ буккального эпителия у детей, проживающих в населенных пунктах с разным уровнем содержания нефтепродуктов в почве.

Оценка частоты клеток с микроядрами является основным общепринятым показателем цитогенетического воздействия исследуемых экзогенных или эндогенных факторов и может являться биомаркером канцерогенного эффекта (Tolbert et al., 1992; Юрченко, 2005; Сычева, 2007; Holland et al., 2008). По результатам исследования частоты различных кариологических показателей у детей установлено, что наименьшая доля клеток с микроядрами выявлена у детей из условно чистых сел Гойты и Червленая (табл. 6). Дети, проживающие в селах Зандак и Шатой, характеризуются повышенным в 1,4-1,7 раза уровнем таких клеток. Значительно (в 2,5-4,3 раз) выше эти показатели у детей сел Долинск и Мескер-Юрт, территория которых загрязнена нефтепродуктами.

Протрузии, как и микроядра, появляются в результате воздействия генотоксических факторов различного генеза и характеризуют нерепарируемые повреждения ДНК и/или белков веретена деления (Tolbert et al., 1991; 1992; Сычева, 2007; Holland et al., 2008; Юрченко, 2008). Значительное (в 2-5 раз) повышение доли клеток с протрузиями у детей, проживающих в загрязненных селах, по сравнению с детьми в условно чистых селах, по-видимому, является результатом воздействия нефтепродуктов.

Межьядерные мосты выделяют в качестве отдельного цитогенетического показателя, поскольку они, предположительно, образуются при митозе в результате "растяжения" к разным полюсам дицентрических хромосом (Сычева, 2012). Частота клеток с межъядерными мостами у детей, проживающих в условно чистых и загрязненных селах, оказалась примерно равной, т.е. не выявлено их зависимости от уровня загрязнения среды (табл. 6), из чего можно предположить, что нефтепродукты, в том числе и ПАУ, не оказывают заметного цитотоксического влияния на процессы протекание митоза.

Показатели пролиферации появляются в результате незавершенного ацитокинетического митоза (Бродский, Урываева, 1981). Их частота увеличивается в ответ на токсическое воздействие многих химических веществ, при воспалении и онкогенных процессах (Сычева, 2007; Юрченко и др., 2008).

Таблица 6. - Кариологические показатели буквальных эпителиоцитов у детей в изучаемых районах

Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями в промилле

Зандак (N=51) Гойты (N=50) Червленая (N=55) Шатой (N=50) Долинск (N=59) Мескер-Юрт (N=52)

Цвтогепетические показателя

Доля клеток с микроядрами 0,65±0,12 0,47±0,07 0,47±0,09 0,80±0,14 1,82±0,18 2,00±0,17

Доля клеток с протрузиями 1,73±0,28 1,08±0,24 0,82±0,23 0,60±0,13 2,58±0,45 3,31±0,56

Доля клеток с межъядерными мостами 0,06±0,28 0,28±0,09 0,13±0,05 0,10±0,04 0,22±0,06 0,23±0,08

Суммарная доля клеток с цитогенетическими нарушениями 1,22±0,26 0,61±0,13 0,47±0,12 0,75±0,10 1,54±0,23 1,84±0,27

Доля клеток с ядром атипичной формы 12,96±1,32 4,60±0,67 7,49±0,83 7,04±0,99 19,20±1,80 11,84±1,36

Показатели пролиферации

Доля клеток с двумя ядрами 10,73±0,83 7,06±0,77 8,00±0,62 10Д6±1,0 11,92±0,78 9Д5±0,72

Доля клеток с тремя и более ядрами 0,78±0,14 0,34±0,07 0,54±0,11 0,66±0Д2 1,14±0,18 1Д5±0,41

Доля клеток со сдвоенным ядром 6,78±0,77 5,88±0,52 4,95±0,60 5,02±0,57 8,27±0,64 8,73±1,20

Суммарный показатель пролиферации 20,73±1,40 14Д2±1,12 14,35±1,07 17,50±1Д0 22,75±1,46 21,81±2Д0

Показатели ранней деструкции ядра

Доля клеток с конденсацией хроматина 13,14±1,85 •6,92±1,63 10,24±1,38 10,30±1,69 13,42±1,46 12,67±1,93

Доля клеток с вакуолизацией ядра 23,75±3,86 13,75±2,27 20,89±2,62 29,44±4,85 25,71±3,44 40,39±5,01

Доля клеток с началом кариолизиса 6,65±1,50 5,9О±1,07 8,18±1,51 5,4б±0,89 9,68±1,62 11,33±2,40

Показатели поздней деструкции ядра

Доля клеток с кариорексисом 4,02±1,13 1,26±0,22 2,93±0,60 4,50±1,19 5,73±0,93 7,40±ЗДб

Доля клеток с кариопикнозом 3,35±0,78 1,86±0,48 1,75±0,52 ЗД4±0,91 11,20±1,74 7,88±2,26

Доля клеток с полным кариолизисом 5,27±0,98 5,78±0,93 4,65±1,64 4,74±0,81 7,83±1,33 12,77*2,22

Апоптический индекс* 12,64±0,63 8,90±0,54 9,33±0,92 12,38±0,97 24,76±1,33 28,05±2,54

* - сумма клеток с кариопикнозом, кариорексисом и полным кариолизисом

В отличие от двуядерных клеток, для которых по результатам нашего анализа не выявлено достоверно значимой зависимости от уровня загрязнения почвы, показатель числа клеток со сдвоенными ядрами, а также содержащих три и более изолированных ядра, проявляет такую зависимость, и доля данного типа клеток увеличивается в 1,5-3,4 раза в условиях загрязнения. Считают, что появление трехъядерных клеток является результатом асимметричного митоза и явным показателем цитотоксического действия (Сычева, 2007). Пролиферативная активность эшггелиоцитов оказалось наиболее высокой у детей из загрязненных сел Долинск и Мескер-Юрт; суммарная частота пролиферативных клеток в буккальном эпителии детей здесь оказалась в 1,5-1,6 раз выше, в сравнении с таковыми в условно чистых селах.

Цитогенетические нарушения могут активизировать процессы клеточного апоптоза. Показатели деструкции ядра, характерные для эксфолиативных клеток, изменяются при экзогенных или эндогенных воздействиях и отражают разрушение клеток буккального эпителия при воздействии повреждающих факторов. В нашем исследовании это наблюдалось только на поздних стадиях деструкции ядра клеток буккального эпителия у детей из загрязненных сел (табл. 6). Так, нами с более высокой частотой были зафиксированы кариопикноз (сморщивание клеточного ядра) и последующие карпорексис (распад клеточного ядра на части) и кариолизис, что может быть результатом цитотоксического и, возможно, генотоксического действия исследуемого фактора. При этом не было выявлено заметного влияния экзогенных факторов на частоту показателей раннего апоптоза (вакуолизация, конденсация и ранний кариолизис), изменения которых наблюдаются при воспалительных процессах и некрозах (Сычева, 2007). Л.П. Сычевой предложено оценивать апоптический индекс для клеток буккального эпителия как сумму частоты кариопикноза, кариорексиса и полного кариолизиса. Как видно из табл. 6, данный индекс также значительно (в 2,3-3,2 раза) выше у детей, проживающих в загрязненных селах Долинск и Мескер-Юрт.

Зависимость цитогенетических показателей от уровня нефтехимического загрязнения

Корреляционный анализ взаимной сопряженности кариологических показателей выявил независимость их друг от друга и высокую зависимость от уровня загрязнения почв исследуемых территорий нефтепродуктами. В связи с этим изученные нами села были сгруппированы в соответствии с Положением о загрязнении земель (Порядок определения размеров.., 1993), согласно которому условно чистые села (Зандак, Гойты, Червленая и Шатой), в почве которых уровень загрязнения не превышает 25 мкг/кг, входят в I группу

(незначительное загрязнение) и II группу (слабое загрязнение). Населенные пункты, в почве которых концентрация нефтепродуктов составляет более 40 мкг/кг почвы, входят в IV (высокий уровень загрязнения - с. Долинск) и V (очень высокий уровень загрязнения - с. Мескер-Юрт) группы. Дальнейший анализ полученных результатов проводился с учетом распределения населенных пунктов по вышеназванным группам.

Все изученные кариологические показатели обнаружили достоверно высокую зависимость от уровня загрязнения нефтепродуктами (табл. 7). В наибольшей степени эта зависимость выражена для цитогенетического показателя «доля клеток с микроядрами». Частота клеток с микроядрами на загрязненной нефтепродуктами территории в 3,3 раза превышает данный показатель условно чистой зоны (р = 1,3 • Ю"20). Для доли клеток с протрузиями значимость зависимости от уровня загрязнения слабее, однако, уровень клеток с протрузиями в зоне нефтезагрязнения в 2,8 раза выше их частоты в условно чистой зоне (р = 1,2 • 10"8). Высокая зависимость различий выявлена и для других кариологических показателей: частоты клеток с двумя и более ядрами (р = 8,1 • 10"5) и частоты клеток в апоптозе (р = 2,2 ■ Ю ). Частота клеток буккального эпителия с двумя и более ядрами и клеток с деструкцией ядра у детей, проживающих в нефтезагрязненной зоне в 1,3 - 1,7 раза больше, по сравнению с условно чистой зоной.

Таблица 7. - Средние значения кариологических показателей в регионах с высоким и низким содержанием нефтепродуктов в почве

Районы (выборка) Уровень загрязнен ия мкг/г почвы M±m, %о

Доля клеток с микро ядрами Доля клеток с протрузи ями Клетки с двумя и более ядер Доля клеток с ранним апоптозом Доля клеток с поздним апоптозом Все клетки в апоптозе

"Чистые" (231) <25 0,58+ 0,05 1,05± 0,12 16,78± 0,63 41,18+ 2,18 18,71± 1,33 59,89+ 2,81

"Грязные" (198) >40 1,91 ±0,12 2,92± 0,36 22,31+ 1,25 62,95± 4,45 36,76± 3,95 99,70+ 6,28

/alue) 1,310 20 1,2-10"8 8,1-Ю"5 1,2-Ю"5 2,0-10"6 2,2-10"'

* Значимость различий по тесту Манна - Уитни

Выявлены различия в распределении клеток с микроядрами в зависимости от уровня нефтезагрязнения почв. Если в условно чистых селах количество детей, у которых не обнаружены микроядра в клетках буккального эпителия составляет 57,3%, то в загрязненной зоне таких детей в 3 раза меньше. И, наоборот, число детей, проживающих в условно чистой зоне и имеющих по три и более клетки с микроядрами всего около 3%, в то время как на загрязненных территориях проживает 44,1%таких детей (рис. 1).

Распределение доли клеток с микроядрами и протрузиями в буккальном эпителии детей, выявило, что 4 и более клеток с микроядром обнаруживаются только у детей, проживающих в зоне нефтезагрязнения, что отражает его выраженное генотоксическое действие (рис. 1).

Такая же картина получена и при изучении распределения числа клеток с протрузиями у детей изученных групп (рис. 2).

У 50% детей,

проживающих в условно чистых регионах, не обнаружены клетки с протрузиями, тогда как в нефтезагрязненных селах число таких детей составляет 26,1%. Более 3 клеток с протрузиями имеет 12,6% детей в условно чистых селах, а в загрязненных населенных пунктах таких детей

Таким образом, результаты настоящего исследования

позволили установить, что генотоксическое и цитотоксическое воздействие продуктов сжигания и переработки нефти на

эксфолиативный эпителий ротовой полости выражается в повышенной частоте доли клеток с микроядрами, протрузиями, с тремя и более ядрами, сдвоенными ядрами, и доли клеток позднего апоптоза у детей, проживающих в экологически неблагоприятных условиях.

Для оценки прогностической значимости кариологических показателей при использовании их в качестве биоиндикаторов цитогенетического и

цитотоксического действия

факторов проведен 1ЮС-анализ совокупности данных для исследованных районов по уровню загрязнения почв нефтепродуктами (рис. 3).

Число клеток с МЯ на 1000 клаток

32,4%.

Рис. 1. Распределение числа клеток с микроядрами (МЯ)

3 4 5 6 Число кяеток с Г1Р на 1000 клеток

Рис. 2. Распределение числа клеток с протрузиями (ПР)

ROC-кривые

Рис. 3. ЯОС - кривые для кариологических показателей как биоиндикаторов наличия нефтехимического загрязнения МЯ - микроядра, ПР - протрузии,

ПЯ - клетки с двумя и более ядрами, АК - клетки в апоптозе

Специфичность

Площадь под ROC-кривой (AUC - Area Under Curve) является интегральным показателем прогностических возможностей маркера и равна вероятности отличить «экспонированного» индивидуума от контрольного, основываясь на результатах тестирования.Значения критического уровня для доли клеток с микроядрами и доли клеток с протрузиями одинаковы и равны 1,5, а для интегрального цитогенетического - достигает 2,5 (табл. 8).

Каждый из изученных цитогенетических показателей может быть использован в качестве биомаркера для оценки уровня загрязнения окружающей среды генотоксикантами, однако, чувствительность и прогностическая значимость их может быть различна. Наибольшей прогностической эффективностью обладает показатель «доля клеток с микроядрами» (0,802) (р = 7,1 ■ 10"19). Показатель «доля клеток с протрузиями» значительно ниже (0,685). Интегральный цитогенетический показатель (микроядра + протрузии) увеличивает величину AUC до 0,805 (р = 3,0-10"19) (табл. 8).

Таблица 8. - Оценки A UC и критического уровня для кариологических показателей при использовании их в качестве биоиндикаторов

Тестовая переменная Критический уровень лис 95% ДИ р*

Доля клеток с микроядрами 1,5 0,802±0,028 0,75 - 0,86 7,1-Ю"19

Доля клеток с протрузими 1,5 0,685±0,032 0,62 - 0,75 5,3-Ю"8

Интегральный цитогенетический показатель 2,5 0,805±0,026 0,75 - 0,86 3,01019

Доля клеток с двумя и более ядрами 16,0 0,634±0,033 0,57 - 0,69 8,2-Ю"5

Доля клеток в апоптозе 69,0 0,704±0,031 0,64 - 0,76 2,2-Ю'9

* Нулевая гипотеза: истинная площадь — 0.5

Прогностически значимыми показателями также являются доля клеток с двумя и более ядрами (0,634; р - 8,2-10"5) и доля клеток в апоптозе {AUС 0,704; р = 2,2-10"9).

Для оценки цитогенетического статуса индивида и формирования групп риска по уровню цитогенетических нарушений Л.П. Сычевой (2012) предложено использовать индекс накопления цитогенетических нарушений 1аси выделять три группы риска: с низким (lac ^ 2), умеренным (2 <1ас<4) и высоким (1ас < 4) уровнем риска.

В данной работе мы апробировали этот показатель для определения влияния нефтезагрязнений на здоровье детей Чеченской Республики. Индивидуальная оценка позволяет определить число детей с низким, умеренным и высоким риском. В условно чистых населенных пунктах общее число детей, входящих в группу высокого риска, составило 15% (31 ребенок), а в загрязненных селах 32,4% (37 детей) (табл. 9).

Таблица 9. - Группы риска по цитогенетическому статусу детей ____ изучаемых групп_

Уровень загрязнения Группы риска

Село N низкий (1„<2) умеренный (2<1«<4) ВЫСОКИЙ (1,с> 4)

абс % абс % абс %

Зандак 18,0 51 28 54,9 12 23,5 11 21,5

Гойты 19,0 50 35 70,0 5 10,0 10 20,0

Червленая 21,7 55 42 76,4 8 14,5 5 9,1

Шзгой 24,7 50 39 78,0 6 12,0 5 10,0

Долинск 42,5 59 25 42,4 15 25,4 19 32,2

Мескер-Юрт 42,5 52 22 42,3 12 23,1 18 34,6

Ы- количество детей

Среднее значение индекса накопления, рассчитанное для всех детей, проживающих в условно чистых селах, позволяет отнести их к группе умеренного риска (2 <1ас< 4), в то время как для детей населенных пунктов с высоким уровнем нефтезагрязнения 1ас> 4, т.е. они относятся к группе высокого риска (табл. 10). Прогностическая значимость индекса накопления цитогенетических нарушений (1ас) немного ниже и равна 0,703 (р = 2,5 • 10"9).

Поскольку 1ас характеризует не только цитогенетические нарушения, но и возможность их накопления в организме при снижении апоптотической активности, этот показатель может быть более значим, чем учет только микроядер. В нашем исследовании впервые определен критический уровень этого показателя (0,87) и его расчетная прогностическая значимость - 0,70 при р = 2,5 • 10"9.

Таким образом, впервые в Чеченской Республике определены группы риска с использованием индекса накопления цитогенетических

нарушений Iac. Выявлено, что 32,4% детей, проживающих на территориях, загрязненных нефтепродуктами, входят в группу высокого риска (1а1>4).

Врожденные морфогенетические варианты как индикаторы загрязнения окружающей среды

Проведенные ранее исследования в различных городах России свидетельствуют о высокой чувствительности организма человека к длительному воздействию химических поллютантов, что прослеживается в возникновении различных отклонений в развитии у детей, чьи родители находились в неблагоприятных экологических условиях. В частности, это отражается на увеличении числа так называемых врожденных морфогенетических вариантов - явных признаков нарушений пренатального морфогенеза органа или части тела (их деформация, излишнее оволосенение, пигментация, отсутствие меланина и пр.), которые не влияют на функционирование органов, но в то же время могут быть маркерами более глубоких нарушений здоровья (Бочков, 1994; 2002; Рахманин, Ревазова, 2004; Асанов и др., 2006; Котышева, 2007).

Нами проведен анализ частоты ВМГВ у детей различных районов Чеченской Республики как показателя, характеризующего генетическое здоровье на уровне целого организма, используя его в качестве индикатора аномалий пренатального развития под действием техногенных факторов. При изучении цитогенетического статуса детей, проживающих на загрязненных нефтепродуктами территориях, выявлены повышенная частота цитогенетических нарушений и сдвиги клеточной кинетики. Можно предположить, что аналогичные изменения, возникающие при опосредованном действии нефтепродуктов, находящихся в окружающей среде, на ранние этапы эмбриогенеза, приводят к формированию ВМГВ. В целом, для оценки влияния различных факторов среды на процессы морфогенеза рекомендовано использование двух показателей ВМГВ: среднего числа ВМГВ на 1 ребенка и долю детей с пятью и более ВМГВ (Котышева, 2007). Наши результаты представлены в табл.10.

Таблица 10. - Средние значения ВМГВ у детей в изучаемых _ населенных пунктах__

Село N Среднее число ВМГВ

М±т m

Зандак 51 2,2±0,18 1,94-2,56

Гойты 50 1,8±0,15 1,52-2,10

Червленая 55 2,4±0,20 2,03-2,73

Шатой 50 2Д±0,19 1,82-2,19

Мескер-Юрт 59 3,1±0Д1 2,87-3,41

Долинск 63 3,4±0,26 2,93-3,67

Средние значения частоты ВМГВ у детей из условно чистых населенных пунктов не отличаются, в нефтезагрязненных селах Долинск и Мескер-Юрт данный показатель в 1,5 раз выше.

Одним из важных показателей при изучении ВМГВ является их число. В нашем исследовании оно варьировало от 0 до 7 на одного ребенка в различных населенных пунктах (табл. 11).

Таблица 11.- Общее число врожденных морфогенетических вариантов у __детей изученных населенных пунктов_

Число ВМГВ Населенные пункты

Зандак Гойты Шатой Червленая Долинск Мескер-Юрт

абс % абс % абс % абс % абс % абс %

0 5 9,8 5 10,0 7 14,0 4 7,3 3 4,8 0 0

1 11 21,6 12 24,0 9 18,0 12 21,8 6 9,5 6 10,2

2 12 23,5 15 30,0 16 32,0 17 30,9 10 15,9 И 18,64

3 12 23,5 И 22,0 11 22,0 10 18,2 15 23,8 20 33,9

4 5 9,8 6 12,0 6 12,0 9 16,4 15 23,8 11 18,6

5 5 9,8 1 2,0 1 2,0 3 5,5 10 15,9 7 11,9

6 1 1,9 0 0 0 0 0 0 3 4,8 3 5,1

7 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,6 1 1,7

В селах Зандак, Гойты, Шатой и Червленая более 60% детей имеют не более двух ВМГВ или вообще их не имеют. Такое же число вариантов морфогенеза в селах Долинск и Мескер-Юрт имеют уже в 2 раза меньше (29,5%) детей. По 3-4 ВМГВ на одного ребенка в этих селах имеют в 1,5 раза больше детей, чем в условно чистых.

Врожденные морфогенетические признаки аномального развития могут проявляться на различных участках тела, в связи с этим мы определяли среднее число признаков в соответствии с их локализацией, а также полом (табл. 12). Согласно полученным результатам, наибольшее число выявленных ВМГВ локализовано на коже и туловище (219), примерно одинаковое количество ВМГВ выявлены в области рта (161) и в краниофасциальной (лицо и череп) области (155), меньшее число отмечается в области глаз и ушей. Минимальное количество вариантов морфогенеза выявлены на верхних и нижних конечностях.

В ряде сел (Гойты, Мескер-Юрт, Червленая) количество ВМГВ в краниофасциальной области в 1,5 раза больше у девочек, чем у мальчиков. В остальных селах такой тенденции не отмечается. Кроме отдельных случаев, когда рассматриваются различия по числу вариантов морфогенеза в общем виде, значимых отличий по полу не наблюдается.

Таблица 12. - Количество морфогенетических вариантов различной локализации у девочек и мальчиков изучаемых групп_

№ Село группы N Количество ВМГВ различной локализации

Кранио фасци альная область кожа и тулови ще глаза рот уши верх ние конеч ности нижние конеч ности

1 Зандак N=51 Девочки 26 10 20 2 11 5 3 1

Мальчики 25 13 16 1 17 1 5 0

2 Гойты N=50 Девочки 25 7 11 8 11 7 4 0

Мальчики 25 12 11 5 8 8 5 0

3 Щатой N=50 Девочки 26 10 10 2 17 16 1 0

Мальчики 24 7 6 1 7 10 3 1

4 Червленая N=55 Девочки 22 8 22 5 5 7 2 0

Мальчики 33 15 22 7 6 11 7 4

5 Долинск N=63 Девочки 30 18 25 9 16 11 8 1

Мальчики 33 19 27 18 26 13 14 3

6 Мескер- Юрт N=59 Девочки 29 12 18 13 18 9 2 3

Мальчики 30 24 31 13 19 17 5 1

Все! 155 219 111 161 115 59 14

Сравнение частоты ВМГВ между изучаемыми населенными пунктами Зандак, Гойты, Шатой и Червленая не выявило значимых различий по их локализации (табл. 13).

Таблица 13. - Частота врожденных морфогенетических вариантов различной локализации у детей в изучаемых населенных пунктах _ (в среднем на 1 ребенка)___

Локализация Населенные пункты

Зандак (N=51) Гойты (N=50) Червленая (N=55) Шатой (N=50) Долинск (N=62) Мескер-Юрт(Ы=59)

Краниофасци-альная область 0,45±0.09 0,34±0,09 0,36±0,08 0,34±0,09 0,59±0,08 0,56±0,10

Кожа и туловище 0,53±0,11 0,42±0,09 0,78±0,12 0,32±0,09 0,84±0,13 0,81±0,12

Глаза 0Д6±0,04 0,22±0,08 0,25±0,07 0,06±0,01 0,43±0,08 0,44±0,09

Рот 0,41±0,10 0,36±0,07 0,37±0,08 0,42±0,08 0,70±0,09 0,61±0,07

Уши 0,06*0,03 0,30*0,05 0,33±0,08 0,52±0,09 0,39±0,08 0,53±0,09

Верхние конечности 0,18±0,06 0,20±0,07 0,16±0,06 0,08±=0,03 0,34±0,07 0,14±0,05

Нижние конечности 0,02±0,02 0,00+0 0,07±0,04 0,02±0,01 0,06±0,03 0,05±0,03

В селах Долинск и Мескер-Юрт частота ВМГВ по локализациям примерно равна. По сравнению с условно чистыми населенными пунктами, в данных селах частота ВМГВ, локализованных в краниофасциальной области, на коже и туловище, в области рта и глаз выше в 1,5-2 раза (табл. 13). Согласно Котышевой (2007), наиболее достоверными являются частоты ВМГВ с популяционной частотой, превышающей 10%. В селе Гойты частота появления отдельного признака ВМГВ не превышает 12%. Наиболее часто появляющимися признаками являются невус (родинки и родимые пятна), лентиго (коричневые пигментные пятна), две макушки, оттопыренные уши, центральная диастема (большие промежутки между передними зубами). В селе Зандак такие признаки, как аномальный рост зубов и центральная диастема у мальчиков, низкий рост волос на шее у девочек и мальчиков, невус у девочек встречаются с частотой более 20%. С такой же частотой зафиксированы у детей из с. Мескер-Юрт диастема, лентиго, аномальный рост зубов и высокое нёбо у девочек, а также высокое небо, невус и гипертрихоз у мальчиков.

В селе Долинск у девочек наблюдались гипертрихоз, низкий рост волос на лбу и синофриз (сращение бровей), у мальчиков - высокое нёбо и голубые склеры. В селе Шатой каждый пятый ребенок имеет бороздки на ушной раковине, оттопыренные ушные раковины и монголоидный разрез глаз. У девочек в данном селе с частотой более 25% встречаются аномальная форма зубов и центральная диастема.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии загрязнения окружающей среды продуктами переработки нефти на частоту врожденных морфогенетических вариантов у детей, проживающих в неблагоприятных экологических условиях. При этом, поскольку не отмечены различия в числе ВМГВ в группах детей в зависимости от пола, можно предположить, что влияние продуктов переработки нефти на организм детей носит общий генотоксический характер.

Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами

Показано, что появление ВМГВ обусловлено действием мутагенов и тератогенов окружающей среды (Бочков; 1994), в связи с чем нами была изучена частота морфогенеза у детей, проживающих в различных населенных пунктах. Выявлено достоверно более высокое значение среднего числа ВМГВ на одного ребенка в загрязненной зоне по сравнению с условно чистой (р = 0,0005) (табл. 14).

Таблица 14, - Частота врожденных морфогенетических '_вариантов у щученных трупп детей_

Село Уровень загрязнения, мкг/г почвы Среднее число ВМГВ

N М±ш ДИ

Зандак 18,0 51 2,6±0,18 2,15-3,14

Гойты 19,0 50 1,8±0,15 1,52-2,10

Червленая 21,7 55 2,4±0,20 2,03-2,73

Шатой 24,7 50 2,0±0,19 1,82-2,19

Мескер-Юрт 42,5 59 3,1±0,21 2,87-3,41

Долинск 42,5 63 3,4±0,26 2,93-3,67

Согласно полученным данным, у 21-го ребенка (10,44%) условно чистой зоны не выявлены ВМГВ (табл. 15), в загрязненной зоне их нет только у 3-х детей (2,46%). 1-2 варианта морфогенеза отмечены у 45,73% детей условно чистой зоны, в загрязненных селах 1-2 ВМГВ обнаружено у 27,05% детей. 50% детей в загрязненных селах имеют по 34 ВМГВ, такое же количество вариантов морфогенеза обнаруживается в условно чистой зоне у каждого третьего ребенка (33,98%).

Показано, что у детей с пятью и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленной патологии и снижению адаптационных возможностей организма (Котышева, 2007), в результате чего их можно отнести к группе риска. По полученным данным в группу риска из условно чистой зоны (села Гойты, Шатой, Зандак и Червленая) входят 6% детей, а в загрязненных селах Долинск и Мескер-Юрт - 20% детей.

Таблица 15. - Распределение и средние значения ВМГВ в чистых и

загрязненных нефтепродуктами районах ЧР

Количество ВМГВ Уровень загрязнения, мкг/г почвы

<25 >40

N % N %

0 21 10,44 3 2,46

1 44 . 21,36 12 9,84

2 50 24,37 21 17,21

3 44 ; 21,36 35 28,69

4 26 12,62 26 21,31

5 10 4,85 17 13,93

6 1 0,48 6 4,92

7 0 0 2 1,64

М±ш 2,34 ±0,10 2,94 ±0,15

Различия распределений по хг-критерию: р = 0,009

Различия средних по тесту Манна-Уитни: р = 0,0005

Корреляционный анализ поиска ассоциаций между морфогенетическими вариантами, кариологическими показателями и уровнем загрязнения окружающей среды нефтепродуктами показал две значимые зависимости: «частота ВМГВ - уровень загрязнения» (р = 4,5-Ю"4) и «частота ВМГВ - доля клеток с микроядрами» (р = 0,014). Как видим, основным фактором, влияющим на формирование ВМГВ, можно считать неблагоприятные условия окружающей среды, в данном случае, повышенное содержание в окружающей среде продуктов нефтепереработки, обладающих мутагенным и канцерогенным действием. Меньший вклад в формирование ВМГВ вносят цитогенетические нарушения, в частности, корреляционная связь выявлена для такого кариологического показателя, как доля клеток с микроядрами.

Таким образом, впервые в Чеченской Республике проведено исследование частоты ВМГВ у детского населения, проживающего в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами и не имеющего отношения к производству. Выявлено статистически достоверное повышение средней частоты ВМГВ на одного ребенка и доли детей с высоким уровнем ВМГВ в загрязненных населенных пунктах при сравнении с условно чистыми районами. Установлено, что повышение частоты ВМГВ значимо сопряжено с уровнем загрязнения окружающей среды продуктами сжигания и переработки нефти (/>=0,0005).

Полиморфизм генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и антиоксидантной защиты у детей чеченской популяции

В настоящее время большое внимание уделяется изучению полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и антиоксидантной защиты и их вклад в формирование индивидуальной чувствительности генома человека к действию мутагенных факторов окружающей и производственной среды. Исходя из концепции, что их воздействие в большей степени выражено в отношении той части населения, которая может иметь определенную генетическую предрасположенность к многофакторным патологиям (Беспалова и др., 2001; Баранов и др., 2000, 2004; Спицын и др., 2005), нами было проведено изучение сопряженности цитогенетических показателей у исследованных групп детей и 23-х полиморфных варвиантов генов ферментов детоксикации ксенобиотиков (СУР1А1 Т3801С ГБ4646903, ТбОбй ге2606345, А4889С ГБ 1048943, СУР1В1 й1294С ге 1056836, ОБТМ1, 05777, N(¿01 6090Т), антиоксидантной защиты (Б002 С47Т «4880, САТ Т21А «7943316, вС£С С129Т ге 17883901), ферментов репарации (ХЯСС1 С589Т ге1799782,ХЯСС1 01996А гэ 25487, ХРВ Т225Ю га13181, ХРП 0862А гб1799793, ЕЯСС1 Т354С ГБ11615, ОСЮ1

C977G Ы052133, АРЕХ1 T444G rsft30409,.47MG5557A rs664143) и гена-триггера MTHFR C677T rsl801133.

Для всех изученных локусов частота генотипов соответствовала распределению Харди - Вайнберга и не отличалась от соответствующих средних для популяций европеоидов. Для сравнения частоты генотипов в условно чистых и нефтезагрязненных селах была проведена проверка однородности соответствующих данных с использованием х2-теста. Для всех изученных локусов частоты генотипов значимо не различались, за исключением гена CYP1B1 1294G>C, который был исключен из анализа генотипических ассоциаций.

Анализ ассоциаций полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и антиоксидантной защиты и цитогенетических показателей

Живые организмы обладают способностью осуществлять генетический контроль метаболизма ксенобиотиков, при этом индивидуумы имеют различную чувствительность к повреждающим агентам (Кулинский, 1999). Учитывая данный факт, нами были изучены полиморфизмы генов детоксикации ксенобиотиков CYP1A1, CYP1B1, GSTM1, GSTT1, NQ01 6090Т у групп детей, проживающих на загрязненных нефтепродуктами территориях. Проведенный нами анализ данных генов не выявил частотных различий полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков. Аналогичный результат был получен в работе Викторовой с сотр. (2004), где у работников нефтехимических производств, имеющих профессиональные заболевания, не было обнаружено различий между по генам CYP1A1, CYP1B1, GSTM1, GSTT1, по сравнению с контрольной группой.

Более чувствительными к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами оказались дети, у которых обнаружены аллельные варианты генов репарации и антиоксидантной защиты, сопряженные с повышенной частотой повреждений ДНК, при воздействии нефтепродуктов: аллели генов репарации XRCC1 580 ОТ, OGG1 977C>G, XPD 862G>A, XPD 22511>G (рис. 4) и генов антиоксидантной защиты SOD2 47С>Т и CAT 21Т>А (рис. 5), которые обнаружили значимую сопряженность со средним уровнем частоты клеток с микроядрами (МЯ) (р = 0,01-0,05). Однако с учетом множественности сравнений (23 полиморфных варианта генов при 2-х уровнях загрязнения) эффекты, представленные на рис. 4 и рис. 5 нельзя признать статистически значимыми.

Значимость вклада генетической изменчивости можно оценить с помощью многомерного регрессионного анализа, который выявил, что частота клеток с микроядрами ассоциирована только с носительством мажорных аллелей XPD*2251Т (р = 0,003). При этом генетическая

изменчивость определяет лишь 1,6% изменчивости признака доли клеток с микроядрами, в то время как вклад уровня загрязнения составляет 20,6%. Значимая сопряженность клеток с протрузиями с локусами генов OGG1 и CAT (р = 0,01; р = 0,05) также не подтверждена регрессионным анализом (рис. 6). Уровень загрязнения значимо определяет 5,9% изменчивости частоты клеток с протрузиями (р = 3,5-10"7).

к s

G/G G/A

XPD 862G>A

Т/Т T/G G/G

XPD 2251T>G

Уровень загрязнения, мкг/г почвы.-j^j < 25 | |

>40

Рис. 4. Однонуклеотидные полиморфизмы генов репарации, обнаружившие сопряженность с частотой микроядер.

тя т/с с/с

яоог 47с>т

Т/А А/А

САТ21Т>А

Уровень загрязнения, мкг/г почвы: < 25 | > 40

Рис. 5. Однонуклеотидные полиморфизмы генов антиоксидантной защиты, обнаружившие сопряженность с частотой клеток с микроядрами.

Ш 111

с/в ею

Овв1 977С> в

тЯ

Т/А САТ 21Т>А

Уровень загрязнения, мкг/г почвы: [~~] < 25

>40

Рис. 6. Однонуклеотидные полиморфизмы, сопряженные с частотой клеток с протрузиями.

Регрессионный анализ подтвердил значимость ассоциации полиморфизма гена ХРИ 225\Т>С с суммарной частотой клеток с микроядрами и протрузиями, однако коэффициент детерминации для этой сопряженности был предельно низок (0,8%) (рис. 7).

Рис. 7. Однонуклеотидные полиморфизмы, обнаружившие сопряженность с суммарным показателем частоты микроядер и протрузий (МЯ+ПР),

Результаты анализа, представленные на рис. 8, показывают, что частота апоптозных клеток в значительной степени ассоциирована с носительством минорного аллеля ХЯСС1 *5&0Т (р = 0,005) с коэффициентом детерминации 1,7%.

жг*

160140" 120"

, 100" £

80" 60" 40" 20"

I Я

Т/С с/с

РАЯР 2285Т>С

С/С СП

ХИСС1 580С>Т

:1<25 1>40

Уровень загрязнения, мкг/г почвы

Рис. 8. Однонуклеотидные полиморфизмы, обнаружившие сопряженность с частотой апоптозных клеток (АК).

Уровень загрязнения нефтепродуктами определяет 8,6% изменчивости частоты апоптозных клеток {р = 3,8-10"9).

В ряде случаев представляется необходимым проведение анализа зависимости цитогенетических эффектов от суммарного числа

минорных аллелей, в отношении которых установлено их отрицательное влияние на активность генного продукта. В обоих случаях регрессионный анализ подтвердил значимость сопряженности показателя доли клеток с микроядрами с указанными комбинациями генов. Генетическая изменчивость контролирует 1,8% изменчивости числа клеток с микроядрами, при этом вклад уровня загрязнения составляет 20,6%.

Гены антиоксидантной защиты (SOD2, CAT, GCLC) и эксцизионной репарации оснований (XRCC1, PARP1, APEXI, OGG1) неоднократно обнаруживали тенденцию к сопряженности с различными кариологическими показателями, которая, как правило, была незначимой с учетом множественности сравнений. Результаты стандартного анализа таблиц сопряженности при высоком и низком уровне загрязнения нефтепродуктами показали, что носительство минорных аллеей генов SOD2, CAT и OGG1 при высоком уровне загрязнения нефтепродуктами ассоциировано с повышенным уровнем числа клеток с микроядрами (OR= 7,53 прир — 0,003) (рис. 9).

0 12 3

XPD*862A + XPD*2252G

а)

£i

0 1 2 3 4 5 6 SOD2*47T+CAT*21 T+OGG1*977G

Уровень загрязнения, мкг/г почвы: [ * |< 25

>40

Рис. 9. Средние уровни числа клеток с микроядрами для носителей различного числа минорных аллелей в сайтах генаXPD (а) и генов SOD2, CAT, OGG1 (б).

При том, что генетическая изменчивость контролирует 1,8% числа клеток с микроядрами, вклад уровня загрязнения при этом составляет 20,6%.

В отношении остальных кариологических показателей соответствующий анализ не проводился в виду заведомо низкой генетической обусловленности.

Сопряженность частоты ВМГВ с полиморфными вариантами генов детоксикации,репарации и антиокидантной защиты

Изучение сопряженности полиморфизма генов детоксикации, репарации и антиокидантной защиты с частотой врожденных морфогенетических вариантов в изученных группах детей показала значимую корреляцию только с минорным аллелем гена антиоксидантной защиты вСЬС* 129Т (р = 0,014) (рис. 10).

По остальным 22-м полиморфным вариантам изученных генов не было выявлено корреляции с показателями морфогенеза. Таким образом, изучение ассоциации полиморфных вариантов генов детоксикации, репарации и антиоксидантной защиты с кариологическими показателями в клетках буккального эпителия у детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами, выявило, что основным фактором, вызывающим цитогенетические нарушения, является загрязнение среды, а вклад генетической компоненты в формирование цитогенетических нарушений буккальных эпителиоцитов у изученных групп детей не столь значителен.

ваС129С>Т

Уровень загрязнения почвы, мкг/кг

□<25 СП >40

Рис. 10 Среднее число ВМГВ для носителей различных генотипов по локусу вСЬС* 129Т.

Тем не менее, выявлены гены антиоксидантной защиты SOD2, CAT и OGG1 при высоком уровне загрязнения нефтепродуктами ассоциированные с повышенным уровнем числа клеток с микроядрами и аллель XRCC1* 580Т, ассоциированный с частотой апоптозных клеток. Значимый вклад в формирование ВМГВ, наряду с потенциальными мутагенами и канцерогенами окружающей среды, вносит минорный аллель гена

антиоксидантной защиты

GCLC* 129Т (р = 0,014). Формирование ВМГВ может рассматриваться как результат взаимодействия наследственной предрасположенности и факторов среды в процессе эмбрионального развития.

' . 42

***

Нефтепродукты, как основные загрязнители территорий Чеченской Республики, представляют собой многокомпонентные смеси различных соединений, обладающих терратогенным, токсическим, цитогенетическим, канцерогенным и мутагенным действием. В связи с этим необходимы новые подходы в изучении генетических последствий воздействия факторов окружающей среды на живые системы, в том числе и на человека. В нашем исследовании определены ряд биомаркеров, изменчивость которых отражает эффекты воздействия продуктов сжигания и переработки нефти на клеточном уровне (кариологические показатели), на уровне целого организма (врожденные морфогенетические варианты), а также на уровне генома (гены репарации и антиоксидантной защиты). Проведенные нами исследования и полученные результаты расширяют представления о вкладе экзогенных факторов как в развитие цитогенетических нарушений в клетках растений, так и патологических состояний детского организма, и могут быть рекомендованы для использования при проведении мониторинга различных территорий в других регионах России, а также при оценке генетического здоровья населения для формирования групп высокого риска и последующего проведения оздоровительных мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. Установлено значительное токсичное и мутагенное воздействие продуктов переработки и горения нефти, образующихся в процессе первичной перегонки нефти на кустарных мини-установках, на модельные тест-системы, дикорастущие виды растений и организм человека при содержании их в почве свыше 45 мкг/кг.

2. Выявлена прямая зависимость между уровнем загрязнения почвы нефтепродуктами и морфо-физиологическими показателями исследованных видов растений: Matricaria recutita L., Taraxacum officinale Wigg. s.l., Rumex confertus Willd., Plantago major L. При повышенном уровне загрязнения наблюдается пониженная всхожесть семян и уменьшение числа соцветий.

3. Показано, что продукты горения и переработки нефти вызывают значительное увеличение уровня цитогенетических нарушений у изученных видов растений в ряду Matricaria recutita L., Taraxacum officinale Wigg. s.l., Rumex confertus Willd., Plantago major L.

4. В модельных исследованиях на соматических клетках сои Glycine max (L) Merill линии T 219 определено, что нефтепродукты индуцируют широкий спектр генетических эффектов - прямые и обратные мутации, соматический кроссинговер и нерасхождение хромосом.

5. Выявлено статистически значимое повышение частоты кариологических показателей в буквальном эпителии у детей,

проживающих в нефтезагрязненных районах, по сравнению с проживающими в условно чистых районах: увеличение числа клеток с микроядрами в 3,3 раза; клеток с протрузиями - в 2,8 раза; клеток с двумя и более ядрами в 1,3 раза; частоты клеток в апоптозе в 1,7 раз. Наличие в клетках буккального эпителия 4-х и более микроядер выявлено у детей только в населенных пунктах с высоким уровнем нефтезагрязнений, что подтверждает их генотоксическое действие.

6. Определен кариологический показатель, обладающий наибольшей прогностической эффективностью - доля клеток с микроядрами: AUC = 0,802 (р = 7,1-10"19). Впервые определен критический уровень индекса накопления цитогенетических нарушений 1ас(0,87) и его прогностическая значимость (0,7 при р = 2,5-Ю"9).

7. Выявлено достоверное повышение среднего числа врожденных морфогенетических вариантов на одного ребенка у детей, проживающих на территориях с содержанием нефтепродуктов выше 45 мкг/кг почвы, а также установлена сопряженность данного показателя с уровнем загрязнения {р = 0,002) и носительством минорного аллеля GCLC* 129Т (р = 0,014), кодирующего фермент антиоксидантной системы.

8. Выявлена статистически значимая ассоциация между уровнем кариологических нарушений (доля клеток с микроядрами и протрузиями) и частотой минорных аллелей генов репарации OGG1 и антиоксидантной защиты SOD2, CAT при высоком уровне загрязнения нефтепродуктами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Джамбетова, П.М. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений. / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова, М.Н. Ситников // Экологическая генетика. - 2005. - Т. 3. - № 4. -С. 5-11.

2. Джамбетова, П.М. Чувствительность растительных и бактериальных тест-систем на определение мутагенного влияния нефтезагрязнений на окружающую среду / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова. // Экологическая генетика. - 2006. - Т.6. - № 1. - С. 22 - 27.

3. Реутова, Н.В. Одуванчик лекарственный {Taraxacum officinale fVigg. S.l.) как удобный объект для генетического мониторинга загрязнения окружающей среды. / Н.В. Реутова, П.М. Джамбетова. // Экологическая генетика. - 2006. - Т.6.-№ 3. - С. 3 - 6.

4. Джамбетова, П.М. Оценка влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус и показатели апоптоза в клетках буккального эпителия у детей. / П.М. Джамбетова, Л.Г.

Молочаева, А.Б. Махтиева, Л.П. Сьгчева // Экологическая генетика. -2009. - Т.VII. - №4. - С. 34-40.

5. Джамбетова, П.М. Анализ врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской республики, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами. / П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, А.Б. Махтиева, Л.П.Сычева//Экологическая генетика. - 2011. - № 3. - С. 89 -94. •

6. Солтаева, А. М.-Х. Комплексное исследование мутагенного действия загрязнений почв нефтепродуктами в Чеченской республике. / А.М.-Х Солтаева, П.М. Джамбетова, С.К. Абилев, Л.П. Сычева, Л.Е. Сальникова, A.B. Рубанович // Санитария и гигиена. - 2011. - № 5. - С. 50 - 55.

7. Джамбетова, П.М. Влияние загрязнения почв нефтепродуктами на кариологические показатели здоровых детей. / П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, Л.П.Сычева // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. - 2011. - № 5. - С. 32 - 37

8. Джамбетова, П.М. Зависимость цитогенетических показателей детей от ландшафтно-эколошческих условий проживания. / Л.Г. Молочаева, Л.Х. Биткаева, П.М. Джамбетова, З.М. Оздыханова // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. - 2011. - №6. - С. 302 - 306.

9. Джамбетова, П.М. Использование видов дикорастущей флоры для генетического мониторинга окружающей среды. / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова. // Экология урбанизированных территорий. - 2012. - № 4. - С. 73 -77.

10. Солтаева, А.М.-Х. Анализ сопряженности цитогенетических аномалий у детей чеченской популяции в связи с полиморфизмом генов детоксикации ксенобиотиков и генов оксидативного ответа. / А.М.-Х Солтаева, П.М. Джамбетова, С.К. Абилев, Л.Е. Сальникова, A.B. Рубанович И Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. -

2012.-№4.-С. 256 - 262.

11. Солтаева, А.М.-Х. Связь полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, SOD2 и CAT с частотой микроядер у детей. / А.М.-Х Солтаева, П.М. Джамбетова, С.К. Абилев, Л.Е. Сальникова, A.B. Рубанович // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. -

2013. -№ 1.- С. 201 -205.

12. Джамбетова, П.М. Сопряженность врожденных морфогенетических вариантов и полиморфизма генов у детей Чеченской республики. / П.М. Джамбетова // Известия Кабардино-Балкарского Научного Центра РАН. -2013. - Т. 1. -№6(56). -С. 126-133.

13. Джамбетова, П.М. Оценка уровня мутабельности одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg. S. L), произрастающего в условиях нефтезагрязнения. / П.М. Джамбетова // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН. - 2013. -№ 4 (54). - С. 72 - 78.

14. Солтаева, А.М-Х. Связь цитогенетических нарушений и генетического полиморфизма у детей Чеченской республики, проживающих в условиях нефтезагрязнения. / А.М.-Х. Солтаева, П.М. Джамбетова, С.К. Абилев // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. - 2013. - № 5. - С. 93 - 98.

15. Джамбетова, П.М. Сопряженность генетического полиморфизма гена NQ01 с цитогенетическими нарушениями у детей чеченской популяции. / П.М. Джамбетова, А.М-Х. Солтаева, М.М. Ацаева // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013 - Т.15. - №3 (6). - С. 1965 - 1968.

Монография

Джамбетова П.М. Эколого-генетический мониторинг окружающей среды / Германия, Изд - во Lambert, 2012. - 98 с.

Методические рекомендации

Джамбетова, П.М. Использование видов дикорастущей флоры для определения генотоксичности загрязнения окружающей среды. / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова. - Грозный, 2013. -16 с.

Статьи, опубликованные в научных журналах

1. Джамбетова, П.М. Определение генотоксичности нефтезагрязненных почв растительными тест-системами. / П.М. Джамбетова / Труды Грозненского государственного нефтяного института им. акад. М. Д. Миллионщикова. - 2003. № 3. - С. 240 - 244.

2. Reutova, N.V. Optimal test - systems for the first stage of the genetic monitoring of the environmental pollution. / N.V. Reutova, P.M. Dzambetova // European Jornal of Natural History. - 2006. - № 3. - P. 120 - 126.

3. Джамбетова, П.М. Оптимальные тест-системы для первого этапа генетического мониторинга загрязнения окружающей среды. / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова // Успехи современного естествознания. -2006,-№4.-С. 77-78.

4. Джамбетова, П.М. Популяционные характеристики врожденных морфогенетических вариантов у детей Чеченской республики / П.М.

Джамбетова, Л.Г. Молочаева // Вестник Чеченского государственного педагогического института. - 2009. -№1.- С. 250-254.

5. Джамбетова, П.М. Исследование влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус детей. / П.М. Джамбетова, Л.Г. Молочаева, Л.П. Сычева // Труды Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (Грозный). -2010.-№3.- С. 159-164.

6. Джамбетова, П.М. Оценка влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей / П.М. Джамбетова, Л.П.Сычева, Л.Г Молочаева. А.Б. Махтиева // Вестник Чеченского государственного педагогического института. - 2011. - №2. - С. 21 - 38.

7. Солтаева, А.М.-Х. Анализ сопряженности цитогенетических аномалий у детей Чеченской популяции в связи с полиморфизмом генов оксидативного ответа. / А.М.-Х. Солтаева, П.М. Джамбетова, Л.Е Сальникова, A.B. Рубанович // Труды Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН, Грозный. -2012.-№5.-С. 102-107.

8. Солтаева, А.М.-Х. Анализ полиморфизма генов антиоксидантной защиты у детей (по Чеченской республике). / А.М.-Х. Солтаева, П.М. Джамбетова. // Труды Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН, Грозный. - 2013. - № 6. - С. 146150.

Подписано в печать 11.03.2014 г. Формат 60x90 1/6 Бумага офисная. Печать-ризография. У.п.л. 3.1. Тираж 100 экз.

Издательство Чеченского государственного университета Адрес: 364037 ЧР, г. Грозный, ул. Киевская, 33

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Джамбетова, Петимат Махмудовна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЧЕЧЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

05201450912

ДЖАМБЕТОВА ПЕТИМАТ МАХМУДОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕФТЕПРОДУКТАМИ В ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Сычева Л.П.; доктор биологических наук Рубанович A.B.

Грозный-2014

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 6

Общая характеристика работы 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16

1.1. Влияние загрязнений окружающей среды продуктами 16 нефтепереработки на живые системы

1.2. Кариологический анализ в эколого-генетических исследованиях 22

1.3. Врожденные морфогенетические варианты как индикатор 37 загрязнения окружающей среды

1.4. Оценка полиморфизма генов для определения чувствительности 45 организма к различным факторам

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 54

2.1. Объекты исследования 54

2.1.1. Населенные пункты 54

2.1.2. Эколого-географическая характеристика районов исследования 56

2.2. Методы определения загрязнения почв 56

2.2.1. Отбор проб почвы 56

2.2.2. Анализ проб почвы на содержание нефтепродуктов 57

2.2.3. Анализ проб на содержание тяжелых металлов 57

2.2.4. Анализ проб на содержание бенз(а)пирена 58

2.3. Исследование фитотоксичности почв, загрязненных 58 нефтепродуктами

2.3.1. Объекты исследований 58

2.3.2. Исследование мутабельности у растений 59

2.3.3. Исследование соматических мутаций на тест-системе «Соя 61 Glycine max. (L.) Merit L.»

2.4. Тестирование исследуемых образцов почв на мутагенность в тесте 61 Эймса

2.5. Методы оценки цитогенетического статуса детей 64

2.5.1. Формирование групп детей для обследования 64

2.5.2. Кариологический анализ буккального эпителия 65 2.7. Методы выявления, учета и оценки врожденных 67 морфогенетических вариантов у детей

2.7. Анализ генов-кандидатов 68

2.7.1. Выделение ДНК 68

2.7.2. Полимеразная цепная реакция 69

2.8. Статистическая обработка результатов 71 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 73

3.1. Оценка состояния территории Чеченской Республики 73

3.1.1. Эколого-географическая характеристика региона 73

3.1.2. Уровень загрязнения почвы в изучаемых населенных пунктах 76 Чеченской Республики

3.2. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы 81

3.2.1. Определение цитотоксичности нефтезагрязненной почвы 81 с использованием дикорастущих растений

3.2.2. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы 85 с использованием дикорастущих растений

3.2.3. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы с 93 использованием растительной тест-системы Соя Glycine max (L.)

Merill.

3.2.4. Определение генотоксичности нефтезагрязненной почвы 98 с использованием теста Эймса

3.3. Исследование цитогенетического статуса детей 102 изученных районов Чеченской Республики

3.3.1. Кариологические показатели буккального эпителия 103

3.3.2. Анализ взаимной сопряженности кариологических показателей 116 с использованием корреляционного анализа

3.3.3. Влияние уровня нефтехимического загрязнения на показатели 119 цитогенетического статуса детей Чеченской республики

3.3.4. Прогностическая оценка кариологических показателей в 127 качестве биомаркеров загрязнения среды

3.3.5. Формирование групп риска детей с учетом 130 цитогенетического статуса

3.4. Исследование частоты врожденных морфогенетических 136 вариантов у детей Чеченской Республики

3.4.1. Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами на 136 формирование ВМГВ у детей

3.4.2. Зависимость врожденных морфогенетических вариантов от 144 уровня загрязнения окружающей среды нефтепродуктами

3.5. Оценка полиморфных вариантов генов детоксикации 148 ксенобиотиков, репарации и оксидативной защиты в Чеченской Республике

3.5.1. Изучение полиморфных вариантов генов детоксикации, 150 репарации и оксидативной защиты у детей чеченской популяции

3.5.2. Однолокусный анализ сопряженности полиморфизма 155 исследованных генов и цитогенетических показателей

3.5.3. Сопряженность ВМГВ с полиморфными вариантами генов 164 детоксикации, репарации и оксидативной защиты

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 166

ВЫВОДЫ 172

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 174

ПРИЛОЖЕНИЯ 212

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Перечень врожденных морфогенетических 213

вариантов и их характеристика

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Анкета 216

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Праймеры, условия амплификации, длины 217

фрагментов соответствующих альтернативным аллельным вариантам ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Морфо-физиологические признаки представителей 220 дикорастущей флоры, произрастающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях Чеченской Республики

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Уровень мутабельности видов дикорастущей 224

флоры, произрастающей в условиях загрязнения почв продуктами переработки нефти

ПРИЛОЖЕНИЕ Е. Типы и число мутаций у представителей 225

дикорастущей флоры в условиях загрязнения почв нефтепродуктами в Чеченской Республике

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж. Зависимость эпидемиологических показателей от 226 уровня нефтехимического загрязнения

ПРИЛОЖЕНИЕ И. Протокол кариологического анализа 227

эпителиоцитов у детей, проживающих в исследованных населенных пунктах

ПРИЛОЖЕНИЕ К. Протокол исследования полиморфных вариантов 240

генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и оксидативной

защиты

Список сокращений

ВМГВ - врожденные морфогенетические варианты

ДИ - доверительный интервал

МЯ - клетки с микроядрами в буккальном эпителии

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ПДК - предельно-допустимая концентрация

ПР - клетки с протрузиями

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФБК - ферменты биотрансформации ксенобиотиков;

ЧР - Чеченская республика

САТ- ген фермента каталазы (оксидоредуктаза)

СУР1А1 - ген цитохрома Р-450 1А1

СУР1В1 - ген цитохрома Р-450 1В1

ЕЯСС1 - ген комплементарной эксцизионной репарации

ССЬС- ген фермента глутаматцистеинлигазы

СгбТМ/ - ген фермента глутатион 8-трансфераза М1

08ТТ1 - ген фермента глутатион 8-трансфераза Т1

МТНЕЯ - ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы

N<201 - ген хиноноксидоредуктазы 1

ОСа - ген фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы

80Б2 - ген фермента Мп-супероксиддисмутазы

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время все более актуальной становится проблема оценки влияния загрязнения окружающей среды, в частности, нефтепродуктами в районах добычи и переработки нефти на здоровье людей и биологические сообщества. Продукты горения нефтескважин, утечки из нефтепроводов и нефтехранилищ, химические отходы, загрязняющие атмосферу, земельные угодья и водные источники являются опасными факторами, влияющими как на свойства почв (Халимов, 1996; Захарова и др, 2007), почвенную микробиоту (Назаров, Иларионов, 2005; Киреева и др., 2009), растения (Седых, 2002; Мифтахова, 2005; Чугунова и др., 2011) так и на здоровье человека (Онищенко, 2002; Ревич, 2007). Особая роль среди комплекса проблем, связанных с загрязнением окружающей среды, отводится изучению генетических последствиий воздействия различных компонентов нефти на организм человека. Показано, что нефть и продукты ее переработки, попадающие в различные объекты окружающей среды, проявляют токсический (Киреева и др., 2004; Чугунова и др., 2011), генотоксичный (Аниськина и др., 2001), анеугенный и кластрогенный эффекты (Фединяк и др., 2002; Lerne et al, 2008; 2009).

Для решения вопросов сохранения здоровья тех категорий населения, которые трудятся или проживают в зонах риска, а также их детей, проводятся комплексные исследования с использованием различных подходов. В ФГБУ

«НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина» разработан и апробирован неинвазивный метод, позволяющий дать объективную оценку состояния генетического здоровья человека на клеточном уровне (цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза) при исследовании эксфолиативных клеток буккального эпителия (Сычева и др., 2007; Юрченко и др., 2007).

Для оценки генетического здоровья на уровне целого организма эффективно применяется метод учета различных аномалий в развитии -врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ, Бочков и др., 1994; Субботина, 1994), разработанный на кафедре клинической генетики Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. В настоящее время ВМГВ рассматривают как биомаркеры неблагоприятного действия факторов окружающей среды на эмбриогенез. У детей с пятью и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленных патологий и снижению адаптационных возможностей организма (Котышева, 2007).

Генотоксический эффект действия различного рода загрязнителей на здоровье работников вредных производств, в том числе, контактирующих с нефтепродуктами, позволяет выявить использование микроядерного теста (Ильинских, 2011; Gattas et al., 2001; Norppa et al., 2003; Roma-Torres et al, 2006; Krishnamurthi et al., 2008; Sellappa et al, 2010).

защитных систем репарации ДНК (Кочетова, 2011), контроля клеточного цикла и антиоксидантной защиты (Засухина, Кузьмина, 2007), являющихся показателями наследственной индивидуальной чувствительности. Связь генетического полиморфизма с ответом организма на мутагенные воздействия факторов среды является крайне важной областью исследований в экологии человека и экологической генетике, изучающих проблему реализации генотипа в определенных условиях и направленных на выявление комплекса генов, отвечающих за возникновение патологических состояний при контакте с повреждающими факторами. Это позволяет исследовать механизмы возникновения экологически обусловленной патологии в зависимости от особенностей генотипа и предлагать конкретные решения, направленные на защиту здоровья людей.

Несмотря на значительное число публикаций, посвященных изучению влияния различных видов загрязнений, а также производственных и других факторов на генетическое здоровье населения, далеко не все промышленные регионы России, в частности, территории Кавказских Республик, охвачены подобными исследованиями. Немногочисленны работы по исследованию генетических последствий влияния неблагоприятных условий окружающей среды на здоровье детей дошкольного и школьного возраста (Котышева, 2007; Сычева, 2007; Дружинин, 2009). Кроме того, большой интерес представляет изучение возможных фенотипических и цитогенетических изменений у представителей дикорастущей флоры, произрастающих на территориях, загрязненных отходами нефтедобычи и ее переработки.

Целыо настоящего исследования является комплексная оценка влияния загрязнения почвы нефтепродуктами на некоторые виды дикорастущей флоры, модельные растительные и бактериальные тест-системы, а также на здоровье детей ряда районов Чеченской Республики с учетом данных о цитогенетическом статусе, частоте врожденных морфогенетических вариантов и полиморфизме генов детоксикации ксенобиотиков, репарации и антиоксидантной защиты.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

3. Изучить влияние загрязнений почвы нефтепродуктами на фертильность, всхожесть и уровень цитогенетических нарушений у четырех видов дикорастущей флоры - Matricaria recutita L (ромашка непахучая), Rumex confertus Willd (конский щавель), Taraxacum officinale Wigg. s. I (одуванчик лекарственный) и Plantago major L. (подорожник большой).

5. Провести анализ частоты врожденных морфогенетических вариантов с учетом пола и их локализации у детей, проживающих в населенных пунктах с разным уровнем загрязнения почв нефтепродуктами.

7. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 rs2606345, rs4646903, rsl048943, CYP1B1 rs 1056836, GSTT1, GSTM1); генов репарации ДНК {XRCC1 rs 1799782, rs25487, XPD rsl799793, rsl3181, ERCC1 rsll615, APEX1 rsl 130409, ATM rs664143, OGG1 rsl052133, ADPRT rsl 136410, ABCB 7rsl045642) и генов оксидативного ответа (SOD2 rs4880, CAT rs7943316, GCLC rsl7883901), а также гена-триггера MTHFR rsl801133 у детей чеченской популяции, проживающих на ипсследованных территориях.

Научная новизна. Впервые на видах дикорастущей флоры Matricaria recutita L., Rumex confertus Willd., Taraxacum officinale Wigg. s. I., Plantago major L., растительной тест-системе - соя Glycine max. (L.) Merill. и бактериальном тесте Эймса показан токсический, цитотоксический и мутагенный эффект нефтезагрязнений при содержании нефтепродуктов в почве свыше 45 мкг/кг. С использованием растительной тест-системы Glycinemax. (L.) Merill показано, что загрязнение почвы компонентами нефти индуцирует в клетках растений широкий спектр генетических эффектов: прямые и обратные мутации, соматический кроссинговер и нерасхождение хромосом.

антиоксидантной защиты при высоком уровне загрязнения нефтепродуктами территорий проживания указывают на весомый вклад экзогенных факторов в развитие патологических состояний и могут послужить основанием для дальнейших исследований данного вопроса.

Предложен комплексный подход к оценке состояния окружающей среды -поэтапное определение генотоксического действия различных эколого-антропогенных факторов естественной среды обитания, в первую очередь, на виды дикорастущей флоры in situ и растительные тест-системы с учетом вклада всего комплекса опасных соединений, затем на здоровье населения, что позволяет провести первичный эколого-генетический мониторинг окружающей �

Информация о работе

Джамбетова, Петимат Махмудовна
доктора биологических наук
Уфа, 2014
ВАК 03.02.07

Диссертация

Генетические последствия загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в Чеченской Республике - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы