Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические эффекты нефтехимического загрязнения у детей чеченской популяции в зависимости от полиморфизма генов оксидативного ответа, детоксикации ксенобиотиков и репарации ДНК

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические эффекты нефтехимического загрязнения у детей чеченской популяции в зависимости от полиморфизма генов оксидативного ответа, детоксикации ксенобиотиков и репарации ДНК"

005059221

На правах рукописи

рЛ

о№е

Солтаева Арбият Магомед - Ханиповна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ У ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ОКСИДАТИВНОГО ОТВЕТА, ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И РЕПАРАЦИИ ДНК

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ ¿013

Москва - 2013

005059221

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждении науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Рубанович Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, доцент

Осипов Андреян Николаевич,

заведующий лабораторией радиационной биофизики, ФГБУ Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна ФМБА России.

Жукова Ольга Владимировна,

заведующая лабораторией генетики человека, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита диссертации состоится «23» мая 2013г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, дом 3. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: aspirantura@vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан « апреля 2013г.

Ученый секретарь диссертационного сов кандидат биологических наук j

Т.А. Синелыцикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В последние годы, в связи с увеличением объемов добычи нефти в России, одним из серьезных загрязнителей окружающей среды нашей страны является нефть и нефтепродукты. Проблема загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти особенно остро стоит в Чеченской Республике, которая несколько последних десятилетий относится к числу самых неблагополучных в экологическом отношении территорий на Северном Кавказе. Несмотря на то, что крупные промышленные предприятия не функционируют в последние годы, мощными источниками загрязнения окружающей среды на территории Чеченской республики являются многочисленные горящие нефтяные скважины, а также открытое горение нефти и ее переработка на кустарных мини-заводах (Джамбетова и др., 2009; Солтаева и др., 2011).

Компоненты нефти (полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бенз[а]пирен, фенолы, тяжелые металлы и др.) и продукты ее переработки оказывают токсическое, мутагенное, канцерогенное действие на живые организмы, что также приводит к нарушению генетической структуры природных популяций (РйпШ й а1, 1980; БюЬоп й а1,1980; ОгапеНа й а1,1991; вгапеПа й а1,1995; Бочков с соавт., 1989; Сериков, Оразбаев, 2002).

Важную роль в ограничении оксидативного стресса, возникающего как ответ на экзогенные и эндогенные интоксикации, влияние техногенных загрязнений окружающей среды и излучения играют специализированные системы ферментативных антиоксидантов. Необходимые для защиты от активных форм кислорода, выработанные в процессе эволюции во всех типах клеток, действие которых зависит от полиморфизма детерминируемых их генов.

В настоящее время систематические данные о влиянии нефтехимических продуктов на генетическое здоровье населения, проживающего на загрязненных территориях, малочисленны. В частности, полностью отсутствуют данные о возможном генотоксическом влиянии нефтехимических продуктов на детей младшего школьного возраста, организм которых наиболее чувствителен к негативным факторам окружающей среды.

Цель работы и задачи исследования.

Анализ ассоциаций генетического полиморфизма с цитогенетическими показателями в буккальных эпителиоцитах детей чеченской популяции, проживающих в разных природно-климатических зонах и при различных уровнях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Оценить однородность чеченской популяции в загрязненных и экологически благополучных районах по полиморфным локусам:

- генов 1-й и 2-й фаз биотрансформации ксенобиотиков (гена CYP1A1 rs2606345, «4646903, rsl048943, CYP1B1 rsl056836, NQ01 rsl800566, GSTT1, GSTM1)\

- генов репарации ДНК (гена XRCC1 rs 1799782, rs25487, гена XPD rs 1799793, rsl3181, ERCC1 rsll615, APEX rsl 130409, ATM rs664143, OGG1 ts1052\33, ADPRTrsl 136410, ABCB1 rsl045642 );

- генов оксидативного ответа (SOD2 «4880, CAT rs7943316, GCLC rsl7883901);

- гена-триггера MTHFR C677T rsl801133.

2. Сравнить частоты микроядер в буккальных эпителиоцитах детей из разных эколого-ландшафтных районов;

3. Провести анализ сопряженности полиморфизма перечисленных генов с уровнем частот микроядер в буккальных эпителиоцитах исследованных выборок детей.

Научная новизна работы.

Впервые определены частоты генов репарации ДНК, детоксикации ксенобиотиков и оксидативного ответа в чеченской популяции.

Впервые показано, что для детей, имеющих контакт с продуктами первичной переработки нефти в непроизводственной сфере, характерен повышенный уровень микроядер в клетках буккального эпителия.

Впервые проведен анализ сопряженности генетического полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации и оксидативного ответа с цитогенетическими параметрами у лиц, проживающих в экологически чистых селах и в селах с загрязнением почв нефтепродуктами.

Практическая значимость работы.

Данная работа показывает ключевую роль молекулярно-генетических методов в оценке здоровья населения на донозологическом уровне.

Результаты исследования демонстрируют целесообразность включения разработанных методов в программу проведения предварительных медицинских осмотров; анализа причин возникновения экологозависимых заболеваний; определения повышенного риска профессиональной, мультифакториальной патологии; при формировании групп специалистов устраняющих техногенные аварии и работающих в условиях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Основные положения, выносимые на защиту.

Частоты генотипов изученных полиморфных вариантов генов у детей чеченской популяции, имеющих, контакт с нефтепродуктами и детей контрольной группы не различаются.

Дети чеченской популяции, проживающие в условиях загрязнения почв нефтепродуктами и в экологически благополучных селах, различаются по цитогенетическим показателям.

Генетический полиморфизм по системе ферментов антиоксидантов -SOD2 rs4880, CAT rs7943316, GCLC rsl7883901 ассоциирован с уровнями цитогенетических аномалий в соматических клетках детей чеченской популяции из разных эколого-ландшафтных районов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Объединенном пленуме научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды (Москва, 15-16 декабря, 2010г.); Всероссийской конференции «Наука и образование в ЧР: состояние и перспективы» (г. Грозный, 7 апреля 2011 г.); Всероссийской ежегодной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и молодежь» (г. Грозный, 3-4 июня 2011г.); международной молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 17-18 ноября 2011г.); на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии наук Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (г. Грозный, 28 ноября 2011г.).

Декларация личного участия автора.

Автором лично проведен сбор биоматериала у детей для исследования. Подготовка цитогенетических препаратов и просчет микроядер в клетках буккального эпителия детей проведена совместно с к.б.н., доцентом Джамбетовой П.М.. Самостоятельно проведено генотипирование исследуемых выборок по локусам CYP1A1 (rs2606345, rs4646903, rsl048943, rsl056836), NQ01 (rs 1800566), GSTM1 (инсерционно-делеционный полиморфизм), GSTT1 (инсерционно-делеционный полиморфизм), XRCC1( rs 1799782, rs25487), гена XPD (ERCC2) (rs 1799793, rsl3181), ERCC1 (rsll615), APEX I (rsl 130409), ATM (rs664143), OGG1 (rsl052133), ADPRT (PARP1) (rsl 136410), ABCBl(MDRl) (rsl045642), MTHFR (rsl801133), SOD2 (rs4880), CAT (rs7943316), GCLC (rsl7883901). Автором также проведена статистическая обработка полученных результатов, оформлены результаты тезисов и докладов для научных конференций и все материалы диссертации.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 115 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы, приложение и список сокращений. Указатель литературы содержит 201 источника, в том числе 131 на иностранном языке. Текст работы иллюстрирован 9 таблицами и 11 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изученные выборки.

Проведено геногипирование по 21 локусу и цитогенетическое обследование у 529 детей чеченской популяции в возрасте от 7 до 11 лет, проживающих в восьми селах разных районов Чеченской Республики. Из них три села с различной степенью загрязнения нефтепродуктами, где в течение 15 лет проводилась первичная переработка нефти кустарным способом (Долинск, Мескер-Юрт, Николаевская). Пять сел, где подобного производства не было, представляют экологически «чистые» высокогорные поселки - Шатой, Зандак и равнинные экологически благополучные села (Гойты, Червленная, Ачхой-Мартан).

Были обследованы только дети из семей коренных жителей региона. Все они относятся к одной национальности - чеченцы. Родители каждого ребенка заполнили анкету, содержащую сведения о ребенке. От всех родителей получено информационное согласие на проведение генетического исследования (Таблица 1).

Таблица 1

Характеристика обследованных районов и групп детей чеченской популяции

Район Населенный пункт Число детей Средний возраст

Мальчики Девочки Мальчики Девочки

«Загрязнен -ный» нефтью Долинск 40 34 8.28±0.16 8.44±0.15

Мескер-Юрт 46 45 7.87±0.12 8.20±0.13

Николаевская 15 20 8.33±0.23 8.5±0.20

Экологически «чистый» Червленая 25 19 8.64±0.10 8.53±0.19

Гойты 19 21 8.89±0.15 8.67±0.14

Зандак 18 24 9.22±0.17 8.75±0.17

Шатой 18 19 8.05±0.22 8.21±0.21

Ачхой-Мартан 85 81 8.05±0.25 8.20±0.15

Всего 266 263 8.36±0.07 8.44±0.06

529 детей

Материалом исследования являлись клетки слизистых оболочек полости рта -буккальные эпителиоциты и клетки периферической крови.

Несмотря на то, что в настоящее время в Чеченской республике крупные промышленные предприятия разрушены и не функционируют, количество выбрасываемых вредных веществ не уменьшилось, а скорей всего, увеличилось за

счет переработки нефти на кустарных мини-установках и десятка нефтяных скважин, горевших в течение нескольких лет. С конца 1999 года по 2002 год число горящих нефтяных скважин колебалось от 28 до 50, а вокруг г. Грозного было равно 14. К 2001г. уровень загрязнения нефтепродуктами почв территории республики превышает ПДК на 10%. (Оценка природного потенциала, 2001).

И.Я. Шахтамировым с соавторами (2010) получены результаты определения суммы нефтепродуктов в почвах населенных пунктах Чеченской республики (Таблица 2).

Таблица 2

Содержание нефтепродуктов в почвах Чеченской республики (Шахтамиров и др., 2010).

№ пробы Район Сумма нефтепродуктов, мкг/г почвы

7 Грозненский 71,40

15 Ножай - Юртовский 33,30

18 Шалинский 41,90

32 Урус — Мартановский 16,00

38 Ачхой - Мартеновский 24,30

49 Шелковской 62,20

Таблица 3

Показатели загрязнения почв нефтепродуктами в экологически чистых и загрязненных нефтепродуктами селах Чеченской республики (по данным Биткаевой и др., 2011)

Геоступень Населенные пункты Нефтепродукты мкг/г почвы

1 Горная Зандак (Шатой) 18,0(24,7)

2 Равнинная Гойты/Мескер-юрт (Долинск) 19,0/42,5

3 Низменная Червленная/Николаевская 21,7/135,0

Кариологический анализ буквального эпителия.

Цитогенетические исследования проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (Беляева и др., 2005) и классификацией Л. П. Сычевой (Сычева, 2007).

Биоматериал у обследуемых детей брали со слизистой щеки в области коренных зубов стерильным шпателем и затем равномерно распределяли по поверхности предметного стекла. Из материала, полученного от одного ребенка, готовили по 2 предметных стекла. Материал высушивали при

комнатной температуре и погружали в свежеприготовленный фиксатор: смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1).

Препараты помещали на 1 час в 2,5% раствор ацето-орсеина (orcein Merck) при 37 °С для окраски хроматина, затем докрашивали цитоплазму 1% раствором светлого зеленого (light green, ICN Biomedicals Inc.) при комнатной температуре в течение 1 мин. На шифрованных препаратах учитывали частоту клеток с микроядрами. На каждом препарате изучали по 1000 клеток.

Генотипирование по генам кандидатам.

Образцы крови собирали в эппендорфы, содержащие К2ЭДТА, и хранили при t = - 18°С. ДНК выделяли из клеток периферической крови с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоционата и Nucleus - соберната (фирма Изоген, Москва).

Генотипирование проводили методом аллель-специфической тетрапраймернаой ПЦР. Праймеры подбирали с использованием программы Primer3, находящейся в открытом доступе (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).

Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Статистические методы анализа.

Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами с помощью пакета WinSTAT 2003.1, интегрированного в Excel. При сравнении межгрупповых различий частот микроядер использовали непараметрический критерий U-критерий Манна-Уитни. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью критерия %2. Проводили ROC-анализ для точной оценки зависимости чувствительности теста (Se) от специфичности (Sp) при изменении порогового значения числа микроядер. ROC-кривая - графическая характеристика качества количественного классификатора; зависимость доли верных положительных классификаций от доли ложных положительных классификаций при варьировании порога решающего правила. Преимуществом применения ROC-кривой является её инвариантность относительно отношения цены ошибки I и II рода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты цитогенетического обследования детей чеченской популяции.

Для реализации поставленных задач в рамках данного исследования нами проведен микроядерный тест на клетках слизистой оболочки щеки для 529 детей, из которых 200 человек проживают в экологически загрязненных нефтехимическими веществами районах и 329 человек в экологически «чистых» селах.

В результате анализа уровня цитогенетических нарушений нами выявлена значимо повышенная частота цитогенетических нарушений у детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами. Так, наблюдалось трехкратное повышение частоты микроядер у детей, проживающих в «загрязненных» нефтепродуктами селах Мескер-Юрт (1,98 ± 0,34) и Долинск (1,72 ± 0,39) по сравнению с частотой микроядер у детей из экологически «чистых» территорий Гойты (0,43 ± 0,18), Червленная (0,48 ± 0,22), Ачхой - Мартан (0,54 ± 0,11). В высокогорных селах наблюдалась повышенная частота микроядер - Зандак (0,74 ± 0,28) и Шатой (0,84 ± 0,36). Мы предполагаем, что причиной этих отличий внутри «чистого» района может служить повышенный фон природной ионизирующей радиации и УФ -облучения в горной местности. Экзогенными природными источниками повреждений ДНК являются солнечный свет, естественный фон ионизирующей радиации (Засухина, 2011). В тоже время в «загрязненном» Николаевске отмечен более низкий уровень микроядер (0,49 ± 0,29), что, возможно, связано с невысокой концентрацией ПАУ, в том числе бенз[а]пирена, анализы содержания, которых не проводились.

Средние частоты микроядер достоверно отличались, составляя у детей в «загрязненных» районах 1.54±0.23 на 1000 просмотренных клеток и 0.58±0.09 в «чистых» районах на 1000 клеток (р=4.8-10~9) (рис.1).

1.60 Г

1.40

1,20 иЯЙШ

1,00 11Р

0,80 -------------------- ^Щм

0,40 -----

0,20 ----- -----

0,00

Чистые районы Загрязненные районы

Рисунок 1. Средние частоты микроядер у детей, проживающих в «чистых» и загрязненных нефтепродуктами районах.

У 58% детей из экологически чистых населенных пунктов не было зарегистрировано микроядер. По 3 микроядра на 1000 клеток имели всего 2% детей. В «загрязненных» нефтепродуктами районах число детей, не имевших микроядер на 1000 клеток, составило только 33%, и в то же время у 27% детей было выявлено по 1 микроядру, по 2 и 3 микроядра имели 20% и 8% детей соответственно. Повышенное количество микроядер (4 и больше) зарегистрировано только у детей из загрязненных нефтепродуктами территорий (рис.2).

- чистым район

- грязный район

70,00 , 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00

Количество микроядер на тысячу клеток

Рисунок 2. Распределение частот клеток с микроядрами у детей, проживающих в загрязненных и экологически «чистых» районах.

Эффективность микроядерного теста для обнаружения генотоксического действия продуктов нефтепереработки подтверждается результатами ШЭС-анализа (рис.3).

1-8р

Рисунок 3. ЯОС-кривая, построенная по распределениям, представленным на рисунке 2.

Кривая отражает зависимость чувствительности теста (8е) от специфичности (Бр) при изменении порогового значения числа микроядер, превышение которого свидетельствует о наличии загрязнения окружающей среды. Площадь под 1ЮС-кривой равна АиС=0,677 ± 0,025 (р-уа1ие = 810"12).

Изучение полиморфных вариантов генов у детей чеченской популяции.

Результаты изучения аллельных вариантов генов оксидативного ответа SOD2 С47Т, CATТ21А, GCLCС129Т представлены в таблице 4.

Таблица 4

Частоты генотипов полиморфных генов SOD2 С47Т, CATС129Т, GCLC С129Т у детей, проживающих на территории, загрязненной нефтепродуктами и

в группе сравнения

№ п/п Локусы и генотипы Контроль Экспонированные

N % P N % P

1 SOD2 С47Т rs4880 T/T 108 34,07 0,42 49 34,03 0,18

T/C 160 50,47 63 43,75

C/C 49 15,46 32 22,22

2 CAT Т21А rs7943316 T/T 151 46,60 0,27 78 41,49 0,05

T/A 146 45,06 77 40,96

A/A 27 8,33 33 17,55

3 GCLC C129T rsl7883901 C/C 282 88,68 0.29 144 89,44 0,48

C/T 36 11,32 17 10,56

T/T 0 0 0 0

N - количество человек;

% - частота встречаемости данного генотипа;

Р - значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга.

Проведенный анализ полиморфизма гена SOD2 С47Т показал, что частота гетерозиготного генотипа Т/С в экспонированной группе составляет 43,8%, что несущественно отличается от таковой в группе контроля - 50,5%. Определено, что частота мажорного генотипа Т/Т в группе экспонированных лиц и в группе сравнения составила 34,0% и 34,1% соответственно. Среди экспонированных лиц частота минорного генотипа С/С гена SOD2 С47Т составила 22,2%, а в контрольной группе частота встречаемости данного генотипа - 15, 5%.

В данной работе частота гетерозиготного генотипа Т/А гена CAT Т21А в группе экспонированных лиц и в группе сравнения составила 41,0% и 45,1% соответственно. Частота мажорного генотипа Т/Т у детей из загрязненных сел (46,6%) и в контрольной группе (41,5%) одинакова, в то время как частота минорного генотипа А/А гена CAT Т21А у детей из экспонированной группы существенно выше (17,6%) встречаемости данного генотипа у детей из экологически «чистых» населенных пунктов (8,3%).

Как видно из табл. 4. распределение частот генотипов гена GCLC С129Т одинаково в контрольной и в экспонированной группах (значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга составила р = 0,29 и р = 0,48 соответственно). Частота мажорного генотипа С/С составила 89%, гетерозиготного генотипа С/Т - 11%, минорного Т/Т - 0%.

Распределение генотипов изученных полиморфных вариантов генов оксидативного ответа SOD2 С47Т, CAT Т21А, GCLC С129Т, как в контрольной выборке, так и в группе экспонированных соответствовало ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга.

Исследование и анализ частот полиморфных генов детоксикации

ксенобиотиков.

Нами были установлены частоты генотипов и аллелей полиморфных генов детоксикации ксенобиотиков CYP1B1 (G1294C), CYP1A1( T606G, A4889G, Т3801СА GSTM1, GSTT1 и NQ0J(609C>T) у детей, проживающих на загрязненной нефтепродуктами территории, и в группе контроля (табл. 5).

В контрольной группе отклонение от равновесия Харди - Вайнберга, обусловленное избытком гетерозигот, обнаружено для CYP1B1 G1294C (р=0.008), также избыток гетерозигот наблюдается по локусу CYP1A1 A4889G (р=0.010). В остальных случаях частоты аллельных вариантов соответствовали распределению Харди-Вайнберга.

Проведенное в данной работе исследование частоты генотипов и аллелей локуса CYP1A1 Т3801С не выявило существенных различий между экспонированной и контрольной группой, и составили в экспонированной группе: Т/Т - 88,4%, С/С - 0%, Т/С - 11,6%; в контрольной группе - 84,7% ,0% и 15,26%, соответственно.

Распределение частот генотипов локуса CYP1A1 T606G в экспонированной группе (Т/Т - 27,1%, T/G - 57,8%, G/G - 15,1%) также не отличалось от группы сравнения (Т/Т - 34,5%, T/G - 48,9%, G/G - 16,6%). Частоты гомозиготных генотипов локуса CYP1A1 A4889G по мажорному (А/А) и минорному аллелю (G/G) отличались незначительно в экспонированной (85,4% и 0%) и контрольной группах (90,4% и 0%). По гетерозиготному генотипу A/G наблюдается повышенная частота в экспонированной группе (14,6%), по сравнению с контрольной (9,6%). В проведенном исследовании частота нулевого генотипа по гену GSTM1 не различалась и составляла 56,1% и 53,0% в группе контроля и группе экспонированных детей, соответственно (табл.5).

Как видно из табл. 5., нами не выявлено различий в частоте встречаемости как нулевого генотипа Del/Del гена GSTT1 в группе экспонированных лиц 12,5% и в группе сравнения 11,4% так и нормального аллеля I/* 87,5% и 88,7%. Полученные результаты соответствуют данным литературы: частота делеции гена GSTT1 варьирует от 15% до 30% в европеоидных популяциях. (Баранов B.C. с соавт., 2000; Garte et al., 2001).

Распределения частот генотипов гена NQ01 609С>Т в группе сравнения и в экспонированной группе также не различаются. Частота генотипа С/С составила 57,2% и 60,8%, С/Т - 36,8% и 33,6% ,Т/Т около 6%.

Полученные частоты как для генов GSTT1 и GSTM1, так и для остальных полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, изученных в настоящей работе близки к значениям в других европеоидных популяциях.

Таблица 5

Частоты генотипов и аллелей полиморфных генов СУР1В1 (С1294С), СУР1А1 (Т606С, А4889С, Т3801С), вБТМ1,Т1, Щ01 в изученной выборке

№ п/ п Локусы и генотипы Контроль Экспонированные

N % P N % P

1 CYP1A1 Т3801С rs4646903 c/c 0 0,00 0.2 0 0,00 0.42

T/C 49 15,26 20 11,56

T/T 272 84,74 153 88,44

2 CYP1A1 T606G rs2606345 G/G 54 16,62 0.85 29 15,10 0.02

T/G 159 48,92 111 57,81

T/T 112 34,46 52 27,08

3 CYP1A1 A4889G rs 1048943 A/A 282 90,38 0.010 169 85,35 0.29

A/G 30 9,62 29 14,65

G/G 0 0 0 0

4 CYP1B1 G1294C rsl056836 C/C 213 65,94 0.008 134 69,07 0.16

C/G 107 33,13 51 26,29

G/G 3 0,93 9 4,64

6 GSTM1 D/D 183 56,13 - 106 53,00 -

I/* 143 43,87 94 47,00

7 GSTT1 D/D 37 11,35 - 25 12,50 -

I/* 289 88,65 175 87,50

8 NQ01 609C>T C/C 163 57,19 0.99 87 60,84 0.69

C/T 105 36,84 48 33,57

T/T 17 5,96 8 5,59

Здесь и далее* означает произвольный аллель. N - количество человек;

% - частота встречаемости данного генотипа, аллеля; Р - значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга.

Изучение и анализ полиморфных вариантов генов ферментов репарации

Проведенное исследование полиморфизма генов репарации установило, что в обеих исследуемых группах статистически значимых различий в распределении частот генотипов нет. В гене XRCC1 С589Т контрольной и экспонированной группах выявлены одинаковые частоты генотипов (С/С -93,8% и 92,9%; С/Т - 6,2% и 7,1%; Т/Т - 0% и 0% соответственно). Аналогичная картина наблюдается по генам: XRCC1 G1996A (А/А - 11,5% и 11,9%; G/A -46,4% и 49,5%; G/G - 42,1% и 38,5%), АРЕХ1 T444G (G/G - 44,7% и 44,1%; G/T -45,7% и 46,9%; Т/Т - 9,5% и 9,0%), ATM G5557A (G/G - 16,3% и 18,8%; G/A -

83,7% и 81,2%; А/А - 0% и 0%), OGG7 C977G (С/С - 51,72% и 54,1%; C/G -38,2% и 37,5%; G/G - 10,0% и 8,5%).

Генотипирование АВСВ1 Т3435С показало, что в экспонированной группе частота минорного генотипа выше С/С - 25,61%, чем в группе контроля -16,88%, а частоты мажорного и гетерозиготного генотипа в обеих группах отличаются незначительно (Т/С - 49,5% и 45,5%, Т/Т - 33,4% и 28,7%).

Разница частот мажорного, гетерозиготного и минорного генотипов гена ADPRT 285Т>С в обеих изучаемых группах составила: С/С - 3, 42% и 1,66%, Т/С - 30,43% и 24,86%, Т/Т - 66,15% и 73,48%.

При изучении распределения генотипов гена ERCC1 Т354С у детей из загрязненных районов выявлено, что частоты минорного, гетерозиготного и мажорного генотипов (С/С - 21,39%, Т/Т - 19,65%, Т/С - 46,2%) незначимо отличаются от частот генотипов детей из контрольной группы (С/С - 32,91%; и Т/Т - 20,89%; Т/С - 58,9%).

При исследовании полиморфизма гена эксцизионной репарации XPD T2251G (Lys751Glny) у детей чеченской популяции выявлено, что частоты генотипов в обеих исследуемых выборках одинаковы: T/G - 55,0%, Т/Т -24,26%б G/G - 20,7% в экспонированной группе и T/G - 48,7%; Т/Т - 25,0%; G/G - 26,3% в контрольной.

Частоты гетерозиготного и мажорного генотипов гена XPD G862A у детей из загрязненных сел незначимо выше (G/G - 32,1%, G/A - 51,2%) по сравнению с детьми из контрольной группы (G/G - 30,3%, G/A - 46,5%). При этом частоты минорного генотипа А/А в изученных выборках составили: 16,7% и 23,00%, соответственно.

Для изученных полиморфных вариантов генов репарации в обследованных выборках распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.

Изучение и анализ полиморфных вариантов гена MTHFR С677Т

При анализе частот генотипов гена MTHFR С677Т у детей из контрольной группы и из загрязненных районов не были установлены значимые различия: С/С - 62,9% и 63,7%, С/Т - 33,8% и 31,8%, Т/Т - 3,34% и 4,5%. Распределение частот генотипов соответствует ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга.

Изучив частоту полиморфных вариантов генов оксидативного ответа, детоксикации ксенобиотиков и генов репарации ДНК мы не обнаружили значимых различий в выборках обследуемых детей, за исключением минорного генотипа гена CAT Т21А. У детей из загрязненных нефтепродуктами районов частота минорного генотипа в 2 раза выше по сравнению с детьми из контрольной группы. Ген СА Т кодирует гемсодержащий фермент тканевого дыхания антиоксидантной защиты класса оксидоредукгаз катализирующий разложение перекиси водорода, образующиеся в ходе различных окислительных процессов в организме с образованием кислорода и воды. Возможно, что полиморфизм данного гена Т21А связан с изменением активности фермента у минорного варианта (Уoung et al., 2006).

Ассоциативное исследование полиморфных маркеров изученных генов с уровнями цитогенетических нарушений у обследованных детей

Нами проведен анализ сопряженности полиморфных вариантов изученных генов систем биотрансформации ксенобиотиков, репарации и оксидативного ответа с частотой микроядер в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости у детей чеченской популяции, проживающих в разных эколого-ландшафтных районах: равнинных загрязненных нефтепродуктами и равнинно - высокогорных незагрязненных. Изменчивость цитогенетических показателей для выборки в целом оказалась достаточно высокой (в загрязненных районах 1.54±0.23 и 0.58±0.09 в «чистых» районах на 1000 клеток), чтобы обеспечить возможность поиска генотипических ассоциаций.

В настоящей работе выявлена сопряженность локуса SOD2 с частотой микроядер в буккальных эпителиоцитах детей из загрязненных нефтепродуктами районов. У носителей минорного варианта 47С она была достоверно выше чем у детей с мажорным аллелем 47Т ((2.16±0.61 против 1.62±0.15; р=0.007 по тесту Манна - Уитни). Для детей из чистых районов эти различия не были статистически значимыми: 0.69±0.24 против 0,53±0,08 для носителей мажорного аллеля 47Т гена SOD2.

Результаты исследований показали, что частота микроядер в клетках слизистой оболочки щеки детей из загрязненных районов выше у носителей минорного генотипа 21А гена CAT (1,79±0,26), чем у носителей мажорного и гетерозиготного генотипа (1,57±0,61), однако эти различия не были статистически значимыми.

На уровне однолокусных эффектов достоверные ассоциации получены также для полиморфных вариантов гена глутаматцистеинлигазы GCLC. При анализе частоты микроядер у детей из загрязненных зон установлено достоверное повышение частоты микроядер у детей с минорным вариантом гена GCLC. Частота микроядер в этой группе составила 24±1,02, что в 1,4 раза выше, чем в группе носителей мажорного аллеля этого гена, в которой частота микроядер равнялась - 1,69±0,28, (р=0,027 по тесту Манна - Уитни).

Минорный вариант 129 Т сайта GCLC С129Т обуславливает пониженную активность промотора и, как результат, более низкий уровень глутатиона в плазме крови у гомозигот Т/Т (Cortes-Wanstreet et al., 2009).

В исследованиях Сальниковой JI.E. и других (2010) показано протективное влияние варианта 21A CAT на радиационно-индуцированный уровень хромосомных аберраций. У ликвидаторов аварии ЧАЭС, гетерозиготные по сайту SOD2 С47Т, уровень хромосомных аберраций значимо не превышал контрольное значение этого же показателя, а также частоты аберраций в лимфоцитах человека на спонтанном и индуцированном уровне не зависят от полиморфизма С47Т гена SOD2. Уровень спонтанных и индуцированных аберраций для носителей разных генотипов локуса GCLC значимо не различался.

В настоящей работе анализ двухлокусных сочетаний в выборках показал, что в когорте детей из загрязненных районов сочетание минорных вариантов генов SOD2 и GCLC ассоциирован с повышенной частотой микроядер, а у детей из незагрязненных районов такой сопряженности нет.

Дети с минорными вариантами генотипов гена С/Т GCLC и 21А гена CAT из загрязненных территорий более чувствительны к нефтехимическому загрязнению. У таких детей выявлена повышенная частота микроядер в буккальных эпителиоцитах щеки, по сравнению с детьми из экологически благополучных районов. Дети с двухлокусным сочетанием минорных генотипов 47С генов SOD2 и 21A CAT имеют повышенный уровень частот микроядер в буккальных эпителиоцитах как в «чистых», так и в «грязных» районах.

Сочетание минорных генотипов генов SOD2A1C, CAT 21А и GCLC увеличивает частоты микроядер в эпителиоцитах, т.е. является «предрасполагающим» генотипом (рис.4). Регрессионный анализ зависимости частоты микроядер от суммарного числа минорных аллелей генов оксидативного ответа {GCLC, SOD2 и CAT) показал, что эта зависимость четче выражена для детей из загрязненных нефтепродуктами территорий (p-value = 0,016).

Рисунок.4. Зависимость частоты микроядер от суммарного числа минорных аллелей генов оксидативного ответа у детей чеченской популяции (0 - чистый район, 1 - загрязненный район)

Таким образом, проведенный анализ сопряженности полиморфных вариантов генов оксидативного ответа, репарации и детоксикации ксенобиотиков с цитогенетическими аномалиями подтвердил данные литературы о существовании так называемых «защитных» и «предрасполагающих» генотипов (Сидорова, 2004, 2005; Григорьева, 2007). Показано, что у детей чеченской популяции, проживающих в районах с

повышенным уровнем загрязнения нефтепродуктами, «протективными» генами являтся мажорные (преобладающие по частоте) аллели генов оксидативного ответа (SOD2, CAT и GCLC) и их комбинации.

ВЫВОДЫ:

1. Показана однородность сравниваемых групп детей чеченской популяции по аллельным вариантам полиморфных генов 1-й и 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков, оксидативного ответа, репарации ДНК и гена MTHFR.

2. При кариологическом анализе буккальных эпителиоцитов детей, проживающих в загрязненных районах Чеченской республики, обнаружен достоверно повышенный уровень частоты микроядер по сравнению с данным показателем в контрольной группе;

3. Согласно ROC-анализу наличие в буккальных эпителиоцитах более двух микроядер однозначно свидетельствует о загрязнении окружающей среды ген отоксикантами.

4. Уровень микроядер в клетках буккального эпителия детей, проживающих в зоне загрязнения нефтепродуктами, статистически значимо сопряжен с полиморфными вариантами генов оксидативного ответа (SOD2, GCLC, и CAT), а именно пропорционален числу минорных аллелей данных локусов (р = 0,016).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Солтаева А. М.-Х, Джамбетова П.М., Абилев С.К. Сычева Л.П., Сальникова Л.Е., Рубанович A.B. Комплексное исследование мутагенного действия загрязнений почв нефтепродуктами в Чеченской республике // «Санитария и гигиена» г. Москва, №5, 2011.С.50-55.

2. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сальникова Л.Е., Рубанович A.B., Абилев С.К. Анализ сопряженности цитогенетических аномалий у детей чеченской популяции в связи с полиморфизмом генов детоксикации ксенобиотиков и генов оксидативного ответа // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН г. Нальчик, .№4, 2012.С.256-262.

3. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сальникова Л.Е., Рубанович A.B., Абилев С.К. Связь полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, SOD2 и CAT с частотой микроядер у детей // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН г. Нальчик, № 1, 2013.С.201-205.

Статьи в сборниках и тезисы конференций:

1. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сальникова JI.E., Рубанович A.B. Сравнительное ассоциативное исследование частот микроядер у чеченских детей, проживающих на чистых и загрязненных территориях // Сб. научных трудов посвященный 35-летию образования биолого-химического факультета и факультета геоэкологии ЧТУ, Грозный. 2010. №2.С.95.

2. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сычева Л.П. Исследование ассоциации частот клеток с микроядрами у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях, с полиморфизмом генов детоксикации и репарации // Материалы объединенного пленума научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды, 15-16 декабря, Москва. 2010.С.173-175.

3. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В.Исследование полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков у чеченских детей // Материалы межд. молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» посвященной 75-летию со дня рождения ак. Ю.П. Алтухова, 1718 ноября, Москва. 2011.С.42.

4. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М. Генетический полиморфизм генов детоксикации у чеченских детей, проживающих на чистых и загрязненных территориях // Всероссийская ежегодная научно- практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, конференция «Наука и молодежь» 3-4 июня, Грозный. 2011.С.63.

5. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М., Сычева Л.П. Исследование врожденных морфогенетических вариантов и микроядер у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях 4P // «Вестник Академии наук Чеченской Республики», №3. 2011.С. 159-164.

6. Солтаева А. М.-Х.. Джамбетова П.М., Сычева Л.П. Исследование ВМГВ и микроядер у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях 4P // Материалы Всероссийской конференции «Наука и образование в 4P: состояние и перспективы», Грозный. 2011.С. 268270.

7. Солтаева А. М-Х„ Джамбетова П.М., Рубанович A.B., Абилев С.К. Исследование взаимосвязи полиморфизма генов оксидативного ответа с частотой микроядер в клетках буккального эпителия детей // Международный сборник научных трудов, посвященный году Германии в России «Естественные и гуманитарные науки - устойчивому развитию общества». М.: ООО «ПКЦ Альтекс», 2012.С. 233-240.

Заказ № 71-П/04/2013 Подписано в печать 17.04.2013 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 0,8

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солтаева, Арбият Магомед-Ханиповна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

04201356323

СОЛТАЕВА Арбият Магомед - Ханиповна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ У ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ОКСИДАТИВНОГО ОТВЕТА, ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И РЕПАРАЦИИ ДНК

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.02.07 - генетика

Научный руководитель: доктор биологических наук Рубанович А. В.

МОСКВА 2013 год

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование микроядерного теста в эколого- 11 генетическом мониторинге

1.2. Полиморфизм генов 15

1.3. Генотоксические эффекты нефтехимических продуктов 21

1.4. Сопряженность генотоксических эффектов нефтехимического 25 загрязнения с полиморфизмом генов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Изученные выборки 32

2.2. Эколого-географическая характеристика территорий 33 проживания обследованных групп детей

2.3. Цитогенетический тест 39

2.4. Генотипирование по генам кандидатам 40

2.4.1. Выделение ДНК 40

2.4.2. ПЦР-реакция 41

2.5. Статистические методы анализа 42

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты цитогенетическош обследования детей чеченской 43 популяции

3.2. Изучение полиморфных вариантов генов у детей чеченской 47 популяции

3.2.1. Изучение и анализ полиморфных вариантов генов 47 ферментов антиоксидантной защиты

3.2.2. Исследование и анализ полиморфных генов детоксикации 49 ксенобиотиков

3.2.3. Изучение и анализ полиморфных вариантов генов 52 ферментов репарации

3.2.4. Изучение и анализ полиморфных вариантов гена -МТНЕК 55 С677Т

3.3. Исследование ассоциаций полиморфных маркеров изученных генов с уровнями цитогенетических нарушений 55 у обследованных детей

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Влияние загрязнения окружающей среды нефтепродуктами 62 на уровень микроядер в клетках слизистой щеки у обследованных детей

4.2. Характеристика полиморфных вариантов генов 64 биотрансформации ксенобиотиков, репарации, оксидативного ответа и гена - триггера в исследованных выборках

4.3. Частота микроядер в буквальных эпителиоцитах у 65 обследованных детей с различными генотипами по исследованным полиморфным локусам

ВЫВОДЫ 68

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 69

ПРИЛОЖЕНИЯ 92

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ГП - генетический полиморфизм

МАИР - международное агентство по изучению рака

МЯ - микроядра в клетках буккального эпителия

ПДК - предельно-допустимая концентрация

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДИ - доверительный интервал

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЧР - Чеченская республика

ФБК - ферменты биотрансформации ксенобиотиков; СУР1А1 - ген цитохрома Р-450 - 1а1 СУР1В1 - ген цитохрома Р-450 - 1Ы GSTM1 - ген глуштион S-трансферазы мю1 GSTT1 - ген глутатион S-трансферазы тета1 MTHFR - ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы NQ01 - ген хиноноксидоредуктазы 1 SOD2 - ген супероксиддисмутазы, митохондриальной CAT- генкаталазы (оксидоредуктазы)

GCLC - ген глутамат-цистеинлигазы (гамма-глутамин-цистеин синтетазы)

XRCC1 - ген репарации комплементарных повреждений ДНК

XPD(ERCC2) - ген эксцизионной репарации комплементарных повреждений ДНК

ERCC1 - ген комплементарной эксцизионной репарации ДНК

АРЕ(Х)1 - ген апуриновой/ апиримидиновой эндонуклеазы 1

OGG1 - ген 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы

ATM- ген, ассоциированный с мутантной атаксией телеангиэктазией АВСВ1 - ген Р-гликопротеина (белка полилекарственной резистентности) кодирует фермент поли-АДФ-рибозилполимеразу2

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

В последние годы, в связи с увеличением объемов добычи нефти в России, одним из серьезных загрязнителей окружающей среды нашей страны является нефть и нефтепродукты.

Проблема загрязнения окружающей среды нефтепродуктами особенно остро стоит в Чеченской Республике, которая несколько последних десятилетий относится к числу самых неблагополучных в экологическом отношении территорий на Северном Кавказе. Несмотря на то, что крупные промышленные предприятия не функционируют в настоящее время, мощными источниками загрязнения окружающей среды на территории Чеченской республики являются многочисленные горящие нефтяные скважины, а также открытое горение нефти и ее переработка на кустарных мини-заводах (Джамбетова с соавт., 2009, Солтаева с соавт., 2011).

По данным специалистов Центра Госсанэпиднадзора по 4P на территории республики интенсивно загрязняется окружающая среда по ряду причин: кустарная переработка нефти и нефтепродуктов, работа автотранспорта и др. У населения, проживающего на экологически неблагополучной территории, выявляется большое количество хронических врожденных патологий (Муслуева, Куценко, 2006).

Содержащиеся в нефти полициклические ароматические углеводороды определяют мутагенность, генотоксичность и канцерогенность сырой нефти и продуктов ее переработки (Petrilli et al., 1980; Dickson et al., 1980; Granella et al., 1991; Granella et al., 1995; Brooks et al., 1995; Reddy et al., 1997; Zemanek et al., 1997).

Входящие в состав нефти вещества (углеводороды, бенз[а]пирен, фенолы, тяжелые металлы и др.) являются токсическими, мутагенными для живых организмов, что также приводит к нарушению генетической структуры

природных популяций (Виталиев с соавт., 1989; Бочков с соавт., 1989; Сериков, Оразбаев, 2002).

Бенз[а]пирен обладает эмбриотоксическим, тератогенным эффектами и отличается наиболее выраженной канцерогенной и генотоксической активностью в сравнении с большинством ПАУ (Ракитский, Турусов, 2005; Sevastyanova et al., 2008; Birikova et al., 2007; Franco et al., 2008).

Установлено, что у рыб, обитающих в ручье, который протекает через территорию нефтехимического комплекса, высокая частота микроядер и ядерных аномалий (de Lemos et al., 2008). Выявлены повреждения ДНК и микроядра в печени и в костном мозге у крыс, которых кормили мидиями, обитающих в загрязненных нефтепродуктами водоемах (Lemiere et al., 2004). У рабочих нефтяных компаний в Эквадоре выявлен достоверно высокий уровень хромосомных аберраций по сравнению с контролем (Paz-y-Minoet et al., 2008), Португалии (Roma-Torreset et al., 2006) и Индии (Krishnamurthi et al., 2008). У лиц, участвовавших в ликвидации последствий разлива нефтяного танкера Prestige (северо-запад Испании, ноябрь 2002 г), и у жителей прилегающих территорий обнаружено повышение общего числа микроядер.

Совокупность полиморфных генов индивидуума определяет повышенную чувствительность или может до определенной степени защищать организм от повреждающих факторов среды. Устойчивость организма к воздействию неблагоприятных агентов внешней среды (химические вещества, мутагены, канцерогены) и способность их активировать или детоксицировать зависит от полиморфизма генов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков (Nebert, Carvan, 1997).

В настоящее время систематических данных о влиянии нефтехимических продуктов на генетическое здоровье населения, проживающего на загрязненных территориях, очень мало. В частности, полностью отсутствуют данные о возможном генотоксическом влиянии

нефтехимических продуктов на детей младшего школьного возраста, организм которых наиболее чувствителен к негативным факторам окружающей среды.

Цель исследования.

Анализ ассоциаций генетического полиморфизма с цитогенетическими показателями в клетках буккального эпителия детей чеченской популяции, проживающих в разных природно-климатических зонах и при различных уровнях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Оценить однородность чеченской популяции в загрязненных и экологически благополучных районах по полиморфным локусам:

- генов 1-й и 2-й фаз биотрансформации ксенобиотиков (гена CYP1A1 rs2606345, rs4646903, rsl048943, CYP1B1 rsl056836, NQ01 rsl800566 ,GSTT1, GSTM1,);

- генов репарации ДНК (гена XRCC1 rs1799782, rs25487, гена XPD rs 1799793, rsl3181, ERCC1 rsll615, APEX rs1130409, ATM rs664143, OGG1 rsl052133, ADPRTvsl 136410, ABCB1 rsl045642);

- генов оксидативного ответа (SOD2 ro4880, CAT rs7943316, GCLC rsl7883901);

- гена-триггера MTHFR C677T rsl801133.

2. Сравнить частоты микроядер в буккальных эпителиоцитах детей, проживающих в разных эколого-ландшафтных условиях.

3. Провести анализ сопряженности полиморфизма перечисленных генов с уровнем частоты микроядер в буккальных эпителиоцитах обследованных детей.

Научная новизна работы.

Впервые определены частоты генов репарации ДНК, детоксикации ксенобиотиков и оксидативного ответа в чеченской популяции.

Впервые показано, что для детей, контактирующих с продуктами первичной переработки нефти в непроизводственной сфере, характерен повышенный уровень микроядер в клетках буккального эпителия.

Впервые проведен анализ сопряженности генетического полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации и оксидативного ответа с цитогенетическими параметрами у лиц, проживающих в экологически чистых селах и в селах с загрязнением почв нефтепродуктами.

Практическая значимость работы.

Данная работа показывает ключевую роль молекулярно-генетических методов в диагностике здоровья населения на донозологическом уровне.

Результаты исследования демонстрируют целесообразность включения разработанных методов в здоровьесохраняющие программы проведения предварительных медицинских осмотров. Для анализа причин возникновения экологозависимых заболеваний; определения повышенного риска профессиональной, мультифакториальной патологии и при формировании групп специалистов, устраняющих техногенные аварии и работающих в условиях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Основные положения, выносимые на защиту.

Частоты генотипов изученных полиморфных вариантов генов у детей чеченской популяции, имеющих контакт с нефтепродуктами и у детей контрольной группы не различаются.

Дети чеченской популяции, проживающие в условиях загрязнения почв нефтепродуктами и в экологически благополучных селах, различаются по цитогенетическим показателям.

Генетический полиморфизм по системе ферментов антиоксидантов -SOD2 rs4880, CAT rs7943316, GCLC rsl7883901 ассоциирован с уровнями цитогенетических аномалий в соматических клетках детей чеченской популяции из разных эколого-ландшафтных районов.

Декларация личного участия автора.

Автором лично проведен сбор биоматериала у детей для исследования. Участвовала в подготовке цитогенетических препаратов и подсчете микроядер в клетках буккального эпителия детей совместно с доцентом, к.б.н. Джамбетовой П.М. Самостоятельно проводила генотипирование исследуемых выборок по локусам CYP1A1 (rs2606345, rs4646903, rsl048943, rs 1056836), NQ01 (rs 1800566), GSTM1 (инсерционно-делеционный полиморфизм), GSTT1 (инсерционно-делеционный полиморфизм), XRCCl(vs\199m, rs25487), гена XPD (ERCC2) (rsl799793, rsl3181), ERCC1 (rsl 1615), APEX1 (rsl 130409), ATM (rs664143), OGG1 (rsl052133), ADPRT СPARP1) (rsl 136410), ABCB1(MDR1) (rsl045642), MTHFR (rsl801133), SOD2 (rs4880), CAT (rs7943316), GCLC (rsl7883901). Автор проводила статистическую обработку полученных результатов, оформляла результаты в виде тезисов и докладов для научных конференций и сделала представление данных в диссертации.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Объединенном пленуме научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды (Москва, 15-16 декабря, 2010г.); Всероссийской конференции «Наука и образование в ЧР: состояние и перспективы» (г. Грозный, 7 апреля 2011г.); Всероссийской ежегодной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и молодежь» (г. Грозный, 3-4 июня 2011г.); международной молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 17-18 ноября 2011г.); на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии наук Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (г. Грозный, 28 ноября 2011г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них — 3 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 115 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы, приложение и список сокращений. Указатель литературы содержит 201 источник, в том числе 131 на иностранном языке. Текст работы иллюстрирован 9 таблицами и 11 рисунками.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование микроядерного теста в эколого - генетическом

мониторинге

Основным методом оценки мутагенных эффектов у людей является анализ частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах крови. Значение этого метода возросло после работ ученых скандинавских стран и итальянских коллег, которые показали сопряженность частоты рака у лиц с повышенным уровнем хромосомных аберраций (Hagmar et al., 2004). В связи с необходимостью взятия крови возможности этого метода ограничены, поэтому представляется актуальным разработка и апробация неинвазивных методов оценки мутагенного эффекта у человека. Оптимальным способом неинвазивной диагностики генетических повреждений клеток организма является цитогенетическое исследование эксфолиативных клеток.

Частота микроядер анализируются в различных типах клеток (лимфоцитах периферической крови, эритроцитах, эпителиальных клетках) у неэкспонированных и подвергшихся мутагенному воздействию лиц. Микроядерный тест эпителиальных клеток может стать мощным инструментом для выявления генотоксического воздействия на людей, но, тем не менее, требуется дальнейшая стандартизация метода и получение большей информации об образовании микроядер (Speit, 2007; Holland, 2008).

Мета-анализ по проекту HUMN(XL) оценил возможности микроядерного теста, а также основные проблемы и направления использования теста (Bonassi et al., 2011). Проведенный мета-анализ 178 публикаций об использовании цитогенетических методов обнаружения хромосомных аберраций и микроядер у детей показал увеличение изученных генетических биомаркеров в популяции детей, включая новорожденных, которые подвергались воздействию загрязнителей окружающей среды (база данных Medline /PubMed за 25-летний период времени: 1980-2004 гг.). Установлена зависимость между увеличением частоты хромосомных

аберраций и микроядер у детей в пренатальный и постнатальный периоды и уровнем загрязнения питьевой воды, загрязнения воздуха и почвы (№п, 2006).

Микроядерный тест используется в молекулярной эпидемиологии, как индикатор нестабильности генома и хромосомных нарушений. Образование микроядер указывает на хромосомную нестабильность клеток, возникшую в результате генетических дефектов и воздействия, экзогенных генотоксических факторов.

Показано, что сопряженность между образованием микроядер и генетическим полиморфизмом является результатом воздействия генотоксических агентов, а также влияния пола, возраста, образа жизни (курение, алкоголь) и различных заболеваний (ишемической болезни сердца, нейродегенеративных заболеваний, рака) (Ьагтагсоуа1 е! а1., 2008).

В исследованиях человека все более важную роль в генетической токсикологии играет микроядерный тест, который используется в качестве надежного инструмента выявления экотоксикантов окружающей среды и уже является стандартным методом тестирования генотоксичности различных факторов в биомониторинге человека.

Руководящие принципы использования микроядерного теста в биомониторинге человека и рекомендации к проведению теста опубликованы в ряде работ (АШеЛии & а1., 2000; РепесЬ, 2003; РепесН е1 а1., 2011;).

Микроядра - это структуры небольших размеров, состоящие из фрагментов хромосом. Во время телофазы эти фрагменты включаются в ядра дочерних клеток или образовывают множественные или одиночные микроядра в цитоплазме клетки (Е1-2ет е1 а1., 2006). И.И. Пелевиной с соавторами (2001) показано, что причины возникновения микроядер лежат в основе процесса разделения хромосом между двумя дочерними клетками: отстающие на стадии анафазы хромосомы, лишенные центромеры в связи образованием аберраций попадают лишь в одну из дочерних клеток и формирует одно или несколько микроядер.

По данным Колюбаева с соавторами (1993) микроядра также могут быть результатом повреждения веретена деления, потери центромерного участка хромосомы, патологического митоза или результатом первой стадии дробления ядра (кариорексис) при апоптической гибели клеток.

Крупные микроядра образуются в результате нарушений при митотическом делении клеток, в ходе которого некоторые хромосомы отстают в метафазе и в анафазе, а мелкие микроядра встречаются преимущественно при структурных хромосомных аберрациях (Захидов, 2002).

Также во время апоптоза при фрагментации ядра клетки, формируются микроядра различного размера. В связи с этим, есть вероятность того, что крупные микроядра формируютс