Молекулярные и клеточные маркеры чувствительности буккальных эпителиоцитов человека к воздействию излучений радона в бытовых условиях

Мейер, Алина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные и клеточные маркеры чувствительности буккальных эпителиоцитов человека к воздействию излучений радона в бытовых условиях
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные и клеточные маркеры чувствительности буккальных эпителиоцитов человека к воздействию излучений радона в бытовых условиях"

На правах рукописи

МЕЙЕР АЛИНА ВИКТОРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИЗЛУЧЕНИЙ РАДОНА В БЫТОВЫХ УСЛОВИЯХ

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени капдидата биологических наук

Москва-2013 005545486

005545486

Работа выполнена на кафедре генетики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский государственный университет»

Научный руководитель: Дружинин Владимир Геннадьевич,

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский государственный университет»

Официальные оппоненты: Сычева Людмила Петровна,

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории генетического мониторинга ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава РФ

Сальникова Любовь Ефимовна,

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики ФГБУН «Института общей генетики им. Н.И. Вавилова» РАН

Ведущая организация: ФГБУ ГНЦ «Федеральный медицинский

биофизический центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, г. Москва

Защита состоится «19» декабря 2013 г. в «15» часов на заседании диссертационного совета Д501.001.65 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: Ломоносовский проспект, д. 27, 8-й этаж, к. 812. Отзывы просим присылать Веселовой Т.В. по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедра биофизики биологического факультета. Факс: +7(495)939-11-15 (2 экз. в бумажном варианте с печатью и подписью обязательно).

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Актуальность исследования. Согласно современным представлениям, индивидуальная радиочувствительность (ИРЧ) имеет мультифакторную природу и в значительной степени определяется генетическими особенностями [Ни et al., 2001; Bamett et al., 2009]. К группе кандидатных генов ИРЧ относят гены репарации ДНК, контроля клеточного цикла и апоптоза, метаболизма ксенобиотиков, индукции механизмов радиозащиты и др., обеспечивающих стабильность генетического материала [Гончарова и др., 2003; Рубенович, 2007; Au et al., Fucic et al., 2008]. Оценку значимости полиморфизма вышеуказанных генетических систем в формировании признака радиочувствительности принято выполнять путем анализа ассоциаций полиморфных вариантов генов с радиационно-индуцированными эффектами, характеризующими степень ИРЧ [Kiuru et al., 2005; Rossi et al., 2009; Сальникова и др., 2010; Abilev et al., 2011; Васильева и др., 2012; Литвяков и др., 2013]. Однако на сегодня по ряду причин имеющиеся в литературе данные по установленным молекулярным маркерам радиочувствительности человека противоречивы и неоднозначны [Salnikova et al., 2012].

Другая проблема изучения радиочувствительности связана с необходимостью поиска специфических биомаркеров генотоксического эффекта ионизирующей радиации (ИР) на клеточном уровне. Выбор таких маркеров должен определяться типом радиации и мишенью воздействия. В настоящее время радиационно-специфическим методом индикации биологических эффектов ИР является анализ хромосомных аберраций (ХА), а именно дицентрических и кольцевых хромосом в лимфоцитах человека [WHO, 1993]. Вместе с тем анализ микроядер и иных типов кариологических повреждений в эпителиальных клетках человека может быть удобным инструментом в оценке гено- и цитотоксических эффектов ИР определенного типа - излучений радона и дочерних продуктов его распада, занимающих ведущую позицию среди естественных источников облучения. В частности, клетки буккального эпителия являются первичными мишенями воздействия газообразного радона, преимущественно попадающего в организм человека через дыхательные пути. Микроядерный анализ в буккальных эпителиоцитах признан экспресс-методом выявления мутагенной активности веществ различной природы [Полиорганный микроядерный.., 2007], техническая составляющая метода стандартизирована на международном уровне [Holland, 2009]. Кроме того, данная тест-система позволяет оценить не только кластогенные и анеугенные события, но и охарактеризовать соотношение основных жизненных процессов - пролиферации, деструкции и уровень цитогенетических повреждений в зависимости от клеточной кинетики [Сычева, 2011].

К настоящему времени цитогенетическими методами установлены кластогенные

эффекты воздействия высоких доз излучения радона для различных групп шахтеров [Smerhovsky et al., 2002; Wolf et al., 2004; Bilban, Jakopin, 2005]. Сведения об эффектах излучений радона в бытовых условиях немногочисленны и противоречивы [Cole et al., 1996; Bauchinger et al., 1996; Lindholm et al., 1999]. Тем не менее в ряде исследований была показана эффективность использования рутинных онтогенетических тестов при оценке ХА в лимфоцитах после воздействия сверхнормативных концентраций радона в воздухе жилых или общественных помещений [Bilban, Vaupoti, 2001; Oestreicher et al., 2004]. В результате многолетнего исследования когорты воспитанников школы-интерната г. Таштагол Кемеровской области, подверженной хроническому воздействию сверхнормативных доз излучений радона и продуктов его распада, в лимфоцитах крови экспонированных детей и подростков было выявлено достоверное увеличение частоты ХА относительно контрольной популяции [Дружинин и др., 2009].

Таким образом, анализ современного состояния исследований показывает наличие нерешенных проблем в области изучения наследственных факторов чувствительности генома человека к ИР в целом и к излучению радона в частности и одновременно подчеркивает актуальность и перспективность таких работ. Актуальность, научная и практическая значимость указанной проблемы в целом обусловлена значительным (более 50 %) вкладом радона в общую структуру облучения, получаемого населением от природных источников; наличием большого числа локальных групп населения, вынужденных проживать в радоноопасных условиях; доказанными канцерогенными и генотоксическими эффектами радона в профессиональных когортах; недостаточностью данных о закономерностях реагирования буккальных эпителиоцитов детей и подростков на воздействие сверхнормативных доз ионизирующих излучений радона; фрагментарностью и противоречивостью экспериментальных данных по изучению роли молекулярного полиморфизма для формирования индивидуальной радиочувствительности; необходимостью поиска молекулярно-генетических маркеров радиочувствительности, значимо ассоциированных со степенью повреждений генома в условиях хронического воздействия сверхнормативных доз излучений радона и продуктов его распада.

Цель исследования. Исследовать гено- и цитотоксические эффекты как показатели чувствительности клеток буккального эпителия детей и подростков, хронически экспонированных излучением радона в условиях проживания и обучения; оценить значение полиморфизмов генов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК как возможных факторов наследственной индивидуальной радиочувствительности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить комплекс радиационных и химических параметров окружающей среды в местах проживания и обучения детей и подростков опытной группы.

2. С помощью микроядерного теста дать характеристику частоты и спектра кариологических нарушений в клетках буккального эпителия (с учетом половозрастной, этнической принадлежности, заболеваемости, вредных привычек) для группы детей и подростков, экспонированных радоном, и для контрольной группы.

3. Оценить прогностические возможности показателей микроядерного теста для идентификации длительного воздействия повышенных доз радона.

4. Исследовать ассоциации аллельных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК с прогностически эффективными показателями микроядерного теста.

5. Оценить значимость сочетаний аллельных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК для формирования признака радиочувствительности человека к хроническому воздействию излучений радона и продуктов его распада.

Положения, выносимые на защиту:

- Идентификация генотоксических и цитотоксических эффектов хронического воздействия сверхнормативных доз излучений радона в бытовых условиях может осуществляться с использованием микроядерного теста в буккальных эпителиоцитах.

- В условиях воздействия ионизирующей радиации уровень кариологических нарушений в клетках эксфолиативного эпителия ассоциирован с генетическим полиморфизмом генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (08ТР1 гэ 1138271, ге1695) и репарации ДНК (ХИСС1 ^25487, ХЯСС4 ге2075685, ХрЭ ЫЗШ, Хрв ге 17655, АОРЯТ Ы136410).

Научная новизна. Впервые проведена оценка цитотоксических и генотоксических эффектов хронического воздействия повышенных концентраций радона с использованием микроядерного теста в буккальных эпителиоцитах. Показано, что данный тест является чувствительным к воздействию излучений радона в бытовых условиях. Впервые изучена и показана значимость полиморфизмов генов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков в формировании признака радиочувствительности с использованием микроядерного теста в буккальных эпителиоцитах.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для скрининговых исследований популяций человека, подверженных длительному воздействию сверхнормативных концентраций радона в бытовых и производственных условиях. Результаты работы служат основанием для разработки рекомендаций по снижению генотоксического риска в когортах населения радоноопасных регионов.

цитогенетического исследования включены в мировую базу данных «The HUman MicroNucleus project on eXfoLiated buccal cells (HUMN(xl))». Федеральной службой по интеллектуальной собственности и товарным знакам зарегистрирована заявка на изобретение «Способ оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию повышенных доз излучений радона и продуктов его распада» (№ 2012118311, приоритет от 03.05.2012).

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на Международных научно-практических конференциях «Образование, наука, инновации -вклад молодых исследователей» (Кемерово, 2010, 2011, 2012), 10th International Conference on Environmental Mutagens (Firenze, Italy, 2009); 40th Meeting of European Environmental Mutagen Society «Environmental Mutagenenesis in the North» (Oslo, Norvay, 2010); Российской научной конференции «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); 42th Meeting of European Environmental Mutagen Society (Warsaw, Poland, 2012); семинаре «Проблемы современной радиационной генетики» (Северск, 2012); VI Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (Томск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 9 рисунков. Список цитированной литературы включает 301 источник, из них 205 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объекты. Экспонированная радоном группа (ЭГ) для исследования микроядер и других кариологических аномалий в клетках буккального эпителия и аллельных вариантов генов систем репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков была сформирована из воспитанников школы-интерната г. Таштагол, являющегося районным центром горного таежного региона Кемеровской области. Экспедиционные выезды осуществлялись в период с 2007 по 2011 г. Всего обследовано 318 детей и подростков в возрасте 8-18 лет (174 мальчика,144 девочки). Этнический состав выборки: шорцы — 172 (54 %), европеоиды - 42 (13 %), метисы - 104 (33 %). Контрольная группа (КГ) (23 мальчика, 42 девочки в возрасте 9-19 лет) включила русских детей и подростков из

сельских населенных пунктов Кемеровской области, проживающих в условиях отсутствия выраженного загрязнения окружающей среды по радиационным и химическим показателям. Сбор анамнестических данных проводили путем устного анкетирования и анализа медицинских карт (форма 025/у-87). Учитывали наличие хронических и инфекционных заболеваний, курения, рентгенодиагностических процедур и приема лекарственных препаратов за 3 месяца до сбора материала.

Для оценки радиационных и химических параметров среды в исследуемых населенных пунктах были выполнены комплексные радиологические, физико-химические и биоиндикаторные исследования. Радиологические исследования выполнены в лаборатории радиационного контроля ООО «Кузбасский СКАРАБЕЙ». Содержание тяжелых металлов в почве исследовалось на базе испытательного центра по агрохимическому обслуживанию «Кемеровский». Результаты биотестирования образцов почвы, воды и воздуха в тестах Эймса и учета доминантных летальных мутаций у Dr. meianogaster любезно предоставлены сотрудниками «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина» д-ром биол. наук Ф.И. Ингель и канд. биол. наук JI.B. Ахальцевой.

Цитогенетические методы. Препараты буккального эпителия готовили с использованием буферного раствора (Tris НС1, EDTA, NaCl, рН = 7) с учетом рекомендаций [Thomas et al., 2009]. Микроядерный тест выполняли с использованием расширенного протокола [Оценка цитологического.., 2005]. Микроядра (МЯ) идентифицировали согласно критериям Tolbert et al. [1992], учет дополнительных показателей проводился в соответствии с рекомендациями Юрченко и др. [2008]. Частоту клеток с МЯ, протрузиями ядра, ядром атипичной формы, с двумя ядрами, с круговой насечкой, перинуклеарными и ядерными вакуолями выражали в промилле (%о); частоту остальных показателей - как число клеток, найденных сверх 1000.

Молекулярно-генетические методы. Выделение ДНК из периферической крови проводили с использованием реактива «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Москва). Исследовали 16 однонуклеотидных замен в 11 генах репарации, 8 замен в 5 генах биотрансформации ксенобиотиков, а также наличие протяженных делеций в генах GSTM1 и GSTT1. Типирование аллельных вариантов генов АРЕ1 T444G (rsl 130409), XRCC1 С589Т (rsl799782), XRCC1 С839Т (rs25489), XRCC1 G1996A (rs25487), XRCC4 C1475T (rs2075686), XRCC4 G1394T (rs2075685), XRCC4 G245A (rsl805377), hOGGl C977G (rsl052133), ADPRT A2285G (rsll36410), XpC A2815C (rs2228001), XpD T2251G (rsl3181), XpG G3310C (rsl7655), NBS1 C535G (rsl805794), ATM G5557A (rsl801516), Ligase IV G26A (rsl805388), Ligase IV C4044T (rsl805389), CYP1A1 A2455G (rsl048943), CYP1A2 A163C (rs762551), NAT2 G590A (rs 1799930), NAT2 G857A (rs 1799931), GSTP1 C341T (rsll38271), GSTP1 A313G (rsl695) осуществляли с

использованием аллель-специфической ПЦР и набора реагентов НПР «Литех». При анализе генов GSTM1 и GSTT1, CYP1A1 Т3801С (rs 4646903), CYP1A2 А163С (rs762551) использовали мультиплексную ПЦР в режиме реального времени с помощью наборов реактивов ООО «СибДНК»; амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в горизонтальном 3 % агарозном геле и в вертикальном 6 % полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

Методы статистической обработки. Статистическую обработку осуществляли средствами программы StatSoft Statistica 6.0. Сравнение групп по качественным признакам и проверку на соответствие равновесию Харди - Вайнберга проводили с помощью критерия %2 [http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwal.pl] с поправкой Йетса для таблиц 2x2 [Гланц, 1998]. Для частот кариологических показателей буккальных эпителиоцитов рассчитывали средние значения (хср) и их стандартные ошибки (SE) [Животовский, 1991]. Для парного сравнения частот кариологических показателей использовали методы непараметрической статистики (ранговый U-тест Манна - Уитни) [Закс, 1976]. Для оценки прогностических возможностей показателей микроядерного теста использовался расчет величины AUC с помощью ROC-анализа [Zweig, Campbell, 1993]. Корреляционный анализ показателей микроядерного теста проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов [Гланц, 1998]. Расчет ассоциаций различных генотипов (отдельно и в сочетаниях) генов репарации и биотрансформации с кариологическими показателями буккального эпителия проводился с учетом FDR (False Discovery Rate) поправки уровня значимости (р) на множественные сравнения [Benjamini, Yekutieli, 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика радиационных и химических параметров окружающей среды в местах проживания детей и подростков. Для оценки радиационной обстановки на территориях проживания и обучения обследованных групп были проведены замеры мощности экспозиционной дозы (МЭД) внешнего у-излучения, объемной активности радона (OAr„) (табл. 1), определение суммарной объемной активности а- и ß-излучающих радионуклидов в пробах водопроводной, питьевой воды, а также в образцах почвы.

Таблица 1. Результаты измерений радиационных параметров в воздухе помещений обследованных территорий

Населенный пункт/год МЭД, мкЗв/ч OAR„ (М ± т), Пределы ОАКп

исследования Бк/м3

Красное РРА-01М-01«Альфарад»

2008 0,14 106 ±17 39-203

Пача РРА-01М-01«Альфарад»

2008 0,12 64 ±22 20-135

Таштагол РРА-01М-01«Альфарад»

2007 (декабрь) 0,15 235 ± 44 68-583

2008 (февраль) 0,14 415 ±53 232-617

2008 (май) 0,20 200 ± 42 101-334

2009 (февраль) 0,18 730 ± 77 192-1285

2010 (февраль) 0,15 905 ± 234 680-1143

Таштагол УСК «Прогресс»

2009 (февраль) 0,17 441 ±116 110-1373

2011 (май) 0,17 347±101 74-749

Примечаиия. ОА^ _ объемная активность радона; М - среднее значение; т - стандартная ошибка средней; МЭД — мощность экспозиционной дозы внешнего у-излучения.

Показатели мощности экспозиционной дозы внешнего у-излучения, полученные с использованием дозиметра ДКГ-02У «Арбитр» во всех изученных помещениях школы-интерната г. Таштагол (за весь период наблюдений) и на территориях контрольных населенных пунктов, не превысили нормируемых значений (0,3 мкЗв/ч) (НРБ-99/2009) и находились в пределах 0,12 - 0,2 мкЗв/ч (табл. 1). При оценке значений показателя ОАял, полученных с использованием радиометра радона РРА-01М-01 «Альфарад», установлено, что в контрольных населенных пунктах средние значения данного показателя составили 106 ± 17 и 64 ± 22 Бк/м3, в свою очередь, на территории школы-интерната показатель средней объемной активности радона варьировал в пределах 235 -905 Бк/м3 в зимнее время, 200 - 347 Бк/м3 - весной. Усредненное значение данного показателя за весь период обследования составило 463 ± 98 Бк/м3. Все средние значения OA радона (за исключением весеннего периода 2008 г.) значимо превысили соответствующие показатели для территорий контрольных населенных пунктов, при этом в некоторых помещениях уровень объемной активности достигал 1373 Бк/м3 (табл. 1).

Для верификации полученных с помощью радиометра радона результатов относительно показателя OAr,, в помещениях школы-интерната были проведены замеры с помощью интегрального метода с использованием УСК «Прогресс» с комплектом

угольных адсорберов в зимний и весенний периоды. Среднее значение данного показателя в помещениях школы интерната составило 441 ±116 Бк/м3 и 347 ± 101 Бк/м3 соответственно (табл. 1).

На основании полученных значений относительно OAru с учетом коэффициента вариации (в зависимости от времени года) был рассчитан показатель эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) радона, значение которого в зимний период составило 314,4 Бк/м3, в весенний - 546,8 Бк/м3. Известно, что наиболее объективным приближением к действительному среднегодовому значению ЭРОА является его среднее значение по данным двух интегральных измерений, выполненных в холодный и теплый периоды года. Таким образом, среднегодовое значение ЭРОА изотопов радона в воздухе помещений школы-интерната г. Таштагол составило 421 Бк/м3 при установленном допустимом уровне для эксплуатируемых зданий в 200 Бк/м3 (НРБ-99/2009). Индивидуальная эффективная доза ингаляционного облучения детей только за счет изотопов радона и их короткоживущих дочерних продуктов в воздухе составила ~27 мЗв/год при допустимом уровне 5 мЗв/год от всех источников облучения.

В пробах водопроводной питьевой воды не было выявлено превышения регламентируемого уровня радионуклидов. Удельная эффективная активность проб почвенного грунта составила 100 Бк/кг, что соответствует средним величинам для почв Кузбасса [Сорокина, 2006]. Содержание валовых и подвижных форм тяжелых металлов (Cr, Mn, Fe, Со, Ni, Си, Zn, Cd, Hg, Pb) в образцах почв на территории интерната находились в пределах ПДК, за исключением подвижных форм цинка (1,5 ПДК). Оценка показателя суммарной мутагенной активности в тесте Эймса Salmonella/микросомы с использованием штаммов Salmonella typhimurium ТА98 и ТА100, а также в тесте на индукцию доминантных летальных мутаций в половых клетках дрозофилы показала, что ни один из исследуемых образцов воздушной пыли и воды не проявил мутагенной активности. Анализ соответствующих проб, отобранных на территории проживания контрольной группы, не выявил превышения содержания тяжелых металлов и мутагенной активности контактных сред.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ведущим неблагоприятным экологическим фактором на территории школы-интерната г. Таштагол является радиация, а с учетом результатов радиологических исследований - основным ее источником является сверхнормативное содержание радона и продуктов его распада в воздухе жилых и учебных помещений интерната.

Цитологический статус буккальных эпнтелиоцитов детей и подростков контрольной и экспонированной радоном групп. По результатам микроядерного анализа препаратов буккальных эпителиоцитов обследованных экспонированной и

контрольной групп рассчитаны пределы варьирования и средние значения частот выявления кариологических нарушений (табл. 2).

Таблица 2. Цитогенетические показатели, показатели пролиферации и деструкции ядра

у обследованных экспонированной и контрольной групп (хср± ЗЕ(тш-тах))

Показатель Экспозиция радоном (п = 318) Контроль (п = 65) Р

Цитогенетические показатели

Частота клеток с микроядрами 0,79 ± 0.07 (0-8) 0.42 ±0.11 (0-6) 0.003

Частота клеток с протрузиями 3.80 ±0,18 (0-24) 1,68 ±0,22 (0-10) 0.000

Частота клеток с протрузиями типа «разбитое яйцо» 0,12 ±0,02 (0-3) 0,20 ± 0,05 (0-2) 0,039

Частота клеток с протрузиями типа «язык» 0,28 ± 0,03 (0-3) 0,14 ±0,05 (0-2) 0,048

Частота клеток с протрузиями типа «пузырек» 3,42 ±0,18 (0-24) 1,34 ±0,19 (О-Ю) 0,000

Частота клеток с микроядрами и протрузиями 4,74 ± 0,2 (0-25) 2,14 ±0,30 (0-17) 0,000

Частота клеток с ядром атипичной формы 17,58 ±0,51 (0-61) 22,71 ±1,41 (3-53) 0,000

Показатели нарушения пролиферации

Частота клеток с двумя ядрами 2,95 ±0,15 (0-12) 1,48 ±0,25 (0-14) 0,00000

Частота клеток с круговой насечкой 5,48 ± 0,23 (0-28) 3,57 ±0,38 (0-16) 0,0002

Суммарная частота 8.51 ±0.33 (0-31) 5,05 ±0,47 (0-19) 0,000

Показатели ранней ста дни деструкции ядра (апоптоза/некроза

Частота клеток с перинуклеарной вакуолью 20,88 ± 1,11 (0-168) 18,40 ±2,45 (1-105) 0,071

Частота клеток с конденсацией хроматина 77,36 ± 3,43 (1-353) 139,74 ±8,57 (41-350) 0,000

Частота клеток с вакуолизацией ядра 26,91 ± 1,77 (0-182) 4,63 ± 1,09 (0-60) 0,000

Показатели завершения деструкции ядра (апоптоза/некроза)

Частота клеток с кариорексисом 2,59 ± 0,28 (0 - 46) 3,43 ± 0,77 (0-27) 0,569

Частота клеток с кариопикнозом 10,17 ±0,65 (0-71) 4,11 ±0,49 (0-19) 0,00005

Частота клеток с кариолизисом 182,98 ±6,92 (12-735) 251,98 ±22,65 (11-821) 0,008

Частота клеток с апоптозными телами 0,47 ± 0,05 (0-7) 0,12 ±0,04 (0-1) 0,001

Примечание. хср - средняя частота; БЕ - ст. ошибка средней; Р - уровень значимости (и-критерий Манна-Уитни).

У обследованной ЭГ по отношению к КГ отмечено достоверное повышение уровня цитогенетических повреждений по всем изученным показателям, за исключением протрузий «разбитое яйцо» и ядер атипичной формы. Показатели пролиферации достоверно выше в ЭГ в 1,5-2 раза в сравнении с КГ. Полученные результаты относительно таких показателей, как конденсация хроматина и кариолизис, свидетельствуют о значимом превышении средних значений для контрольной группы (р = 0,008 и р = 0,000 соответственно). Важно отметить, что снижение интенсивности деструктивных изменений (конденсация хроматина, кариолизис) в клеточной популяции, характеризующейся повышенным уровнем цитогенетических повреждений, является наиболее неблагоприятным процессом, приводящим к накоплению генетически поврежденных клеток [Сычева, 2007].

Сопряженность показателей микроядерного теста в обследованных группах.

Корреляционный анализ показал, что в группе, экспонированной радоном, микроядра чаще встречаются в сочетании с пузырьками (R = 0,22; р < 0,001), двуядерными клетками (R = 0,12; р = 0,028), перетяжками (R = 0,30; р < 0,001), суммарным показателем пролиферации (R = 0,28; р < 0,001). В контрольной группе положительная корреляция показана между частотой выявления микроядер и двуядерными клетками (R = 0,32; р = 0,008).

Среди исследуемых цитогенетических аномалий в обеих группах чаще всего регистрируются ядерные протрузии по типу «пузырек». Положительная корреляция данного показателя выявлена с частотой выявления клеток с атипичной формой ядра, при этом в контрольной группе коэффициент корреляции оказался выше (R = 0,42; р < 0,001), чем в группе экспонированной радоном (R = 0,26; р < 0,001). Для группы детей и подростков г. Таштагол выявлены положительные статистически достоверные корреляции ядерной протрузии типа «пузырек» с двуядерными клетками (R = 0,22; р < 0,001) и ядрами с перетяжкой (R = 0,45; р < 0,001), суммарным показателем пролиферации (R = 0,44; р < 0,001), пикнотическими ядрами (R = 0,13; р = 0,022), ядерными вакуолями (R = 0,24; р < 0,001) и перинуклеарными вакуолями (R = 0,16; р = 0,004). В контрольной группе соответствующих взаимосвязей не обнаружено.

Таким образом, цитогенетические нарушения в клетках эксфолиативного эпителия при воздействии сверхнормативных доз радона чаще сочетаются между собой, а также с нарушениями пролиферации и деструктивными изменениями ядер, а в контроле чаще наблюдаются одиночные цитогенетические повреждения. Кроме того, полученные корреляционные связи подтверждают предположения других исследователей [Tolbert et al., 1991, Юрченко и др., 2008, Сычева, 2007] о наличии не только цито-, но и генотоксической компоненты в происхождении двуядерных клеток и клеток со сдвоенными ядрами. Повышение частоты этих клеток отмечается при злокачественных

новообразованиях, поэтому они могут быть дополнительным прогностическим признаком потенциальной канцерогенное™ изучаемого фактора.

Прогностическая эффективность показателей микроядерного теста.

Эффективность микроядерного теста для выявления генотоксического воздействия радона и продуктов его распада подтверждается результатами ROC-анализа. Характеристика прогностической ценности кариологических показателей буккального эпителия, основанная на анализе площади под ROC-кривой (Area Under Curve-AUC), представлена в табл. 3, отличным классификатором является вакуолизация ядра при пороговом значении 5 %о, хорошим классификатором - протрузии типа «пузырек» при пороговом значении 2 %о. На основании полученных результатов в ходе последующих ассоциативных исследований использовались показатели микроядерного теста, обладающие, согласно экспертной шкалы значений AUC, свойствами отличного, хорошего и среднего классификаторов.

Таблица 3. Значения величины AUC для показателей микроядерного теста

Показатель AUC m ДИ (95 %) Прогностическая ценность

Вакуолизация ядра 0,839 0,026 0,788;0,889 Отличный классификатор (> 0,8)

Протрузия типа «пузырек» 0,748 0,029 0,690;0,805 Хороший классификатор (0,7-0,8)

Двуядерные клетки 0,686 0,033 0,621 ;0,750 Средний классификатор (0,6-0,7)

Кариопикноз 0,660 0,032 0,598;0,722

Круговая насечка 0,644 0,036 0,574;0,714

Микроядро 0,604 0,036 0,533;0,675

Апоптозные тела 0,598 0,013 0,530;0,666 Плохой классификатор (0,5-0,6)

Перинуклеарная вакуоль 0,571 0,039 0,494;0,648

Протрузия типа «язык» 0,555 0,037 0,483;0,628

Кариорексис 0,479 0,041 0,398;0,559 Случайный классификатор (<0,5)

Протрузия типа «разбитое яйцо» 0,456 0,041 0,376;0,536

Кариолизис 0,396 0,043 0,313;0,479

Атипичная форма ядра 0,361 0,039 0,284;0,438

Конденсация хроматина 0,209 0,027 0,157;0,262

Примечания, m - стандартная ошибка; ДИ - доверительный интервал.

Влияние половозрастных характеристик, этнической принадлежности, заболеваемости, вредных привычек на показатели микроядерного теста. Для

корректного изучения роли наследственного полиморфизма в формировании признака радиочувствительности у обследованных ЭГ был проведен сравнительный анализ частот кариологических показателей буккального эпителия в зависимости от пола,

возраста, этнической принадлежности, заболеваемости, наличия вредных привычек (курение).

При анализе влияния пола показано повышение частоты клеток с протрузией типа «пузырек» у девочек в сравнении с мальчиками (4,03 ± 0,31 %о и 2,91 ± 0,18 %о соответственно, р < 0,01). В контрольной группе зависимости частоты данного показателя от пола не выявлено, а при сопоставлении средних значений анализируемого показателя в опыте и контроле с учетом пола они в обоих случаях статистически достоверно выше оказались в группе, экспонированной радоном, что свидетельствует о доминирующей роли влияния радона в формировании ядерных протрузий типа «пузырек». По остальным онтогенетическим параметрам, показателям пролиферации и деструкции ядра, статистически значимых тендерных отличий не выявлено.

Данные литературы о сопряженности возраста обследованных с показателями микроядерного теста неоднозначны [Loomis et al., 1990; Pastor S., Creus., Parrón et al., 2003; Gattas et al., 2001; Мамуйлов и др., 1998]. В данном исследовании в состав ЭГ, согласно возрастной периодизации [Ваганов, 2005; Колесинская, Соколов, 2007], вошли представители 3 возрастных групп: второе детство (N = 151), подростковый (N = 128), юношеский (N = 39). Анализ зависимости частот кариологических показателей от возраста обследованных не выявил значимых отличий.

По результатам анкетирования, проведенного в ходе исследования, доля курящих детей и подростков в экспонированной радоном выборке составила 14,8% (47 человек). Влияния курения на цитогенетические, пролиферативные и деструктивные показатели буккального эпителия установлено не было. Полученные результаты соответствуют литературным данным, представленным в обзорной публикации N. Holland [2008].

Сравнительный анализ частот кариологических нарушений в ЭГ в зависимости от национальной принадлежности, а также в подгруппах, сформированных по наличию отдельных форм хронических и инфекционных заболеваний, согласно действующей международной классификации болезней Десятого пересмотра (МКБ-10), не выявил влияния данных факторов на изученные показатели.

Результаты микроядерного анализа позволяют сделать следующие заключения: кластогенный эффект воздействия сверхнормативных концентраций радона в буккальных эпителиоцитах детей, включенных в данное исследование, выражается в увеличении значений числа клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, доли клеток с апогггозными телами; показатели нарушения пролиферации буккальных эпителиоцитов выше в группе лиц, подвергающихся воздействию радона; алиментарные факторы: возраст, этническая принадлежность, вредные привычки (курение), заболеваемость - не вызывают существенной модификации регистрируемых повреждений в клетках буккального эпителия за исключением гендерных различий по

частоте встречаемости клеток с иротрузиями типа «пузырек»; показана эффективность применения микроядерного теста для выявления генотоксического воздействия радона и продуктов его распада in vivo. Следовательно, использование данного теста является перспективным для проведения ассоциативных исследований взаимосвязи кариологических биомаркеров буккальных эпителиоцитов с наследственными полиморфизмами ферментных систем, обеспечивающих стабильность генома человека.

Характеристика полиморфизма генов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков в экспонированной радоном группе. Исследованию ассоциаций кариологических показателей с носительством различных вариантов генотипов предшествовало изучение характеристик распределения аллельных вариантов генов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков в экспонированной радоном и контрольной группах. В ЭГ выявленные отклонения частот распределения от равновесия Харди - Вайнберга обусловлены снижением частоты гетерозигот по локусам АРЕ1 (X2 н-w = 4,0032; р = 0,0452) и ХрС (X2 H-w = 5,0519; р = 0,0246), а в контрольной группе по локусам АРЕ1 (X2 H-w = 14,2542; р = 0,0002) и XpG (X2 H-w = 5,9265; р = 0,0149).

Сопоставление характеристик распределения генотипов систем репарации ДНК в опытной и контрольной группах позволило установить отличия по локусам XRCC1 С839Т (X2 = 4,157, df = 2, р = 0,041), АРЕ1 (X2 = 7,471, df = 2, р = 0,024), hOGGl (X2 = 23,814, df = 2, р = 0,000), ADPRT (X2 = 7,314, df= 2, р = 0,026).

Анализ полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков в экспонированной радоном группе выявил отклонения частот распределения от равновесия Харди -Вайнберга, обусловленные повышением частот встречаемости гетерозигот по локусам CYP1A1 A2455G (X2 H-w = 7,8163; р = 0,0052), CYP1A1 Т3801С (X2 H.w = 30,1501; р = 0,0000); по частотам распределения генотипов в контрольной группе отклонений от равновесия Харди - Вайнберга не выявлено.

Отличия в характеристиках распределения генотипов между опытной и контрольной группами, обусловленные избытком гомозиготных вариантов по мажорному аллелю в группе сравнения, установлены по локусам CYP1A1 A2455G (X2 = 32,4324, df = 2, р = 0,000), CYP1A1 Т3801С (X2 = 48,8263, df = 2, р = 0,000), и GSTP1 С341Т (X2 = 10,4205, р = 0,005). Отличия по локусу GSTM1 (X2 = 12,818, df = 1, р = 0,0003) обусловлены более высокой частотой встречаемости носителей активной формы фермента в экспонированной группе по сравнению с контролем.

Ассоциации изученных полиморфизмов с показателями микроядерного теста. Дитогенетические показатели. Учет «строгих» микроядер как основного цитогенетического показателя, имеющего исключительно генотоксическое происхождение, до недавнего времени считался единственным биомаркером эффекта

различного типа и уровня экспозиции. Однако современные исследования указывают на высокую информативность дополнительных кариологических показателей МЯ теста [Полиорганный микроядерный.., 2007], что подтверждается результатами изучения цито- и генотоксических эффектов воздействия радона (табл. 2).

В данном исследовании значимых ассоциаций изученных полиморфизмов с уровнем МЯ выявить не удалось. В свою очередь, установлено, что носительство гомозиготных вариантов по минорным аллелям генов 08ТР1 УаШ4Уа1 (Т341Т) и ввТР1 Уа1105Уа1 (03130) в условиях хронической экспозиции сверхнормативным излучением радона ассоциировано с повышенной частотой выявления протрузий типа «пузырек» (р = 0,006 и р = 0,014 соответственно) (рис.1).

Полученный результат может быть обусловлен тем, что у носителей инвариантных аллелей гена 08ТР1 изменяется афинность к электрофильным субстратам и снижается активность ферментов, что увеличивает риск развития оксидативного стресса, особенно при дополнительном воздействии ионизирующей радиации. Оксидативный стресс, в свою очередь, сопровождается цитотоксическими и генотоксическими эффектами.

GSTP1 Alall4Val

3,35

I 2,84

ИМИ

ИА1а/А1а (п=Г1 ™)

Ala/Val (п=79)

Val/Val (ii=12)

4,5 4 3,5 3

2,5 2 1.5 1

0,5 0

GSTP1 Ilel05Val

Т 3,03 1

1 Т 2.44*

М№ П№ I 1

(HÉ в!!

яй

Ile/Ile

(n=65)

Ile/Val (n=l 09)

Val/Val (n=37)

Здесь и далее * - статистически значимые отличия (Л-критерий Манна - Уитни). Рисунок 1. Частоты выявления протрузий «пузырек» у носителей различных генотипов генов биотрансформации ксенобиотиков

Образование «пузырьков» связывают с удалением из ядра ДНК-репарационных комплексов и амплифицированной ДНК [Сычева, 2007]. При анализе модифицирующего влияния полиморфизма генов репарации ДНК установлено, что у носителей мажорных аллелей генов ХЯСС1 А^39901п (01996А) (рис. 2А) и Хрв АзрПОШэ (033 ЮС) (рис. 2Б) частота выявления протрузий типа «пузырек» выше, чем у носителей минорных аллелей (р = 0,011 и р = 0,009 соответственно), что подтверждает более высокую эффективность процессов репарации ДНК у носителей мажорных аллелей.

4,5 4 3,5 3

2,5

1,5 1

0,5 0

XRCC1 Arg399Gln

p.2fi

,53*

Arg/Arg (ii=131)

Arg/Glu (n=93)

Glu/Gln (n=29)

4.5 4 3.5 3

1,5 1

0,5 0

XpG Aspll04His

—-* .................... J

Jjjjj5*

[TI As15/As-

I I (11=132

Asp )

Asp/His (ii=126)

His/His (n=40)

Рисунок 2. Частоты выявления протрузий «пузырек» у носителей различных генотипов генов репарации ДНК

Показатели нарушении пролиферации. Результаты анализа модифицирующего влияния сочетаний генов биотрансформации ксенобиотиков на пролиферативные показатели буккального эпителия позволили установить, что при среднем значении активности ацетилирования, характерного для гетерозигот по гену NAT2 G857A, наличие минорного аллеля CYP1A1 Т3801С, приводящего к ускорению метаболизма ксенобиотиков на первой фазе биотрансформации, приводит к увеличению частоты выявления двуядерных клеток (р = 0,006), что свидетельствует о нарушениях процесса цитокенеза вследствие накопления электрофильных соединений, развития энергодефицита и повреждения цитоскелета у носителей генотипа CYP1A1 3801 TC/NAT2 857 GA (рис. 3).

CYP1A1 T3801C/NAT2 G857A

4,64*

1.18*

TT/GA (ii=ll) TC/GA (ii=ll)

Рисунок 3. Частоты выявления двуядерных клеток у носителей различных генотипов СУР1А1 Т3801С/ИАТ2 0857А Вступление клеток в митотический цикл возможно при успешной репарации ДНК. Анализ полученных результатов позволил установить, что у носителей мажорных

аллелей генов репарации ДНК ХЯСС4 013940 и ХрЭ Ьуз751Ьу8 (Т2251Т) в ЭГ показатели пролиферативной активности выше, чем у носителей минорных аллелей (рис. 4).

4,5 4 ч s

1,5 I

0.5 О

XRCC4 G1394T

иг

3,82

G/G(n=59) О/Т (п=80) Т/Т(п=38)

г—| Lys/Lys LËJ (п=7б)

Lys/Gin (n=110)

Glu-Gin (n=54)

Рисунок 4. Частоты выявления клеток с двумя ядрами (А) и круговой насечкой (Б) у носителей различных вариантов генов репарации ДНК

Показатели деструкции ядра. Анализ модифицирующего влияния полиморфизмов изученных генов на показатели деструкции ядра позволил установить, что для гомозигот по гену АОРЯТ характерна более высокая частота выявления клеток с пикнотическими ядрами и вакуолизацией ядра по сравнению с носителями минорных аллелей в гомо- и гетерозиготном состояниях (рис. 5А).

40 35 30 25 20 15 10

ADPRT Val762Ala

ш 1.0* 1

■ LJ

9«

шкт ...... >* j

m ■ ;;; ИДИ

T1S,22*

Val/Val (n=l 22)Val'Ala (n=138) Ala/Ala (n=55)

XRCC1 Arg399GIn/ADPRT Val762Ala

[0.37

С I

Б GG/VA(iï=15) AG/VV (n=37)

Рисунок 5. Значимые ассоциации частоты клеток с вакуолизацией ядра р) и частоты клеток с кариопикнозом (и) с полиморфизмом генов репарации ДНК Носители генотипа АИРЯТ Уа1/Уа1 (А2285А) характеризуются высокой активностью фермента [ЬоскеИ е! а!., 2004], что в условиях воздействия ионизирующей радиации

может приводить к снижению содержания НАД и развитию энергодефицита клетки. Снижение продукции АТФ, в свою очередь, сопряжено с превращением пуриновых оснований в гипоксантин и мочевую кислоту, а этот процесс сопровождается выделением супероксидных анионов, вызывающих повреждение проницаемости клеточных мембран, в том числе и ядерного матрикса, поступлением воды в ядро, образованием ядерных вакуолей и повышением риска деструктивных изменений ядра в клетках буккального эпителия при воздействии ионизирующей радиации.

В составе мультиферментного комплекса, обеспечивающего репарацию ДНК, взаимодействие продуктов генов АБРЯТ и ХЯСС1 нарушает взаимодействие последнего с другими компонентами [Жимулев, 2003] и таким образом снижает эффективность репарации. В данном исследовании показано, что у гомозигот по мажорному аллелю ЛОРИТ в сочетании с гетерозиготностью ХЯСС1 399 (01996А) статистически достоверно чаще отмечаются клетки с пикнозом ядра по сравнению с гетерозиготами по гену АВРЯТ и гомозиготами по минорному аллелю XR.CC! 399 (А1996А) (р = 0,0009) (рис. 5Б).

Анализ модифицирующего влияния полиморфизмов изученных генов в контрольной группе не выявил статистически значимых отличий ни по одному из показателей микроядерного теста. Такой результат, вероятно, свидетельствует о том, что в условиях отсутствия воздействия мутагенных факторов носительство инвариантных аллелей изученных генов не оказывает влияния на цитологический статус буккального эпителия.

выводы

1. Ведущим неблагоприятным экологическим фактором на территории школы-интерната г. Таштагол является сверхнормативное содержание радона и продуктов его распада в воздухе жилых и учебных помещений.

2. Для экспонированной радоном группы показано статистически значимое повышение уровня цитогенетических и пролиферативных нарушений в сочетании со снижением интенсивности деструктивных изменений в сравнении с контрольной группой.

3. Наиболее эффективными показателями для идентификации длительного воздействия повышенных доз радона в буккальных эпителиоцитах является частота клеток с протрузией типа «пузырек» и вакуолизацией ядра.

4. Носительство мажорных аллелей генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (С8ТР1 А1а114Уа1, 05ТР1 ИеЮ5Уа1) и репарации ДНК (ХЯСС1 А^39901п, ХЯСС4 01394Т, ХрИ Ьуз75Ю1п, Хрв AspП04His) следует отнести к протекгивным молекулярно-генетическим маркерам, обеспечивающих более высокую адаптивность клеток буккального эпителия к воздействию ионизирующей радиации.

5. Деструктивные изменения ядер в клетках эксфолиативного эпителия ассоциированы с носительством мажорных аллелей гена АБРЯТ как изолированно, так и в сочетании с носительством минорных аллелей ХЯСС1 А^39901п, а нарушение пролиферации связано с носительством сочетания СУР1А1 3801 ТС/КАТ2 857 ОА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Мейер A.B., Толочко Т.А., Лунина A.A., Ларионов A.B., Минина В.И., Дружинин В.Г. Влияние полиморфизмов генов репарции ДНК на показатели нестабильности генома детей и подростков в условиях повышенной концентрации радона// Медицинская генетика. 2010. № 2. С. 3-8.

2. Мейер A.B., Дружинин В.Г., Ларионов A.B., Толочко Т.А. Генотоксические и цитотоксические эффекты в буккальных эпителиоцитах детей, проживающих в экологически различающихся районах Кузбасса // Цитология. 2010. Т. 52, № 4. С. 305— 310.

3. Дружинин В.Г., Алукер Н.Л., Ахальцева Л.В., Головина Т.А., Ингель Ф.И., Ларионов A.B., Сорокина Н.В., Толочко Т.А., Шапошникова A.B. Комплексный подход к оценке экологических факторов токсико-генетического риска у детей из Горной Шории // Гигиена и санитария. 2010. № 3. С. 12-18.

4. Мейер A.B., Лунина A.A., Ларионов A.B., Минина В.И., Дружинин В.Г. Изучение взаимосвязи между частотой микроядер и ядерных протрузий в клетках буккального эпителия человека и полиморфизмом генов репарации ДНК на фоне воздействия радона//Цитология. 2010. Т. 52. № 8. С. 673-674.

5. Дружинин В.Г., Волков В.А., Глушков А.Н., Головина Т.А., Минина В.И., Ингель Ф.И., Ларионов A.B., Мейер A.B., Лунина A.A., Толочко Т.А., Ахальцева Л.В., Кривцова Е.К., Юрцева H.A., Юрченко В.В. Роль полиморфизма генов репарации в оценке чувствительности генома человека к воздействию сверхнормативных концентраций радона // Гигиена и санитария. 2011. № 5. С. 26-30.

Статьи в сборниках и тезисы конференций:

1. Мейер A.B., Лунина A.A., Волобаев В.П. Влияние полиморфизма гена CYP1A1 A2455G на показатели апоптоза и некроза буккальных эпителиоцитов у детей и подростков // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий. Абакан: Издательство Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова, 2009. Выпуск 13: в 2 т. Т. 2. С. 142-143.

2. Druzhinin V.G., Golovina Т.А., Glushkov A.N., Larionov A.V., Minina V.l., Shaposhnikova A.V., Volkov A.N. Long-term exposition by domestic radon radiation and genotoxical effects in children from Western Siberia / Abstr. lOth International Conference on Environmental Mutagens. 2009. Firenze, Italy, August 20-25. Firenze, Italy, 2009. P. 189.

3. Мейер A.B. Цитогенетические нарушения в эпителии щеки детей и подростков проживающих в условиях повышенной концентрации радона // Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей: материалы V (XXXVII) Международной

научно-практической конференции в 2 т. Кемеровский госуниверситет. Кемерово: ООО «ИНТ», 2010. Вып. 11. Т. 2. С. 41-43.

4. Druzhinin V., Glushkov A., Larionov A., Lunina A., Minina V., Meyer A., Tolochko Т., Volkov A. Correlation between reparation genes polymorphism and chromosomal aberrations in long-term radon exposition conditions / Abstr. 40th Meeting of European Environmental Mutagen Society «Environmental Mutagenenesis in the North», September 15-18", 2010. Oslo, Norvay, 2010. P. 212-213.

5. Bonassi S., Coskun E., Ceppi M., Lando C., Bolognesi C., Burgaz S., Holland N.. Kirsh-Volders M., Knasmueller S., Zeiger E., Camesoltas D., Cavallo D., da Silva J., de Andrade V.M., Demircigil G.C., Odio A.D., Donmez-Altuntas H„ Gattas G., Giri A., Giri S., Gomez-Meda В., Gomez-Arroyo S., Hadjidekova V., Haveric A., Kamboj M., Kurteshi K., Martino-Roth M.G., Montoya R.M., Nersesyan A., Pastor-Benito S., Salvadori D.M., Shaposhnikova A., Stopper H., Thomas P., Torres-Bugarin O., Yadav A.S., Gonzalez G.Z., Fenech M. The HUman MicroNucleus project on eXfoLiated buccal cells (HUMN(XL)): the role of life-style, host factors, occupational exposures, health status, and assay protocol // Mutat. Res. 2011. Vol. 728, № 3. P. 88-97.

6. Мейер A.B., Дружинин В.Г., Толочко T.A. Влияние повышенных доз радона в воздухе жилых и учебных помещений на кариологические показатели буккальных эпителиоцитов детей / Современные проблемы экологии: доклады VII Всероссийской науч.-техн. конф.; под общ. ред. Э.М. Соколова. Тула: Издательство «Инновационные технологии», 2011. С. 99-101.

7. Мейер А.В., Толочко Т.А. Изучение динамики цитогенетических показателей буккального эпителия детей и подростков г. Таштагол // Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей: материалы VI (XXXVIII) Международной научно-практической конференции в 2 т. Кемеровский госуниверситет. Кемерово: ООО «ИНТ», 2011. Вып. 12. Т. 2. С. 46-48.

8. Мейер А.В. Влияние полиморфизма гена NBS1 на цитогенетические показатели буккального эпителия // Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей: материалы VII (XXXIX) Международной научно-практической конференции в 2 т. Кемеровский госуниверситет. Кемерово: ООО «ИНТ», 2012. Вып. 13. С.102.

9. Druzhinin V., Fucic A., Meyer A, Sinitsky М. Chromosome aberration and micronucleus frequency in lymphocytes and buccal cells of children environmentally exposed to increased radon levels / Abstr. 42th Meeting of European Environmental Mutagen Society, September 16-20й, 2012. Warsaw University, Poland, 2012. P. 113.

10. Мейер A.B., Толочко T.A. Использование микроядерного теста для поиска генетических основ радиочувствительности / Медицинские и экологические эффекты

ионизирующего излучения: материалы VI международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2013 г., Северск-Томск / отв. ред. P.M. Тахауов. Томск: ООО «РГ «Графика», 2013. 155 с.

Подписано в печать 8.11.2013. Формат 60x84'Чи. Бумага офсетная № 1. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 2/13.

Адрес издательства и типографии: ООО «Издательство «Кузбассвузиздат». 650043, г. Кемерово, ул. Ермака, 7. Тел. 8 (3842) 58-29-34, т/факс 36-83-77. E-mail: 58293469@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мейер, Алина Викторовна, Москва

На правах рукописи

04201365496 МЕЙЕР АЛИНА ВИКТОРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИЗЛУЧЕНИЙ РАДОНА В БЫТОВЫХ

УСЛОВИЯХ

03.01.01 - Радиобиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Г. Дружинин

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................10

1.1. Феномен радиочувствительности и возможные подходы к ее определению.............10

1.2. Эффекты воздействия малых доз радиации.................................................................11

1.3. Радон как радиационный фактор окружающей среды................................................13

1.3.1. Особенности воздействия радона на клеточные структуры....................................15

1.4. Использование цитогенетических тест-систем для оценки генотоксических

эффектов воздействия малых доз радиации.........................................................................17

1.4.1. Оценка генотоксического воздействия радона..........................................................20

1.5. Использование цитогенетических характеристик буккального эпителия для оценки мутагенного воздействия факторов внешней среды...........................................................22

1.6. Ассоциации полиморфизма генов-кандидатов с эффектами ионизирующих излучений в малых дозах........................................................................................................31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................38

2.1.Материалы исследования.................................................................................................38

2.2.Методы цитогенетического анализа................................................................................39

2.3. Молекулярно-генетические методы...............................................................................40

2.4. Методы статистической обработки................................................................................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......49

3.1. Комплексная оценка экологических факторов действующих в районе проведения исследования............................................................................................................................49

3.2. Цитологический статус буккальных эпителиоцитов детей и подростков контрольной и экспонированной радоном групп.......................................................................................58

3.2.1. Основные кариологические показатели эксфолиативных клеток обследованных групп........................................................................................................................................59

3.2.2. Сопряженность показателей микроядерного теста в обследованных группах......66

3.2.3. Прогностическая эффективность показателей микроядерного теста.....................67

3.2.4. Оценка влияния заболеваемости, курения, половозрастных характеристик и этнической принадлежности обследованных на цитогенетические показатели в клетках буккального эпителия............................................................................................................69

3.3. Характеристика изученных полиморфизмов в обследованных группах....................75

3.3.1. Сравнительная характеристика полиморфизма генов репарации ДНК в

исследуемых выборках..........................................................................................................75

3.3.2. Сравнительная характеристика полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков в исследуемых выборках............................................................................81

3.3.3. Ассоциации изученных полиморфизмов с показателями микроядерного теста.... 85

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................91

ВЫВОДЫ..............................................................................................................93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................94

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Согласно современным представлениям индивидуальная радиочувствительность (ИРЧ) имеет мультифакторную природу и в значительной степени определяется генетическими особенностями [Ни et al., 2001; Barnett et al., 2009]. К группе кандидатных генов ИРЧ относят гены репарации ДНК, контроля клеточного цикла и апоптоза, метаболизма ксенобиотиков, индукции механизмов радиозащиты и др., обеспечивающих стабильность генетического материала [Гончарова и др., 2003; Рубанович, 2007; Au et al., Fucic et al., 2008]. Оценку значимости полиморфизма вышеуказанных генетических систем в формировании признака радиочувствительности принято выполнять путем анализа ассоциаций полиморфных вариантов генов с радиационно-индуцированными эффектами, характеризующими степень ИРЧ [Kiuru et al., 2005; Rossi et al., 2009; Сальникова и др., 2010; Abilev et al., 2011; Васильева и др., 2012; Литвяков и др., 2013]. Однако на сегодня по ряду причин имеющиеся в литературе данные по установленным молекулярным маркерам радиочувствительности человека противоречивы и неоднозначны [Salnikova et al., 2012].

Другая проблема изучения радиочувствительности связана с необходимостью поиска специфических биомаркеров генотоксического эффекта ионизирующей радиации (PIP) на клеточном уровне. Выбор таких маркеров должен определяться типом радиации и мишенью воздействия. В настоящее время радиационно-специфическим методом индикации биологических эффектов ИР является анализ хромосомных аберраций (ХА), а именно дицентрических и кольцевых хромосом в лимфоцитах человека [WHO, 1993]. Другие цитогенетические маркеры эффекта - микроядра (МЯ), используются в целях биоиндикации радиационных эффектов значительно реже [Cytogenetic dosimetry, 2011]. Вместе с тем, анализ микроядер и иных

типов кариологических повреждений в эпителиальных клетках человека

* i ' <

4 1 '

может быть удобным инструментом в оценке гено- и цитотоксических эффектов ИР определенного типа - излучений радона и дочерних продуктов его распада, занимающих ведущую позицию среди естественных источников облучения. В частности, клетки буккального эпителия являются первичными мишенями воздействия газообразного радона, преимущественно попадающего в организм человека через дыхательные пути. Микроядерный анализ в буккальных эпителиоцитах признан экспресс-методом выявления мутагенной активности веществ различной природы [Полиорганный микроядерный..., 2007], техническая составляющая метода стандартизирована на международном уровне [Thomas et al.„ 2009]. Кроме того, данная тест-система позволяет оценить не только кластогенные и анеугенные события, но и охарактеризовать соотношение основных жизненных процессов - пролиферации, деструкции и уровень цитогенетических повреждений в зависимости от клеточной кинетики [Сычева, 2013].

К настоящему времени цитогенетическими методами установлены кластогенные эффекты воздействия высоких доз излучения от радона для различных групп шахтеров [Smerhovsky et al., 2002; Bilban, Jakopin, 2005]. Сведения об эффектах излучений радона в бытовых условиях немногочисленны и противоречивы [Cole et al., 1996; Bauchinger et al., 1996; Lindholm et al., 1999]. Тем не менее, в ряде исследований была показана эффективность использования рутинных цитогенетических тестов при оценке ХА в лимфоцитах после воздействия сверхнормативных концентраций радона в воздухе жилых или общественных помещений [Bilban, Vaupoti, 2001; Oestreicher et al., 2004]. В результате многолетнего исследования когорты воспитанников школы-интерната г. Таштагол Кемеровской области, подверженной хроническому воздействию сверхнормативных доз излучений радона и продуктов его распада, в лимфоцитах крови экспонированных детей и подростков было выявлено достоверное увеличение частоты ХА относительно контрольной популяции

[Дружинин и др., 2009].

1. значительным (более 50%) вкладом радона в общую структуру облучения, получаемого населением от природных источников;

2. наличием большого числа локальных популяций человека, вынужденных проживать в сходных неблагоприятных радоноопасных условиях;

3. доказанными канцерогенными и генотоксическими эффектами радона в профессиональных когортах;

4. недостаточностью знаний о закономерностях реагирования генома на воздействие ионизирующих излучений радона в малых дозах;

5. фрагментарностью и противоречивостью экспериментальных данных по изучению роли молекулярного полиморфизма для формирования индивидуальной радиочувствительности;

6. необходимостью поиска молекулярно-генетических маркеров радиочувствительности, значимо ассоциированных со степенью повреждений генома в условиях хронического воздействия сверхнормативных доз излучений радона и продуктов его распада.

Цель исследования

Исследовать гено- и цитотоксические эффекты как показатели чувствительности клеток буккального эпителия детей и подростков, экспонированных сверхнормативных хроническим излучением радона в условиях проживания и обучения; оценить значение полиморфизмов в генах биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК как возможных

факторов наследственной индивидуальной радиочувствительности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Положения, выносимые на защиту.

1. Основным экологическим фактором, действующим в условиях проживания и обучения детей и подростков, является сверхнормативное излучение радона и продуктов его распада.

2. Микроядерный тест в буккальных эпителиоцитах может быть использован для скрининговых исследований, позволяющих оценить гено- и цитотоксические последствия длительного воздействия повышенных доз излучений от радона.

3. Носительство мажорных аллелей генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (вБТР А1а114Уа1, вБТР 11е105Уа1) и репарации ДНК (ХЯСС1 Агё39901п, ХЯСС4 01394Т, ХрБ Ьуз75Ю1п, Хрв А8р1104Н1з) можно

» < \ * 7 ' ' •

отнести к протективным молекулярно-генетическим маркерам, обеспечивающим более высокую адаптивность клеток буккального эпителия к воздействию ионизирующей радиации.

4. Деструктивные изменения ядер в клетках эксфолиативного эпителия ассоциированы с носительством мажорных аллелей гена ADPRT, как изолировано, так и в сочетании с носительством минорных аллелей XRCC1.

Научная новизна. Впервые проведена оценка цитотоксических и генотоксических эффектов хронического воздействия повышенных концентраций радона с использованием микроядерного теста в буккальных эпителиоцитах. Показано, что данный тест является чувствительным к воздействию излучений от радона в бытовых условиях. Впервые изучена и показана значимость полиморфизмов генов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков в формировании признака радиочувствительности с использованием микроядерного теста в буккальных эпителиоцитах.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования получены в рамках выполнения НИР по грантам РФФИ: 10-04-00497-а, 12-04-32218 мол_а; государственного контракта ФЦНТП №16.512.11.2062. Результаты цитогенетического исследования включены в мировую базу данных «The HUman MicroNucleus project on eXfoLiated buccal cells (HUMN(xl))»- Федеральной службой по интеллектуальной собственности и товарным знакам принято решение о выдаче патента «Способ оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию повышенных доз излучений радона и продуктов его распада»

(№2012118311, приоритет от 03.05. 2012).

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на Международных научно-практических конференциях «Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей» (Кемерово, 2010, 2011, 2012), на 10th International Conference on Environmental Mutagens (Firenze, Italy, 2009); на 40th Meeting of European Environmental Mutagen Society «Environmental Mutagenenesis in the North» (Oslo, Norvay, 2010); на Российской научной конференции «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); на 42th Meeting of European Environmental Mutagen Society (Warsaw, Poland, 2012); на Семинаре «Проблемы современной радиационной генетики» (Северск, 2012); на VI Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (Томск, 2013).

Личный вклад автора. Автором в полном объеме (383 человека) проведен микроядерный анализ буккальных эпителиоцитов, включая сбор образцов, приготовление препаратов, учет кариологических показателей; выполнены основные этапы молекулярного типирования аллельных вариантов генов биотрансформации (15%) и репарации (23%), а также статистический анализ результатов цитогенетического и молекулярно-генетического исследований.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Феномен радиочувствительности и возможные подходы к ее

определению

В современном мире человек подвергается воздействию ионизирующего излучения от различных источников. К числу искусственных источников относится медицинское облучение в диагностических и терапевтических целях, профессиональное облучение специалистов в условиях промышленного производства, в различных областях науки и медицины. Опасность несет массовое применение ядерных технологий с использованием источников ионизирующего излучения, в результате чего облучению подвергаются как работающий персонал, так и население, проживающее вблизи радиоактивно загрязненной территории. Особенно пагубно это сказывается при аварийных ситуациях на предприятиях атомного комплекса [Энергетика, 1994]. Облучение природного происхождения определяется космическим излучением, естественной радиоактивностью воздуха, почвы, воды и пищи, а также радиоактивностью самих живых организмов [Рихванов, 2009]. Необходимо отметить, что в большинстве случаев, при которых люди подвергаются воздействию радиации, как от естественных, так и от техногенных источников, речь идет об облучении в небольших дозах. Такое облучение не оказывает быстрого и заметного влияния на здоровье, однако его отдалёнными биологическими последствиями могут быть злокачественные новообразования, изменение продолжительности жизни, а также генетические эффекты у потомства [Радиация и патология, 2005]. Согласно современным представлениям эффекты ионизирующего воздействия определяются индивидуальной радиочувствительностью (ИРЧ), которая, в свою очередь, имеет мультифакторную природу и в значительной степени обусловлена генетическими особенностями человека [Ни а1., 2001; Вашей е! а1., 2009]. Радиочувствительность определяется многими факторами, среди которых выделяют: способность к репарации после радиационного воздействия,

степень активности метаболитических процессов, скорость окислительно-восстановительных реакций, физико-химических и биохимических процессов в клетке [Гончарова и др., 2003; Рубанович, 2007; Au et al., Fucic et al., 2008]. Зависимость эффектов как от генетических, так и от средовых факторов, ставит вопрос о выделении групп повышенного риска, имеющих наибольшую чувствительность к воздействию генотоксических агентов, и как следствие противопоказания к работе и проживанию в условиях повышенного радиоактивного груза.

Таким образом, проблема исследования феномена радиочувствительности человека, помим�

Информация о работе

Мейер, Алина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.01

Диссертация

Молекулярные и клеточные маркеры чувствительности буккальных эпителиоцитов человека к воздействию излучений радона в бытовых условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы