Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутринейронная цАМФ-зависимая система, управляющая проницаемостью мембраны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Внутринейронная цАМФ-зависимая система, управляющая проницаемостью мембраны"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗШО-ТЕХНИЧЕСКШ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

2 £ ;^ : Ш, 577.352:

577,37

Авдонин Владшир Борисович

ВНУТРИНЕИРСШАЯ цАМФ-ЗАВЮШЯ СИСТВ1А, УПРАВЛНЩАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬЮ ЫЕМБРАШ

03:00,02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте проблем передачи информации РАН

Научны® руководитель:

доктор (Экологических наук

профессор

Е.А.Либерман

Официальные ошонентн: доктор физико-математических наук

Д.Н.Шаршсов

доктор биологических наук В.Д.Барон

Ведущая организация: МГУ, Институт Физико-химической биологии имени А.К. Белозерского

Зацита состоится " Z(f -1994 г. в /ч чао.Зо мин.

ча заседании Специализированного ученого совета К.063.91.10 при Московском фкзико-техвжчесяом институте по адресу: 141700, Московская область, г.Долгопрудный-, Институтский пер., Э, МОГИ, ауд.

Автореферат разослан " ¡^с^ 1994 года.

Учатай секретарь

Специализированного ученого совета кандидат физике математических наук

В.Б.Киреез

. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1 Актуальность проблемы. Открытие электрических нервных имяу-ьсов положило начало физическому описанию процессов, лежащих в гнове работы нервной системы. В последствии основное результаты в гом направлений связаны с установлением ионных механизмов генера-ш нервных импульсов [Hcdgkin, 19523, исследованием химического зханизма нервно-мышечной передачи tKata, 1959], изучением работы эзбувдащих и тормозных синапсов tEocles, '1964; Ходоров, 1975; эствк, 1977]. На основании экспериментальных данных были сформули-эваны предположения об основных свойствах нейрона, существенных за функционировании его в качестве элементарной единицы нершой ютеда: пороговый характер возникновения нервного импульса, воз-эжность передачи возбуждения меаду нейронами через разветвленную ютему синаптических связей, суммирование на нейроне воздействия г отдельных синапсов, взаимодействие между синапсами. В работе ЛакКаллок, Пите, 19561 показано, что многие функции, приписываемые эрвной системе, могут быть реализованы устройством, образованным зедииением пороговых элементов,' имеющих несколько входов и едан-гввттшй выход, таким, что выход одних элементов монет непссред-гвенно подаваться или заправлять прохождением сигнала на вход дру-IX. Такие элементы получили название формальных нейронов, а сис\ j, получаемые их коммутацией, называют нейронными сетями. Доказа-j, что нейронные сети могут реализовнвэгь любую логическую функ-по. Дальнейшие исследования показали, что динамические процессы в ¡йронных сетях могут быть использованы для решения таких сложных ¡дач, как распознавание образов [Hopiield, 1982].

Так как имеется соответствие "мехду свойствами формального и ¡ального нейронов, мокао предполагать, что работа нервной системы :нована на принципах теории нэйронных сетей. Однако, прямых экспе-¡ментальных доказательств такого предположения пока не существует, тому же, не исключено, что теория формального нейрона использует i все свойства реального нейрона, имеющие отношение к процесса ¡работки ;_4формации в нервной системе. Еозможно, одним из таких юйств является наличие механизма управления проводимостью клеточ-(й мембраны изнутри нейрона, связанного с системой циклических тслеотидов Шберман и др., 1975). Существование такого механизма ясазано разными авторами у нейронов различных животных (см. обзор

[Солнцева, 19913).

Эксперименты с внутринейронной инъекцией цАМ® указывают на то, что цАМФ-завигамое изменение проводимости связано не только с процессами, происходящими иа мембране, но также и в объеме нейрона. Р первую очередь, это данные о малом времени задержи меиду началом введения цАМФ в клетку и началом изменения мембранной проводимости ш сравнении с временем, необходимым для диффузии цАШ от места инъекции до мембраны СЫЬегтап еЬ а1,19851, а также данные о влиянии на цАШ-йашсшую проводимость изменения структуры цитоскелета [Либерман и др...1Э8Ы. Для того, чтобы понять, насколько существенным может Сыть наличие объемных процессов, влияющих на проводимость мембраны нейрона, для работы его в качестве элемента системы, перерабатывающей информация, необходимо прездэ всего исследовать их свойства. Такому исследованию и посвящена данная работа. .

1.2 Цель работы. Главной задачей настоящего исследования было изучение особенностей электрической реакции нейрона на внутриклеточную инъекцию цШ>, связанных с пространственной организацией внутриклеточной системы, управляющей проводимостью мембраны. Для этого была применена методика введения цАА® в различные области нейрона. Изменение характеристик цАМФ-ре акции, вызванное варьированием места инъекции, позволяет судить о месторасположении центров связывания цА№ в нейроне. Для интерпретации экспериментальных данных применялось компьютерное модел1фование.

1.3 Научная новизна. Предложен метод для изучения пространственной организации внутринейронной цАШ-зевисимой системы, управляющей проводимостью мембраны. Продемонстрирована механочувствктель-ность одиночных цАШ-зависимых калиевых каналов.

1.4 Практическое значение. Полученные данные об организации внутриклеточной системы циклических нуклеотидов позволяют на живой клетке проводить количественное исследование кинетических параметре * химических и физических процессов, протекающих в этой системе. Поэтому открывается возможность детального изучения на живой клетке механизма - действия лекарственных препаратов, влияющих на систему циклических нуклеотидов. Принципы обработка информации на трехмерной пространственной структуре в нейроне, изучение которых становится возможным с применением предложенного в работе метода, могут быть использованы при создании новых информационных технологий.

- э -

1.5 Апробация. Материалы диссертации были дожжены на конфорон-ции молодых ученых Института проблем передачи информации РАН 1993 г.

1.6 Публикации. По материалам работы опубликовано 5 печбгнмх работ. "

1.7 Структура диссертации. • Диссертация состоит из веэдэядя, обзора литературы, экспериментальной части, ошсяния численного моделирования, обсуждения, выводов и описка литературы,

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и метода исследования

¿Эксперименты проводились на идентифицированных и невдонт'/фи-цировянных нейронах подглоточного комплекса ганглиев виноградной улитки (Helix luoorua), поскольку на ншотг'и этого вида проведено подробное исследование эффекта внутриклеточной инъекции циклического АМФ.

2.1.1 Приготовление препарата.

Изолированные нейрогы выделялись из улиток, пробужденных от спячки за несколько дней до эксперимента. Для изучения реакции нейронов в таких трепаротах обычно использовался физиологический раствор слэдукщего ссстьва: NaCl - 80 vii, KCl - 4 уЧ. СаС_а~ 7 мМ, HgCJL,- 5 мМ, HEPES-K0E - 5 мМ, глюкоза - 5 мМ, пзницяллин и стрептомицин - по 0.05 мг/мл. Выделенный генглий освоооздали от плотных оболочек и инкубировали, в растворе проназы Е (2.5 мг/мл физиологического раствора) в течениэ 50 мин црц t - 28°С. Затем после промывания физиологическим раствором о ганглиев удалялась тонкая оболочка. Нейроны изолировались от ганглиев металлическими иглами под визуальным контролем с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9- Выделенные нейроны переносились в чатку Петри, на дно которой был нанесен тонкий слой агара для того, чтобы предотвратить контакт клеток со стеклом. После этого нейроны могли сохраняться при t - 7°0 без ухудшения их свойств в течение нескольких суток. Нейроны идентифицировались в процессе выделения визуально в соответствии с работой [Сахаров, 19791. Были использованы счедующие нейроны (обозначения в данной классификации): ЖЬП, ЛПа1, ЛПа2, ЛПаз, В4, Вб, Ша1, ППа2, ШаЭ.

2.1.2 опасение экспериментальной установки.

Перед экспериментом нейроны переносились в вксперимвнтальпув

камеру. Негрош, не поврежденные при выделении, прикреплялись поверхности стекла, в течение нескольких минут. Камера устанавливг лась в проходящем свете в юле зрения ошокулярного мкгоскот ЫБС-9. Ыикрошпетки, вводимые в тело нейрона для регистрации злею рической активности в инъецирования цАМФ, позиционировались о поме щы> механического милреманппулятора с линей-ой точностью 5 мки Измерение линейных размеров нейрона производились с помощь окуляр-микрометра с точностью ю мкм.

Внутриклеточные микрозлэктрода изготовлялись из капилляров с микроволокном фирмы ряс Вгтв«1ок (США) на полуавтомате для вытяжки микроалектродов МЭ-Э непосредственно перед опытом, чтобы избежать загрязнения. Затем они заполнялись раствором через пластиковую пипетку, которая вводилась в ствол электрода с тупого конца. Для стабильного выведения раствора из электродов заполнение производилось растворами, очищенными от механических примесей путем пропускания через фильтры Бупрог фирмы Хемапол (ЧССР) с диаметром пор 0.10-0.17 мкм Заполнение контролировалось визуально под микроскопом АУ-12, отбирались равномерно заполненные электроды с сопротивлением 5-15 Шм и диаметром кончика не более 1 мкм.

циклический амф вводился внутрь нейрона путем подачи импульсе давления 2-5 атм внутрь микропштки в виде 0.1 М раствора, приготовленного на 50 Ш НКР13-КСН-буфере, рН 7.4. Объем вводимого такт способом раствора пропорционален величине прикладываемого давленая а длительности импульса. Величину инъецирующего давления в процессе опыта не меняли. Для изменения количества вводимого однократно вещества варьировали длительность инъекции в пределах 0,02 - 0,6 сек.

Ышсропигттка для инъекций герметично фиксировалась в держателе специальной конструкции, имеющем входное отверстие для подачи давления внутрь микрошшетки. Вход держателя соединялся эластичной трубкой с выходом пневматического ключа, а. вход которого через редуктор подавалось высокое давление от баллона с двуокисью углерода. Шевмоклш имел электрическое управление, подключенное к выходу цифро-аналогового преобразователя ЭВМ, на котором программно формировался управляющий импульс заданой длительности. Во время подачи управляющего импульса на выход пневмоключа передавалось высокое давление, в неактивном состоянии выход соединялся с атмосферой.

Креме микропипвток для инъекции цАМФ в клетку вводились шосро-электрода для регистрации избранного потенциала в подачи поляризующего тока. Микроал9ктроды подключались к регистрирующей системе через коммутатор, позволяющий соединить любой чз микроэлектродов со входом буферных усилителей с высоким входным сопротивлением и с источником тока с высоким внутренним сопротивлением.

Регистрация тока через одиночные ионные каналы проводилась по стандартной методике. Пипетка для записи тока через калиевые каналы заполнялась раствором, содержащим 84 шМ К01, 7 ты Са01г, 5 оМ HgCla, 5 тМ Tris-HCl-буфер (рН 7,5). Механочувствительность цАМВ-зависимых ионных каналов изучалась путем шдат небольшого давления внутрь регистрирующей пипетки. Давление создавалось вручную с помощью шприца, контролировалось манометром и записывалось в ЭВМ через шевмо-электрический преобразователь.

Эксперименты проводились под управлением ЭВМ Eolipae СЗЗО, оснащенной аналого-цифровыми и цифро-аналоговыми преобразователями. Для проведения автоматизированного эксперимента был создан программный комплекс, работающий в среде многозадачной операционной системы AOS. Рохт фиксированного потенциала на мембране нейрона поддерживался программно.

2.2 Результата экспериментов.

2.2.1. Эффект цАМФ на изолированном нейроне.

Эффект внутриклеточной инъекции цШФ подробно описан для нейронов, находящихся в комплекса ганглиев. Первой задачей нашего исследования было подтверждение этих результатов для изолированного яейрона. Примеры записей тока, вызванного внутрдаейрокной инъекцией цЩЬ в изолированный нейрон при' потенциале покоя, приведены на рис.1 ,в,г. В сериях опытов на рагныг нейронах характеристики Форш тока - величина задержки, длительность и амплитуда тока, соотношение длительностей фаз нарастания и спада - варьируют в примерно равных пределах для обоих объектов. Таким образом, временной ход тока, вызванного введением цАМФ в нейроны, совпадает для опытов на изолированих нейронах и на нейронах в составе ганглия. Проводимость мембраны во время ответа на цШ> изолированного нейрона меняется слабо, как и в случае нейрона в составе ганглия, что говорит о наличии у изолированного нейрона обоих компонент цАМФ-зависимой проводимости.

Сходство реакции на цАМФ у штактного нейрона, находящегося в состава целого ганглия, и у лишенного аксона изолированного нейрона позволяет утверждать, что цАШ-зависимая система нейрона, изменяющая проводимость мембраны, в основном связана с телом клетки. Основная часть соответствуй^ ионных каналов находится на соматической мембране.

2.2.2. Зависимость задержки реакции на цАШ от места инъекции.

Величина задержки эффекта никогда не превышала 0,8 сек независимо от размера нейрона я положения кончика инъэцирунцей микропипетки внутри нейрона, в частности, имеются записи опытов, когда при инъекции в центре нейрона диаметром 300 мкм задержка составляла 0,2. сек. В сериях иаьекцяй цАМФ в один и тот же нейрон на различных расстояниях от клеточной мембраны, наибольшее время задержки

Рисунок 1.

а - зависимость задержки эффекта цАШ от глубины погружения кончика иньецируюдей пипетки в нейрон диаметром 180 мкм. • - первоначальные величины; х - после возвращения с большей глубины, б - зависимость амплитуды цШО-тока от глубины погружения кончика инъещфушцей пипетки в не»*рон в двух опытах. • - диаметр нейрона 140 мкм, гремя инъекции 0,02 сок; * - диаметр нейрона 180 мкм, время шгьекции 0,08 сек.

в, г - Сравнение формы временного хода цАШ-зависшого ионного тока при введении цАМФ из двух микротшеток в один и тот же нейрон. Кривые 1 - инъекции в области центра нейрона; кривые 2 - инъекции вблизи мембраны. в - Нейрон ШаЗ, диаметр 250 мкм. г - Нейрон ЛПл1, диаметр 200 мкм.

д, е - Изменение натриевой (д) и калиевой (в) проводамостей мембраны нейрона во время реакции на инъекцию цАЖ. Смещение кончика мшсротшвтки относительно начального положения: 25 мкм (•) и 75 мкм (х). Отсчет времени - от начала инъекции.

ж - зависимость амплитуда цАЫФ-тска от кодкчаства вводимого вещества яри инъекциях на глубине погружения кончика шшэтки равной половине радиуса (.) и в центре нейрона (х).

з - Записи цАЫФ-тока при О мВ, полученные при инъекции в разные места нейрона диаметром 280 мкм. Кривая 1 - инъекция вблизи мембраны; 1фивая 2 - инъекция в области центра нейрона.

, " - в -

подучено при гаъекциях в районе центра ньйрсьа. Однако, в целом, величина задержки меняется слабо по сравнении с теоретической оценкой, равной 4 сек, для инъекции в центр нейрона радиусом 10и мкм. Регистрируемая задержка соответствует расстоянию от места инъекции до ближайших цАМФ-связывапцих цек ров не более 40 микрон, что заметно меньше расстояния до мембраны в случав инъекции в области центра клеи«.

Как и в случае нейрона в составе ганглия, в опытах на изолированных нейронах наблюдается постепенное возрастание задержки эффекта в большой серии инъекций при неизменном положении микропипетки. Для объя -нения этого факта в работе СЛИбарман и др., 19853 выдвинуто предположение, что имещаяся задержка аффекта связана с наличием вблизи инъецирующей микропипетки зоны механического повреждения внутриклеточных структур, образующейся при введении пипетки в тело клетки и увеличивающейся в результате процедуры инъекции. Опыты с изменением положения микропипетки в нейроне также могут быть использованы г ш проверки этого предположения, поскольку перемещения микропипетки также сопровождаются повреждением внутриклеточной структуры. На рис.1,а показаны данные зависимости величины задержки от глубины погружения кончика пипетки, полученные в опыте на нейроне диаметром 180 мкм. Кружками на этом рисунке обозначены точки, полученные при первоначальном помещении микропипетки в данное положение, крестиками - точки, полученные при обратном ходе микропипетки с,большей глубины. Имеющееся увеличение задержки связано о перемещениями микропипетки, поскольку при неизменном положении инъэкцирупцей пипетки увеличение задержки проявляется при гораздо больших сериях инъекций.

2.2.3. Заг 'симость амплитуды аффекта цАМФ от места инъекции.

По зависимости (амплитуды тока, вызванного инъекцией цАМ®, от соложения кончика инъецирующей микропипетки в нейроне можно судить о расположении цАЫФ-связыващих центров, управляющих проводимостью мембраны. Если бы эти центры были расположены только на поверхности мембраны, то при удалении места инъекции от мембраны амплитуда аффекта должна была бы-уменьшаться, так как при увеличении расстояния концентрация цАМФ падает из-за диффузии и разрушения фосфодиэс-теразой. На рис.1,6 показано, как менялась амплитуда цАМФ-ответа при прохождении микропипеткой вдоль нейрона в двух опытах. Как

мсжно видеть, отсутствует прямая зависимость амтлтуды эффекта от расстояния до ближайшей мембраны. В то же время имеется достаточно хорошо воспроизводимая при повторных проходах зависимость амплитуды от места инъекции. Эта зависимость не имела общего вида для разных опытов, что можно объяснить тем, что, по-видимому, цАШ-овязываюгдае центры имеют неравномерное пространственное распределение в нейроне. Различные опыты могут отличаться как видом распределения связывающих центров в данном нейроне, так и траекторией движения кончика микропипетки относительно этого распределения.

2.2.4. Зависимость формы цАМФ-тока от места инъекции при потенциале покоя.

Опыты с инъекцией цАМФ из одной микроттетки имеют тот недостаток, что перемещение пипетга внутри нейрона сеязэнс с некоторым повреждением клетки. Этого не происходит, когда инъекции производятся из двух микропипеток, помещенных в разные места нейрона. В этом случае состояние нейрона практически не меняется при последовательны! инъекциях в разные области, и, следовательно, различия во временном ходе цАМФ-тока связаны с разным протеканием в этих областях процессов, составляющих эффект цАМФ. В то же время при инъекциях из разных пипеток нельзя гарантировать равенство колич-?тв вводимого вещества. Поэтому, е качества неизменного параметра при сравнении формы тока была выбрвна амплитуд эффекта, равенства которой при инъекции из разных микрошшеток добивались подгонкой длительности инъекций.

На рис.1,в,г представлены результаты двух опытов, иллюстрирующих два основных типа зависимости фермы временного хода тока, вызванного инъекцией цАМФ, от места инъекции при равенстве амплитуд эффекта. На каждом из ртунков 1,в,г сравниваются записи цАМФ-тока при инъекции вблизи мембраны и в центральной области нейрона. Сравнение кривых на каждом из рисунков показывает, что инъекция в разные места приводит к различиям в скорости нарастания переднего фронта toi з и во времени достижения максимума. На рис.1,в 1флвая 1, соответсвующая инъекции на большем удалении от мембраны, достигает максимума раньше, чем кривая 2. У кривых на рнс.1,г порядок достижения максимума противоположный. Как и в опыте на рис.1,в, реакция на инъекцию на большем удаление от мембраны имеет большую задержку.

Скорость нарастания тока на начальное стадии эффекта вше при инъекции вблизи мембрьны. В дальнейшем возможно изменение соотношения скоростей нарастания тока на переднем фронте аффекта, как это било в опыте на рис.1,в.

Длительность эффекта определяется, в пзрвую очередь, количеством введенного цАМФ и активностью фосфодиэстеразн. Равенство амплитуды при различной длительности эффекта для инъекции в разные области мокет быть связано либо с отличиями в локальной активности фосфодиэстеразы, либо разной чувствительностью к цАМФ в этих областях.

2.2.5. Зависимость амплитуды эффекта цАМД от количества вводимого вещества при инъекциях в различные моста нейрона.

Изучение зависимости амплитуды цАКЗ-тока от количества введенного вещества дают даннкэ о кинетике процессов, составляющих эффект ЩДОО. На рис.1,ж проедены давние о зависимости амплитуды цАМФ-тока от количества вводимого вещества при инъекциях на глубине погружения кончика пипетки равной половине радиуса (•) и в центре нейрона (х). Из рисунка видно, что равные приращения количества вводимого вещества вызывают большее увеличение цАМФ-тока при инъекциях в центре нейрона, что означает большую чувстзительность к цАМФ в этой области. Как уже говорилось выше, чувствительность к цАШ заметно изменяется при варьировании места инъекции. Данный опыт иллюстрирует тот .важный случай, когда чувствительность к цАМФ выше на большем удалении от мембраны. При инъекциях больших количеств цШВ проявляется насыщение цАМФ-связывавдих центров, что сказывается в отклонении кривой доза-эффект от линейной зависимости. В большинстве опытов замечено, что насыщение проявляется сильнее при приближении места инъекции к мембране, как это видно и в опыте на рис.1,д. Это может объясняться отражением диффузионного потока от непроницаемой для цАМФ мембраны, приводящим к накоплению вещества в примембранной области. Нелинейность зависимости доза-эффект для инъекций в центре нейрона при малых дозах может указывать на отсутствие цАМФ-связывающих центров в локальной области в цэнтре клетки.

2.2.6. Зависимость временного хода итеных компонент цАШ-тока от места инъекции.

Разница в форма цАШ~тока, йолученного при инъекции в разные точки анутринойронного пространства, может определяться различиями в развитии двух компонент цАМФ-токц - натриевой и калиевой. Для изучения временного хода каздой из этих компонент производилось периодическое смещение величины фиксируемого мембранного потенциала на несколько милливольт. Используя интерполяцию значений тока при базовом потенциале в моменты времеш, когда потенциал был смещен, получаем пвры значений ток-потенциал, на основшпги которых опроделяются величины изменения натриевой и калиевой проводимос-тей. Проводя такия вычисления для всех ыомэнтов времени, когда давались смещения потенциала, получаем данные для оценки временного хода натриевой л калиевой компонент н'Ш-зависпмой проводимости.

На рис.1 ,д,е показали изменения натриевой (рис.1,д) и калиевой (рте.1,о) проводимостий мембран?! нейрона а ответ на инъекцию цАт на глубине погружения кончика мккропилетки 25 и 75 мк.д. Как видно из рисунков, отличия имеются во временном ходе обоих компонент проводамостей. Обе инъекции вызвали одинаковое по амплитуде изменение натриевой проводимости (рис.1 однако имеется заштное различие в форме кривых. При инъекции вблизи мембраны натриевая компонента быстрее достигла максимального значения по сравнению со случаем инъекции при большем погружении. Для калиевой компоненты в первую очередь бросается в глаза различив в амплитуде реакции при изменении места инъекции. Тот факт, что натриевая и калиевая компоненты цАМФ-реакции имеют отличную мевду собой зависимость от места внутриклеточной инъекции, указывает на то, что эти компоненты имеют раздельные механизмы чувствительности к цАМФ, причем цАМ®-связывапцио центры имеют заметно разное пространственное распределение для кредой из компонент.

2.2.7. Особенности временного хода цАШ-тока при деполяризации клеточной мембраны.

Различная зависимость натриевой и калиевой компонент цАМФ-завасимой проводимости от положения инъецируицей микропипетки в нейроне не проявляется в форме цАМЪ-тока при потенциале покоя, так как вблизи потенциала реверсии для копов калия общая форма цАМФ-тока определится, в основном, изменением натриевой проводимости.

Прч г.зполяриаации вклад калиевой компоненты в общий ток становится более заметным. В этих условиях различная зависимость компонент цй№-Ц$<жта от места инъекции может быть выявлена по форме т са.

№ рис. 1,з показаны записи тока при инъекции из двух микропипеток. Цри положительном потенциале можно видеть,-что ток, вызванный инъекцией цАЫФ, имеет две составляюцих, рас. лчающихся временем достижения максимума. Цри инъекции из микропипетки 1 первая быстрая компонента то амплитуде превосходит вторую медленную, тогда как для инъекции из шкропипэтки 2 соотношение амплитуд противоположное, обращает внимание также различное время достижения максимума компонентами. Сравнивать абсолютные величины токов при подобной постановке опыта неправомерно, поскольку нельзя гарантировать то, что при инъекциях из разных микропипеток вводятся равные количества вещества в нейрон.

Измерение проводимости показало, что быстрая компонента тока сзязана с увеличением проводимости, а медленная - с уменьшением ее. Так как ток обеих компонент является входящим, то ионную природу этих составляющих можно интерпретировать следующим образом: быстрая компонента обусловлена увеличением проводимости для ионов натрия, а медленная - уменьшением проводимости для ионов калия.

2.2.8. Ыеханочувствительность одиночных цАМФ-зависимых ионных каналов.

В работах [Iiiberman et al, 1988; Mberman et al, 1989] было высказано предположение, что малая задержка цАМФ-тока при инъекции давлением и чувствительность цАМФ-эффекта к воздействию не цитоскелет объясняется тем, что сигнал от цАЫФ-связывапцих центров, расположенных в объеме нейрона, переносится к ионным каналам клеточной мембраны механическими гиперзвуковыми колебаниями, распространяющимися по структурам цитоскелвта. Для проверки этого предположения были поставлены опыта, направленные на изучег э механочувствитель-ностп одиночных цДМФ-зависимых каналов.

В опытах регистрировалась активность одиночных каналов на фрагменте мембраны йейгэна. (конфигурация oail-attaohed) во время реакции клетки на инъекцию цАМФ и при воздействии на этот фрагмент мембраны механического раздрежения, производимого подачей внутрь регистрирующей пипетки небольшого давления. На рис.2 представлены

записи одного из таких опытов.

Пипетка для регистрами одиночных, каналов была зттолнэза раствором, содержащим 34 kW KOI, 7 .nü OaCl,,, î> nJí Kg012, 5 п2£ ïrip-HCi буфер (pli 7.5). ffira: разности потенциалов на клеточной мембране -50 мВ регистрировался входэдий ток чероз одиьо'ошэ каналы. На рис.2,а показана запись активности этих каналов во время реакции клетки ка инъекцию цДМФ. Одновременная запись тока через всю клеточную мембрану поксзана клже на рис.2,б. Момент шьекцзи отмечен стрелгой. IIa рисунке видно значительное уменьшаете экгивпоста одиночных квяалов в момент, когда эффект цАЫЗ достигает максимума.

На рис.2,в показана запись токе чорэз каналы этого же мзчбрая-ного фрагмента после окончания реакции на инъекцию цАМ» и Еоссга-новлония канальной активности. В момент времени, отмеченный стрелкой, к пнпетко было приложено отрицательное давлоние (-16 m ртутпо-го столба). Это воздоастглв вызвало быстрое умзншение кабальной активности. Фрагменты этой записи, джонстрзрухвдэ активность каналов до и после приложения давления, представлены а более подробном временном масштабе на рис.2,г и рис.2,д, соответственно.

Проводимость этих каналов, определенная по пахлояу вольт-амперной характеристики, составляла 40 пС. Потенциал реверсии бал . около 0 кв. Открывашя каналов группировались в пачки. Воздействия давления и инъе^сциз цШ> ne изменяли среднего времени ни открытого, ни закрытого состояния во время па пси. Как инъекция цАЖ, так и воздействие давления увеличивали время наховдеиия каналов в закрытом состоянии между пачками.

Были сделаны записи тока через такие каналы после огрквания мембранного фрагмента от клетки (конфигурация Insiie-out), когда внутреннюю сторону мембранного фрагмента омывал раствор, содержаний 4 шМ KCl. В этих условиях ток через одиночные каналы не изменял направления вплоть до потенциала 50 мВ, что указывает на ионную селективность этих каналов. Поело отрывания фрагмента мембраны от Рис.2

клетки каналы не проявляли чувствительности к воздействия давления. Чувствительность к давлению часто пропадала и у каналов, находящихся на интактном фрагменте мембраны, прикрепленном к клетке после нескольких циклов подачи-снятия давления. После произошедшей таким образом потери механочувствительности у этих каналов пшеогда не

была зарегистрирована чувствительность к цШ9.

Дгя изучения натриевых цАЫФ-зазисжых каналов опыты, подобные олисяншм вшпе, ставились с пипеткой для регистрации одиночных кеналсв,. заполненной влекла точным раствором с большим -содержанием на'/рия. Одйбхо никакие каналы, регистрировавшиеся в этих условиях, не обладали чувствительность!) ей I: цАКФ, ни к давлению. Единственной результат, подученный. в таких условиях, cocтoяJ: в том, что иногда паб.мдалось некоторое увеличение фонового шума не записях тока через <5рагаэнг мембрана, вызываемо* кяк инъекцией цДЖ, так и воздействием давления. Это г нф1*>кт, возможно, объясняется тем, что ток через натриевые цАШ-ЗЕВисимае конные кана-л имеет слишком маленькие а»шлктуду и/или длительность, лэжащиэ за пределами раэре-пещей способности имевшейся у нас аппаратуре.

Приведенные выше результата качественно иллюстрируют основные закономерности.вреданнсго хода цАЩ-гависиьюго ионного тока, выявляемые при варьировании места инъекции. Выяснение причин, лэгапшх в основе втих закономерностей, возможно в рачках математического описания процессов, протехсагащх э клоясэ при проведении подобных екапэримэнтов. Наш был проделан необходимей анализ 'с ис гользозани-ем мэтода компьютерного моделирования. Далзе излагаются результаты атего исследования.

Еиоунок 2.

ЫэхЕяочувог-нггелыюоть одиночных цДМФ-оавпопмнх К+ лозных каналов, а - Ясстсь тока через испный канал во время реакции нейрона на инъекцию цШ5. Момент инъекции отмечен стрелкой, б - Запись интегрального тока через клеточную ¡доморяну, сделанная одновременно с ззшеью кг pi;c.2,a.

б - Изменение активности того же конного какала при воздействии

отрщита.икого давления {-1С mm Hg) на мембранный фрагмент.

г,д - <5р wohtu записи на ряс.?..в до и после прикладывания

дрвлоияя. ' .

ц ц» II. www ■утг.уу 9?т> »■ ■ m Г» Тг'^СЯЯЖ

U -1 *

рА

4 nA

&

-/

ir

6

■'j. * " i ♦ у"

4 рА

NwrH Нч|

10 с

1.8 рА

9

1 .Э рА Ol в

з. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОПЫТОВ С ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ИНЬЕКВДЕИ ЦАЫФ

3.1. Описание модели.

Изменение концентрации цАМФ 1Г в точке пространства с координатами г с ходом времени 4 задается уравнением трехмерной диффузии со стоками, описывающими разложение цАЪЖ фосфодиэстеразой:

--ВАп(гЛ) -кП(РЛ), (1)

: а\ ■

где I) - коэффициент диффузии, к - константа активности фосфодиэс-теразы. Задача ставилась для области, ограниченной сферой радиуса

и, моделирувдэй клеточную мембрану нейрона.

Начальная концентрация цАМО принималась равной нулю во всей рассматриваемой области за исключением шарового объема радиусом Но с центром в точке го, в котором концентрация постоянна и равна концентрации з инъецируемом растворе (0.1 М).

О(г.О)

Г V при |г-го|<Ио

(2)

О, при |г-г |ж

При такой постановке задача имэет ось симметрии, проходящую через центр сферы, моделирующей нейрон, и центр шара, на котором задана ненулевая начальная концентрация. Наиболее удобной системой координат для рыпения являются полярные координаты (г,6,<р) с началом в центре внешней сферы и отсчетом угла 9 от оси симметрии. При этом из симметрии вытекает независимость рашения от угла ср. Граничные условия, вытекающие из непроницаемости клеточной мембраны для диффундирующего вещества, в выбранной системе координат имеют следующий простой ьлд :

аИ

- О . (3)

г=И

Для получения численного решения задачи диффузии использован метод стабилизации, описанный в Шарчук, 1Э89].

Регистрируемое в опытах цАШ-зависимое изменение проводимости предполагалось пропорциональным количеству активированных комплек-

сов цАМФ с регуляторными центрам!, управляющими проводимостью меибранн. Реакция связывания цАМФ с рьгуляторными центрами моделировалась в соответствии с результатами работы /Либермви и .яр., 1989./: принималось, что для образования активного комплекса четыре молекулы цАМ> попарно реагируют с одним регуляторным центром. Зависимость количестга активированных комплексов от времени дзег гя следующим выражением:

г Х14(г,*)

Е(Г) —Г-—-г <СТ , (4)

Л (О* + ТГ (Г, 4) )

где с - константа диссощгации комплекса молекулы цА?й> с рогулятбр-ным центром, Е(г) - пространственное распределение концентрации цЦТ^-связывавдих центроз. Интегрирование ведется по всему объему сферы и Чрона).

Основной задачей моделирования была проверка различных гипотез о распределении цАМФ-связывапцих центров, то есть айда функции Е(г). Ниже приведены функции, использовавшиеся в вычислениях для моделирования рг тт'в деления цАМФ-связквающих центров.

Случай расположения регуляторных центров только на мембране описывался следящим образом:

Г

■ I о!

при Г=Е

(5)

при г<Н

При этом интегрирование в (4) велось по поверхности г=н. Остальные функции моделируют распределение цАМФ-связывающих центров в. объеме нейрона. Величина й^обозтчает размзр зоны ьокруг места инъекции, где внутриклеточная среда разрушена микропшгеткой. Считая, что в этой зоне связывание цАМЭ не влияет на проводимость мембраны, функции Е(г) здесь прг 'авали нулевое значение.

Равномерное распределение связывающих центров по объему имеет следующий вид:

{Б , ПрИ |Г-Г 1*1*. И ° ° * п , (6) О, при |Г-Г0|<Н4Щг<На

где Н^ обозначает радауо центральной шаровой войн, во содержащей рецепторам цАЫФ.

Простейший случай неравномерного распределения - это линейно убпапцев с роете» расстояния от места о максимальной концентрацией в точке г

' i г - г j ч

j , при I M^ | < Ь

Ь' " . (7)

О. при I м- | i 1

Здесь 1 - раанер зош, содержащей регуляторвыв центры. 3.2. Результаты ^счетов.

3.2.1. Зьвисимозть аидлитуда цАМФ-эзакции от места инъекции. На рио.З прлзедены результат расчета измекония во времени количества активированиях. цАШ-овязы^аадих центров при инъекции в нейрон радиусом R=100 мкм. Рисунки (е,в,д) соответствуют шгьею^ш,

Риоуаок 3.

Расчэише кривые зависимости относительного количества активных рецепторов ц4Ш от времени для ошта о ннугриклеточно.Ч инъекцией цАМ&. Радауо нейрона 100 мкь:.

Расстояние от цёнтра н&йрона до мэста инъекции: е.в.д - 26 мкм; б,г,е - 76 мкм.

Моделируеиые распределения цЛКФ-связываяцкх центров: а,б - рецепторы равно»'..piso распределены на поверхности мембраны; в,г - р&цептора равномерно распределены во всем объема клетки 8а кет лечением центральной зош радиусом 60 мкм; д,е - равномерное распределение по всему объему клетки. На рисунках а-э приведены кривые для двух доз инъецируемого вещества, отличавздгхсл в два рааа.

*,з - Расотсяьие от центра дс места инъекции: кривые 1 - 25 мкм, 1фиаыэ Z 73 мкм. При расчетах использовалось модельное распреде-' jifcHue цАШ-рецепторов по всему объему ыэйрона, за исключением центральной od/.асти размером: п - 25 жм, з - 50мкм. В расчетах количество цШС подбиралось таким образом, чтобы амплитуды аффектов при го_лсшш в резных местах были близки. ".

а 5

9 *

ж.

произведенной на расстоянии 25 мкм от центра нейрона (четверть рэдиуса), для рисунков (б,г,о) - это 75 мкм (три четверти радиу са). Какдзя горизонтальная пара рисунков представляет данные, рассчитанные для одного и того же распределения связывающих центров: рис.3,а,б - центры расположены только на мембране (функция Еу(г), формула (5)), рис.3,в-е - центры распределены с постоянной концентрацией в шаровом слое (функция Ея(г), формула (6)). Распределения в этих парах отличаются только размером центральной шаровой зоны, не содержащей связывающих центров (параметр в формуле (6)): для рис.3,в,г Еп=50 мкм, для рис.3,д,е Еп=0. На каждом из рисунков приведены кривые для двух инъецируемых объемов раствора цАШ, отличающихся в два раза.

Из рис.Зга,б видно, что при смещении места инъекции на 50 мкм к,центру нейрона амплитуда эффекта, рассчитанная для распределения цА1К>-связыБающйх центров только на мембране, уменьшается на 3 порядка. Такого значительного изменения амплитуды никогда не наблюдалось в опытах с варьированием места инъекции. Расчеты для распределения связывающих центров в обьеме клетки (рис.3,в-е) показывают большее соответствие с экспериментальными данными в том смысла, что инъекции на ^азных расстояниях от мембраны вызывают сравните по амплитуде эффекты. В общем случае можно сказать, что инъекция в область, не содержащую связывающих центров, вызывает заметно меньший ответ по сравяэнко с инъекцией вблизи рецепторов. Иными словами, амплитуда эффэкта, в основном, определяется распределением связывающих центров в некоторой близкой окрестности места инъекции.

3.2.2 Зависимость емплитуды цАМФ-тока от количества вво.димого вещества.

Рассмотрим зависимость амплитуда в^фэкта от дозы по результатам расчетов, представленным на рис.З. Для случая расположения центров связывания цАМФ только ыз мембране двукратное увеличение дозы при инъекции на расстоянии 25 им от центра показывает изменение амплитуды реакции более чем на порядок (рис.3,2). Это противоречит полученным экспериментальным данным, описанным выше. Результаты, вычислений, основанные на предположении о связывании цАМФ в объеме нейрона (рис.3,в-е), лучше согласуются с экспериментом.

3.2.3. Зависимость формы цМИХ-зависимого тока от места инъекции..

Выше в Бкспериментаяьной части описано, как изменение места инъекции цщ& отражается на форме цАМСКзависамого тока. Чтобы облегчить сравнение формы временного хода тока в опытах с инъекцией из двух микропиголж в разных положениях, подгоняли дезу вводимого вещества так, чтобы регистрируемые токи имели близкие амплитуды. Такая подгонка была выполнена и при модельных расчетах. Результаты представлены на рт:с.3,ж,з.

На рисунка наложены правые, рассчитанные для инъекции на расстояниях 25 и 75 мкм от центра нейрона радиусом 100 мкм. Количество введенного вещества подобрано так, что кривые имеют близкие амплитуды. Представлены расчета для двух значений параметра Нп, определящего размер центральной зоны, нэ содержащей связывающих центров: 25 мкм для рис.3,ч и 50 мкм для рис.3,е. "".•".. Данные расчеты воспроизводят два характерных случая, регистрируема в экспериментах. Соответствующие экспериментальные записи были привиЛ?*ш на рис.1,в,г. На рис.3,ж кривая 1, рассчитанная для инъекции на большем удалении от мембраны, достигает максимума раньше, чем крива« для инъекции у мембравн. Такое аэ соотношение получено в опыт (уис.1,в). У расчетных кривых (рио.З.з), как и у. экспериментальных (рис.1,г), порядок достижения максимума кривыми противоположный. Также характерным является поведение кризше на начальных стадиях реакции. В первом случае -1 рис.3,к - кривая для инъекции у центра пересекает втору» кривую в двух точках, тог^з как на рис.3,з пересечение -имеет место только в одной точке. Именно такое поведение наблюдается у соответствующих экспериментальных кривых - рис.1,в,г. Из результатов расчетов ясно, что причина такого явления кроется в пространственном расположении цАМФ-связывапцих центров г" отношению к мес-у инъекции. В случае, когда кончик центральной инъецирующей мшфопипетки находится вблизи области, содержащей связывающие центры, регистрируется один вид, соотношения временного хода; когда центральная микрэпипетка глубоко погружена в область, не содержащую центров — другой.

3.2.4. Ксделиров&мв случая различного распределения цЫИ>-связывакщих центров, управляла разными компонентами мембранной

проводимости.

Выше приведены данные ш изменение во времени натриевой и калиевой составлявши цАЬЮ-тока. Показано, что изменение каста инъекции по-разному отражается на каждой из этих компонент, '¿тот эффект был воспроизведен при моделировании, когда для каждой компоненты проницаемости бэли выбраны различные ф-чкции распределения, например, Е^ для центров, изменяющих. проницаемость мембраны для натрия, в Еь - для калиевых центров. Подобные различия в ходе компонент можно получить только при неравномерном распределении связывающих центров, хотя бы для одной компоненты.

3.2.5. Оценка кинетических парьметров ввугринейронной цАМР-завиьимой системы, управляющей проводимостью мембраны.

О помощью подгонки расчетных кривых под экспериментальные данные можно получить количественные оценки для коэффициента диффузии цАМФ в цитоплазме нейрона и константы диссоциации комплекса рецептора и молекул цАМФ. Основным параметром, определяющим погрешность полученных оценок, является количество вводимого в клетку вещества, которое определялось из приращения линейных размеров нейрона после большой серии инъекций. Для определения доверительного интервала, содержащего истинную величину оцениваемого параметра, применялось варьирование параметра Ко в пределах соответ-ствувдего доверительного интервала. С учетом тг им образом оцененных погрешностей, величина с для разных нейронов лежала в диапазоне от 1-10~4М до 4-10-4Ы. Величина коэффициента диффузии в разных опытах оценена от 0,6-10~6 до 1,2-10~6 см2/сек.

4, ОБСУЖДЕНИЕ.

Основными направлениями предыдущих исследований роли цАМФ в нервной клетке были изучение ионной природы цАШ-зависимой мем-

бранной проницаемости и выявление действия Различных химических агентов на эффект цАЬЮ. В данной работе внимание концентрировалось прежде всего на свойствах цАМФ-эффекта, связанных с пространственной организацией ¿, -.ЧФ-зависимой системы, управляющей проводимостью мембраны нейрона, то есть на характеристиках, чувствительных к изменению места инъекции цАМФ внутри нейрона. Характер зависимости задержки, амплитуды и формы временного хода цАМФ-тока от места

инъекции позволяет сделать следующие основные выводы о пространственной организации цАМФ-завиимой нейрона: цАШ-связывающие центры, управляющие проводимостью мембраны, имеются в большой части объема нейрона, причем распределены в нем неравномерно.

Математическое модечирование процессов, составляющих эффект цАМФ, позволяет судить о том, как расположение цАМФ-связывающих центров в пространстве проявляется в зависимости эффекта цАМФ от места инъекции. Регистрируемые в опытах аффекты могут имэть место лишь при наличии цАМФ-связывающих центров в объеме нейрона. Пока-.зано, что в центре нейрона имеется область, не содержащая связывающих центров, которая, по-видимому, соответствует клеточному ядру.

На основании полученных таким образом сведений о расположении цАМФ-связывающих центров в нейроне область применения компьютерного моделирования в изучении Енутринейронной системы цАЫФ можэт быть расширена от качественного воспроизведения экспериментальных данных до определения количественных характеристик явления, как, например, было сделано при оценке коэффициента диффузш. Однако, наиболее интересным в этом направлении представляется возможность детального описания распределения цАМФ-связывающих центров в нейроне .

Опыты с варьированием места инъекции цАМФ можно рассматрт ль как своего рода сканирование внутршейронпой сроды. Произведя записи реакции клетки на инъекции цШ> в достаточно большом количестве различных точек внутри нейрона, можно получить достаточное количество данных для определения пространственного расположения мест с наибольшей и наименьшей' концентрацией цАМФ-связывающих центров, управляющих каждой из компонент цАМФ-завискмой мембранной проницаемости. Такого рода измерения важно произвести прежде всего для идентифицированных нейронов, так как это покажет, насколько устойчиво распределение цАМФ-связывающих центров в нейронах и связано ли оно с расположением каких-либо видимых клеточных орга-нелл.

Данные о механочувствительности цАМФ-зависимых ионных каналов дают дополнительное подтвараденке предположению, выдвинутому в работе [ЫЬегтап et а1, 1988], о том, что внутринейронная независимая система связана с мембранной проводимостью посредством быстрых механических процессов. Тот факт, что механочувстзитель-

ность регистрируется только у каналов на мембране, прикрепленной к клетке, и исчезает при удалении мембранного фрагмента от клетки, указывает на существование некоторого мостика между каналом на мембране и внутриклеточной средой. Учитывая данные о связи эффекта цАЫФ с состоянием структур цитоскелета можно ожидать, что цАМФ-завйсимые ионные каналы непосредственно связаны с цитоскелетом.

Полученные в работе результаты могут быть использованы дай расширения представления о процессах в нейроне, участвующих в переработке информации в нервной системе. Наши данные говорят в пользу того,что в нейроне имеется сложно организованная пространственная структура," состояние которой может локально изменяться в результате сшаптической активности* причем изменения в ее состоя- . нии практически мгновенно отражаются на проводимости внешней мембраны нейрона. Можно ожидать, что такая система способна производить гораздо более сложное прзобргзование информации, чем формальный нейрон, представляющий собой пороговый элемент с весовым суммированием. Нами был рассмотрен модельный нейрон, функционирование которого определяется структурой ц4МФ-зависимой системы, управляющей проводимостью мембраны. Можно показать, что система обработки информации, основанная на таких нейронах может обладать высокой производительностью и экономичностью: система оперирует многокомпонентными вектор-функциями времени; элементарным актом, выполняемым элементом системы, является распознавание; для передачи информации используется помехоустойчивое кодирование. Функционирование медального нейрона определяется его структурной: пространственным распределением '^ЧФ-связывавдх центров и фосфодиэстеразы, расположением синапсов. Можно ожидать, что внутренняя структура нейрона обладает значительной пластичностью; что делает возможным обучаемость, а также программируемооть системы со стороны генетического аппарата клетки. Основание для этого предположения дают данные о езязи внутринейронной цАЩ-зависиыой системы, управлякщей проводимостью мембраны, с цитоскелетом, который, как известно, может подвергаться дошьмичэским структурным перестройкам.

5. вывода.

1. Временной ход цШ5-зависимого ионного тока и во. л чина изменения проводимости мембраны в опытах на изолированном нейроне

•

такие же, как и в случае оштов на нейронах, находящихся в комплексе ганглиев. Это указывает на то, что цАКФ-зависимая мембранная проницаемость связана в основном с соматической мембраной нейрона.

2. Величина задержки реакции ез инъекцию цАМФ мала и при изменении положения кончика инъецирующей пипетки меняется слабо по сравнению с теоретической оценкой. Максимальное время задержки соответствует инъекциям в центре нейрона. Показано, что при потенциале покоя амплитуда и форма переднего фронта тока, вызванного инъекцией цАМФ, изменяются при варьировании места инъекции в нейроне, тгргу" отсутствует прямая зависимость этих параметров от близости KjH4**f'v инъецирующей микропипетки к внешней мембране. Показано, что raá-анение места инъекции по-разному отражается на формах временного хода Иа+- и КА-компонэнт цАМФ-зависимой проБода-мости клеточной мембраны.

3. В опытах- по регистрации ионных каналов методом пэтч-клямя продемонстрирована механочувствительность цАМФ-зависамых калиевых каналов. Чувствительность каналов к механическому раздражению наблюдалась только в конфигурации oell-attaohed. и исчезала при отрывании фрагмента г.'.ембранн от нейрона.

4. Построена компьютерная модель опыта с внутриклеточным введением цАМФ, позволяющая описывать эффекты изменения места инъекции внутри нейрона. С помощью модели была изучены зависимости параметров временного хода цАШ-ответа от места инъекции при различных предположениях о пространственном распределении цШ&-CI ззывавдих центров, управляющих проводимостью мембраны, в теле нейрона. Результаты моделирования показывают, что наблюдаемый в экспериментах характер зависимости цАМФ-эффе^-а от места инъекции воспроизводится 'в моделировании только при предположении о том, что цАМФ-связыващие центры расположены не только на внешней мембране нейрона, но и в объеме нейрона. При этом в центре нейрона í ia быть область, lj содержащая цАМФ-связывяющих центров, а в Сильном объеме концентрация этих центров может быть непостоянной. На основе экспериментальных денных in vivo сделана оценка коэффициента диффузии цАМФ в цитоплазме нейрона и сродства цАМ® к рецепторам.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах: 1. S.7. Minina, О.Ь. Myalcotina,У.В. Àvdonin. B.A. ЫЪегпню Meoha-nioal influenae and oASiP inj в о t tor. «токе tUe оатэ reaotion of nf топ loxilo channels. - ÎE8S letters. 1991,V. 289, * 1. P. 224226. ; v •

г. Авдонин В .В., Мякотина С.Л., Минина C.B., Либерман Е.А. Особенности оространсгвонпой оргаш8Еции системы, меняющей проницаемооть мембраны нейрона в ответ на сАМР. I. Зависимость изменения проницаемости мембраны от мвота инъекции еАМР. - Биологические ыембра-нк, 1993, Т. 10, * в. С. 593-305.

3. Авдонин В.Б., Мякотина О.Л., Минина C.B., Либерман В.А. Особенности пространственно? организации системы, меняющей проницаемооть мембраны нейрона в ответ на оАМГ. и. Моделирование на ЭВМ. -Биологические мембраны, 1&ЭЗ; Т. 10, Я 6, 0. 60S-616.

Авдонин В.Б., Ыякотина О.Л. Возможность разделения компонент чАМФ-зависимого ионного тока при тгалокЕтелъком потонциале. - Труды XXVIII конференции молодых ученых ШЛИ РАН. М. 1993, 0 . 48-51. Б. Авдонин В.Б., Мякотина О.Л. Оценка кинетических параметров Ечутринейронной иАШ-Бавнстмой системы, упрявляицей проводимостью мембраны. - Труды ХХУП1 конференции молодых ученых ИЛЫ РАН. М. 1993, С. 52-65.

МФТИ- ,8Ж^ >kTUf'so>k!