Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

цАМФ/цГМФ-активируемые каналы обонятельных рецепторов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "цАМФ/цГМФ-активируемые каналы обонятельных рецепторов"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛИКИ

На правах рукописи

Косолапов Андрей Витальевич

УДК 577.352.465

цАМФ/цГМФ - АКТИВИРУЕМЫЕ КАНАЛЫ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Специальность 03.00.02 "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертант на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

ПУШИНО - 1992

Работа выполнена в Институте биофизики клетки АН СССР

Научный руководитель:

Доктор биологических наук С.С. Колесников Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук В.И. Новоселов Кандидат химических наук А.Я. Зильберштейн

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского при МГУ.

/1

Защита состоится / т~ декабря 1992 г. в 1 V час, на заседании Специализированного совета Д 200.23.01 по специальности "биофизика" и "биохимия" при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, Московская обл., г. Пущино, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г. Пушино.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Специализированного совета ¡j

кандидат биологических наук £ ¡А j ^^улУ/ 'Г Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящий момент наиболее обоснована та точка зрения, в соответствии о которой трансдукцию пахучих стимулов обеспечивают системы метаболизма циклических нуклеотидов. Установлена, например, что аденилатциклаза обонятельного эпителия активируется различными запахами /Расе et al,1985; . Lancet,19S6/; активация фермента происходит за десятки миллисекунд /Вгеег et 11,1990/, что вполне может обеспечить передний фронт физиологических ответов; инъекция цАМФ в обонятельную клетку вызывает заметное увеличение проводимости наружной мембраны 'Suzuki,1989; Kurahashi,1990; Firestein et al,1991/; ингибиторы >ДЭ модифицируют ответы на пахучий стимул обонятельных клеток 'Firestein et al,1991/; изменение ответов в присутствии югидролизуемых аналогов ГДФ и ГТФ свидетельствуют об участии ;-белков в трансдукцш запахов / Firestein et al, 1991/.

Т.о., вполне вероятно, что активация' обонятельных клеток гроисходит классическим образом: рецептор ® G-белок =» денилатциклаза =» цАМФ =» ионный канал /Bruch et al, 1989/.

Многое в обсуздаемой проблеме остается неясным. Например, ©которые стимулы не влияют на активность аденилатциклазы /Sklar t al,1986/, но стимулируют быстрый синтез IP /Boeknoff et 1,1990, Вгеег et al, 1990 /. Если учесть, что стимулы, ктивирующие синтез цАМФ или IPg относятся к разным классам апахов (для цАМФ - цветочные,камфорные,муксусше запахи, а для Р3~ острые и мятные), то, возможно, инозитольная система также частвует в возбуждении обонятельных нейронов.

Каков оы ни был истинный механизм трансдукцш пахучих стимулов, го исполнительным элементом являются соответствующие ионные эналы наружной мембраны обонятельного нейрона (запах-зависимые зналы). Поскольку трансдукцию в обонятельных клетках могут 5еспечивают несколько систем внутриклеточной сигнализации, вполне эавомерно возникает вопрос - каждая система имеет свой зполнительный элемент или они контролируют активность [действенной ион-транспортирующей системы? A priory на этот вопрос гветить невозможно - в литературе имеются примеры в пользу любой )чки зрения.

На плазматической мембране обонятельных клеток обнаружены тюнные каналы, активируемые цАМФ и цГМФ /Nakamura & Gold,1987/. то же время, для фоторецепторов позвоночных показано, что 1налы, активируемые цГМФ, функционируют in vivo как

1.

светозависимые /Pesenko et al, 1985; Matthews, 1987/. Учитывая это обстоятельство, а также факты, изложенные выше, вполне допустимо предположить, что цАМФ/цГМФ-акгивируемые каналы функционируют как запах-зависимые. Если это предположение соответствует действительности, то изучение свойств каналов даного типа и механизмов управления, в принципе, позволяет проследить путь от мембраны к рецептору запахов и расширить наши представления о механизмах трансдукции пахучих стимулов.

Цель работы. К моменту начала настоящей работы имелась только одна публикация, в которой сообщалось лишь о факте регистрации цАМФ/цГМФ-активируемой проводимости обонятельных рецепторов /NaKamura & Gold, 1987/. Поэтому целью настоящей работы . было изучение основных свойств каналов данного типа, без чего невозможно приступать к исследованию механизмов управления их активностью.

Научно-практическая ценность. Впервые зарегистрированы ЩШФ/цГМФ-активируемые каналы обонятельных рецепторов лягушки и карпа, изучены их свойства, в том числе и на уровне одиночных каналов. Впервые исследована селективность каналов данного типа и действие блокаторов - l-cis-дилтиазема и 3',4'~ дашюробензамила. Разработана кинетическая модель, объясняющая закономерности кинетического поведения цАМФ/ЦГМФ- активируемых каналов карпа. Полученные результаты расширяют существующие представления о ион-транотортирующих системах обонятельных рецепторов позвоночных и механизмах их управления.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 4 работах. Основные результаты были доложены на Всесоюзном .симпозиуме "Монные каналы в биологических мембранах" (Кара-Даг, 1990), на VII Симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва, 1992).

Структура и объем'работы. Диссертация изложена на tyf- стр., состоит из введения, обзора литературы, изложения собственных экспериментальных данных, обсуждения результатов и выводов, а также приложения, содержащего описание использовавшихся в рабоде методов и материалов. Список цитированной литературы содержит наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Метод patch clamp. Суть метода состоит в следующем. К поверхности клетки прижимается стеклянная мшсрогшпетка о кончиком » 1 мкм и давление в ней устанавливается ниже атмосферного. Это приводит к втягиванию в пипетку фрагмента клеточной мембраны и

г.

кзразованию (при определенных условиях) весьма плотного контакта 18вду стеклом и мембраной. Последнее позволяет оторвать фрагмент [емОраны под пипеткой и исследовать его свойства в полностью .онтролируемых условиях.

Выделение обонятельных.клеток. Обонятельный эпителий помещался раствор трипсина (0.5 мг/мл) состава (мМ): NaCl - 100; MgCl2~ 1; аС12 -0.1; глюкоза - 5; Na - пируват - 5; HEPES - 5; рН 7.5. осле инкубации в течении 5 минут раствор трипсина удалялся и кань промывалась рингером и несколько раз пипетировалась. олученный препарат содержал большое количество одиночных клеток, том числе рецепторных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Интегральная цАМФ/цГМ5-активируемая проводимость

1.1 Феноленология действия циклических нуклеашидов.

В отсутствие цАМФ или цГМФ в тестовом растворе проводимость роводимости системы электрод-фрагмент мембраны (далее просто ?тч) была невелика и обычно лежала в пределах 50-200 пСм.Если 1утриклеточная сторона пэтча омывалась раствором, содержащим ташческие нуклеотиды (I0~6-I0-5 М), то проводимость пэтча гщественно возрастала. Увеличение проводимости было обратимым и >гло воспроизводиться многократно добавлением нуклеотида в ютовый раствор или его удалением. Следует особо отметить, что зфекты циклических нуклеотидов имели место' в отсутствии ■клеозидтрифосфатов, т.е. не были опосредованы процессами юфорилирования.

Т.о., на мембране обонятельных рецепторов функционируют ионные налы, непосредственно активируемые цАМФ и цГМФ (AG-каналы).

1.2 Влияние Саг+ и Mg24".

Ионы Саг+ и Mg2"1" являются проникающими блокаторами AG-каналов, оводимость которых по этой причине не превышает 1 пСм при зиологических условиях. Это обстоятельство, а также низкая этность AG-каналов приводят к тому, что при физиологических нцентрациях Са2+ и Mg2"1" цАМФ или цГМФ весьма незначительно зличивают проводимость inslde-out фрагментов мембраны тела этки и дендрита. -Следует отметить, что, хотя плотность -каналов существенно выше на обонятельных цилиях, размеры ?ледних ( диаметр « 1/3 мкм) не позволяют проводить достаточно Активных экспериментов. В связи с этим, для повышения точности

3.

и эффективности экспериментов цАМФ/цГМФ-активируемая проводимость (Ай-проводимость) тела клетки и дендрита обонятельного рецептора исследовалась, в основном, в среде, не содержащей Са2+ и - в этом случае АС-проводимость обонятельных клеток более чем на порядок выше, чем при физиологических условиях.

. 1.3 Концентрационные ваВисьлости.

Циклические нуклеотиды дозозависимым образом увеличивают ионную проницаемость наружной мембраны обонятельных клеток. На рис.1 и 2 представлены типичные вольтамперные (ВА) характеристики пэтчей

£

Рис.1. а-ВА-характеристики inside-out фрагмента мембраны обонятельного рецептора карпа при различных концентрациях цГМФ (цифры _ справа от кривых). По обе стороны мембраны (мМ): NaCI-ЮО; ЭГТА-0.5; ЭДТА-0.5; HEPES-10;рН 7-5 б- Зависимость нормированного AG-тока от концентрации цАМФ ( В А О О ) и цГМФ (V Д). Непрерывная кривая соответствует уравнению Хил-ла с п=1 .пунктирная - п=2.

-8

чАМфжМ

45

О

ад

[цАМФУКр

а: I ю ю

обонятельных клеток карпа и лягушки при различных концентрациях цАМФ/цГМФ и соответствующие зависимости цАМФ/цГМФ-активируемого тока (АС-ток) от концентрации агониста. пА а

8ВгцП»,ЫКИ

_I ыВ

I/I

0.5

• - вВгцПН

• - цП»

ЦШЭ

1в(мшс,/л)

-6

-5

-4

-Э

Рис.2. а-ВА-характеристики inside-out фрагмента мембраны обонятельной клетки лягушки при различных концентрациях вВгцГМФ. По обе стороны мембраны (мМ): NaCI-ЮО; ЭГТА и ЭДТА-0.5; HEPES-10;рН 7.5 б- Зависимость нормированного AG-тока от концентрации агонистов.

1

Существует несколько линейных анаморфоз, в которых принято 'писывать концентрационные зависимости взаимодействия лиганда и юцептора. В частности,линеаризация зависимостей в координатах илла используется для определения числа молекул лиганда, вязывагацихся с молекулой рецептора, которое принято арактеризовать коэффициентом Хилла.

Описанные выше концентрационные зависимости аппроксимировались равнением Хилла:

де А - концентрация агониста (цГМФ, ЗВгцГМФ или цАМФ); I(А) и тах- Ав-ток при данной концентрации агониста и максимальный С-ток; п - коэффициент Хилла; К1/г- концентрация половинного ффекта. Средние по всем экспериментам данные представлены в аблице 1.

Таблица 1. Параметры уравнения Хилла.

8ВгцГМФ

цГМФ

цАМФ

Ав-проводимость К . ,мкМ 0.8 ± 0.17 2.1 + 0.4 обонятельных п 1Д+П? 13

клеток лягушки 4 ~

0.2

АО-проводимость обонятельных клеток карпа

К1/2,мкМ

********** 0.9 + о.З ********** 1.12±0.05

3.4 ± 0.5 1.5 ± 0.3

1.3 ± 0.6 1.07±0.15

1.4 Селективность АО-ианалов.

В специальной серии экспериментов измерялись сдвиги потенциала эверсии Ав-тока, обусловленные изменением ионного состава с ятоплазматической стороны фрагмента мембраны , и расчитывались гносительные коэффициенты проницаемости одновалентных

зтионов на основе уравнения

АУ=(ЙТ/Р)Щ(Р11ааЫа/Рхах)

це Рх и ах- коэффициент проницаемости и активность соответствую-эго иона.

Уменьшение вдвое концентрации ЫаС1 с цитоплазматической стороны загмента мембраны обонятельных клеток приводило к сдвигу этенциала реверсии АС-токов на 16-18 мВ в область положительных этенциалов. Это свидетельствует о исключительно катионной элективности АС-каналов.

Замена Иа с цитоплазматической стороны пэтча на другие катионы

5.

приводит к незначительному сдвигу потенциала реверсии Ай-токов (рис 3) Это говорит о том,что описываемые каналы примерно в равной степени транспортируют одновалентные катионы.

Рис.3 а - Сдвиги потенциала реверсии АО-тока лягушки, вызванные заменой 100 мМ МаС1на 100 мМ ЫС1,КС1, ЙЬС1 или СбС1. В пипетке 100 мМ ЯаС1. Везде (мМ): ЭГТА-0.5;ЭДТА-0.5;НЕРЕБ-5; рН 7.5. Во всех случаях 10 мкМ цАМФ.

-20 0 20

Для AG-каналов обонятельных рецепторов карпа средние по четырем экспериментам сдвиги потенциала реверсии AG-тока, вызванные заменой NaCl на КС1,ЫС1,НЬС1 или CsCl были равны,соответствэно, 0.9±1.5;1.3±1 -2; 9.9±1.8; 13.5+3.2 мВ, что дает следующий ряд селективности с учетом коэффициентов активности ионов:

PNa:PK:PIi:FRb:FCS=1:0-98:Q-94:0-TO:0-61

Для AG-каналов лягушки:

PNa:PLi:PRb:PCB=1:0-91:0-78:0-68

Помимо одновалентных катионов AG-каналы обонятельных клеток эффективно транспортируют и двухвалентные катионы, причем для лягушки:

Са > Na4 > Mg24 > Ваг+

Отметим, что сдвиги потенциала реверсии AG-тока обонятельных клеток лягушки при замене NaCl на КС1 не удалось точно измерить из-за большой плотности К+-каналов на мембране данных клеток. Однако, можно уверенно утверждать, что в данном случае этот сдвиг не превышает 10 мВ, т.е. AG-каналы обонятельных клеток лягушки хорошо проницаемы и для К+. Следует также отметить, что оценить проницаемость AG-каналов обонятельных клеток карпа для двухвалентных катионов не удалось. Причина этого - весьма незначительная величина циклонуклеотид-зависимой проводимости этш клеток в присутствии Са£+ или 6.

1.5 Действие блокаторов.

Блокэторы яйляются мощным инструментом исследования ионного транспорта. В связи с этим было весьма интересно найти блокаторы шисываемых каналов и изучить их действие. Как оказалось, 1-с{з хилтиазем и производное амилорида - дихлоробензамил (ДХБА) в яшромолярных концентрациях блокировали АС-ток с датоплазматической стороны мембраны (Рис.4).

Рис.4 Вольт-амперные характеристики АО-проводимости лягушки при. различных концентрациях дилгиазема и ДХБА. 20 мкМ цГМФ. По обе стороны мембраны (мМ): ИаС! -100; ЭГТА -0.5 ; ЭДТА-0.5; НЕН'ЕЗ-10;рН 7.5

В задачу настоящей работы не входило подробное исследование [ействия блокаторов на АО-проводимость, тем не менее, некоторые ¡анные заслуживают внимания.Прежде всего о кинетике действия ¡локаторов. Эффекты дилтиазема были обратимыми и развивались со жоростью смены растворов - это говорит о том, что блокатор ¡.ействует из водной фазы. В противоположность этому, эффекты ДХБА взвивались медленно и достигали плато за 1-3 мин.Действие ¡локатора было обратимым, но фаза отмывания была весьма [родолжительной (10-15 мин). По всей видимости, столь медленная :инетика действия ДХБА (с учетом его гидрофобности) :видетельствует о том, что данный блокатор накапливается в юмбране и воздействует на Ай-каналы из лшшдной фазы.

2. Одиночные каналы цАМФ/цГМФ-активируеыые каналы

Наиболее полную информацию о свойствах каналов дает регистрация ктивности одиночных каналов, поэтому помимо интегральной О-проводимости, параметры которой описанны выше, мы исследовали и диночные АС-каналы.

2.1 Распределение каналов.

АС-каналы распределены неравномерно по поверхности клетки. На еле клетки и дендрите плотность АС-каналов карла не превышает 1

7.

•40 40

—2 —? мкм ,а лягушки 4 мкм ; на цилиях их плотность как минимум на два

порядка выше.

2.2 Проводимость каналов.

При физиологических концентрациях Са2+ и блокируют

прохождение одновалентных катионов через Ав-каналы. В этих условиях активность одиночных каналов не детектируется, однако, можно оценить их эффективную проводимость. Идея состоит в том, что среднее (I) и дисперсия (Б) тока, текущего через ансамбль идентичных каналов связаны соотношением:

Б/1 = 7У(1-Ро)

где 7 - проводимость одиночного канала, V - мембранный потенциал, Р - вероятность найти канал в открытом состоянии. Используя данное соотношение мы пришли к заключению, что эффективная проводимость Ай-каналов и карпа и лягушки не превосходит 0.5 пСм в присутствии Са2+ и Если по обе стороны мембраны двухвалентные катионы

отсутствуют, то проводимость одиночных каналов возрастает на два порядка и становится вполне детектируемой.

Как уже отмечалось, плотность АС-каналов на мембране обонятельной клетки лягушки составляет 1-4 мкм-2, поэтому для обычно использовавшихся электродов (диаметр ^ 1мкм) в пэтче функционировало много АО-каналов. Активность одиночных каналов в этом случае можно было наблюдать лишь при низких концентрациях агониста (рис.5). Плотность АС-каналов обонятельных рецепторов карпа ниже в 2-5 раз, поэтому в ряде случаев в пэтче функционировал ровно один АС-канал. Это обстоятельство позволило исследовать активность канала в - широком диапазоне концентраций

Рис.5 а - реакция inside-out фрагмента обонятельного рецептора лягушки на аппликацию цАМФ и цГМФ. По обе стороны мембраны (мМ): ИаС1-100;ЭГТА и ЭДТА-0.5; HEPES-1О;рН 7.5 Полоса 0-2 кГц;-50мВ

агониста.

0.5мкМ цГМФ 0.5мкМцАМФ

30 с

г

2пА

Юме

Используя хорошо разрешенные флуктуации тока через одиночные Ав-каналы (рис.ба), можно оценить их амплитуду при различных потенциалах. Результаты таких экспериментов для АС-каналов карпа представлены на рис.66. Линейная регрессия дает проводимость 51±9 пСм. Для лягушки аналогичные эксперименты дали оценку проводимости Ав-канала в 19+5 пСм, т.е. величину, почти в три раза меньшую.

40

-40 ЛЛч/иГ^

Юме |^4пА

Рис.6 а - Флуктуации тока через одиночный Ай-канал карпа при различных потенциалах. По обе стороны мембраны (мМ): ЫаС1-100;ЭГТА и ЭДТА-0.5; НЕРВЗ-10; рН 7.5 б- ВА-характеристи-ка открытого канала

2.3 Вероятность открытого состоегния Ж?-данало6 карпа.

Обычно в пэтче обонятельных рецепторов карпа функционировало

ряде экспериментов

юсколько АС-каналов и лишь в

наблюдалась

активность ровно одного АО-канала. Тем не менее, относительно шзкая поверхностная плотность АО-каналов карпа и их высокая 1роводимость позволили достаточно подробно исследовать активность этих каналов при различных концентрациях

цАМФ.ккМ

ао!

агонистов.

ЧГ

\

2пА] 20МС

" ' Г

'■УчЧН«

Рис.7 Флуктуации тока через одиночный Ай-ка-нал карпа при различных концентрациях цАМФ. Полоса 0-2000 Гц -40 мВ.

На рис.7 представлены результаты эксперимента, когда в пэтче функционировал ровно один АС-канал. Как и для большинства каналов биологических мембран активность Ай-каналов носит пачечный характер, т.е. акты открывания канала сгруппированы в пачки (береты).Обращает на себя внимание то обстоятельство, что при насыщающих концентрациях цАМФ канал практически не флуктуирует Это может означать, что АО-каналы, связав молекулу агониста, пребывают все время в открытом состоянии до ее десорбции.

В ряде экспериментов определялась вероятность найти канал в открытом состоянии (Р ) при различных концентрациях агониста. Данные по совокупности всех экспериментов представлены на рис.8 из которого видно, что при насыщающих концентрациях агониста Ро стремиться к 1. Отметим, что аналогично интегральной АО-проводимости карпа, зависимость Ро от концентрации агониста хорошо аппроксимируется уравнением Хилла с коэффициентом, близким к 1 .

1.0

0.5

0.0

Pf

Рис. 8 Зависимость Р от о

концентрации цАМФ, Непрерывная кривая соответствует уравнению Хилла: (а/К.

[цАМФ]/К

h

р = о

где а

1 /2 '

1+(a/K1/2i [цАМФ.], п=1

0.01 0.1 1 10 100 1000

В настоящий момент опубликовано достаточно много работ, в которых исследовались циклонуклеотид-зависимые (CN) каналы различных рецепторных клеток. Ни в одной из них не отмечается поведение каналов при насыщающих концентрациях агониста, подобное обнаруженному наш в случае карпа. Так, CN-каналы обонятельных рецепторов саламандры /Zufall et а1,1991/ или CN-каналы фоторецепторов позвоночных /Matthews'& Watanabe,1988; Zhainazarov & Kolesnikov,I990;Haynes & Yau, 1990/ флуктуируют мевду открытым и закрытым состояниями во всем диапазоне концентраций агониста.Эт приводит к тому, что PQ даже при насыщающих концентрациях цГМ заметно меньше 1. Максимальная величина PQ для CN-каналов НСП жаб составляет 0.42 /Matthews & Watanabe 1988/, а для НСП саламандры 10.

НС колбочки золотой рыбки она равна 0.7-0.9 /Haynes & Yaw, 1990/. Для AG-каналов карпа максимальное значение PQ составляло 0.98 при 200 мкМ цАМФ и при этом явных флуктуаций канала практически не наблюдалось. В настоящий момент неясно, означает ли это, что кинетическое поведение AG-каналов обонятельных рецепторов, карпа и других CN-каналов принципиально отличаются. Возможно,что характерные времена флуктуаций AG-каналов при насыщающих концентрациях цАМФ не превышают 10~5 сек и их невозможно разрешить.

2.4 Кинетические параметры АО-каналов карпа.

Регистрация одиночных AG-каналов позволяла исследовать их кинетические характеристики при различных концентрациях цАМФ - распределение времен жизни канала в открытом и закрытом состояниях (т и тс),а также продолжительность беретов (ть).

На рис.9 показаны распределение упомянутых выше времен при 100 яМ и 1 мкМ цАМФ. Из распределений видно, что с ростом концентрации Ш® увеличивается число продолжительных открываний канала (рис.9 а,в) и,наоборот, сокращается число продолжительных закрываний канала (рис.9 б).

Рис.9 Распределение То (а), Тс (б) и (в) при 100 нМ ( □ ) и 1 мкМ (▼) цАМФ. Данные аппроксимировались суммой двух экспонент (непрерывная и пунктирная линии): ]?(1;)=Аехр(-'1;/'1;1 )+Бехр(-'Ь/гг). 100 нМ:а--г1=0.71,Т2=1.94;б- т., =0.26, тг=2.35;в- ^=0.32 Лг=2. .01 1 мкМ:а- т1=Ю.28,гг=1.8;б- т =0.25,т;2=1 .52;в- т =0.3б,тг=3.08; все времена даны в мс.

Результаты анализа флуктуаций АО-канала суммированы в таблице 2, [3 которой видно, что среднее время жизни в открытом состоянии и шина берета растут,а среднее время жизни в закрытом состоянии ■меньшается с увеличением концентрации агониста. Для сравнения

11.

отметим, что среднее время жизни открытого состояния цГМФ-активируемых каналов фоторецепторных клеток не зависит от концентрации цГМФ (Matthews & Watanabe, 1988).

Таблица 2. Средние времена жизни AG-канала.

[цАМФ] хо(мс) тс(мс) -т (мс)

10 HM 1.3 ± 0.2 63.7 ± 10.6 4.5 ± 0.7

100 НМ 1.9+0.9 . 6.4 + 2.8 4.7 + 0.4

1 мкМ 8.5 ± 4.1 2.7 + 1.2 24.6 ± 5.4

10 мкМ '20.2 + 2.6 0.62 ± 0.31 252 ± 93

2.5 Действие ДХБА на функционирование одиночных Ай-каналов.

Как уже упоминалось выше, ДХБА подавлял интегральные АС-токи. Е основе блокирования может лежать либо уменьшение проводимости каналов, либо уменьшение вероятности найти канал в открытом состоянии, либо обе эти причины. На рис Ю показаны флуктуации Ав-тока, текущего' через группу каналов. Видно, что по мере увеличения концентрации ДХБА уменьшается вероятность найти канал е открытом состоянии при неизменной амплитуде тока . через одиночный канал.

•S

з 2

ч

X X

0 -Л

Рис.10 Флуктуации АО-токг при различных концентраци ях ДХБА. Потенциал -30 мЕ 2 мкМ цАМФ; полоса 2 кГц.

ДХБА.мкМ

2.6 Кинетическая лоделъ АО-каналов обонятельных клеток карпа,

АС-каналы обонятельных рецепторов карпа, описанные выше, по своим свойствам, в основном, схожи с циклонуклеотид-активируемыми каналами других рецепторнных клеток, в том числе и с Ав-каналами лягушки. Неожиданностью оказалось то обстоятельство, что средний Ав-ток и Р в координатах Хилла пропорциональны первой степени 12.

концентрации агониста.Если придерживаться традиционной интерпретации этого факта, то следует принять, что для активации CN-каналов требуется одна,молекула цАМФ или цГМФ. В этом,возможно, проявляются какие-то существешше отличия кинетического поведения AG-каналов обонятельных клеток карпа от AG-каналов жабы / Nakamura % Gold, 1987/, лягушки /Kolesnikov et al, 1990/ и тритона /Kurahashi,1990/, а также CN-каналов - фоторецепторных клеток, для активации которых требуется не менее двух молекул агониста /Fesenko at al,I985;Haynes et al,1986; Zimmerman & Baylor,1986; Matthews & Vatanabe,1988;Haynes & Yau,1990/.

Кинетическое поведение агонист-зависимых каналов обычно интер-третируется с помощью кинетической модели переходов канала между состояниями. По-видимому, первой из них была схема Дэль Кастилло и Сатца /Del Castillo & Katz, 1957/, предложенная для объяснения »ффектов ацетилхолина (Ail) на мембранный потенциал концевой шшс-'инки :

R <=• AR <=> AR* (I)

'де закрытое состояние Ah-рецептора обозначено R, открытое R*, а цетилхолин обозначен как А. Для такой схемы взаимодействия эгоиста и канала вероятность найти канал в открытом состоянии PQ как ункция концентрации Ah описывается уравнением Хилла с коэффициен-ом равным 1.Среднее время открытого состояния и длина берета в том случае не зависят от концентрации агониста /Colquhoun & Haw-ез,1981/. В нашем случае эти параметры зависят от концентрации АМФ (см. Таблицу 2), и поэтому приведенная выше схема не может ить использована для объяснения свойств AG-каналов карпа. В то же ремя, кооперативный механизм взаимодействия агониста и канала ает зависимость среднего времени открытого состояния и берета от энцентрации агониста /Colquhoun & Hawkes,1981/, и, следовательно, эк минимум две молекулы цАМФ или цГМФ необходимы для активации Ч-каналов.. При этом, однако,схема взаимодействия агониста и кана-з должна быть такова, чтобы лианеризация в координатах Хилла кон-знтрационных зависимостей давала коэффициент Хилла порядка 1.

Из всех последовательных моделей взаимодействия двух молекул ■"ониста с каналом наилучшим образом экспериментальные данные опи-тает следующая:

к1 * ß h *

r Л AR* AR ApR (2 )

kg a k4

;e R,AR and AR* имеют тот же смысл,что и в приведенной выше схеме ),а AgR* - открытое состояние канала при связывании двух молекул

13.

агониста. Отметим, что проводимости канала в состояниях AR* и AgR* предполагаются одинаковыми. В задачу настоящей работы не входило полное исследование свойств модели (2), тем не менее , некоторые выводы можно сделать уже сейчас. Во-первых, при такой схеме взаимодействия агониста и канала его активность носит Оерстовый характер. В данный момент мы не можем указать по какому закону среднее время в открытом и закрытом состояниях, а также длительность берета зависят от концентрации агониста, однако, такая зависимость этих величин - внутреннее свойство рассматриваемой модели (2) /Colquhoun & Hawkes,1981/. Далее, рассматриваемая модель может правильно предсказывать поведение канала в предельные случаях.Напримэр, если предположить,что kg » (3 ,то при малыг концентрациях агониста активность канала будет проявляться ,i основном, в виде одиночных открываний, 'а берстовый xapaKTej флуктуаций будет возникать при умеренных концентрациях. I эксперименте при 10 нМ цАМФ 80% открываний канала были одиночными v лишь 20% в виде беретов. При повышении концентрации цАМФ активност! канала приобретала, в основном, берстовый характер (рис.7 ). Для модели (2) PQ дается выражением:

Po=ak1 (pic3a+ak4)/(a2pk1k3+ak1k4(a+p)+ak2k4) (3)

где а-концентрация агониста А. Заметим, что Р =» 1 при а => <». Простые преобразования дают:

P0/(1-P0)=a(k3/ki)(1+(a/k3)(k1k4-lc2k3)/(p Ца+alc,)) (4)

Если в выражении (4) величина

В = 1 + (cx/k3)(k1k/t-k2k3)/(p ^а+сОс.) (5)

практически не зависит от а во всей экспериментальной области концентраций агониста то

Ро/(1-Ро) = а(к3/кд)В = const*a (6)

Соотношение (6) означает, что в координатах Хилла PQ как функци? концентрации агониста линеаризуется с коэффициентом 1.

Отметим два очевидных случая когда величина В практически не зависит от концентрации. Прежде всего, если

!k1 кд- к^кз! « т.е. ¡к/к3- к£/к1! « к2/к1 (7)

то В = 1. Соотношение (7) будет выполняться, если обе молекулы агониста связываются с одинаковым сродством. Далее, если

р k1a « akg т.е. а « (a/pKkg/k.,) (8)

то величина В = /к^

До некоторой, степени эта модель была проверена следующим образом. Экспериментальные значения Ро аппроксимировались с использованием соотношения

Ро=а(а+т)/(а2+ра-^) (9)

которое является следствием уравнения (3) _и где ш=ак.д/(Зк3,р=К.4(а+Р)/к3р /рк Оказалось,что оно с хорошей

точностью описывает зависимость Р от концентрации цАМФ (Рис.11).

Рис.11 Зависимость Р от о

концентрации цАМФ.Экспериментальные данные (О ) аппроксимировались уравнением Хилла с К1/г=0.34 мкМ и п-1 (непрерывная

кривая) и уравнением (V)

о

Р0=а (а-нв)/ (а"+па+р) т=3.66 мкМ, р=3.81 мкМ, q=^\. ЗЗмкМ2

Итак, в настоящей работе были исследованы цАМФ/цГМФ-активируемые аналы обонятельных- рецепторов карпа Cyrpivua carpió и лягушки Pono emporarla. AG-каналы и карпа и лягушки характеризуются общим абором свойств - они примерно в равной степени активируются цАМФ цГМФ, эффективно транспортируют катионы щелочных металлов и роницаемы для двухвалентных катионов, блокируются дилтиаземом и ихлоробензамштом, локализованы преимущественно на обонятельных алиях. Идентичным набором свойств характеризуются запах-зависимые аналы обонятельных рецептроЕ, как это следует из литературных энных. Таким образом, скорее всего именно AG-каналы функционируют i vivo как запах-зависимые.

Как уже отмечалось выше, ряд фактов свидетельствует о том, что юзитольная система может быть вовлечена в трансдукцию запахов. )ЗМожно, что AG-каналы находятся под контролем и инозитольной :стемы. Активация фосфолипазы-С приводит к увеличению нцентрации 1Р3 и диацилглицерина, что может вызвать имобилизацию 2+, активацию киназы-С и ряд других процессов /Berridge, Irvine, 89/. Из полученных в данной работе результатов следует, что

15.

0.01 0.1 1 10 100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

изменение цитоплазматической концентрации Са2+ на фоне физиологических концентраций Mg24" не приводит к изменению AG-проводимости. В ряде экспериментов с цитоплазматическая сторона inside-out фрагментов обонятельных рецепторов инкубировалась в растворах, содержащих 0.5 - 1.5 мкМ IP . Ни в одном из таких экспериментов IP не оказывал сколь-нибудь заметного действия на активность AG-каналов. Таким образом, инозитольная система не может регулировать активность AG-каналов- путем изменения концентрации Са2+ или IP . Возможно, что AG-каналы фосфорилируются киназой-С, возможно, инозитольная система регулирует собственную ион-транспортиругацую систему. Эти и другие вопросы, касающиеся взаимоотношения AG-каналов и инозитольной системы, требуют специальных экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Методом patch clamp на плазматической мембране обонятельных рецепторов карпа и лягушки зарегистрированы катионные каналы, активируемые цАМФ и цГМФ.

2. Показано, что циклические нуклеотиды обратимо активируют соответствующие каналы в микромолярном диапазоне концентраций. Зависимости доза-эффект выявляют кооперативное взаимодействие циклических нуклеотидов и каналов - не менее двух молекул агониста требуется для их активации. Эффекты циклических нуклеотидов имеют место в отсутствие нуклеозидтрифосфатов, и, следовательно, не опосредованы процессами фосфорилирования.

3. Установлено, что цАМФ/цГМФ-активируемые каналы примерно с равной эффективностью транспортируют катионы щелочных металлов и проницаемы для ионов Са2+ и Wg24.

4. Показано, что в присутствии двухвалентных катионов проводимость цАМФ/цГМФ-активируемых каналов не превышает 0.5 пСм. В отсутствии Саг+ и Mg24 проводимость каналов в 0.1 М NaCl составляет 51 и 19 пСм, соответственно для карпа и лягушки.

5. Установлено, что дилтиазем и дихдоробензамил являются блокаторами AG-каналов. В случае карпа изучено действие дихлоробензамила на активность одиночных AG-каналов и показано, что блокатор уменьшает вероятность открытого состояния при неизменной проводимости канала.

6. Изучены кинетические характеристики флуктуаций одиночных цАМФ/цГМФ-активируемых каналов при различных концентрациях агониста. В случае обонятельных рецепторов карпа предложена модель с четырьмя состояними, объясняющая наблюдаемые закономерности поведенкя цАМФ/цГМФ-активируемых каналов.

16.

По материалам диссертации опубликованы работы

1.Колесников С.С..Жайназаров А.Б..Косолапов А.В. цГМФ-активируемые каналы рецепторных клеток. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах", Кара-Даг, 1990,стр. 34.

2.Kolesnikov S.S..Zhainazarov А.В..Kosolapov A.V.Cyclic nucleotid-activated channel in frog olfactory receptor plasma membrane. FEBS Le 11 ers,1990,V.266,pp.96-98.

3.Kolesnikov S.S..Zhainazarov А.В.,Kosolapov A.V.Cyclic nucleotid-activated channel of frog olfactory receptor cell plasma membrane. 1990, 10 school on biophysics of membrane transport. Proceedings, Poland, Szczyrk, 1990, p.272.

4.Косолапов А.В..Колесников С.С. цАМФ/цГМФ-активируемые каналы обонятельных клеток. Сенсорные системы,1992,Т.6,стр.120-123.

Зак.5182Р Тир.70 экз. Уч.-изд.л: 1,0

29.10.92 г.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН