Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб

Гдовский, Петр Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб"

На правах рукописи

ГДОВСКИЙ ПЕТР АНАТОЛЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ РЫБ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ I диссертации на соискание ученой степени

I доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2005

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РМАН

Владимир Алексеевич Отеллин доктор биологических наук, профессор

Александр Ованесович Касумян доктор биологических наук Анатолий Александрович Мокрушин

Ведущая организация: Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской Академии Наук

Защита состоится «10» мая 2005 г. в_уо__часов

на заседании специализированного диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова Российской Академии Наук (ИЭФБ И.М. Сеченова РАН) по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФБ им. Сеченова РАН.

Автореферат разослан рс ¿< /> е и ^_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

WM з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обонятельная система (ОС) животных формировалась как сигнальная система. В отличие от других сенсорных сигнальных систем (зрительной, акустической), перед ней стояла труднейшая задача: воспринять множество значительно различающихся по химической структуре веществ, выделить из них определенную группу в виде обонятельного образа, запомнить и в дальнейшем узнавать его, какое бы ни было химическое окружение. Для решения столь трудной задачи в геноме млекопитающих отведено только на кодирование обонятельных рецепторных (ОР) белков 3% генов (одна тридцатая генома!), что сравнимо только с иммунной системой (Mombaerts, 1999, 2001). Сложнейшая задача восприятия и расшифровки мира запахов обусловила консервативность стратегии построения ОС в филогенезе животных (Ache, 1994; Krieger, Breer, 1999).

Принцип организации ОС у животных филогенетически далеких таксонов (моллюски, насекомые, десятиногие раки и позвоночные) одинаков. Столь удивительная общая морфологическая схожесть ОС, не гомологичной по происхождению, у этих животных определяется, во-первых, каскадом генов раннего развития и транскрипции - Нох, Dix и Pax, которые у них гомологичные (Franco et al., 2001; Ledje et al., 2002; Levi et al., 2003; Long et al., 2003; Nomura, Osumi, 2004) и, во-вторых - конвергентной адаптацией (Eisthen, 2002). Построение ОС у животных различных филогенетических групп подобное, но не идентичное. Различия наблюдаются как на молекулярном, так и на морфологическом уровне. К настоящему времени накоплено много примеров, показывающих, что у очень далеких таксонов молекулярное обеспечение и морфологическое построение ОС близко, а у филогенетически родственных несколько отличается (Shirsat, Siddiqi, 1993; Krieger, Breer, 1999; Strausfeld, Hildebrand, 1999; Zufall et al., 2000; Scott et al., 2001; Sullivan, Beltz, 2001; Eisthen, 2002; Sachse, Galizia, 2002).

Среди позвоночных животных большой интерес, вследствие филогенетического положения и адаптивных возможностей, представляют костистые рыбы. Это самая большая группа позвоночных, включающая приблизительно 24 000 видов и

юс tMUiiOH'WibHAfl

BK£>«»<Uï£kA

СЛ1йт«р6>рг ЛМ^РК _

составляющая больше, чем 99 % Actinopterygii, лучеперых рыб (Taylor, 2001; Venkatesh, 2003; Christoffels, 2004).

Несмотря на большое сходство у позвоночных двух филогенетических линий - Actinopterygii и Sarcopterygii, построение ОС несколько различается анатомически, морфологически и, по-видимому, нейрохимически, что связано с задачами системы и средой обитания. ОС Sarcopterygii, особенно у млекопитающих, изучена более подробно, чем ОС Actinopterygii. Прогресс ОС в обеих группах в первую очередь связан с увеличением количества генов рецепторных белков. Это привело к усложнению морфологической организации обонятельной луковицы (ОЛ). Хотя слоистость ОЛ у костистых рыб выражена менее ярко, чем у млекопитающих, синаптическая организация клубочкового нейропиля не уступает им (Satou, 1990). Однако нейрохимическая организация ОЛ рыб только начинает исследоваться (Edwards, Michel, 2002, 2003), а отдельные работы по изучению распределения холинергических ферментов ОЛ рыб (Northcu, Braford, 1977; Anadon et al., 2000) показывают, что холинергическая система в ОЛ рыб может существенно отличаться от амфибий и млекопитающих. Ионные и молекулярные механизмы трансдукции у рыб также мало изучены (Kaneko et al., 2001; Lipschitz et al., 2002).

Из-за недостаточной изученности ОС костистых рыб невозможно сделать выводы о причинах (адаптация к условиям среды, анцестральные признаки или положение животного в эволюционном ряду) различий в морфологической и молекулярной организации ОС Actinopterygii и Sarcopterygii.

В связи с этим исследования по таким проблемам, как нейрохимическая организация ОЛ, первичные механизмы трансдукции обонятельного сигнала, гомеостаз ионного окружения апикальной части обонятельных рецепторных нейронов и защита её от неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов у костистых рыб, являются актуальным направлением в сенсорной и эволюционной физиологии.

Цель работы: исследовать структурно-функциональную организацию и закономерности формирования обонятельной выстилки и луковицы костистых рыб.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. На гисто- и цитологических уровнях исследовать морфологию и сенсорные функции обонятельного эпителия при воздействии низких значений рН и сублетальной концентрации ксенобитика, 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфата (ДДВФ).

2. Установить концентрацию основных ионов (ТЧа+, К+, С1-) в слизи на поверхности обонятельной выстилки, выяснить механизм, создающий ионный гомеостаз в слизи и установить участвующие в этом процессе структуры.

3. Установить роль ионов натрия, калия и хлора в генерации рецепторного потенциала.

4. Исследовать влияния холинергических и Ж)-ергических веществ на рецепторный потенциал (ЭОГ) у интактных и адаптированных к следовым концентрациям кальция рыб.

5. Провести биохимическое, гистохимическое и цитохимическое исследование распределения ацетилхолинэстеразы (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.8) и холинацетш?рансферазы (ацетил-КоА: холин-О-ацетилтрансфераза, ХАТФ; К.Ф. 2.3.1.6) в обонятельной луковице у рыб различных систематических групп и выяснить роль эндогенного ацетилхолина обонятельной луковицы в процессах восприятия запаха.

6. Сопоставить полученные результаты с имеющимися в литературе данными по затронутой проблеме по другим филогенетическим группам животных и попытаться установить, какие особенности организации ОС костистых рыб обусловлены конвергентной адаптацией, а какие - анцестральными признаками.

Научная новизна. В работе впервые рассмотрена холинергическая нейрохимическая организация ОС рыб. На примере 2 видов костно-хрящевых и 19 видов костистых рыб установлено, что удельная активность АХЭ в ОС рыб зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в ОЛ асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Впервые установлена зависимость удельной активности АХЭ обонятельной луковицы рыб от состояния афферентного входа. Впервые выявлено, что в ОЛ рыб имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. Активность фермента в них зависит от афферентного входа. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки

могут синтезировать ацетилхолин. Впервые показано, что в некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на пре- и постсинаптических мембранах. Исходя из морфологии и расположения в ОЛ, эти синапсы относятся к аксо-дендритным -между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритным - между интернейроном и релейным нейроном. Впервые установлено, что в О Л рыб содержатся ХАТФ-позитивные нейроны и синапсы. Впервые показано, что в ОЛ рыб имеются М1 и М2 холинорецепторы (ХР). Функциональная активность ХР подтипа М1 проявляется только при запоминании запаха (долговременная посттетаническая потенциация после тетанизации обонятельного нерва), в то время как М2-ХР осуществляют модулирующее влияние на релейные нейроны, участвуя, скорее всего, в первичной обработке обонятельного сигнала. Предлагается гипотеза, согласно которой обонятельная луковица рыб, независимо от степени развития обоняния, имеет собственную холинергическую систему. Впервые установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются специализированные микровиллярные клетки, ответственные за защиту ОВ от ксенобиотиков. Впервые показано, что у пресноводных рыб концентрация ионов хлора в обонятельной слизи сравнима с их содержанием в плазме. Поддержание столь высокой концентрации ионов в слизи, которая непосредственно контактирует с пресной водой, осуществляется специализированными ионтранспортирующими клетками. Впервые установлено, что в возникновении рецепторного потенциала (ЭОГ) ведущая роль принадлежит ионам хлора и кальция и показано, что при дефиците ионов кальция во внешней среде в процессах трансдукции обонятельного сигнала может участвовать Са из внутриклеточных депо кальция.

Теоретическое и практическое значение работы.

Проведенное исследование вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы эволюции развития обонятельной системы у животных. Описанные взаимодействия на клеточном, молекулярном и функциональном уровнях в обонятельной выстилке и луковице костистых рыб свидетельствуют, что у них присутствует много анцестральных признаков. Различия между филогенетическими группами позвоночных обусловлены ходом эволюции и принципиальных отличий в их ОС не наблюдается. Однако по

организации холинергического входа в обонятельную луковицу костистые рыбы резко отличаются от 8агсор1егуди и очень схожи с беспозвоночными. Это еще один пример конвергентной адаптации в развитии обонятельной системы животных.

На основании анализа собственных и литературных данных разработан простой и экспрессный способ определения функционального развития обонятельной и зрительной сенсорных систем у рыб (авторское свидетельство № 1423075).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Защиту апикальной части обонятельного эпителия от ксенобиотиков и излишка одорантов выполняют специализированные клетки эпителия - микровиллярные опорные клетки лимфоидного типа.

2. В рецепторном отделе обонятельной выстилки рыб поддержание ионного гомеостаза обеспечивается специализированными ионтранспортирующими клетками.

3. Ведущим ионом в трансдукции обонятельного сигнала у рыб является хлор. Вследствие повышенной концентрации в рецепторной клетке (за счет электрогенного транспорта), при открытии хлорных кальций-зависимых каналов, он выходит из клетки, в результате чего создается входящий деполяризующийся ток. Хлорными каналами в основном управляют инозитол-1,4,5-трифосфат и ионы кальция.

4. Обонятельная луковица костистых рыб имеет холинергический вход и собственную холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельного сигнала, так и в запоминании запаха.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Представленные в диссертации материалы были доложены на: "Всес. совещании "Сенсорная физиология морских рыб" (Мурманск, 1984); Всес. Конференции "Экология и биологическая продуктивность Баренцевого моря" (Мурманск, 1986); V Всес. конференции по водной токсикологии (Одесса, 1988); VI Всес. симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988); VI Всес. симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва, 1988); Всес. совещании "Хемокоммуникация животных"

(Москва, 1989); X Всес. совещании по эволюционной физиологии памяти JI.A. Орбели (Ленинград, 1990); VII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск,

1992); The 15th Intracenter Workshop. (Columbia, USA, 1992); I Междунар. симпозиуме "Зооиндикация и эктотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта" (Днепропетровск,

1993); International symposium "Chemoreception in aquatic vertebrates" (Noresund, Norway, 1994); II Всероссийском совещании по поведению рыб (Борок, 1996); International symposium on Olfaction and Taste, ХП and AChemS, XIX (San Diego, California, 1997); III междунар. конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних вод европейского Севера" (Сыктывкар, 2003); Междунар. научной конференции "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" (Петрозаводск, 2004).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 39 печатных работах (из которых 25 статей опубликовано в рецензируемых журналах).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Материал диссертации изложен на ^страницах машинописного текста, содержит таблиц, 27 схем и рисунков. Работа состоит из введения, глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы {из отечественных 7И иностранных источников).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе были исследованы особи 21 вида, в скобках указано число исследованных экземпляров. Класс Костные рыбы, Osteichthyes, надотряд Ганоидные, Ganoidomorpha, Сибирский осетр, Acipenser baeri (10), стерлядь Acipenser ruthenus (6), Настоящие костистые, Euoteleostei, стальноголвый лосось Salmo gairdneri (20) сем. Лососевые; щуки Esox lucius (120) сем. Щуковые; окунь Perca fluviatilis (30) сем. Окуневые; тилапия мозамбикская Oreochromis mossambicus (8) сем. Цихлиды; карась золотой Carassius carassius (30), карп Cyprinus carpió (300), плотва Rutilus rutilus (8), лещ Abramis brama (42), синец Abrama ballerus (30), чехонь Pelecus cultratus (12), уклейка Alburnus alburnus (24) и жерех Aspius aspius (4) сем. Карповые; налим Lota lota (12) сем. Налимовые; треска Gadus morhua

(4) сем. Тресковые; камбала Platessa platessa (3) сем. Камбаловые; вьюн Misgurnus fossilis (5) сем. Вьюновые; угорь Anguilla anguilla (4) сем. Угревые; крапчатый сомик Corydoras paleatus (6) сем. Каллихтовые.

Для решения поставленных задач был использован ряд стандартных методов и приемов, которые в большинстве экспериментов использовались комплексно. Такой подход позволил получить оригинальные данные, более полно раскрывающие связь структуры и функции в исследуемых отделах обонятельной системы.

Методы исследования.

1. Электрофизиологические исследования: регистрация электроольфактограммы (ЭОГ), импульсной активности от обонятельных трактов, вызванной стимуляцией обонятельной выстилки одорантом, или суммарного электрического ответа обонятельной луковицы при электростимуляции обонятельного нерва.

2. Спектрофотометрическое определение: АХЭ тиохолиновым методом Эллмана (Ellman et al., 1961), карбоангидразы (KA, К.Ф. 4.2.1.1) по методу Машитер, Морган (Mashiter, Morgan, 1975) в собственной модификации (Гдовский, Ружинская, 1988), никотинамид адениндинуклеотидфосфат-диафорзу (НАДФН-диафораза, НАДФНд) по методу Хоупа (Норе et al., 1991), С1-активируемую АТФазу молибденовым методом (Гдовский и др., 1992).

3. Гистохимическое определение АХЭ, НАДФНд

4. Цитохимическое определение АХЭ, ХАТФ и НАДФНд

5. Определение натрия и калия методом эмиссионной фотометрии в пламени.

6. Определение рСГ методом потенциометрии с селектавными электродами.

7. Препаративные методы: дифференциальное центрифугирование и ультрафильтрация через миллипоровые фильтры.

8. Хронические токсикологические эксперименты в проточных условиях с использованием дилютерной установки для поддержания постоянной концентрации токсикантов в воде (Виноградов, Тагунов, 1989).

9. Световая и электронная микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация к повышенной кислотности. Пресноводные рыбы обитают в водоемах с широким диапазоном значений рН. Это наиболее характерно для карповых рыб: крайние значения рН среды их обитания различаются на 6 порядков. Так, угай (Tribolodon hakonensis) живет в озерах Японии с рН 3.5, а в щелочных (рН 9.4) озерах Тибета обитает гимноциприс Пржевальского (Gymnocypris przewalskii) (Hirose et al., 2003; Wang et al., 2003). Большинство видов рыб живет в более мягких условиях, в воде с рН от 5 до 8. Проблема адаптации рыб к низким значениям рН возникла в середине прошлого столетия в связи с интенсивным антропогенным закислением водоемов. Механизм кислотного стресса у рыб подробно изучен (Виноградов, 1990), и показано, что толерантность организма к низким значения рН лимитируется только способностью осморегуляторной системы адаптироваться к этому фактору среды. Как ведет себя обонятельная система при кислотном стрессе не известно. Показано лишь, что закисление воды, омывающей ОВ форели (Salmo gairdneri и S. trutta), до рН 5 ингибирует ответ на аминокислоты (Thommesen, 1978, 1983; Klaprat et al., 1988).

Нами были проведены исследования поведения обонятельной системы при длительном пребывании карпа в воде с низким значением рН в течение 10 суток. Трехчасовое пребывание рыб в закисленой воде привело к ухудшению восприятия химических стимулов на 30-55%, в зависимости от класса одоранта. Величина ответа на стимуляцию обонятельной выстилки феромоном (запах собственного вида) уменьшилась на 1/3 от первоначального значения, а на стимуляцию 1 мМ раствором d, 1-серина уменьшилась в два раза. Максимальное снижение обонятельной чувствительности приходилось на первые сутки, после чего происходило постепенное восстановление обонятельного восприятия. Карпы, как и другие рыбы, адаптируются к низкому значению рН в течение 7-10 суток - к этому сроку величина обонятельных реакций на стимуляцию одорантами восстанавливается до нормы.

Потеря обонятельной чувствительности сопровождалась снижением рН слизи обонятельного эпителия с 7.25 до 6.85, а восстановление - возвращением этих параметров к норме. Электронно-микроскопические исследования показали, что у рыб,

живущих в нейтральной воде, по всей поверхности обонятельного эпителия отчетливо видны секреторные поры, различающиеся формой и размерами, и все структуры апикальной поверхности ОЭ. После 3-часового пребывания рыб в воде с рН 4.5 поверхность ОЭ начинает существенно отличаться от контроля: рельефный рисунок, отражающий топографию жгутиковых и микровиллярных клеток, не просматривается, так как весь ОЭ покрыт слизью. В зонах рецепторного и нерсцепторного эпителия просматриваются отдельные, довольно крупные гранулы секрета (диаметр 2-3 мкм), количество которых в 10 раз превышает норму (контроль 5-6 гранул на 100 мкм2). Содержимое гранул, растекаясь по поверхности эпителия, скрывает апикальные части клеток обонятельной выстилки. Структурных повреждений апикальных отделов рецепторных клеток не обнаружено. Однако наблюдается выпячивание апикальной поверхности эпителиальных клеток. Это, скоре всего, происходит из-за того, что в зоне нерецепторного эпителия секреторной функцией обладают преимущественно бокаловидные клетки (БК) (Попова, 1971; Бронштейн, 1977), и поэтому выпячивание эпителиальных клеток, по всей вероятности, связано с увеличением объема бокаловидных секреторных клеток, тела которых расположены под слоем эпителиальных клеток. В дальнейшем выделение слизи уменьшается. На 3-й сутки скопления слизи встречаются реже, и только на 7-е сутки с начала воздействия поверхность ОЭ принимает первоначальный вид. Итак, в ответ на снижение рН среды все элементы обонятельной выстилки карпа, обладающие секреторной функцией, повышают уровень своей активности. По всей вероятности, в этот период слизь имеет специфические физико-химические свойства, поскольку не исчезает во время фиксации препаратов, тогда как у рыб, живущих в нейтральной воде, при таком же способе обработки материала она встречается редко и в малых количествах. Ионный состав слизи также претерпевает значительные изменения в ответ на снижение рН среды (рис. 1).

Обращает на себя внимание то, что одновременно с интенсивной секрецией слизи увеличивается концентрация калия, в то время как содержание натрия и хлора уменьшается. Однако в дальнейшем, когда функция обоняния начинает возвращаться к норме и прекращается патологическое слизеотделение, наблюдается снижение концентрации всех элементов в слизи. Это связано, скорее всего, с тем, что в состав

слизи входят мукополисахариды, содержащие связанный калий (Бронштейн, 1977), а ионные формы

N9 к а

Ц'М.

контроль 3 часа бчасой 1 суткй 3 суток 6 суток 12 суто'к

Рис. 1. Влияние закисления воды (рН 4.5) на содержание натрия, калия и ионов хлора в слизи обонятельной выстилки. По вертикали - концентрация, % от контроля. По горизонтали - время пребывания рыб в закисленной воде

исследуемых элементов поступают с помощью специализированных ион-транспортирующих клеток, так называемых хлоридных клеток (Гдовский, Мензиков, Ружинская, 1990, 1991). Известно также, что в жаберном эпителии эти клетки на первых этапах акклимации к низким значениям рН снижают свою функциональную активность (Nieminen, Korhonen, Laitinen, 1982; Hirose et al., 2003).

Кислотно-щелочное равновесие во многих тканях, в том числе и в ОВ млекопитающих, поддерживается карбоангидразой (КА) (Coulson, Herbert, 1984; Brown et al., 1984; Okamura et al., 1996), a химический состав слизи в ОВ амфибий и млекопитающих контролируется вегетативной холинергической нервной системой (Zielinski et al., 1989; Getchell ML, Getchell TV, 1992). Активность К A в обонятельной выстилке у рыб, находящихся 1 сутки в воде с рН 4.5, возрастает почти в 3 раза, и ее уровень зависит от состояния М-ХР структур (табл. 1).

Таблица 1. Влияние атропина и кислой среды на активность карбоангидразы в обонятельной выстилке карпа

Условия опыта Активность карбоангидразы, усл. единицы.

Контроль, рН 7.2 2.6±0.7

рН 4.5, 1 сутки 7.4±0.9*

Атропин 0.1 мг/ кг 2.0±0.8

Атропин 0.1 мг/кг + рН 4.5,1 сутки 1.9±1.0

*- достоверное отличие от контроля при Р < 0.05

Таким образом, адаптация ОЭ карпа к повышенной кислотности происходит за счет формирования слизи с новыми кислотно-основными свойствами, скорее всего с повышенной буферной емкостью. В этом процессе первостепенную роль играют малые секреторные клетки и бокаловидные клетки (БК).

Известно, что у млекопитающих деятельность БК регулируется парасимпатической системой (Ое^та е1 а1., 1992; Ве]ит, 1993; БЫтотига е1 а1., 1996; Каппо е! а1., 2003). На стрессорные воздействия БК не только усиливают свою секреторную активность, но измейяют химический состав слизи (ТасЫЬапа ег а1., 1986, 1991). Таким образом, как у млекопитающих, так и рыб, бокаловидные клетки контролируются некоторыми регуляторными факторами секреторной системы и играют важную роль в назальном физиологическом механизме.

У млекопитающих есть еще одна система защиты ОЭ от воздействия вредных веществ окружающей среды специализированные микровиллярные клетки, экспрсссирующие альфа- и мю- глутатион-8-трансферазу (Г8Т), ферменты, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков. У рыб таких клеток еще не обнаружено. Для выяснения вопроса о структурах, участвующих в защитных функциях, была исследована ультраструктура ОЭ у рыб, подвергшихся хроническому воздействию сублетальной концентрации ксенобиотика.

Роль микровиллярных клеток в детоксикации ксенобиотиков. По данным сканирующей электронной микроскопии, месячная экспозиция рыб в воде, содержащей ДДВФ, не отражается на структуре индифферентного эпителия, однако приводит к некоторым изменениям на поверхности сенсорного. Здесь появляются многочисленные округлые образования, выступающие над уровнем эпителия. Их размер составляет в диаметре 2-3 мкм, что значительно меньше диаметра секреторных гранул и в 2-3 раза превышает размеры обонятельных булав жгутиковых рецепторных клеток. Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что эти образования являются результатом гипертрофии светлых микровиллярных опорных клеток (СмОК) и представляют собой выпячивания апикальных участков цитоплазмы (рис. 2).

Рис. 2. Влияние ДДВФ на ультраструктуру клеток ОВ тилапии. А - сенсорный эпителий через 15 дней воздействия ДДВФ; Б - апикальная часть микровиллярных опорных клеток через 15 дней. Обозначения: ОРН обонятельный рецепторный нейрон, ОЖ - обонятельный жгутик, КЖ - комплексный жгут, СмОК -светлая микровиллярная опорная клетка, МВ - микровилла, ЛМТ - лизосомоподобное микротельце

В ОЭ контрольных рыб СмОК также обнаруживаются. Апикальная мембрана этих клеток образует многочисленные фестоичатовидные выпячивания и микровиллеподобные выросты. Как темные, так и светлые клетки содержат обычный набор органелл -гранулярную и агранулярную эндоплазматическую сеть,

многочисленные митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи и не обнаруживают признаков секретообразования. Их цитоплазма пронизана актиновыми филаментами опоясывающих и тонофиламентами точечных десмосом, которые скрепляют все элементы эпителия в единый пласт. Однако цитоплазма светлых микровиллярных клеток включает в свой состав различные лизосомоподобные органеллы. Среди них наиболее многочисленны лизосомоподобные микротельца размером 0.2-0.4 мкм, имеющие однослойную мембрану и в разной степени заполненные пластинчатыми структурами и мелкими осмиофильными зернами.

Встречаются отдельные мультивезикулярные тельца, а также окаймленные пузырьки. "Щетинистая" оболочка прозрачных пузырьков выглядит относительно "пушистой", а оболочка электронноплотных - имеет более жесткую "щетинку", сходную с "корзинками" окаймленных пузырьков в синаптических элементах нервной ткани. И те и другие, обычно располагаются вблизи базолатеральных мембран. Их матрикс содержит большое количество рибосом, расширенные цистерны агранулярного эндоплазматического ретикулума и лизосомоподобные осмиофильные микротельца. Количество последних заметно возрастает и в основном объеме этих клеток. По сравнению с нормой значительно чаще встречаются мультивезикулярные тельца и окаймленные пузырьки. Такая картина сохраняется в течение всего срока воздействия ДДВФ. Никаких изменений в структуре рецепторных элементов и в опорных клетках жгутикового типа не обнаружено.

Согласно результатам цитологических (Бонашевская, 1975; Miller et al., 1995; Farrari et al., 1995, 2000) и иммунноцитохимических (Rama Krishna et al., 1995) исследований, основная роль в процессах биотрансформации и детоксикации в ОЭ млекопитающих принадлежит микровиллярным опорным клеткам. TST является основным ферментом второй фазы детоксикации вредных веществ и составляет большое семейство, состоящее из 9 классов. Основными считаются альфа, мю, пи и тета классы. В обонятельном эпителии млекопитающих экспрессируются альфа и мю классы и только в несенсорных клетках (Rama Krishna et al., 1995), а в ОЭ форели найден один пи класс и только в сенсорных клетках (Starcevic, Zielinski, 1997). Как сейчас установлено, в тканях рыб экспрессируются только пи и тета классы TST. Тета класс наиболее близок к анцестральному

ферменту, и на этот класс у рыб ложится основная нагрузка по детоксикации (Angelucci et al., 2000; Henson, Gallagher, 2004). В последние годы у пи класса TST обнаружена неожиданная способность к депонированию оксида азота, и поэтому его рассматривают как внутриклеточное депо оксида азота (Maria et al., 2003; Turella et al., 2003).

Таким образом, на клеточном уровне защита ОЭ от воздействия вредных веществ рыб и млекопитающих однотипна. На молекулярном уровне различия, возможно, наблюдаются только в экспрессии подклассов детоксицирующих ферментов, что, скорее всего, связано с положением рыб в эволюционном ряду.

Хлоридные клетки и ионный состав слизи обонятельного эпителия. Содержание ионов натрия и хлора в обонятельной слизи у наземных позвоночных животных сопоставимо с содержанием их в плазме крови, а ионов калия - в несколько раз больше. Считается, что иОны в слизь поступают пассивно с секретирующейся слизью, а гомеостаз поддерживается активной абсорбцией с помощью натрий-калиевого насоса. Полученные же нами результаты об изменении концентрации натрия и калия в обонятельной выстилке карпа при адаптации рыб к повышенной кислотности воды не укладывались в эту схему (рис. 1).

Исследование трансэпителиального потенциала (ТЭП) обонятельной выстилки карпа и использование селективных ингибиторов транспорта ионов показало, что снижение ТЭП катионов делает поверхность эпителия более отрицательной, а анионов - более положительной. Таким образом, в обонятельном эпителии пресноводных рыб активный транспорт ионов направлен из организма в слизь.

В слизи ОЭ у исследованных нами рыб только содержание ионов хлора сопоставимо с его концентрацией в обонятельной слизи млекопитающих и наземных амфибий (Бронштейн, Леонтьев, 1972; Минор и др., 1990; Grubb et al., 2002). Концентрация неионизированного калия в слизи ОЭ позвоночных в десятки раз превышает содержание этого элемента в межклеточном пространстве нейронов мозга и даже в ионной форме (К+) она почти на порядок больше (Минор и др., 1990). Это характерно для электролитного окружения апикального отдела рецепторных клеток всех

модальностей и обусловлено особенностью трансдукции

сенсорного сигнала (уменьшение соотношения шум/сигнал) (Грибакин, 1990).

Таблица 2. Концентрация натрия, калия и ионов хлора в слизи обонятельной выстилки рыб

Объект исследования п Натрий, мМ Калий, мМ СГ, мМ

Карась 10 26±2.5 47±2 101±6

Карп 10 35±4.0 47±3 81±5.5

Щука 5 43±3.0 46±4 121±6

Вода из аквариума - 2 0.1 1

Таким образом, у пресноводных рыб между слизью обонятельного эпителия и водой возникает концентрационный градиент, определяющий непрерывную утечку ионов из слизи. Очевидно, что потеря ионов может восполняться как за счет секреции слизи, так и за счет пассивной диффузии. Вопрос об участии системы активного транспорта ионов в поддержании ионного гомеостаза слизи у пресноводных рыб представляется более проблематичным, что послужило поводом для поиска в ОЭ структур, осуществляющих этот транспорт. Наиболее вероятно, что в создании определенной ионной среды на поверхности обонятельного эпителия могли бы принимать участие хлоридные клетки. Эти клетки известны как специализированные структурные элементы жаберного эпителия рыб, которые осуществляют активный транспорт ионов между внутренней и внешней средой для поддержания ионного и осмотического гомеостаза. У морских рыб они экскретируют Na+ и СГ наружу, а у пресноводных - абсорбируют их из внешней среды (Perry, 1997). В раннем эмбриональном развитии хлоридные клетки найдены в эпителии, покрывающем тело личинки и желточный мешок (Kaneko et al., 2002), а у взрослой форели в ОЭ (Bertmar, 1972).

Однако до настоящего времени не появилось никаких новых сведений о хлоридных клетках обонятельного эпителия. По-прежнему не известно, насколько широко распространено это явление среди пресноводных рыб. Для выяснения этого вопроса и проведено электронно-микроскопическое исследование строения обонятельной

выстилки у представителей 7 видов из 5 отрядов костных рыб: сибирском осетре, стерляди, стальноголовом лососе, карпе, карасе, окуне и мозамбикской тилапии. В обонятельном эпителии этих семи видов рыб обнаружены клетки, подобные хлоридным. Они встречаются поодиночке как в области индифферентного, так и сенсорного эпителия. Однако пограничные участки этих областей отличаются групповым распределением клеток и соответственно более высокой их плотностью. Наружная поверхность таких клеток имеет весьма характерный вид благодаря своей округлой или треугольной форме, а также коротким микровиллеподобным выростам апикальной мембраны. Иногда наружная клеточная мембрана образует небольшие углубления - апикальные ямки. В основном же она плоская или даже слегка выпуклая.

Специфика ультратонкой организации обнаруженных нами клеток заключается в обилии митохондрий, наличии интенсивно развитой тубулярной системы и своеобразной форме апикальной поверхности. Все это позволяет идентифицировать исследуемые клетки как хлоридные.

Для проверки нашего предположения о том, что хлоридные клетки в ОЭ пресноводных рыб функционируют по экскреторному типу, нами проведены опыты с ингибитором минерального обмена морских рыб, тиоцианатом натрия (табл. 3). Чувствительность различных ионных потоков к действию тиоцианата оказалась примерно такой же, как и в жаберном эпителии морских рыб - в наибольшей мере подавляется выведение ионов хлора (табл. 3).

Таблица 3. Содержание натрия, калия и ионов хлора в плазме и влияние тиоцианата (5 мМ, 2 суток) на их концентрацию в обонятельной слизи карпа

Условия эксперимента Концентрация Соотношение N3 : К : С1

натрий калий ионы хлора

Плазма 123±7 5.1±0.3 95±0.8 1 : 0.04 : 0.77

Слизь, контроль 26±2.5 47±2 101±6 1 : 1.8:3.9

Слизь, опыт 14±1.5 16±1 19±1 1 : 1.1 : 1.4

Это позволяет считать, что хлоридные клетки в обонятельном эпителии пресноводных рыб функционируют по экскреторному типу. Однако по сравнению с жабрами морских рыб, интенсивность ионного обмена в обонятельном эпителии должна быть существенно ниже, т.к. здесь активный транспорт ионов направлен против более низких концентрационных градиентов. Вероятно, с этими двумя обстоятельствами связаны и некоторые особенности ультраструктуры хлоридных клеток из обонятельного эпителия пресноводных рыб. При обилии митохондрий и высоком уровне разветвленности тубулярного ретикулума они практически лишены апикальных ямок, которые весьма характерны для хлоридных клеток жаберного эпителия морских рыб. Их тубуло-везикулярная зона, как и в жаберных хлоридных клетках морских рыб, тоже содержит окаймленные пузырьки, однако количество их сравнительно невелико. Очевидно, что у пресноводных рыб хлоридные клетки обонятельного органа не участвуют в поддержании общего ионного гомеостаза, т.к. в противоположность клеткам жаберного эпителия функционируют по экскреторному типу.

Таким образом, в рецепторном отделе обонятельной слизи пресноводных рыб только концентрация ионов хлора совпадает с содержанием его в межклеточном пространстве нервной ткани. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, показывающих, что ведущими ионами в электрогенезе рецепторного потенциала у наземных животных (у которых концентрация в слизи ОЭ такая же, как в плазме) являются кальций и хлор. Ионы кальция выступают как третичный мессенджер, а ионы хлора несут несколько функций контроля состояния возбудимости ОРН в зависимости от степени поляризации его мембраны и внутриклеточной концентрации хлора. У пресноводных рыб эти процессы совершенно не изучены.

Роль ионов хлора. Рецепторный потенциал оказался весьма чувствительным к селективному ингибитору хлорных каналов 4-этилбициклофосфату. Это вещество вызывало снижение ЭОГ, начиная с концентрации 5 мкМ, а уменьшение амплитуды потенциала на 50% соответствовало концентрации 10 мкМ. Был также протестирован фуросемид, известный как ингибитор котранспорта Ка7К+/2СГ. Фуросемид в концентрации 100 мкМ при перфузии обонятельной

выстилки карпа оказывал влияние на восстановительные процессы в ОРН в большей степени, чем на возникновение рецепторного потенциала (табл. 4). В этой таблице приведена динамика изменения амплитуды ЭОГ на кондиционирующий и тестирующий стимулы при воздействии фуросемида. Перфузия выстилки в течение 5 минут вызывает одинаковое снижение амплитуды ответов на оба стимула. Однако дальнейшая перфузия приводит к резкому снижению величины ответа ЭОГ на повторный стимул.

Исследование в модельных биохимических экспериментах хлор-зависимых процессов позволило установить, что фуросемид ингибирует АТФ-зависимое поглощение 3бС1 (150=150 мкМ) и С1-активируемую АТФазную активность (15о=120 мкМ) в везикулах плазматических мембран ОВ карпа. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в электрофизиологических опытах. Итак, на основании полученных результатов можно предположить, что в невозбужденном состоянии в обонятельный нейрон ионы хлора активно закачиваются против электрохимического градиента, и их равновесный потенциал становится более положительным по отношению к мембранному потенциалу ОРН. В ответ на действие

Таблица 4. Влияние фуросемида на амплитуду ЭОГ карпа, вызванную серином (100 мкМ)

Условия эксперимента Длительность воздействия, мин Амплитуда ЭОГ, мВ (п=4) Уменьшение тестирующего стимула по отношению к кондиционирующему, %

1 стимул 2 стимул через 15с

Контроль 0 3.6±0.2 3.2±0.2 И

Фуросемид 20мкМ 5 2.8±0.2 2.5±0.2 11

10 2.6±0.2 2.1±0.2* 19

15 2.1±0.1 1.4±0.1" 33

Отмывка 15 2.9±0.2 2.3±0.2" 21

40 3.6±0.2 3.6±0.2 11

* достоверно отличается от первого стимула при Р < 0.05.

одоранта через систему внутриклеточных посредников возрастает проницаемость апикальной мембраны ОРН для ионов хлора, которые по электрическому градиенту выходят из клетки. Вследствие этого возникает входящий ток, что приводит к деполяризации апикальной части дендрита и возбуждению ОРН.

Аминокислоты (АК) являются эффективными обонятельными стимулами для рыб (Michel, Derbige, 1997; Zippel et al., 1997). Имеющиеся в литературе сведения, полученные на основании биохимических исследований путей трансдукции АК сигнала у рыб, неоднозначны. In vitro АК стимулируют синтез инозитол-1,4,5,-трифосфата (ИФ3) и аденозин-3,5-монофосфата (цАМФ) (Huque, Bruch, 1986; Bruch, Teeter, 1990; Lo et al., 1995;). За счет какого внутриклеточного вторичного посредника (или их пути пересечены) возникает рецепторный потенциал у рыб на стимуляции АК еще не выяснено. Для выяснения этого вопроса было проведено исследование влияния на рецепторный потенциал фармакологических веществ, действующих селективно на отдельные звенья трансдукции обонятельного сигнала.

Роль фосфолипазы С. ЭОГ, вызываемая L-серином в широком диапазоне концентраций (0.01-1 мМ), оказалась чувствительна к ингибитору фосфолипазы С, аминогликозидному антибиотику неономицину, который в концентрации 0.1 мМ препятствовал возникновению рецепторного потенциала на L-серин в исследуемых концентрациях. Очень высокую чувствительность рецепторный потенциал, вызванный L-серином, проявил к блокатору инозитол-зависимых кальциевых каналов рутениевому красному. Его пороговая концентрация составляет около 0.01 мкМ. При концентрации 1 мкМ рецепторный потенциал полностью блокируется. Эти данные показывают, что для возникновения рецепторного потенциала в ответ на аминокислотную стимуляцию в первую очередь требуются активация фосфолипазы С и вхождение ионов кальция в рецепторную клетку через инозитол-зависимые каналы.

Роль цАМФ. Динамика синтеза и распада цАМФ определяет амплитуду и длительность рецепторного потенциала. Если цАМФ участвует в процессе трансдукции обонятельного сигнала у рыб, то фармакологические вещества, тормозящие распад цАМФ, должны увеличивать длительность рецепторного потенциала. При перфузии

выстилки карпа 0.2 мМ раствором З-изобутил-1 -метилксантина (ИБМК) были получены неожиданные результаты. Форма ЭОГ, вызванная низкими концентрациями Ь-серина (до 0.1 мМ), изменяется только по амплитуде - происходит ее снижение (Рис.ЗБ,а). При более высоких концентрациях (от 0.1 мМ до 1 мМ) наблюдается как снижение амплитуды, так и увеличение длительности ответа. Причем длительность увеличивается не по всему заднему фронту ЭОГ, а только в низкоамплитудной ниспадающей ее части (Рис. ЗБ, б,в).

Рис. 3. Влияние З-изобутил-1 -метилксантина (ИМБК) на ЭОГ у карпа,

вызванную различными концентрациями Ь-серина. А - норма. Б - перфузия ИМБК (0.2 мМ). а - Ь-серин, 0.01 мМ; б - Ь-серин, 0.1 мМ; в - Ь-серин, 1 мМ. «негативность» направлена вверх

Таким образом, при воздействии ИБМК ЭОГ, вызванная высокой концентрацией Ь-серина, приобретает двухкомпонентную форму. Начальная, основная часть ЭОГ, состоит из быстрого

1мв

высокоамплитудного, а вторая - из медленного низкоамплитудного компонентов. Подобный эффект вызывают и ионы марганца (1 мМ), которые, как известно, направленно стимулируют каталитическую единицу аденилатциклазы (Sibley et al., 1986). Амилорид и 1-цис-дилтиазем (блокаторы циклонуклеотид чувствительных каналов) в концентрациях 0.1 мМ не оказывают влияния на амплитуду ЭОГ, вызванную низкими концентрациями L-серина. Однако эти вещества снимают вызванную ИБМК пролонгацию ЭОГ в ответ на высокие концентрации одоранта.

Таким образом, активация аденилатциклазы в рецепторной клетке осуществляется не рецептор-во^-белок-зависимым способом, а как-то иначе. Известно, что аденилатциклаза может активироваться диацилглицеролом, метаболитом фосфо-инозитольного обмена, независимо от рецептор-О-белок. Это вещество активирует протеинкиназу С, которая, в свою очередь, стимулирует аденилатциклазу. Протеинкиназа С может также активироваться ионами кальция, вошедшими через инозитол-зависимые каналы (Frings, 1993).

С целью проверки возможности участия протеинкиназы С в генерации рецепторного потенциала мы воспользовались ингибитором этого модулятора - тамоксифеном. Это вещество в концентрации 0.1 мМ так же, как и блокаторы циклонуклеотид-зависимых каналов, снимает пролонгацию ЭОГ, вызванную ИБМК.

В некоторых случаях (приблизительно у 10% исследованных рыб) в ответ на кратковременную стимуляцию L-серином или цАМФ регистрируется ЭОГ двухфазной формы: быстрая негативная волна переходит в более медленный и низкоамплитудный позитивный потенциал (рис. 4, а). Рутениевый красный (1 мкМ) и неомицин (ЮОмкМ) ингибируют негативную часть ЭОГ, не затрагивая позитивную (рис.4, А, б, в). Эффект же амилорида (100 мкМ) противоположен - он полностью подавляет позитивную волну ЭОГ (рис. 4, Б, в). СИТС (100 мкМ), блокатор Са-активируемых хлорных каналов, значительно снижает негативную и увеличивает позитивную части ЭОГ (Рис. 4, В, б, в). Другой канальный блокатор - 4-аминопиридин, который ингибирует Са-зависимый калиевый ток, уменьшает амплитуду ЭОГ в целом (рис. 4, В, б, в). Все эти вещества действуют обратимо (рис. 4, г).

Известно, что клеточные мембраны малопроницаемы для цАМФ

и, кроме того, есть сведения об экстраклеточных рецепторах цАМФ (Федоров и др., 1993). В связи с этим, чтобы установить причастность цАМФ к внутриклеточным процессам, мы провели серию опытов с продолжительной стимуляцией. Оказалось, что, если в условиях кратковременной стимуляции выстилки серин и цАМФ вызывают сходные ЭОГ, то при стимуляции в течение 15 секунд форма ЭОГ на эти вещества существенно различается. Ь-серин вызывает негативный потенциал, который на фоне продолжающейся стимуляции быстро снижается до некоторой величины, оставаясь по-прежнему негативным вплоть до прекращения подачи стимула (рис,5,А,а), Эта типичная форма ЭОГ на длительный стимул отражает адаптивные свойства ОРК и описана другими авторами (ШтЬе^, е1 а!., 1992).

Кг-

I {г А- -А-

3 мв 5 сек.

Рис. 4. Влияние различных блокаторов ионных каналов на ЭОГ у карпа, вызванную Ь-серином (1мМ). А - рутениевый красный (1 мкМ), Б - амилорид (0.1 мМ), В - СИТС (0.1 мМ), Г - 4-аминопиридин (0.1 мМ); а - норма; б - перфузия, 2 мин; в - перфузия, 10 мин; г - отмывка, 20 мин

Продолжительная стимуляция выстилки цАМФ также вызывает деполяризацию, которая, в отличие от ЭОГ на Ь-серии, быстро переходит в позитивность (рис. 5,А,б). Возвращение к базовому уровню после прекращения подачи стимула происходит медленнее, чем в первом случае. Рутениевый красный (1 мкМ) и неомицин (100 мкМ) полностью снимают негативную волну, не затрагивая позитивный компонент ЭОГ, вызванной цАМФ (рис.5,Б,б). При действии этих веществ на ЭОГ, вызванную Ь-серином (1мМ), негативная волна исчезает и появляется слабая позитивность (рис. 5,Б,а).

Змв

15сек.

Рис. 5. Влияние рутениевого красного на ЭОГ у карпа, вызванную

Ь-серином (1мМ) и цАМФ (1мМ) А - норма, Б - рутениевый красный (1мкМ); а - Ь-серин, б - цАМФ. Начало стимуляции обозначено стрелкой, направленной вверх, а прекращение стимуляции - стрелкой, направленной вниз

Таким образом, показанная нами многотипность трансдукции аминокислотного сигнала находит отражение в неоднородности ОРН по биохимическим и электрофизиологическим характеристикам. Вполне вероятно, что такое разнообразие механизмов трансдукции может иметь важный биологический смысл, так как не исключено, что один и тот же одорант в различных концентрациях может обладать различным сигнальным значением. У пресноводных рыб фундаментальные черты обонятельной трансдукции схожи с таковыми у других позвоночных животных. Однако в хлорной проводимости имеется ряд особенностей, которые, по всей видимости, связаны с водной средой обитания.

Восприятие амино- и желчных кислот карпом при акклимации к среде с низким содержанием кальция. Возбуждение ОРН обязательно связано с увеличением концентрации Са2+ в нем. Ионы кальция в ОРН входят из экстраклеточного пространства через каналы,

управляемые цАМФ или ИФ3. В других рецептор-зависимых процессах возбуждение клетки может обуславливаться внутриклеточным кальцием, выходом его из внутриклеточных кальциевых депо (ВКД) (Авдонин, Ткачук, 1994). В открытии кальциевых каналов в ВДК могут участвовать ИФЗ, ацетилхолин (АХ), оксид азота (NO) и сам кальций (Berridge, 1993). В обонятельной трансдукции у млекопитающих этот процесс только начинают изучаться. Отмечено, что даже между ОРН человека и мышей наблюдаются некоторые различия (Gomez et al., 2000; Mizutani et al., 2000; Zufall et al., 2000).

В норме блокатор М-холинорецепторов скополамин (0.1 мМ) и ингибитор NO-синтазы N-нитроаргинин (0.2 мМ) вызывают снижение рецепторных ответов как на серин, так и на таурохолат (рис. 6, 7). В условиях дефицита ионов кальция действие скополамина на вызванные L-серином, несколько усиливается, тогда как его эффект на ответы рецепорнных нейронов (ЭОГ), вызванные таурохолатом, заметно ослабляется. Эффективность N-нитроаргинина в бескальциевой среде возрастает для обоих одорантов, однако в большей мере это относится к рецепторным ответам на аминокислоты. Особенно впечатляющими оказались опыты с кальциевыми блокаторами, показывающие, что при восприятии

серина в низкокальциевой среде внешний кальций не требуется, а при рецепции таурохолата - обязателен.

Рис. 6. Влияние лигандов М-ХР, NOS и кальциевых каналов на ЭОГ у карпа, вызванную серином, у рыб из пресной воды (А) и искусственной низкокальциевой (Б). 1 - норма, 2 - скополамин (0.1 мМ), 3 - N-нитроаргинин (0.2 мМ), 4 - нифедипин (20 мкМ), 5 - резерпин (1 мкМ)

Рис. 7. Влияние лигандов М-ХР, NOS и кальциевых каналов на ЭОГ у карпа, вызванную таурохолатом, у рыб из пресной воды (А)

и искусственной низкокальциевой (Б). 1- норма, 2- скополамин (0.1 мМ), 3 - N-нитроаргинин (0.2 мМ), 4 - нифедипин (20 мкМ)

Для выяснения возможных внутриклеточных механизмов регуляции содержания ионов кальция в ОРН было исследовано влияние различных фармакологических веществ (блокаторов ионных каналов и модификаторов биохимических процессов) на ЭОГ, вызванную М-холиномиметиком пилокарпином, а также донором оксида азота нитропруссидом натрия. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности блокатора М-ХР скополамина (0.2 мМ). Он ингибирует рецепторный ответ пилокарпина на 75%, а нитропруссида на 60%. Ингибитор N0-синтазы ЬГ-нитроаргинин снижает на 48% ответ, вызванный пилокарпином, и на 75% ответ на нитропруссид. Дипиридамол (10 мкМ), ингибитор фосфодиэстеразы IV (гидролизует цГМФ), подавляет ЭОГ на пилокарпин на 80%, а ЭОГ, вызванную нитропруссидом, на 44%, одновременно увеличивая продолжительность ЭОГ в 4 раза.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что эндогенный ацетилхолин может участвовать в трансдукции обонятельного сигнала за счет активации поступления ионов кальция из слизи внутрь ОРН через кальциевые каналы плазматической мембраны, а также стимулируя освобождение кальция из внутриклеточных депо. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция в свою очередь может активировать N0 синтазу и, соответственно, через оксид азота, гуанилатциклазу, вызывая таким образом повышение уровня цГМФ.

В связи с выявленной функциональной значимостью АХ и N0 в трансдукции обонятельного сигнала, была исследована клеточная и субклеточная локализация ферментов, участвующих в метаболизме этих биологически активных веществ.

Локализация АХЭ и НАДФН-диафоразы в обонятельной выстилке карпа. В обонятельной выстилке карпа АХЭ сосредоточена только в клетках жгутикового типа -- рецепторных и опорных. В микровиллярных и в секреторных клетках фермент не обнаружен. АХЭ-позитивные клетки образуют довольно крупные скопления, мозаично расположенные среди участков эпителия, не содержащего осадка. Эти скопления встречаются в области как сенсорного, так и индифферентного эпителия. Следует отметить, что только часть клеток жгутикового типа АХЭ-позитивны. Даже внутри отдельного скопления могут встречаться клетки, не содержащие осадка, хотя доля

АХЭ-позитивных здесь значительно выше, чем в целом по выстилке, и составляет в разных скоплениях от 40 до 70%.

АХЭ-позитивные клетки, независимо от морфологической принадлежности, различаются количеством содержащегося в них осадка: если у одних матрикс буквально заполнен продуктом реакции, то у других локализация фермента ограничивается плазматической мембраной булавы и мембранами жгутиков. При этом увеличение плотности осадка в базо-апикальном направлении типично для всех АХЭ-позитивных клеток без исключения. В окрашенных клетках высокая активность фермента ассоциируется с апикальными участками плазматической мембраны и с мембранами жгутиков. Причем для жгутиков рецепторных клеток и для мерцательных ресничек опорных клеток характерна локализация осадка в виде отдельных глобул с внешней стороны плазматической мембраны.

Внутриклеточная локализация фермента ограничивается перинуклеарной мембраной, гранулярным эндоплазматическим ретикулумом и митохондриальными мембранами. В гранулярном эндоплазматическом ретикулуме фермент концентрируется в цитоплазме между цистернами и, возможно, связан с наружной поверхностью образующих их мембран. Митохондриальная АХЭ локализована на наружных мембранах и обращена в сторону межмембранного матрикса. Количество митохондрий, содержащих фермент, в клетке постепенно увеличивается в базо-латеральном направлении.

Биохимическое исследование распределения АХЭ по субклеточным фракциям ОВ полностью подтвердило гисто- и цитохимические результаты. Удельная активность АХЭ в гомогенате ОВ карпа составила 0.72±0.09 мкмоль/мг белка/ч (п=6), что на порядок ниже значений, установленных для обонятельной луковицы и переднего мозга, соответственно 14±1.4 и 6±0.6 мкмоль/мг белка/ч (п=6). Однако во фракции жгутиков удельная активность была сравнима с таковой в мозгу и составила 8.8±0.9 мкмоль/мг белка/ч (п=6), во фракциях плазматических и внутриклеточных мембран -была также достаточно высока и составила 4.8±0.6 и 2.4±0.2 мкмоль/мг белка/ч (п=6) соответственно. Уровень активности растворенной в цитозоле АХЭ был незначительным - 0.6±0.06 мкмоль/мг белка/ч (п=6).

НАДФН-диафораза в обонятельной выстилке карпа. Диафоразное окрашивание клеток обонятельной выстилки карпа совпало с распределением АХЭ, т. е. НАДФНд присутствовала только в рецепторных и опорных клетках жгутикового типа. В микровиллярных и секреторных клетках фермент не обнаружен.

Внутриклеточная локализация НАДФНд обонятельной выстилки, прежде всего, характеризуется четкой ее связью с субмембранной системой, т.е. с фибриллами жгутиков, их базальными тельцами, микрофиламентами корешков, а также с фибриллярными структурами десмосом. Наличие фермента свойственно и таким органеллам 7 как митохондрии, гранулярный и агранулярный эндоплазматические ретикулумы. При этом основная часть формазанов содержится в цитозоле и рассредоточена по всему объему клетки. На наш взгляд, цитозольное положение фермента не свободно, а связано с цитоскелетом. Сама по себе сеть цитоскелета даже при обычном двойном контрастировании имеет невысокую электронную плотность. В нашем же случае при использовании слабо контрастированных срезов визуализация его элементов особенно низка. Тем не менее, за счет продукта гистохимической реакции сеть цитоскелета в опорных клетках выстилки слегка обозначается.

АХЭ и НАДФНд ассоциируются с ОРК жгутикового типа и имеют общие места ультраструктурной локализации. В апикальной части ОРК, т.е. на жгутиковых и апикальных мембранах, АХЭ локализована экстраклеточно, а НАДФНд занимает субмембранное положение. Кроме того, оба фермента присутствуют в ретикулуме и митохондриях ОРК - основных внутриклеточных депо ионов кальция, а их связь с плазматическими и внутриклеточными мембранами строго ориентирована, что свидетельствует об определенной согласованности их функций. Эндогенный ацетилхолин не только управляет поступлением ионов кальция в ОРК рыб, но и модулирует синтез оксида азота. Очевидно, что такая система, играющая роль внутриклеточного усилителя внешнего сигнала посредством его преобразования в кальциевый сигнал, должна особенно эффективно функционировать в условиях дефицита ионов кальция во внешней среде.

Присутствие в ОВ карпа рецепторных клеток и их аксонов, содержащих АХЭ и НАДФНд, побудило провести исследование распределения этих ферментов ОЛ рыб. Тем более это представляет

значительный интерес с позиций сравнительной и эволюционной сенсорной физиологии, так как у млекопитающих слой обонятельных волокон ОЛ не содержит АХЭ и в нем не обнаружены холинергические элементы (Le Jeune et al., 1996).

Для выяснения роли АХЭ в обонятельных сенсорных процессах в OJI, в качестве модельных видов, были взяты: 1) карп, имеющий хорошо развитую ОС и относящийся к макросматикам; 2) щука, в биологии которой использование обоняния ограничено, относящаяся к микросматикам; 3) осетр, как и карп, относящийся к макросматикам. Однако у хондростей уровень АХЭ в головном мозге значительно ниже, чем у костистых рыб (Лейбсон, 1968).

Локализация АХЭ в обонятельной луковице карпа, щуки и осетра. АХЭ обнаруживается во всех слоях ОЛ карпа. Наибольшая плотность осадка наблюдалась в наружных слоях - в слое обонятельных волокон и в слое клубочков. На продольном срезе ОЛ хорошо выражена асимметрия в локализации фермента: окрашенные волокна сосредоточены в основном на медиальной стороне луковицы. Проникая в глубь луковицы, волокна обонятельного нерва разветвляются только в пределах клубочков. Как и в слое волокон, продукт гистохимической реакции содержится преимущественно в медиально-расположенных клубочках.

Содержащие АХЭ нейроны распределены в ОЛ более или менее симметрично. Ближе к слоям волокон и клубочков расположены относительно немногочисленные и довольно крупные тела клеток (15-20 мкм), которые по своим размерам, форме и локализации могут быть отнесены к митральным клеткам, релейным нейронам. Они располагаются поодиночке или небольшими группами. Продукт реакции содержится как в телах этих клеток, так и в их отростках. В центральной части ОЛ нейроны, содержащие АХЭ, более многочисленны и составляют около 30% общего количества клеток в этой зоне. Окрашиваются сравнительно мелкие клетки (5-15 мкм), имеющие характерную веретеновидную форму, что позволяет идентифицировать их как нейроны переднего обонятельного ядра.

Кроме того, на глубине от 800 до 1100 мкм, в каудальной части луковицы наблюдаются позитивные волокна. Они собраны в пучок, который расположен довольно близко к месту формирования обонятельного тракта.

Хотя удельная активность АХЭ в OJI щуки на порядок ниже, чем у карпа (табл. 6), наблюдаемые различия в локализации фермента в О Л этих рыб в основном количественные, а не качественные. Отдельные АХЭ-позитивные митральные клетки расположены только в латеральной и медиальной части OJI щуки. Продукты реакции присутствуют также в слое зернистых клеток, однако и здесь количество АХЭ-позитивных нейронов весьма умеренно.

Несмотря на то, что удельная активность АХЭ в ОЛ осетра ближе к таковой ОЛ щуки, распределение же АХЭ-позитивных структур было более схожим с локализацией АХЭ в ОЛ карпа. Гистохимическая реакция при инкубации срезов с селективным субстратом АХЭ ацетил-Р-метилтиохолином (MTX) наблюдалась во всех слоях ОЛ осетра, за исключением эпендимального слоя. Наиболее интенсивное окрашивание проявлялось в слое митральных клеток. В этом слое нейроны, содержащие продукт реакции гидролиза MTX, по своим размерам, форме и локализации могут быть отнесены к большим и средним митральным клеткам (МК). Продукт реакции содержится как в телах клеток, так и в их отростках. Особенно много АХЭ-позитивных клеток в вентролатеральной и вентромедиальной зоне этого слоя. Менее интенсивное окрашивание наблюдалось в клубочковой зоне и слабое в слое волокон обонятельного нерва (ВОН). В слое зернистых клеток (ЗК) окрашивались только отдельные нейроны, проявляя интенсивную реакцию.

Ультраструктурная локализация АХЭ в клубочках и нейронах ОЛ карпа. В нейропиле клубочков АХЭ обнаруживается не только в пучках аксонов, но и в тех участках аксолеммы, которая непосредственно примыкает к дендритам и богата синаптическими контактами. Наличие синаптических пузырьков, заполняющих всю аксонную терминаль, а в некоторых случаях и филаментозного материала около мембраны дендрита позволяет говорить о локализации АХЭ на поверхности пресинаптического элемента в аксо-дендритных синапсах. То же самое можно сказать о содержании фермента в дендритах, расположенных в пределах скопления АХЭ-позитивных аксонов в клубочке. АХЭ локализуется на наружной стороне плазматической мембраны и, благодаря светлому матриксу дендритов, местоположение осадка довольно надежно может быть

отнесено к синаптической щели дендро-дендритных синапсов. Довольно часто АХЭ обнаруживает связь с синаптическими комплексами, состоящими из асимметричного аксо-дендритного и дендро-дендритного синапсов.

Часть митральных клеток (вторичные или релейные нейроны) содержит продукт реакции на АХЭ. Внутриклеточная локализация АХЭ ограничивается эндоплазматическим ретикулумом и перинуклеарной мембраной. Примерно такое же распределение фермента наблюдается и в других многочисленных клетках обонятельной луковицы карпа. Обращают на себя внимание АХЭ-позитивные нейроны схожие с митральными клетками по размеру перикариона, ядра (d = 8.1±0.6 )и консистенции хроматина, но у них отсутствует характерный признак митральных клеток - тельца Ниссля. Скорее всего, эти клетки могут быть отнесены к так называемым гривастым - "ruffed" клеткам, которые, как и митральные клетки, посылают свой аксон в вышележащие обонятельные центры мозга. В мелких клетках луковицы (диаметр ядра у них составляет 5.1±0.4 мкм) обнаружено еще одно место локализации фермента - свободные рибосомы. Эти нейроны можно условно разделить на два типа. Ядерный хроматин в нейронах первого типа распределен неравномерно и образует довольно крупные скопления. Клетки второго типа отличаются обилием рибосом, собранных в розетки, при малом содержании гранулярного эндоплазматического ретикулума в цитоплазме. В элементах внутреннего нейропиля также обнаружены АХЭ-позитивные структуры. Здесь так же, как и в клубочках, АХЭ находится на наружной стороне мембраны дендритов и довольно часто концентрируется в межклеточных щелях вблизи синаптических контактов.

Ультраструктурная локализация ХАТФ в клубочковом слое OJI карпа. Продукт цитохимической реакции на ХАТФ обнаружен на отдельных участках клубочкового слоя обонятельной луковицы карпа. В этом слое выявлены рецепторные аксоны, терминали рецепторных аксонов, дендриты митральных клеток и интернейронов, а также отдельные нейроны с внутриклеточным содержанием продукта реакции на ХАТФ. В аксо-дендритных синапсах осадок находится на синаптических мембранах и поверхности везикул, расположенных около них. Элементы, образующие эти синапсы, имеют типичную локализацию ХАТФ - на внутренней стороне плазматических и

синаптических мембран, на микрофиламентах и поверхности везикул, на мембранах агранулярного эндоплазматического ретикулума и на обеих митохондриальных мембранах, включая кристы. Микротрубочки содержат осадок в незначительных количествах. Осадок практически отсутствует в межклеточных пространствах. Субклеточная локализация продукта реакции на ХАТФ в дендритах митральных клеток такая же, как и в контактирующих с ними аксонах. Часть синапсов заметно выделяется на общем фоне за счет скопления продукта реакции на пре- и постсинаптических мембранах, а также на поверхности везикул, расположенных вблизи активных зон. Продукт реакции на ХАТФ обнаружен также в асимметричных дендро-дендритных синапсах между митральными клетками и интернейронами.

Дифференциация слоев в ОЛ рыб выражена слабо, поэтому клубочковый слой, помимо собственно клубочков и межкпубочкового нейропиля, содержит участки плексиформного нейропиля и нейроны. Продукт реакции обнаруживается в некоторых нейронах, которые имеют цитоплазму, богатую рибосомами, и светлое ядро (с1=4-5 мкм) с равномерным распределением хроматина. В таких нейронах осадок содержится внутри ядра, на митохондриальных мембранах, цистернах гладкого эндоплазматического ретикулума, в рибосомах и на поверхности везикул. На перинуклеарной мембране и цистернах гранулярного эндоплазматического ретикулума количество осадка незначительно.

Роль АХЭ обонятельной луковицы в сенсорных процессах. Деафферентация приводит к снижению активности АХЭ в ОЛ карпа на 45% через трое суток аносмии. Затем этот проиесс замедляется. На седьмые сутки депривации активность фермента снижается еще на 13% и в дальнейшем не изменяется. В целом в результате блокирования афферентного входа активность АХЭ уменьшается на 60%. Гистохимическое исследование позволило уточнить динамику этого процесса на структурном уровне. Через сутки после аносмии картина распределения АХЭ на срезах ОЛ карпа существенно изменилась. Окраска слоя обонятельных волокон и клубочков стала почти в два раза светлее. В то же время количество АХЭ-позитивных нейронов в разных клеточных слоях сравнительно долго сохранялось без изменений (табл. 5).

Таблица 5. Активность АХЭ в отдельных структурах обонятельной луковицы карпа при аносмии.

Длительность аносмии (сутки) Интенсивность гистохимической реакции в слоях волокон и клубочков (четырехбалльная шкала) Количество окрашенных клеток на 0.036 мм2

митральных веретено-видных

0 ++++ - 2.5±0.2 13.8±0.7

1 ++ 2.6±0.2 13.8±0.6

3 - 2.9±0.3 13.1±0.8

5 - 2.7±0.3 5.9±0.9*

12 - 0.3±0.3* 3.1 ±0.4*

* Достоверно отличается от контроля при р < 0.05.

Деэфферентация обонятельной луковицы у карпа не вызывала достоверных изменений в активности АХЭ.

Продолжительная стимуляция самцов вьюна половым феромоном (содержание их в воде из-под овулирующих самок) вызывает увеличение активности АХЭ в медиальной части на 201%, а в латеральной на 129%. Стимуляция же карпов Ь-аргинином (1 мкМ) приводит к повышению активности АХЭ только в латеральной части ОЛ на 45%.

Итак, активность АХЭ в ОЛ значительно зависит от сенсорного входа, особенно это касается первых двух слоев. Столь высокая лабильность АХЭ во внешних слоях ОЛ может быть обусловлена аксональным транспортом из АХЭ-позитивных рецепторных нейронов и/или внутрилуковичным синтезом этого фермента. Обе эти версии были проверены с помощью комплексного подхода с использованием цитохимических и биохимических методов и функциональных нагрузок.

Возможность аксоплазматического транспорта АХЭ из синтезирующих ее обонятельных рецепторных клеток была проверена цитохимическим методом и был получен отрицательный результат. При исследовании поперечных срезов обонятельного нерва на всем протяжении от выстилки до луковицы фермент не был обнаружен внутриаксонально. Он находился на внешней стороне аксолеммы.

Другая версия, согласно которой АХЭ синтезируется в аксонных терминал ях, проверялась биохимическим методом. Для этого определялся прирост активности АХЭ в ростральной половине изолированной ОЛ карпа после необратимого ингибирования фермента ДДВФ в разные сроки после начала депривации. Для выделения доли фермента, связанного с волокнами и клубочками, ростральная половина луковицы, в которой сосредоточены почти все клубочки, сравнивалась с каудальной половиной. Последняя использовалась в качестве контроля. После необратимого ингибирования фермента прирост активности АХЭ за 1 минуту в изолированной ростральной половине луковицы интактных рыб составляет 8.4+0.9 мкмоль/мгбелка/час, а в каудальной - 2.7+0.3 мкмоль/мг белка/час. У аносмированных рыб снижение этого показателя в ростральной половине достоверно обнаруживается уже на вторые сутки, а в каудальной - только на 6-е сутки. Как свидетельствуют данные, приведенные выше (табл. 5), в результате аносмирования фермент в волокнах и клубочках полностью исчезает на третьи сутки, тогда как первые изменения в количестве АХЭ-позитивных нейронов происходят только на пятые сутки с начала депривации. Поэтому высокая скорость восстановления активности АХЭ в изолированной ростральной половине луковицы убедительно свидетельствует о наличии механизма внутриаксонального синтеза, а ее снижение у аносмированных рыб - о тонической регуляции этого механизма со стороны обонятельной выстилки.

Подтверждение этого вывода получено на другом виде костистых рыб - щуке, у которой удельная активность АХЭ в обонятельной луковице на порядок ниже и обоняние в биологии играет значительно меньшую роль, чем у карпа.

Через 60 минут после тетанизации обонятельного нерва, т. е. при достижении максимального уровня потенциации, картина полностью преображается - на срезах появляются отчетливо выраженные слои митральных и зернистых клеток. Это связано как с резким увеличением общего количества АХЭ-позитивных нейронов, так и с интенсивностью их окрашивания. Для дорсальной части потенциированной ОЛ характерно появление большого количества позитивных нейронов, упорядоченно расположенных в виде многочисленных рядов. По нашему мнению, они могут представлять структуры переднего обонятельного ядра. В вентральной части

потенциированной ОД количество АХЭ-позитивных митральных клеток возрастает столь значительно, что они образуют вполне сформированный и отчетливо выраженный слой. Продукты гистохимической реакции заполняют как сому митральной клетки, так и ее дендриты. В зернистом слое так же увеличивается, как количество АХЭ-позитивных нейронов, так и плотность содержащегося в них осадка. Удельная активность АХЭ в потенциированных О Л возрастает по сравнению с контролем на 89%. По данным электрофизиологических экспериментов величина посттетанической потенциации (ПТП) через 60 минут составляет 170%.

Для выяснения вопроса, связано ли это увеличение активности АХЭ с синтезом фермента de novo, проведено две серии экспериментов с использованием необратимого ингибитора АХЭ -ДДВФ и ингибитора синтеза белка на стадии транскрипции -актиномицина Д. Электрофизиологические эксперименты проводили по следующей схеме. Предварительно обе луковицы подвергали фармакологическому воздействию (ДДВФ, в течение 2-х минут с последующей отмывкой актиномицином Д в течение 15 минут), после чего в одной из них вызывали длительную ПТП. Удельную активность АХЭ определяли через 60 минут с начала эксперимента. Результаты показали, что после ингибирования АХЭ 10 мкМ раствором ДДВФ скорость восстановления ферментативной активности в потенциированных ОЛ вдвое выше по сравнению с контролем. За 45 минут удельная активность АХЭ в контроле возросла до 83 мкмоль/г/час, в то время как в потенциированных луковицах она достигла 160 мкмоль/г/час. За это же время в другой серии экспериментов ферментативная активность ОЛ, афферентный вход которых подвергался тетанизации после аппликации актиномицина Д (100 мкг/мл), осталась на уровне контроля. Таким образом, увеличение активности АХЭ в фазе развития длительной ПТП действительно обусловлено синтезом фермента de novo.

Полученные результаты показывают, что удельная активность АХЭ в обонятельной выстилке и луковице может в какой то степени отражать обонятельные способности отдельной особи. Нами было предположено, что активность этого фермента может характеризовать обонятельные способности и вида в целом. Для оценки степени развития обоняния у исследованных видов мы использовали

относительную величину. Обонятельный коэффициент определяли как отношение суммарной активности АХЭ в обонятельном эпителии и луковице к активности в переднем мозге (табл. 6).

Таблица 6. Удельная активность АХЭ (мкмоль/г-ткани/час) в отделах обонятельной системы у рыб с различной обонятельной способностью.

№ Вид п Обонятель- Обонятель- Передний Обонятель-

ная ная мозг ный коэф-

выстилка луковица фициент

1 Вьюн 5 40±4 411±4 в,г * 116±19 3.88 а*

2 Налим 5 418±63 311±62 г,д 198±17 3.68 а

3 Осетр 6 34±4 94±5 ж 49±17 3.60 а

4 Карп 7 34±2 754±93б 333±21 2.37 6

5 Чехонь 4 74±7 511±34б 254±34 2.30 6

6 Сомик 6 70±5 1300±126 а 650±72 2.11 6

7 Угорь 4 7±1 167±2д 91±15 1.91 б

8 Лещ 4 12±1 463±69 в,г 431±44 1.10 в

9 Синец 6 11±2 249±37 д 303±33 0.88 в

10 Форель 4 7±1 140±12е 170±20 0.86 в

11 Камбала 3 28±7 157±22 д,е 321±42 0.58 г

12 Ряпушка 6 8±1 78±9 ж 220±24 0.44 д

13 Окунь 8 6±0.5 75±5 ж 201±8 0.40 д

14 Щука 4 3.5±0.3 69±4 ж 255±34 0.27 е

15 Треска 4 15±3 96±7 з 431±23 0.27 е

* Одинаковыми буквами отмечены значения, достоверно между

собой не различающиеся при Р<0.05.

В целом распределение видов по величине обонятельных коэффициентов полностью соответствует экологическим особенностям рыб (Павловский, Курепина, 1953; Мантейфель, 1980; Чинарина, 1985; Девицына, 2004).

Заключение

В данной работе экспериментально получены функциональные и структурные характеристики периферического и первого центрального отделов обонятельной системы рыб. Эти характеристики сопоставлены с литературными данными по другим филогенетически близким и далеким животным.

Установлено, что у рыб осуществление защиты обонятельного эпителия от неблагоприятных химических факторов окружающей среды сравнимо с таковым у млекопитающих. Показано, что у рыб, так же как и у млекопитающих, в ОЭ присутствуют специализированные микровиллярные клетки, активизирующиеся при воздействии токсических веществ. Активное участие в защите ОЭ принимают секреторные клетки эпителия, которые не только усиливают секрецию, но и изменяют химический состав секретируемой ими слизи. Регуляция выделения слизи и ее химический состав находятся под контролем вегетативной нервной системы. Результаты наших экспериментов показывают, что у рыб защита ОЭ сравнима с таковой у млекопитающих. Однако на тетраподах эта проблема исследована шире. Показано, чт о выделение слизи контролируется как адренергической, так и холинергической системами, причем последняя управляет выделением слизи несколькими субтипами холинорецепторов, на которые ложится разная функциональная нагрузка (Okayama et al., 1993). Показано также, что животные, ведущие различный образ жизни, имеют различное оснащение ОЭ специализированными микровиллярными клетками (Ferrari et al., 1998, 2000; Byrum et al., 2001).

При исследовании ионного состава обонятельной слизи пресноводных рыб установлено, что концентрация ионов хлора в ней соответствует концентрации их в плазме, а натрия - значительно меньше, чем в плазме. Установлено, что поток электролитов направлен из организма в слизь, транспорт их осуществляют специализированные клетки, так называемые хлоридные клетки, или, как сейчас принято их называть- "mitochondria-rich cells".

У млекопитающих обонятельная слизь и плазма не различаются по концентрациям этих ионов (Минор и др., 1990; Chiu et al., 1988; Grubb et al., 2002). В обонятельном эпителии наземных (воздуходышащих) позвоночных электролиты поступают в слизь

пассивно, вместе с секретирующейся слизью (Бронштейн, 1977), а гомеостаз ионов поддерживается активными электрогенными процессами - перемещением ионов из слизи внутрь организма (Persaund et al., 1987,1988)

Исследование роли вторичных мессенджеров в восприятии одорантов показало, что общий принцип трансдукции у рыб схож со всеми другими изученными животными. Однако при оценке восприятия L-серина в широком диапазоне концентрации установлено, что внутриклеточный путь трансдукции этой АК зависит от ее концентрации. Этот механизм регуляции трансдукции может объяснить различные формы поведения рыб при восприятии одной и той же аминокислоты.

Особое место занимают результаты по исследованию холинергической (ХЕ) системы обонятельной луковицы (OJI) рыб. Получены убедительные доказательства того, что у костистых рыб имеются прямой афферентный ХЕ вход в ОЛ и внутрилуковичная холинергическая система. Известно также, что у акул и голостей наблюдается схожая картина. У хрящевых рыб релейные нейроны являются и АХЭ-позитивными (Kusunoki et al., 1973) и ХАТФ-позитивными, а в латеральном обонятельном тракте проходят ХАТФ-позитивные волокна, которые могут быть аксонами этих клеток. Кроме того, в слое зернистых клеток имеется рассеянная популяция ХАТФ-позитивных клеток (Anadón et al., 2000). На другом представителе костных рыб, длинноносой щуке (Lepisteus osseus), показано, что слой зернистых клеток является АХЭ-положительным (Northcutt, Braford, 1977). Обонятельная луковица амфибий и

млекопитающих не получает рецепторный афферентный ХЕ вход. Вследствие этого в первом слое ОЛ - слое волокон обонятельного нерва-отсутствуют АХЭ, ХАТФ и ХР (Le Jeune et al., 1996). Все ХЕ элементы внутренних слоев ОЛ млекопитающих и амфибий обусловлены ХЕ проекциями от базального переднего мозга (Рагимова, Крацкин, 1984; Крацкин, 1989; Senut et al., 1989; Marin et al., 1997). Установлено, что в ОЛ амфибий, насекомоядных и грызунов ХАТФ-позитивные клетки отсутствуют, а наблюдаются только волокна, приходящие в ОЛ по медиальному тракту (Le Jeune, Jordan, 1993; Crespo, 1999; Senut et al., 1989). В ОЛ крыс АХЭ-позитивность проявляют кисточковые клетки, относящиеся к релейным нейронам, перигломерулярные и поверхностные короткоаксонные клетки - интернейроны (Nickell, Shipley, 1988; Le Jeune, Jordan, 1993; Kasa et al., 1995). Эти три типа холиноцептивных, нехолинергических нейронов являются основными мишенями холинергического входа из магноцелюлярного ядра переднего мозга. В связи с такой нейрохимической структурированностью ХЕ ферментов АХ оказывает лишь модулирующее влияние на электрическую активность ОЛ у крыс. В конечном итоге ХЕ афференты, уменьшая тормозное действие интернейронов, могут облегчать передачу сигнала от релейных нейронов к центральным структурам (Ravel et al., 1990; Kasa et al., 1995; Castillo et al., 1999; Crespo et al., 2000).

Такое разительное различие ХЕ систем первого обонятельного центра у Actinopterygii и Sarcopterygii могло возникнуть по причине того, что у Actinopterygii переднее обонятельное ядро осталось в ОЛ, не мигрировало в передний мозг, как у тетрапод. Но это предположение может объяснить только внутрилуковичную ХЕ систему, связанную с внутренним клеточным слоем ОЛ. Оно не затрагивает причин различия в афферентном входе.

Однако рыбы по организации холинергического пути прохождения обонятельной информации в ассоциативные центры мозга в животном мире не исключение. Наблюдается поразительное сходство гистохимической, цитохимической организации ХЕ входа в ОС и функций ХЕ системы в осуществлении обработки обонятельной информации у насекомых и рыб - несхожих по образу жизни и происхождению животных. У насекомых уровни АХ, АХЭ и ХАТФ

повышаются быстро в лепестках с ростом аксонов обонятельных нейронов от антенн к обонятельным лепесткам, а в деафферентированных лепестках (удаление развивающихся антенн) уровни этих ферментов значительно уменьшаются (Sanes et al., 1977; Waldrop, Hildebrand, 1989). Установлено также, что холинергическая система проявляет селективность в восприятии запаха. Она, скорее всего, связана с обычными обонятельными рецепторными терминалями, а не с феромон-чувствительными афферентами (Homberg et al., 1995).

Таким образом, особенности организации ХЕ системы обонятельной луковицы рыб могут быть обусловлены не генетически-родственными причинами, а конвергентной адаптацией.

Выводы

1. Впервые показано, что обонятельная луковица костистых и костнохрящевых рыб, независимо от их обонятельных способностей, имеет внутреннюю холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельной информации, так и в запоминании запахов.

2. Показано, что ортодромный потенциал, регистрируемый с поверхности обонятельной луковицы щуки и осетра, а также вызванная одорантом импульсная активность в обонятельном тракте карпа, модулируется холинергическими веществами.

3. Установлено, что в обонятельной выстилке и луковице удельная активность АХЭ зависит от обонятельной способности, как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в обонятельной луковице рыб асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ иотенциируется одорантами различных классов. Увеличение активности АХЭ в обонятельной луковице щуки в фазе развития посттетанической потенциации обусловлено синтезом фермента de novo.

митральной клетки, а также к денро-дендритным между интернейроном и релейным нейроном. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует о том, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин.

5. Обнаружено присутствие холинацетилтрансферазы фермента,синтезирующего ацетилхолин, в основных звеньях прямого афферентного пути - рецепторных аксонах, аксонных терминалях, аксодендритных синапсах и дендритах митральных клеток. Показано также наличие этого фермента в элементах дендритной сети, осуществляющей латеральную регуляцию внутри луковицы.

6. Установлено, что концентрация ионов хлора в слизи обонятельного эпителия соответствует концентрации их в плазме, натрия - значительно меньше, а калия - больше, чем в плазме. Ионный гомеостаз в слизи обонятельного эпителия пресноводных рыб поддерживается хлоридными клетками, транспортирующими ионы из организма в слизь.

7. В апикальной части обонятельной рецепторной клетки имеется система активного транспорта ионов хлора, создающая против электрохимического градиента повышенную концентрацию СГ в ней. Частью этой системы является С1-активируемая Мд АТРаза. Деполяризация большей части обонятельных рецепторных нейронов при рецепции амино- и желчных кислот происходит в результате выхода ионов хлора из клетки в результате активации Са-зависимых хлорных каналов инозитол-1,4,5- трифосфатом.

8. На основе анализа экспериментальных данных, полученных в результате исследования холинергических составляющих обонятельной системы рыб, предложен количественный критерий (по активности АХЭ) оценки обонятельных способностей рыб.

9. Ацетилхолин и оксид азота принимают участие в перирецепторных процессах, обеспечивая выход ионов кальция из внутриклеточных депо. Особенно это проявляется при рецепции аминокислот у рыб, адаптированных к низкокальциевой среде.

10. Установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются две стратегии защиты от химических неблагоприятных факторов среды:

в обонятельной выстилке обнаружены микровиллярные опорные клетки, выполняющие защитную функцию и обеспечивающие сохранность рецепторных элементов от воздействия ксенобиотиков.

- адаптация обонятельной системы к кислотному стрессу осуществляется за счет секреции слизи повышенной буферной емкости; секреторная активность клеток, секретирующих слизь, регулируется вегетативной нервной системой.

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Флерова Г.И., Гдовский П.А. Влияние изменения температуры на вызванные потенциалы обонятельной луковицы рыб // Нейрофизиол. 1975. Т. 7.N. 1. С. 97-99.

2. Флерова Г.И., Гдовский П.А. Скорость распространения возбуждения по волокнам обонятельного нерва и вызванные ответы обонятельного мозга рыб в условиях изменяющейся температуры // Вопр. ихтиол. 1976. Т.16. N. 1(96). С.119-125.

3. Гдовский П.А., Флеров Б. А. Физиолого-биохимические механизмы действия хлорорганических соединений у водных животных//Гидробиол. журн. 1979. Вып. 6. С. 76-84.

4. Ружинская H.H., Гдовский П.А. О специфической чувствительности обонятельных рецепторов карпа (Cyprinus carpió) и налима (Lota lota) // Сенсорная физиология рыб. Апатиты. 1984. С.70-72.

5. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Роль холинергической системы в восприятии запаха у рыб различной экологии // Тез. докл. Всес. конф. Экология и биол. и продукт. Баренцева моря. Мурманск. 1986. С. 227-228

6. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Влияние закисления среды на обонятельную чувствительность рыб // Тез. докл. Всес. конф. «Экология и биол. и продукт. Баренцева моря». Мурманск. 1986. С. 251-252.

7. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Влияние закисления среды на обонятельную систему карпа Cyprinus carpió // Вопр. ихтиол. 1988. Т. 28. N. 2. С. 259-302.

8. Гдовский П.А. О роли сАМР и кальция в генерации ЭОГ у рыб // Тез. докл.У1 Всес. симпозиум «Роль циклических нуклеидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций». Петрозаводск. 1988. С.114-115.

9. Ружинская H.H., Гдовский П.А. О специфической чувствительности обонятельных рецепторов карпа (Cyprinus carpió) и налима (Lota Iota) // Вопр. ихтиол. 1988. Т.28. N.5. С. 846-852.

10. Гдовский П.А., Ружинская H.H., Мензиков С.А., Мензикова О.В. Действие фосдрина на обонятельную систему карася // Тез. докл.У Всес. конф. по водной токсикол. Одесса. 1988. С.108.

11. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Оценка функционального развития обонятельной и зрительной сенсорных систем рыб по активности ацетилхолинэстеразы // Вопр. ихтиологии. 1990. Т.2. С. 305-314.

12. Мензиков С.А., Гдовский П.А. Влияние фуросемида на Mg-АТРазу из обонятельной выстилки карпа//Биохимия. 1990. Т.55. N. 6. С. 970-973.

13. Гдовский П.А., Мензиков С.А., Ружинская H.H. Транспорт ионов в обонятельном эпителии пресноводных костистых рыб // X Всесоюз. совещ. по эвол. физиол. памяти JI.A. Орбели. JT. 1990. С. 55.

14. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Особенности организации холинергической системы в обонятельной луковице рыб // X Всесоюз. совещ. по эвол. физиол. памяти JI.A. Орбели. Л. 1990. С. 55.

15. Ружинская H.H., Гдовский П.А., Мензикова О.В. Влияние аносмии и деафферентации на активность ацетилхолинэстеразы обонятельной луковицы карпа // Физиол. биохим. и токсикол. водных животных. Л.: Наука, 1990. С. 79-80.

16. Ружинская H.H., Гдовский П. А Локализация ацетилхолинэстеразы в обонятельной луковице карпа Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1990. Т. 26. N. 3. С. 323-327.

17. Гдовский П.А., Мензиков С.А., Ружинская H.H. Ионный состав слизи обонятельного эпителия пресноводных костистых рыб // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1991. Т.27. N. 1. С. 13-18.

18. Мензиков С.А., Гдовский П.П., Глебов Р.Н., Ребров И.Г. АТР-зависимый транспорт хлора в обонятельной выстилке карпа // Биохимия. 1991. Т. 56. N.6. С. 995-998.

19. Гдовский П.А., Мензиков С.А. Влияние фуросемида на экскрецию хлора и Mg-АТРазу жабр тилапии // Биол. науки. 1991. N. 1.С. 38-45.

20. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Ультраструктурная локализация ацетилхолинэстеразы в обонятельной луковице карпа

Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1992. Т.28. N. 6. С.715-719.

21. Гдовский П.А., Мензиков С.А. Физиолого-биохимические механизмы адаптации пресноводных рыб к закислению среды // Материалы I Междунар. симпозиум «Зооиндикация и экотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта». Днепропетровск. 1993.

22. Gdovskii P.A., Ruzhinskaya N.N. Cholinergic mechanism in fish olfactory system and its role in the discrimination of various biological signals // Chemoreception in aquatic vertebrates Noresaund, Norway. 1994.

23. Гдовский П.А., Мензиков C.A. Свойства Mg-АТРазы обонятельной выстилки рыб и амфибий // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. Т.ЗО. N. 5.С. 656-661.

24. Гдовский П.А., Гремячих В.А., Непомнящих В.А. Влияние аносмии на содержание глюкозы в крови и исследовательское поведение карпа в присутствии зрительного ориентира // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. Т.ЗО. N. 6. С. 746-752.

25. Мензиков С.А., Гдовский П.А., Мензикова O.B. Mg-ATP -регулятор активности С1-АТРаз в обонятельном эпителии рыб // Биохимия. 1995. Т. 61. N. 4. С. 555-559.

26. Ружинская H.H., Гдовский П.А Распределение ацетилхолинэстеразы в периферическом отделе обонятельной системы карпа Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1996. T.32.N. 1.С. 28-36.

27. Ружинская H.H., Гдовский П.А Ультраструктурная локализация холинацетилтрансферазы в клубочковом слое обонятельной луковицы карпа Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1997. Т. 33. N. 6. С. 657-661.

28. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Хлоридные клетки - составной компонент обонятельного эпителия рыб // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2001. Т. 37. N. 1.С. 69-73.

29. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Циклонуклеотид-зависимый путь обонятельной транедукции аминокислотного сигнала у карпа Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2001. Т. 37. N. 2. С. 114117.

30. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Долговременные посттетанические изменения синаптической передачи и морфологии

синапсов в обонятельной луковице щуки (Esox lucius L.) // Ж. эвол. биохим. И физиол. 2005. Т. 41. N. 1.

31. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Влияние холинергических веществ на пластичность синапсов в обонятельной луковице щуки (Esox lucius L.) II Ж. эвол. биохим и физиол. 2005. Т. 41. N. 1.

32. Ружинская H.H., Гдовский П.А. Активность ацетилхолинэстеразы в обонятельной луковице щуки (Esox lucius L.) и ее роль в развитии длительной посттетанической потенциации // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2005. Т. 41. N. 2.

Лицензия ПД 00661. Печ. л. 2. 3. 245. Т. 100. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, ул. Советская, 14а, тел. 30-56-63.

♦

РНБ Русский фонд

2005-4 45164

19 МАЙ 200

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гдовский, Петр Анатольевич

Введение. Общая характеристика работы

Глава 1. Обонятельная система животных основных филогенетических групп.

Обзор литературы.

1.1. Происхождение билатерального мозга

1.2. Ме1агоа

1.2.2. Хеморецепция кишечнополостных.

1.2.3. Хеморецепция гребневиков.

1.3. ЬорЫЛогосЫ^оа.

1.3.1. Хеморецепция плоских червей.

1.3.2. Хеморецепция аннелид.

1.3.3. Обонятельная система моллюсков. 21 1.3.3.1 Осфрадий.

1.3.3.2. Апикальный сенсорный орган.

1.3.3.3. Трансдукция химического сигнала метаморфоза у личинок моллюсков и балянуса.

1.4. Есёузогоа.

1.4.1. Обонятельная система нематод. 32 1.4.1.1. Роль химически сигналов в жизненном пространстве немадоды.

1.4.2. Обонятельная система насекомых.

1.4.3. Обонятельная система десятиногих раков.

1.5. ОюгсЫа

1.5.1. Ланцетник. Примордиум обонятельной системы.

1.5.2. Разделение обонятельной системы у тетрапод.

1.5.2.1. Вомероназальная система.

1.5.2.2. Септальный орган.

1.5.2.3. Основной обонятельный орган.

1.5.3. Структурные элементы хемосенсорного пути в обонятельном эпителии и обонятельной луковице у рыб.

1.5.4. Молекулярные компоненты трансдукции обонятельного сигнала.

1.5.4.1. Одорант связывающие белки.

1.5.4.2. Рецепторные белки. . 57 1.5.4.2.1. Рецепторы одорантов.

1.5.4.2.3. Рецепторы вомероназального органа.

1.5.4.2.4. Гуанилат циклаза Б - возможный рецептор феромонов.

1.5.4.2.5. С-белки.

Глава 2. Материал и методы исследования.

2. 1. Электрофизиологические исследования

2.2. Спектрофотометрическое определение ферментативной активности.

2.3. Подготовка ткани к гисто- и цитохимическим исследованиям.

2.4. Гистохимическое определение ферментативной активности.

2.4.1. Гистохимическое определение АХЭ и БХЭ.

2.4.2. Гистохимическое определение НАДФН диафоразы.

2.5. Цитохимическое определение АХЭ, ХАТФ и НАДФН диафоразы.

2.6. Определение транспорта ионов хлора с помощью 36С1.

2.7. Определение натрия, калия и ионов хлора.

2.8. Препаративные методы: дифференциальное центрифугирование и ультрафильтрация через миллипоровые фильтры.

2.9. Определение скорости синтеза АХЭ Собственные экспериментальные данные

Глава 3. Защита обонятельного эпителия рыб от неблагоприятных факторов внешней среды

3.1. Обзор литературы

3.2. Роль опорных клеток

3. .3. Роль секреторных клеток

Глава 4. Ионные механизмы трансдукции обонятельного сигнала у рыб.

4.1. Ионный состав слизи обонятельного эпителия амфибий и млекопитающих. 4.1.1. Обзор литературы.

4.2.1 Ионный состав слизи обонятельного эпителия пресноводных рыб.

Глава 5. Ионные механизмы трансдукции желчно- и аминокислотного обонятельного сигнала у рыб.

5.1. Принципиальная схема обонятельной трансдукции с участием цАМФ и ИЗФ.

5.2. Роль аминокислот и желчных кислот в коммуникации рыб.

5.2. Хлор-зависимые процессы в рецепторном отделе обонятельного эпителия

5.3. Роль вторичных мессенджеров в восприятии минокислотного обонятельного сигнала

5.4. Восприятие амино- и желчных кислот карпом при аклимации к низкокальциевой среде

5.5. Локализация ферментов обмена ацетилхолина и оксида азота в обонятельном эпителии

5.5.1 . Локализация АХЭ в обонятельной выстилке карпа

5.5.2. НАДФН диафораза в обонятельной выстилке карпа.

Глава 6. Холинергическая организация афферентного входа в обонятельную луковицу рыб

6.1. Влияние холинергических веществ на электрическую активность обонятельной луковицы рыб.

6.2. Локализация ацетилхолинэстеразы в обонятельной луковице карпа

6.3. Локализация НАДФН диафоразы в обонятельной луковице карпа

6.4. Ультраструктурная локализация холинергических ферментов в клубочковом слое обонятельной луковицы рыб

6.4.1. Синаптическия организация клубочкового нейропиля обонятельной луковицы рыб

6.4.2. Ультраструктурная локализация ацетилхолинэстеразы в клубочках и в нейронах обонятельной луковицы карпа

6.4.3. Ультраструктурная локализация холинацетилтрансферазы в клубочковом слое обонятельной луковицы карпа

6.5. Роль эндогенного ацетилхолина и ацетилхолинэстеразы обонятельной луковицы в сенсорных процессах

6.6. Локализация АХЭ и БХЭ в обонятельной луковице осетра. 146 Заключение 152 Выводы 155 Список цитированной литературы

Введение. Общая характеристика работы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб"

Принцип организации ОС у животных филогенетически далеких таксонов (моллюски, насекомые, десятиногие раки и позвоночные) одинаков. Столь удивительная общая морфологическая схожесть ОС, не гомологичной по происхождению, у этих животных определяется, во-первых, каскадом генов раннего развития и транскрипции — Нох, Dix и Pax, которые у них гомологичные (Franco et al., 2001; Ledje et al., 2002; Long et al., 2003), и, во-вторых, - конвергентной адаптацией (Eisthen, 2002). Построение ОС у животных различных phyla подобное, но не идентичное. Различия наблюдаются как на молекулярном, так и на морфологическом уровне. К настоящему времени накоплено много примеров, показывающих, что у очень далеких таксонов молекулярное обеспечение и морфологическое построение ОС близко, а у филогенетически родственных несколько отличается (Krieger, Breer, 1999; Zufall et al., 2000; Scott et al., 2001; Sullivan, Beltz, 2001; Eisthen, 2002).

Среди позвоночных животных большой интерес представляют костистые рыбы вследствие их филогенетического положения и адаптивных возможностей. Это самая большая группа позвоночных, включающая приблизительно 24 000 видов и составляющая больше, чем 99 % Actinopterygii, лучеперых рыб (Taylor, 2001; Christoffels, 2004).

Несмотря на большое сходство у позвоночных двух филогенетических линий, Actinopterygii и Sarcopterygii, построение ОС несколько различается анатомически, морфологически и, по-видимому, нейрохимически, что связано с задачами системы и средой обитания. ОС Sarcopterygii, особенно у млекопитающих, изучена более подробно, чем первой группы. Прогресс ОС в обеих группах в первую очередь связан с увеличением количества генов рецепторных белков. Это привело к усложнению морфологической организации обонятельной луковицы (OJI). Хотя слоистость OJI у костистых рыб выражена менее ярко, чем у млекопитающих, синоптическая организация клубочкового нейропиля не уступает им (Satou, 1990). Однако нейрохимическая организация OJI рыб только начинает исследоваться (Edwards, Michel, 2002, 2003), а отдельные работы по исследованию распределения холинергических ферментов OJI рыб показывают, что холинергическая система в OJI рыб может существенно отличаться от амфибий и млекопитающих. Ионные и молекулярные механизмы трансдукции у рыб также менее изучены (Kaneko et al., 2001).

Из-за недостаточной изученности ОС костистых рыб не возможно делать выводы о причинах (адаптация к условиям среды, анцестральные признаки или положение животного в эволюционном ряду) различий в морфологической и молекулярной организации ОС Actinopterygii и Sarcopterygii.

В связи с этим исследования по таким проблемам, как нейрохимическая организация OJI, первичные механизмы трансдукции обонятельного сигнала, гомеостаз ионного окружения апикальной части обонятельных рецепторных нейронов и защита её от неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов у костистых рыб, являются актуальным направлением в сенсорной и эволюционной физиологии.

Цель работы: установить особенности структурно-функциональной организации обонятельной выстилки и луковицы костистых рыб и выяснить обуславливающие их причины.

Для достижения цели решались следующиезадачи:

1. На гисто- и цитологических уровнях исследовать морфологию и сенсорные функции обонятельного эпителия при воздействии низких значений pH и сублетальной концентрации ксенобитика, 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфата (ДЦВФ).

2. Установить концентрацию основных ионов (Na+, К+, С1-) в слизи на поверхности обонятельной выстилки, выяснить механизм, создающий ионный гомеостаз в слизи и установить участвующие в этом процессе структуры.

3. Установить роль ионов натрия, калия и хлора в генерации рецепторного потенциала.

4. Провести исследование влияния холинергических и NO-ергических веществ на рецепторный потенциал (ЭОГ) у интактных рыб и адаптированных к следовым концентрациям кальция.

5. Провести биохимическое, гистохимическое и итохимическое исследование распределения ацетилхолинэстеразы (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.8) и холинацетилрансферазы (ацетил-КоА: холин-О-ацетилтрансфераза, ХАТФ; К.Ф. 2.3.1.6) в обонятельной луковице у рыб из различных систематических групп и выяснить роль эндогенного ацетилхолина обонятельной луковицы в процессах восприятия запаха.

6. Сопоставить полученные результаты с имеющимися в литературе данными по затронутой проблеме на других филогенетических группах животных и установить, какие особенности организации ОС костистых рыб обусловлены конвергентной адаптацией, а какие - анцестральными признаками.

Научная новизна. В работе впервые рассмотрена холинергическая нейрохимическая организация ОС рыб. Впервые установлено, что удельная активность АХЭ в ОС рыб зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в ОЛ асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Впервые установлена зависимость удельной активности АХЭ обонятельной луковицы рыб от состояния афферентного входа. Впервые выявлено, что в ОЛ рыб имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. Активность фермента в них зависит от афферентного входа. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин. Впервые показано, что в некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на пре- и постсинаптических мембранах. Исходя из их морфологии и расположения в ОЛ, можно предположить, что они относятся к аксо-дендритным синапсам между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритными между интернейроном и релейным нейроном. Впервые установлено, что в ОЛ рыб содержатся ХАТФ-позитивные нейроны и синапсы. Впервые показано, что в О Л рыб имеются М1 и М2 холинорецепторы (ХР). Функциональная активность подтипа М1-ХР проявляется только при запоминании запаха, (долговременная посттетаническая потенциация после тетанизации обонятельного нерва), в то время как М2-ХР осуществляют модулирующее влияние на релейные нейроны, участвуя, скорее всего, в первичной обработке обонятельного сигнала. Предлагается гипотеза, что обонятельная луковица рыб, независимо от степени развития обоняния, имеет собственную холинергическую систему. Впервые установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются специализированные микровиллярные клетки, ответственные за защиту ОВ от ксенобиотиков. Впервые определено, что у пресноводных рыб концентрация ионов хлора в обонятельной слизи сравнима с их содержанием в плазме. Поддержание столь высокой концентрации ионов в слизи, которая непосредственно контактирует с пресной водой, осуществляется специализированными ионтранспортирующими клетками. Впервые установлено, что в возникновении рецепторного потенциала (ЭОГ) ведущая роль принадлежит ионам хлора и кальция и показано, что при дефиците ионов кальция во внешней среде в процессах трансдукции обонятельного сигнала может участвовать Са2+ из внутриклеточных депо кальция.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы эволюции развития обонятельной системы у животных. Описанные взаимодействия на клеточном, молекулярном и функциональном уровнях в обонятельной выстилке и луковице костистых рыб свидетельствуют, что у них присутствует много анцестральных признаков, различия между филогенетическими группами позвоночных обусловлены ходом эволюции и принципиальных отличий в ОС не наблюдается. Однако по организации холинергического входа в обонятельную луковицу костистые рыбы резко отличаются от 8агсор1егуди и очень схожи с беспозвоночными. Это еще один пример конвергентной адаптации в развитии обонятельной системы животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. В рецепторном отделе обонятельной выстилки рыб поддержание ионного гомеостаза обеспечивают специализированные ионтранспортирующие клетки.

3. Ведущим ионом в трансдукции обонятельного сигнала у рыб является хлор. Вследствие повышенной концентрации в рецепторной клетке (за счет электрогенного транспорта) при открытии хлорных кальций-зависимых каналов он выходит из клетки и создается входящий деполяризующийся ток. Хлорными каналами в основном управляют инозитол-1,4,5-трифосфат и ионы кальция.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Представленные в диссертации материалы были доложены на: "Всес. совещании "Сенсорная физиология морских рыб" (Мурманск, 1984); Всес. конференции "Экология и биологическая продуктивность Баренцевого моря" (Мурманск, 1986); V Всес. конференции по водной токсикологии (Одесса, 1988); VI Всес. симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988); VI Всес. симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции"

Москва, 1988); Всес. совещании "Хемокоммуникация животных" (Москва, 1989); X Всес. совещании по эволюционной физиологии памяти Л.А. Орбели (Ленинград, 1990); VII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); The 15th Intracenter Workshop. (Columbia, USA, 1992); I Междунар. симпозиуме "Зооиндикация и эктотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта" (Днепропетровск, 1993); International symposium "Chemoreception in aquatic vertebrates" (Noresund, Norway, 1994); II Всероссийском совещании по поведению рыб (Борок, 1996); International symposium on Olfaction and Taste, XII and AChemS, XIX (San Diego, California, 1997); III междунар. конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних вод европейского Севера" (Сыктывкар, 2003); Междунар. научной конференции "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" (Петрозаводск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материал диссертации изложен на 221 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 3 7 схем и рисунков. Работа состоит из введения, б глав, выводов и списка цитируемой литературы (// 9 отечественных, 7SS иностранных источников).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гдовский, Петр Анатольевич

Выводы.

1. Впервые показано, что обонятельная луковица костистых и костнохрящевых рыб, независимо от их обонятельных способностей имеет внутреннюю холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельной информации, так и в запоминании запахов.

2. Показано, что ортодромный потенциал, регистрируемый с поверхности обонятельной луковицы щуки и осетра, а также вызванная одорантом импульсная активность в обонятельном тракте карпа, модулируются холинергическими веществами.

3. Установлено, что в обонятельной выстилке и луковице удельная активность АХЭ зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в обонятельной луковице рыб асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Увеличение активности АХЭ в обонятельной луковице щуки в фазе развития посттетанической потенциации обусловлено синтезом фермента de novo.

4. В обонятельной луковице карпа имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. В некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на пре- и постсинаптических мембранах. Эти синапсы относятся к аксо-дендритным синапсам между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритными между интернейроном и релейным нейроном. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин.

5. Обнаружено присутствие холинацетилтрансферазы, фермента синтезирующего ацетилхолин, в основных звеньях прямого афферентного пути — рецепторных аксонах, аксонных терминалях, аксодендритных синапсах и дендритах митральных клеток. Показано также наличие этого фермента в элементах дендритной сети, осуществляющей латеральную регуляцию внутри луковицы.

6. Установлено, что концентрация ионов хлора в слизи обонятельного эпителия соответствует концентрации их в плазме, натрия — значительно меньше, а калия — больше, чем в плазме. Ионный гомеостаз в слизи обонятельного эпителия пресноводных рыб поддерживается хлоридными клетками, транспортирующими ионы из организма в слизь.

7. В апикальной части обонятельной рецепторной клетки имеется система активного транспорта ионов хлора, создающая против электрохимического градиента повышенную концентрацию С1- в ней. Частью этой системы является С1-активируемая М^ АТРаза. Деполяризация большей части обонятельных рецепторных нейронов при рецепции амино- и желчных кислот происходит в результате выхода ионов хлора из клетки в результате активации Са-зависимых хлорных каналов инозитол-1,4,5- трифосфатом.

10. Установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются две стратегии защиты от химических неблагоприятных факторов среды: в обонятельной выстилке обнаружены микровиллярные опорные клетки, выполняющие защитную функцию и обеспечивающие сохранность рецепторных элементов от воздействия ксенобиотиков.

• Заключение.

В данной работе представлены экспериментально полученные функциональные и структурные характеристики периферического и первого центрального отделов обонятельной системы рыб и сопоставлены с литературными данными по другим филогенетически близким и далеким животным.

Установлено, что у рыб осуществление защиты обонятельного эпителия от неблагоприятных химических факторов окружающей среды сравнимо с таковым у млекопитающих. Показано, что у рыб в ОЭ, так же, как и у млекопитающих, присутствуют специализированные микровиллярные клетки, активизирующиеся при воздействии токсических веществ. Активное участие в защите ОЭ принимают секреторные клетки эпителия, которые не только усиливают секрецию, но и изменяют химический состав секретируемой ими слизи. Регуляция выделения слизи и ее химический состав находятся под контролем вегетативной нервной системы. Результаты наших экспериментов показывают, что у рыб защита ОЭ сравнима с таковой у млекопитающих. Однако на тетраподах эта проблема исследована шире. Показано, что выделение слизи контролируется как адренергической, так и холинергической системами, причем последняя управляет выделением слизи несколькими субтипами холинорецепторов, на которые ложится разная функциональная нагрузка (Okayama et al., 1993). Показано также, что животные, ведущие различный образ жизни, имеют различное оснащение ОЭ специализированными микровиллярными клетками (Ferrari et al., 1998,2000; Byrum et al., 2001).

При исследовании ионного состава обонятельной слизи пресноводных рыб установлено, что концентрация ионов хлора в ней соответствует концентрации их в плазме, а натрия - значительно меньше, чем в плазме. Установлено, что поток электролитов направлен из организма в слизь, транспорт их осуществляют специализированные клетки, так ф называемые хлоридные клетки, или, как сейчас принято — "mitochondria-rich cell".

У млекопитающих и наземных амфибий обонятельная слизь и плазма не различаются по концентрациям этих ионов (Минор и др., 1990; Chiu et al., 1988; Grubb et al., 2002). В обонятельном эпителии наземных позвоночных электролиты поступают в слизь пассивно, вместе с секретирующейся слизью (Бронштейн, 1977), а гомеостаз ионов поддерживается активными электрогенными процессами - перемещением ионов из слизи внутрь организма (Persaund et al., 1987, 1988)

Показанное нами соотношение натрия и хлора в обонятельной слизи - скорее всего характерная особенность для всех обитателей пресных вод, у которых ОЭ контактирует с водой. В связи со столь необычным ионным окружением электрогенного участка рецепторного нейрона ведущим ионом в возникновении рецепторного потенциала становится хлор. У наземных же животных ионы хлора, хоть и играют важную роль в электрогенезе рецепторного потенциала, но выполняют только модулирующую роль, облегчая процессы возбуждения и восстановления (Kleene, Gesteland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi, Yau, 1993, 1994; Lowe, Gold, 1993; Firestein et al., 1994). На сегодняшний день, с получением новых результатов, ионам хлора в обонятельной трансдукции отводится еще большая роль (Reuter et al., 1998; Kaneko et al., 2001; Reisert et al, 2005). Обонятельная рецепторная клетка крыс выделяется среди других нейронов очень высокой концентрацией внутриклеточного [Cl"]i - 70 - 80 мМ (Reuter et al., 1998; Kaneko et al., 2001) и внешним окружением этого иона (32 мМ) (Reuter et al., 1998). Против электрохимического градиента ионы хлора переносятся Na/K/2C1 котранспортером (NKCC1), который чувствителен к аналогам фуросемида (Reisert et al, 2005). По всей видимости, обнаруженная нами система АТФ зависимого транспорта СГ и фуросемд чувствительная С1-АТФаза в обонятельной выстилке рыб является гомологичной котранспортеру NKCC1 млекопитающих.

Исследование роли вторичных мессенджеров в восприятии одорантов показало, что общий принцип трансдукции у рыб схож со всеми другими изученными животными. Однако при оценке восприятия L-серина в широком диапазоне концентрации установлено, что внутриклеточный путь трансдукции этой АК зависит от ее концентрации (Гдовский, Ружинская, 2001). Этот механизм регуляции трансдукции может объяснить различные формы поведения рыб при восприятии одной и той же аминокислоты.

Особое место занимают результаты по исследованию холинергической (ХЕ) системы обонятельной луковицы рыб. Во-первых, в обонятельной луковице активность АХЭ распределена асимметрично. В медиальной части луковицы активность АХЭ достоверно больше на треть, чем в латеральной области (Ружинская, Гдовский, 1992). У рыб, в отличие от тетрапод, одна обонятельная система. Вомероназальная система, ответственная за восприятие половых феромонов отсутствует. Однако обонятельная луковица рыб разделяется функционально на латеральную и медиальную области при восприятии общих запахов (в том числе пищевых) и феромонов, соответственно (Ружинская, Гдовский, 1984, 1988; Dulka, 1993). Активация АХЭ в этих частях луковицы соответствует природе стимула (Ружинская, Гдовский, 1992). Во-вторых, получены убедительные доказательства, что у костистых рыб имеются прямой афферентный ХЕ вход в обонятельную луковицу и внутрилуковичная холинергическая система (Gdovskii, Ruzhinskaya, 1994;.Ружинская и др., 1997). Известно также, что у акул и голостей наблюдается схожая картина. У хрящевых рыб релейные нейроны являются и АХЭ-позитивными (Kusunoki et al., 1973), и ХАТФ-позитивными, а в латеральном обонятельном тракте проходят ХАТФ-позитивные волокна, которые могут быть аксонами этих клеток. Кроме того, в слое зернистых клеток имеется рассеянная популяция ХАТФ-позитивных клеток (Anadon et al., 2000). На другом представителе костных рыб, длинноносой щуке (Lepisteus osseus), показано, что слой зернистых клеток является АХЭ-положительным (Northcutt, Braford, 1977). Обонятельная луковица амфибий и млекопитающих не получает рецепторный афферентный ХЕ вход. Вследствие этого в первом слое OJI, слое волокон обонятельного нерва, отсутствуют АХЭ, ХАТФ и ХР (Le Jeune et al., 1993). Все ХЕ элементы внутренних слоев обонятельной луковицы млекопитающих и амфибий обусловлены ХЕ проекциями от базального переднего мозга (Рагимова, Крацкин, 1984; Крацкин, 1989; Senut et al.,1989; Marin et al., 1997). Установлено, что в OJI амфибий, насекомоядных и грызунов ХАТФ-позитивные клетки отсутствуют, а наблюдаются только волокна, приходящие в обонятельную луковицу по медиальному тракту (Le Jeune, Jordan, 1993; Crespo, 1999; Senut et al., 1989). В обонятельной луковице крыс АХЭ-позитивность проявляют кисточковые клетки, относящиеся к релейным нейронам, перигломерулярные и поверхностные короткоаксонные клетки - интернейроны (Nickell, Shipley, 1988; Le Jeune, Jordan', 1993; Kasa et al., 1995). Эти три типа холиноцептивных, нехолинергических нейронов являются основными мишенями холинергического входа из магноцелюлярного ядра переднего мозга. В связи с такой нейрохимической структурированностью ХЕ ферментов, АХ оказывает лишь модулирующее влияние на электрическую активность OJI у крыс. В конечном итоге ХЕ афференты, уменьшая тормозное действие интернейронов, могут облегчать передачу сигнала от релейных нейронов к центральным структурам (Ravel et al., 1990; Kasa et al., 1995; Castillo et al., 1999; Crespo et al., 2000).

Такое разительное различие ХЕ систем первого обонятельного центра у Actinopterygii и Sarcopterygii могло произойти по причине того, что у Actinopterygii переднее обонятельное ядро осталось в OJI, не мигрировало в передний мозг, как у тетрапод. Но это предположение может объяснить только внутрилуковичную ХЕ систему, связанную с внутренним клеточным слоем ОЛ. Но оно не затрагивает причин различия в афферентном входе. Можно предположить, что эласмобранхии и лучеперые рыбы - близкородственны, a Sarcopterygii имели независимого предка. Это может быть также обосновано альтернативной гипотезой основного древа позвоночных, подкрепленной большим генетическим материалом (Martin, 2001).

Однако может быть и другая причина. Рыбы по организации холинергического пути прохождения обонятельной информации в ассоциативные центры мозга в животном мире не исключение. Наблюдается поразительное сходство гистохимической, цитохимической организации ХЕ входа в обонятельную систему и функций ХЕ системы в осуществлении обработки обонятельной информации у этих несхожих по образу жизни и происхождению животных. У насекомых уровни АХ, АХЭ и ХАТФ повышаются быстро в лепестках с ростом аксонов обонятельных нейронов от антенн к обонятельным лепесткам, а в деафферентированных лепестках (удаление развивающихся антенн) уровни этих ферментов значительно уменьшаются (Sanes et al., 1977; Waldrop, Hildebrand, 1989). Установлено также, что холинергическая система проявляет селективность в восприятии запаха. Она, скорее всего, связана с обычными обонятельными рецепторными терминалями, а не с феромон чувствительными афферентами (Homberg et al., 1995). Таким образом, особенности организации ХЕ системы обонятельной луковицы рыб могут быть обусловлены не генетически-родственными причинами, а конвергентной адаптацией.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гдовский, Петр Анатольевич, Борок

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М. Наука. 1994. 288с.

2. Аронова М.З. Сенсорные системы гребневиков: Автореф. докт. дис. JL, 1987.

3. Аронова М.З., Алексеева Т.М. Морфофункциональные особенности хеморецепторов гребневиков Beroe cucumis // Сенс.Системы. 1991. Т. 5. С. 5-15.

4. Аронова М.З., Алексеева Т.М. Ультраструктурная организация предполагаемых хеморецепторных клеток губ гребневика Beroe cucumis // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1984а. Т. 20. С. 206-211.

5. Аронова М.З., Алексеева Т.М. Ультраструктурная организация эпителия губ гребнивика Beroe cucumis //Ж. эвол. биохим. и физиол. 19846. Т. 20. С. 386-390.

6. Аронова М.З., Алексеева Т.М. Развитие хеморецепторных клеток в оральном эпителии взрослых гребнивиков Beroe Cucumis // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2003. Т. 39. С. 577-585.

7. Бахтин Е.К., Филюшина Е.Е. Ультраструктурные особенности секреторных клеток и секрета обонятельной выстилки некоторых видов рыб, связанные с возможным механизмом обонятельной рецепции // Цитология. 1974. Т.15. С. 1089-1094.

8. Бонашевская Т. И. о барьерной функции опорных клеток рецепторного отдела обонятельного анализатора//Цитология. 1975. Т. 17. С. 1351-1356.

9. Бондаренко В.Ф. Сигнальное значение аминокислот в пищевом поведение карпа. Автореф. Канд. Дисс. 1982. М. 15С.

10. Бронштейн A.A. Обонятельные рецепторы позвоночных // JL: Наука. 1977. 159с.

11. Бронштейн A.A. Опыт гистохимического изучения обонятельной выстилки позвоночных животных при воздействии на нее пахучими веществами // ДАН СССР. 1962. Т. 145. № 3. С. 661-664.

12. Бронштейн A.A., Леонтьев В.Г. О содержании натрия и калия в слизи обонятельной выстилки позвоночных //Ж. эвол. биохим. и физиол. 1972. Т.8. С. 580-585.

13. Бронштейн A.A., Леонтьев В.Г., Пяткина Г.А. О содержании ионов в обонятельной слизи и роли ионов в движение обонятельных жгутиков // Механизмы работы рецепторных элементов органов чувств. Л.: Наука.1973. С. 98-103.

14. Бронштейн A.A., Пяткина Г.А. Ультраструктурная организация органа обоняния птиц // Матер. VII Всесоюзн. конф. по электронной микроскопии. Секция IV. Киев. 19696. С. 130.

15. Бронштейн А.А., Пяткнна Г.А. Электронномикроекопичеекое исследование локализации ионов натрия в органе обоняния лягушки Rana temporaria // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1969а. Т. 5. С. 274-278.

16. Винников А.Я. Цитологические и молекулярные основы рецепции. Наука. JI. 1971. 298 с.

17. Винников А.Я. Эволюция рецепторов. Наука. JI. 1979. 140 с.

18. Винников Я.А., Пяткина Г.А., Шахматова Е.И., Наточин Ю.В. Структура и ионный состав обонятельной и респираторной слизи осетровых рыб и окислительная гипотеза обоняния// ДАН СССР. 1979.Т. 245. С. 750-753.

19. Виноградов Г.А. Процессы ионной регуляции у пресноводных рыб и беспозвоночных. Экологические и эволюционные аспекты. Автореф. док. дис. JL 1987. 50с.

20. Виноградов Г.А., Гдовский П.А., Матей Е.В. Закисление водоемов и его влияние на метаболизм у пресноводных животных // Физиол. Паразитол. Пресн. Животных. Д.: Наука. 1979. С. 3-16.

21. Гдовский П.А. О роли сАМР и кальция в генерации ЭОГ у рыб // Тез.докл.У1 Всес.симпозиум Роль циклических нуклеидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций. Петрозаводск. 1988. С.114-115.

22. Гдовский П.А., Гремячих В.А., Непомящих В.А. Влияние аносмии на содержание глюкозы в крови и исследовательское поведение карпа в присутствие зрительного ориентира//Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. Т.30. N. 6. С. 746-752.

23. Гдовский П.А., Мензиков С.А. Физиолого-биохимические механизмы адаптации пресноводных рыб к закислению среды // Материалы I Междунар. симпозиум Зооиндикация и экотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта. Днепропетровск. 1993.

24. Гдовский П.А., Мензиков С.А. Влияние фуросемида на экскрецию хлора и Mg-АТРазу жабр тилапии // Биол. науки. 1991. N. 1. С. 38-45.

25. Гдовский П.А., Мензиков С.А. Свойства Mg-АТРазы обонятельной выстилки рыб и амфибий // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1994. Т.30. N. 5. С. 656-661.

26. Гдовский П.А., Мензиков С.А., Ружинская Н.Н. Ионный состав слизи обонятельного эпителия пресноводных костистых рыб // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1991. Т.27. N. 1. С. 13-18.

27. Гдовский П.А., Мензиков С.А., Ружинская Н.Н. Роль ионов хлора и С1-активируемой Mg-АТРазы в электрогенезе обонятельного рецепторного потенциала у пресноводных рыб//Сенс.Системы. 1992 Т. 6. С. 92-94.

28. Гдовский П.А., Мензиков С.А., Ружинская H.H. Транспорт ионов в обонятельном эпителии пресноводных костистых рыб // X Всесоюз. совещ. по эвол. физиол. памяти Л.А. Орбели. Л. 1990. С. 55.

29. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Влияние закисления среды на обонятельную систему карпа Cyprinus carpió // Вопр. ихтиол. 1988. Т. 28. N. 2. С. 259-302.

30. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Влияние ионов меди на периферический отдел обонятельной системы карпа Cyprinus carpió //Биол. внутр. вод. 2001. № 1. С.90-95.

31. Гдовский П.А., Ружинская H.H. О защитной функции микровиллярных опорных клеток обонятельной выстилки тиляпии Oreochromis mossambicus Peters, 1852 // Биол. внутр. вод. 2000. №4. С. 127-132.

32. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Особенности организации холинергической системы в обонятельной луковице рыб // X Всесоюз. совещ. по эвол. физиол. памяти Л.А. Орбели. Л. 1990. С. 55.

33. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Оценка функционального развития обонятельной и зрительной сенсорных систем рыб по активности ацетилхолинэстеразы // Вопр. Ихтиол. 1990. Т.2. С. 305-314.

34. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Роль холинергической системы в восприятии запаха у рыб различной экологии // Тез. докл. Всес. конф. Экология и биол. и продукт. Баренцева моря. Мурманск. 1986. С. 227-228

35. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Способ определения функционального развития обонятельной и зрительнойсенсорных систем у рыб и амфибий // Авторское свидет. SU 1423075 Al. 1988. Бюл. №34.

36. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Циклонуклеотид-звисимый путь обонятельной трансдукции аминокислотного сигнала у карпа Cyprinus carpió // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2001. Т. 37. N. 2. С. 114-117.

37. Гдовский П.А., Ружинская H.H. Электрофизиологическое изучение действия полихлорпинена (ПХП) на обонятельную систему рыб // Физиол. и биохим. аспекты токсикол, пресноводных животных Борок. Деп.ВИНИТИ № 1637-84Деп 1984. С. 191210.

38. Гдовский П.А., Ружинская H.H., Мензиков С.А., Мензикова О.В. Действие фосдрина на обонятельную систему карася // Тез. докл.У Всес. Конф. по водной токсикол. Одесса. 1988. С.108.

39. Гдовский П.А., Ружинская H.H., Чуйко Г.М., Подгорная В.А. Распределение ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы в мозгу осетра // Матер. III междун.40.

Информация о работе

Гдовский, Петр Анатольевич
доктора биологических наук
Борок, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы