Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточный транспорт белков ТБГ2 и ТБГ3 вирусов растений

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточный транспорт белков ТБГ2 и ТБГ3 вирусов растений"

На правах рукописи

ЩЕПЕТИЛЬНИКОВ Михаил Вячеславович

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ БЕЛКОВ ТБГ2 И ТБГЗ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

03.00.06 - ВИРУСОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2006

Работа выполнена в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Соловьев Андрей Геннадьевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор

Завриев Сергей Кнрнаковнч

доктор биологических наук, профессор

Аграновский Алексей Анатольевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея РАМН

Защита состоится 2 ноября 2006 года в "на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «Р(» октября 2006 года

УЧеный секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

__

Н.О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение молекулярных механизмов внутриклеточного транспорта вирусов растений представляет собой одно из основных направлений современной ■ фитовирусологии. Транспортные белки вирусов принято рассматривать в качестве удобной модельной системы для исследования механизмов внутриклеточного транспорта в клетках растений, что имеет большое теоретическое и практическое значение, позволяя разрабатывать эффективные способы защиты растений от вирусной инфекции.

Транспортные белки обеспечивают перенос вирусного генома внутри клетки, а также его межклеточный транспорт и распространение по растению (Atabekov and Dorokhov, 1984). На основании особенностей организации генома принято выделять группу вирусов с тройным блоком транспортных генов (ТБГ), который содержит три гена, кодирующих белки ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ (Morozov and Solovyev, 2003). Функциональное взаимодействие всех трех белков необходимо для транспорта вируса в зараженном растении (Erhardt et al., 2005; Lauber et al., 1998; Lawrence & Jackson, 2001; Solovyev et al., 1999; Zamyatnin et al., 2004).

Объектом настоящей работы являлись белки ТБГ2 и ТБГЗ ТБГ-содержащих вирусов растений. Ранее была показана специфическая локализация белка ТБГ2 в мембранах эндоплазматического ретикулума, а также способность ТБГЗ транспортироваться на периферию клетки и формировать мембранные структуры в области плазмодесмы (Cowan et al., 2002; Gorshkova et al., 2003; Haupt et al., 2005; Solovyev et al., 2000; Zamyatnin et al., 2002), но сигналы, направляющие их внутриклеточный транспорт, не были картированы. Существуют многочисленные экспериментальные данные, согласно которым для специфической внутриклеточной локализации транспортных белков вирусов растений, принадлежащих различным систематическим группам, необходимы структуры цитоскелета в клетках (Heinlein et al., 1995; Mas et al., 1999; McLean et al., 1995; Prokhnevsky et al., 2005). Однако, возможный вклад актиновых филаментов и микротрубочек в процесс транспорта белков ТБГ2 и ТБГЗ не был до сих пор исследовна. Кроме того, отсутствовали сведения об участии классического секреторного пути и отдельных внутриклеточных мембранных компартментов, как, например, аппарата Гольджи, в транспорте этих белков.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение механизмов внутриклеточного транспорта белков ТБГ2 и ТБГЗ вирусов растений. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение последовательностей белка ТБГ2, отвечающих за его специфическую

локализацию в клетках растений;

2. Картирование районов белка ТБГЗ, необходимых для его транспорта на периферию клеток растений;

3. Изучение роли СОРН-везикул в транспорте белка ТБГЗ из ЭПР;

4. Определение способности белка ТБГЗ использовать классический секреторный путь для специфической локализации на периферии клетки;

5. Изучение влияния элементов цитоскелета на внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе была изучена роль второго трансмембранного сегмента в специфической локализации белка ТБГ2 в структурах ЭПР. Были картированы последовательности белка ТБГЗ, отвечающие за его транспорт на периферию клетки. Показано, что ТБГЗ транспортируется из ЭПР COPII-независимо. Получены данные о том, что ТБГЗ специфически локализуется на периферии клетки, минуя классический секреторный путь, и в процессе транспорта ТБГЗ не участвуют малые клеточные ГТФазы семейств Rab и Arf, отвечающие за формирование и отпочковывание транспортных везикул. Было показано, что разрушение микротрубочек и акгиновых филаментов при обработке специфическими химическими реагентами не влияет на транспорт белка ТБГЗ на периферию клетки. Работа имеет теоретическое значение для дальнейших исследований молекулярных механизмов внутриклеточного транспорта вирусов растений. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых подходов к созданию устойчивых к вирусной инфекции трансгенных растений.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на российской и международных конференциях: 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, Санкт-Петербург, Россия, 2003; The 6th Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, Болонья, Италия, 2005; The 6th International Symposium in Series Recent Advances in Plant Biotechnology From Laboratory to Business, Чески Будеёвицы, Чехия, 2005, а так же на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Структура работы

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на I9C страницах, содержит (3 иллюстраций. Список литературы включает36$публикаций.

2

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Геномы ряда вирусов растений несут тройной блок генов (ТБГ), эволюционпо консервативный генный модуль, кодирующий три транспортных белка, называемые ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ {Morozov and Solovyev, 2003). Эти белки обеспечивают направленный внутриклеточный транспорт вирусного генома к плазмодесмам и последующую транслокацию в соседние клетки через микроканалы плазмодесм. Детали молекулярного механизма ТБГ-зависимого транспорта в настоящее время неизвестны, но имеющиеся данные позволяют с достаточной долей уверенности говорить о том, какие функции выполняет каждый из белков ТБГ. Так, белок ТБГ1, обладающий РНК-связывающими свойствами, участвует в формировании транспортных рибонуклеопротеинов (РНП), комплексов, содержащих вирусную геномную РНК и предназначенных для транслокации через плазмодесмы (Morozov and Solovyev, 2003). Белки ТБГ2 и ТБГЗ обеспечивают транспорт таких Р1Ш к плазмодесмам за счет сигналов внутриклеточного транспорта, локализованных в белке ТБГЗ, тогда как дальнейший транспорт через плазмодесмы в соседние клетки требует энзимагических активностей белка ТБГ1 (Morozov and Solovyev, 2003; Zamyatnin et at., 2004). Выяснение механизмов внутриклеточного транспорта белков ТБГ, таким образом, требует детального анализа сигналов внутриклеточной локализации белков ТБГ2 и ТБГЗ а также путей их внутриклеточного транспорта. В настоящей работе предпринята попытка такого анализа применительно к белкам ТБГ2 и ТБГЗ, кодируемых вирусами, принадлежащими к двум таксономическим группам, Х-вирусом картофеля (PVX, потексвирус) и полулатентным вирусом мятлика (PSLV, гордеивирус).

Локализация и внутриклеточный транспорт белка ТБГ2 PSLV

Ранее было показано, что GFP-15K (ТБГ2 PSLV, слитый с маркерным зеленым флуоресцирующим белком GFP), локализован преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) (Solovyev et al., 2000; Zamyatnin et al., 2002 и Рис. 2a). Было также обнаружено, что делеции, затрагивающие гидрофильные районы белка ТБГ2 PSLV, не влияют на его локализацию в мембранах ЭПР (Solovyev et al., 2000). В настоящей работе было выявлено, что на внутриклеточную локализацию ТБГ2 существенное влияние оказывает второй трансмембранный сегмент белка.

Были получены мутанты GFP-15K с делениями двух, четырех, восьми и шестнадцати аминокислотных остатков в последовательности трансмембранного сегмента (GFP-15K-d2, GFP-15K-d4, GFP-15K-d8 и GFP-15K-dl6, соответственно), а также мутанты GFP-15K-in3 и GFP-15K-in6 (с удлинением трансмембранного сегмента на три и шесть аминокислотных остатков, соответственно) (Рис. 1). Мутант GFP-15K-mut содержал замену последовательности трансмембранного сегмента на неспецифическую гидрофобную

последовательность (Рис. 1). Мутантные гены экспрессировали в клетках эпидермиса N. Ъешкатапа с помощью агроинфильтрации или бомбардировки листьев микрочастицами металла, несущими соответствующие векторы экспрессии.

РЯЬУ15К

СБХ.ОСхУхПй

15К Э 3 РСМЫ,РТЬРГ IЮ ГУБ УЬИА------Т1«ЗЕ1М

15К-<12 ззрсзмы-ртитиехуагс.--------ТЯЗЕГМ

1Ж-а4 ЗЗРСМЫРТХ-РТПЭГУБ----------ТЕЭЕШ

15К-Л8 ЗЗРСМЫ.РТЫТИ--------------ТНСЕ1М

15К-а1б БЭРОМЬ----------------------тявЕГм

15КтЗ SSPGMLLPTLFTIiarVSYLWAI.IL---ТЯСЕ1М

15К-Ш6 3 Я РСМЫ,РТХ.ГГ 11вГ/35ГЬИА1.1Ъ31 ИКСЕ1 м.

15К-пи^ Б 3 РСМЬЬРТЬА! 11ЫШШ,------Т1«ЗЕ1М

Рис. 1. Мутагенез белка ТБГ2 РБЬУ. Белок схематически обозначен прямоугольником, закрашенные фрагменты которого обозначают трансмембранные сегменты белка. В центральной области белка указаш консервативная последовательность. Приведена аминокислотная последовательность района, подвергавшегося мутагенезу, и последовательности полученных мутантов.

Было показано, что только уменьшение длины трансмембранного сегмента на четыре и более остатков (Рис. 1) приводит к неспособности белка локализоваться в структурах ЭПР (Рис. 2Ь, 2с, 2с)), тогда как его удлинение или замена на неспецифическую гидрофобную последовательность (Рис. 1) не влияет на внутриклеточную локализацию (данные не показаны). ОГР-15К-<М локализован в многочисленных подвижных везикулах, но не в сети кортикального ЭПР (Рис. 2Ь), тогда как СРР-15К-с18 детектировался в везикулах, напоминающих структуры, в которых обнаруживался СРР-15К-<34, но образующих агрегаты и неспособных к внутриклеточному движению (Рис. 2с). ОРР-15К-с116 локализовался в немногочисленных крупных везикулярных структурах внутри клетки (Рис. 2(1), которые варьировали по форме и часто образовывали «пары» и, реже, — «цепочки». Ко-экспрессия мутантов ТБГ2 РвЬУ с маркерами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) шСКР5-ЕЯ (Назе1о£Г е1 а]., 1997) и аппарата Гольджи (АГ) БТ-УРР (Воеутк е1 а1„ 1998 и Рис. 2е) показала, что структуры, в которые распределяются мутантные белки, не содержат ни одного их этих маркеров (Рис. 2Г, 2g, 2Ь и данные не показаны).

Таким образом, определяющим фактором локализации ТБГ2 в ЭПР является длина, но не специфическая последовательность этого сегмента белка. Известно, что локализация белков в ЭПР может быть либо статической, т.е. являться результатом действия механизма, препятствующего выходу данного белка из ЭПР, либо динамической, т.е. возникающей в результате действия сигналов, обеспечивающих возвращение белка из других мембранных структур, куда белок может транспортироваться из ЭПР в отсутствие механизма,

препятствующего его выходу из этого компартмента (Gomord et al., 1999). В настоящей работе не было выявлено, какой из этих механизмов действует в случае ТБГ2, так же как не была определена природа мембранных компартментов, в которых локализуются его мутанты с делециями 4, 8 и 16 аминокислотных остатков во втором гидрофобном сегменте. Однако следует отметить, что в тех известных в настоящее время случаях, когда локализация мембранных белков определяется именно длиной их трансмембранных сегментов, такая локализация является статической (Munro, 1995; Rayner and Pelham, 1997).

E IF IG : - [H

Рис. 2. Изображения клеток эпидермиса N. benthamiana, зкспрессирующих белок ТБГ2 и его мутанты, слитые с GFP, Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, (а) Локализация GFP-15K. (£>) Локализация GFP-15K-d4. (с) Локализация GFP-15K-d8. (d) Локализация GFP-15K-dl6. (е) Локализация ST-YFP. (J) КС-локализация GFP-15K-d4 и маркера AT ST-YFP. (g) Ко-локализация GFP-15K-d8 и ST-YFP. (А) Ко-локализация GFP-15K-dl6 и ST-YFP. Для визуализации ко-локализации белков использовали наложение изображений, полученных независимо для каждого флуоресцирующего белка. Масштабная линейка, 20 мкм.

Ни один из этих способов локализации ТБГ2 в ЭПР (статический или динамический) не противоречит имеющимся данным о способности ТБГ2 изменять свою локализацию в присутствии других вирусных белков. Во-первых, при временной ко-экспрессии двух изолированных генов, ТБГЗ направляет ТБГ2 в периферические тельца, в которых локализован сам ТБГЗ (Solovyev et al„ 2000; Zamyatnin et al, 2002). Во-вторых, как было недавно показано для белка ТБГ2 вируса штриховатой мозаики ячменя (гордеивируса, родственного PSLV), в клетках, инфицированных вирусом, ТБГ2 ассоциирован с участками оболочки хлоропластов, где происходит репликация вируса (Torrance et al, 2006). Эти данные согласуются с имеющимися представлениями о роли ТБГ2 в ТБГ-зависимом

внутриклеточном транспорте (Morozov and Solovyev, 2003; Zamyatnin et al., 2004). Действительно, ТБГ2 вируса скручивания верхушек картофеля (PMTV, помовирус) необходим для ТРГЗ-зависимого транспорта к плазмодесмам белка ТБГ1 (Zamyatnin et al, 2004), а также, как полагают, и ТБГ1-содержащих РНП. Весьма вероятно, что мобилизация ТБГ2 в сайты репликации вируса, где может происходить взаимодействие ТБГ1 и ново-синтезированной геномной РНК с образованием транспортных РНП, необходима для взаимодействия этих структур с ТБГЗ, который обеспечивает транспорт макромолекулярных комплексов к плазмодесмам. Такая модель предполагает способность ТБГЗ транспортировать ТБГ2 в периферические тельца не только из ЭПР, как при временной экспрессии индивидуальных белков, но и из сайтов репликации вируса, которые могут быть ассоциированы, как в случае гордеивирусов, с хлоропластами.

Локализация и внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ PVX

Ранее сообщалось, что слитый с GFP ТБГЗ PVX локализован в сети кортикального ЭПР (Krishnamurthy et al, 2003), что существенно отличало его от белков ТБГЗ других вирусов, локализованных в периферических тельцах (Gorshkova et al, 2003; Solovyev et al, 2000; Zamyatnin et al, 2002, 2004). В наших экспериментах использовался аналогичный слитный белок GFP-8K, сконструированный в соответствии с данными Krishnamurthy et al. (2002) и локализовавшийся при экспрессии в клетках растений в сети кортикального ЭПР (Рис. За). Полученные в настоящей работе данные позволяют утверждать, что такой слитный белок является нефункциональным. Во-первых, GFP-8K не способен комплементировать транспорт PVX, мутантного по гену ТБГЗ (данные не показаны). Во-вторых, GFP-8K имеет внутриклеточную локализацию, отличающуюся от белка, не слитого с GFP, поскольку при ко-экспрессии GFP-8K и ТБГЗ дикого типа было показано, что GFP-8K локализован в периферических тельцах (Рис. 3d), что может объясняться только тем, что в этом случае GFP-8K перенаправляется в сайты локализации белка дикого типа. Эти данные подтверждаются тем, что в клетках, зараженных PVX, GFP-8K локализовался в периферических тельцах (Рис. ЗЬ, Зс). Таким образом, можно заключить, что в присутствии белка ТБГЗ PVX дикого типа способность локализоваться в периферических тельцах, утраченная белком, слитым с GFP, восстанавливается. В-третьих, было показано, что GFP-8К не способен направлять ТБГ2 PVX из популяции внутриклеточных везикул (Рис. Зе) в периферические тельца (Рис. 3g), как это делает белок дикого типа (Рис. 3f).

Используя ко-экспрессию GFP-8K и 8К в сочетании с мутагенезом, мы анализировали роль различных районов белка в его внутриклеточной локализации, а также путь его внутриклеточного транспорта. В экспериментах применялась бицистронная конструкция 12К/8К, содержащая перекрывающиеся гены ТБГ2 и ТБГЗ PVX. Образующаяся при ее транскрипции мРНК соответствует вирусной суб-геномной РНК для синтеза белков ТБГ2 и

А ■ У : ' . . . •• gf .¿■-S-,.^ ' ..> f ф--1 * •/Ar " - в <

D ' * \ \ * « ■0- - E ' • *" • 4 « .... ...."-■'.: ■ ■ •

- : H Щ 4 * " * » ч «

Рис. 3. Изображения клеток эпидермиса N. benthamiana, экспрессирующих белок ТБГЗ PVX и его мутанты, слитые с GFP. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, (а) Локализация GFP-8K. (Ь, с) Ко-экспрессия GFP-8K и pPVX201. Показано наложение серии оптических срезов (Ь) и единичный медиальный срез (с). (<0 Ко-экспрессия GFP-8K и 8К. (е) Локализация GFP-12K. (/) Ко-экспрессия GFP-12K и 8К., (g) Ко-экспрессия GFP-12K и GFP-8K. (А) Ко-экспрессия GFP-8K и 12/8КД24. (О Ко-экспрессия GFP-8K и 12/8КД39. Масштабная линейка, 10 мкм.

ТБГЗ. Данная конструкция позволяла нам моделировать уровень экспрессии ТБГЗ, характерный для вирусной инфекции (Dolja et al., 1987; Zhou and Jackson, 1996). Был получен набор делеционных мутантов ТБГЗ PVX с делециями 24,28 и 36 аминокислотных остатков в последовательности С-концевого гидрофильного сегмента (12К/8КД24, 12К/8КД28 и 12К/8КД36, соответственно), в которых консервативная последовательность CXjGXgC (Morozov and Solovyev, 2003) была частично (12К/8КД28) или полностью (12К/8КД39) удалена, либо оставалась не тронутой (12К/8КА24) (Рис. 4). Было установлено, что делеции в С-концевой области белка, включая практически полное ее удаление, не устраняют способности мутантного белка поддерживать, хотя и менее эффективно по сравнению с белком дикого типа, межклеточный транспорт PVX (данные не показаны). Ко-экспрессия делеционных мутантов с белком GFP-8K обеспечивала его локализацию в периферических тельцах (Рис. ЗЬ, 3i и данные не показаны). Эти данные показывают, что эти мутантные

белки частично или полностью сохраняли функциональную активность белка дикого типа. Таким образом, можно заключить, что основные функции белка ТБГЗ РУХ связаны с его концевым гидрофобным сегментом.

'зайВ"

ШШМЯК1 ЭДг;'-".' .'..г. Я»} - ^Т

12КЙКД28 I- •. ЦЗЙИЗЬ"

......

12к/вкдза г.

Рис. 4. Мутагенез белка ТБГЗ РУХ. ТБГ2 и ТБГЗ схематически изображены в виде прямоугольников, темные фрагменты которых обозначают трансмембранные сегменты белков. Перекрывание прямоугольников соответствует перекрыванию генов ТБГ2 и ТБГЗ в последовательности вирусной сгРНК. Пунктирной линией выделен ТБГЗ, трансляция которого блокирована из-за замены старт-кодона на последовательность АСй, при этом трансляция ТБГ2 не нарушается. Указан консервативный мотив последовательности. В конструкциях 12К/8КД24, 12К/8КД28 и 12К/8КД39 указаны положения делегированных участков.

Локализация и внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ Р81.У

С-концевой сегмент белка ТБГЗ РЭЬУ необходим для транспорта в периферические тельца

Ранее было показано, что ОРР-18К (ТБГЗ РБЬУ, слитый с вРР) при экспрессии в клетках растений локализуется в периферических мембранных структурах в области плазмодесм (5о1оууеу й а1, 2000; гатуайнп Л а1, 2002). Было также обнаружено, что С-концевой гидрофобный сегмент ТБГЗ РБЬУ оказывает существенное влияние на его локализацию, поскольку его дслеция приводила к неспособности белка локализоваться в периферических тельцах (ЭоЬууеу й а1, 2000). Более детальный анализ, проведенный в настоящей работе, показал, что сигнал транспорта ТБГЗ РвЬУ к периферическим тельцам состоит из двух независимых элементов, один из которых представляет собой С-концевой трансмембранный сегмент.

Для анализа роли отдельных элементов в составе второго трансмембранного сегмента в белок ТБГЗ РБЬУ вносили два типа мутаций -, во-первых, делеции фрагментов гидрофобной последовательности (СГР-18Кт1И5Ну, \ТР-18К1Ш и УГР-18КШ8; Рис. 5) и, во-вторых, замена специфической последовательности на произвольную последовательность

гидрофобных аминокислотных остатков (GFP-18KmutHy; Рис. 5). Внутриклеточная локализация GFP-18Kmut5Hy имела существенные отличия от локализации белка дикого типа, а именно, мутант был ассоциирован с популяцией небольших мембранных телец, образующих гранулярные сетчатые структуры внутри клетки, напоминающие сеть кортикального ЭПР (Рис. бе). При ко-экспрессии GFP-18Kmut5Hy и маркера ЭПР ER-YFP (Zamyatnin et al, 2004) было обнаружено, что внутриклеточные мембранные структуры, содержащие GFP-18Kmut5Hy, располагались вдоль структур кортикальной сети ЭПР, но никогда не содержали маркер ER-YFP (Рис. 7а). При ко-экспрессии YFP-18KIId4 либо YFP-18К1И8 с маркером ЭПР mGFP5-ER эти делеционные мутанты локализовались в структурах гранулярной сети, ассоциированных с кортикальной сетью ЭПР (Рис. 7е и данные не показаны). Несмотря на то, что эти делеционные мутанты локализовались вне структур ЭПР, их экспрессия приводила к изменению морфологии ЭПР, вызывая формирование множественных мембранных образований различной формы, связанных с мембранами ЭПР и содержащих mGFP5-ER (Рис. 7е и данные не показаны). В отличие от прочих мутантов, внутриклеточная локализация GFP-18KrautHy не отличалась от локализации слитного белка GFP-18K (данные не показаны). Можно утверждать, что фактором, определяющим транспорт ТБГЗ PSLV в периферические тельца, является длина второго трансмембранного сегмента, но не его специфическая последовательность, поскольку уменьшение длины этого сегмента приводит к неспособности белка транспортироваться на периферию клетки, тогда как замена его последовательности на неспецифическую гидрофобную последовательность той же длины (мутант 18KmutHy) не меняет локализацию белка.

Важно отметить, что различные мутации в С-концевом трансмембранном сегменте ТБГЗ PSLV по-разному сказываются на локализации белка. Так, мутант 18Kmut62 с полной делецией этого сегмента (Рис. 5 и Solovyev et al, 2000) в составе слитого с YFP белка YFP-18Kmut62 локализован в дискретных структурах в составе кортикального ЭПР и, более того, накопление этого мутанта в таких структурах вызывает изменение морфологии ЭПР, приводя к появлению «узелков» и утолщений (Рис. 7Ь). С другой стороны, мутант 18Kmut5Hy с небольшой делецией в составе этого участка локализован в мелких везикулах, расположенных вдоль структур кортикального ЭПР, но не содержащих ЭПР-специфического маркера (Рис. 7а). Возможно, эти данные отражают полное (в случае 18Kmut62) и частичное (в случае 18Kmut5Hy) блокирование функций С-концевого трансмембранного сегмента в транспорте белка. Если это так, то можно предположить, что этот сигнал определяет во-первых, выход белка ТБГЗ из структур ЭПР, который блокирован у мутанта 18Kmut62, и, во-вторых, транспорт ТБГЗ к периферическим тельцам, который блокирован у мутанта 18Kmut5Hy на некой промежуточной стадии, в результате чего такой мутант обнаруживается в популяции везикул неизвестной природы.

ЧА ..................................

с{В ------ * ■ ~ ~

Нх3СхСХ2С РхУ1Ж(бххРхС

пиЛ71 4 1 ЯБТО

ТБГЗ Ёькым'ЕЗх.узАцсга'аи.п.ц.ьтп!

тиТ62 ........------------------

тиМу 18К1И4

18К1ИВ ..............................

Рис. 5. Мутагенез белка ТБГЗ РЭЬУ. Белок схематически обозначен прямоугольником, закрашенные фрагменты которого являются трансмембранными сегментами. Указаны консервативные мотивы последовательностей центрального и К-концевого доменов. Приведена аминокислотная последовательность района, подвергавшегося мутагенезу. Точечные аминокислотные замены в последовательности обозначены буквами. Точками выделена последовательность, оставшаяся без изменений, а пунктиром - делегированные участки. Буквами ЯБТО обозначена тетрапептидная последовательность вставки, разрушающей консервативный мотив. Консервативные остатки лизина выделены жирным шрифтом.

В целом, учитывая полученные нами данные о том, что Ы-концевой трансмембранный домен ТБГЗ РУХ необходим для транспорта белка в периферические тельца, можно предположить, что, несмотря на отсутствие структурного сходства белков ТГБЗ РУХ и РвЬУ, им свойственны аналогичные пути внутриклеточного транспорта, которые определяются способом взаимодействия этих белков с клеточными мембранами, обусловленным структурой их трансмембранных сегментов.

Влияние последовательности центрального гидрофильного района на внутриклеточную локализацию ТБГЗ РвЬУ

Второй элемент сигнала, определяющего локализацию ТБГЗ РвЬУ в периферических тельцах, картирован в центральной гидрофильной области белка. Согласно ранее полученным данным, мутация, нарушающая целостность расположенного в этой области мотива (мутант 18Кгтия71 и Рис. 5), который консервативен в гордеивирусных белках

ТБГЗ, блокировала транспорт белка в периферические тельца (5о/оууеу е! а!., 2000). При ко-экспрессии \ТР-18Кпш171 и маркера ЭПР пЮРР5-ЕК такой мутант локализовался в мелких везикулах, расположенных вдоль элементов ЭПР, но не содержащих маркера структур ЭПР (Рис. 7с), что было в значительной степени сходным с локализацией мутанта 18Кти15Ну

Рис. 6. Изображения клеток эпидермиса N. ЬемИатита, экспрессирукяцих слитные флуоресцирующие белки. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа. (а) Локализация ОРР-18К. (Ь) Локализация ОРР-18Кс1А. (с) Локализация СРР-18К<1В. ((I) Локализация СРР-18К(1М. (е) Локализация СРР-18Кти15Ну. (/) Локализация СРР-18КгтЛб2. {#) Локализация СРР-18Кти171. (А) Локализация СРР-18Кшт71/5Ну. (I,к) Ко-экспрессия 5аг1[Т39М] и мутантов ТБГЗ, слитых с СРР: вРР-18КтШб2 (0, СРР-18Кши15Ну (/)> СРР-18Кти171 (к). (/) Локализация ОзЯес1-18К.тт71. (от) Локализация ОРР-А1Ага7[<369Ь]. (и) Локализация ОРР-А1Ага7. (о, р) Локализация СРР-Яор7. Единичный срез через медиальную часть клетки (р). Увеличенное изображение области клеточной стенки, на котором видна плазматическая мембрана по обе стороны клеточной стенки соседних клеток (о). Масштабная линейка, 5 мкм (а - А, / - о). Масштабная линейка, 10 мкм (е - g, < - к, р).

(Рис. 7а). Можно предположить, что у мутантов 18Ктиг5Ну и 18Кт1И71 блокированы аналогичные стадии транспорта ТБГЗ. Был получен мутант 18КтШ71/5Ну, который

содержит обе мутации в составе одного белка (Рис. 5). При временной экспрессии в клетках растений GFP-18Kmut71/5Hy локализовался в полигональной сети кортикального ЭПР (Рис. 6h). При этом наблюдались гранулярные структуры, типичные для мутантов 18Kmut71 и 18Kmut5Hy. Далее, взаимодействие этих мутаций проверялось в ситуации, когда они локализуются в разных белках. Ко-экспрессия 18Kmut71, слитого с GFP, и 18Kmut5Hy, слитого с желтым флуоресцирующим белком YFP, показала, что зеленая и желтая флуоресценции ко-локализовались в гранулярной сети внутри клеток (Рис. 7d), как и в случае экспрессии каждого из мутантов по отдельности. Тем не менее, было показано что, мутанты 18Kmut71 и 18Kmut5Hy не ко-локализуются, а располагаются в разных популяциях везикул, ассоциированных с ЭПР (Рис. 7d). Эти данные показывают, что центральный гидрофильный район и С-концевой гидрофобный сегмент не являются частями одного сигнала внутриклеточной локализации, напротив, они представляют собой два независимых элемента такого сигнала, мутации в которых по-разному влияют на внутриклеточную локализацию белка.

Возможная роль центрального QDLN-содержащего района в транспорте белка была выявлена при использование различных флуоресцентных белков-маркеров для изучения внутриклеточной локализации мутанта 18Kmut71. Оказалось, что этот мутант, слитый с белком DsRed, в отличие от вариантов, в которых он был слит с GFP или YFP, локализовался в периферических тельцах, типичных для белка дикого типа (Рис. 61). Существенным отличием DsRed от GFP и YFP является его способность образовывать стабильные олигомеры и высокомолекулярные агрегаты (Baird et al, 2000; Wall et al., 2000). Поскольку белок ТБГЗ PSLV детектируется в зараженных клетках в виде высокомолекулярных комплексов (Gorshkova et al, 2003), можно предполагать, что мутация, внесенная в 18Kmut71, блокировала способность белка образовывать такие комплексы, тогда как в составе слитного белка с DsRed эта способность восстанавливалась. Это предположение согласуется с результатами иммуноблот-анализа трансгенных растений, экспрессирующих GFP-18Kmut71, показывающими неспособность этого мутанта образовывать высокомолекулярные комплексы (Горшкова Е.Н, «Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих белки тройного блока генов гордеивирусов», 2003, кандидатская диссертация, Биологический факультет, МГУ). Таким образом, можно заключить, что центральный гидрофильный район ТБГЗ обеспечивает олигомеризацию белка, что является необходимым условием его транспорта в периферические тельца. Такой вывод может объяснять фенотип локализации мутанта 18Kmut62 (см. выше), который обладает сигналом образования высокомолекулярных комплексов, что обеспечивает сегрегацию белка, но не обладает сигналом внутриклеточного транспорта, который обеспечивается С-концевым трансмембранным сегментом, делегированным у данного мутанта, и в результате происходит его накопление в дискретных сайтах в структурах ЭПР.

Рис. 7. Изображения клеток эпидермиса N. benthamiana, экспрессирующих слитные флуоресцирующие белки. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, (я, Ь, с) Ко-экспрессия белка-маркера ЭПР mGFP-ER (зеленый) и мутантов белка ТБГЗ, слитых с YFP, 18Kmut5Hy (a), 18Kmut62 (6), and 18Kmut71 (с), (d) Ко-экспрессия GFP-18Kmut71 и YFP-18Kmyt5Hy. (e) Ко-экспрессия YFP-18KIId4 и маркера ЭПР mGFP5-ER. (J) Ко-экспрессия GFP-AtAra2 и маркера АГ ST-YFP. (g) Ко-экспрессия GFP-NtRab2 и белка-маркера AT ST-YFP. (А) Ко-экспрессия GFP-AtRablc и маркера ЭПР YFP-ER. Для визуализации ко-локализации белков использовали наложение изображений (правая колонка), независимо полученных для GFP (левая колонка) и YFP (средняя колонка). Масштабная линейка, 5 мкм.

Результаты мутационного анализа показывают наличие в последовательности ТБГЗ PSLV двух сигналов, обеспечивающих внутриклеточную локализацию этого белка (см. выше). Для подтверждения того, что наличие обоих сигналов достаточно для транспорта

ТБГЗ на периферию клетки, были получены мутанты белка ТБГЗ с делециями в аминотерминальной области: мутант 18KdB, в составе которого оставался только второй трансмембранный сегмент, мутант 18KdA, содержащий второй гидрофобный сегмент и часть центрального гидрофильного сегмента, за исключением специфической аминокислотной последовательности QDLN, а так же мутант 18KdN, содержащий полностью последовательности второго трансмембранного и центрального гидрофильного доменов (Рис. 5). Таким образом, обе последовательности, являющиеся сигналами локализации ТБГЗ в периферических тельцах, оставались полностью нетронутыми только в мутанте мутанта 18KdN. GFP-18KdA и GFP-18KdB были ассоциированы с сетью кортикального ЭПР (Рис. 6Ь, бс). Напротив, внутриклеточная локализация GFP-18KdN была сходной с локализацией белка дикого типа ТБГЗ PSLV (Рис. 6d), а, значит, можно заключить, что данные сигналы являются необходимыми и достаточными для транспорта белка на периферию клетки.

ТБГЗ транспортируется в периферические тельца СОРП-незавиеимо

Согласно классической модели, встраивание трансмембранных белков в мембраны происходит ко-трансляционно: по мере высвобождения полипептидной цепи в процессе ее синтеза на рибосомах гидрофобные сегменты белка взаимодействуют с мембраной ЭПР (Blobel, 2000). Таким образом, после окончания трансляции трансмембранный белок оказывается заякоренным в мембране ЭПР, откуда может транспортироваться другие мембранные компартменты в составе транспортных везикул. В частности, транспорт трансмембранных белков из ЭПР в АГ происходит в составе транспортных СОРП-везикул (Brandizzi et al, 2002; Hawes, 2005). Формирование СОРИ-везикул на мембране ЭПР происходит при участии малой клеточной ГТФазы Sari (Barlowe, 2003). Чтобы выяснить, является ли внутриклеточный транспорт ТБГЗ COPII-зависимым, мы использовали доминантно-негативный мутант Sarl[T39N], который, как было известно ранее, блокирует формирование СОРИ-везикул (Andreeva et al., 2000). Белок-маркер ST-YFP локализуется в цистернах АГ (Рис. 9а), в которые, как известно, он транспортируется из ЭПР в составе COPII-везикул (Boevink et al., 1998). В соответствии с описанным ранее эффектом Sari [T39N] (Ward et al, 2001) ко-экспрессия ST-YFP и Sarl[T39N] приводит к перераспределению желтой флуоресценции из АГ в структуры ЭПР (Рис. 9с) При этом ко-экспрессия Sarl[T39N] с GFP-18K. PSLV не оказывает влияния на локализацию слитного белка в периферических тельцах (Рис. 9g). Кроме того было установлено, что Sarl[T39N] не влияет на способность GFP-8K транспортироваться в периферические тельца при ко-экспрессии GFP-8K и белка 8К дикого типа (Рис. 8а), также при экспрессии GFP-8K в PVX-инфицированных клетках (Рис. 8с). Эти данные определенно показывают, что в транспорте ТБГЗ PVX и PSLV не участвуют COPII-везикулы, но вместе с тем не отвергают возможности

везикулярного внутриклеточного транспорта ТБГЗ, поскольку известно, что в клетках растений существует пока плохо изученные неканонические пути транспорта, которые не зависят от COPII-везикул (Dong et al., 2003; Нага-Nishimura et al., 1998; Jiang and Rogers, 1998; Mitsuhashi et al„ 2001; Morrow et al., 2002).

Рис. 8. Изображения клеток эпидермиса N. ЪемИагтапа, ко-экспрессирующих флуоресцирующий белок-маркер 8Т-УРР и белок ТБГЗ РУХ, а также его мутанты, слитые с СРР. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, (а). Ко-экспрессия СП'-8К, 12К/8К, БТ-УРР и БагЦТЗЭЫ]. (6) Ко-экспрессия СРР-8К, 12/8КД24, ЭТЛТР и 5аг1[Т39\']. (с) Ко-экспрессия СРР-8К, ЗТЛТР, рРУХ201 и 5аг1 [Т39М]. Для визуализации ко-локализации белков использовали наложение изображений (правая колонка), независимо полученных для вРР (левая колонка) и УРР (средняя колонка). Масштабная линейка, 20 мкм.

Роль СОРН-зависимого транспорта была проанализирована также для мутантов ТБГЗ РУХ и РБЬУ. Было обнаружено, что мутанты 12К/8КД28 и 12К/8К.Д39 способны обеспечивать транспорт ОРР-8К на периферию клетки в присутствии 5аг1[Т39М], в то время как маркер АГ БТ-УРР перераспределялся в структуры ЭПР (данные не показаны). При этом мутант с наименьшей удаленной последовательностью 12К/8КД24 (Рис. 5) в сходных

экспериментальных условиях утрачивал способность направлять транспорт GFP-8K на периферию клетки (Рис. 8Ь). Можно утверждать, что способность белка ТБГЗ PVX к СОРИ-независимому внутриклеточному транспорту определяется его трансмембранным сегментом, но может модулироваться С-концевой гидрофильной последовательностью.

В случае ТБГЗ PSLV было обнаружено, что мутанты 18Kmut62 и 18Kmut5Hy не меняют своей внутриклеточной локализации в присутствии Sarl[T39N] (Рис. 6i, 6j), в отличие от мутанта 18Kmut71, который обнаруживался в условиях блокирования COPII-зависимого транспорта в типичных структурах ЭПР (Рис. 6к). Эти данные показывают, что необходимым условием транспорта ТБГЗ PSLV по СОРП-независимому пути является целостность его центрального гидрофильного района, который определяет способность белка образовывать олигомеры и высокомолекулярные комплексы. Известно, что олигомеризация трансмембранных транспортируемых белков либо их рецепторов в сайтах выхода из ЭПР мобилизует ГТФазу Sari и белки коатомерного комплекса, таким образом стимулируя формирование и отпочковывание транспортных везикул (daSilva et al, 2004). Известны также примеры формирования везикул благодаря олигомеризации трансмембранного белка кавеолина-1, который образует 14- или 16-мерные комплексы (Parton, 2006; Sargiacomo et al, 1995). Можно предположить, что, сходным образом, способность белка ТБГЗ к олигомеризации в мембранах ЭПР может индуцировать формирование транспортных везикул в процессе Sari-независимого выхода из ЭПР.

Структуры аппарата Гольджи не участвуют в транспорте ТБГЗ PSLV на периферию клетки

В целом, данные, полученные при блокировании COPII-зависимого транспорта, показывают, что во внутриклеточном транспорте ТБГЗ к периферическим тельцам задействован некий неканонический механизм, который отличается от того, который используется для большинства трансмембранных белков в клетке. Этот вывод получил подтверждение в опытах по блокированию формирования COPI-везикул. COPI-везикулы обеспечивают транспорт между цистернами АГ, из АГ в ЭПР, а так же транспорт секреторных везикул из АГ к различным внутриклеточным компартментам в клетках растений (Barlowe, 2003; Memon, 2004; Nebenfuhr, 2002). Образование COPI-везикул зависит от действия малой клеточной ГТФазы Arfl (Barlowe, 2003; Nebenfuhr, 2002). Для того, чтобы определить, является ли внутриклеточный транспорт ТБГЗ COPI-зависимым, мы использовали доминантно-негативный мутант Arfl[T31N], блокирующий формирование COPI-везикул (Lee et al, 2002). Ко-экспрессия Arfl[T31N] и маркера АГ ST-YFP приводит к перераспределению сигнала YFP в полигональную сеть кортикального ЭПР и ассоциированные с ней гранулярные структуры (Рис. 9Ь). В присутствии Arfl[T31N] GFP-18К локализуется в периферических тельцах (Рис. 9f), что указывает на то, что его

внутриклеточный транспорт происходит без участия СОР1-везикул. Этот вывод подразумевает, что во внутриклеточном транспорте ТБГЗ РБЬУ не задействован АГ, поскольку и ретроградный транспорт из АГ в ЭПР, и транспорт из АГ по секреторному пути во внутриклеточные мембранные структуры происходит в составе СОР1-везикул (ЫеЬепГиЬг, 2002; ВаНо««, 2003). Этот вывод подтверждается опытами с брефелднном А (БФА), известным ингибитором секреторного пути в клетках растений (ЫеЬепШЬг « а1., 2002Ь). Обработка раствором БФА клеток растений приводит к слиянию компартменгов ЭПР и АГ в специфический БФА-компартмент (Воеутк й а!., 1998; КеЬепГиЬг Й а1., 2002Ь). В результате маркер БТ-УРР перераспределяется в полигональную сеть, сходную по структуре с ЭПР (Рис. 9с!). Обработка БФА не влияла на локализацию ОРР-18К в периферических тельцах (Рис. 9Ь). Таким образом, внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ РЭЬУ не включает СОР1-и СОРН-зависимые стадии и, вероятнее всего, происходит, минуя аппарат Гольджи.

А я * ч > В j" ». С * Ш" 'Си 4 . ф-* : а - ^ » **.. *, >.V -V- ** i . '

Е F G н

i. 1

+ ДгН +Sar1 >1* + RFA Г

Рис. 9. Изображения клеток эпидермиса N. benthamiana, экспрессирующих слитные флуоресцирующие белки. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, {а, Ь, с, d) Временная экспрессия белка-маркера АГ ST-YFP в клетках эпидермиса N. benthamiana. Контрольный эксперимент (а), ко-экспрессия с Arfl[T31N] (Ь), ко-экспрессия с Sarl[T39N] (с), обработка БФА (d). (е. / g, h) Временная экспрессия GFP-18K в клетках эпидермиса N. benthamiana. Контрольный эксперимент (е), ко-экспрессия с Arfl[T31N] (/), ко-экспрессия с Sarl[T39N] С?), обработка БФА (А). Масштабная линейка, 10 мкм (а, Ь, с, d). Масштабная линейка, 5 мкм {e.f.g, h).

Влияние малых клеточных ГТФаз семейства Rab на внутриклеточный транспорт ТБГЗ PSLV

Известно, что клеточные ГТФазы семейства Rab регулируют все этапы везикулярного транспорта в клетках растеиий (Jordens et al., 2005; Vernoud et al., 2003; Zerial and McBride, 2001). Геном A. Ihaliana содержит 57 генов Rab. Каждый из этих белков контролирует

отдельный этап везикулярного транспорта. Блокирование транспорта на каждом этапе возможно с помощью доминантно-негативного мутанта определенной ГТФазы семейства Rab (deGraaf et al., 2005; Dhonukshe et al., 2006; Zheng et al, 2005). Мы изучили эффект доминантно-негативных мутантов ряда ГТФаз семейства Rab на транспорт ТБГЗ PSLV, а, именно, AtAra2 и NtRabl lb (необходимых для транспорта между транс-сетью Гольджи и плазматической мембраной), AtAra3 (необходимой для транспорта секреторных везикул к плазматической мембране), AtAra7 (необходимой для эндоцитоза), а также NtRab2 и AtRablc (необходимых для транспорта между ЭПР и аппаратом Гольджи). В предварительных экспериментах была проверена внутриклеточная локализация доминантно-негативных мутантов ГТФаз семейства Rab, слитых с GFP. Так GFP-AtAra7 локализовался в популяции везикул (Рис, 6п), которые являются превакуолярными компартментами (Geldner et al., 2004). Доминантно-негативный мутант GFP-AtAra7[Q69L], напротив, располагался в крупных сферических везикулярных структурах (эндосомах) (Рис. бт). Таким образом, AtAra7[Q69L] стимулирует агрегацию ранних эндосом и перераспределение в них себя самого и содержимого превакуолярных компартментов, изменяя при этом свою локализацию, что соответствует литературным данным (Geldner et al., 2004; Kotzer et al., 2004; Lee et al., 2004; Ueda et al., 2004). Можно утверждать, что в наших экспериментальных условиях мутант AtAra7[Q69L] является функционально активным. Аналогичным образом были сконструированы слитые с GFP доминантно-негативные мутанты остальных пяти ГТФаз семейства Rab, использованных в нашей работе. При их ко-экспрессии с маркерами ЭПР и АГ (Рис. 7f, 7g, 7h и данные не показаны) эти мутанты локализовались в соответствии с литературными данными о внутриклеточной локализации этих ГТФаз (Batoko et al., 2000; Cheung et al., 2002; deGraaf et al., 2005; Zerial et al., 1995; Zheng et al., 2005), и сходные результаты были получены в наших экспериментальных условиях. Было обнаружено, что ко-экспрессия доминантно-негативных мутантов ГТФаз семейства Rab с GFP-18К не влияет на транспорт последнего в периферические тельца (данные не показаны). Хотя в этой части работы не был проведен исчерпывающий перебор всех возможных клеточных ГТФаз семейства Rab, можно говорить о том, что, по крайней мере, несколько ключевых этапов везикулярного транспорта не задействованы во внутриклеточном транспорте ТБГЗ PSLV. Эти данные, вместе с данными об ингибировании СОРН- и COPI-зависимых путей везикулярного транспорта ставят под сомнение возможность того, что ТБГЗ транспортируется в клетке с помощью канонического везикулярного транспорта.

Внутриклеточная локализация и транспорт белка ТБГЗ PSLV не зависят от цитоскелета

Везикулярный транспорт в клетках растений тесно связан с цитоскелетом: транспортные везикулы ассоциированы с сетью актиновых микрофиламентов и упорядоченно

перемещаются вдоль нитей актина при помощи молекулярных моторов, миозиновых белков (Brandizzi et al, 2002; Brandizzi et al„ 2003; Hawes, 2005; Neumann et a!., 2003). Ранее было показано, что некоторые транспортные белки вирусов растений активно взаимодействуют с цитоскелетом. Например, для транспорта клостеровирусного белка HSP70h к плазмодесмам необходимо наличие интактных актиновых филаментов (Prokhnevsky et al, 2005). Кроме того, тяжи актина участвуют в поддержании структуры полигональной сети кортикального ЭПР и направленной диффузии трансмембранных белков в плоскости мембран ЭПР (Runions et al, 2005). Следует отметить, что микротрубочки в клетках растений, в отличие от клеток животных, не участвуют в дальнем везикулярном транспорте (Gillespie et al, 2002). Тем не менее, транспортный белок 30К тобамовируса TMV взаимодействует с микротрубочками, которые оказывают регуляторный эффект на его внутриклеточный транспорт (Heinlein et al, 1995; Mas et al, 1999; McLean et al, 1995). В настоящей работе мы анализировали возможную роль цитоскелета в транспорте ТБГЗ PSLV в периферические тельца.

<3 Г И .у^д

;■■ Г"'

>

■HOryz +Тахо1.

Рис. 10. Изображения клеток эпидермиса Ж ЬетИапиапа, экспрессирующих слитные флуоресцирующие белки. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, {а, Ь, с, <1) Временная экспрессия йРР-Ыт в клетках эпидермиса N. ЬемИапиапа. Контрольный эксперимент (о), обработка цитохолазином Д (6), обработка латрункулином Б (с), обработка фаллоидином (с!), (е, /, А) Трансгенные растения N. ЬешЬат1апа линия СВ#13 (СРРЧиЬ). Контрольный эксперимент (е), обработка трифлуралином (/), обработка оризалином (#), обработка таксолом (А). Масштабная линейка, 20 мкм.

Был получен маркер актиновых филаментов GFP-talin, представляющий собой слитый с GFP актин-связывающий домен талина мыши (Kost et al, 1998). При экспрессии маркера GFP-talin в клетках растений хорошо заметны многочисленные тонкие переплетенные

фибриллы актина (Рис. 1 Оа), что соответствует литературным данным (Brandizzi et al, 2002; Haupt et al, 2005; Kost et al, 1998; Prokhnevsky et al, 2005). Для визуализации микротрубочек использовались трансгенные растения N. benthaniana (линия СВ#13), в которых был экспрессирован альфа-тубулин A. thaliana, слитый с GFP (GFP-tua) (Gillespie et al, 2002). В клетках трансгенных растений микротрубочки видны в виде многочисленных переплетенных нитей тубулина (Рис. 10е), что соответствует литературным данным (Gillespie et al, 2002; Prokhnevsky et al, 2005; Seemanpillai et al, 2006).

Для анализа роли цитоскелета в транспорте ТБГЗ применялись специфические химические реагенты, вызывающие разрушение или стабилизацию актиновых филаментов, либо микротрубочек. Фаллоидин нарушает динамику сборки-разборки актиновых филаментов и приводит к их утолщению (Рис. 10d), обработка таксолом приводит к аналогичному эффекту в случае микротрубочек (Рис. 10h). Латрункулин Б и цитохолазин Д разрушают сеть актиновых филаментов (Рис, 10b, 10с), а трифлуралин и оризалин оказывают аналогичное действие на микротрубочки (Рис. 10f, 10g) (Ding et al, 1996; Marcus et al, 2001; Saint-Jore et al, 2002). В контрольных экспериментах обработка латрункулином Б и цитохолазином Д нарушала транспорт белка HSP70h-GFP BYV к плазмодесмам (Рис. lib), что соответствует ранее опубликованным данным (Prokhnevsky et al, 2005).

Рис. 11. Изображения клеток эпидермиса N. ЪетЬатхапа, экспрессирующих слитные флуоресцирующие белки. Изображения получены при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа. (а) Локализация СРР-18К в клетках эпидермиса N. ЬешИатгапа в контроле и при обработке указанными реагентами. (6) Локализация ШР70Ь-ОРР в клетках эпидермиса N. ЪеыЪат'шпа в контроле и при обработке указанными реагентами. Увеличенные изображения области клеточной стенки, полученные при оптическом срезе через медиальные части клеток. Масштабная линейка, 5 мкм.

Таким образом, все реагенты оказывали ожидаемое действие на элементы цитоскелета клеток и транспортный белок HSP70h BYV, однако, ни один из них не влиял на способность GFP-18K локализоваться в периферических тельцах (Рис. 11а). Эти данные показывают, что транспорт ТБГЗ PSLV в периферические тельца не зависит от элементов цитоскелета.

Неканонический внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ PSLV

Суммируя полученные в настоящей работе данные об особенностях внутриклеточного транспорта ТБГЗ, можно заключить, что этот транспорт происходит в обход известных и хорошо изученных канонических путей везикулярного транспорта. Основываясь на имеющихся результатах, можно предположить, что локализация ТБГЗ в периферических тельцах является результатом направленного пост-трансляционного встраивания белка в те мембранные компартменты, в которых он локализован. Пост-трансляционное встраивание в мембранные структуры описано для нескольких классов клеточных белков, среди которых -белки с С-концевой якорной гидрофобной последовательностью, к которым относятся белки SNARE. Их гидрофобная последовательность становится доступна для взаимодействия с мембраной непосредственно после завершения синтеза белка на рибосоме. В результате, их встраивание в мембрану происходит пост-трансляционно (Borgese et al., 2003; Brambillasca et al., 2005; Ceppi et al., 2005). Второй трансмембранный сегмент белка ТБГЗ PSLV примыкает к С-концсвому остатку белка, и он мог бы играть роль С-концевой якорной последовательности при встраивании в мембрану при условии, что новосинтезированная молекула белка, имеющая еще и N-концевой гидрофобный сегмент, может удерживается в растворе с помощью клеточных шаперонов.

Другой класс белков, встраивающихся в мембраны пост-трансляционно, включает малые клеточные ГТФазы супер-семейства Ras, которые взаимодействуют с мембраной за счет пост-трансляционных модификаций в виде гераниловых и пальмитоиловых остатков (Pfeffer and Aivazian, 2004; Pfeffer, 2005). Следует подчеркнуть, что для некоторых таких белков, в частности — для ГТФазы Rop7 Zea mays, показана специфическая локализация только в плазматической мембране, но не ассоциация с внутриклеточными компартмептами, которые могли бы быть промежуточными пунктами при внутриклеточном транспорте белка (Ivanchenko et al., 2000).

В настоящей работе мы использовали слитую с GFP С-концевую гипервариабельную область ГТФазы Rop7, которая содержит сигнальные мотивы, необходимые для локализации белка в плазматической мембране (Ivanchenko et al., 2000). Было обнаружено, что, как было показано ранее в работе Ivanchenko et al., (2000), в наших опытах GFP-Rop7 ассоциирован с плазматической мембраной (Рис. 6о, бр), но блокирование СОРИ- и COPI-эависимого транспорта при помощи Sarl[T31N] и Arfl[T39N], соответственно, не оказывает влияния на его локализацию (данные не показаны). Кроме того, химические реагенты, влияющие на

цитоскелет, также не оказывают влияния на локализацию ОРР-Кор7 (результаты не показаны). Эти данные демонстрируют возможность прямого пост-трансляционного встраивания белков в определенные мембранные компартменты клеток растений. Хотя в настоящее время возможность такого пути транспорта для белка ТБГ является гипотетической и требующей экспериментальной проверки, имеющиеся экспериментальные данные, как представляется, позволяют исключить другие возможности внутриклеточного транспорта ТБГЗ и остановиться на модели прямого пост-трансляционного встраивания в периферические тельца как на основной рабочей гипотезе.

выводы

1. Картированы последовательности белков ТБГ2 и ТБГЗ, определяющие их специфическую внутриклеточную локализацию.

2. Показано, что транспорт белка ТБГЗ является СОР1- и СОРН-независимым.

3. Показано, что внутриклеточный транспорт белка ТБГЗ происходит независимо от структур цитоскелета клетки.

4. Установлено, что белок ТБГЗ транспортируется на периферию клетки, минуя классический секреторный путь.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Schepetilnikov MV, Manske U, Solovyev AG, Zamyatnin AA Jr, Schiemann J and Morozov SYu (2005) The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking. J Gen Virol 86,2379-2391.

2. Schepetilnikov MV, Solovyev AG, Savenkov EI. (2005) High scale analysis of potato mop-top virus (PMTV) coat protein and minor coat protein mutants reveals requirements for the virus long distance movement. The 6th Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, September 5-7, Bologna, Italy.

3. Schepetilnikov MV, Solovyev AG, Morozov SY. (2005) Peculiarities of Intracellular Trafficking of Plant Virus Membrane-Bound Movement Proteins. The 6th International Symposium in Series Recent Advances in Plant Biotechnology From Laboratory to Business, September 12-16, ¿esk£ Budejovice, Czech Republic.

4. Solovyev AG, Schepetilnikov MV, Zamyatnin AA Jr, Schiemann J and Morozov SYu. (2003) Membrane trafficking of triple gene block-encoded virus movement proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future. 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, July 18-26, St.-Petersburg, Russia.

Напечатано с гоёиюго ориптал-мвютн

ИздателылъобОО "МАКС Пресс" Лицензия ИД |§ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к|кчати 26.09.200« г. Формат 60x90 1/16. Усядфд. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 648. Тел. 939-3890еГел./Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Лешпфие горы. МГУ ям. М.В. Ломоносова, 2-й учебщв корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щепетильников, Михаил Вячеславович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 2.1. Внутриклеточный везикулярный транспорт в клетках растений

2.1.1. Роль малых клеточных ГТФаз семейства Arf во внутриклеточном 10 транспорте

2.1.1.1. Малые клеточные ГТФазы подсемейства Arf

2.1.1.2. Структура малых клеточных ГТФаз Arf

2.1.1.3. Факторы обмена ГТФ (GEF)

2.1.1.4. Активаторные белки ГТФаз Arf (GAP)

2.1.1.5. Заякоривание ГТФаз Arf на мембране

2.1.1.6. Формирование COPI-везикул с участием малых клеточных ГТФаз 14 Afr

2.1.1.7. Клатрин транспортные везикулы

2.1.2. Малые клеточные ГТФазы Sar подсемейства

2.1.2.1. Структура белков Sar

2.1.2.2. Участие ГТФазы Sar в сборке COPII-окаймленных везикул

2.1.3. Белки SNARE

2.1.3.1. Классификация SNARE

2.1.3.2. Структурные особенности N-концевого домена белков SNARE

2.1.3.3. Структура SNARE комплекса

2.1.3.4. Белки SNARE растений

2.1.3.5. Механизм действия белков SNARE в везикулярном транспорте

2.1.3.6. Механизм разборки цис-SNARE комплекса

2.1.3.7. Функции и регуляция белков SNARE

2.1.3.8. Факторы, регулирующие активность SNARE

2.1.3.9. Внутриклеточная локализация белков SNARE

2.1.3.10. Сигналы внутриклеточной локализации

2.1.3.11. Взаимодействие с другими регуляторными белками

2.1.4. Белковые tethering факторы

2.1.4.1. Coiled-coil tethering факторы

2.1.4.2. Мульти-субъединичные tethering факторы

2.1.4.3. Механизм действия tethering факторов. Модель моста

2.1.4.4. Внутриклеточная локализация tethering факторов

2.1.5. Малые клеточные ГТФазы семейства Rab

2.1.5.1. Механизм действия ГТФаз Rab семейства

2.1.5.2. Структурные особенности регуляторных факторов белков Rab

2.1.5.3. Заякоревание на мембране

2.1.5.4. Внутриклеточная локализация ГТФаз Rab

2.1.5.5. Взаимодействие Rab с эффекторными белками

2.1.5.6. Транспортная функция ГТФаз Rab

2.1.6. Внутриклеточный везикулярный транспорт в высших растениях

2.1.6.1. Экзоцитозный путь

2.1.6.1.1. Транспорт между ЭПР и АГ

2.1.6.1.2. Антероградный COPII-зависимый транспорт

2.1.6.1.3. Модели везикулярного транспорта между структурами ЭПР и АГ

2.1.6.1.4. Ретроградный COPI-зависимый транспорт

2.1.6.1.5. Аппарат Гольджи

2.1.6.1.6. Сеть транс-Гольджи

2.1.6.1.7. Секреторный транспорт в вакуоли

2.1.6.1.8. Секреторный транспорт к плазматической мембране

2.1.6.2. Эндоцитозный путь 52 2.1.6.2.1. Роль сети транс-Гольджи и эндосом в эндоцитозе 54 2.2. Внутриклеточный транспорт вирусов, кодирующих тройной блок транспортных генов (ТБГ), в растениях

2.2.1 Вирусы, кодирующие тройной блок транспортных генов (ТБГ)

2.2.2 Структура генома ТБГ-содержащих вирусов

2.2.3. Структура доменов и сравнение последовательностей белков, 59 кодируемых тройным блоком транспортных генов

2.2.4. Два класса ТБГ-транспортных модулей

2.2.5. Особенности экспрессии тройного блока транспортных генов

2.2.6. Структура белков ТБГ

2.2.7. Активности ТБГ белков in vivo и их функции в вирусном 64 транспорте

2.2.8. Структура и транспортные функции РНП ТБГ-содержащих 65 вирусов

2.2.9. Роль белка оболочки

2.2.10. Дальний транспорт

2.2.11. Внутриклеточная локализация белков тройного блока 69 транспортных генов

2.2.12. Сигналы внутриклеточной локализации белков тройного блока 71 трапспортных генов

2.2.13. Ко-локализация белков ТБГ2 и ТБГЗ в клетке

2.2.14. Ко-локализация ТБГ1 и ТБГ2/ТБГЗ в клетках

2.2.15. Модель транспорта

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточный транспорт белков ТБГ2 и ТБГ3 вирусов растений"

Транспортные белкн вирусов способны транспортироваться к местам своейспецифической локализации и обеспечивают при этом перепое вирусного геномавнутри клетки, являясь, таким образом, удобной модельной системой для изучениямолекулярных механизмов внутриклеточного транспорта в клетках растений. Наосновании особенностей организации генома припято вьщелять группу вирусов стройным блоком транспортных генов (ТБГ), который содержит три гена, кодирующихбелки ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ. Функциональное взаимодействие всех трех белковнеобходимо для транспорта вируса в зараженном растении.Объектом настоящей работы являлись белки ТБГ2 и ТБГЗ ТБГ-содержащихвирусов растений. Ранее была показана специфическая локализация белка ТБГ2 вмембранах эндоплазматического ретикулума, а также способность ТБГЗтранспортироваться на периферию клетки и формировать мембранные структуры вобласти плазмодесмы, но сигналы, нанравляющие их внутриклеточный транспорт, пебыли картированы. Для специфической внутриклеточной локализации транспортныхбелков вирусов растений, принадлежащих различным систематическим группам,необходимы структуры цитоскелета в клетках. Однако, возможный вклад актиновыхфиламентов и микротрубочек в процесс транспорта белков ТБГ2 и ТБГЗ не был до сихпор исследован. Кроме того, отсутствовали сведения об участии классическогосекреторного пути и отдельных внутриклеточных мембранных компартментов, как,например, аппарата Гольджи, в трапспорте этих белков.В настоящей работе изучались механизмы внутриклеточного транспорта белковТБГ2 и ТБГЗ вирусов растений. В ходе работы решались следующие основные задачи:изучение последовательностей белка ТБГ2, отвечающих за его специфическуюлокализацию в клетках растений, картирование районов белка ТБГЗ, необходимых дляего транспорта па периферию клеток растепий, изучение роли СОРП-везикул втранспорте белка ТБГЗ из ЭПР, определение способности белка ТБГЗ использоватьклассический секреторный путь для специфической локализации па периферии клетки,изучение влияния элементов цитоскелета па внутриклеточпый транспорт белка ТБГЗ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Щепетильников, Михаил Вячеславович

1. Картированы носледовательности белков ТБГ2 и ТБГЗ, определяющие их

специфическую внутриклеточную локализацию. 2. Показано, что транспорт белка ТБЗ является COPI- и СОРП-независимым. 3. Показано, что внутриклеточный транснорт белка ТБГЗ происходит независимо

от структур цитоскелета клетки. 4. Установлено, что белок ТБГЗ транспортируется на нериферию клетки, минуя

классический секреторный путь.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щепетильников, Михаил Вячеславович, Москва

1. Abdul-Ghani, М., Gougeon, P. Y., Prosser, D. C, Da-Silva, L. F. & Ngsee, J. K. (2001). PRA isoforms are targeted to distinct membrane compartments. J Biol Chem 276,6225-33.

2. Abell, B. M., Hahn, M., Holbrook, L. A. & Moloney, M. M. (2004). Membrane topology and sequence requirements for oil body targeting of oleosin. Plant J 37,461-70.

3. Agranovsky, A.A., Karasev, A.V,, Novikov, V.K., Lunina, N.A., Loginov, S., Tyulkina, 1..G. (1992). Poa semilatent virus, a hordeivirus having no internal polydisperse poIy(A) inthe 3' non-coding region of the RNA genome. J. Gen. Virol., 73,2085-2092.

4. Ahlquist, P., Noueiry, A. 0., Lee, W. M., Kushner, D. B. & Dye, B. T. (2003). Host factors in positive-strand RNA virus genome replication. J Virol 77,8181-6,

5. Alexandrov, K., Horiuchi, H., Steele-Mortimer, 0., Seabra, M. C. & Zerial, M. (1994). Rab escort protein-1 is a multifunctional protein that accompanies newly prenylated rabproteins to their target membranes. Embo J 13,5262-73.

6. Ali, B. R., Wasmeier, C, Lamoreux, L., Strom, M. & Seabra, M. C. (2004). Multiple regions contribute to membrane targeting of Rab GTPases. J Cell Sci 117,6401-12.

7. Allan, B. В., Moyer, B. D. & Balch, W. E. (2000). Rabl recruitment of pi 15 into a cis- SNARE complex: programming budding COPII vesicles for fusion. Science 289,444-8.

8. Alory, С & Balch, W. E. (2001). Organization of the Rab-GDI/CHM superfamily: the functional basis for choroideremia disease. Traffic 2,532-43.

9. Alvarez, C, Garcia-Mata, R., Hauri, H. P. & Sztul, E. (2001). The pll5-interactive proteins GM130 and giantin participate in endoplasmic reticulum-Golgi traffic. J Biol Chem276,2693-700.

10. Amor, J. C, Harrison, D. H., Kahn, R. A. & Ringe, D. (1994). Structure of the human ADP-ribosylation factor 1 complexed with GDP. Nature 372,704-8.

11. An, S. J. & Aimers, W. (2004). Tracking SNARE complex formation in live endocrine cells. Science 306,1042-6.159

12. Andreeva, A. V., Kutuzov, M. A., Evans, D. E. & Hawes, С R. (1998). Proteins involved in membrane transport between the ER and the Golgi apparatus: 21 putative planthomologues revealed by dbEST searching. Cell Biol Int 22,145-60.

13. Andreeva, A. V., Zheng, H., Saint-Jore, C. M., Kutuzov, M. A., Evans, D. E. & Hawes, C. R. (2000). Organization of transport from endoplasmic reticulum to Golgi in higher plants.Biochem Soc Trans 28,505-12.

14. Angell, S. (2002). Tip-toeing through the cell with potato virus X. Xllth International Congress of Virology. Paris, France, Abstracts, V-208.

15. Angell, S.M., Davies, C, Baulcombe, D. (1996). Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells ofNicotiana develandii. Virology, 216,197-201.

16. Aniento, F. & Robinson, D. G. (2005). Testing for endocytosis in plants. Protoplasma 226,3-11.

17. Antonin, W., Fasshauer, D., Becker, S., Jahn, R. & Schneider, T. R. (2002). Crystal structure of the endosomal SNARE complex reveals common structural principles of allSNARES. Nat Struct Biol 9,107-11.

18. Antonny, В., Gounon, P., Schekman, R. & Orci, L. (2003). Self-assembly of minimal COPII cages. EMBO Rep 4,419-24.

19. Aravanis, A. M., Pyle, J. L., Harata, N. C. & Tsien, R. W. (2003). Imaging single synaptic vesicles undergoing repeated fusion events: kissing, running, and kissing again.Neuropharmacology 45, 797-813.

20. Atabekov, J. G. & Dorokhov Yu, L. (1984). Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Adv Virus Res 29,313-64.

21. Atabekov, J. G. & Taliansky, M. E. (1990). Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes. Adv Virus Res 38,201-48.

22. Atabekov, J. G., Rodionova, N. P., Kaфova, 0. V., Kozlovsky, S. V. & Poljakov, V. Y. (2000). The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNAfrom a nontranslatable into a translatable form. Virology 271,259-63.

23. Baluska, F., Cvrckova, F., Kendrick-Jones, J. & Volkmann, D. (2001). Sink plasmodesmata as gateways for phloem unloading. Myosin VIII and calreticulin as moleculardeterminants of sink strength? Plant Physiol 126,39-46.160

24. Baluska, F., Samaj, J., Hlavacka, A., Kendrick-Jones, J. & Volkmann, D. (2004). Actin- dependent fluid-phase endocytosis in inner cortex cells of maize root apices. J Exp Bot 55,463-73.

25. Barbieri, M. A., Hoffenberg, S., Roberts, R., Mukhopadhyay, A., Pomrehn, A., Dickey, B. F. & Stahl, P. D. (1998). Evidence for a symmetrical requirement for Rab5-GTP in in vitroendosome-endosome fusion. J Biol Chem 273,25850-5.

26. Barlowe, С (2002). Three-dimensional structure of a COPII prebudding complex. Dev Cell 3,467-8.

27. Barlowe, С (2003). Molecular recognition of cargo by the COPII complex: a most accommodating coat. Cell 114,395-7.

28. Bar-Peled, M. & Raikhel, N. V. (1997). Characterization of AtSEC12 and AtSARl. Proteins likely involved in endoplasmic reticulum and Golgi transport. Plant Physiol 114,315-24.

29. Bayne, E. H., Rakitina, D. V., Morozov, S. Y. & Baulcombe, D. C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J 44,471-82.

30. Becher, A., Drenckhahn, A., Pahner, L, Margittai, M., Jahn, R. & Ahnert-Hilger, G. (1999). The synaptophysin-synaptobrevin complex: a hallmark of synaptic vesicle maturation.JNeurosci 19,1922-31.

31. Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Andersen, M.T., Forster, R.L.S. (1991). Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for virus infections. PlantI,7,1045-1053.

32. Bednarek, S. Y. & Falbel, T. G. (2002). Membrane trafficking during plant cytokinesis. Traffic 3,621-9.

33. Ben-Tekaya, H., Miura, K., Pepperkok, R. & Hauri, H. P. (2005). Live imaging of bidirectional traffic from the ERGIC. J Cell Sci 118,357-67.161

34. Beraud-Dufour, S., Paris, S., Chabre, M. & Antonny, B. (1999). Dual interaction of ADP ribosylation factor 1 with Sec7 domain and with lipid membranes during catalysis of guaninenucleotide exchange. J Biol Chem 274,37629-36.

35. Berg, J. S., Powell, B. C. & Cheney, R. E. (2001). A millennial myosin census. Mol Biol Cell 12,780-94.

36. Bi, X., Corpina, R. A. & Goldberg, J. (2002). Structure of the Sec23/24-Sarl pre-budding complex of the COPII vesicle coat. Nature 419,271-7.

37. Bielli, P., Casavola, E. C , Biroccio, A., Urbani, A. & Ragnini-Wilson, A. (2006). GTP drives myosin light chain 1 interaction with the class V myosin Myo2 IQ motifs via a Sec2RabGEF-mediated pathway. Mol Microbiol 59,1576-90.

38. Bleykasten, C , Gilmer, D., Guilley, H., Richards, K.E., Jonard, G. (1996). Beet necrotic yellow vein virus 42 kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. J Gen Virol, 11,889-897.

39. Bock, J. В., Matem, H. Т., Peden, A. A. & Scheller, R. H. (2001). A genomic perspective on membrane compartment organization. Nature 409,839-41.

40. Boehm, M., Aguilar, R. C. & Bonifacino, J. S. (2001). Functional and physical interactions of the adaptor protein complex AP-4 with ADP-ribosylation factors (ARFs).Embo J 20, 6265-76.

41. Boevink, P., Martin, В., Oparka, K., Santa-Cruz, S., Hawes, C. (1999). Transport of virally expressed green "uorescent protein through the secretory pathway in tobacco leaves isinhibited by cold shock and brefeldin A. Planta, 208,392-400.

42. Boevink, P., Oparka, K., Santa-Cruz, S., Martin, В., Betteridge, A., Hawes, C. (1998). Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network. Plant J, 15,441-447.

43. Bolte, S., Talbot, C , Boutte, Y., Catrice, 0., Read, N. D. & Satiat-Jeunemaitre, B. (2004). FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. JMicrosc 214,159-73.

44. Borgese, N., Brambillasca, S., Soffientini, P., Yabal, M. & Makarow, M. (2003a). Biogenesis of tail-anchored proteins. Biochem Soc Trans 31,1238-42.

45. Borgese, N., Colombo, S. & Pedrazzini, E. (2003b). The tale of tail-anchored proteins: coming from the cytosol and looking for a membrane. J Cell Biol 161,1013-9.162

46. Borisovska, М,, Zhao, Y., Tsytsyura, Y., Glyvuk, N., Takamori, S., Matti, U., Rettig, J., Sudhof, T. & Bruns, D. (2005). v-SNAREs control exocytosis of vesicles from priming tofusion. Embo J 24,2114-26.

47. Brandizzi, F., Irons, S. L., Johansen, J., Kotzer, A. & Neumann, U. (2004). GFP is the way to glow: bioimaging of the plant endomembrane system. J Microsc 214,138-58.

48. Brandizzi, F., Saint-Jore, C, Moore, I. & Hawes, C. (2003). The relationship between endomembranes and the plant cytoskeleton. Cell Biol Int 27,177-9.

49. Brandon, E., Szul, Т., Alvarez, C, Grabski, R., Benjamin, R., Kawai, R. & Sztul, E. (2006). On and off membrane dynamics of the endoplasmic reticulum-golgi tethering factorpi 15 in vivo. Mol Biol Cell 17,2996-3008.

50. Bruns, D. & Jahn, R. (1995). Real-time measurement of transmitter release from single synaptic vesicles. Nature 377,62-5.

51. Carroll, T. W. (1970). Relation of barley stripe mosaic virus to plastids. Virology 42, 1015-22.163

52. Caruthers, J.M., McKay, D.B. (2002). Helicase structure and mechanism. Curr Opin Struct Biol, 12,123-133.

53. Caumont, A. S., Galas, M. C, Vitale, N., Aunis, D. & Bader, M. F. (1998). Regulated exocytosis in chromaffin cells. Translocation of ARF6 stimulates a plasma membrane-associated phospholipase D. J Biol Chem 273,1373-9.

54. Cavileer, T.D., Halpem, B.T., Lawrence, D.M., Podleckis, E.V., Martin, R.R., Hillman, B.I. (1994). Nucleotide sequence of the carlavirus associated with blueberry scorch andsimilar diseases. J Gen Virol, 75,711-720.

55. Chardin, P. (1991). Small GTP-binding proteins of the ras family: a conserved functional mechanism? Cancer Cells 3,117-26.

56. Chavrier, P., Simons, K. & Zerial, M. (1992). The complexity of the Rab and Rho GTP- binding protein subfamilies revealed by a PCR cloning approach. Gene 112,261-4.

57. Chavrier, P., Vingron, M., Sander, C, Simons, K. & Zerial, M. (1990). Molecular cloning of YPTl/SEC4-related cDNAs from an epithelial cell line. Mol Cell Biol 10,6578-85.

58. Chen, X., Tomchick, D. R., Kovrigin, E., Arac, D., Machius, M., Sudhof, T. C. & Rizo, J. (2002). Three-dimensional structure of the complexin/SNARE complex. Neuron 33,397-409.

59. Chen, Y. A. & Scheller, R. H. (2001). SNARE-mediated membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol 2,98-106.

60. Christoforidis, S., McBride, H. M., Burgoyne, R. D. & Zerial, M. (1999). The Rab5 effector EEAl is a core component of endosome docking. Nature 397, 621-5.

61. Clary, D. 0. & Rothman, J. E. (1990). Purification of three related peripheral membrane proteins needed for vesicular transport. J Biol Chem 265,10109-17.

62. Cole, N. В., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J. & Lippincott-Schwartz, J. (1996). Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheralendoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell 7,631-50.

63. Contreras, I., Ortiz-Zapater, E. & Aniento, F. (2004a). Sorting signals in the cytosolic tail of membrane proteins involved in the interaction with plant ARFl and coatomer. Plant J 38,685-98.

64. Contreras, I., Yang, Y., Robinson, D. G. & Aniento, F. (2004b). Sorting signals in the cytosolic tail of plant p24 proteins involved in the interaction with the COPII coat. Plant CellPhysiol 45,1779-86.164

65. Cowan, G. H., Lioliopoulou, F., Ziegler, A. & Torrance, L. (2002). Subcellular localisation, protein interactions, and RNA binding of Potato mop-top virus triple gene blockproteins. Virology 298,106-15.

66. Davenport, G. F. & Baulcombe, D. С (1997). Mutation of the GKS motif of the RNA- dependent RNA polymerase from potato virus X disables or eliminates virus replication. JGen Virol 78 (Pt 6), 1247-51.

67. Deak, F., Schoch, S., Liu, X., Sudhof, T. С & Kavalali, E. T. (2004). Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol 6,1102-8.

68. Denecke, J., Botterman, J. & Deblaere, R. (1990). Protein secretion in plant cells can occur via a default pathway. Plant Cell 2,51-9.

69. Dietrich, L. E., Boeddinghaus, C , LaGrassa, T. J. & Ungermann, С (2003). Control of eukaryotic membrane fusion by N-terminal domains of SNARE proteins. Biochim BiophysActa 1641,111-9.

70. Dietrich, L. E., Peplowska, K., LaGrassa, T. J., Hou, H., Rohde, J. & Ungermann, C. (2005). The SNARE Ykt6 is released from yeast vacuoles during an early stage of fusion.EMBO Rep 6,245-50.

71. Ding, B. (1998). Intercellular protein trafficking through plasmodesmata. Plant Mol Biol 38,279-310.

72. Dirac-Svejstrup, A. В., Sumizawa, T. & Pfeffer, S. R. (1997). Identification of a GDI displacement factor that releases endosomal Rab GTPases from Rab-GDI. Embo J 16, 465-72.

73. Donald, R. G., Lawrence, D.M., Jackson, A.O. (1997). The barley stripe mosaic virus 58- kilodalton |Sb protein is a multifunctional RNA binding protein. J. Virol., 71,1538-1546.

74. Donald, R.G., Jackson, A.O. (1994). The barley stripe mosaic virus 'jb gene encodes a multifunctional cysteine-rich protein that affects pathogenesis. Plant Cell, 6,1593-1606.

75. Donald, R.G., Zhou, H., Jackson, A.O. (1993). Serological analysis of barley stripe mosaic virus-encoded proteins in infected barley. Virology, 195,659-668.

76. Dulubova, L, Yamaguchi, Т., Arac, D., Li, H., Huryeva, L, Min, S. W., Rizo, J. 8c Sudhof, T. С (2003). Convergence and divergence in the mechanism of SNARE binding bySecl/Muncl8-like proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 100,32-7.

77. Edeling, M. A., Smith, C. & Owen, D. (2006). Life of a clathrin coat: insights from clathrin and AP structures. Nat Rev Mol Cell Biol 7,32-44.

78. Erhardt, M., Stussi-Garaud, C, Guilley, H., Richards, K.E., Jonard, G., Bouzoubaa, S. (1999a). The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to theplasmodesmata during virus infection. Virology, 264,220-229.

79. Erhardt, M., Vetter, G., Gilmer, D., Bouzoubaa, S., Richards, K., Jonard, G. & Guilley, H. (2005). Subcellular localization of the Triple Gene Block movement proteins of Beet necroticyellow vein virus by electron microscopy. Virology 340,155-66.

80. Fasshauer, D. & Margittai, M. (2004). A transient N-terminal interaction of SNAP-25 and syntaxin nucleates SNARE assembly. J Biol Chem 279,7613-21.

81. Fasshauer, D. (2003). Structural insights into the SNARE mechanism. Biochim Biophys Acta 1641,87-97.

82. Fasshauer, D., Sutton, R. В., Brunger, A. T. & Jahn, R. (1998). Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs.PNAS 95,15781-15786.

83. Fiedler, K., Veit, M., Stamnes, M. A. 8c Rothman, J. E. (1996). Bimodal interaction of coatomer with the p24 family of putative cargo receptors. Science 273,1396-9.

84. Filippini, F., Rossi, V., Galli, Т., Budillon, A., D'Urso, M. & D'Esposito, M. (2001). 1.ongins: a new evolutionary conserved VAMP family sharing a novel SNARE domain.Trends Biochem Sci 26,407-9.

85. Forster, R.L.S., Beck, D.L., Guilford, P.G.J., Voot, D.M., Van Dolleweerd, C.J., Andersen, M.T. (1992).The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role infacilitating cell-to-cell transport in plants. Virology, 191,480-484.

86. Fridborg, I., Grainger, J., Page, A., Coleman, M., Findlay, K., Angell, S. (2003). TIP, a novel host factor linking callose degradation with the cell-to-cell movement of Potato virusX. Mol Plant Microbe Interact, 16,132-140.

87. Fukuda, R., McNew, J. A., Weber, Т., Parlati, F., Engel, Т., Nickel, W., Rothman, J. E. & Sollner, T. H. (2000). Functional architecture of an intracellular membrane t-SNARE.Nature 407,198-202.

88. Gandhi, S. P. & Stevens, С F, (2003). Three modes of synaptic vesicular recycling revealed by single-vesicle imaging. Nature 423,607-13.

89. Garcia-Mata, R. & Sztul, E. (2003). The membrane-tethering protein pi 15 interacts with GBFl, an ARF guanine-nucleotide-exchange factor. EMBO Rep 4,320-5.

90. Gillingham, A. K. & Munro, S. (2003). Long coiled-coil proteins and membrane traffic. Biochim Biophys Acta 1641,71-85.

91. Gillingham, A. K., Tong, A. H., Boone, C. & Munro, S. (2004). The GTPase Arflp and the ER to Golgi cargo receptor Ervl4p cooperate to recruit the golgin Rud3p to the cis-Golgi.J Cell Biol 167,281-92.

92. Gillooly, D. J., Morrow, I. C, Lindsay, M., Gould, R., Bryant, N. J., Gaullier, J. M., Parton, R. G. & Stenmark, H. (2000). Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate inyeast and mammalian cells. Embo J 19,4577-88.

93. Gilmer, D., Bouzoubaa, S., Hehn, A., Guilley, H., Richards, K., Jonard, G. (1992). Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 3' proximal geneslocated on RNA 2. Virology, 189,40-47.

94. Goldberg, J. (1998). Structural basis for activation of ARF GTPase: mechanisms of guanine nucleotide exchange and GTP-myristoyl switching. Cell 95,237-48.

95. Goldberg, J. (1999). Structural and functional analysis of the ARFl-ARFGAP complex reveals a role for coatomer in GTP hydrolysis. Cell 96,893-902.

96. Gonzalo, S. 8c Under, M. E. (1998). SNAP-25 palmitoylation and plasma membrane targeting require a functional secretory pathway. Mol Biol Cell 9, 585-97.

97. Gonzalo, S., Greentree, W. K. & Under, M. E. (1999). SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain. J Biol Chem 274,21313-8.

98. Gorbalenya, A. E., Koonin, E,V. (1993). Helicases. Amino acid sequence comparisons and beyond. Curr. Opin. Struct. Biol., 3,419-429.

99. Gorelick, F. S. & Shugrue, C. (2001). Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol 177,13-8.

100. Grabski, S., de Feijter, A.W., Schindler, M. (1993). Endoplasmic reticulum forms a dynamic continuum for lipid diffusion between contiguous soybean root cells. Plant Cell, 5,25-38.

101. Guo, W., Roth, D., Walch-Solimena, C. & Novick, P. (1999). The exocyst is an effector for Sec4p, targeting secretory vesicles to sites of exocytosis. Embo J 18,1071-80.

102. Hadlington, J. L. & Denecke, J. (2000). Sorting of soluble proteins in the secretory pathway of plants. Curr Opin Plant Biol 3,461-8.

103. Hala, M., Elias, M. & Zarsky, V. (2005). A specific feature of the angiosperm Rab escort protein (REP) and evolution of the REP/GDI superfamily. J Mol Biol 348,1299-313.

104. Hammond, A. T. & Glick, B. S. (2000). Dynamics of transitional endoplasmic reticulum sites in vertebrate cells. Mol Biol Cell 11,3013-30.

105. Hanton, S. L., Bortolotti, L. E., Renna, L., Stefano, G. & Brandizzi, F. (2005). Crossing the divide-transport between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus inplants. Traffic 6,267-77.

106. Hara-Nishimura, 1.1., Shimada, Т., Hatano, K., Takeuchi, Y. & Nishimura, M. (1998). Transport of storage proteins to protein storage vacuoles is mediated by large precursor-accumulating vesicles. Plant Cell 10,825-36.

107. Hashimoto, K., Igarashi, H., Mano, S., Nishimura, M., Shimmen, T. & Yokota, E. (2005). Peroxisomal localization of a myosin XI isoform in Arabidopsis thaliana. Plant CellPhysiol 46,782-9.169

108. Haupt, S., Cowan, G. H., Ziegler, A., Roberts, A. G., Oparka, K. J. & Torrance, L. (2005). Two plant-viral movement proteins traffic in the endocytic recycling pathway. PlantCell 17,164-81.

109. Hawes, С & Satiat-Jeunemaitre, B. (2005). The plant Golgi apparatus-going with the flow. Biochim Biophys Acta 1744, 93-107.

110. Hawes, С (2005). Cell biology of the plant Golgi apparatus. New Phytologist 165,29- 44.

111. Hefferon, K.L., Doyle, S., AbouHaidar, M.G. (1997). Immunological detection of the 8K protein of potato virus X (PVX) in cell walls of PVX-infected tobacco and transgenicpotato. .4rc/z Virol, 142,425-433.

112. Heo, J. В., Rho, H. S., Kim, S. W., Hwang, S. M., Kwon, H. J., Nahm, M. Y., Bang, W. Y. & Bahk, J. D. (2005). OsGAPl functions as a positive regulator of OsRabl 1-mediatedTGN to PM or vacuole trafficking. Plant Cell Physiol 46,2005-18.

113. Herzog, E., Hemmer, 0., Hauser, S., Meyer, G., Bouzoubaa, S., Fritsch, С (1998). Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology,248,312-322.

114. High, S. & Abell, B. M. (2004). Tail-anchored protein biosynthesis at the endoplasmic reticulum: the same but different. Biochem Soc Trans 32, 659-62.

115. Hirst, J., Miller, S. E., Taylor, M. J., von Mollard, G. F. & Robinson, M. S. (2004). EpsinR is an adaptor for the SNARE protein Vtilb. Mol Biol Cell 15,5593-602.

116. Hodge, T. & Cope, M. J. (2000). A myosin family tree. J Cell Sci 113 Pt 19,3353-4.

117. Hohl, I., Robinson, D. G., Chrispeels, M. J. & Hinz, G. (1996). Transport of storage proteins to the vacuole is mediated by vesicles without a clathrin coat. J Cell Sci 109 (Pt 10),2539-50.

118. Hohl, T. M., Parlati, F., Wimmer, C, Rothman, J. E., Sollner, T. H. & Engelhardt, H, (1998). Arrangement of subunits in 20 S particles consisting of NSF, SNAPs, and SNAREcomplexes. Mol Cell 2,539-48.170

119. Holweg, & Nick, P. (2004). Arabidopsis myosin XI mutant is defective in organelle movement and polar auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A 101,10488-93.

120. Hong, W. (2005). SNARES and traffic. Biochim Biophys Acta 1744,120-44.

121. Huang, M., Weissman, J. Т., Beraud-Dufour, S., Luan, P., Wang, C, Chen, W., Aridor, M., Wilson, I. A. & Balch, W. E. (2001). Crystal structure of Sari-GDP at 1.7 Aresolution and the role of the NH2 terminus in ER export. J. Cell Biol. 155,937-948.

122. Hume, A. N., Collinson, L. M., Hopkins, C. R., Strom, M., Barral, D. C, Bossi, G., Griffiths, G. M. & Seabra, M. C. (2002). The leaden gene product is required with Rab27a torecruit myosin Va to melanosomes in melanocytes. Traffic 3,193-202.

123. Itaya, A., Liang, G., Woo, Y.M., Nelson, R.S., Ding, B. (2000). Non-specific intercellular protein trafficking probed by green-fluorescent protein plants. Protoplasma, 213,165-175.

124. Jackson, A.O., Hunter, B.G., Gustafson, G.D. (1989). Hordeivirus relationships and genome organization. Annu. Rev. Phytopathol, 27, 95-121.

125. Jackson, A.O., Petty, I.T.D., Jones, R.W., Edwards, M.C., French, R. (1991). Analysis of barley stripe mosaic virus pathogenicity. Semin. Virol, 2,107-119.

126. Jahn, R., Lang, T. & Sudhof, T. С (2003). Membrane fusion. Cell 112,519-33.

127. Jankowsky, E., Gross, C.H., Shuman, S., Pyle, A.M. (2001). Active disruption of an RNA-protein interaction by a DExH/D RNA helicase. Science, 291,121-125.

128. Jauh, G. Y., Phillips, T. E. & Rogers, J. C. (1999). Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions. Plant Cell 11,1867-82.

129. Jelkmann, W. (1994). Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and theirrelationship with potex- and carlaviruses. J Ge« Virol, 75,1535-1542.

130. Jelkmann, W. (1994). Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and theirrelationship with potex- and carlaviruses. J Gen Virol 75 (Pt 7), 1535-42.171

131. Jiang, R., Gao, В., Prasad, K., Greene, L. E. & Eisenberg, E. (2000). Hsc70 chaperones clathrin and primes it to interact with vesicle membranes. J Biol Chem 275, 8439-47.

132. Jordens, I., Marsman, M., Kuijl, C. & Nee^es, J. (2005). Rab proteins, connecting transport and vesicle fusion. Traffic 6,1070-7.

133. Jurgens, G. (2004). Membrane trafficking in plants. Annu Rev Cell Dev Biol 20,481- 504.

134. Juuti, J.T., Bamford, D.H., Tuma, R., Thomas, G.J. Jr. (1998). Structure and NTPase activity of the RNA-translocating protein (P4) of bacteriophage phi 6. J Mol Biol, 279, 347-359.

135. Kalinina, N. O., Rakitina, D. V., Solovyev, A. G., Schiemann, J. & Morozov, S. Y. (2002). RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first geneof the triple gene block. Virology 296,321-9.

136. Kalinina, N.A., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, Т., Morozov, S.Yu., Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analysis of recombinant potatovirus X 25K movement protein. FEBSLett, 397, 75-78.

137. Kalinina, N.O., Rakitina, D.V., Solovyev, A.G., Schiemann, J., Morozov, S.Y. (2002). RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of thetriple gene block. Virology, 296,321-329.

138. Kasai, K. & Akagawa, K. (2001). Roles of the cytoplasmic and transmembrane domains of syntaxins in intracellular localization and trafficking. J Cell Sci 114,3115-24.

139. Katz, L. & Brennwald, P. (2000). Testing the 3Q:1R "Rule": Mutational Analysis of the Ionic "Zero" Layer in the Yeast Exocytic SNARE Complex Reveals No Requirement forArginine. Mol. Biol. Cell 11,3849-3858.

140. Kawasaki, M., Nakayama, K. & Wakatsuki, S. (2005). Membrane recruitment of effector proteins by Arf and Rab GTPases. Curr Opin Struct Biol 15,681-9.

141. King, J.A., Dubielzig, R., Grimm, D., Kleinschmidt, J.A. (2001). DNA helicase- mediated packaging of adeno-associated virus type 2 genomes into preformed capsids. EMBOJ, 20,3282-3291.

142. Kirchhausen, T. (2002). Clathrin adaptors really adapt. Cell 109,413-6.

143. Koonin, E. V. & Dolja, V. V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit Rev BiochemMol Biol 28, 375-430.

144. Koticha, D. K., Huddleston, S. J., Witkin, J. W. & Baldini, G. (1999). Role of the cysteine-rich domain of the t-SNARE component, SYNDET, in membrane binding andsubcellular localization. J Biol Chem 274,9053-60.

145. Krishnamurthy, K., Heppler, M., Mitra, R., Blancaflor, E., Payton, M., Nelson, R. S. & Verchot-Lubicz, J. (2003). The Potato virus X TGBp3 protein associates with the ERnetwork for virus cell-to-cell movement. Virology 309,135-51.

146. Kuge, 0., Dascher, C , Orci, L., Rowe, Т., Amherdt, M., Plutner, H., Ravazzola, M., Tanigawa, G., Rothman, J. E. & Balch, W. E. (1994). Sari promotes vesicle budding from theendoplasmic reticulum but not Golgi compartments. J. Cell Biol. 125, 51-65.

147. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227,680-5.

148. Lauber, M. H., Waizenegger, I., Steinmann, Т., Schwarz, H., Mayer, U., Hwang, I., 1.ukowitz, W. & Jurgens, G. (1997). The Arabidopsis KNOLLE protein is a cytokinesis-specific syntaxin. J Cell Bid 139,1485-93.

149. Lawrence, D.M., Jackson, A.O. (2001). Interactions of the TGBl protein during cell- to-cell movement of Barley stripe mosaic vims. J Virol, 75,8712-8723.

150. Lederkremer, G. Z., Cheng, Y., Petre, B. M., Vogan, E., Springer, S., Schekman, R., Walz, T. & Kirchhausen, T. (2001). Structure of the Sec23p/24p and Secl3p/31p complexesof COPII. Proc Natl Acad Sci U S A 98,10704-9.

151. Lee, Y. R. & Liu, B. (2004). Cytoskeletal motors in Arabidopsis. Sixty-one kinesins and seventeen myosins. Plant Physiol 136,3877-83.

152. Levanony, H., Rubin, R., Altschuler, Y. & Galili, G. (1992). Evidence for a novel route of wheat storage proteins to vacuoles. J Cell Biol 119,1117-28.

153. Lin, N. S. & Langenberg, W. G. (1983). Immunohistochemical localization of barley stripe mosaic virions in infected wheat cells. J Ultrastruct Res 84,16-23.

154. Linstedt, A. D. & Hauri, H. P. (1993). Giantin, a novel conserved Golgi membrane protein containing a cytoplasmic domain of at least 350 kDa. Mol Biol Cell 4,679-93.

155. Littleton, J. Т., Barnard, R. J., Titus, S. A., Slind, J., Chapman, E. R. & Ganetzky, B. (2001). SNARE-compIex disassembly by NSF follows synaptic-vesicle fusion. Proc NatlAcad Sci и S A 98,12233-8.

156. Loh, E. & Hong, W. (2004). The binary interacting network of the conserved oligomeric Golgi tethering complex. J Biol Chem 279,24640-8.

157. Longstaff, M., Brigneti, G., Boccard, F., Chapman, S. & Baulcombe, D. (1993). Extreme resistance to potato virus X infection in plants expressing a modified component ofthe putative viral replicase. Embo J 12,379-86.

158. Loranger, S. S. & Linder, M. E. (2002). SNAP-25 traffics to the plasma membrane by a syntaxin-independent mechanism. J Biol Chem 277,34303-9.174

159. Lough, Т. J., Balmori, E., Beck, D. L. & Forster, R. L. (1998). Western analysis of transgenic plants. Methods Mol Biol 81,447-51.

160. Lough, T. J., Lee, R. H., Emerson, S. J., Forster, R. L. & Lucas, W. J. (2006). Functional analysis of the 5' untranslated region of potexvirus RNA reveals a role in viralreplication and cell-to-cell movement. Virology 351,455-65.

161. Lough, T.J., Emerson, S.J., Lucas, W.J., Forster, R.L. (2001). Trans-complementation of long-distance movement of White clover mosaic virus triple gene block (TGB) mutants:phloem-associated movement of TGBpl. F/ro/ogy, 288,18-28.

162. Lowry, 0. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193,265-75.

163. Luan, P., Heine, A., Zeng, K., Moyer, В., Greasely, S. E., Kuhn, P., Balch, W. E. & Wilson, 1. A. (2000). A new functional domain of guanine nucleotide dissociation inhibitor(alpha-GDI) involved in Rab recycling. Traffic 1,270-81.

164. Lukowitz, W., Mayer, U. & Jurgens, G. (1996). Cytokinesis in the Arabidopsis embryo involves the syntaxin-related ICNOLLE gene product. Cell 84,61-71.

165. Lupas, A. (1997). Predicting coiled-coil regions in proteins. Curr Opin Struct Biol 7, 388-93.

166. Macia, E., Luton, F., Partisani, M., Cherfils, J., Chardin, P. & Franco, M. (2004). The GDP-bound form of Arf6 is located at the plasma membrane. J Cell Sci 117,2389-98.

167. Mahal, L. K., Sequeira, S. M., Gureasko, J. M. & Sollner, T. H. (2002). Calcium- independent stimulation of membrane fusion and SNAREpin formation by synaptotagmin L JCell Biol 158,273-82.

168. Martelli, G. P. & Jelkmann, W. (1998). Foveavirus, a new plant virus genus. Arch Virol 143,1245-9.175

169. Marty, F. (1999). Plant Vacuoles. Plant Cell 11,587-600.

170. Marz, K. E., Lauer, J. M. & Hanson, P. I. (2003). Defining the SNARE complex binding surface of alpha-SNAP: implications for SNARE complex disassembly. J Biol Chem278,27000-8.

171. Matsuoka, K., Orci, L., Amherdt, M., Bednarek, S. Y., Hamamoto, S., Schekman, R. & Yeung, T. (1998). COPII-coated vesicle formation reconstituted with purified coat proteinsand chemically defined liposomes. Cell 93,263-75.

172. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K. & Nakano, A. (2006). 1.ive imaging of yeast Golgi cistemal maturation. Nature 441,1007-10.

173. McBride, H. M., Rybin, V., Murphy, C, Giner, A., Teasdale, R. & Zerial, M. (1999). Oligomeric complexes link Rab5 effectors with NSF and drive membrane fusion viainteractions between EEAl and syntaxin 13. Cell 98,377-86.

174. McGeachy, K.D., Barker, H. (2000). Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol PlantMicrobe Interact, 13,125-128.

175. McMahon, H. T. & Mills, I. G. (2004). COP and clathrin-coated vesicle budding: different pathways, common approaches. Curr Opin Cell Biol 16,379-91.

176. Meckel, Т., Hurst, A. C.,Thiel, G. & Homann, U. (2004). Endocytosis against high turgor: intact guard cells of Vicia faba constitutively endocytose fluorescently labelled plasmamembrane and GFP-tagged K-channel KATl. Plant J 39,182-93.

177. Memon, A. R. (2004). The role of ADP-ribosylation factor and SARI in vesicular trafficking in plants. Biochim Biophys Acta 1664,9-30.

178. Molendijk, A. J., Ruperti, B. & Palme, K. (2004). Small GTPases in vesicle trafficking. Curr Opin Plant Biol 7,694-700.

179. Morozov, S., Dolja, V. V. & Atabekov, J. G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J Mol Evol 29,52-62.176

180. Morozov, S.Yu., Lukasheva, L.I., Chernov, B.K., Skryabin, K.G., Atabekov, J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron inpotato virus X. FEBSLett., 213,438-442.

181. Morozov, S.Yu., Miroschnochenko, N.A., Solovyev, A.G., Fedorkin, O.N., Zelenina, D.A., Lukasheva, L.I., Karasev, A.V., Dolja, V.V., Atabekov, J.G. (1991). Expressionstrategy of the potato virus X triple gene block. J Gen Virology, 72,2039-2042.

182. Morozov, S.Yu., Solovyev, A.G. (2003). Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. JGe« Virol, 84:1351-1366.

183. Morozov, S.Yu., Solovyev, A.G., Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Schiemann, J., Atabekov, J.G. (1999). Evidence for two nonoverlapping functional domainsin the potato virus X 25K movement protein. Virology, 260,55-63.

184. Morozov,S.Yu. and Solovyev,A.G. 1999. Genome organization in RNA viruses. In "Molecular biology of plant viruses".(C.L.Mandahar,Ed) pp 47-98. Kluwer AcademicPublishes, (review) Boston/Dordrecht /London.

185. Mossessova, E., Bickford, L. C. & Goldberg, J. (2003). SNARE selectivity of the COPIIcoat. Cell 114,483-95.

186. Movafeghi, A., Happel, N., Pimpl, P., Tai, G. H. & Robinson, D. G. (1999). Arabidopsis Sec21p and Sec23p homologs. Probable coat proteins of plant COP-coatedvesicles. Plant Physiol 119,1437-46.

187. Muller, I., Wagner, W., Volker, A., Schellmann, S., Nacry, P., Kuttner, F., Schwarz- Sommer, Z., Mayer, U. & Jurgens, G. (2003). Syntaxin specificity of cytokinesis inArabidopsis. Nat Cell Biol 5,531-4.

188. Murshid, A. & Presley, J. F. (2004). ER-to-Golgi transport and cytoskeletal interactions in animal cells. Cell Mol Life Sci 61,133-45.177

189. Nagashima, К., Torii, S., Yi, Z., Igarashi, M., Okamoto, K., Takeuchi, T. & Izumi, T. (2002). Melanophilin directly links Rab27a and myosin Va through its distinct coiled-coilregions. FEBS Lett 517,233-8.

190. Nagel, R., Elliott, A., Masel, A., Birch, R.G., Manners, J.M. (1990). Electyroporation of binary Ti plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes.FEMS Microb Lett, 67,325-328.

191. Nakamura, N., Lowe, M., Levine, T. P., Rabouille, С & Warren, G. (1997). The vesicle docking protein pi 15 binds GM130, a cis-Golgi matrix protein, in a mitoticallyregulated manner. Cell 89,445-55.

192. Nakamura, N., Rabouille, C , Watson, R., Nilsson, Т., Hui, N., Slusarewicz, P., bCreis, T. E. & Warren, G. (1995). Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J CellBiol 131,1715-26.

193. Nebenfuhr, A. & Staehelin, L. A. (2001). Mobile factories: Golgi dynamics in plant cells. Trends Plant Sci 6,160-7.

194. Nebenfuhr, A. (2002). Vesicle traffic in the endomembrane system: a tale of COPs, Rabs and SNAREs. Curr Opin Plant Biol 5,507-12.

195. Nebenfuhr, A., Frohlick, J. A. & Staehelin, L. A. (2000). Redistribution of Golgi stacks and other organelles during mitosis and cytokinesis in plant cells. Plant Physiol 124,135-51.

196. Nebenfuhr, A., Gallagher, L. A., Dunahay, T. G., Frohlick, J. A., Mazurkiewicz, A. M., Meehl, J. B. & Staehelin, L. A. (1999). Stop-and-go movements of plant Golgi stacks aremediated by the acto-myosin system. Plant Physiol 121,1127-42.

197. Nebenfuhr, A., Ritzenthaler, С & Robinson, D. G. (2002). Brefeldin A: deciphering an enigmatic inhibitor of secretion. Plant Physiol 130,1102-8.

198. Neu, M., Brachvogel, V., Oschkinat, H., Zerial, M. & Metcalf, P. (1997). Rab7: NMR and kinetics analysis of intact and C-terminal truncated constructs. Proteins 27,204-9.

199. Neumann, U., Brandizzi, F. & Hawes, C. (2003). Protein transport in plant cells: in and out of the Golgi. Ann Bot (Lond) 92,167-80.

200. Nickel, W., Brugger, B. & Wieland, F. T. (2002). Vesicular transport: the core machinery of COPI recruitment and budding. J Cell Sci 115,3235-40.

201. Nufer, 0., Guldbrandsen, S., Degen, M., Kappeler, F., Paccaud, J. P., Tani, K. & Hauri, H. P. (2002). Role of cytoplasmic C-terminal amino acids of membrane proteins in ERexport. J Cell Sci 115, 619-28.

202. Oparka, K. J. & Roberts, A. G. (2001). Plasmodesmata. A not so open-and-shut case. PlantPhysiol 125,123-6.

203. Oparka, K.J., Prior, D. (1996). Direct evidence for pressure generated closure of plasmodesmata. Plant J., 2,741-750.

204. Orci, L., Perrelet, A. & Rothman, J. E. (1998). Vesicles on strings: moфhological evidence for processive transport within the Golgi stack. Proc Natl Acad Sci U S A 95,2279-83.

205. Oufattole, M., Park, J. H., Poxleitner, M., Jiang, L, & Rogers, J. C. (2005). Selective membrane protein intemalization accompanies movement from the endoplasmic reticulum tothe protein storage vacuole pathway in Arabidopsis. Plant Cell 17,3066-80.

206. Pabst, S., Margittai, M., Vainius, D., Langen, R., Jahn, R. & Fasshauer, D. (2002). Rapid and selective binding to the synaptic SNARE complex suggests a modulatory role ofcomplexins in neuroexocytosis. J Biol Chem 277,7838-48.

207. Paleotti, 0., Macia, E., Luton, F., Klein, S., Partisani, M., Chardin, P., Kirchhausen, T. & Franco, M. (2005). The small G-protein Arf6GTP recruits the AP-2 adaptor complex tomembranes. J Biol Chem 280,21661-6.

208. Pan, X., Eathiraj, S., Munson, M. & Lambright, D. G. (2006). TBC-domain GAPs for Rab GTPases accelerate GTP hydrolysis by a dual-finger mechanism. Nature 442,303-6.

209. Paris, N. & Neuhaus, J. M. (2002). BP-80 as a vacuolar sorting receptor. Plant Mol Biol 50,903-14.

210. Paris, N., Stanley, C. M., Jones, R. L. & Rogers, J. C. (1996). Plant cells contain two functionally distinct vacuolar compartments. Cell 85,563-72.179

211. Pashkova, N., Catlett, N. L., Novak, J. L. & Weisman, L. S. (2005a). A point mutation in the cargo-binding domain of myosin V affects its interaction with multiple cargoes.Eukaryot Cell 4,787-98.

212. Pashkova, N., Catlett, N. L., Novak, J. L., Wu, G., Lu, R., Cohen, R. E. & Weisman, 1.. S. (2005b). Myosin V attachment to cargo requires the tight association of two functionalsubdomains. J Cell Biol 168,359-64.

213. Pashkova, N., Jin, Y., Ramaswamy, S. & Weisman, L. S. (2006). Structural basis for myosin V discrimination between distinct cargoes. Embo J 25,693-700.

214. Pereira-Leal, J. B. & Seabra, M. С (2000). The mammalian Rab family of small GTPases: definition of family and subfamily sequence motifs suggests a mechanism forfunctional specificity in the Ras superfamily. J Mol Biol 301,1077-87.

215. Pereira-Leal, J. B. & Seabra, M. С (2001). Evolution of the Rab family of small GTP- binding proteins. J Mol Biol 313,889-901.

216. Petty, I.T., Hunter, B.G., Wei, N., Jackson, A.O. (1989). Infectious barley stripe mosaic virus RNA transcribed in vitro from full-length genomic cDNA clones. Virology, 171,342-349.

217. Petty, I.T.D., Jackson, A.O. (1990). Mutational analysis of barleystripe mosaic virus RNA/3. Virology, 179,712-718.

218. Pfeffer, S. & Aivazian, D. (2004). Targeting Rab GTPases to distinct membrane compartments. Nat Rev Mol Cell Biol 5,886-96.

219. Pfeffer, S. (2005a). A model for Rab GTPase localization. Biochem Soc Trans 33, 627-30.

220. Pfeffer, S. R. (2005b). Structural clues to Rab GTPase functional diversity. J Biol Chem 280,15485-8.

221. Phillipson, B. A., Pimpl, P., daSilva, L. L., Crofts, A. J., Taylor, J. P., Movafeghi, A., Robinson, D. G. & Denecke, J. (2001). Secretory bulk flow of soluble proteins is efficient andCOPII dependent. Plant Cell 13,2005-20.

222. Pimpl, P., Movafeghi, A., Coughlan, S., Denecke, J., Hillmer, S. & Robinson, D. G. (2000). In situ localization and in vitro induction of plant COPI-coated vesicles. Plant Cell 12,2219-36.

223. Pobbati, A. V., Razeto, A., Boddener, M., Becker, S. & Fasshauer, D. (2004). Structural basis for the inhibitory role of tomosyn in exocytosis. J Biol Chem 279,47192-200.180

224. Polishchuk, R. S. & Mironov, A. A. (2004). Structural aspects of Golgi function. Cell Mol Life Sci 61,146-58.

225. Pratelli, R., Sutter, J. U. & Blatt, M. R. (2004). A new catch in the SNARE. Trends Plant Sci 9,187-95.

226. Provance, D. W., James, T. L. & Mercer, J. A. (2002). Melanophilin, the product of the leaden locus, is required for targeting of myosin-Va to melanosomes. Traffic 3,124-32.

227. Reddy, A. S. & Day, I. S. (2001). Analysis of the myosins encoded in the recently completed Arabidopsis thaliana genome sequence. Genome Biol 2, RESEARCH0024.

228. Reichelt, S., Knight, A. E., Hodge, T. P., Baluska, F., Samaj, J., Volkmann, D. & Kendrick-Jones, J. (1999). Characterization of the unconventional myosin VIII in plant cellsand its localization at the post-cytokinetic cell wall. Plant J 19,555-67.

229. Rein, U., Andag, U., Duden, R., Schmitt, H. D. & Spang, A. (2002). ARF-GAP- mediated interaction between the ER-Golgi v-SNAREs and the COPI coat. J Cell Biol 157,395-404.

230. Rizo, J. & Sudhof, T. C. (2002). Snares and Muncl8 in synaptic vesicle fusion. Nat RevNeurosci 3,641-53.

231. Robinson, D. G., Hinz, G. & Holstein, S. E. (1998). The molecular characterization of transport vesicles. Plant Mol Biol 38,49-76.

232. Rodionova, N. P., Kaфova, 0. V., Kozlovsky, S. V., Zayakina, 0. V., Arkhipenko, M. V. & Atabekov, J. G. (2003). Linear remodeling of helical virus by movement proteinbinding. J Mol Biol 333,565-72.

233. Rohde, W., Gramstat, A., Schmitz, J., Tacke, E., Prufer, D. (1994). Plant viruses as model systems for the study of non-canonical translation mechanisms in higher plants. J. Gen.Virol, 75,2141-2149.181

234. Rossi, V., Banfield, D. K., Vacca, M., Dietrich, L. E., Ungermann, C, D'Esposito, M., Gain, T. & Filippini, F. (2004). Longins and their longin domains: regulated SNAREs andmultifunctional SNARE regulators. Trends Biochem Sci 29,682-8.

235. Roth, M.G. (1999). Inheriting the Golgi. Cell 99,559-62.

236. Rowe, J., Calegari, F., Tavema, E., Longhi, R. & Rosa, P. (2001). Syntaxin lA is delivered to the apical and basolateral domains of epithelial cells: the role of munc-18proteins. J Cell Sci 114,3323-32.

237. Rupasov, V.V., Morozov, S.Yu., Kanyuka, K.V., and Zavriev, S.K. (1989). Partial nucleotide sequence of potato virus M RNA shows similarities to protexviruses in genearrangement and the encoded amino acid sequences. J. Gen. Virol., 70,1861-1869.

238. Russinova, E., Borst, J. W., Kwaaitaal, M., Cano-Delgado, A., Yin, Y., Chory, J, & de Vries, S. C. (2004). Heterodimerization and endocytosis of Arabidopsis brassinosteroidreceptors BRIl and AtSERK3 (BAKl). Plant Cell 16,3216-29.

239. Rutherford, S. & Moore, I. (2002). The Arabidopsis Rab GTPase family: another enigma variation. Curr Opin Plant Biol 5, 518-28.

240. Ryabov, E.V., Oparka, K.J., Santa-Cruz, S., Robinson, D.J., Taliansky, M.E. (1998). Intracellular location of two groundnut rosette umbravirus proteins delivered by PVX andTMV vectors. Virology, 242,303-313.

241. Ryabov, E.V., Robinson, D.J., Taliansky, M.E. (1999). A plantvirus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 96,1212-1217. '

242. Sacher, M., Barrowman, J., Wang, W., Horecka, J., Zhang, Y., Pypaert, M. & Ferro- Novick, S. (2001). TRAPP I implicated in the specificity of tethering in ER-to-Golgitransport. Mol Cell 7,433-42.

243. Samaj, J., Baluska, F., Voigt, В., ScMicht, M., Volkmann, D. & Menzel, D. (2004). Endocytosis, actin cytoskeleton, and signaling. Plant Physiol 135,1150-61.

244. Samaj, J., Read, N. D., Volkmann, D., Menzel, D. & Baluska, F. (2005). The endocytic network in plants. Trends Cell Biol 15,425-33.

245. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.

246. Sanderfoot, A. A., Assaad, F. F. & Raikhel, N. V. (2000). The Arabidopsis genome. An abundance of soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptors. PlantPhysiol 124,1558-69.

247. Sanderfoot, A. A., Kovaleva, V., Bassham, D. C. & Raikhel, N. V. (2001). Interactions between syntaxins identify at least five SNARE complexes within theGolgi/prevacuolar system of the Arabidopsis cell. Mol Biol Cell 12,3733-43.

248. Santa-Cruz, S. (1999). Perspective: phloem transport of viruses and macromolecules - what goes in must come out.Trends Microbiol, 7,237-241.

249. Santa-Cruz, S., Roberts, A.G., Prior, D.A.M., Chapman, S., Oparka, K.J. (1998). Cell- to-cell and phloem - mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant cell, 10,495-510.

250. Sapperstein, S. K., Walter, D. M., Grosvenor, A. R., Heuser, J. E. & Waters, M. G. (1995). pi 15 is a general vesicular transport factor related to the yeast endoplasmic reticulumto Golgi transport factor Usolp. Proc Natl Acad Sci U S A 92,522-6.

251. Sata, M., Donaldson, J. G., Moss, J. & Vaughan, M. (1998). Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange activity of Sec7 domain from yeast Sec7 with yeast andmammalian ADP ribosylation factors. PNAS 95,4204-4208.

252. Sato, M. H., Nakamura, N., Ohsumi, Y., Kouchi, H., Kondo, M., Hara-Nishimura, I., Nishimura, M. & Wada, Y. (1997). The AtVAM3 encodes a syntaxin-related moleculeimplicated in the vacuolar assembly in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 272,24530-5.

253. Savenkov, E.I., Solovyev, A.G., Morozov, S.Y. (1998). Genome sequences of poa semilatent and lychnis ringspot hordeiviruses. .(4rc/z. Virol., 143,1379-1393.183

254. Scales, S. J., Hesser, B. A., Masuda, E. S. & Scheller, R. H. (2002). Amisyn, a novel syntaxin-binding protein that may regulate SNARE complex assembly. J Biol Chem 277,28271-9.

255. Schalk, I., Zeng, K., Wu, S. K., Stura, E. A., Matteson, J., Huang, M., Tandon, A., Wilson, I. A. & Balch, W. E. (1996). Stracture and mutational analysis of Rab GDP-dissociation inhibitor. Nature 381,42-8.

256. Seabra, M. С & Coudrier, E. (2004). Rab GTPases and myosin motors in organelle motility. Traffic 5,393-9.

257. Seabra, M. C. & Wasmeier, С (2004). Controlling the location and activation of Rab GTPases. Curr Opin Cell Biol 16,451-7.

258. Serafmi, Т., Orci, L., Amherdt, M., Brunner, M., Kahn, R. A. & Rothman, J. E. (1991a). ADP-ribosylation factor is a subunit of the coat of Golgi-derived COP-coatedvesicles: a novel role for a GTP-binding protein. Cell 67,239-53.

259. Serazev, T. V., Kalinina, N. 0., Nadezhdina, E. S., Shanina, N. A. & Morozov, S. Y. (2003). Potato virus X coat protein interacts with microtubules in vitro. Cell Biol Int 27,271-2.

260. Shapiro, A. D. & Pfeffer, S. R. (1995). Quantitative analysis of the interactions between prenyl Rab9, GDP dissociation inhibitor-alpha, and guanine nucleotides. J BiolChem 270,11085-90.

261. Shorter, J. & Warren, G. (2002). Golgi architecture and inheritance. Annu Rev Cell Dev Biol 18,379-420.

262. Shorter, J., Beard, M. В., Seemann, J., Dirac-Svejstrup, A. B. & Warren, G. (2002). Sequential tethering of Golgins and catalysis of SNAREpin assembly by the vesicle-tetheringprotein pi 15. J Cell Biol 157,45-62.184

263. Simonsen, A., GauUier, J. M., D'Arrigo, A. & Stenmark, H. (1999). The Rab5 effector EEAl interacts directly with syntaxin-6. J Biol Chem 274,28857-60.

264. Sivars, U., Aivazian, D. & Pfeffer, S. R. (2003). Yip3 catalyses the dissociation of endosomal Rab-GDI complexes. Nature 425, 856-9.

265. Snyder, D. A., Kelly, M. L. & Woodbury, D. J. (2006). SNARE complex regulation by phosphorylation. Cell Biochem Biophys 45,111-23.

266. Soderholm, J., Bhattacharyya, D., Strongin, D., Markovitz, V., Connerly, P. L., Reinke, С A. & Glick, B. S. (2004). The transitional ER localization mechanism of Pichiapastoris Secl2. Dev Cell 6,649-59.

267. Soldati, Т., Shapiro, A. D., Svejstrup, A. B. & Pfeffer, S. R. (1994). Membrane targeting of the small GTPase Rab9 is accompanied by nucleotide exchange. Nature 369, 76-8.

268. Sollner, Т., Whiteheart, S. W., Brunner, M., Erdjument-Bromage, H., Geromanos, S., Tempst, P. & Rothman, J. E. (1993). SNAP receptors implicated in vesicle targeting andfusion. Nature 362,318-24.

269. Solovyev, A. G., Stroganova, T. A., Zamyatnin, A. A., Jr., Fedorkin, 0 . N., Schiemann, J. & Morozov, S. Y. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associatedtriple gene block proteins: TGBp3-assisted targeting of TGBp2. Virology 269,113-27.

270. Sonnichsen, В., Lowe, M., Levine, Т., Jamsa, E., Dirac-Svejstrup, B. & Warren, G. (1998). A role for giantin in docking COPI vesicles to Golgi membranes. J Cell Biol 140,1013-21.

271. Soultanas, P., Wigley, D.B. (2001). Unwinding the 'Gordian knot' of helicase action. Trends Biochem Sci, 26,47-54.

272. Stenmark, H. & Aasland, R. (1999). FYVE-fmger proteins-effectors of an inositol lipid. J Cell Sci 112 (Pt 23), 4175-83.

273. Stroupe, С & Brunger, A. T. (2000). Crystal structures of a Rab protein in its inactive and active conformations. J Mol Biol 304,585-98.

274. Sudhof, T. C. (2004). The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Neurosci 27,509-47.

275. Suфin, M. & Raikhel, N. (2004). Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 5,100-9.

276. Sutter, J. U., Campanoni, P., Blatt, M. R. & Paneque, M. (2006). Setting SNAREs in a different wood. Traffic 7,627-38.

277. Sutton, R. В., Fasshauer, D., Jahn, R. & Brunger, A. T. (1998). Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution. Nature 395,347-53.

278. Suvorova, E. S., Duden, R. & Lupashin, V. V. (2002). The Sec34/Sec35p complex, a Yptlp effector required for retrograde intra-Golgi trafficking, interacts with Golgi SNAREsand COPI vesicle coat proteins. J Cell Biol 157,631 -43.

279. Sztul, E. & Lupashin, V. (2006). Role of tethering factors in secretory membrane traffic. Am J Physiol Cell Physiol 290, Cll-26.

280. Takeuchi, M., Ueda, Т., Yahara, N. & Nakano, A. (2002). Arfl GTPase plays roles in the protein traffic between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus in tobacco andArabidopsis cultured cells. Plant J 31,499-515.

281. Taliansky, M.E., Robinson, D.J., Murant, A.F. (1996). Complete nucleotide sequence and organization of the RNA genome of groundnut rosette umbravirus. Gen Virol, 77, 2335-2345.

282. Tamai, A., Meshi, R. (2001). Cell-to-cell movement of potato virus X: the role of pl2 and p8 encoded by second and third open reading frames of the triple gene block. Mol PlantMicrobe Interact, 14,1158-1167.186

283. TerBush, D. R., Maurice, Т., Roth, D. & Novick, P. (1996). The Exocyst is a multiprotein complex required for exocytosis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J 15, 6483-94.

284. The Arabidopsis Genome, I. (2000). Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408,796-815.

285. Topfer, R., Matzeit, V., Gronenborn, В., Schell, J., Steinbiss, H.-H. (1987). A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. Nucleic Acids Res. 15,5890.

286. Tseng, S.S., Weaver, P.L., Liu, Y., Hitomi, M., Tartakoff, A.M., Chang, Т.Н. (1998). Dbp5p, a cytosolic RNA helicase, is required for poly(A)+ RNA export. EMBO J, 17, 2651-2662.

287. Ueda, T. & Nakano, A. (2002). Vesicular traffic: an integral part of plant life. Curr Opin Plant Biol 5,513-7.

288. Ueda, Т., Uemura, Т., Sato, M. H. & Nakano, A. (2004). Functional differentiation of endosomes in Arabidopsis cells. Plant J 40,783-9.

289. Uemura, Т., Ueda, Т., Ohniwa, R. L., Nakano, A., Takeyasu, K. & Sato, M. H. (2004). Systematic analysis of SNARE molecules in Arabidopsis: dissection of the post-Golginetwork in plant cells. Cell Struct Funct 29,49-65.

290. Uemura, Т., Yoshimura, S. H., Takeyasu, K. & Sato, M. H. (2002). Vacuolar membrane dynamics revealed by GFP-AtVam3 fusion protein. Genes Cells 7, 743-53.

291. Ungermann, C. & Langosch, D. (2005). Functions of SNAREs in intracellular membrane fusion and lipid bilayer mixing. J Cell Sci 118,3819-28.

292. Verchot, J., Angell, S.M., Baulcombe, C. (1998). In vivo translation of the triple gene block of the potato virus X requires two subgenomic mRNAs. J. Virol, 1998,8316-8320.

293. Verma, D. P. (2001). Cytokinesis and Building of the Cell Plate in Plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52,751-784.

294. Vemoud, V., Horton, A. C, Yang, Z. & Nielsen, E. (2003). Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. Plant Physiol 131,1191-208.187

295. Vetter, I. R. & Wittinghofer, A. (2001). The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science 294,1299-304.

296. Voinnet, 0., Lederer, С & Baulcombe, D. С (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal inNicotiana benthamiana. Cell 103,157-67.

297. Wang, Z. & Pesacreta, T. C. (2004). A subclass of myosin XI is associated with mitochondria, plastids, and the molecular chaperone subunit TCP-1 alpha in maize. Cell MotilCytoskeleton 57,218-32.

298. Washbourne, P., Cansino, V., Mathews, J. R., Graham, M., Burgoyne, R. D. & Wilson, M. C. (2001). Cysteine residues of SNAP-25 are required for SNARE disassemblyand exocytosis, but not for membrane targeting. Biochem J 357,625-34.

299. Waters, M. G., Clary, D. 0. & Rothman, J. E. (1992). A novel 115-kD peripheral membrane protein is required for intercisternal transport in the Golgi stack. J Cell Biol 118,1015-26.

300. Watson, R. T. & Pessin, J. E. (2001). Transmembrane domain length determines intracellular membrane compartment localization of syntaxins 3, 4, and 5. Am J Physiol CellPhysiol 281, C215-23.

301. Weimbs, Т., Low, S. H., Chapin, S. J., Mostov, K. E., Bucher, P. & Hofmann, K. (1997). A conserved domain is present in different families of vesicular fusion proteins: a newsuperfamily. Proc Natl Acad Sci U S A 94,3046-51.

302. Wickner, W. & Haas, A. (2000). Yeast homotypic vacuole fusion: a window on organelle trafficking mechanisms. Annu Rev Biochem 69,247-75.

303. Wu, X, Wang, F., Rao, K., Sellers, J. R. & Hammer, J. A., 3rd (2002). Rab27a is an essential component of melanosome receptor for myosin Va. Mol Biol Cell 13,1735-49.

304. Wung, C.H., Hsu, Y.H., Liou, D.Y., Huang, W.C, Lin, N.S., Chang, B.Y. (1999). Identification of the RNA-binding sites of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaicpotexvirus. J. Gen Virol, 80,1119-1126.188

305. Yamakawa, Н., Seog, D. H., Yoda, K., Yamasaki, M. & Wakabayashi, T. (1996). Usol protein is a dimer with two globular heads and a long coiled-coil tail. J Struct Biol 116,356-65.

306. Yang, В., Steegmaier, M., Gonzalez, L. C, Jr. & Scheller, R. H. (2000). nSecl binds a closed conformation of syntaxinlA. J Cell Biol 148,247-52.

307. Yang, Y., Ding, В., Baulcombe, D., Verchot, J. (2000). Cell-to-cell movement of the 25K protein of potato virus X is regulated by three other viral proteins. Mol Plant MicrobeInteract, 13,599-605.

308. Yano, D., Sato, M., Saito, C, Sato, M. H., Morita, M. T. & Tasaka, M. (2003). A SNARE complex containing SGR3/AtVAM3 and ZIGA^TIll in gravity-sensing cells isimportant for Arabidopsis shoot gravitropism. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8589-94.

309. Zamyatnin, A. A., Jr., Solovyev, A. G., Bozhkov, P. V., Valkonen, J. P., Morozov, S. Y. & Savenkov, E. I. (2006). Assessment of the integral membrane protein topology in livingcells. Plant J 46,145-54.

310. Zerial, M. & McBride, H. (2001). Rab proteins as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol 2,107-17.189

311. Zhao, L., Helms, J. В., Brugger, В., Harter, C, Martoglio, В., Graf, R., Brunner, J. & Wieland, F. T. (1997). Direct and GTP-dependent interaction of ADP ribosylation factor 1with coatomer subunit beta. Proc Natl Acad Sci U S A 94,4418-23.

312. Zhao, L., Helms, J. В., Brunner, J. & Wieland, F. T. (1999). GTP-dependent binding of ADP-ribosylation factor to coatomer in close proximity to the binding site for dilysineretrieval motifs and p23. J Biol Chem 274,14198-203.

313. Zhou, Y., Jackson, A.O. (1996). Expression of the barley striple mosaic virus "triple gene block". Virology, 216,367-379.190