Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики"

На правах рукописи

МАПИНОВСКИИ

Владимир Иванович

МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток 1998

Работа выполнена в лаборатории физиологии растений Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения Российской Академии наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. В. Реунов доктор биологических наук А. С. Романенко доктор биологических наук В. И. Чиков

Ведущее учреждение - Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита состоится "¿С" 1998 г. в час на

заседании диссертационного совета ДР 003.97.07 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, Владивосток, Проспект 100-летия Владивостока, 159. Факс 8-4232-310-193.

С диссертацией можно ознакомиться в Цетрапьной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан "ЗО' ОлЛ^Лл-РЛхтъ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 7 Л. А. Варфоломеева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА501 Ы

Работа представляет собой экспериментальное исследование основных этапов взаимодействия вируса табачной мозаики с чупс.твитель-ными и сверхчувствительными растениями табака, проникновение вируса в растение, накопление инфекционного вирусного материала и распространение его в растении. Особое внимание обращено на изучение механизмов защитных реакций, специфичных для сперхчупстии-тельных растений: некроз инфицированных клеток и поиобре)енная устойчивость к повторному заражению вирусом.

Актуальность проблемы. Необходимость выяснемия исханиямое устойчивости растений к вирусам определяется их связью с практическими задачами охраны растений от вирусов. Ущерб, наносимый вирусами, очень велик, так как вирусные болезни значиюлвно снижают урожай сельскохозяйственных культур и ухудшают товарные качества продуктов.

Химические методы борьбы имеют ряд ограничений. Во-первых, они небезопасны для человека и окружающей среды Во-вторых, химические методы применяются, в основном, в тех случаях, когда вирусы передаются от растения к растению насекомыми-переносчиками, против которых и используются химические средства защиты растений В-третьих, они недостаточно эффективны, так как их использование не дает 100 %-ного положительного эффекта и часто пооисходит быстрое привыкание переносчиков к инсектицидам.

Наиболее перспективно с гкологической точки зрения использовать защитные механизмы самих растений сформировавшиеся л процессе длительной совместной эволюции растений и патогенов [Вавилов, 1967], но они еще недостаточно изучены. Это объясняется, во-первых, их сложностью, во-вторых, отсутствием до недавнего времени модельных систем и методов, посредством которых можно было бы разграничить и воспроизвести разные этапы взаимодействия вирус - растение и дать им количественные характеристики. Сейчас положение иное. Разработаны 1акие системы как изолированные поотопласты и клетки, позволящие моделировать отдельные этапы взаимодействия вируса с растением Соврем? иные, о том числе и применяемые в данной работе, методы даюг возможность количественно характеризонать некоторые события, происходящие в больном растении.

Цель и основные задачи работы. Целью настоящей работы было изучение механизмов устойчивости свеохчуиствигельных растений <а

бака к вирусу табачной мозаики (ВГМ). В ходе работы решались следующие задачи:

1). Сравнить проникновение частиц ВТМ в листья чувствительных и сверхчувствительных растений в процессе механической инокуляции

2). Определить динамику накопления разных штаммов ВТМ и ингибиторов вирусной репликации в растениях, различающихся по своей реакции на вирусное поражение.

3). Сравнить "ближний" транспорт ВТМ от клетки к клетке в листьях разных растений-хозяев.

4). Изучить иекротизацию инфицированных клеток сверхчувствительных растений.

5) Охарактеризовать приобретенную устойчивость сверхчувствительных растений к повторному заражению вирусом.

Научн ая _ но в и л и а Работа представляет собой первую попытку комплексного исследования основных этапов инфекционного процесса у родственных растений, сходных по своему морфологическому строению, но по-разному реагирующих на заражение одними и теми же вирусами, с целью выяснении механизмов устойчивости растений против вирусов.

Впервые доказано, что при равных условиях заражения у чувствительных, толерантных и сверхчувствительных растений табака заражается одинаковое число эпидермальных и мезофипьных клеток и в листьях образуется равное количество инфекционных центров.

Впервые дана сравнительная характеристика поглощения частиц ВТМ протопластами, изолированными из листьев чувствительных и сверхчувствительных растений табака, в зависимости от условий инокуляции. Впервые изучено поглощение частиц ВТМ протопластами, изолированными из листьев с приобретенной устойчивостью к повторному заражению вирусом.

Впервые получены данные об агрегации, деградации и инактивации частиц ВТМ в межклеточном пространстве листьев чувствительных и сверхчувствительных растений табака. Показана зависимость защитной активности апопласта от развития приобретенной устойчивости сверхчувствительных растений.

Впервые установлено, что снижение по сравнению с чувствительными растениями скорости накопления вируса е листьях сверхчувствительных растений после формирования локальных некрозов зависит от гена, контролирующего реакцию сверхчувствительности

Впервые показано, что у сверхчувствительных растений с геном N'

образование некрозов не тормозит транспорт ВТМ от клетки к клетке и локализация вируса происходит на уровне листа.

Впервые доказано, что для индукции в клетках гена N. определяющего сверхчувствительную реакцию растений табзка к ВТМ, необходима клёточнач С1 --нка Согласно н?чшм данном, состояние индукции гена N сохоаниет ся после сиру-ие\чя ингрс^а^ии клеток и реализуется в изопиоованных протопластах, находящихся в гипертонических условиях.

Впервые обнару>;2но, чго увеличение проницаемости клеточных мембран происходит но топько и не.фотизирующихся клетках, но и в кленках межнекрозного пространства зараженных листьев сверхчувствительных растении табака.

Впервые проведояа часг»ии.»я ичис^а, определены белковая природа и молекулярная масса (примерно 70 КД) "киллера протопластов", ответственного, как предполагали ранее ¡Ноо'юу, ЫсСапьу, 1830], за некротизацию инфицированных клеток сверхчувствительных растений табака. Показано, что он непосредственно действует ча клеточные мембраны.

Впервые доказано, что вещества, образующиеся в первично зараженных листьях сверхчувствительных растений и вызывающие развитие приобретенной устойчивости, являются не вирусными ингибиторами, а индукторами их образования.

Основные защищаемые положения:

1. Чувствительные, толерантные и сверхчувствительные растения табака одинаково устойчивы к проникновению ВТМ в листья в процессе механической инокуляции.

2. До появления локальных некрозов ВТМ размножается и транспортируется в листьях сверхчувствительных и чувствительных растений табака с равной скоростью.

3. У сверхчувствительных растений табака, зараженных ВТМ, а клеточной стенке активируется или образуется индуктор гена N. способный вызывать экспрессию гена и в изолированных клетках, находящихся в гипертонических условиях. Одним из результатов его экспрессии является накопление 'киллера протопластов" (кислою белка с молекулярной массой примерно 70 КД), который непосредственно разрушает клеточные мембраны.

4. Вещества, образующиеся в первично зараженных листьях сверхчувствительных растений табака и ответственные за развитие системной приобретенной устойчивости, являются индукторами образования

вирусных ингибиторов.

Практическая значимость. Настоящая работа направлена на развитие фундаментальных знаний о метаболизме растений, пораженных вирусами. Разработка биологических основ охраны растений от вирусов и создание высокопродуктивных и устойчивых сортов сельскохозяйственных растений невозможны без ясных представлений о защитных механизмах растений, различающихся по своей реакции на заражение вирусами. Полученные данные по накоплению и транспорту вируса в растениях, по регуляции в разных модельных системах гена N, контролирующего реакцию сверхчувствительности у растений табака, по деградации и инактивации вирусных частиц в апопласте, по накоплению вирусных ингибиторов могут быть использованы при разработке критериев вирусоустойчивости растений. Материалы работы нашли практическое применение в лабораторных занятиях и лекциях (Биолого-почвенный факультет Дальневосточного государственного университета).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном совещании социалистических стран по проблемам устойчивости растений (Галле, 1932), XV Международном тихоокеанском конгрессе (Новая Зеландия, 1983), VIII Всесоюзном совещании "Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними" (Вильнюс, 1984), VIII Съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), VIII Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Рига, 1986), VII Международном конгрессе по вирусологии (Эдмонтон, 1987), XVI Международном конгрессе по генетике (Торонто, 1988), и 3е" Международных симпозиумах по вирусам с +РНК (Вена, 1989, Флорида, 1992), 10 Конференции чехословацких вирусологов (Прага, 1989), Всесоюзном семинаре по приобретенной устойчивости (Ростов-на-Дону, 1989), Конференции, посвященной 100-летию со дня открытия вирусов Д.И. Ивановским (Ростов-на-Дону, 1992), I Мировом конгрессе по клеточной и молекулярной биологии (Париж, 1992), II и III съездах Всероссийского общества физиологов растений (Минск, 1992, С.-Петербург, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 357 страницах, состоит из введения, 6 глав, заключения с выводами. Первая глава представляет собой обзор литературы по теме работы. Вторая глава содержит описание материала и использованных методов. В третьей главе представлены результаты опытов по изучению устойчивое-

ти чувствительных и сверхчувствительных растений табака к проникновению ВТМ. В четвертой главе излагаются результаты исследований накопления и транспорта двух штаммов ВТМ (ОМ и 412) в растениях с чувствительной, толерантной и сверхчувствительной реакциями на заражение вирусом Пятая глава посвящена изучению некротизации инфицированных клеток, а шестая - приобретенной устойчивости сверхчувствительных-растений к повторному заражению вирусом. Экспериментальные данные представлены в 118 таблицах и 32 рисунках. Список цитируемой литературы включает 474 источника, из которых 363 на иностранных языках,

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Растения. Опыты проводили со сверхчувствительными к ВТМ растениями табака Nicotiana tabacum L. с геном N (сорта Ксанти нк, Сам-сун 27, Самсун 47/10) [Sela, 1981) или геном N' (сорт Самсун EN) [Meicners et а'., 1966], а также со сверхчувствительными растениями N.sylvestris Speg et Comes с геном N' [Valleau, 19521. Во многих опытах для сравнения применяли чувствительные растения N.tabacum L. сорта Самсун. Использовали 40-60-дневные растения с плэстохронным индексом Р1= 14-22. Пластохронный возраст растений и листьев определяли по методу Р. Эриксона и о. Мичдлини [Erickson, Minhelim, 1957].

Вирус. Исследования проводили со штаммом ОМ ВТМ JNozu. Окаса, 1968]. В отдельных экспериментах использовали штамм 412 БШ, вызывающий у растений сорта Самсун толерантную реакцию [Чуян, Стре-козова, 1985]. Очищенные препараты вируса получали методом дифференциального центрифугирования [Boedtker, Simmons, 1958], но первое осаждение проводили в солевой среде (0,43 % Na CI) в присутствии полиэтиленгликопя (мол. м. 6000, конечная концентрация 5%). Для работы использовали препараты вируса с отношением экстинкции в максимумах поглощения белка и РНК (Е2бо :Е2ег = 1,2-1,22) и вызывающими при заражении растений сорта Ксанти нк суспензией ОМ (концентрация 1 мкг/мл) не менее 100 некрозов на половину листа. Меченые препараты ВТМ получали по разработанной в нашей лаборатории методике (Журавлев и др., 1S766j. Удельная радиоактивность препаратов была равна 75-250 К5к/мг вируса. Для электронной микроскопии препараты вирусов контрастировали на подложках 2 %-ной фосфорновольфрамо-вой кислотой (pH 6,4) и исследовали в микроскопе ЭВМ-100 Л. В случае малого содержания вируса в пробе применяли метод иммунной

электронной микроскопии [Derrick, 1973]. Инфекционность проб определяли, считая число локальных некрозов на 15-20 листьях растений сорта Ксанти нк, инокулированных суспензиями ВТМ или гомогенатами проб в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,0. В некоторых опытах содержание антигена ВТМ в пробах определяли иммуноферментным методом (ELISE) [Clark, Adams, 1977].

Крахмальные и тепловые некрозы в инфицированных листьях растений сорта Самсун выявляли методами Ф. О. Холмса [Holmes, 1931 -цит. по Кирай и др., 1974] и Дж. А. Фостера и А. Ф. Росса [Foster, Ross, 1975]. Тепловые, крахмальные и локальные некрозы измеряли с помощью микроскопа МИ-1. Вирусные суспензии или растворы веществ вводили в листья с помощью медицинского шприца или вакуум-инфильтрацией. Межклеточную жидкость получали по методу 3. Клемента [Klement, 1965].

Мезофильные и эпидермальные протопласты изолировали из листьев, заражали ВТМ в присутствии поли-1-орнитина и инкубировали по методу Ю Н. Журавлева [1980]. Изолированные клетки получали по методу Р. Г. Дженсена с соавторами [Jensen et al., 1971] с некоторыми модификациями. Количество протопластов и клеток в пробах определяли с помощью счетной камеры Фукса-Розенталя. Число жизнеспособных протопластов и клеток оценивали после окрашивания их диаце-татом флуоресцеина [Larkin, 1976]. Содержание инфицированных протопластов в пробах определяли методом иммунофлуоресцентного окрашивания IQtsuki, Takebe, 1969].

Активность РНКазы определяли по скорости гидролиза дрожжевой РНК [Татарская и др., 1966] с некоторыми модификациями [Мусорок и др., 1976]. Активность протеиназ определяли по расщеплению гемоглобина методом Ансона [цит. по Алексеенко, 1968] в модификации, применяемой для растительных объектов {Романенко и др., 1984]. Феноль-ные соединения экстрагировали кипящим этиловым спиртом согласно методике А Н. Ксендзовой [1971]. Концентрацию белка в пробах определяли г.о ме топу В Шзфмера и С. Вейсмана [Schaffner, Weissmann, 1S73] n^OijHv^tuI'ilijü^ определяли по выходу элек-

тролитсп из äi-ckc."; листвен кондукюметрическим методом на кондуктометре типа OK -102/1 фирмы RadelKis (Венгрия) с электродом ОК-902. Неочищенный препарат "киллера протопластов" получали по методу Р. Гули и Д.Маккарти [Hooley, McCarthy, 1980] с некоторыми модификациями и использовали для пр/и'ошвл&лия инкубационной с;леси для культивирован.!,-,;' иаопи(.озанкых протопластов или подвергали

дальнейшей очистке диализом, высаливанием сульфатом аммония, гель-фильтрацией через сефадекс G-100, ионно-обменной хроматографией через колонки с CM-Trisacryl М или DEAE-Trisacry! М.

Во всех вариантах каждого опыта использовали по 5-10 растений. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические и стандартные ошибки (М ± м) по объединенным результатам 5-7 опытов. Некоторые опыты повторяли 10-15 раз. Достоверность различий между значениями вариантов оценивали по t-хритерию Стьюдента. Результаты некоторых опытов подвергали дисперсионному анализу [Пло-хинский, 1970].

3. УСТОЙЧИВОСТЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К МЕХАНИЧЕСКОМУ ЗАРАЖЕНИЮ ВТМ

Зависимость восприимчивости растений к механическому заражению вирусами от морфологического строения листьев описана в литературе довольно хорошо, но сейчас нет единого мнения о том, различаются ли по своей устойчивости к заражению родственные растения, сходные по своему строению, но отличающиеся по своей реакции на поражение вирусами.

Поэтому была дана количественная характеристика ранних событий инфекционного процесса у чувствительных и сверхчувствительных растений табака. С этой целью сравнили связывание вируса инскулюма листьями, выяснили, что происходит с вирусными частицами при связывании, определили число инфекционных центров, образующихся в результате заражения и проявляющихся в виде крахмальных и тепловых некрозов у чувствительных и локальных некрозов у сверхчувствительных растений, определили число зараженных эпидермапьных и мезофильных протопластов, изолированных из механически инокули-рованных листьев, изучили поглощение ВТМ in vitro протопластами, выделенными из листьев растений с разной реакцией на поражение.

Связывание вируса инокулюма листьями. В процессе механической инокуляции с листьями растений сортов Самсун и Ксанти нк связывалось одинаковое число вирусных частиц инокулюма. При повышении концентрации 14 С-ВТМ в инокулюме в 100 раз удельная радиоактивность листьев увеличивалась примерно в 50 раз, но количество прочно связанной метки не превышала 3 % от исходной радиоактивности инокулюма, что совпадает с литературными данными fYarwood, 1S52; Kurtz- Fritsch, Hirth, 1967; Show, 1972).

Инактивация ВТМ в межклеточном пространстве листьев чувствительных и сверхчувствительных растений табака. Связывание вируса йнокулюма на поверхности листьев и в межклеточном пространстве приводило к деградации вирусных частиц, обнаруживаемой с помощью электронной микросколии [Kassanis, Kenten, 1978; Gaard, de Zoeten, 1979; Щетинин, 1989]. Эта деградация может быть обусловлена или продуктивной депротеинизацией вирусной РНК, необходимой для инициации инфекционного процесса, как предположили Г.Гаард и Г. де Зу-тен [Gaard, de Zoeten. 1979! или инактивацией вируса, вызываемой действием защитных механизмов растения. Для выяснения этого вопроса были определены размеры и инфекционность частиц ОМ ВТМ, инъецированных в межклеточное пространство листьев растений табака сортов Самсун и Ксанти нк.

Сравнение длины вирусных частиц в пробах, замороженных через разное время после инъекции суспензии вируса в межклеточное пространство, с длиной частиц в исходном препарате показало следующее. Сразу после инъекции происходила кратковременная агрегация вири-онов: частицы соединялись конец в конец, образуя агрегаты разной длины (табл. 1). Одновременно снижалось содержание частиц модальной длины (270-330 нм) и длиной до 270 нм. При выдерживании инъецированных участков листьев во влажной камере в течение 48 ч содержание агрегированных частиц в пробах уменьшалось и увеличивалось число коротких частиц. Пробы из растений сортов Самсун и Ксанти нк не различались между собой по степени агрегации и деградации инъецированных частиц ВТМ.

Содержание вирусных частиц в пробах специально не определяли. Однако во всех опытах через 24 ч инкубации инъецированных участков листьев во влажной камере в поле зрения микроскопа при равных разведениях наблюдалось гораздо меньше частиц, чем сразу после инъекции, а через 48 ч в отдельных случаях вирусные частицы не обнаруживались совсем.Эти наблюдения указывают на то, что в межклетниках наряду с уменьшением размеров частиц имело место их полная деградация.

В специальных опытах было выяснено, что наблюдаемые изменения инъецированных частиц являются, в основном, результатом действия вещества межклеточного пространства, а не процесса гомогенизации высечек из листьев. Было установлено, что в межклеточном пространстве листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк присутствуют протеиназы с кислым оптимумом pH и потенциально одинаковой актив-

ностью. Инъекция суспензии ВТМ вызывала у растений табака обоих сортов увеличение активности протеиназ и РНКаз в межклеточной жидкости. Одной из причин агрегации и деградации вирусных частиц, попавших в межклеточное пространство листьев, может быть образование комплекса вирион-фермент в результате электростатического взаимодействия из-за разницы суммарных поверхностных зарядов. Образование таких комплексов может приводить к инактивации вируса [Тгетаюе, Адгама!, 1972; ЕЬага, Мтг, 1984] и препятствовать адсорбции вирионов на плазмалемме и проникновению их в цитоплазму [гиигау1еу е( а1., 1983; Танашкина, 19881-

Таблица 1

Распределение частиц ВТМ разной длины в гомогенатах листьев

Вариант Растения Время инкубации, ч Количество частиц. % к кон гролю

< 270 нм 270-330 нм > 330 нм

Исходный 100 100 100

препарат

ВТМ

ВТМ сме- Самсун 0 88 ± 10 92 ±8 121 ± 8

шивали с Ксанти нк 0 101 ± 6 71 ± 9 146 ± 14

гомогена-

том листьев

ВТМ инъе- Самсун 0 46 ± 6 36 ± 4 325 ± 21

цировали в 24 159 ± 14 42 ±7 124 ± 18

листья 48 173 ± 13 5в ± 8 106 ± 15

Ксанти нк 0 62 ± 5 4615 286 ± 12

24 156 ± 12 52 ±7 112 ± 10

48 166 ±3 47 ±6 96 ± 4

Деградация вирусных частиц в межклеточном пространстве листьев связана не с продуктивной депротеинизацией вирусной РНК, необходимой для инициации инфекционного процесса, а с инактивацией вирионов, так как инъецированные вирионы теряли свою инфекцион-ность. Одновременно изменялся их спектр поглощения. Инъекция суспензий ВТМ в межклеточное пространство не приводила к заражению растений: не было обнаружено симптомов заболевания и накопления ВТМ ни в инъецированных, ни в остальных листьях растений.

Инактивацию можно представить как двухступенчатый процесс: 1)

кратковременная агрегация; 2) деградация вирусных частиц и утрата инфекционности. Оба процесса происходят в результате действия вещества клеточных стенок и межклетников. Совокупность этих процессов представляет собой механизм первичной защиты растения от проникновения патогена. Была выявлена примерно равная способность растений сортов Самсун и Ксанти нк к инактивации ВТМ в межклетниках. Это свидетельствует о том, что чувствительные и сверхчувствительные растения табака располагают одинаковым по эффективности механизмом первичной защиты.

Образование инфекционных центров в механически инокулирован-ных листьях. После механической инокуляции в одинаковых условиях штаммами ОМ или 412 у растений всех использованных сортов, независимо от их реакции на вирусную инфекцию (чувствительную, толерантную или сверхчувствительную), образовывалось равное число инфекционных центров (табл. 2).

Таблица 2

Число некрозов на 100 см2 поверхности листьев растений табака, механически инокулированных штаммами ОМ и 412 , усл. ед.

■ Растения Тип некрозов Концентрация ВТМ в инокулюме, мкг/мл

0,1 1,0 10,0

Самсун Крахмальные Не опред. Не опред. 2,42 + 0,05

Не опред. Не опред. 2,34 ± 0,06

Тепловые 1,57 ±0,06 2,34 ± 0,05 2,60 + 0,09

1,47 ±0,06 2,35 ± 0,04 2,73 + 0,06

Ксанти нк Локальные 1,74 ±0,09 2,36 ± 0,09 2,50 + 0,04

1,79 ±0,08 2,42 ± 0,09 2,45 + 0,03

Самсун 47/10 1,38 ±0,08 2,27 ± 0,06 2,56 + 0,05

1,14 ± 0,06 2,15 ±0,08 2,54 ± 0,08

Самсун 27 1.44 ± 0.09 2,30 ± 0,04 2,64 + 0,07

1,38 ± 0,04 2,34 ± 0,06 2,52 + 0.06

Самсун ЕМ 1.64 ± 0.06 2,40 ± 0,05 2,62 + 0,05

1,47 ±0,03 2,32 ± 0,07 2,54 + 0,08

N. зу^еБЫй 1,52 ±0,05 2,19 ±0.09 2,54 + 0,05

1,48 ±0,05 2,08 ± 0,05 2,60 + 0,05

Примечание. В числителе представлены некрозы, образовавшиеся после заражения штаммом ОМ, в знаменателе - штаммом 412.

Определение числа зараженных клеток в механически инокулиро-

ванных листьях показало, что при равных условиях заражения у чувствительных и сверхчувствительных растений заражается одинаковое число клеток (табл. 3).

Таблица 3

Содержание зараженных протопластов в эпидермисе и мезофилле листьев растений табака сортов Самсун и Ксанти нк, мацерированных через разное время после механической инокуляции листьев ОМ ВТМ _(100 мкг/мл), % от общего числа протопластов в пробе_

Сорт

Время от момента инокуляции до мацерации листьев, ч

0

6

24

30

48

54

Самсун Ксанти нк

29 + 5 22 ±5

39 + 6 28 ±7

Эпидермис 50 ±4 41 ±6

52 ± 7 42 ±7

54 ± 6 43 ±7

Мезофилл (заражали верхнюю поверхность листа)

Самсун Ксанти нк

6± 1 9 ± 3

14 ± 3 20 ±5

20 ±5 31 ±4

29 + 4 38 ±4

34 ± 1 44 ±5

Мезофилл (заражали нижнюю поверхность листа)

57 ± 5 46 ±4

42 ±4 33 + 5

Самсун 9 ± 3 12 ±2 17 ±4 25 ±4 36 ±5 44 ± 5

Ксанти нк 7 ±3 15 ± 4 25 ±5 36 ±5 47 ±4 29 ±4

В процессе механической инокуляции заражались не только клетки эпидермиса, но и мезофилла. Сейчас нет единого мнения о том, может ли вирус инокулюма попадать непосредственно в мезофилл при механическом заражении листьев или необходимо время для накопления вируса в эпидермисе и транспорта его в мезофильные клетки. Согласно многочисленным литературным данным требуется 2-10 ч после инокуляции листьев для проникновения вирусов в мезофилл и образования некрозов в обнаженном мезофилле. Этого времени недостаточно для того, чтобы в мезофилл транспортировался вирус, размножившийся в эпидермисе. Даже в опытах с изолированными протопластами, инфицированными в условиях in vitro, когда эффективность заражения значительно выше, чем в опытах с листьями, прирост инфекционности отмечался примерно через 6 ч после инокуляции. Вероятно, загрязнение мезофилла при удалении эпидермиса не является основной причиной появления вирусных частиц в мезофилле. В своих опытах мы не обмывали листья после заражения, чтобы исключить возможность адсорбции вирусных частиц неинокулированным верхним эпидермисом. Кроме того, инокуляция верхнего или нижнего (удаляемого при выде-

лении протопластов) эпидермиса не влияла на содержание больных мезофильных протопластов в "нулевых" пробах (табл. 3) и листья ма-церировали при +5сС, чтобы избежать вторичного инфицирования протопластов при изолировании Следовательно, можно с уверенностью предположить, что вирус инокулюма способен проникать в мезофилл в процессе механической инокуляции листьев.

Связывание 14С-ВТМ изолированными протопластами. Изучение влияния различных условий инокуляции (длительность заражения, рН инокуляционной среды, содержание вируса и протопластов в инокуля-ционной смеси) показало, что протопласты сортов Самсун и Ксанти нк в условиях in vitro одинаково связывали 14С-ОМ ВТМ.

Таким образом, независимо от своей реакции (чувствительной, толерантной. сверхчувствительной) на поражение вирусом родственные растения, похожие по своему строению, одинаково устойчивы к проникновению вируса в растение.

4. НАКОПЛЕНИЕ И ТРАНСПОРТ ВТМ В РАСТЕНИЯХ С РАЗНОЙ РЕАКЦИЕЙ НА ВИРУСНОЕ ПОРАЖЕНИЕ

Об устойчивости растений к вирусу можно судить по накоплению

этого вируса в клетках растения и транспорту инфекционного материа-

ла в растении. К началу наших исследований было общепринято, что в листьях сверхчувствительных растений вирусы накапливаются в мень-

ших количествах, чем в листьях чувствительных растений. Однако

опыты с изолированными протопластами показали равные потенциальные возможности клеток чувствительного и сверхчувствительного рас-

тений-хозяев к репродукции вирусов [Oísuki et al., 1972]. было проведено сравнительное изучение накопления штаммов ОМ и 412 ВТМ и транспорта вируса в механически инокулированных чувствительных и

сверхчувствительных растениях табака.

Накопление штамма ОМ ВТМ в разных модельных системах. В предварительной серии опытов на примере штамма ОМ ВТМ было проверено, как накапливается вирус у чувствительных и сверхчувствительных растений в зависимости от использованной модельной системы (интактные листья, диски из листьев, изолированные протопласты, зараженные в условиях in vitro или in vivo).

В интактных листьях и дисках из листьев прирост инфекционности регистрировали через 12 ч после заражения. При 25°С в этих двух модельных системах вирус размножался медленнее, чем при 32°С, и

через 72-96 ч после заражения инфекционнссть проб достигала максимума и затем значительно не менялась. У растений сорта Ксанти н;< при 25°С видимые некрозы появлялись через 36-48 ч после инокуляции. До образования некрозов накопление инфекционное™ шло с одинаковой скоростью в листьях чувствительных и сверхчувствительных растений. После появления некрозов накопление ВТМ в листьях растений Ксанти нк начинало отставать и через 96 ч после заражения различия в инфекционности проб из листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк становились достоверными при степени вероятности Р=0,95. В опытах с дисками не было выявлено различий в накоплении ВТМ между чувствительными и сверхчувствительными растениями Возможно, это обусловлено тем, что диски находились в условиях высокой влажности, что вызывает торможение процесса локализации вируса [Селецкая, Журавлев, 1976; Коваленко, 1988]. При 32°С в этих двух модельных системах инфекционнссть проб увеличивалась в течение всего времени опыта с одинаковой скоростью у чувствительных и сверхчувствительных растений.

Накопление инфекционности в протопластах, изолированных из листьев здоровых растений табака сортов Самсун и Ксанти нк и зараженных после выделения, происходило быстрее, чем в других модельных системах. Продолжительность лаг-фазы составляла 6 ч и инфек-ционность достигала максимума через 24 ч после инокуляции. Повышение температуры инкубации существенно не влияло на длительность лаг-фазы и скорость накопления вируса в протопластах. Накопление ВТМ в протопластах обоих сортов шло с равной скоростью.

Если протопласты выделяли из инокулированных листьев в течение первых 30 ч после заражения листьев, то инфекционность протопластов Ксанти нк не отличалась от инфекционности протопластов сорта Самсун, но была ниже, если протопласты изолировали позже 30 ч. В ходе инкубации изолированных протопластов их инфекциоиноегь повышалась, но увеличивались и различия в инфекционности между протопластами обоих сортов. Различия обусловлены снижением содержания протопластов Ксанти нк в пробах в результате их гибели, как будет показано ниже. Если по данным этих опытов рассчитать инфекцион-ность проб на равное число жизнеспособных протопластов, то она будет одинакова у протопластов обоих сортов.

Таким образом, различия между чувствительными и сверхчувствительными растениями табака в накоплении инфекционного ВТМ проявлялись в двух модельных системах: листьях и протопластах, изолиро1

ванных из зараженных листьев этих растений. Различия проявлялись после формирования видимых локальных некрозов и выражались в замедлении накопления инфекционности в пробах из сверхчувствительных растений. При повышенной температуре, когда было подавлено образование некрозов, в листьях растений обоих сортов размножение инфекционного ВТМ происходило с одинаковой скоростью.

Накопление штаммов ОМ и 412 в листьях растений всех использованных сортов, инкубированных при 25°С, было одинаковым в течение первых двух суток после заражения. Затем скорость размножения инфекционного материала в листьях сверхчувствительных растений с геном N снизилась по сравнению с чувствительными и сверхчувствительными растениями с геном N', которые существенно не различались между собой по инфекционности проб в течение всего времени опыта (10 сут). При 32° С уровень накопления обоих штаммов был немного выше, чем при 25° С . Во всех опытах при обоих температурах у растений всех исследованных сортов штамм 412 накапливался несколько хуже, чем штамм ОМ (рис. 1).

Накопление штаммов ОМ и 412 в изолированных протопластах. Протопласты, выделенные из листьев растений всех использованных сортов и зараженные одним штаммом (ОМ или 412), существенно не отличались по своей инфекционности. Однако штамм ОМ размножался в протопластах значительно лучше, чем штамм 412 (табл. 4).

Накопление ингибиторов вирусной репликации в листьях и изолированных протопластах. В протопластах, полученных из листьев сверхчувствительных растений табака сорта Са?лсун NN и зараженных ВТМ, продуцировался ингибитор вирусной репликации (ИВР). Он подавлял накопление ВТМ в протопластах и листьях чувствительных и сверхчувствительных растений. Протопласты сорта Самсун и незараженные протопласты сорта Самсун NN не продуцировали ИВР [Loebenstein, Gera,1981; Gera, Loebenstein, 19831.

В наших опытах в процессе культивирования здоровые и зараженные в условиях in vitro протопласты сортов Самсун и Ксанти нк выделяли в среду смесь различных веществ. Изучение спектров поглощения инкубационных сред показало, что эти вещества поглощают в интервале от 220 до 320 нм. Не обнаружено существенных различий в характеристиках спектров поглощения выделенных веществ между здоровыми и зараженными протопластами сортов Самсун и Ксанти нк. Эти вещества угнетали накопление ВТМ в протопластах обоих сортов. В отличие от протопластов сорта Самсун образование этих веществ в

протопластах сорта Ксанти нк увеличивалось после инокуляции ivt ВТМ.

Время после заражения листьев, сут

Рис. 1. Накопление инфекционности в листьях растений табака, зараженных штаммами ОМ (А) и 412 (Б). I, II - растения инкубировали при 25 и 32° С, соответственно; 1 - Самсун, 2 - N. sylvestris, 3 - Самсун EN, 4 - Самсун 47/10, 5 - Ксанти нк. 6 -Самсун 27; растения заражали суспензиями вирусов (концентрация 1 мкг/мп).

Аналогичный ИВР ингибитор был выделен из межклеточной жидкости листьев здоровых растений амфидиплоидного гибрида N. glutinosa х N. debney Domin. [Loe'oenstein et al., 1990]. В наших опытах было обил-

ружено, что вещества, подавляющие накопление ВТМ в изолированных протопластах сортов Самсун и Ксанти нк, вымываются из клеточных стенок и межклеточного пространства листьев здоровых растений обоих сортов. Заражение этих растений ВТМ вызывало увеличение ингибиторной активности межклеточной жидкости. Помимо ингибиторов вирусного размножения из некротизированных листьев Ксанти нк еще вымывались вещептва(вп), одинаково токсичные для изолированных протопластов обоих сортов. Если зараженные растения Ксанти нк до инфильтрации выдерживали при температуре 32°С, при которой локальные некрозы не образуются и растения становятся "чувствительными" рокиБсй, 1966], то межклеточная жидкость из листьев этих растений не влияла на состояние протопластов.

Таблица 4

Инфекционность протопластов, инокулированных штаммами ОМ и 412 ВТМ, условные единицы

Сорт Время после инокуляции протопластов, ч

растения 0 24 48

Самсун 1,18 ±0.08 2.78 ± 0,06 2.90 ± 0,09

1,08 ±0,08 1,56 ±0,07 1,84 ±0,08

Ксанти нк 1,23 ±0,05 2,66 ± 0,06 2,60 ± 0,08

1,14 ±0,06 1,50 ±0,08 1,63 ±0,04

Самсун 47/10 1.19 ± 0.06 2,80 ± 0.06 2.84 ± 0.06

1,18 ± 0,05 1,23 ± 0,08 1,29 ± 0,06

Самсун 27 1,15 ± 0,06 2.89 ± 0.06 2,84 ± 0,07

1,18 ± 0,06 1,24 ± 0,05 1,27 ± 0,06

М.БуЬ/еэМз 1,20 ± 0,06 2,75 ± 0.08 3.01 ± 0,06

1,12 ±0,07 1,22 ±0,06 1,24 ±0,05

Самсун Е№ 1,25 + 0,04 2.29 ± 0.06 2,77 ± 0,06

1,14 ±0,06 1,19 ±0,05 2,25 ± 0,05

Примечание. В числителе представлены данные по инфекционное™ протопластов, инокулированных штаммом ОМ, в знаменателе - штаммом 412.

Транспорт ВТМ в инокулированных листьях. До начала наших исследований в литературе имелись неоднозначные данные о распространении вирусов в зараженных листьях чувствительных и сверхчувст-

- I'J

вительных растений. Поэтому было проведено сравнительное изучение транспорта штаммов ОМ и 412 в инокулированных листьях растений табака: определяли инфекционность обнаженного мезофилла после удаления инокулированного эпидермиса, измеряли локальные и тепловые, некрозы, подсчитывали число зараженных эпидермальных и мезофильных протопластов, изолированных через разное время после механического заражения листьев.

Сразу после заражения обнаруживалось достаточное для определения методом локальных некрозов количество инфекционного материала в эпидермисе и мезофилле. Инфекционный материал в мезофилле обладал высокой устойчивостью к растительным нукпеазам. Поэтому можно предположить, что в мезофилл попали целые вирусные частицы, а не лишенная белковой оболочки вирусная РНК, чувствительная к РНКазам. Накопление инфекционного ВТМ в эпидермисе и мезофилле листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк имело одинаковый характер.

Сравнение размеров некрозов, индуцируемых штаммами ОМ и 412 у растений табака, показало, что у растений, обладающих геном N (сорта Самсун 47/10, Самсун 27, Ксанти нк), рост некрозов при 25°С прекращался через 10 сут после заражения. У растений с геном N' (N. sylvestris, Самсун EN) при 25°С некрозы увеличивались в течение всего времени опыта (15 сут) и не отличались по своим размерам от тепловых некрозов, образующихся в листьях растений сорта Самсун. Скорость транспорта ВТМ в инокулированных листьях увеличивалась, если растения после заражения инкубировали при 32°С. Независимо от температуры инкубации тепловые и локальные некрозы, развивавшиеся у растений всех исследуемых сортов после заражения штаммом 412, были достоверно меньше некрозов, индуцированных штаммом ОМ. Вероятно, более низкая по сравнению со штаммом ОМ скорость "ближнего" транспорта штамма 412 связана с его слабой способностью к размножению. Однако время выхода инфекционного материала из первично зараженных листьев растений сорта Самсун и скорость распространения по растению у обоих штаммов были примерно одинаковыми.

Общепринято, что распространение вируса в инокулированных листьях сверхчувствительных растений блокируется в результате образования локальных некрозов. Наши данные свидетельствуют о том, что степень угнетения "ближнего" транспорта вируса зависит от гена, контролирующего реакцию сверхчувствительности. У растений с геном N

достоверное торможение транспорта штаммов ОМ и 412 было обнаружено после формирования видимых некрозов (3-4 сут после заражения). У растений с геном N' образование некрозов не влияло на скорость транспорта ВТМ в течение 15 сут после заражения. В более поздние сроки измерений некрозов не проводили, однако инфекционный вирус никогда не выявлялся в неинокулированных листьях растений с геном М', что указывает на локализацию вируса в зараженных листьях.

В опытах по определению количества зараженных протопластов, изолированных из инокулированных штаммом ОМ (концентрация ино-кулюма 100 мкг/мл) листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк, было установлено, что в процессе механической инокуляции заражается до 30 % эпидермальных протопластов. При выдерживании растений в условиях, благоприятных для размножения и транспорта ВТМ, количество эпидермальных протопластов, содержащих вирусный антиген увеличивалось и через 54 ч составляло примерно 50 % от общего числа эпидермальных протопластов.

У растений обоих сортов сразу после механической инокуляции около 8% мезофильных протопластов содержали антиген ВТМ. Затем содержание инфицированных мезофильных протопластов увеличивалось и через 54 ч после инокуляции листьев достигало у растений сорта Самсун примерно 50% от общего числа мезофильных протопластов. У растений сорта Ксанти нк содержание инфицированных мезофильных протопластов сначала также возрастало и достигало максимума (примерно 44%) в пробе, взятой через 48 ч после заражения листьев. Затем оно снижалось и через 54 ч составляло около 30% от общего числа протопластов в пробе. Как будет показано ниже, это снижение вызвано функционированием в изолированных протопластах гена N. В течение всего времени опыта (54 ч) не выявлено достоверных различий между растениями сортов Самсун и Ксанти нк в содержании зараженных эпидермальных и мезофильных протопластов. Распространение вирусного антигена в мезофилле не зависело от того, какой эпидермис (верхний или нижний) инокулировали ВТМ (табл. 3).

Таким образом, результаты наших опытов по определению инфек-ционности эпидермиса и мезофилла, размеров тепловых и локальных некрозов, содержанию инфицированных эпидермальных и мезофильных протопластов свидетельствуют об одинаковой скорости "ближнего" транспорта вирусного инфекционного материала в листьях чувствительных и сверхчувствительных растений табака в первые сутки после заражения.

5. ОБРАЗОВАНИЕ ЛОКАЛЬНЫХ НЕКРОЗОВ У СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА

Образование локальных некрозов является характерной реакцией сверхчувствительных растений в ответ на заражение вирусом. В результате гибели инфицированных клеток и накопления антивирусных веществ в некротизированных клетках и клетках, окружающих некрозы, происходят локализация и элиминация патогена, что приводит к выздоровлению растений. Поэтому понятен интерес исследователей к не-кротизации клеток при сверхчувствительной реакции. Опубликовано много работ, но механизмы, приводящие к гибели клеток, пока до конца не известны.

Влияние вирусного и растительного геномов и температуры внешней среды на развитие симптомов заболевания. В наших опытах у растений сортов Ксанти нк, Самсун 47/10, Самсун 27, Самсун EN и N. sylvestris после заражения штаммом 412 образовывались локальные некрозы при температуре до 34°С. При 35° С у всех растений развивалась системная реакция. Штамм ОМ вызывал образование некрозов у растений сорта Самсун 27, Самсун EN и N.sylvesiris при температуре до 35°С, а при этой температуре сверхчувствительная реакция менялась на чувствительную. У растений сортов Ксанти нк и Самсун 47/10, зараженных штаммом ОМ, локальные некрозы не образовывались при температуре свыше 28°С.

В отличие от штамма ОМ штамм 412 не вызывал у растений сорта Самсун видимых симптомов заболевания при 25°С. При 32°С у этих растений через 10 сут после заражения штаммом 412 на верхних листьях развивались симптомы (мозаика листьев), похожие на симптомы, вызываемые штаммом ОМ.

Полученные результаты подтвердили литературные данные IJokusch, 1966; Коваленко, 1983] о том, что сверхчувствительная и толерантная реакции растений на вирусную инфекцию зависят от температуры окружающей среды и комбинации вирус-растение.

Влияние интеграции тканей и клеток растений на образование локальных некрозов. В пробах, взятых в интервале 0-5 ч от заражения штаммом ОМ листьев растений сорта Ксанти нк до удаления эпидермиса, в мезофилле обнаруживалась инфекционность, но некрозы в изолированном эпидермисе и обнаженном мезофилле не развивались. При удалении эпидермиса через 5-6 ч после инокуляции в мезофилле формировались некрозы. Если заражение листьев проводили без кар-

борунда, тс время контакта инокул/рованного эпидермиса с мезофиллом, необходимое для появлении некрозов в обнаженном мезофилле, увеличивалось на 2-4 ч. Некрозы не развивались в эпидермисе, изолированном в интервале 0-30 ч посла заражения.

Эти результаты подтвердили литературные данные о том, что эпидермис необходим для образования локальных некрозов, но в самом изолированном опидермиа: некрозы не образуются lEhara, Misawa, 1968. 1969; Kasamo, S'nfmornura, 1977; SlVimomura, 1977; Courts, 1980; HoEOXc'vva о! э!., 1989].

Гипертонические растворы маннита и других осмотически активных веществ вызывали плазмолиз клеток, нарушающий межклеточное взаимодействие, подавляли образование некрозов и снижали содержание вируса в плазмолизированных листьях [Kaipagarn et а!., 1977; Coutts, 1978; Gulyas, Farkas, 1978] Однако из результатов этих работ не ясно, чем вызвано это снижение. Поэтому было проверено влияние плазмо-лиж.чоз (Д мзннит, сахароза, этиленгликоль) на накопление и транспорт штамма ОМ и образование некрозов в листьях растений сорта Ксанти нк.

Результаты наших экспериментов подтЕ<ердили литературные данные об угнетении гипертоническими растворами плазмолитиков накопления ВТМ и образования ло.йльных некрозов. Кроме того, было установлено. что низкое содержание ВТМ в листьях, обработанных плаз-молитиками, обуслоапено следуюшими причинами. Во-первых, растворы плазмолитиков ингибировали размножение ВТМ и степень угнетения была пропорциональна концентрации вещества в растворе и времени его иоздейстуил на клетки. Во-вторых, растворы плазмолитиков тормозили транспорт ВТМ по листу. По-видимому, плазмолиз клеток не является единственной причиной торможения транспорта ВТМ, так как такой же эффект вызывали гипо- и изотонические концентрации манни-та В-третьих, низкая по сравнению с контролем иьфекционность дисков, содержавшихся на растворах плазмолитиков, может быть обусловлена инактивацией ВТМ. Гак, гипертонический раствор мамнита снижал инфекционность дисчов из листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк, инкубированных после заражения на воде и перенесенных затем на раствор маннита. Как показали результаты электронной микроскопии гомогенатов зараженных дисков снижение инфекционности проб обусловлено деградацией вирусных частиц под влиянием маннита.

Было высказано предположение [Otsuki et al., 1972], что для индукции гена N необходим контакт зараженных кпеток с соседними здоро-

выми клетками тканей лкстл, тгк к а,: поотоиласты, зёраякшии? посте выделения, сохраняли свою жизнеспособность. Этп прсдпо»-ся;о»П1'5 косвенно подтверждается результатами опытов по изуче^иы влияния эпидермиса и плазмолитикш на развитие локальных |<еьрозог. Ьыго проверено, необходима ли интеграция клеток и тканей только дли и:: дукиии гена N или сна нужна также и для дальнейшей его реалилации включая некротизацию пораженных клеток.

Ёсли протопласты изолировали ич листьев здорскых рнслег'ии сортов Самсун и Ксанти нк и з.чражяли их после выделения, то содержание инфицированных протопластов всегда составляло не менее 80 % ог общего числа протопластов а пробах В процессе инхубг::п'и протопласты обоих сортов не различались по содержанию нежизнеспособных протопластов в пробах и по своей инфекционносги (табл. 5).

1?бпицэ5

Содержание нежизнеспособных протопласте» к инф-л цвснноси. проб нроюпласточ. инкубированных на ргюных сруца/. после заражения ОМ ВТ'Л

Время после Содержание нежизнеспо- Иифеп.ч и; наесть

заражении собных протолнастоэ. Г,¿V .Ti.it :~гл с: г-,

лооюллзстоз. % к контролю \'Сио ал::! .и ль:

ч Самстн. Ксгнти ик Самсун К.'.'.лнти 1-::

0 Ж±4 105 ± 3 109 ± 5 100 ±. 6 1,2£ 0.03 1,2У 0 08

24 104 ±6 94 ± е 103 ± С 102 ± 5 1,06 ± 0.0*; 1,12 ± 0,09

48 07 + 5 107 ± 4 108 ± б 110 ± Л 2.0! ± 0,10 1,86 ± 0,03

72 106 » 4 ил 1 ;; 98 -'■ Г) к;б 1 <; 19-; <- 1').м5 ■ 0,06

Примечания В качестве контроля наюпьзоэа/м шктог.1,асш обработанные инскуляционпсй смесь», по содержа: и ;гй ИТ г/., н мглитслс представлены пробы, инкубированные з жидчой сред я. с знладеилге.-п» в агаризоаанний среде. Инфекционное ¡ь определяли у проб, инкубированных в жидкой среде. Содержание нздизнеспособ! прогоппг-оссз в контрольных прсбэх из листьев растений сорта Семен оыпо р.эйнт 15±4 % от общего числа протопластов п пробе, Ксанти мг - то?.(>

Если протопласты изолировали из инокулировпннь*- листьев, то в

пробах из растений сорта Самсун содержание нежизнеспособных протопластов было стабильным в течение опыта и не отличалось от контроля (проба из листьев здоровых растений). Независимо от консистенции питательной среды для культивирования протопластов, в пробах из зараженных листьев растений Ксанти нк, инкубированных до выделения протопластов при 25°С, содержание нежизнеспособных протопластов было выше, чем в контроле. Различия между опытными и контрольными пробами возрастали с увеличением времени от момента заражения листьев до их мацерации и в процессе культивирования протопластов в питательной среде. Если растения Ксанти нк инкубировали до выделения протопластов при 32°С, то содержание нежизнеспособных протопластов в пробах из здоровых и больных растений было одинаковым (табл. 6).

Таким образом, полученные результаты указывают, во-первых, на то, что ген N индуцируется в протопластах только тогда, когда они интегрированы в составе листа как клетки, во-вторых, на то, что состояние индукции сохраняется при нарушении интеграции и, в-третьих, не-кротизация протопластов, содержащих ген N в индуцированном состоянии, может происходить в гипертонической среде.

При определении содержания нежизнеспособных клеток в пробах из растений сорта Ксанти нк, инкубированных до мацерации листьев при 25°С, были получены те же результаты, что и в опытах с изолированными протопластами. Если растения выдерживали после заражения при 32°С, то наблюдали повышение rio сравнению с контролем (клетки из листьев здоровых растений, инкубированных при 32°С) содержания нежизнеспособных клеток в пробах из больных растений с увеличением времени, прошедшего с момента заражения листьев до их мацерации, и в процессе инкубации изолированных клеток на питательной среде при 25°С. Эти данные свидетельствуют о том, что ген N индуцировался в клетках после нарушения их интеграции. Содержание нежизнеспособных клеток в пробах из растений сорта Самсун было одинаковым в опыте и в контроле и не зависело от температуры инкубации растений (табл. 7).

Вероятно, в некротизации клеток, изолированных из растений сорта Ксанти нк, прединкубированных при 32°С, большую роль играет клеточная стенка. Возможно, в ней локализованы индукторы гена N, способные вызывать экспрессию гена и в изолированных клетках, находящихся в гипертонических условиях. Это предположение подтверждается опытами с актиномицином Д - ингибитором ДНКзависимого синте-

за РНК. Добавление актиномицина Д (10 мкг/мл) в инкубационную среду незначительно снижало содержание нежизнеспособных протопластов и клеток, изолированных из растений Ксанти нк, содержавшихся после заражения при 25°С, но полностью ингибировзло гибель клеток, выделенных из растений Ксанти нк, инкубированных при 32"С.

Таблица 6

Содержание нежизнеспособных протопластов в пробах, изолированных из инокулированных листьев растений сортов _Самсун и Ксанти нк, % к контролю_

Температура Время от иноку- Время инкубации протопластов, ч

инкубации ляции листьев

растений, "С до мацерации, ч 0 | 24 | 43 72

Протопласты инкубировали в жидкой среде

24 100 ± 3 106+4 99 ± 4 10314

25 109 ±4 12816 177 ± 5 18016

48 105 ± 4 111 ±4 100 + 5 101 13

133 ±4 139 ±5 244 ± 6 261 14

24 89 ±5 96 ±4 102 ±5 115 + 4

32 112 ± 4 97 ±5 98 ±3 107 + 4

48 103 + 4 117 ± 5 11315 105 + 4

89 ±4 100 ± 4 94 16 104 + 4

Протопласты инкубировали в агаризованной среде

24 104 1 6 96 + 6 106 + 7 106 ± 6

25 116 1 4 141 1 5 185 + 6 170 14

48 94 +С 10217 106 1 4 105 ± 4

166 + 6 21316 261 1 4 25415

24 11016 10313 1031 5 10614

32 10014 96 + 6 107 1 6 101 +6

48 98 + 5 100 + 6 109 1 5 11214

112 + 4 95 1 6 104+6 10316

Примечание. В качестве контроля использовали протопласты, изолированные из листьев здоровых растений. В числителе представлены данные по содержанию нежизнеспособных протопластов в пробах из листьев растений сорта Самсун, в знаменателе - Ксанти нк. Содержание нежизнеспособных протопластов в контрольных пробах из листьев растений сорта Самсун было равно 20±6 % от общего числа протопластов в пробе, Ксанти нк - 21 ±5 %.

2й

Таблица 7

Содержание нежизнеспособных клеток в пробах, изолированных из инокулированных листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк, _% к контролю _ _

Температура Время от иноку- Время инкубации клеток, ч

инкубации ляции листьев

растений, °С до мацерации,ч ' 0 24 48 72

Клетки инкубировали в жидкой среде

24 100+8 92 ± 6 113 ± В 104+6

25 121 ±5 128 ±8 198 ±6 180 ±7

48 114 ±7 112 ± 8 109 ± 6 114 ±6

133 ±6 189 ±6 243 ±8 285 + 9

24 94 ± 6 102 ± 4 101 ± 5 96 ±4

32 99 + 4 108 ± 6 12216 132 ± 6

48 95+5 98+ б 98 ± 5 102 ±6

104 ± 6 138 ± 8 156 ±6 153 ± 5

Клетки инкубировали в агаризованной среде

24 101 ± 5 88 + 7 111+9 107 ± 8

25 133 ± 6 187 ± 8 214 1 6 201 ± 5

48 109 ± 4 97 ± 7 89+8 85 ± 7

129 +. 6 235 ± 8 303 + 7 334 т. 9

' 24 104 ± 4 97 + 6 100 ± 8 99 + 6

32 9316 114 ± 6 125 ± 6 139 ±6

48 96 ± 6 92 + 4 102 ± 6 89 ± 7

108 ±5 144 ±8 178 ± 5 190 ±6

Примечание. Обозначения те же, что в табл. 6. Содержание нежизнеспособных клеток в контрольных пробах сразу после изолирования из листьев растений сорта Самсун было равно 26±8 % от общего числа клеток в пробе, Ксанти нк - 24+6 %.

Таком образом, полученные данные свидетельствуют о том, что интеграция клеток не является обязательным условием для индукции гена N при вирусном поражении, так как он может быть активирован и в изолированных клетках.

Влияние 8ТМ на проницаемость клеточных мембран у чувствительных и сверхчувствительных растений табака Предполагается, что нзкротнзация инфицированных клеток сверхчувствительных растений происходит в результате выхода фенолов из центральной вакуоли и гидролитических ферментов из лизосом вследствие нарушения целое-

тности клеточных мембран и увеличения их проницаемости [Метлицкий и др., 1984]. Проведенные нами исследования подтвердили литературные данные (Брегетова, Шемагонова, 1971; Kato, Misawa, 1976; Ohashi, Shimomura, 1976; Wp.ststeijn, 1978; Pennazio et al., 19 79] о гом, что повышение проницаемости клеточных р/ембрак является одним из самых ранних проявлений реакции сверхчувствительности. Кроме; mi о, (Зилэ гоказано увеличение проницаемости и у здоровых клеточ, окружающих некрозы.

Изучение "кил по п а протопластов' из л и с \ ье; ^; i.'iCTC н и^таЬ а ка со Ксанти нк поражённых ВГМ Возможно. нзэушгник '!йп~гт.<-'>оги ,-пч-точных мембран и увеличение их проницаемое и ибуслоилены действием "киллера протопластов", обнаруженною в некротизированкых листьях сверхчувствительных растении тзбака, лорзжг-нных ВТМ или бактериями (Hooley, McCarthy, 1980; Klement et at., 1983]. В этих работах было показано, что водные экстракты некротизированных листьев токсичны для изолированных протопластов.

В наших опытах токсичность экстрактов некроти.чированных листьев растений сорта Ксанти нк также повышалась с увеличением числа некрозов, образующихся в листьях, и времени, прошедшего с момента заражения растений. Кроме того, было обнаружено, что "киллер протопластов" может находиться и в апоппасте, так как межклеточная жидкость, выделенная из некротизированных листьев, инфильтрированных водой, была токсичной для протопластов.

На основании наших данных по гель-фильтрации и ионно-обменной хроматографии экстрактов некротизированных листьев растений Ксанти нк (рис. 2, 3) можно сделать вывод о том, что "киллер протопластов" является кислым бзпком с молекулярной массой примерно 70 КД. Он осаждался сульфатом аммония при 60-100 %-ном насыщении, его токсичность снижалась ь результате обработки фипомом и бопкоьзм фракция некротизированных листьев была значительно более токсична. чем фенольная фракция.

Накопление "киллера протопластов" янляв'ся ответной реакцией растений Ксанти нк на заражение ВТМ, так как экстракты листьев, некротизированных в результате химического JHooley, McCarthy, 1980] или, как в наших опытах, механического повреждения, не влияли на состояние протопластов. Механизмы образования и действия "киллера протопластов" пока не известны. Несмотря на высокую пероксидазную активность во фракции "киллера протопластов", он не является перо-ксидазой, так как очищенный препарат пероксидазы не был токсичен

2х

для протопластов. Вероятно, "киллер протопластов" непосредственно действует на клеточные мембраны, а не является индуктором образования веществ, разрушающих мембраны, так как в наших опытах ингибиторы синтеза РНК и белка (актиномицин Д, циклогексимид, пуроми-цин, хлорамфеникол) не снижали токсичное действие экстрактов нек-ротизированных листьев на изолированные протопласты, а ионы кальция и марганца, а также ингибиторы дыхания (2,4-динитрофенол, фтористый натрий, азид натрия) повышали устойчивость протопластов. Возможно, "киллером протопластов" могут быть фосфолипазы или ли-поксигеназа, способные разрушать клеточные мембраны [Thompson, 1988J В пользу предположения о том, что "киллером протопластов" может быть липоксигеназа. свидетельствуют данные о быстром увеличении ее активности сразу после заражения листьев и угнетении образования локальных некрозов ингибитором этого фермента [Kato, Misawa, 1976].

300

о I.« I ;

§ 1.6 М ;250 I

о 14 , / \ I х

л

ю

200 « | *

г 1 . | А | : 1ряд

§0,8 Н Д ' 150 || f *-РЯА

I 0,6 Ш iHil I

? о,4 ; 1 л L Li \ 1 1

s _ _ u / вчиГ V_

100 ^ * s

<и с

х о

Е - 50 I

О

Номер фракции эпюата

Рис. 2. Гель-фильтрация через сефадекс в-ЮО экстрактов некро-тизированных листьев растений табака сорта Ксанти нк, полученных через 3 сут после механической инокуляции листьев суспензией ВТМ (концентрация 100 мкг/мл). 1 - содержание нежизнеспособных протопластов в пробах, % к контролю; 2 - оптическая плотность 002.ад.

250

200

; 15 0 100

9 с; о

X -Ф со

<в о ^ го

в-Знин^г

= 50

*

о. о

ч о О

о оо см О О

о о

X I-

о с; ¡г

0,3

0,25

0,2

• , 250

0,15

0,1

Ь 0,05

5 15

Номер фракции элюата

-Ряд2 ■РядЗ ■Ряд1

-Ряд2 •РядЗ •Ряд1

Рис. 3. Хроматография на колонках с СМ-Тлэасгу! М (вверху) и ОЕАЕ-ТпБасгу! М (внизу) объединенных фракций элюата пика 1 кривой элюции при гель-фильтрации экстрактов некротизирован-ных листьев Ксанти нк. Элюирование проводили в линейном градиенте ЫаСЬ (0 - 0,5 М). 1- содержание нежизнеспособных протопластов в пробах, % к контролю; 2 - оптическая плотность СЮгаэ; 3 - концентрация МаСЬ.

6. РАЗВИТИЕ ПРИОБРЕТЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

ТАБАКА СОРТА КСАНТИ НК К ПОВТОРНОМУ ЗАРАЖЕНИЮ ВТМ

В процессе некротизации первично зараженных листьев у сверхчувствительных растений развивается устойчивость к повторному заражению вирусом в принекрозных клетках (локальная приобретенная устойчивость - ЛПУ) и в неинокулированных листьях (системная приобретенная устойчивость - СПУ). Приобретенная устойчивость выражается в снижении числа и (или) размеров "вторичных" некрозов, образующихся после второго заражения[Мэтьюз, 1973; Коваленко, 1983]. Данные по размножению вирусов в устойчивых листьях противоречивы. Отмечалось как снижение JRoss, 1966; Stein et al., 1985], так и отсутствие различий от контроля [Baläzs et al., 1977b; Coutts, Wagih, 1983] в накоплении инфекционного вируса.

В настоящее время механизм приобретенной устойчивости не известен. Поэтому было изучено влияние предварительного заражения штаммом ОМ растений сорта Ксанти нк на образование "вторичных" некрозов, проницаемость клеточных мембран некротизированных и принекрозных клеток, защитную активность апопласта, накопление и транспорт ВТМ в устойчивых листьях, сделана попытка определить механизм действия веществ, образующихся в первично зараженных листьях и ответственных за развитие СПУ.

Образование локальных некрозов в листьях с приобретенной устойчивостью. Выявлено снижение числа и размеров "вторичных" некрозов в первично зараженных листьях и листьях с СПУ. Это снижение было пропорционально концентрации ВТМ в инокулюме и числу зараженных листьев при первом заражении растений, а также времени, прошедшему между первой и второй инокуляциями (0 -14 сут).

Проницаемость клеточных мембран в листьях с СПУ. Как в первично зараженных, так и в инокулированных ВТМ листьях с СПУ образование некрозов сопровождалось увеличением проницаемости Клеточных мембран. Это увеличение было пропорционально числу и размерам некрозов, а также времени, прошедшему с момента заражения листьев. Была обнаружена следующая закономерность: чем быстрее происходила локализация вируса, тем выше была проницаемость клеточных мембран у принекрозных клеток (табл. 8).

Инактивация ВТМ в межклеточном пространстве листьев растений табака сорта Ксанти нк с приобретенной устойчивостью. В листьях с

СПУ и, особенно, в первично зараженных листьях повышалась защитная активность апопласта, что выражалось в более быстром по сравнению с листьями здоровых растений снижении инфекционное™ и деградации вирусных частиц, инъецированных в межклеточное пространство листьев.

Таблица 8

Изменения проницаемости клеточных мембран у принекрозных клеток листьев растений табака сорта Ксанти нк с СПУ в _ зависимости от расстояния до некроза, %_

Расстояние от некроза,

Концентрация ВТМ в инокулюме при заражении листьев I - III ярусов, мкг/мл

мм 0 1 10 100

Некроз 100 100 100 100

0-5 49 ± 3 65 ± 7 75 + 4 82 ± 6

6-10 46 ±6 62 ± 4 68 ±5 72 ±6

11 - 15 39 ±4 55 + 6 64 ±4 68 ±5

16-20' 38 ±5 51 ± 1 62 ±3 65 ±6

21 -25 37 ±2 50 ±4 60 ±3' 62 ±4

Примечание. Листья IV яруса с СПУ заражали суспензией ВТМ (концентрация 0,01 мкг/мл) через 7 сут после заражения листьев 1-Ш ярусов. Измерения проводили через 3 сут после инокуляции листьев с СПУ.

Накопление ВТМ в листьях растений табака сорта Ксанти нк с приобретенной устойчивостью было подавлено по сравнению с первично зараженными листьями. Это было установлено в опытах по определению содержания антигена ВТМ и инфекционности проб (высечек из листьев и изолированных протопластов). Степень угнетения была пропорциональна концентрации ВТМ в инокулюме при первом заражении растений и времени между первой и второй инокуляциями (табл. 9).

Низкий уровень накопления ВТМ в листьях с приобретенной устойчивостью может быть обусловлен тем, что в этих листьях более высокое по сравнению с листьями здоровых растений содержание вирусных ингибиторов. Однако в устойчивых листьях больше подавлялся транспорт вируса, чем его репродукция, что подтверждается увеличением с развитием приобретенной устойчивости удельной инфекционности проб, рассчитанной на единицу площади некротизированной ткани. Одной из возможных причин ограничения транспорта может

быть изменение состава клеточных стенок, о чем свидетельствует повышение их устойчивости к действию мацерирующих ферментов.

Таблица 9

Инфекционность проб из листьев растений табака

сорта Ксанти нк с ЛПУ и СПУ, % к контролю_

Время между Концентрация ВТМ в инокулюме

первой и вто- при первом заражении растений,

рой инокуля- м кг/мл

циями, сут 0 0,01 0,1 1,0 10,0 100,0

Листья с ЛПУ (первично зараженные листья)

3 100 81±6 80±4 55+6 Не Не

100 114±5 119±6 121±6 опред. опред.

7 100 62 ±7 5816 33±6 Не Не

100 129±4 150±5 180+6 опред. опред.

14 100 66±8 54+7 2818 Не Не

100 149±6 198±6 213+5 опред. опред.

Листья с СПУ

3 100 106+5 108±5 9216 76+5 69±7

100 101±4 124+6 139±5 142±6 15016

7 100 94±7 76±6 69±6 63±5 5216

100 123+6 144±8 204+6 221 ±5 36017

14 100 88±6 73±6 60±5 55±6 3916

100 128±6 152±6 196±8 23417 34416

Примечание. В числителе представлены данные по определению общей инфекционное™ проб, в знаменателе - данные по инфекционное™ проб, рассчитанной на 1 мм2некротизированной ткани.

Влияние декапитации растений и кинетина на развитие СПУ. Дека-питация подавляла развитие СПУ в верхних листьях больных растений сорта Ксанти нк и протопластах, изолированных из этих листьев. Это угнетение выражалось в том, что предварительная инокуляция нижерасположенных листьев не оказывала отрицательного влияния на образование "вторичных" некрозов и накопление ВТМ.

Возможно, что удаление верхушки растения как сильного аттраги-рующего центра препятствовало транспорту о верхние листья веществ, образующихся в первично зараженных листьях и ответственных за развитие СПУ [Ross, 1966]. Обработка верхних листьев кинетином, который является малоподвижным, но сильным аттрактантом [Кулагва,

19731, должна была снять угнетающее действие декапитации на развитие СПУ. Опрыскивание растворами кинетина листьев целых здоровых растений вызывала снижение числа и размеров некрозов, а также угнетение репродукции ВТМ. Обработка кинетином существенно не влияла на образование некрозов и накопление ВТМ в листьях с СПУ и в верхних листьях декапитированных растений, у которых предварительно были заражены'нижние листья (табл. 10).

Таблица 10

Влияние декапитации, предварительного заражения листьев I - 111 ярусов и обработки кинетином на образование некрозов и накопление ВТМ в листьях IV яруса растений табака сорта Ксанти нк, % к контролю

Концентрация Целые растения Декапитированные растения

кинетина, мг/л Вода* ВТМ" Вода* ВТМ**

Число некрозов на 100 см2 листовой поверхности

0 100 33 ±5 36 ±5 31 ±5

20 73 ±6 27 ±4 39 ±6 25 ±4

100 69 ± 6 2 ч t в 31 ± 5 22+5

Диаметр некрозов

0 10 0 67 ±3 1 11 2: Г, 98 ± 6

20 77 ± 4 63 г !5 97 ±5 92 ±6

100 61 ± 4 57 ± 4 80 + 5 83 + 5

Инфекционност ч проб

0 100 С-6 + 8 72 + 6 110 ± 6

20 89 ± 7 62 ±8 55 + 3 103 ± 8

100 69 ± 8 56 ± 6 48 + 7 99 ±8

Примечание. В качестве контроля использовали целые здоровые растения. Листья I - III ярусов натирали водой (*) или суспензией ВТМ с концентрацией 100 мкг/мл ("). После удаления верхушки листья IV яруса до заражения ежедневно опрыскивали растворами кинетина. Листья IV яруса заражали суспензией ВТМ с концентрацией 1 мкг/мл через 7 сут после заражения нижерасположенных листьев и удаления верхушки.

Изучение веществ, образующихся в первично зараженных листьях растений табака сорта Ксанти нк и вызывающих СПУ. В настоящее время природа, механизмы образования и действия этих веществ не известны. Чтобы выяснить, являются ли они вирусными ингибиторами

или индукторами их образования, было проверено влияние актиноми-цина Д и экстремальных температур на развитие СПУ.

Было установлено, что инъекция актиномицина Д (таб. 11), выдерживание больных растений сорта Ксанти нк при повышенной температуре (32°С) и в условиях дифференциальной температурной обработки, когда большая часть растения находилась при 25°С, а верхушка при 5°С, ингибировапи развитие СПУ в верхних листьях. Кроме того, предварительное заражение сверхчувствительных подвоев не влияло на накопление и транспорт ВТМ в листьях чувствительных привоев, но подавляло эти процессы в листьях сверхчувствительных привоев (таб. 12).

Таблица 11

Действие актиномицина Д (АМД) на образование локальных некрозов и накопление ВТМ в листьях с СПУ, % к контролю

'Обработка лис- Число некрозов Диаметр Инфекционность

тьев на 100 см2 листовой поверхности некрозов проб

Листья инъецировали через 3 сут после индуцирующего заражения

Не инъецировали 100 100 100

84 ± 5 91 + 4 80 14

Инъеция воды 102 ±4 9613 10013

86 ±6 89 + 4 8514

Инъекция АМД 96 ± 4 117 + 4 12214

82 ±5 10315 10615

Листья инъецировали через 7 сут после индуцирующего заражения

Не инъецировали 100 100 100

70 ±4 6314 59 + 5

Инъекция воды 100 ± 4 97 + 4 104 + 6

7314 6015 74+5

Инъекция АМД 102 + 4 12814 13315

80 + 4 921 4 91 14

Примечание. В качестве контроля использовали неинъецированные листья здоровых растений. В числителе представлены данные, полученные в опытах со здоровыми растениями, в знаменателе - с растениями, нижние листья которых были заражены суспензией ВТМ с концентрацией 100 мкг/мл. Верхние листья заражали суспензией ВТМ с концентрацией 1 мкг/мл.

(аблица 12

Влияние предварительного заражения подвоев на транспорт и накопление ВТМ в листьях привоев, % к контролю_

Концентрация ВТМ Число некрозов на 100 см2листо- Диаметр Инфекцион-

в инокулюме при некрозов ность проб

заражении подво- вои поверхности

ев, мкг/мл I II I II I II

0 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100

1 98±11 96+10 95±3 33±6 98±12 92±9

105±8 75±8 91±7 61+6 103+8 83±6

10 107±12 90+9 103+8 77±5 105±9 80+9

102±8 64+9 88±6 50+6 95±8 69±6

100 104±8 86+6 90±7 71±6 100+8 73±Ю

93±9 58±8 83+8 44+6 92±6 58±8

Примечание. I - привои сорта Самсун, II - сорта Ксанти нк. В числителе представлены данные, когда привои заражали через 3 сут после инокуляции подвоев, в знаменателе - через 7 сут.

Эти результаты свидетельствуют о том, что из первично зараженных листьев транспортируются не вирусные ингибиторы, а индукторы их образования, не способные функционировать в клетках чувствительного хозяина. Этот вывод подтверждается нашими данными о неспецифическом угнетении репродукции ВТМ в протопластах, изолированных из листьев растений сортов Самсун и Ксанти нк, экстрактами листьев больных растений сорта Ксанти нк.

В литературе имеются данные о том, что индуктором СПУ может быть салициловая кислота [Malamy et ai., 1990; Metraux et al., 1990; Chen, Klessig, 1991; Weymann et al., 1995J. Чтобы проверить действительно ли салициловая кислота вызывает развитие приобретенной устойчивости, было проверено ее влияние на репродукцию и транспорт ВТМ в листьях чувствительных и сверхчувствительных растениях табака. Логика экспериментов была такова. Если салициловая кислота является индуктором СПУ, то она не должна действовать в листьях чувствительных растений.

Было установлено, что салициловая кислота угнетала накопление и транспорт ВТМ в листьях растений сортов Самсун и Ксанти нк, ингиби-ровала репродукцию вируса в изолированных протопластах обоих сортов и актиномицин Д не подавлял полностью действие салициловой кислоты на накопление ВТМ в протопластах (табл. 13).

Таблица 13

Влияние салициловой кислоты и актиномицина Д на накопление ВТМ в протопластах, изолированных из листьев здоровых растений табака сортов Самсун и Ксанти нк и зараженных ВТМ после изолирования.

% к контролю

Среда для инкубации Сорт протопластов

изолированных протопластов Самсун Ксанти нк

Без актиномицина Д и салициловой кислоты 100 100

С салициловой кислотой 73 ±6 52 ± 6

С актиномицином Д 154 ± 6 168 ±5

С актиномицином Д и салициловой кислотой 129 ±5 134 ± 6

Примечание. Концентрации актиномицина Д и салициловой кислоты были 10 мкг/мл. Протопласты инкубировали 24 ч.

Таблица 14

Влияние инъекции растворов салициловой кислоты (100 мкг/мл) на образование некрозов и накопление ВТМ в инъецированных и соседних листьях растений табака сортов Самсун и Ксанти нк,

% к контролю

Располо Число некрозов Диаметр Инфекционность

жение на 100 см2 листо- некрозов проб

' листьев вой поверхности

I II 1 II I II

Листья заражали через 1 сут после инъекции

+2 97 ±6 87 ±6 88 ±4 85 ±5 80 ±5 81 ±5

+1 84 + 6 84 ±5 81 ±5 88 ± 3 77 ±6 76 ±6

0 80 ± 6 67 ±5 70 ±4 79 ±2 71 ±6 62 ±5

-1 89 + 5 79 ± 6 89 ±4 80 ±4 79 ±7 79 ± 7

-2 94 ±6 84 ± 6 93+6 83 ±4 87 ±6 77 ± 6

Листья заражали через 3 сут после инъекции

+2 76 ± 6 65 ± 6 83 ± 5 73 ±3 66 ±6 68 ±7

+1 78 ±7 64 ± 6 84 ± 6 74 ±4 64 ±5 68 ±5

0 70 ±6 55 ±6 76 ± 4 69 ±2 56 ±6 65 ±6

-1 86 ±6 69 ± 6 79 ± 5 71 + 4 69 + 5 73 ±5

-2 78 ±6 73 ±6 81 ±6 71 ± 3 69 ±6 75 ±6

Примечание I - растения сорта Самсун, II - сорта Ксанти нк. Расположение листьев: инъецированные (0), выше- (+) и нижерасположенные (-). В качестве контроля использовали соответствующие листья неинъецированных растений.

В опытах по изучению действия салициловой кислоты на транспорт и накопление ВТМ в соседних неинъецированных листьях были полулучены противоречивые данные. Когда салициловую кислоту инъецировали в листья среднего яруса, то в выше- и нижерасположенных листьях растений обоих сортов угнетались накопление и транспорт ВТМ (табл. 14). Если салициловую кислоту инъецировали в нижние листья, то она не влияла на транспорт и накопление ВТМ в вышерасположенных листьях у растений сорта Самсун, но ингибировала эти процессы у растений сорта Ксанти нк.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что салициловая кислота является не индуктором развития СПУ, а одним из вирусных ингибиторов, образующихся в первично зараженных листьях и транспортирующихся в сверхчувствительных растениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Обобщая литературные данные и результаты наших экспериментов, можно сделать заключение, что устойчивость растений к проникновению вирусов в процессе механической инокуляции определяется особенностями строения тканей растений и не зависит от их реакции на поражение вирусом. В клетки растений проникает незначительное количество вируса в результате первичного механизма защиты, проявляющегося в связывании, деградации и инактивации вирионов на кутикуле и клеточных стенках. Деградация и инактивация вирионов иноку-люма происходит под влиянием вещества клеточных стенок, в том числе протеиназ и РНКаз. Повышение активности этих ферментов при попадании вируса инокулюма в межклетники указывает на активную защитную функцию апопласта.

При равных условиях заражения у чувствительных, толерантных и сверхчувствительных растений заражается одинаковое число клеток и в листьях образуется равное количество инфекционных центров (крахмальные и тепловые некрозы у чувствительных и толерантных растений, локальные некрозы у сверхчувствительных растений).

В чувствительных и сверхчувствительных растениях репродукция и распространение вирусов идут с одинаковой скоростью в течение нескольких суток после заражения растений. После появления некрозов накопление и транспорт вируса в листьях сверхчувствительных растений замедляются в зависимости от гена, контролирующего реакцию сверхчувствительности. Замедление четко выражено у растений с ге-

ном N и незначительно у растений с геном N'. Одной из причин замедления репродукции вируса в листьях сверхчувствительных растений является накопление вирусных ингибиторов в зараженных и здоровых клетках.

Некротизация инфицированных клеток сверхчувствительных растений изучается давно, но ее механизм еще до конца не выяснен. Предполагается, что некротизация происходит в результате автолиза вследствие нарушения целостности клеточных мембран и увеличения их проницаемости [Метлицкий и др., 1984, с. 18]. Согласно нашей гипотезе, для некротизации инфицированных клеток необходима клеточная стенка. В ней активируется или образуется индуктор гена N, способный вызывать экспрессию гена и в изолированных клетках, находящихся в гипертонических условиях. Одним из результатов его экспрессии является накопление "киллера протопластов" (кислого белка с молекулярной массой примерно 70 КД), который непосредственно разрушает клеточные мембраны.

В процессе образования локальных некрозов у сверхчувствительных растений развивается устойчивость к повторному заражению вирусом. Она выражается в снижении числа и размеров видимых "вторичных" некрозов и угнетении вирусной репродукции. С развитием приобретенной устойчивости повышается защитная активность апопласта, что выражается в более значительной по сравнению с листьями здоровых растений деградации и инактивации вирусных частиц, инъеци-ров~чных в межклеточное пространство листьев. Развитие СПУ обусловлено действием веществ, образующихся в первично зараженных листьях и распространяющихся по всему растению [Ross, 1966]. Согласно нашим данным, эти вещества являются не вирусными ингибиторами, а индукторами их образования. Проверка салициловой кислоты (предполагаемого индуктора СПУ) показала, что она ингибирует репродукцию и транспорт ВТМ в листьях чувствительных и сверхчувствительных растений табака и протопластах, изолированных из этих листьев. Эти данные дают возможность сомневаться в том, что салициловая кислота действительно является индуктором СПУ, специфичным для сверхчувствительных растений табака.

На основании собственных результатов и данных литературы нами предлагается обобщенная схема взаимодействия вируса со сверхчувствительным растением, приводящего к экспрессии гена сверхчувствительности (рис. 4).

Вирус инокулюма

Связывание, агрегация, деградация, инактивация

Вещестао клеточной стенки, в т.ч. протс-иназы и РНКаза

Индуктор(ы) гена N

Размножение-

Геном

"Киллер протопластов'

Клеточные мембраны

Индуктор(ы) приобретенной устойчивости

Вирусные ингибиторы, в т.ч салициловая кислота

Передвижение в соседние клетки и проводящую систему

' еном

Вирусные ингибиторы

Модификация клеточной стенки

Рис. 4. Схема, иллюстрирующая события, приводящие к инактивации вирионов инокулюма на кутикуле и клеточной стенке, некротизации инфицированных клеток и развитию приобретенной устойчивости.

На основе полученного экспериментального материала сделаны следующие выводы:

1. Родственные и сходные по своему строению растения табака одинаково устойчивы к проникновению ВТМ. В растениях, независимо от их реакции на поражение вирусами, действует единый механизм первичной защиты от проникновения вирусов. Его действие заключается в связывании, кратковременной агрегации с последующей деградацией и инактивации вирионов инокулюма на клеточных стенках под влиянием веществ клеточных стенок, б том числе протеиназ и РНКаз.

2 При равных условиях заражения у чувствительных, толерантных и сверхчувствительных растений табака заражается одинаковое число эпидермальных и мезофильных клеток и в листьях образуется равное количество инфекционных центров. Нет различий между чувствительными и сверхчувствительными растениями табака в устойчивости к проникновению ВТМ и на уровне изолированных протопластов, которые в условиях in vitro одинаково поглощают и накапливают вирус.

3. В листьях чувствительных и сверхчувствительных растений табака ВТМ размножается с одинаковой скоростью до формирования локальных некрозов. После появления некрозов накопление вируса в листьях сверхчувствительных растений начинает отставать в зависимости от генома растения. Замедление репродукции ВТМ незначительно у растений с геном N' и четко выражено у растений с геном N. В растениях и изолированных протопластах всех использованных сортов штамм 412 накапливается хуже, чем штамм ОМ Угнетение репродукции ВТМ в листьях сверхчувствительных растений табака обусловлено накоплением вирусных ингибиторов. Однако межклеточная жидкость из листьев больных растений сортов Самсун и Ксанти нк одинаково подавляет размножение ВТМ в протопластах обоих сортов.

4. В листьях чувствительных и сверхчувствительных растений табака ВТМ распространяется с равной скоростью в течение нескольких суток после заражения, затем транспорт ВТМ в листьях сверхчувствительных растений замедляется. Степень угнетения "ближнего" транспорта зависит от гена, контролирующего реакцию сверхчувствительности. У растений с геном N достоверное торможение транспорта штаммов ОМ и 412 происходит после формирования видимых некрозов. У растений с геном N' образование локальных некрозов не влияет на транспорт вируса и локализация вируса происходит на уровне листа.

5 Толерантная реакция растений сорта Сзмсун в ответ на заражение штаммом 412 меняется на чувствительную при повышении температуры до 32° С. У растений сортов Самсун 47/10 и Ксанги нк, зараженных штаммом ОМ, сверхчувствительная реакция меняется на чувствительную уже при 28° С, а у других использованных сверхчувствительных растений - при 35° С. У сверхчувствительных растений, зараженных штаммом 412, при 35° С развивается чувствительная реакция.

6. Ответственный за реакцию сверхчувствительности ген N индуцируется а протопластах, когда они интегрированы в составе листа как клетки, и состояние индукции сохранятся при нарушении интеграции даже в гипертонических условиях. На основании результатов опытов с изолированными клетками сделано заключение о необходимости клеточной стенки для некротизации инфицированных клеток, тогда как интеграция клеток не является обязательным условием для индукции гена N.

7. Проницаемость клеточных мембран увеличивается как у некроти-зирующихся, так и у здоровых клеток, окружающих некрозы. Деструкция клеточных мембран происходит под действием "киллера протопластов", так как ингибиторы синтеза РНК и белка (актиномицин д, цикло-гексимид, пуромицин, хлорамфеникол) не снижают токсичное действие экстрактов некротизированных листьев на изолированные протопласты, а ионы кальция и марганца, а также ингибиторы дыхания (2,4-динитрофенол, фтористый натрий, азид натрия) повышают устойчивость протопластов. "Киллер протопластов" является кислым белком с молекулярной массой примерно 70 КД.

8. Снижение числа и размеров "вторичных" некрозов в межнекроз-ном пространстве первично зараженных листьев и листьях с СПУ пропорционально концентрации ВТМ в инокулгаме при первичном заражении растений и времени, прошедшего между первой и второй инокуляциями. Чем выше проницаемость клеточных мембран у принекрозных клеток и защитная активность апопласта, выражающаяся в связывании, деградации и инактивации вирусных частиц, инъецированных а межклеточное пространство листьев, тем меньше размеры "вторичных" некрозов.

9 Развитие приобретенной устойчивости сопровождается угнетением вирусной репродукции во "вторичных" некрозах. Степень угнетения пропорциональна концентрации ВТМ в инокулюме при индуцирующем заражении листьев и времени между первой и второй инокуляциями. Одной из причин низкого содержания вируса в устойчивых листьях яв-

пяется накопление вирусных ингибиторов. В устойчивых листьях больше подавляется транспорт вируса, чем его репродукция.

10. Декалитация растений подавляет развитие СП У в верхних листьях растений, у которых предварительно были заражены нижерасположенные листья. СПУ не проявляется ни в листьях декапитированных растений, ни в протопластах, изолированных из этих листьев.

11. Салициловая кислота не является индуктором развития СПУ, так как ингибирует репродукцию и транспорт ВТМ в листьях чувствительных и сверхчувствительных растений табака и протопластах, изолированных из этих листьев.

12 Образующиеся в первично зараженных листьях сверхчувствительных растений вещества, ответственные за развитие СПУ. являются не вирусными ингибиторами, а индукторами образовании ингибиторов, не способными функционировать в клетках чувствительного хозяина.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Журавлев Ю.Н., Малиновский В И. Применение изолированных протопластов в изучении реакции сверхчувствительности к ВТМ у растений табака//Тезисы докл. Международного совещ. соц. стран по проблемам устойчивости растений. Галле. 1932. С. 108.

2 Малиновский В И., Журавлев Ю.Н.. Шумилова П.А., Селецкая Л Д Репродукция вируса табачной мозаики в листьях и протопластах системного и сверхчувствительного расгений-хозяев//В кн : Влияние вирусов на обмен растений. Владивосток. Изд. Д6НЦ. 1983. С. 3-9.

3. Шумилова П.А., Журавлев Ю.Н., Селецкая Л.Д., Малиновский В.И. К вопросу об участии эпидермиса в образовании некрозов/Яам же. С. 113-114.

4. Малиновский В.И., Журавлев Ю.Н., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д. Индукция гена N у сверхчувствительных растений в модельных условиях//Тезисы докл. 8-го Всесоюзн. совещ. Вильнюс. 1984. С. 242243.

Ь. Журавлев Ю.Н., Варфоломеева Л.А., Малиновский В И. Роль апо-пласта в защите растения от вирусов//Там же. С. 12-13.

6. Малиновский В.И., Журавлев Ю.Н., Варфоломеева Л А., Селецкая Л.Д. По1 лощение 14С-ВТМ протопластами, выделенными из листьев растений табака с разной реакцией на вирусное поражение//В кн.: Вза-имоогношения вирусов с клетками растения-хозяина. Владивосток.

Изд. ДВНЦ. 1985. С. 3-9.

7. Варфоломеева Л.А., Селецкая J1 Д., Малиновский В.И. Инактивация ВТМ в свободном пространстве листьев растений табака с разной реакцией на вирусное поражение//Там же. С. 120-121.

8. Варфоломеева Л.А.. Селецкая Л.Д.. Журавлев Ю Н.. Малиновский В.И. Инактивация ВТМ а апопласго листьев растений с разной реакцией на лоражение//Тезисы докл. 8 съезда ВМО. Алма-Ата 1985. Т. 5. С. 6.

9 Малиновский В.И., Журавлев Ю.Н., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д. Проявление гена N в изолированных протопластах табака//' Физиология растений. 1986. Т. 33, № 1. С. 159-164

10. Малиновский В.И., Журавлев Ю.Н., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л Д. Проявление индуцированной устойчивости к В ГМ в изолированных протопластах табака'/Тезисы докл. 8 Всесоюзм. совещ. по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям Рига. 1986 Ч. III. С. 56.

11 Malinovsky V., Zhuravlev Yu. TMV uptake and multiplication in protoplasts isolated from leaves of hypersensitive tobacco plants revealed the acquired resistance//Abstr. VII Intern/ Congress of Virology. Edmonton. Canada. 1987. P. 1C57.

12 Malinovsky V., Zhuravlev Yu., Gnutcva R. Symptom pattern and reproduction of two TMV strains in systemic and locai lesion nosts//Abstr. XVI Intern. Congress of Genetics. Toronto. Canada. 1988. P. 456.

13. Малиновский В.И., Журазлев Ю.Н., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д., К'угук Н.С Поглощение и накопление ВТМ в протопластах, изолированных из листьев сверхчувствительных растений табака с приобретенной устойчивостьюЛМикробиол. журн. 1988. Т. 50, № 2. С. 48-52.

14. Малиновский В.И., Селецкая Л.Д., Варфоломеева Л.А. Влияние осмотического шока на образование некрозов и накопление ВТМ в листьях сверхчувствительных растений табака//В кн.. Фигоаирусологи-ческие исследования на Дальнем Востоке. Владивосток. ДВО АН СССР. 1989. С 77-87.

15 Селецкая Л.Д., Варфоломеева Л А., Малиновский В.и. Накопление ВТМ и развитие некрозов в листьях растений табака сорта Ксанти нк. инфильтрированных водой/ГТам же. С. 134-186.

16. Malinovsky V, Zhuravlev Yu., Varfolomeeva L, Seietskaya L. Manifestation of the N gene in isolated tobacco protoplasts and cells //Abstr 2 Intern. Symposium on Positive Strand RNA Viruses. Vienna. 1989. P. 344.

4 I

17 Vartolomenva l., /tuiravlev Yu., Malinovsky V. Aggregation and degradation of TMV pariicfes in the intercellular spaces of tobacco leaves . i ibid. P '111

18. Malinovsky V., Seietskaya L., Zhuravlev Yu Manifestation of acquired resistance to tobacco mosaic virus in isolated protopiasts//Proc. 10 Conf. Czechoslovak Plant Virologists. Praha. 1989. P. 126.

19. Zhuravlev Yu., Varfolomeeva L., Malinovsky V. Fate of TMV particles injected in the intercellular space of leaves of local lesion and susceptible hosts/Vlbid. P. 216.

20. Мзлинзискии О.П., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д., Кугук Н.С., Журавлев Ю.Н. Изучение приобретенной устойчивости растений к вирусам с помощью модельных систем/Яезисы докл. Всесоюзн. семинара по приобретенной устойчивости Ростов-на-Дону. 1989. С. 66.

21 Малиновским В И., Журавлев Ю.Н , Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д. Агрегация и деградация вируса табачной мозаики в межклеточном пространстве листьев чувствительных и сверхчувствительных растений табака/'/'Биол. науки. 1990. №4. С. 26-31.

22. Малиновский В.И. Изучение устойчивости чувствительных и сверхчувствительных растений табака с помощью модельных систем //Материалы конференции (2-6 сентября 1992 г.). Ростов-на-Дону, 1992. С. 25-26

23 Малиновский В.И. Реакция сверхчувствительности растений к вирусам//Успехи современной биологии, 1992. Т. 112, № 4. С. 528-540.

24. Малиновский В.И., Варфоломеева Л.А. Физиолого-биохими-ческие механизмы устойчивости чувствительных и сверхчувствительных растений к вирусам/'/Т'ез. докл. II съезда Всесоюзн. об-ва физиологов растений (Минск, 24-29 сентября 1990 г.). М.: 1992. 4.2. С. 127.

25. Malinovsky V., Kuguk N. Partial purification and characterization of "protoplast killer" from hypersensitive tobacco plants infected with TMV// Pioc. 3 Intern. Positive Strand RNA Symposium (19-24 September 1992 USA). 1992. P. 647.

26. Varfolomeeva L, Kuguk N., Zhuravlev Yu., Malinovsky V. Protective roie ot plant apoplast against viruses//lbid. P, 648.

27. Malinovsky V.. Vailolomeeva L., Seietskaya L., Kuguk N. The study of systemic acquired resistance of hypersensitive tobacco plants// Ibid. P. 649.

28. Малиновский В.И., Варфоломеева Л.А., Селецкая Л Д., Кугук Н.С. Влияние различных обработок на системную приобретенную устой-

чивость сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мо-заики//Тез. докл. III съезда Всерос. об-ва физиологов растений (С.Петербург, 24-29 июня 1993 г.). С.-Петербург, 1993. С. 663.

29. Малиновский В.И., Селецкая Л.Д., Варфоломее-па Л.А., Кугук И С. Влияние вируса табачной мозаики на жизнеспособность протопластов и клеток, изолированных из листьев чувствительных и сверхчувствительных растений табака/7Физиология растений. 1993. Т. 40, № 5. С. 785-790.

30. Малиновский В.И , Селецкая П Д., Варфоломеева П.А., Кугук Н.С. Влияние экстремальных температур на системную приобретенную устойчивость к ВТМ у сверхчувствительных растений табака/f Микроби-ол. журн. 1393. Т.55, № 2. С. 64-68.

31. Малиновский В.И., Варфоломеева Я.А., Селецкая II.Д., Гнутова Р В. Накопление и транспорт двух штаммов ВТМ (ОМ и 412) в растениях табака//Фитовирусы Дальнего Востока. Владивосток: Дальнаука, 1993. С. 58-72.

32 Малинсвскии В.И , Оепецкая ЛД, Варфоломеева H.A., Кугук Н.С.. Журавлев Ю.Н. Влияние заражения сверхчувствительных подвоев на транспорт и накопление ВТМ в листьях чувствительного и сверхчувствительного привоев табака//Физиология растений. 1994. Т. 41, № 1. С 118-122.

33. Малиновский В.И., Селецкая Л.Д., Варфоломеева Л.А., Кугук Н.С Влияние актиномицина Д на системную приобретенную устойчивость растений табака к вирусу табачной мозаики/УМикробиол. журн. 1995 Г. 57, №1. С. 80-85

34. Малиновский В.И , Варфоломеева Л.А., Селецкая Л.Д. Сравнительное изучение устойчивости чувствительных и сверхчувствительных растений табака к механическому заражению чирусом табачной мозаики//Проблемы фитовирусологии на Дальнем Востоке Владивосток: Дальнаука, 1996. С. 160-171.

35. Селецкая Л.Д., Кугук Н.С., Варфоломеева Л.А., Журавлев Ю. Н., Малиновский В.И. Проницаемость клеточных мембран у сверхчувствительных растений табака, пораженных вирусом табачной мозаики//Тзм же С. 172-181.

Владимир Иванович МАЛИНОВСКИЙ

МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ

Автореферат

Изд. лиц. ЛР № 040118 от 15.10.96 г. Подписано к печати 17.04.98 г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл.п.л. 3. Уч.-изд.л. 2,59. Тираж 100 экз. Заказ 93

Отпечатано в типографии издательства "Дальнаука" ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио, 7

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Малиновский, Владимир Иванович, Владивосток



/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ИНСТИТУТ

Малиновский Владимир Иванович

МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ

03.00.12 - физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

На Правах рукописи

Владивосток 1998

Содержание

Введение..............................................................................................7

Глава 1 Обзор литературы..............................................................16

1.1. Общая характеристика растений по их устойчивости

к вирусам.................................................................................16

1.1.1. Чувствительные растения................................................16

1.1.2. Толерантные растения.....................................................18

1.1.3. Иммунные растения.........................................................18

1.1.4. Сверхчувствительные растения......................................19

1.2. Проникновение вирусов в растения......................................21

1.3. Накопление вирусов в чувствительных и сверхчувствительных растениях...........................................30

1.4. Распространение вирусов по растению................................32

1.5. Некротизация клеток сверхчувствительных растений.......39

1.6. Приобретенная устойчивость сверхчувствительных растений к повторному заражению вирусами......................44

Глава 2. Материалы и методы исследований................................51

2.1. Растения..................................................................................51

2.2. Вирус.................................................................-.......................52

2.2.1. Исходный материал..........................................................52

2.2.2. Очищенные препараты вируса........................................52

2.2.3. Меченые препараты вируса.............................................53

2.3. Заражение растений...............................................................53

2.4. Определение инфекционное™ проб.....................................54

2.5. Определение вирус-ингибирующей активности проб..........55

2.6. Выявление крахмальных и тепловых некрозов...................56

2.7. Инфильтрация листьев и получение

межклеточной жидкости........................................................57

2.8. Приготовление препаратов для электронной микроскопии.............................................................................58

2.9. Изолированные протопласты и клетки.................................58

2.9.1. Получение и заражение изолированных протопластов.....................................................................58

2.9.2. Получение изолированных клеток..................................80

2.9.3. Определение количества жизнеспособных протопластов и клеток......................................................61

2.9.4. Определение количества инфицированных протопластов.....................................................................61

2.10. Определение активности РИКазы и протеиназ..................63

2.11. Изучение "киллера протопластов"......................................64

2.11.1. Получение неочищенного препарата

"киллера протопластов".................................................64

2.11.2. Очистка "киллера протопластов" диализом и высаливанием сульфатом аммония.............................64

2.11.3. Очистка "киллера протопластов" методом гель-фильтрации.............................................................65

2.11.4. Очистка "киллера протопластов" методом ионнообменной хроматографии....................................65

2.11.5. Ферментативная обработка "киллера протопластов" ..66

2.11.6. Выделение водорастворимых фенольных соединений......................................................................66

2.12. Определение концентрации белка в пробах......................67

2.13. Определение проницаемости клеточных мембран...........67

2.14. Статистическая обработка результатов.............................67

Глава 3. Устойчивость чувствительных и сверхчувствительных

растений табака к механическому заражению ВТМ.......70

3.1. Связывание вируса инокулюма листьями.............................74

3.2. Инактивация ВТМ в межклеточном пространстве листьев....................................................................................76

3.2.1. Морфологические изменения частиц ВТМ.....................77

3.2.2. Изменения инфекционности препаратов ВТМ...............84

3.2.3. Активность протеиназ и РНКаз в межклеточном пространстве листьев.......................................................87

3.3. Образование инфекционных центров в механически инокулированных листьях......................................................93

3.4. Определение числа зараженных клеток в механически инокулированных листьях......................................................96

3.5. Связывание 14С-ВТМ изолированными протопластами.....99

3.5.1. Влияние продолжительности инокуляции....................100

3.5.2. Влияние рН......................................................................101

3.5.3. Зависимость связывания от концентрации вируса и количества протопластов...............................................102

Глава 4. Накопление и транспорт ВТМ в растениях с разной

реакцией на вирусное поражение..................................108

4.1. Накопление штамма ОМ ВТМ в разных модельных системах................................................................................109

4.1.1. Опыты с интактными листьями.....................................109

4.1.2. Опыты с дисками из листьев.........................................111

4.1.3. Опыты с изолированными протопластами, зараженными в условиях in vitro....................................113

4.1.4. Опыты с изолированными протопластами, зараженными в условиях in vivo....................................115

4.2. Накопление штаммов ОМ и 412 в интактных листьях и изолированных протопластах..............................................117

4.2.1. Опыты с интактными листьями.....................................119

4.2.2. Опыты с изолированными протопластами,

инокулированными в условиях in vitro..........................119

4.3. Накопление ингибиторов вирусной репликации в листьях и изолированных протопластах..............................................122

4.4. Транспорт ВТМ в инокулированных листьях.......................138

4.4.1. Опыты по удалению инокулированного эпидермиса ...140

4.4.2. Опыты по измерению некрозов.....................................142

4.4.3. Опыты по определению содержания инфицированных протопластов в пробах, изолированных из инокулированных листьев..............................................146

Глава 5. Образование локальных некрозов у

сверхчувствительных растений табака.........................150

5.1. Влияние вирусного и растительного геномов и температуры внешней среды на развитие симптомов заболевания.. 150

5.2. Влияние интеграции тканей и клеток растений на образование локальных некрозов.......................................153

5.2.1. Участие эпидермиса в образовании

локальных некрозов........................................................153

5.2.2. Влияние осмотического шока на

образование некрозов....................................................156

5.2.3. Проявление гена N в изолированных протопластах.... 173

5.2.4. Проявление гена N в изолированных клетках...............184

5.3. Влияние ВТМ на проницаемость клеточных мембран у чувствительных и сверхчувствительных

растений табака ....................................................................193

5.4. Изучение "киллера протопластов" из листьев растений табака сорта Ксанти нк, пораженных ВТМ..........................202

Глава 6. Развитие приобретенной устойчивости растений табака

сорта Ксанти нк к повторному заражению ВТМ...........220

6.1. Образование локальных некрозов в листьях с

приобретенной устойчивостью...........................................221

6.2. Проницаемость клеточных мембран в листьях с системной приобретенной устойчивостью.........................228

6.3. Инактивация ВТМ в межклеточном пространстве листьев растений табака сорта Ксанти нк с приобретенной устойчивостью............................................231

6.4. Накопление ВТМ в листьях растений табака сорта

Ксанти нк с приобретенной устойчивостью........................238

6.4.1. Опыты с листьями..........................................................238

6.4.2. Опыты с изолированными протопластами...................241

6.5. Влияние декапитации растений и кинетина на развитие системной приобретенной устойчивости............................250

6.6. Изучение веществ, образующихся в первично зараженных листьях растений табака сорта Ксанти нк и вызывающих системную приобретенную устойчивость...........................261

6.6.1. Влияние экстремальных температур на системную приобретенную устойчивость растений табака

к ВТМ................................................................................262

6.6.2. Влияние актиномицина Д на системную приобретенную устойчивость растений табака к ВТМ....................266

6.6.3. Опыты с чувствительными и сверхчувствительными растениями табака, привитыми на сверхчувствительные подвои........................................270

6.6.4. Влияние салициловой кислоты на транспорт и накопление ВТМ в листьях чувствительных и сверхчувствительных растениях табака.......................279

Заключение и выводы....................................................................290

Литература.....................................................................................307

ВВЕДЕНИЕ

Предлагаемая работа посвящена сравнительному изучению устойчивости сверхчувствительных и чувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики, В ней исследуются такие основные этапы взаимодействия вируса с растением, как проникновение вируса в растение, накопление инфекционного вирусного материала и распространение его в растении. Особое внимание обращено на изучение механизмов защитных реакций, специфичных для сверхчувствительных растений: некротизация инфицированных клеток и приобретенная устойчивость к повторному заражению вирусом.

Актуальность исследований устойчивости растений к фитовиру-сам определяется их связью с практическими задачами охраны растений от вирусов. Сейчас известно более 600 вирусов и их штаммов [Коваленко, 1983]. Некоторые из них имеют широкий круг растений-хозяев. Так, вирус погремковости табака поражает более 400 видов растений из 50 семейств [Гиббс, Харрисон, 1978]. Многие растения заражаются несколькими вирусами. В настоящее время обнаружено несколько сот вирусов и их штаммов на 12 наиболее ценных продовольственных культурах - таких как рис, пшеница, кукуруза, свекла, картофель, соя, фасоль, сахарный тростник, батат, маниок, кокосовая пальма и банан [Коваленко, 1983]. Ущерб, наносимый вирусными заболеваниями, очень велик. Вирусные болезни снижают урожай сельскохозяйственных культур и ухудшают товарные качества продуктов.

Очевидна необходимость разработки мер защиты растений от вирусов. Химические методы борьбы с вирусами имеют ряд ограничений. Во-первых, они небезопасны для человека и окружающей среды. Во-вторых, химические методы применяются, в основном, в тех

случаях, когда вирусы передаются от растения к растению насекомыми-переносчиками, против которых и используются химические средства защиты растений. В-третьих, они малоэффективны, так как их использование не дает 100 %-ного положительного эффекта и часто происходит быстрое привыкание переносчиков к инсектицидам.

Наиболее перспективно с экологической точки зрения для борьбы с вирозами использовать защитные свойства самих растений и культивировать устойчивые сорта. Очень часто растения, пораженные вирусами, не только не погибают, несмотря на морфологические и биохимические повреждения различной степени, но и сравнительно легко переносят заболевание. Выживание растений обусловлено наличием у растений защитных механизмов, сформировавшихся в процессе длительной совместной эволюции растений и патогенов [Вавилов, 1967]. Эффективность этих механизмов варьирует в зависимости от комбинации вирус - растение, а природа их еще недостаточно изучена. Поэтому особую актуальность приобретает исследование защитных механизмов, лежащих в основе таких известных типов устойчивости, как толерантность, сверхчувствительность и крайняя устойчивость.

Для выявления защитных механизмов необходимо исследовать процессы взаимодействия вирус - растение на всех уровнях этого взаимодействия, сравнивая количественные характеристики последовательно сменяющихся этапов инфекционного процесса у восприимчивых и устойчивых растений, зараженных одним и тем же вирусом. Измерив количество вируса, связавшегося с листьями при их инокуляции и проникшего в клетки, проследив за изменением состояния вирусных частиц инокулюма при заражении растений, определив число первично зараженных клеток можно сделать вывод об эффек-

тивности защитных реакций этих растений на ранних этапах инфекционного процесса. Эта стадия взаимодействия вирус - растение имеет особое значение, так как очень часто устойчивость растения определяется его способностью препятствовать внедрению патогена. Однако до сих пор нет единого мнения о механизмах проникновения вирусов в клетки растений.

Сведения о более поздних этапах инфекционного процесса у растений с разной реакцией на вирусное поражение так же неоднозначны и часто противоречивы. Сравнивая через разное время после заражения растений накопление вируса и распространение его по растению, определяя число зараженных клеток в листьях можно выяснить эффективность защитных реакций последующих этапов инфекционного процесса, а именно репродукции и транспорта вируса. Таким образом, можно выявить весь комплекс и последовательность событий, приводящих к ограничению инфекционного процесса в устойчивых растениях, и выявить факторы, блокирующие инфекционный процесс.

Недостаточная изученность защитных механизмов растений объясняется, во-первых, сложностью изучаемых процессов, во-вторых, отсутствием до недавнего времени методов и модельных систем, посредством которых можно было бы разграничить и воспроизвести разные этапы взаимодействия вирус - растение и дать им количественные характеристики. Сейчас положение иное. Разработаны такие системы как изолированные протопласты и клетки, позво-лящие моделировать отдельные этапы взаимодействия вируса с растением. Современные, в том числе и применяемые в данной работе, методы дают возможность количественно характеризовать некоторые события, происходящие в больном растении.

Целью настоящей работы было изучение механизмов устойчи-

вости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики Во многих опытах использовали для сравнения чувствительные к этому вирусу растения табака. Некоторые опыты были проведены со штаммом 412 вируса табачной мозаики, который вызывает у растений использованного в работе чувствительного к штамму ОМ сорта Самсун толерантную реакцию [Чуян, Стрекозова, 1985; Савина, Гнутова, 1989]. Наш выбор объектов обусловлен рядом причин. Использование классической для фитовирусологии системы "табак -вирус табачной мозаики" дает возможность сравнить полученные нами данные с многочисленными результатами других исследований, проведенных на этой модели ранее. Кроме того, использование одних и тех же растений, по-разному реагирующих на заражение разными вирусами или штаммами, и разных растений, различающихся по своей реакции на заражение одним и тем же вирусом или штаммом может существенно помочь в изучении защитных механизмов растений.

При планировании этой работы были поставлены следующие задачи:

1). Сравнить проникновение вируса инокулюма в листья чувствительных и сверхчувствительных растений в процессе механической инокуляции:

- определить количество вируса инокулюма, связавшегося с листьями при инокуляции;

- проследить за состоянием вирусных частиц, попавших в межклеточное пространство листьев;

- определить количество инфекционных центров и инфицированных клеток в первично зараженных листьях,

- дать количественную характеристику поглощения вируса изолированными протопластами в зависимости от разных условий.

2). Сравнить содержание вируса в растениях, различающихся по своей реакции на вирусное поражение:

- изучить динамику накопления разных штаммов вируса табачной мозаики в различных модельных системах (диски из листьев, листья, изолированные протопласты, зараженные в условиях in vivo и in vitro);

- определить содержание ингибиторов вирусной репликации в листьях и изолированных протопластах.

3). Сравнить "ближний" транспорт вируса от клетки к клетке в листьях разных растений-хозяев по следующим параметрам:

- инфекционность обнаженного мезофиила;

- размеры тепловых и локальных некрозов;

- содержание инфицированных клеток.

4). Изучить некротизацию инфицированных клеток сверхчувствительных растений:

- выяснить влияние вирусного и растительного геномов на образование симптомов заболевания в зависимости от температуры внешней среды;

- определить влияние интеграции растительных тканей и клеток на образование некрозов;

- проследить за изменением проницаемости клеточных мембран у инфицированных листьев;

- выделить "киллер протопластов" и описать его свойства.

5). Охарактеризовать приобретенную устойчивость сверхчувствительных растений к повторному заражению вирусом:

- изучить особенности образования некрозов и накопления вируса в устойчивых листьях и протопластах, изолированных из этих листьев;

- определить механизм действия веществ, образующихся в пер-

вично зараженных листьях и ответственных за развитие приобретенной устойчивости.

Диссертация изложена на 357 страницах, состоит из введения, 6 глав, заключения с выводами, списка цитируемой литературы и содержит 118 таблиц и 32 рисунка.

Первая глава является обзором литературы по изучаемым вопросам. В этой главе дана краткая общая характеристика растений по их устойчивости к вирусам. Излагаются результаты исследований таких процессов взаимодействия вирусов со сверхчувствительными и чувствительными растениями, как проникновение вирусов в растение, репродукция и транс�