Внутриклеточные локальные изменения сопротивления как проявление сопряжения между мембранным потенциалом и состоянием внутриклеточных структур

Сатыбалдина, Назым Капановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внутриклеточные локальные изменения сопротивления как проявление сопряжения между мембранным потенциалом и состоянием внутриклеточных структур
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сатыбалдина, Назым Капановна

Введение

Обзор литературы

I. УЛЬТРАМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТОЙ

СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ

1) Структура сократительного аппарата

Актин.

Миозин.II

Тропомиозин.

Тропонш.

Роль ионов Са^+ в регуляции сокращения

2) Морфология Т-системы и саркоплазматического ре-тикулума.

П. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВВДЕНИЯ О ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СКЕЛЕТНЫХ

ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТЫХ МЫШЦ.

Возбуждение.

Распространение активации внутрь волокон

Проблема электромеханического сопряжения

Ш. ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ ПРИ

АКТИВАЦИИ СОКРАЩЕНИЯ И РАССЛАБЛЕНИИ.

1У. МЕХАНИЗМ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ.

Модели механизма генерации силы сокращений

Методика.

Результаты исследований

Глава I. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЛОКАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПРОТИВЛЕ

НИЯ (ВЛИС) В ЦИТОПЛАЗМЕ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ЛЯГУШКИ.

Методика снятия мышечных сокращений

Результаты.

Обсуждение.

Глава П. ПРИРОДА СТРУКТУРЫ, ОТВЕТСТВЕННОЙ ЗА ЭФФЕКТ

ВЛИС.

Раздел I.

§1. Исследование эффекта ВЛИС после разрушения Т-системы.

1) Описание метода однородной поляризации

2) Оценка емкости мембраны мышечных волокон

3) Эффект локальных изменений сопротивления в норме и после детубуляции.'.

Обсуждение.

§2. Исследование эффекта ВЛИС при подавлении окислительного метаболизма.

Обсуждение £ . •.

Раздел П. Оценка пространственных особенностей структуры, с которой связан эффект ВЛИС

Раздел Ш. Оценка влияния разрушения цитоплазматических микротрубочек на эффект ВЛИС.

Обсуждение

Глава Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ВЫЯСНЕНИЕ МЕХАНИЗМ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ МЫШЦЫ ЛЯГУШКИ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ СТРУКТУРУ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА ЭФФЕКТ

ВЛИС.

Раздел I.

Методические особенности

§1. Эффект ВЛИС при удалении кальция снаружи

Обсуждение.

§2. Эффект ВЛИС в условиях блокады потенциал-зависимой кальциевой проницаемости.

Обсуждение.

Раздел П. Влияние внешних факторов на величину внутриклеточных локальных изменений сопротивления

§1. Влияние изменения рН омывающего раствора на величину эффекта ВМС.

Обсувдение.

§2. Влияние этилового спирта на эффект ВМС

Методические особенности.

Обсуждение

§3. Влияние изменения температуры раствора на эффект

Методические особенности.

Обсуждение.

§4. Эффект ВМС после денервации.

Методические особенности

Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточные локальные изменения сопротивления как проявление сопряжения между мембранным потенциалом и состоянием внутриклеточных структур"

В настоящее время в электрофизиологических исследованиях широко применяется метод внутриклеточной'инъекции постоянного тока через стеклянный микроэлектрод, введенный в клетку. Метод часто используется с целью измерения электрических характеристик мембраны (постоянной времени, емкости, сопротивления).

Принято считать, что изменение тока, пропускаемого через микроэлектрод, обуславливающее падение напряжения на мембране, вызывает изменение во входном сопротивлении клетки. При этом исходят из допущения, что внутреннее содержимое клетки играет роль пассивного проводника с постоянным сопротивлением, а наблю-емые изменения сопротивления в цепи микроэлектрода являются результатом изменения сопротивления клеточной мембраны. Вероятно, в большинстве случаев это допущение справедливо. Однако впервые Томита ( То4п*£ес, 1965), изучая свойства потенциалов, вызванных световой стимуляцией,- в горизонтальных клетках сетчатки карпа, обнаружил градуальные изменения сопротивления в цепи микроэлектрода, сопровождавшие эти потенциалы, которые не могли объясняться изменением сопротивления мембраны. В опытах Томиты при пропускании постоянного тока через внешнюю пипетку коаксиального микроэлектрода и регистрации потенциалов через внутреннюю пипетку, при одновременных сдвигах мембранного потенциала с помощью включения и выключения света, сопротивление цепи микроэлектрода возрастало в ответ на гиперполяризацию, вызванную световой стимуляцией сетчатки, и снижалось на деполяризацию в темноте. Поскольку эти изменения сопротивления развивались значительно медленнее, чем электрическая реакция горизонтальных клеток на свет, Томита сделал вывод, что они являются не причиной, а следствием изменения мембранного потенциала.

Применяя метод внутриклеточной инъекции тока через отводящий микроэлектрод для поляризации мембраны, горизонтальных клеток, Вызов и Трифонов обнаружили изменения сопротивления в цепи микроэлектрода, также не объяснимые за счет изменения сопротивления мембраны (Вызов, Трифонов, 1973). В этих опытах в некоторых случаях гиперполяризационный.ответ горизонтальных клеток на свет сопровождался повышением сопротивления цепи микроэлектрода на величину до 10-80 МОм. Искусственная гиперполяризация клеточной мембраны также вызывала возрастание, а деполяризация - снижение сопротивления цепи микроэлектрода. Прямыми опытами с двойным микроэлектродом в этой работе было показано, что эти изменения сопротивления происходят не в мембране клетки, а локализуются вблизи от кончика микроэлектрода, введенного в горизонтальную клетку. Авторы предположили, что обнаруженный эффект локальных изменений сопротивления обусловлен "затыканием" кончика микроэлектрода какой-то внутриклеточной структурой, сопротивление которой меняется при изменении мембранного потенциала.

Аналогичный эффект локальных изменений сопротивления во время реакции на световое раздражение удавалось наблюдать Г .

Вызов,7рц<роно& 1973) на мюллеровских (глиальных) клетках сетчатки амфибий. Глиальным клеткам в некоторых случаях присуща способность генерировать медленные деполяризационные отклонения потенциала на включение и выключение света; соответственно, сопротивление цепи микроэлектрода снижалось во время этих деполяри-зационных отклонений.

Из всех этих данных можно сделать вывод: в исследованиях, в которых для измерения сопротивления клеточной мембраны используется отводящий микроэлектрод или второй ствол двуствольного микроэлектрода, необходимо учитывать возможность локальных изменений сопротивления внутри клетки во время ее электрической реакции.

С другой стороны этот эффект представляет интерес с точки зрения проблемы сопряжения процессов, происходящих внутри клетки, с изменением мембранного потенциала. Применение электрофизиологических методов для изучения активности клеточных органелл могло бы представлять значительный интерес для цитологии.

Среди процессов передачи сигнала от поверхностной мембраны внутрь клетки наиболее изученными являются процессы освобождения медиатора из пресинаптических нервных окончаний в ответ на сдвиги мембранного потенциала, электромеханическое сопряжение в мышцах, изменение скорости движения протоплазмы, вызываемое изменениями потенциала на наружной мембране.

Эффект внутриклеточных локальных изменений сопротивления, происходящих в ответ на сдвиги мембранного потенциала, является неизвестным ранее проявляением связи между мембранным потенциалом и процессами внутри клетки. Обнаружение этого эффекта в таких разных клетках как нервные и глиальные (горизонтальные клетки сетчатки глаза и клетки Мюллера) позволяет предположить, что он может быть обнаружен и в возбудимых клетках другого типа. 'Имело смысл, очевидно, исследовать этот эффект на таком объекте, для которого хорошо изучен механизм передачи сигнала от мембраны вглубь клетки. Таким объектом является скелетная мышца, в которой электромеханическое сопряжение является объектом интенсивных исследований. 4

Задачей настоящей работы явился поиск и изучение эффекта внутриклеточных локальных изменений сопротивления в мышечных волокнах.

В диссертации ставились следующие вопросы, которые и выносятся на защиту:

I. Выяснить возможность возникновения в цитоплазме скелетной мышцы эффекта локальных изменений сопротивления в ответ на изменение потенциала наружной мембраны.

П. Если удастся обнаружить эффект локальных изменений сопротивления в цитоплазме скелетной мышцы, попытаться выяснить сущность этого явления и природу структуры, с которой связан этот эффект.

Ш. Исследовать роль внешних факторов, влияющих на свойства эффекта локальных изменений сопротивления, с целью выяснить механизм передачи электрического сигнала с поверхности на структуру, ответственную за данный эффект.

В настоящей работе был сделан подход к решению этих задач. Впервые обнаружен и качественно исследован эффект локальных изменений сопротивления в цитоплазме скелетной мышцы лягушки при изменении потенциала поверхностной мембраны.

Проведено исследование стерических особенностей структуры, ответственной за эффект локальных изменений сопротивления, позволившее оценить ее размеры. Эксперименты по идентификации структуры, с которой связан данный эффект, позволили сделать предположение относительно ее природы.

Результаты проведенных исследований доложены на УШ (Москва, 1977) и IX (Москва, 1978) конференциях молодых ученых биологического факультета М1У и опубликованы в виде статей (Трифонов, Саты-балдина, Каменская, 1979; Сатыбалдина, 1982; Трифонов, Сатыбалди-на, Каменская, 1982 а, в).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Еще в прошлом веке мышечное сокращение пытались объяснить на основе морфологической картины изменений поперечной исчер-ченности, наблюдаемой с помощью светового микроскопа. Однако только в настоящее время с помощью электронно-микроскопических, рентгенографических, иммунохимических, оптических, электрофизиологических и многих других методов исследования стало возможным, наконец, приблизиться к выяснению таких проблем, как электромеханическое сопряжение и молекулярные механизмы мышечного сокращения.

I. УЛЬТРАМИКРОСК ОПИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТОЙ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ

II Структура сократительного аппарата

Мышца состоит из множества параллельных мышечных волокон диаметром от 10 до 100 мкм (Шмидт-Ниельсен, 1982) и длиной от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Волокна, в свою очередь, состоят из более тонких фибрилл диаметром I мкм ( 9 1969). В волокне имеются хорошо развитые митохондрии, овальные ядра, лежащие, как и митохондрии, между мио-фибриллами, агранулярная эндоплазматическая сеть (называемая здесь саркоплазматическим ретикулумом).

На продольных срезах через миофибриллу можно видеть чередующиеся темные и светлые полосы, так называемые анизотропные и изотропные диски (А и 1-диски). Полосы расположены в разных миофибриллах на одинаковом уровне, что и создает характерную

-то поперечную исчерченность волокна. В центре А-диска видна светлая зона Н, зависящая от степени сокращения мышцы, и более темная М-полоса. В центре 1-диска отчетливо заметны плотные & -линии.

Единицей структурной организации миофибрилл является сарко-мер - область между двумя линиями & , регулярно повторяющаяся через каждые 2,5 мкм в расслебленной мышце (Шмидт-Ниельсен, 1982).

Миофибриллы состоят из тонких и толстых филаментов. Тонкие филаменты начинаются от % линий и идут от них в обе стороны сар-комера; в промежутки между их конечными участками входят толстые филаменты. С помощью электронного микроскопа (ММиЛ'&у , 1963; Р<б^е, 1964) были установлены размеры актиновых и миозиновых филаментов: длина миозиновых нитей 1,6 мкм, диаметр 120 А°, длина актиновых нитей от одного конца до другого 1,95-2,0 мкм, диаметр 80 А , 1963,' ё^яА^ ЖаЛ у 1969). Толстые филаменты, определяющие анизотропию А-дисков, состоят из продольно ориентированных молекул миозина. Тонкая нить скелетных мышц позвоночных состоит из актина в фибриллярной форме, тропомиозина и тропонина. Структуре тонкой нити соответствует молярное отношение тропомиозина, тропонина и глобулярного актина, равное 1:1:7 ((/к(епг , Шоииа^, 1973).

Актин

Актин присутствует во всех сократительных системах позвоночных. Молекулярный вес актина 60 ООО. В мономерной или глобулярной форме актин представляет собой молекулы диаметром 55 1 {&-актин). В тонких нитях актин представлен в полимерной форме в виде длинных двойных "суперспиралей" (фибриллярный, или Ф-актин) из двух нитей, закрученных одна вокруг другой. Полимеризация актина протекает с гидролизом АТФ. Согласно данным рентгенодифракционного метода расстояние между точками пересечения двух нитей равно

О О

360 А, что соответствует шагу двойной спирали в 720 А 1967). Число "бусинок" актина в витке суперспирали равно 13 (Бендолл, 1970).

Миозин

Миозин представляет собой глобулярный белок с молекулярным весом 420 ООО (Поликар, 1976). Молекула миозина, как и тропомио-зина, содержит большое число кислотных и основных аминокислотных остатков, что создает большой заряд молекулы в отличие от молекулы актина, заряд которой невелик (Бендолл, 1970). Средняя длио О на молекулы 1500 А. Она состоит из "хвоста" длиной 1300 А и шириной 20 А и "головы" длиной 200 'А и шириной' 40 А ( Н. Ни* 1963). В " голове" расположен ферментативный центр расщепления АТФ и центр связывания с актином. Путем гидролиза с помощью трипсина миозин расщепляется на легкий меромиозин (ЛММ) и тяжелый меромиозин (ТММ). ТММ расположен в области "головы" и частично в "хвосте" и сохраняет ферментативную активность, влияющую на АТФ ( 1966). ЛММ сосредоточен в прямой хвостовой области, похож на миозин, но не имеет АТФ$азной активности и не связывается с актином. Молекулярный вес ТММ - от 230 000 до 320 000, ЛММ - 100 000. Дальнейшее ферментативное действие трипсина на ТММ приводит к образованию субфрагмента-1 (С-1) с молекулярным весом около 120 000, занимающим часть "головы" миозина ( А^ау --(л/ь , Же^-Щ , 1967). В результате папаинового протеолиза вместе с "головой" отщепляется фракция ТММ, субфрагмент-2 (С-2), представляющая участок "хвоста" и имеющая вид стержня с молекулярным весом 60 ООО (МьуЬл- , , 1967). По своему строению ЛММ близок к тропомиозину. Фракция ЛММ состоит из двух полипептидных цепей, зак^енных одна вокруг другой в «^-спиральной форме, с образованием "спирализованной спирали" ( о

1966). Длина цепей ТММ варьирует от 500 до 700 А (Бендолл, 1970). Во фракции ТММ содержится мало спиральных участков и большая часть их сосредоточена в области "шейки" и остатка "хвоста", а "голова" совсем не содержит спиралей, а представляет собой глобулярный белок ( , 1966). Было показано {Мси/^ , -Ш-ву , 1967), что молекула миозина имеет две головы, расположенные рядом на оси молекулы.

Структура толстой нити, состоящей из миозина, хорошо изучена ( НомЛО**» 1971). Толстый филамент биполярен, что объясняется наличием двух типов упаковки молекул миозина. В'центральной части филамента молекулы миозина упакованы биполярно, т.е. по типу "хвост к хвосту"^ к образуя "голую зону". Эта часть филамента соответствует зоне Н и линии М в А-диске. По обе стороны от центра молекулы ассоциированы полярно, т.е. по типу "хвост к голове". В такой структуре "хвосты" миозиновых молекул, образованные ЛММ-частями, упакованы внутрь нити, тогда как "головы" (ТММ-части) направлены наружу, образуя выступы на поверхности нити. Выступы играют роль поперечных мостиков между актиновыми и миозиновыми нитями в мышце. Методом дифракции рентгеновских лучей было показано, что поперечные мостики расположены попарно о с субъединичным периодом 143 А, и каждая пара повернута относительно другой на 120°, т.е. расположена спирально вдоль нити. о

Осевой период поперечных мостиков 429 А, и каждый мостик ("голова") выступает на 135 А от центра нити (НМшс&у, ?

1967).

Тропомиозин

Тропомиозин - один из регуляторных белков мышечного сокращения. Молекула его длинная и тонкая, стержнеобразная, состоит из двух оС -спиральных полипептидных цепей, свитых в сверхспираль. По своей длине одна молекула тропомиозина соответствует семи мо-' лекулам актина. Молекулярный вес тропомиозина 53 ООО, длина моо о лекулы 400 А, диаметр спирализованной спирали 8-13 А (Поликар, 1977; Вазина и др., 1977). В тонком филаменте молекулы тропомиозина ассоциированы по типу "конец к концу". Было показано {НЛщс 1972; Ра,г'1у , 1973), что тропомиозин локализован в двух длинных канавках двойной спирали Р-актина. В регуляции мышечного сокращения функция тропомиозина состоит в посредничестве тормозной активности одной из субъединиц тропониня в отношении МАТФ-азы миозина в отсутствие или при низких концентрациях "ионов Са^+ ( , 1968). Существенной функцией тропомиозина является также способность связываться с актином и тропонином. В актин-связывавдей регуляторной системе позвоночных эта функция тропомиозина может рассматриваться как первичная по отношению ко вторичной функции посредничества тормозной активности тропонина {Иа^аЛ^ , , 1978).

Тропонин

Тропонин - глобулярный белок с молекулярным весом около 80 ООО. Как первоначально было предположено Эбаши, а затем подтверждено другими авторами ( е£ а1 , 1969; ОЫ^-ЬС , ШаЛь

-14, 1972), тропонин локализован на тропомиозиновых о тяжах в тонких филаментах с интервалами 390 А. На основе косвенных данных Эбаши предложил следующую схему действия тропонина в регуляции мышечного сокращения ( ЁёсжЬс 1969): I) тропонин действует на актиновую нить через тропомиозин; 2) действие тропонина состоит в подавлении взаимодействия миозина-актина-АТФ в отсутствие ионов Са; 3) Са устраняет это подавление и в результате происходит сокращение. Исследованиями разных авторов было установлено (Ил^сЬА^аи^^ } 1972; , 1972), что тропонин состоит из трех субъединиц, названных ТНТ, ТНИ и ТНС. Показано, что ТНТ обладает сродством к тропомиозину и присоединяет й нему и тем самым к актину всю остальную часть тропонина. ТНИ ингибирует Ма^+-стимулируемую АТФ-азную активность

2+ актомиозина. ТНС связывает Са и регулирует ингибирование, производимое компонентом ТНИ. Ингибирование наступает только при низком уровне Са^+. Поэтому комплекс тропонина с тропомиозином принято считать регуляторной системой, управляющей сокращением в зависимости от уровня свободных ионов кальция.

Для понимания механизма действия тропонина- необходимо определить участки его прикрепления к тонким нитям. Последнее в свою очередь невозможно без знания взаимодействия отдельных тропонино-вых субъединиц с комплексом тропомиозина и Ф-актина. Различные типы взаимодействия субъединиц тропонина между собой и актином, или тропомиозином, на которых основана регуляция сокращения, изучались разными авторами (А, , 1974; УасЛ^-к 1975; НлЫЬесЛ , 1975} Подлубная и др., 1977; ¿/¿г/ ^ 1978) и сейчас имеются подробные данные об этих взаимодействиях. С физиологической точки зрения, однако, еще не достигнуто ясного понимания (

Мс^&г , 1980).

Одзуки (ОкЬг^Лс, 1979) продемонстрировал, что химотрипсин путем мягкого протеолиза расщепляет скелетный ТНТ на два субфрагмента ТНТ-]- и ТНТ2 с молекулярным весом 22 ООО и 13 ООО соответственно. Аминокислотный анализ этих субфрагментов показал, что ТНТ^ и ТНТ2 фрагменты являются А/ - и С-терминалью соответственно. //-терминаль является слабо кислой, а С-терминаль сильно основной.

Иммуноэлектронная микроскопия показала, что субъединицы тропонио на ТНС, ТНИ и ТНТ распределяются через каждые 380 А вдоль тонкого филамента фкЬг^^ , 1975), что было показано также путем использования антител ко всему тропонияовому комплексу фкЬгСсЛс^ 1974). Одзуки фкЬ^Лх , 1974) показал, что антитела к ТНС и ТНИ образуют одну поперечную полосу вдоль тонких филаментов, а антитела к ТНТ образуют пару полос в каждом периоде. Позднее Одзуки {ОкЬиЛл , 1979) установил, что эти две полосы обусловлены разными субфрагментами молекулы ТНТ и предположил пространственное разделение этих субфрагментов в пределах молекулы ТНТ: ТНТ2 о располагается в 270 А от верхушки тонкого филамента и совпадает о с положением тропонинов С и И, а ТШ^ располагается в 130 А от ТНТ2 в направлении линии. Методом гельэлектрофореза Котояма ( ¡Со^оусйШ', 1979) показал, что субфрагмент ТНТ]- обладает специфическим сродством к тропомиозину, а субфрагмент ТНТ2 обладает сильным сродством к ТНС, ТНИ и тропомиозину. Функциональное раз--личие в пределах молекулы ТНТ должно учитываться при построении модели тропонинового комплекса.

Разделение тропонина Т на субфрашенты способствовало дальнейшему пониманию взаимодействия между субъединицами тропонина, а также между ними и актином, а также тропомиозином. В таблице перечислены эти типы взаимодействий и их физиологическое значение , 1980).

Таблица

Взаимодействие субъединиц тропонина, актина и тропомиозина

Взаимодействие

I-C (Са-зависимое) I-C (независимое от Са)" I-T (Т2) I-A I-TM

ТМ-Т (Tj, т2) J

С-Т (Т2)

Физиологическое значение наиболее решаклцее V существенное не существенное

А - актин; ТМ - тропомиозин; I, С, Т - тропонины I, С и Т; Тр Т2 - химотрипсические продукты протеолиза тропонина Т.

Подчеркивалось (Е&ььЬи , 1974), что взаимодействие тропо-нинов С и Т не считается существенным для регуляции сокращения, потому что хотя такое взаимодействие и отмечается для скелетного тропонина, для сердечного тропонина оно является слабым.

Взаимодействия среди субъединиц тропонина, тропомиозина и актина, существенные для Са-регуляции сокращения можно представить в виде схемы {ЫакЬс , 1980):

Са2+ (-)

Т-ТМ

•I ——А—

Са2+ (+)

•АI тм tr—^k \ /

На этой схеме А - актин; ТМ - тропомиозин; С, I, Т - тро-помиозин С, I и.Т. Са2+(-) и Са^+(+) означают отсутствие и присутствие Са'в среде и соответствуют состояниям расслабления и сокращения, соответственно. Схема обобщает представления о взаимодействиях, важных с физиологической точки зрения. Взаимодействия наибольшей значимости в отсутствии или присутствии Са^+ показаны утолщенной линией.

Известно, что фазная скелетная мышца имеет четыре места „ 2+ связывания Са , два с высоким сродством и два с низким сродством для Са2+ {ЫсыМ Жа1 , 1968; , , 1975). Считается, что места высокого сродства, имеющие также высокое сродство и для отличаются от мест низкого сродства, и что только последние, ответственны за регуляцию сокращения (РоШк-^ , 1975).

Роль ионов Са2+ в регуляции сокращения

Большинство авторов отдает предпочтение механизму стеричес-кого блокирования сокращений, в котором основное внимание обращается на положение тропомиозина в разные стадии цикла. Было показано (Н-Ник&у. , 1972; Нсц^^сО^е- , 1972), что тропомиозин 2+ изменяет свое положение в зависимости от уровня Са в среде. В состоянии расслабления тропомиозин находится в положении, более отдаленном от "канавки", закрывая на актиновой нити участки взаимодействия с миозином. В состоянии активации связывание Са + с ТНС вызывает перемещение тропомиозина вглубь "канавки" Г-акти-на, что освобождает на актине участки связывания с миозином.

Другой механизм ингибирования взаимодействия актина и миозина в отсутствие Са2+ предполагает конформационные изменения актиновых молекул; увеличение в жесткости актиновых нитей препятствует взаимодействию с миозином и приводит к "ингибированной" форме актина {Оо&Ша, 1975).

2. Морфология Т-системы и саркоплазматического ретикулума

Помимо сократительной системы белков, поперечнополосатые скелетные мышцы содержат две внутренние мембранные структуры -саркоплазматический ретикулум (СР) и тубулярную систему (Т-сис-тему). СР - это продольно ориентированная система сообщающихся цистерн, трубочек и везикул, ответственная за накопление и регуляцию уровня Са2+ в саркоплазме {Poïtfrt , PoUadt t 1957). Т-сис-тема представляет собой впячивания плазмолеммы, идущие внутрь волокон в виде сети поперечных трубочек, каждая диаметром 400-о

500 А, на уровне % -линий у лягушек, а у млекопитающих - на уровне мест соединения А- и I-дисков {Po'ib/c , Paicuit , 1957; Бен-долл, 1970). Структура СР и Т-системы фазного скелетного волокна лягушки была изучена Пичи ( , 1965). Согласно схеме Пичи, в центре саркомера на уровне А-диска локализованы плоские цистерны с небольшими круглыми отверстиями. Эта структура называется "продырявленный воротничок" ( ^cuyfctA&d' фМсиг, ). По обе стороны от плоских цистерн по направлению к краям саркомера тянутся продольные каналы СР в виде трубочек. У краев саркомера продольные каналы сливаются, значительно расширяются и образуют терминальные цистерны. Терминальные цистерны, как и поперечные трубочки соседних саркомеров, в отдельных случаях могут связываться друг с другом путем анастомозов и ветвлений в продольном и радиальном направлении (Кроленко, 1975). Однако в литературе нет данных о прямой морфологической связи между Т-системой и СР. Как Т-система, так и СР непрерывны в поперечном направлении на большей части диаметра волокна {А,Ник&у , 1959; Кроленко, 1975). В результате они образуют непрерывную сеть, через которую проходят миофибриллы.

Терминальные цистерны и трубочки Т-системы образуют трех-компонентную структуру, названную триадой (Яз^г- ,Ра1ои$£ ,1957), которая у амфибий выявляется на продольных и поперечных срезах через волокно в области £ -линий.

Опыты с проникновением крупномолекулярных маркеров (ферри-тин^пероксидаза) внутрь Т-системы позволили сделать вывод, что полость Т-системы сообщается с внешней средой, причем маркеры обнаруживаются только в полости трубочек, но не в СР (Кроленко, 1975). Полость трубочек заполнена внеклеточной жидкостью, а концентрация катионов равна аналогичной во внешней среде {Вшсу , А($л1<ш,, 1973). Фиксированные отрицательные заряды на стенках трубочек способствуют снижению концентрации анионов, в частности С£~ в полости трубочек ( (Ьа^изроъб , 1969). Отверстия Т-системы в фазных волокнах лягушки имеют диаметр 500-2000 А ( СаМьЯ -Ьь^НаЖк, 1970).

Т-система занимает в волокнах лягушки объем, равный 0,13 %, а СР - 13 % от общего объема волокна (Кроленко, 1975). В связи с проблемой передачи сигнала с Т-системы на СР структура триад-ного соединения привлекает внимание исследователей. Согласно данным Франзини-Армстронг (} 1970) триадное соединение в фазных волокнах лягушки характеризуется параллельным о расположением мембран Т-системы и СР на расстоянии 120-140 А друг от друга, фестончатостью мембран СР и наличием регулярно расположенных "мостиков"между мембранами. "Мостики" представляют собой выступы мембраны СР, расположенные двумя параллельными ряса дами с расстоянием между их центрами 400-500 А, причем в контакте с "мостиками" находится только 30 % поверхности Т-системы. "Мостики" представляют собой скопления электронноплотного материала. Кончики выступов СР не достигают Т-системы, а отделяются о от нее щелью в 50 А, заполненной аморфным веществом. Собственно "мостиками" называют выступы СР и аморфное вещество щели

1970). Ширина "мостиков" 120-140 А, и повторяюто ся они через кадцые 300 А.

П. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ О ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СКЕЛЕТНЫХ ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТЫХ МЬВД

Возбуждение .

Мышечные волокна являются электровозбудимыми клетками, и первая ступень в активации сокращения в норме включает потенциал действия (ЦД), возникающий, когда разность потенциалов мембраны фазных волонон уменьшается от -90 мВ (потенциал покоя) до -50 мВ (порог сокращения) (, 1960). ЦД, генерируемый мышечным волокном, распространяется в обе стороны к концам волокна и радиально вглубь мышечного волокна через Т-систему.

Если мышечное волокно активируется прямой деполяризацией с помощью повышенной концентрации ионов калия в растворе, то речение нескольких секунд мышца сокращается с последующим спонтанным расслаблением несмотря на продолжающуюся деполяризацию. Активация электромеханического сопряжения (ЭМС) для развития максимального механического напряжения происходит в случае фазных волокон при МП -20 мВ , МоъеиЛеЬ , 1960).

Распространение активации внутрь волокон

Существование специфического механизма, проводящего возбуждение внутрь волокна и локализованного на уровне Ъ-шннйв фазных волокнах амфибий, было показано в экспериментах: с локальной стимуляцией постоянным током через микропипетку различных участков саркомера ^^.Им^&^.^ос^Сох^ , 1958). Структурой, ответственной за распространение возбуждения внутрь волокна, является поперечная тубулярная система. В настоящее время общепризнанным считается активный механизм распространения сигнала по Т-системе ( (ицс&д, 1971). Было показано, что электрическая проводимость в поперечных тубулах является регенеративным процессом, качественно сходным с таким же процессом в поверхностной мембране ( Св^сиЛли, , 1975). Известно, что ПД в поперечных тубулах необходим для нормальных сокращений в мышце лягушки при 20 °С, но: менее важен при низких температурах (

1974). Это объясняется тем, что при низких температурах продолжительность ПД увеличивается, а длительная деполяризация поверхностной мембраны увеличивает эффективность пассивной деполяризации, распространяющейся вдоль тубул.

Проблема электромеханического сопряжения

По современным представлениям следующие процессы приводят сократительные элементы в состояние активности ( ^^

1968; Шмидт-Ниельсен, 1982): I) генерация ЦЦ в сарколемме и распространение деполяризации внутрь мышечного волокна по Т-системе; 2) освобождение Са^+ из саркоплазматического ретикулума; 3) диффузия Са^+ к тонким филаментам; 4) связывание Са^+ тропонином, который претерпевает конформационное изменение, позволяющее тро-помиозину сойти со своей блокирующей позиции на актиновых тяжах; 5) взаимодействие между актином и миозином, включающее в себя а) образование поперечных мостиков к актиновым тяжам головками толстых.филаментов, содержащих комплекс миозин-АТФ, б) поворот поперечных мостиков при гидролизе АТФ и образовании свободного АДФ. Процессы I и 3 не являются лимитирующими в формировании сократительного ответа, т.к. длительность ЦЦ и распространение волны деполяризации внутрь волокна занимает несколько мсек, а время диффузии ионов Са^+ на расстоянии порядка I мкм составляет около I мсек. Прямых экспериментальных доказательств лимитирующей функции процессов 4 и 5 пока нет. Основным лимитирующим фактором при формировании сократительного ответа считается процесс 2. Это показано при инъекции мурексида в живую мышцу О^Соккоъ- , 1966).

Механизм, посредством которого изменение потенциала на мембранах Т-системы в области триадного контакта вызывает выброс ионов Са из СР, остается пока неизвестным. Возможно несколько объяснений этой связи.

I). Чисто электрический процесс: изменение МП Т-системы может непосредственно изменять МП терминальных цистерн в области их контакта ( Ё^а^ЬС €<£ , 1969). Франзини-Армстронг (

- , 1970) рассматривает два механизма электрической связи в триадах: а) путь с низким сопротивлением связи, с помощью которого может иметь место прямой ионный ток, б) емкостная связь между СР и пространством Т-системы ЯлеиА^ , 1969).

Рассматривая первую гипотезу, целесообразно сравнить структуру триадного соединения с межклеточным контактом, который отличается высокой проницаемостью для ионов. При ближайшем сравнении можно видеть, что структура триадного контакта значительно отличается от всех известных межклеточных контактов (Беркинблит и др., 1981), таких как: а) "щелевой контакт" ( ej&ft J-uu&kfrH- ), Где расстояние между клетками 20-40 А, в) "плотный контакт" ("itfyfoi^uuetc -dir ), где внешние мембраны соседних клеток сливаются друг с другом и с) "септированный контакт" ^¿¿¿tz&M*- ), в о котором межклеточное пространство шириной в 150-170 А пересека0 ется септами толщиной в 40-50 А. Триадное соединение также не подходит и для емкостной связи, которая требует, чтобы два проводника находились в тесной близости на большой площади, что не выполняется в триадах. В контакте с "мостиками" находится, как уже упоминалось, только 30 % поверхности Т-системы, а расстояние межо ду проводниками в триадах также слишком велико, около 260 А с учетом толщины мембран ( ^«^Vfe»^^, 1970).

Исходя из особенностей строения, Франзини-Армстронг считает, что электрическая связь в триадах маловероятна.

2). Существует предположение об аналогии между структурой нервно-мышечного синапса и "внутреннего синапса" в области триадного контакта. Согласно гипотезе Бианэи ( (kcuieJu- , , 1967), изменения проницаемости мембран GP к ионам Ca, происходящее в момент возбуждения, может быть вызвано неидентифицированным веществом, высвобождающимся из Т-системы. Задержка во времени, обусловленная диффузией медиатора, должна быть в пределах времени, требуемого для связи процессов возбуждения с сокращением, поскольку диффузия адетилхолина через нервно-мышечный синапс, область которого в 10 раз шире, занимает I мсек 1965).

3). Триггерная природа механизма, управляющего выбросом Са из СР: изменение потенциала на Т-системе повышает проницаемость ее мембран для ионов Са2+, последние входят из внешней среды внутрь волокна в области терминальных цистерн. Это активирует 2+ систему выброса Са и вызывает выход из ретикулума такого коли отчества Са , которое достаточно для активации миофибрилл. На пре^ паратах скинированных волокон (

Ь , 1972) показано, что увеличение концентрации ионов Са2+

2+ в наружном растворе облегчало высвобождение Са из ретикулума. Некоторые авторы полагают, что поток внешнего Са2+ внутрь во время ЦД является возможным механизмом* контролирующим высвобождение Са2+ из СР и в интактной мышце (ФсгсЛ, , 1972; в^шшш^

Цскл , /Ы&1еи<£ , 1973). Однако имеется много фактов, опровергающих эту гипотезу. Так, мышечные сокращения могли наблюдаться при понижении наружной концентрации Са2+ посредством ЭГТА до Ю"9 К ( е£а£ , 1972). Прямые измерения кальциевых ответов в живой мышце путем инъекции в нее индикатора кальция красителя арсеназо Ш показали, что высвобождение Са2+ из СР практически не менялось в условиях удаления или снижения содер-* •жания Са2+ в наружной среде ( УКьвик, ^ , 1977).

Таким образом,"индуцированное кальцием высвобождение Са как механизм электромеханического сопряжения в физиологических условиях в скелетных фазных мышечных волокнах представляется мало возможным, однако для тонических волокон такой путь активации не исключен ( ^ос&Л^ , 1970).

4). Существует предположение, что причиной высвобождения Са является деполяризация мембран ретикулума в ответ на деполяризацию поверхностной мембраны (¿М&сиь ь //дМц'сУил- , 1974; 1977). Аналогичный механизм высвобождения Са2+ был предположен и для препаратов скинированных мышечных волокон (И/лЛ^-Жйо 1973), а также фрагментов изолированного саркоплазмати-ческого ретикулума (ФОР) (/йгЖс ¡ТШуемлМь | 1976), когда деполяризацию вызывали путем изменения ионного состава среды: замена аниона метаносульфоната на анион хлора вызывала поток ионов С£~ внутрь мембран ретикулума, деполяризацию мембран СР и высвобождение ионов Са2+. Однако недавно было показано {Лот^^о Ы, 1977), что состав электролитов в полости СР не соответствует гипотезе о деполяризации, вызывающей высвобождение Са. Тем не менее Эбаши ) считает эту гипотезу наиболее возможным физиологическим механизмом.

Некоторые авторы (Шшмк , ^ К^нй^ } 1976. ?

1979) считают, что высвобождение Са из ФСР при изменении ионного состава среды объясняется не деполяризацией, а скорее осмотическими эффектами. Билер ( л/ , 1979) показал, что создание отрицательного внутрь направленного потенциала на мембранах изолированных везикул СР не вызывает высвобождения ионов Са^+. Кошита и Хота (

КоЖсЫ,, КМси , 1981), используя флуоресценцию красителя цианина для регистрации изменений МП, и, изменяя ионный состав среды для вызова высвобождения Са2+ из ФСР скелетной мышцы лягушки,не обнаружили прямой связи между деполяризацией мембраны и высвобождением Са2+. При замене К-глюконата в среде на трис-глюконат наблюдался значительный отрицательный внутрь направок. ленный потенциал, однако высвобождения Са не наблюдалось. С другой стороны, замена К-глюконата на КС£ вызывала значительное выо, свобождение Са^" из ФСР при небольшом изменении МП. Добавление сахарозы к отмывающему раствору КС& тормозило высвобождение Са^+ из ФСР. Эти результаты означают, что высвобождение Са^+ из

ФОР путем изменения ионного состава среды обусловлено осмотическим эффектом.

Представленные здесь факты однако не доказывают, что индуцируемый деполяризацией механизм высвобождения Са2+ не может действовать в интактной мышце. Поскольку препараты ФСР содержат различные компоненты СР (продольные каналы, терминальные цистерны, поперечные трубочки), необходимы дальнейшие исследования с использованием различных частей ретикулума, чтобы понять механизм высвобождения

5). Появилась гипотеза электромеханической связи, основанная на возникновении ассиметричных токов смещения, или иначе, подвижных зарядов, в структуре триадного контакта в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны {Лслбсс&^с- , СЛ&^сМ^с , 1973; Алмерс, 1981). Эти токи смещения вызывают открытие гипотетических кальциевых каналов в мембране СР и выброс ионов Са2+ в миоплазму в ответ на деполяризацию, и закрытие кальциевых каналов при реполяризации наружной мембраны. Было предположено ( САвии^-^ , 1976; , 1976), что щель в области триадного контакта пронизана длинными макромолекулами, один конец которых реагирует на тубулярный МП, а другой - открывает или закрывает Са2+ каналы. Существуют некоторые факты предполагающие, но не доказывающие роль подвижных зарядов в регуляции внутриклеточного освобождения ионов Са^+ и мышечного сокращения (Алмерс, 1981): I) количество смещаемого заряда достаточно велико и зависит от потенциала, 2) ряд факторов тормозит как движение зарядов, так и мышечное сокращение при деполяризации наружной мембраны, 3) измерение порогов мышечного сокращения показало, что существует определенная корреляция или даже совпадение между стационарными и кинетическими свойствами предполагаемого кальциевого канала в мембранах саркоплазматического ретикулума и подвижным зарядом как функции потенциала.

Ш. ИЗМЕНЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЫМЯ ПРИ АКТИВАЦИИ СОКРАЩЕНИЯ И РАССЛАБЛЕНИИ

В настоящее время хорошо установлено, что активация сокращения в скелетных мышцах осуществляется при высвобождении ионов Са^+ из ретикулума в саркоплазму ( 1968). Присутствие аккумулированного кальция в продольных каналах СР и терминальных цистернах было установлено с помощью электронного микроскопа в препаратах, включавших осажденный оксалат кальция, или радиоавтографически с изотопом кальция

Са45 ( 1966).

Анализируя радиоавтографические картины саркоплазматического ретикулума (1970) пришел к выводу о пространственном разграничении участков преимущественного выброса (терминальные цистерны) и аккумуляции (продольные трубочки СР) ионов Са.

В состоянии покоя концентрация ионов Са в саркоплазме сос7 ставляет около 10 М, что ниже порога активации сокращения. При деполяризации мембраны происходит повышение проницаемости мембран ретикулума к ионам Са и выброс их в саркоплазму. В результате этого концентрация Са^+ повышается в 5-10 раз, что достаточно ' для активации сокращения {АаиД&и/, 1965). Согласно данным, полученным на скинированных волокнах, пороговая концентрация для

7 2+ вызова сокращений равна около ЮМ Са, а максимальная активация достигается при Ю~6 М Са2+ ( 1980).

Прямые доказательства того, что деполяризация мембран ретикулума существует и вызывает освобождение ионов Са2+ из СР, отсутствуют. Однако существуют косвенные доказательства, а именно, повышение внутримышечной концентрации ионов Са, обнаруженное путем измерения кальциевых потоков в живых мышцах при использовании индикаторов кальция флуоресцентного белка экворина {ЛлЖЛу, ^а^иИХ^, 1970), красителя арсеназо Ш (

Изучение зависимости кальциевого ответа от МП в одиночных скелетных волокнах лягушки с помощью арсеназо Ш показало, что высвобождение Са2+ из СР начинается при -40 мВ и постепенно достигает максимума при ю мв ( ыг&Л и а1, 1977). Градуальность кальциевого ответа на МП означает, что высвобождение Са из СР, вероятно, не является регенеративным процессом. Зависимость между степенью активации и эмиссией света экворином в одиночных мышечных волокнах амфибий была изучена Блинксом (И&нЖь , 1978). Было предположено, что изменения реакции экворина отражают изменения в высвобождении и поглощении Са ретикулумом во время серии последовательных одиночных сокращений с частотой стимуляции 5 Гц. Наблюдавшееся постепенное уменьшение амплитуды лю-минисценции экворина отражало прогрессирующее уменьшение количества Са^+, высвобождаемого из СР при следующих друг за другом сокращениях, а одновременно возраставдее замедление спада ответа экворина, по-видимому, отражало постепенное замедление удаления кальция ретикулумом.

Влияние длины волокна на высвобождение Са^+ и механические ответы также было изучено Блинксом с соавторами ( В&нЖл 1978), которые показали, что ответ экворина во время тетануса при 50 Гц был максимальным в саркомерах длиной около 2,4 мкм и значительно уменьшался в саркомерах большей длины. Аналогичные результаты были получены ими в опытах с одиночными сокращениями, в которых максимальные ответы экворина в разных волокнах наблюдались в саркомерах длиной от 2,4 до 3,0 мкм. Эти результаты предполагают, что в саркомерах большой длины высвобождается меньшее п количество кальция. Механизм этого уменьшения выброса Са неизвестен, но оно может быть вызвано обратимым изменением структуры триадного контакта.в ответ на растяжение волокон, что отражается на выбросе Са2+.

Многие вопросы, связанные с активацией сокращений и выбросом ионов Са2+ еще требуют разрешения. Так, на основании измерения продукции теплоты, выделяющейся при сокращениях, допускалось, что процесс активации не зависит от длины волокон, что противоречит данным Блинкеа ( &&иЖ ded , 1978).

Задержка в освобождении Са2+ из CP, по данным Миледи , 1977), составляет от 1,8 до 2,3 мсек. Было показано в экспериментах с использованием экворина (, t Л

1970), что повышенная концентрация ионов Са сохраняется в cap

Г\ коплазме недолго. При инъекции ионов Са в живые волокна с кон7 центрацией в саркоплазме 5-10-10 М через 20 сек после сокращерасслабление (Po-ifeM, 1964). ния всегда наступало Таким образом, сразу после выброса ионов Са2+ из СР их уровень в саркоплазме снижается до значения ниже порога активации сокра-ния и начинается их обратное поглощение ретикулумом.

В фазных волокнах расслабление наступает, несмотря на продолжающуюся деполяризацию - так называемое "адаптационное расслабление". В медленных волокнах расслабление происходит пропорционально снижению деполяризации наружной мембраны. Скорость расслабления определяется рядом факторов: количеством выброшенных из СР ионов Са2+, скоростью их аккумуляции,соотношением сродства к кальцию тропонина и саркоплазматического ретикулума ( , кЖо , 1968).

Остается необъясненным тот факт, что активная аккумуляция кальция СР в изолированные везикулы и скинированные волокна происходит в меньшей степени, чем это требуется для объяснения расслабления ( , 1977). Функциональная роль калыщйсвязываю-щих белков парвальбумина и кальцийкустерина в саркоплазме остается пока неизвестной 1980).

Реаккумуляция ионов Са2+ саркоплазматическим ретикулумом осуществляется против химического градиента, посредством гидролиза АТФ, и происходит с помощью специальной транспортной АТФл азы, активируемой ионами Са и расположенной в мембранах ретикулума ^еммли 1973). Было показано, что гидролиз одной молекулы АТФ сопровождается переносом двух ионов Са^+ ( Щш- ЫсЖ, 1966). Эффективность аккумуляции Са определяется, таким образом, соотношением входа и выхода Са + из СР. Направление и интенсивность процесса зависят от соотношения констант сродства к Са^+ системы переноса по обе стороны мембраны. Величина градиента Са^+ в СР определяется, по-видимому, этими же константами (Ритов, 1972).

В настоящее время остается неясным, является ли кальциевый насос электрогенным или электронейтральным. Кроме того, существует определенная сложность при переносе выводов, полученных л УсЫо на фрагментированном саркоплазматическом ретикулуме, на процессы в живой мышце. Билер ( ¿¿¿г/, 1979) полагает, что во время аккумуляции Са^+ ФСР не происходит изменений потенциала мембран ретикулума. С другой стороны, флуоресцентными исследованиями с помощью красителя цианина на ФСР было показано мДйг- , 1981), что поглощение Са2+ ретикулумом связано с созданием положительного направленного внутрь потенциала. Причиной создания МП может являться электрогенный кальциевый насос. Поскольку добавление в среду ваяиномицина, нигерицина и замена С2-" на глюконат" воздействовали на создание МП, Кошита и Хотта (. КожЬсЫг , Н^&Ъ' , 1981) сделали вывод, что поглощение Са^+ ФСР сопровождается выходом К+ и (или) входом Сдля частичной компенсации электрогенного потенциала, создаваемого аккумуляцией Са2+.

17. МЕХАНИЗМ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

Мышечные волокна укорачиваются путем скольжения толстых филаментов относительно тонких, при этом поперечные молекулярлинийни у ные связи между ними перестраиваются и расстояние между . .я уменьшается ( ¡-¡.Нхцс&у , 1969). При сокращении мышцы длина' тонких и толстых филаментов не изменяется (/¿/йи*1^ } 1954; Л.НмК'О^ , 19Б7). Модель скольжения нитей подтверждается электронными микрофотографиями филаментов на разных стадиях сокращения. Сила, развиваемая мышцей, зависит от степени перекрывания филаментов, что также подтверждает модель скользящих нитей. Цикл сокращения состоит из периодического замыкания и отсоединения поперечных мостиков между тонкими и толстыми филаментами. Предполагается, что во время сокращения миозиновые головы прикрепляются к тонким филаментам под определенным углом; тонкие филамен-ты испытывают конформационное изменение, в результате этого угол поперечных мостиков изменяется и они тянут тонкую нить вдоль толстой ( Н^Шм-Ои/ , 1973). Поперечные мостики на противоположных концах от свободной от мостиков зоны Н в середине толстого филамента поворачиваются в разные стороны и приближают друг к другу линии л/ концы тонких филаментов, сближая между собой. Такое линиями н уменьшение расстояния между . . и ведет к укорочению мышцы. В гипотетическом химическом взаимодействии миозиновый поперечный мостик использует энергию связывания и гидролиза АТФ для перемещения тонкого филамента, с которым он связан. Стадия огш-единения мостика позволяет повторить взаимодействие в более отдаленных местах вдоль тонкого филамента по мере укорочения волокна ^ауЛоЪ , 1971). Предполагают, что обе "головы" мио-зиновой молекулы действуют независимо при генерации напряжения 1978). Генерирующее силу взаимодействие фио ламентов включает их скольжение на расстояние около 100 А друг относительно друга без диссоциации филаментов

ВоасЬиг , Шам>л

1978). Таким образом, предполагается, что прикрепленные поперечные мостики совершают микрохимическое движение на расстояние о около 100 А.

Целый ряд методов, включая электронную микроскопию, дифракцию рентгеновских лучей и спектральные метки, был], применен:' в опытах на мышечных волокнах. Эти исследования концентрировались на характеристиках трех хорошо известных физиологических состояний мышцы. Состояние расслабления достигается, когда филаменты оказываются в среде, содержащей высокий уровень.АТФ и низкие концентрации ионов Са. Считается, что поперечные мостики либо прикрепляются очень слабо, либо отсоединяются при расслаблении. Добавление ионов Са^+ в эту среду вызывает сокращение. При этом значительное количество поперечных мостиков прикрепляется и совершает работу. Отсутствие АТФ вызывает окоченение (ритор), при котором мышца находится в жестком состоянии и не растягивается, потому что поперечные мостики прочно прикреплены.

Структура ригорной мышцы хорошо изучена, в частности потому, что это стационарное состояние, при котором мышца высоко упорядочена. Энзиматические исследования, спектр парамагнитных меток, прикрепленных к поперечным мостикам, и исследования прстео-литических свойств миозина показали, что в ригорной мышце абсолютно все миозиновые головы были прикреплены к актиновым филамен-там ( СвоЬ, , Ф&шЛь } Х980; , , 1980; 1981). В ригорной мышце поперечные мостики, по-видимому, прикрепляются к актину и образуют по отношению к оси волокна угол приблизительно в 45°. Аналогичный угол миозиновой головы в состоянии ригора был определен для комплексов актин-суб-фрагмент-1 в растворе ( е4 й£ } 1970). В расслабленной мышце неприкрепленные поперечные мостики, по-видимому, распола-ются приблизительно перпендикулярно к оси волокна. Дифракция рентгеновских лучей под малыми углами показала, что в ригорной мышце миозиновые поперечные мостики дают дифракционную картину, характерную для актиновой спирали, тогда как в расслабленной мышце поперечные мостики расположены спирально на поверхности толстых филаментов ( И./^щс&у, 1969). Однако недавноу&<^а^ Ат^^ЦйсгК&у используя метод быстрого замораживания для полученая электронных микрофотографий ригорной мышцы, получили снимки мостиков, которые были наклонены менее значительно, чем было показано раньше методом негативного окрашивания. Поперечные мостики ригорной мышцы имели широкое угловое распределение от 50° до 90°, а в комплексе актин-субфрагмент-1, С-1 располагался скорее перпендикулярно к актиновому филаменту. Эти результаты поднимают вопрос о точной ориентации поперечных мостиков при ригоре, но все же согласуются с моделями сокращении, которые предполагают подвижный поперечный мостик. Изучение влияния растяжения на ригорную мышцу показало, что приложение больших сил к ней не изменяет угла поперечного мостика {С&о&£ , 1981). Таким образом, когда к ригорной мышце прикладывается сила, должны растягиваться эластические элементы.

Исследования расслабленной мышцы методами флуоресцентных и парамагнитных меток показали, что поперечные мостики имеют при расслаблении мышцы скорее широкое, чем узкое, распределение углов ( 1982). В расслабленной мышце . спиновые метки, прикрепленные к поперечным мостикам, испытывали движения влечение микросекунд. Эти движения сходны с аналогичными в изолированных толстых фила-ментах. Таким образом, в расслабленной мышце поперечные мостики совершают броуновские вращения под большими углами в течение микросекунд.

Ориентация поперечных мостиков в сокращающейся мышце менее понятна. Измерения мышечной жесткости показывают, что некоторые поперечные мостики прикрепляются во время сокращения, но не ясна ориентация этих мостиков. Изучение меток, прикрепленных к миози-новым головам, дало разные результаты. Поляризация трипторановой флуоресценции предполагает, что ориентация поперечных мостиков была промежуточной между таковой при риторе и при расслаблении

1974); однако поляризация флуоресцентного нук-леотида и меток, прикрепленных к сульрдрильным группам, обнаружила небольшие различия между расслабленной и сокращающейся мышцей ( ¡^очл/сЬ , 1979). Спектр парамагнитных меток для сокращающейся мышцы представляет собой суперпозицию спектров для расслабленной и ригорной мышц. Во время сокращения около 30 % меток имели угловое распределение, эквивалентное распределению для ри-горной мышцы, тогда как распределение остальных 70 % напоминает картину для расслабленной мышцы ( Сос^г Ы &£ , 1982). Эти спектры проще всего объяснить как показатель того, что 30 % ми-озиновых голов прикрепляются в сокращающейся мышце, и метки на них имеют ориентацию, аналогичную для ригорной мышцы.

Существуют данные о том, что поперечные мостики вращаются во время мышечного сокращения. Методом флуктуационной спектроскопии было показано ( , 1979), что в сократительном цикле должны быть по крайней мере два состояния с различной ориентацией поперечных мостиков, причем, вероятно, в обоих состояниях мостики прикреплены. Хаксли ( 1981) зарегистрировал изменения дифракционных картин сокращающейся мышцы с высоким временным разрешением в период кратковременного ответа на градуальные изменения длины мышцы. Эти изменения могли объясняться за счет вращений в течение миллисекунд прикрепленных поперечных мостиков. Таким образом, во время сокращения некоторое количество поперечных мостиков прикрепляется к актину, и они движутся. Однако характер движения менее понятен.

Модели механизма генерации силы сокращений

Наиболее популярная модель механизма генерации силы подразумевает жесткое связывание субфрагмента-1 миозина и поворот на жестком актине, в результате чего дистальная часть С-1 перемещается на 100 А , 1969; 1971). В простейшем варианте этой модели ни С-1, ни актин существенно не изменяются, за исключением их относительной ориентировки. Однако можно предположить целый ряд других механических моделей.

Рассмотрим эти модели, включая и первую описанную модель.

В каждой из них подчеркивается единственный тип изменений (

1) Жесткий С-1 вращается на актине. Глобальное конформационное изменение происходит для всего комплекса актин - С-1, но не для 'актина или С-1 в отдельности.

2) Прочно связанный с актинонС-1 изгибается. Глобальное конформационное изменение совершается только для субфрагмента-1.

3) Актин вращается, двигая крепко связанный С-1. Глобальное конформационное изменение совершается только для актина.

4) Переход спираль-кольцо совершается в субфрагменте-2 миозина. Глобальное конформационное изменение - только для С-2.

5) Изменение заряда на С-1 перемещает актин. Происходит глобально е конформационное изменение.

Именно глобальные конформационные изменения, включающие изменения размеров белка или бежового комплекса, являются возможной причиной движения филаментов на 100 А, которое вызывает их скольжение. Эти изменения необходимо отличать от локальных конформационных изменений, включающих изменения только небольших частей бежа.

В модели 5 было предположено, что электрические заряды на несвязанном субфрагменте-1 взаимодействуют соответствующими зарядами на тонких филаментах так, что тонкие филаменты тянутся в полости, образованной толстыми филаментами (Тиюмшнс , 1979). Модель 5 требует, чтобы поперечный мостик и актин не связывались и чтобы заряды на С-1 прилагали силу к актину. Целый ряд экспериментальных исследований показывает, однако, что во время генерации напряжения имеет место образование комплекса между актином

1983). о

- з? и миозином. Было показано, что при связывании нуклеотида субфраг-ментом-1 его сродство к актину уменьшается ( ,

1980). При связывании актина и миозина происходит возрастание в реактивности тй^в на миозиновых головах в присутствии нуклео-тидов (¡СомФуатАу, 1980). При связывании головы с Г-актином менялись спектральные свойства флуоресцентных меток, прикрепленных к £Н-группе головы миозина ( ¡■¿¿^Жмш.Жк' аЛ , 1976). Связывание актина с С-1 ограничивает протеолитическое расщепление суб фрагмента-1 трипсином, возможно, вследствие блокады доступности места для трипсина ( "Уатот^о , А&Мш- , 1979). Высокая жесткость сократительных волокон, тройные комплексы актина, миозина и нуклеотида, обнаруживаемые в растворах белков и волокнах, спектр парамагнитных меток показали, что актиномиозиновый комплекс образуется во время сокращения. Наконец, высокая диэлектрическая константа делает экранирование любых дальнодействующих электрических взаимодействий очень вероятным. Следовательно, модель 5 н^ириемлима.

Существуют сведения, уменьшающие вероятность модели 3. Вращение актинового мономера требует глобального изменения конформа-ции актина. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют только о локальных конформационных изменениях структуры актина, в области реактивной сульфгидрильной группы актина, Суч -373 при связывании миозиновых голов {рочАъ , (¿¡в&ъ , 1979). Поскольку ни связывание тяжелого меромиозина, ни С-1 с актиновыми фи-ламентами не изменяло ориентацию флуоресцентного нуклеотида в актине ( О&^сиОа^ , 1978), то вращение мономеров актина или другие глобальные конформационные изменения структуры актина маловероятны. Исследования, в которых конформация актиновых мономеров ограничивалась с помощью химических поперечных связей, также показали, что актиновые филаменты могли все же активировать АТФ-азную активность субфрагмента-1, и при этом происходила суперпреципитация актомиозина , ^^ , 1980). Это означает, что актиновые мономеры при связывании С-1 не могут вращаться. Таким образом, можно утвержать, что хотя актин и является решающим для генерации силы, он, по-видимому, не испытывает глобального конформационного изменения или вращения во время своего взаимодействия с миозином, и модель 3 также маловероятна.

В модели 4 было предположено, что соединение между С-1 и стержнем толстого филамента, называемое субфрагмент-2, подвергается спирально-кольцевому изменению, которое является причиной укорочения и генерирует силу ( , 1971). Модель 4 включает укорочение области миозина, находящейся в субфрагменте-2, или, возможно, в части С-1, проксимальной к С-2. Спирализованная спираль из двух «¿-спиралей, составляющая миозиновый стержень, испытывает в некоторых условиях обратимый переход от «¿-опирали к беспорядочному кольну ( В^Лл 1973). Температурные измерения скоростей перехода спираль-кольцо показали, что при 40 °С С-2 мог обратимо переходить из спирали в кольцо достаточно быстро, что предполагает роль такого перехода в механизме мышечного сокращения ( Зл^и^ , 1979). Однако доказательства, что этот переход происходит в условиях, близких к физиологическим, отсутствуют. Слабость этой модели в том, что не существует доказательств, что наблюдаемые температурные переходы спираль-кольцо в С-2 ассоциируются либо со связыванием актина, либо с гидролизом АТФ в С-1. Тот факт, что наименее стабильный участок С-2 отдален от активных мест с помощью длинного об-спирального пептида делает прямое участие этого участка в механизме сокращения маловероятным. Некоторые механические эксперименты также свидетельствуют против этой модели. Дифракция рентгеновских лучей с высоким временным разрешением, ориентированные флуктуации флуоресцентных меток предполагают, что во время генерации напряжения возникает движение типа вращения (ёохе/ о и а£ , 1979; а1 , 1981). Таким образом, можно заключить что укорочение субфрагмента-2 в области, проксимальной по отношению к легкому меромиозину, не является вероятным механизмом генерации силы сокращений. Однако нельзя полностью исключить возможность того, что укорочение области вблизи контакта С-:1 - С-2 способствует генерации сокращения.

Модели I и 2 похожи. В обоих случаях сила генерируется за счет вращения части поперечного мостика; однако в модели I оно включает в себя вращение всего субфрагмента-1, тогда как в модели 2 вращается только часть С-1. Различие медцу двумя этими моделями существенно. В модели I генерация силы происходит там, где соприкасаются актин и миозин. При этом небольшие изменения структуры актин-связывающего места на С-1, согласованные с изменениями нуклёотид-гидролизупцего участка, заставляют остающийся жестким С-1 изменять свою ориентацию на тонком филаменте. В модели 2 сила генерируется путем относительного движения двух доменов субфрагмента-1, один из которых прочно связывается с актином. В этом случае связывание актина ведет к значительному изменению общего размера С-1.

Модель I подтверждается данными, которые предполагают, что при АТФ-азной активности или при связывании актина не происходит значительных изменений формы миозина. Исследования молекулярных вращений миозиновой головы с помощью флуоресцентных и парамагнитных проб ( е^а£ , 1975; -Жгл^лл 1980) показали, что связывание нуклеотида с С-1 не вызывает существенных изменений формы миозиновых голов, что соответствует представлению о С-1 как эллипсоиде вращения. Однако структура С-1, полученная путем реконструкции электронных микрофотографий, показывает, что С-1 имеет несимметричную форму СЗ&у&'С , ,1981). Это затрудняет оценку наблюдаемых молекулярных вращений, поскольку значительные конформационные изменения мозтут и не влиять на подвижность вращения структуры несимметричной формы, как С-1, Гидродинамические исследования формы С-1 подтверждают эту модель

1980). Измерения вторичной белковой структуры также подтверждают эту модель, поскольку при добавлении нуклеотида глобальные изменения конформации С-1 не наблюдались ( » 1975). Единственные данные, которые, по-видимому, противоречат модели I это то, что спиновые метки на поперечных мостиках имеют одинаковую ориентацию, когда они генерируют напряжение, и когда мостики находятся в состоянии ригора 1982). Сведения о том, что прикрепленная метка вращается и поперечный мостик движется во время сокращений, а также существование двух прикрепленных положений мостика согласуется с любой из двух моделей.

Модель 2 подтверждается рядом фактов. Факт, что ^Н группы на голове могут соединяться с помощью поперечных связей длиной о от 0 до 140 А, совместим с представлением о доменах, которые могут двигаться друг относительно друга

ШМ± , 1980).

Подавление обнаруживаемых с помощью ядерного магнитного резонанса движений субфрагмента-1 путем связывания актина предполагает, что во время сокращения могут происходить значительные изменения нитные метки показывают, что какой-то участок миозина не вращается во время генерации мостиком усилия. Следовательно, если вращение действительно происходит, то оно включает в себя вращение одного домена миозина относительно другого. Однако окончательное доказательство модели 2, т.е. прямая демонстрация глобального конформационного изменения субфрагмента-1 миозиновой головы еще не получено. ния механизма генерации силы сокращений, хотя и сильно отличаются друг от друга.

Хотя в литературе отдается предпочтение модели 2 ( допустимы для объясне

-427 МЕТОДИКА

Препарат и камера

Исследования проводили на изолированной портняжной мышце (fri.Aa'do'ttíbi ) травяной лягушки (Rafia te^ota/icoL ). Препарат помещали в камеру из органического стекла. Камеру заполняли раствором Рингера следующего состава (мМ):/VaC£ - 110,5; КС£ -2,5; Ñ аНСОд - 4; СаС^ - 1,8; рН = 7,2 - 7,4.

Конец мышцы с косточкой неподвижно укрепляли в камере с помощью булавки, а другой конец растягивали ниткой, привязанной к сухожилию. Конец нитки привязывали к винту на краю камеры, и с помощью этого винта можно было регулировать степень натяжения мышцы. Камеру с препаратом и держатель относительного электрода располагали на гладкой поверхности, смазанной вазелином, что позволяло плавно перемещать их в горизонтальной плоскости. Для проведения опытов добивались снятия мышечных сокращений (см. Глава I).

Электроды и регистрация потенциалов

Для отведения внутриклеточных потенциалов были использованы стеклянные микроэлектроды со впаянными внутрь них волокнами, которые вытягивались из алюмосиликатного стекла С-48-3, обладающего достаточной механической прочностью. Диаметр кончика микроэлектрода составлял 0,5 мкм; сопротивление 20-50 МОм.Электроды заполняли 2,7 М КСб. В большинстве опытов использовали двуствольные микроэлектроды. Электроды вытягивали из двойных заготовок, спаянных лишь на протяжении 5-7 мм. Тыльные части стволов раздвигали, чтобы устранить возможные утечки тока между стволами. Каждый из стволов был соединен с отдельным катодным повторителем. Через один из стволов можно было пропускать ток от источника через стабилизирующее сопротивление. Второй ствол служил для регистрации мембранного потенциала, а также для дифференциального отведения между стволами. Контакт микроэлектрода со входом катодного повторителя осуществляли с помощью агарового мостика и серебряной проволоки. Относительный электрод в виде серебряной проволоки был погружен в раствор Рингера.

Сигналы от объекта поступали на входы катодных повторителей, а от них на осциллограф С1-18, с экрана которого они фотографировались с помощью фоторегистрирующего прибора ФОР-1. Запись велась при покадровой съемке на ФОР-1. В части опытов сигналы фотографировались с экрана осциллографа с помощью фотоаппарата "Сме

Усилитель биопотенциалов снабжался питанием от анодных батарей БАС на 100 В. Анодные батареи на 100 В и 75 В использовали для питания системы, обеспечивающей продольную поляризацию волокон постоянным током и для мостовой схемы.

Измерение сопротивления и электрическая стимуляция

С целью измерения сопротивления в цепи микроэлектрода или одного из стволов двойного микроэлектрода, через него пропускали схемы (тестирующий ток). Мостовая схема (рис.1), служившая для пропускания тестирующего тока от источника \7", позволяла менять силу и направление этого тока, подававшегося от источника ^ с помощью делительной цепочки сопротивлений (20-3 К) и двухполюсного ключа через стабилизирующее сопротивление 7; 10 или 15 ГОм. на-8". небольшой постоянный ток (0,3*10' г-9

- 32-10 ® А) с помощью мостовой

Рис.1. Мостовая схема для пропускания постоянного тока через микроэлектрод и мышцу:

V"- источник постоянного тока для подачи тестирующих толчков тока;

- микроэлектрод для пропускания тока через отводящий ствол или через соседний ствол (показан штриховыми линиями) двойного микроэлектрода

Создаваемое на микроэлектроде падение напряжения компенсировалось с помощью второго плеча мостовой схемы. Мостовая схема соединялась со входом катодного повторителя. Прежде чем ввести микроэлектрод в волокно, при помощи переменных сопротивлений 2,2 к и 1,5 к устанавливался баланс мостовой схемы. Для этого подбирали сопротивления так, чтобы включение тока через мостовую схему не вызывало сдвига потенциала на входе катодного повторителя. Об из- ', менении сопротивления в цепи микроэлектрода судили по нарушению баланса мостовой схемы.

Электрическая стимуляция мышцы (сдвиг МП мышечных волокон) осуществлялась посредством тока, пропускаемого через внеклеточные электроды I и 2 (поляризующий ток) по наружной среде с раствором Рингера (рис.2). Направление поляризующего тока меняли, переключая тумблер в схеме.

Перед.введением микроэлектрода 3 в волокно подбирали такое положение относительного электрода 4, чтобы при включении поляризующего тока не возникала разность потенциалов между микроэлектродом и относительным электродом (рис.2). Такая предварительная балансировка позволяла после введения микроэлектрода регистрировать сдвиги мембранных потенциалов в чистом виде без добавления внеклеточных перепадов напряжений. Для пропускания поляризующего тока были использованы серебряные электроды с пористой поверхностью, что уменьшало сопротивление этих электродов и позволяло пропускать через них токи большой силы.

Некоторые частные методические особенности опытов разных серий приведены в каждой из глав раздела "Результаты".

Рис.2. Схема поляризации мышцы продольным током через внеклеточные электроды:

V- источник постоянного тока для подачи поляризующих толчков тока; I и 2 - внеклеточные электроды; 3 - микроэлектрод; 4 - относительный электрод; М - мышца в растворе Рингера

Статистическая обработка результатов

При вычислении средних значений (М) величины эффектов ВЛИС всегда определяли ошибку репрезентативности (М -Щ по формуле ¿он , где о - среднее квадратическое отклонение, Иу - число объектов в группе (Плохинский, 1970). При сравнении средних значений емкости мембраны и эффектов ВЛИС пользовались критерием достоверности разности, определяя стандартное значение критерия по таблице Стьюдента (Плохинский, 1970).

Результаты экспериментов представлены в виде осциллограмм, таблиц и графиков, отражающих изменение эффекта ВЛИС в зависимости от тестирующего тока и поляризации мембраны.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ,

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Сатыбалдина, Назым Капановна

Выводы

1. В скелетных мышечных волокнах лягушки впервые удалось обнаружить и зарегистрировать эффект внутриклеточных локальных изменений сопротивления в ответ на сдвиги потенциала поверхностной мембраны.

2. В опытах с детубуляцией волокон с помощью осмотического тока было показано, что сохранность Т-системы не является необходимой для передачи сигнала об изменениях МП к структурам, ответственным за эффект локальных изменений сопротивления.

3. В опытах по идентификации структуры, с которой связан эффект, было установлено, что обработка мышцы цитоплазматичес-ким ядом колхицином и метаболическим ядом динитрофенолом, разрушающим микротрубочки и митохондрии соответственно, не устраняла эффекта ВЛИС. Это позволило заключить, что эффект ВЛИС не обусловлен изменением сопротивления этих структур.

4. Хроническая денервация седалищного нерва волокон портняжной мышцы лягушки не ведет к изменению или исчезновению эффекта локальных изменений сопротивления.

5. Эксперименты с бескальциевым раствором Рингера с добавлением I мМ ЭДТА и блокадой кальциевой проницаемости с помощью ионов кобальта, кадмия и лантана показали, что эффект ВЛИС не зависит от присутствия ионов кальция снаружи и по величине сравним с эффектами в контрольных препаратах.

6. Этиловый спирт в растворе Рингера (4 %), увеличение рН среды до 9-10 и нагревание до 30-35 °С вызывали уменьшение эффекта ВЛИС вплоть до исчезновения и инверсии эффекта в противоположную сторону. Охлаждение раствора до О °С и снижение рН до 3,5-4, напротив, способствовали возрастанию величины эффекта.

7. Результаты опытов позволяют считать, что существует процесс передачи информации от мембраны внутрь клетки, не требующий участия метаболических процессов и связанный с изменением агрегатных состояний, каких-то цитоплазматических структур.

8. Эксперименты с оценкой пространственных особенностей структуры, с которой связан эффект. ВЛИС, позволили заключить, что эффект ВЛИС не может быть обусловлен изменением сопротивления одиночной компактной частицы, сравнимой по размерам с диаметром кончика микроэлектрода (0,5-1 мкм ). Структуры, ответственные за эффект ВЛИС, представляют собой слой, составленный из отдельных элементов, каддШ из которых по отдельности не в состоянии загородить просвет кончика микроэлектрода. По-видимому , отдельные элементы слоя, либо его толщина близки по размерам к 0,1-0,2 мкм.

9. Структурами, обусловливающими эффект ВЛИС, по.нашим представлениям, могли быть субплазмалеммные микрофиламенты, встречающиеся в большинстве мышечных и немышечных клеток эукариотов и о по размерам 30-70 А достаточно малые.

Заключение

Рассматривал общий итог настоящей работы, вернемся к задаче, которая была поставлена перед нами вначале, а именно: обнаружить впервые в скелетной мышце лягушки феномен, внутриклеточных,, локальных изменений сопротивления.'

Очевидно, что поставленная поисковая задача нами выполнена. Таким образом, эффект внутриклеточных локальных изменений сопротивления, обнаруженный Бызовым и Трифоновым (1973) на горизонтальных клетках сетчатки глаза, имеет, по-видимому, более общее физиологическое значение, поскольку может быть воспроизведен и на скелетных мышечных волокнах.

В настоящей работе нам удалось показать, что в цитоплазме мышечных волокон есть структуры, сопротивление, которых изменяется в зависимости от мембранного потенциала, а именно: в.ответ на деполяризацию мембраны волокон уменьшается, а в ответ на гипер-поляризацшо - увеличивается. Величина этих локальных изменений сопротивления достигает нескольких десятков мегом. Была' изучена зависимость этого эффекта от мембранного потенциала: при увеличении степени деполяризации и гиперполяризации мембраны эффект возрастал. Возрастание величины эффекта при токе положительного направления, пропускаемого через микроэлектрод, позволило сделать вывод об отрицательном знаке заряда структуры, с которой связан эффект.

Эффект ВМС удавалось наблюдать не только в ответ на постоянный ток, но и в ответ на деполяризацию, вызванную повышением .концентрации ионов калия, и на потенциалы действия мышечных волокон.

В серии опытов с разрушением Т-системы путем осмотического шока было установлено, что детубуляция ведет к значительному снижению средних значении емкости мембраны от 5,13^0,29 мкФ/см2 (Л= 18) в норме до 2,25±0,47 мкФ/см2 (/7= 13), где /1 - число волокон. Уменьшение емкости служило показателем разрушения Т-сис-темы. Эффект ВМС в детубулированных препаратах, как оказалось, сохранялся, а величина его снижалась в среднем до -5,5-1,5 г/Юм -(15) по сравнению с -11,1-1,9 МОм (/7= 20) в норме, где /£ -число измерений эффекта ВМС. Представляется вероятным, что причиной уменьшения эффекта ВЛИС является не детубуляция волокон сама по себе, а ухудшение свойств волокон (набухание волокон при отмывке глицерина) и, как следствие, уменьшение сопротивления микроэлектрода, что могло отражаться на величине эффектов.

Нарушение окислительного фосфорилирования при инкубации препаратов с 2,4 динитрофенолом в концентрациях 10"^ М; 4,38-10"^ М и 8,7«10~4 М в течение 1,5 - 2-х часов вело к снижению средних эффектов ВЛИС в опытных препаратах до -8,0-1,8 МОм (/£ = 26) по сравнению с контрольными препаратами: -17,5-4,9 МОм (Л-= 38), где число измерений эффекта ВМС. Причиной уменьшения эффекта ВМС, вероятно, может являться снижение уровня поляризации мембраны под влиянием ингибитора метаболизма.

Разрушение цитоплазматических микротрубочек с помощью колхицина (0,5 г/л) при инкубации с одновременной регистрацией эффекта ВМС на протяжении 0,5 - 3-х часов показало, что эффект ВЛИС сохраняется и величина его существенно не меняется.

Таким образом, опыты с детубуляцией, подавлением окислительного метаболизма и с колхицином позволяют сделать выводы о том, •■• что сигнал об изменении МП к внутриклеточной структуре может происходить без участия Т-системы, а также, что митохондрии и .микротрубочки не являются структурами, ответственными за эффект ВЛИС.

В серии опытов с хронической денервацией портняжной мышцы лягушки (4 недели и 5 недель) у ~ £ лягушек была обнаружена сохранность эффекта ВЛИС. Это позволяет заключить, что трофическое влияние нерва на мышцу не является непосредственно необходимым для сохранности эффекта ВЛИС. Величина эффекта при этом существенно не изменялась.

Была изучена зависимость эффекта ВМС от ионного состава среды. Оказалось, что для воспроизведения эффекта ВЛИС удаление кальция из наружной среды с добавлением I мМ ЭДТА, а также блокада кальциевой проницаемости мембраны с помощью ионов кобальта и кадмия в концентрациях, изотоничных обычному раствору Рингера (85 мМ) и гипертоническому за счет сахарозы (212,5 мМ), а также при инкубации препаратов с лантаном в концентрациях 2 мМ, 4 мМ и 5 мМ и с кобальтом в концентрации 30 мМ не приводят к исчезновению эффекта ВЛИС. Другими словами, ионы Са^+ извне волокон не принимают участия в сопряжении процесса возбуждения мембраны и передане сигнала к внутриклеточным структурам.

Нами была исследована зависимость эффекта ВЛИС от температуры и рН среды. Установлено, что величина ВМС возрастает по мере охлаждения вплоть до 0 °С, а нагревание до 30-35 °С почти полностью, но обратимо устраняет этот эффект. Эффект уменьшался также под действием этилового спирта (концентрация 4 %) и при возрастании рН омывающего раствора до 9-10; уменьшение рН до 3,5-4 увеличивало эффект.

Эксперименты с оценкой пространственных особенностей структуры с использованием трехствольных микроэлектродов с различной геометрией сечения токового и отводящего стволов позволяют полагать, что эффект ВШС не связан с одиночной компактной частицей, размеры которой соизмеримы с диаметром кончика микроэлектрода (0,5 - I мкм). Иными словами,структура, с которой связан эффект ВМС, состоит из большого числа "притянутых" к кончику токового ствола элементов, каждый из которых по отдельности не в состоянии загородить просвет кончика микроэлектрода. С этой точки зрения эффект ВМС может представлять либо изменение электрического сопротивления отдельных элементов слоя, либо изменение плотности их упаковки в ответ на сдвиги мембранного потенциала.

Мы предполагаем, что наиболее вероятными структурами, ответственными за данный эффект, являются элементы цитоскелета мышцы -актиновые микрофиламенты, расположенные непосредственно под плаз-малеммой и одним концом встроенные в нее (ёовс&яйЯ, } ^йХД/сь-(Ьлг , РоКке1 , ШЖ*- , 1375).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сатыбалдина, Назым Капановна, Москва

1. Алмерс В., 1981. Воротные тока и движение зарядов в возбудимых мембранах. В кн. Мембраны: ионные каналы. Мир, Москва.

2. Алов И.А., Брауде А.И., Аспиз М.Е., 1966. Митохондрии. В кн. Основы функциональной морфологии клетки. Медицина, Москва, 52-78.

3. Аспиз М.Е., Старосветская H.A., 1977. Микрос'трубочки и микрофибриллы. В кн. Движение немышечных клеток и их компонентов. Наука, Ленинград, 45-55.

4. Бендолл Дж., 1970. Мышцы, молекулы и движение. Мир, Москва.

5. Беркинблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю. и др., 1981. Высокопроницаемые контактные мембраны. Наука, Москва.

6. Бызов А.Л., Трифонов Ю.А., 1973. Локальные изменения сопротивления внутри горизонтальной клетки сетчатки, вызванные сдвигами мембранного потенциала. Нейрофизиология, 5, 4, 432-441.

7. Бызов А.Л., Ханич Р., 1966. Внутриклеточная регистрация реакций различных клеток сетчатки лягушки и аксолотля. Физиол. журн. СССР, 52, 250-257.

8. Вазина A.A., Железная Л.А., Лукина В.И. и др., 1977. Рентгенографическое исследование мышц и жидких кристаллов сократительных белков. В кн. Молекулярная и клеточная биофизика. Наука, Москва, 53-72.

9. Гейльбрун Л., 1957. Динамика живой протоплазмы. Иностр.лит., Москва.

10. Де Робертис Э., Новинский В., Саэф Ф., 1962. Общая цитология. Иностр.лит., Москва.

11. Жуков E.K., 1969. Очерки по нервно-мышечной физиологии. Наука, Ленинград.j

12. Камия H., 1962. Движение протоплазмы. Иностр.лит., Москва.

13. Костюк П.Г., Сорокина З.А., Шаповалов А.И., 1959. Внутриклеточное отведение потенциалов мышечных волокон. Ритмическая активность. Биофизика, 4, 3, 310-318.

14. Кроленко С.А., 1975. Т-система мышечных волокон. Наука, Ленинград.

15. Мигулина Е.В., 1979. Влияние активности скелетной мышцы на передачу возбуждения в нервно-мышечном синапсе лягушки. Канд.дисс., Москва.

16. Плохинский H.A., 1970. Биометрия. Изд.МГУ, Москва.

17. Подлубная З.А., Фрейдина H.A., Шпагина М.Д., Орлова A.A., 1977. Исследования молекулярных взаимодействий в структуре толстых и тонких нитей мышцы. В кн. Молекулярная и клеточная' биофизика. Наука, Москва, 124-152,

18. Поликар А., 1977. Элементы физиологии клетки. Наука, Ленинград.

19. Ритов В., 1972. Исследование биохимических механизмов мем-бранно-миофибриллярной связи. Канд.дисс., Москва.

20. Сатыбалдина Н.К., 1982. Локальные изменения сопротивленияв цитоплазме мышечных волокон после детубуляции. Биологические науки, 6, 39-40.

21. Сорокина З.А., 1959. Роль обмена веществ в поддержании потенциала покоя попереннополосатого мышечного волокна. Физиол. журн.им.Сеченова, Х1У, № II, 1359-1366.

22. Сорокина З.А., 1961. Зависимость между внутри- и внеклеточным pH, потенциалом покоя и концентрацией ионов К+ в поперечнополосатом мышечном волокне лягушки. Цитология, 3, № I, 48-59.

23. Тидор С.Н., 1976. Особенности мембранного потенциала волокон скелетной мышечной ткани при различных гипоксических воздействиях. Канд.дисс., Петрозаводск.

24. Трифонов Ю.А., Сатыбалдина Н.К., Каменская М.А., 1979. Локальные изменения сопротивления в цитоплазме мышечных волокон. Биофизика, деп. в ВИНИТИ, В 3684.

25. Трифонов Ю.А., Сатыбалдина Н.К., Каменская М.А., 1982 а. Внутриклеточные локальные изменения сопротивления в мышечных волокнах в зависимости от мембранного потенциала. Биофизика, 27, гё I, 106-110.

26. Трифонов Ю.А., Сатыбалдина Н.К., Каменская М.А., 1982 в. Влияние воздействий на величину внутриклеточных локальных изменений сопротивления. Биофизика, 27, № 2, 273-275.

27. Трифонов Ю.А., Чайлахян Л.М., 1975. Однородная поляризация волокон и синцитиальных структур внеклеточными электродами. Биофизика, 20, № I, 107-112.

28. Ходоров Б.И., 1975. Общая физиология возбудимых мембран. Наука, Москва.

29. Ходоров Б.И., Беляев В.И., 1965. Исследование механизма действия новокаина на электрическую активность одиночного перехвата Ранвье. Биофизика, 10, $4, 625-633.

30. Ходоров Б.И., В0рновицкий Е.Г., 1967. О различиях в механизме угнетающего действия тетродотоксина и новокаина на скелетные мышечные волокна лягушки. Бюлл.экспер.биол. и мед., 10, 34-37.

31. Ходоров Б.И., Пеганов Э.М., Шишкова Л.Д., 1973. Медленная натриевая инактивация в мембране перехвата Ранвье. В сб. Биофизика мембран. Каунас, 620-625.

32. Чайлахян Л.М., 1969. Современные представления об электрической структуре мышечных волокон. Биофизина, 14, Ш 2, 348-358.

33. Шмидт-Ниельсен К., 1982. Физиология животных. Мир, Москва.

34. М АашуМ; £ У/, /9? 3,Мы* бЛмреьсе ¿с/с^аМ^и**?1. Ф Ам^'¿у1. У, М<глнг Р^ ск&и- ** *

35. Ч!- бал&Ък ЛМлш**^ /9? у. ¿ь

36. Г —' ' •'V Г i-'/t' fy ' V-' í y "" " ✓ — — /J -1. Jmûbi/ céczt'/g ù/ а/и/.

37. J- utUußiaM- c&jiAcMy awi %eutaеШсикЛ.,

38. Mpci'teitiMi (ф ÙtP/ieitùi Ùtiv ¿Am СШ7/и*се^17. StocÂe/H tJ 9Z)66. ZêûiJù J,uki

39. Н*иШ2.М} UiupAut, Р, с, m Ш

40. J uUùui fieá^tzA à? àceaA/fihu, #liu&i^ АЛ^ст fay »lustéí,^^^.;^

41. Zvwutôel Л; im. №яЖйи*иек ашёbetofdüy.«Ж d/ггш-ил ¿*¿¿c*,e/íÁe MctÁttu.lie.li, a.u¿ C^sLwÜHí-tmtokdim сяА&м1м (tm ÁOytW'a'u^lâetA- ийМмЖ bünMwiM- iu&Jtbr,1. Ъ1о1. S-, Po(C&&lH-,UJele>cms.

42. Jidnléiót&h e£ad¿h яыипше^е celé^.^e. им Sue/Mod« ùi ~tAc Jtcez&%a£oi! в?aeiù'/ со-cï/pùt -¿/ce nubto-fi&uwd е/-»иш. 6T3ce¿¿\. ù£i Ли.yб. ectÂiL. J. /970. Лепи:. eMdl с^А^ШР^и'е

43. Ao&iûiHisi eít eMituie£fHi cud-c¿tcéxAe¿¿e(trf&Pcuat PPc. £ &!ot W3-SVÍ1. Mr-62?.toad) Afyaucá.¿ Асъ, Ay zMof.wy/asttc'/^i OJ.Tj/97/. ЛHt¿cM/wcÁyj^g, ' ''1. U/dé . &ÓP^wW / e4 /9**. ^ ^ e^ec afifi, Qùuud 3 ш ?

44. ПНашФ^ ¿a, ш. Мсш^а feteárt аг^Мёъшш mcWibêjl и, ¿ч^шгишс^. у.&се/ш,^ ¿2

45. Afeif еЛ&гс-ле I&oí ot? t/¿e /шгг&а/и. „£fMfelíM sicuubC a¿a*é fyЛg. UeiUeâ XMj fatdut лу.; /96-?* TÏûtUâ-é ^A^eáée/1. Zssr- ж* *liZrtuváy/v. A9G3, &€edu»? M¿cm>je¿>/e SX? ¿Atfmj, /naátá, Mo^S^^j1. Ш Kwéy/Ш % 'м&ёлусШы &1. C&útcaeá&t,1. Wee- tf¿faváé/мЖ

46. Citiûi¿4 msA&oie, ^с^Лу.Л^е,S.jtfg,-/кщёу A é\j /972-Áfaiéá¿xA¿ e/uz/tJ/í и, Ыг ¿Htúb

47. СеМ MU/ьй ftetfac, JjbtUs*. 3¿/~3?¿Щ

48. Аъ&яМь CV,j /007, z^W- ir- с&ь -tf- bôtiàfi&â ¿faUh/ Л/céU-^tot Afaeé^t^A^stA*,. Mc^Ctc-Un eé f&ue ¿t<? A-tfiu 'а&лс ¿made. /úá¿u>u.dt Шъа. tet-W/. ù

49. С2. ài -¿fee. ybiudg e^cc^^ÙHt feíesuvue/a?. у^саъ/гтлег^. 11; 99?-№9.ib-e â,j /913- (f Ùhodrâcictti а/т/лал&Ш.

50. TeÂ/ccU. Ptoe.^ /УЗу /S/7- /у¿3. 1$$. M.; Uíúrnufóc M J /976. <?Oe/í.&&/u

51. J-^Ыгыг d e&étut» -fajfo, ^в/0ХЗ-/о&. ' ./л V

52. Qrtbicu&eto ¿fit'to/art^'h ut-d/, fcyltuc*-T7tout t& Ашш'/ ^ /i^í/- 7 . Л ,

53. APiaiïùbtïcr fa ¿гел-i't-риг- МЯя-сЪс/л ¿f fZZ ¡¿ахч, ê. UíCfóéúñ.j tfA^/íA^ác4f a¿c^ of aeeÚ^üetúic ге&я^ Ле~cmcuâu&t/ç üuudio^. Асе, Mâ, Мъ & /6A m ^ KfceM^S^O^uT/a^ ¿St<&á*nu¿e ï/cedtïU. múüaáiteibf.'ácuti^i.cùd u¿u£ zei¿£ái/táe

54. Ada- ЖтЛее, Лел/J., •ъ Гt£., /aeg. з, •ое&ёйа -£а£ /u>é*¿éúb¿ а^léfarfùU fMttJeâ ß&vi. £t'ef,eAÁ*e&.j±2yA/31. T" ¿WzW« .MK1. Он -Ш dùsUfafa ¿ц1.iUC/tf U?1. JA TT' Í

Информация о работе

Сатыбалдина, Назым Капановна
кандидата биологических наук
Москва, 1984
ВАК 03.00.13

Диссертация

Внутриклеточные локальные изменения сопротивления как проявление сопряжения между мембранным потенциалом и состоянием внутриклеточных структур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Похожие работы