Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм изменения электрического потенциала и динамика концентраций ионов H+ и Ca+ в клетках высших растений при генерации вариабельного потенциала

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Механизм изменения электрического потенциала и динамика концентраций ионов H+ и Ca+ в клетках высших растений при генерации вариабельного потенциала"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Способность растительных организмов адаптироваться к изменениям условий окружающей среды в первую очередь базируется на комплексной работе разных систем регуляции, включая электрофизиологическую систему. Функциональными элементами данной системы являются распространяющиеся из зоны воздействия электрические сигналы - потенциалы возбуждения, представленные двумя типами реакций - потенциалом действия (ПД) и вариабельным потенциалом (ВП). В настоящее время показано, что как ПД, так и ВП, способны вызывать ряд функциональных ответов, включая, изменение активности фотосинтеза, изменения уровня газообмена, дыхания, индукцию экспрессии генов (pinll) и др. (Dziubinska et al., 2003; Fromm, Lautner, 2007; Krol et al„ 2010). Стоит отметить, что в большинстве случаев ПД и ВП вызывают однонаправленные физиологические изменения в клетках, расположенных вне зоны раздражения (Fromm, Lautner, 2007). Однако, согласно существующим представлениям, имеются различия в механизмах распространения потенциалов возбуждения по растению, и в ионной природе развивающейся электрической реакции на уровне отдельной клетки.

В отличие от ПД, распространяющегося электротонически, ВП не является самораспространяющейся электрической реакцией, а представляет собой локальный электрический ответ клеток на распространение из области повреждения гидравлической волны или химического фактора (Rhodes et al., 1999; Stahlberg et al., 2006; Vodeneev et al., 2012).

На сегодняшний день сформированы представления об ионной природе ПД у высших растений - генерация электрической реакции связана с возникновением пассивных потоков ионов Са2+, СГ, К+ и временной инактивацией протонного насоса (Lautner et al., 2005; Trebacz et al., 2006; Воденеев и др., 2006).

Ионная природа изменений мембранного потенциала при ВП остаётся не до конца изученной. Несмотря на тот факт, что в отдельных работах продемонстрирована возможность формирования пассивных потоков ионов, в частности Са2+ и СГ во время развития ВП (Zimmermann, Felle, 2009; Воденеев и др., 2011), основной гипотезой о механизме генерации электрической реакции на сегодняшний день остаётся временная инактивация протонного насоса плазматических мембран (Julien et al

t

У

1991; Stahlberg et al„ 2006; Zimmerman, Mithofer, 2013). Аргументами в пользу данной гипотезы служат зарегистрированные неизменность сопротивления и проницаемости мембраны при развитии ВП, что говорит об отсутствии активации ионных каналов и формирования пассивных потоков ионов через них. Кроме того, в работах (Stahlberg et al„ 1996, Rousset et al„ 2002) показано, что внесение в среду блокаторов кальциевых, хлорных и калиевых каналов не влияет на форму ВП. Об участии протонного насоса может также свидетельствовать подавление развития ВП при действии ингибиторов метаболизма, и зарегистрированные изменения рН апопласта (Julien et al„ 1991; Stahlberg, Cosgrove, 1992; 1996; Воденеев и др., 2011).

Стоит отметить, что вопрос о механизме генерации потенциалов возбуждения, и ВП в частности, тесно связан с вопросом об их физиологическом смысле для высшего растения, поскольку развитие деполяризации мембраны и сдвиги ионных концентраций, лежащих в её основе, вероятно, обуславливают процесс преобразования распространяющегося сигнала в функциональный ответ клеток. При этом, в роли основных интермедиатов данного преобразования могут выступать ионы Са2+ и Н\ как ключевые регуляторы целого ряда физиологических процессов: фотосинтеза, дыхания, экспрессии генов, роста и др. (Dziubinska et al. 2003; Sukhov et al„ 2012; Булычев и др., 2013). Стоит, однако, отметить, что в настоящее время прямые сведения о динамике внутриклеточных концентраций Н+ и Са2+ при генерации ВП отсутствуют.

Таким образом, раскрытие природы вариабельного потенциала позволит не только расширить знания о механизме генерации электрической реакции данного типа, но и будет способствовать изучению процессов развития индуцируемого им функционального ответа клеток.

Цель и основные задачи исследования

Целью работы явилось изучение изменений электрического потенциала клеток высшего растения и оценка динамики внутриклеточного рН и рСа при генерации ВП.

В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:

- ингибиторный анализ изменений электрического потенциала клеток при ВП;

- оценка изменений сопротивления мембраны при генерации ВП;

- определение динамики ионов Н+ внутри клетки и апопласте при генерации ВП;

- определение динамики внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в процессе генерации ВП.

Научная новизна

Показано, что генерация ВП сопровождается падением входного сопротивления клетки. Внесение в омывающий раствор блокаторов СГ - и К+ - каналов подавляет развитие ВП и препятствует сопряженному с ним падению сопротивления клетки. Формирование пассивных потоков ионов, в частности хлора - на фазе деполяризации и калия - на фазе реполяризации, вносит вклад в развитие ВП.

Выявлено, что при генерации ВП происходит переходное закисление цитозоля. Впервые выполнена количественная оценка изменений внутриклеточного рН у проростка тыквы при генерации электрической реакции.

Генерация ВП сопровождается длительным возрастанием внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Продолжительное повышение концентрации ионов Са2+ в клетке связано с нахождением кальциевых каналов в открытом состоянии.

Научно-практическое значение

На результатах работы базируется предложенная схема формирования и возможного пути действия на клетки вариабельного потенциала, которая может служить основой для понимания механизмов преобразования сигналов о воздействии в функциональные изменения.

Адаптированная для клеток стебля целого растения методика загрузки флуоресцентных АМ-содержащих зондов может быть использована для определения изменений внутриклеточной концентрации ионов, в частности Са2+ и Н+, у интактных растений.

Основные выводы и результаты будут использованы в учебном процессе, при разработке соответствующих спецкурсов для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) В развитие изменений электрического потенциала клеток при ВП вносят вклад

пассивные потоки ионов, на что указывает подавление реакции в присутствии

соответствующих блокаторов ионных каналов и падение сопротивления клетки

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

В качестве объекта исследований использовали 2-3-недельные проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) и тыквы (Cucurbita pepo L.). Растения выращивали гидропонным способом (керамзит, 50 % среда Хоглэнда-Арнона) в климатической камере (KBW-240, «Binder») при освещении люминесцентными лампами (16-ти часовой световой период) и температуре 24°С.

Регистрацию электрической активности производили с помощью микроэлектродной и макроэлектродной техники. Установка для внутриклеточного измерения мембранного потенциала (EJ и сопротивления клеток включала микроскоп Olympus ВХ51 с автоматическими микроманипуляторами Luigs and Neumann, усилитель Multiclamp 700В (Axon Inst.) и ПК. Растение располагали на предметном столике микроскопа, при этом участок листа проростка закрепляли в кювете со стандартным раствором, содержащим 0,1 мМ NaCl, 0,1 мМ KCl, 0,5мМ СаС12. Электрод сравнения помещали в кювету, измерительный электрод с диаметром кончика около 1 цм, заполненный 0,1 М KCl, вводили в паренхимную клетку листа пшеницы 2-3 слоя. Для анализа изменения сопротивления клеток при генерации ВП через измерительный электрод подавался переменный ток частотой 2 Гц и амплитудой 40 пА. Регистрация соответствующих изменений мембранного потенциала, генерируемых при прохождении тока заданной амплитуды, позволили оценить величину сопротивления клеток проростка путём применения закона Ома для участка цепи. Внеклеточная регистрация электрической активности осуществлялась с помощью Ag/AgCl макроэлектродов. Усилителем служил иономер универсальный ИПЛ-112, соединенный с ПК.

Индуцирующее ВП повреждающее раздражение в виде ожога открытым пламенем в течение 2 с наносили на кончик листа.

Ингибиторный анализ базировался на оценке изменения параметров ВП клетки при внесении в среду ингибиторов за час до нанесения раздражения. Были использованы: специфический ингибитор протонного насоса - ортованадат натрия (0,1 мМ) хелатор ионов Са2+ - ЭГТА(1 мМ), блокатор анионных каналов - этакриновая кислота (0,5мМ) и блокатор калиевых каналов — тетраэтиламмоний (ТЭА) (0 5 мМ)

Для регистрации изменений концентрации ионов Н+ и Са2+ при ВП применяли флуоресцентные зонды FITC-dextran, BCECF,AM , Fluo-4,AM и Fura-2,AM. Загрузка в

7

растение FITC-dextran производилась путём 12-14 часовой инкубации участка проростка с удалённым эпидермисом в растворе зонда. Для загрузки АМ-содержащих зондов внутрь клеток проростка применялась методика низкотемпературной загрузки (Zhang et al., 1998). С целью предотвращения расщепления АМ-компонента эстераза-ми апопласта участок проростка, погруженный в раствор зонда инкубировали при температуре 4°С. Продолжительность низкотемпературного этапа экспериментально подбирали в ходе работы. Затем при комнатной температуре проросток отмывали от зонда путем четырёх-пяти кратной замены стандартного раствора в ячейке.

Регистрацию флуоресценции проводили на комплексе лазерной сканирующей микроскопии Carl Zeiss LSM 510 МЕТА (инвертированный микроскоп Axiovert 200М, лазерный сканирующий модуль, спектральный модуль Carl Zeiss 23 МЕТА). Проросток располагали на предметном столике микроскопа, участок стебля, ранее погруженный в раствор зонда, размещался в ячейке, содержащей стандартный раствор объемом 3 мл. Дном ячейки служило покровное стекло. Формирование изображений осуществлялось с использованием объектива Plan Apochromat 40х/0,6 Korr. Для возбуждения флуоресценции использовался аргоновый лазер (488нм). Флуоресценция регистрировалась в двух спектральных диапазонах: 500-550 нм («зеленый канал») и 650-710 нм («красный канал»). Одновременно с регистрацией флуоресценции осуществлялась запись электрической активности.

Для количественного анализа сдвигов pH регистрацию флуоресценции осуществляли с помощью спектрофлуориметра SHIMADZU RF-5301 PC. Для изучения зависимости параметров флуоресценции FITC-dextran и BCECF,AM от концентрации Н+ использовали буферные растворы (Tris-MES, 20 мМ) с различным значением pH (от 4,5 до 8 с шагом 0,5 единиц). Для изучения зависимости параметров флуоресценции Са2+-чувствительного зонда Fura-2 от концентрации Са2+ использовали растворы с различным рСа (от 5 до 8 с шагом 0,5 единиц). Анализ осуществляли п>тём последовательного снятия спектров возбуждения во времени при регистрации флуоресценции от загруженных зондом проростка на длине волны 520 нм.

Эксперименты проводили в 5-10-кратной биологической повторное™. В результатах представлены средние значения величин и стандартное отклонение, а также типичные записи отдельных измерений.

АТФазы в процессе генерации электрической реакции на ожог. В то же время, деполяризация мембраны в присутствии ортованадата приводит к нарушению электрохимических градиентов других ионов, которые могут вносить вклад в генерацию ВП.

Удаление из омывающего раствора ионов Са2+ путём внесения хелатора ЭГТА значительно подавляло развитие ВП (рис. 2Б), что указывает на необходимость входа кальция из внеклеточного пространства для генерации электрической реакции, что согласуется сданными литературы (Julien et al„ 1991; Stahlberg et al„ 1992).

Блокатор анионных каналов этакриновая кислота значительно подавляет амплитуду и скорость деполяризации при ВП. Данный результат может указывать на то, что формирование переднего фронта ВП определяется выходящим потоком анионов (рис.2В). Анализ существующих на мембране ионных градиентов (Опритов и др., 1991; Stahlberg et al., 2006) позволяет предположить, что такими анионами являются СП Возможная роль ионов СГ в деполяризации мембраны также подтверждается данными литературы об изменении рС1 омывающего раствора при генерации ВП (Zimmerman, Felle, 2009; Воденеев и др., 2011).

Для оценки участия ионов калия в процессе генерации ВП был использован блокатор калиевых каналов TEA. Стоит отметить, что внесение в среду TEA, как и этакриновой кислоты и ЭГТА, не оказывало значительного влияния на уровень мембранного потенциала в покое. При блокировании калиевых каналов амплитуда электрической реакции также меняется незначительно, однако заметно подавляется скорость реполяризации (рис.2Г).

Таким образом, результаты ингибиторного анализа указывают на вклад хлорных и калиевых ионных токов в генерацию ВП. При этом именно активация хлорных и калиевых каналов определяет падение сопротивления мембраны у высших растении при развитии электрической реакции другого типа - потенциала действия (ПД) (Samejima and Sibaoka, 1982). На следующем этапе нами была произведена оценка динамики сопротивления клетки при развитии электрической реакции на ожог в нормальных условиях и при внесении блокаторов ионных каналов.

100с

lla

ЕщЛвп VD VR

и

Н* Ann V0 VR

Б

Hal

I

E* Аци VD VR

В

Рис. 2. Влияние ингибиторов на генерацию ВП, индуцированного ожогом кончика листа пшеницы. А -ингибитор Н+-АТФазы ортованадат натрия (0.1мМ); Б - блокатор анионных каналов этакриновая кислота (0.5мМ); В - хе-латор ЭГТА (0.5мМ); Г - блокатор калиевых каналов TEA (0.5мМ). Ет - мембранный потенциал, Егаг-мембранный потенциал в покое, А„„ - амплитуда ВП, Vu-скорость деполяризации, Ук-скоросгь реполяризации. Момент нанесения ожога обозначен стрелкой. Расстояние от зоны раздражения до зоны регистрации - 5 см. Параметры электрической реакции на диаграммах представлены в процентах or контроля (усреднение по 5-7 измерениям).

Для оценки сопротивления через измерительный электрод подавался переменный ток заданной амплитуды. Перед измерением сопротивления во время генерации ВП, были подобраны параметры импульсов тока, пропускание которого не вызывало изменений электрического потенциала (рис. ЗА). На рисунке ЗБ показано изменение сопротивления при генерации ВП в листе пшеницы. Как видно из рисунка, генерация реакции сопровождается заметным падением величины входного сопротивления клетки. Это может указывать на активацию ионных каналов, во время генерации электрической реакции на ожог.

В присутствии ЭК электрическая реакция не сопровождается заметным падением сопротивления, при этом амплитуда электрического ответа значительно подавлена (рис.4А).

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катичева, Любовь Андреевна, Москва

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И.ЛОБАЧЕВСКОГО

КАТИЧЕВА Любовь Андреевна

Механизм изменения электрического потенциала и динамика концентраций ионов Н+ и Са2+ в клетках высших растений при генерации вариабельного потенциала

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук Воденеев В.А.

Нижний Новгород — 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы...............................................................................................9

1.1. Электрические сигналы у высших растений........................................................9

1.1.1. Потенциалы действия у высших растений.....................................................9

1.1.2. Вариабельный потенциал у высших растений............................................12

1.2. Ионы Са2+ в растительной клетке........................................................................23

1.2.1. Пути поддержания внутриклеточной концентрации кальция...................23

1.2.2. Кальциевые каналы высших растений.........................................................25

1.2.3. Сигнальная роль изменений концентрации свободного кальция у растений.....................................................................................................................30

1.3. Изменения рН в клетках высших растений........................................................35

1.3.1. Регуляция величины рН у высших растений...............................................35

1.3.2. Сигнальная роль изменений рН у растений.................................................39

Глава 2, Материалы и методы........................................................................................45

2.1. Объект исследования............................................................................................45

2.2. Методы исследования...........................................................................................45

2.2.1.Регистрация мембранного потенциала и сопротивления клеток проростков ....................................................................................................................................45

2.2.2. Ингибиторный анализ ВП..............................................................................46

2.2.3. Оценка времени нахождения кальциевых каналов в открытом состоянии ....................................................................................................................................47

2.2.4. Флуоресцентный анализ изменения ионных концентраций......................47

2.3. Статистическая обработка результатов..............................................................53

Глава 3. Ионная природа изменения электрического потенциала клеток при ВП... 54

3.1. Характеристика ВП клеток проростка пшеницы...............................................54

3.2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП..............................................56

3.3. Анализ изменения входного сопротивления клеток при генерации электрической реакции................................................................................................62

Глава 4. Изменения рН апопласта и клетки при генерации ВП.................................67

»

4.1. Оценка возможности применения флуоресцентных зондов для анализа изменения рН в стебле высшего растения.................................................................67

4.2. Анализ изменений рН клеток и апопласта при генерации ВП.........................72

Глава 5. Изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+при генерации ВП ...........................................................................................................................................77

5.1. Оценка возможности применения флуоресцентных зондов для анализа изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в стебле высшего растения ........................................................................................................................................77

5.2. Анализ изменений внутриклеточной концентрации ионов Са2+ при генерации

ВП..................................................................................................................................81

5.3. Определение времени нахождения кальциевых каналов в открытом состоянии при генерации ВП......................................................................................84

Заключение.......................................................................................................................86

Выводы.............................................................................................................................88

Список литературы..........................................................................................................89

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота;

ВП - вариабельный потенциал;

КЦХФГ - карбонилцианид хлорфенил гидразон;

ПД - потенциал действия;

ТЭА - тетраэтиламмоний;

ЭГТА — этиленгликоль тетраацетат

ЭК - этакриновая кислота;

Ет - мембранный потенциал;

Ер - метаболическая компонента мембранного потенциала;

SP - system potential (системный потенциал);

VT - voltage transiets (переходные изменения потенциала);

ДУ - амплитуда изменений трансмембранной разности потенциалов (при пропускании тока);

AU - впеклеточно регистрируемая разность потенциалов.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Способность растительных организмов адаптироваться к изменениям условий окружающей среды в первую очередь базируется на комплексной работе разных систем регуляции, включая электрофизиологическую систему. Функциональными элементами данной системы являются распространяющиеся из зоны воздействия электрические сигналы - потенциалы возбуждения, представленные двумя типами реакций - потенциалом действия (ПД) и вариабельным потенциалом (ВП). В настоящее время показано, что как ПД, так и ВП, способны вызывать ряд функциональных ответов, включая изменение активности фотосинтеза, изменения уровня газообмена, дыхания, индукцию экспрессии генов (pinll) и др. (Dziubinska et ab, 2003; Fromm, Lautner, 2007; Krol et al., 2010). Стоит отметить, что в большинстве случаев ПД и ВП вызывают однонаправленные физиологические изменения в клетках, расположенных вне зоны раздражения (Fromm, Lautner, 2007). Однако, согласно существующим представлениям, имеются различия в механизмах распространения потенциалов возбуждения по растению и в ионной природе развивающейся электрической реакции на уровне отдельной клетки.

Так, в отличие от ПД, распространяющегося электротонически, ВП не является самораспространяющейся электрической реакцией, а представляет собой локальный электрический ответ клеток на распространение из области повреждения гидравлической волны или химического фактора (Rhodes et al., 1999; Stahlberg et al., 2006; Vodeneev et al., 2012).

На сегодняшний день сформированы представления об ионной природе ПД у высших растений - генерация электрической реакции связана с возникновением пассивных потоков ионов Са2+, СГ, К+ и временной инактивацией протонного насоса (Lautner et al., 2005; Trebacz et al., 2006; Воденеев и др., 2006).

Ионная природа изменений мембранного потенциала при ВП остаётся не до конца изученной. Несмотря на тот факт, что в отдельных работах

5

продемонстрирована возможность формирования пассивных потоков ионов, в частности Са2+ и СГ во время развития ВП (Zimmermann, Felle, 2009; Воденеев и др., 2011), основной гипотезой о механизме генерации электрической реакции на сегодняшний день остаётся временная инактивация протонного насоса плазматических мембран (Julien et al., 1991; Stahlberg et al., 2006; Zimmerman, Mithofer, 2013). Аргументами в пользу данной гипотезы служат зарегистрированные неизменность сопротивления и проницаемости мембраны при развитии ВП, что говорит об отсутствии активации ионных каналов и формирования пассивных потоков ионов через них. Кроме того, в работах (Stahlberg et al., 1996, Rousset et al., 2002) показано, что внесение в среду блокаторов кальциевых, хлорных и калиевых каналов не влияет на форму ВП. Об участии протонного насоса может также свидетельствовать подавление развития ВП при действии ингибиторов метаболизма, и зарегистрированные изменения рН апопласта (Julien et al., 1991; Stahlberg, Cosgrove, 1992; 1996; Воденеев и др., 2011).

Стоит отметить, что вопрос о механизме генерации потенциалов возбуждения, и ВП в частности, тесно связан с вопросом об их физиологическом смысле для высшего растения, поскольку развитие деполяризации мембраны и сдвиги ионных концентраций, лежащих в её основе, вероятно, обуславливают процесс преобразования распространяющегося сигнала в функциональный ответ клеток. При этом, в роли основных интермедиатов данного преобразования могут выступать ионы Са2+ и Н , как ключевые регуляторы целого ряда физиологических процессов: фотосинтеза, дыхания, экспрессии генов, роста и др. (Dziubinska et al. 2003; Sukhov et al., 2012; Булычев и др., 2013). Стоит, однако, отметить, что в настоящее время прямые сведения о динамике внутриклеточных концентраций Н+

■у I

и Са при генерации ВП отсутствуют.

Таким образом, раскрытие природы вариабельного потенциала позволит не только расширить знания о механизме генерации электрической реакции данного типа, но и будет способствовать изучению процессов развития индуцируемого им функционального ответа клеток.

Цель и основные задачи исследования

Целью работы явилось изучение изменений электрического потенциала клеток высшего растения и оценка динамики внутриклеточного рН и рСа при генерации ВП.

В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи:

- ингибиторпый анализ изменений электрического потенциала клеток при

ВП;

- оценка изменений сопротивления мембраны при генерации ВП;

- определение динамики ионов Н+ внутри клетки и апопласте при генерации

ВП;

- определение динамики внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в процессе генерации ВП.

Научная новизна

Показано, что генерация ВП сопровождается падением входного сопротивления клетки. Внесение в омывающий раствор блокаторов СГ - и К+ -каналов подавляет развитие ВП и препятствует сопряженному с ним падению сопротивления клетки. Формирование пассивных потоков ионов, в частности хлора - на фазе деполяризации и калия — на фазе реполяризации, вносит вклад в развитие ВП.

Выявлено, что при генерации ВП происходит переходное закисление цитозоля. Впервые выполнена количественная оценка изменений внутриклеточного рН у проростка тыквы при генерации электрической реакции.

Генерация ВП сопровождается длительным возрастанием внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Продолжительное повышение концентрации ионов Са2+ в клетке связано с нахождением кальциевых каналов в открытом состоянии.

Научно-практическое значение

На результатах работы базируется предложенная схема формирования и

возможного пути действия на клетки вариабельного потенциала, которая может

7

служить основой для понимания механизмов преобразования сигналов о воздействии в функциональные изменения.

Адаптированная для клеток стебля целого растения методика загрузки флуоресцентных АМ-содержащих зондов может быть использована для определения изменений внутриклеточной концентрации ионов, в частности Са2+ и Н+, у интактных растений.

Основные выводы и результаты будут использованы в учебном процессе, при разработке соответствующих спецкурсов для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В развитие изменений электрического потенциала клеток при ВП вносят вклад пассивные потоки ионов, на что указывает подавление реакции в присутствии соответствующих блокаторов ионных каналов и падение сопротивления клетки при ВП. При этом, развитие фазы деполяризации связано с активацией хлорных каналов, а реполяризации - с активацией калиевых каналов.

2. Во время генерации ВП у проростков тыквы происходит переходное закисление цитозоля на 0,3±0,1 ед.рН и защелачивание апопласта на 0,3±0,1 ед.рН. Динамика изменений рН как внутри, так и снаружи клеток соответствует динамике электрического потенциала.

3. Во время генерации ВП у проростков тыквы происходит длительное увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Амплитуда изменений концентрации внутриклеточного кальция составила 300

*у I

±50 нМ. Продолжительное увеличение [Са ]in связано с длительным нахождением кальциевых каналов в открытом состоянии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Электрические сигналы у высших растений

Ключевой характеристикой жизнеспособности любой клетки является устойчивость ее как системы и возможность переходить из одного стационарного состояния в другое в случае необходимости. Смена стационарных состояний в клетке осуществляется за счет быстрого перераспределения кинетических и диффузионных характеристик, активации цепей реакций и переноса веществ между клеткой и внешней средой. При этом важным параметром, определяющим в первую очередь направление и активность трансмембранного транспорта, является разность потенциалов на плазматической мембране или потенциал покоя. Электрические реакции на мембране, представляющие собой быстрые изменения потенциала покоя, вызванные теми или иными воздействиями, таким образом, служат одним из механизмов обеспечивающих развитие адаптации клетки к новым условиям среды.

На внешние воздействия высшие растения способны отвечать генерацией двух типов электрических реакций: потенциалом действия (ПД), который возникает при неповреждающем раздражении, и вариабельным потенциалом (ВП), генерация которого возникает при повреждении (Опритов и др., 1991; Fromm, Lautner, 2007). При этом в ряде работ продемонстрирована непосредственная роль ПД в качестве сигнала, индуцирующего формирование адаптивного ответа, в частности, показано, что ПД вызывают широкий круг функциональных изменений и повышение несиецифической устойчивости растения (Ретивин и др., 1997; Krol et al., 2010).

1.1.1. Потенциалы действия у высших растений

Распространение вызванного неповреждающим раздражителем ПД у

высших растений, как и у животных, осуществляется по принципу местных токов.

ПД возникает только в том случае, если сила действия раздражителя достигает

определенной пороговой величины (Опритов и др., 1991; Krol et al., 2010).

9

Появление ПД может наблюдаться и в случае нескольких подпороговых воздействий раздражителей. Как правило, в растительных клетках величина порога возбуждения варьирует от 10 до 60 мВ (Опритов и др., 1991; Медведев, 1998).

По форме ПД у высших растений сходен с нервным импульсом животных (Медведев, 1998), однако, растительному ПД свойственна большая длительность и меньшая скорость распространения. Кроме того, важным отличием ПД растительной клетки от ПД животной клетки является ионная природа такой электрической реакции (Опритов и др, 1991).

В настоящее время, благодаря многочисленным работам, проведенным на локомоторных растениях и клетках харовых водорослей, картина генерации ПД на клетке практически сформирована. Деполяризация мембраны при ПД у растений начинается с активации потенциалзависимых Са2+-каналов. Рост внутриклеточной концентрации Са2+ приводит к активации СГ-каналов. Помимо этого, согласно современным представлениям, входящий ток ионов кальция приводит к временной инактивации протонного насоса плазматических мембран (Fisahn et al., 2004; Воденеев и др., 2006). Выходящий из клетки поток ионов хлора и входящий ток протонов формируют передний фронт ПД. При этом собственный вклад возрастания концентрации кальция в формирование фазы деполяризации ПД в клетках растений может быть пренебрежимо мал. Фаза реполяризации обусловлена выходящим из клеток потоком ионов калия через потенциалзависимые К+-каналы (Lewis et al., 1997; Trebacz et al., 2006; Felle, Zimmermann, 2007). Кроме того, фаза реполяризации ПД характеризуется реактивацией электрогенного протонного насоса. Фактором реактивации насоса может выступать удаление избытка Са2+ из цитоплазмы. Стоит отметить, что о комплексной ионной природе развития изменений мембранного потенциала при ПД можно судить, в частности, и по сложной форме фазы реполяризации импульса. Так, считается, что быстрое «спадание» мембранного потенциала вначале фазы реполяризации связано с потоком ионов калия, а более медленные изменения базируются на восстановлении активности протонного насоса (Пятыгин и др., 2005; Воденеев и др., 2006).

В настоящее время не возникает сомнений, что ПД у растений выполняет сигнальную функцию. Роль ПД как сигнала, по видимости, состоит в передаче информации о внешнем воздействии от одной части растения к другой, что особенно очевидно в случае растений с быстрыми локомоторными функциями. У них распространяющийся ПД несет известие о внешнем раздражителе, запускающий цепь процессов, приводящих к механической реакции. Чаще всего эта механическая реакция бывает связана с выходом К+ из локомоторных клеток и изменением их осмотических свойств (Sibaoka, 1991). ПД могут выполнять сигнальную роль и в репродуктивных органах высших растений. Показано, что при попадании пыльцы на пестик цветка в столбике пестика возникают биоэлектрические импульсы, распространяющиеся к завязи и стимулирующие в ней усиление обменных процессов до того, как ее достигнет пыльцевая трубка. Таким образом, происходит подготовка завязи к оплодотворению. В ряде экспериментальных работ показано изменение фотосинтеза в листьях под влиянием ПД, вызываемого тем или иным раздражителем (Lautner et al., 2005; Pavlovic, Mancuso, 2011). Также были выявлены изменения в активности процессов дыхания и газообмена (Fromm et al., 1995; Fromm, Fei, 1998). В работе Stankovic, Davies были зарегистрированы изменения в уровне экспрессии генов pin2 при генерации ПД, индуцированного электрическо�