Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локальная пластичность соматической мембраны нейронов прудовика

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Локальная пластичность соматической мембраны нейронов прудовика"

л

\ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОИ ФИЗИКИ АН СССР

на правах рукописи

Запара Татьяна Александровна

Локальная пластичность соматической мембраны нейронов прудовика.

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории комплексных исследований нейронных систем Института автоматики и электрометрии СО АН СССР

Научный руководитель: кандидат Биологических наук, н.с. A.C. Ратушняк

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, с.н.с.

М.А. Костенко

кандидат биологических наук, н.с. A.C. Пивоваров

Ведущее учреждение: Институт биологии развития АН СССР

Защита состоится час

на заседании специализированного совета К 002.61.01 в Институте Биофизики АН СССР (Московская область г. Пущино) С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института биофизики АН СССР

Афтореферат разослан «/f " 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета г Л

к.В.и. ~ , V/

4V

V

Л.В. Сложеннкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. По существующим представлениям сложные высокоспецифические функции нервной системы обеспечиваются способностью клетки к пластическим изменениям реактивности. Эта способность проявляется под действием последовательных раздражений и выражается в обратимом изменении реакции. Под пластическими изменениями понимают относительно устойчивые функциональные изменения в системе нейронов, которые превышают по длительности время обычных синаптическкх и импульсных процессов и определяют эффективность и направленность межнейрональных связей [Костюк,1983].

Наиболее результативным направлением исследований механизмов пластических изменений нейрональных реакций является анализ простых видов научения у животных с несложной организацией нервной системы. Параллельная регистрация поведенческих актов и электрической активности клеток позволила провести сравнительный анализ перестройки нейрональных реакций и модификаций поведения. Операционная четкость схем научения позволяет использовать их как алгоритм эксперимента, для того чтобы на редуцированных нейронных сетях и отдельных нейронах моделировать условия выработки поведенческих модификаций и исследовать механизмы регуляции пластических изменений проницаемости мембраны клетки для ионов.

Для нейрона характерны многочисленные синаптическне связи благодаря которым он может принимать участие в проведении многих сигналов. Для понимания системной организиции работы мозга важно определить может ли изменение реакции клетки быть вызвано перестройкой части рецепторных и эффёкторных структур или для этого необходима генерализованная модификация нейрона. Механизмы пластичности предложено разделять на диффузные, вовлекающие в перестройку всю клетку, и локальные, изменяющие свойства части ее однородных структур (Фролов, Муравьев, 1987]. Возможным проявлением локальных механизмов может быть модификация проводимости отдельных участков электровозбудимой мембраны.

На клеточных аналогах обучения моллюсков было выявлено, что пластические модификации нейрональных реакций сопровождаются изменением трансмембранных ионных токов соматической мембраны [Alkon, 1984, Kandel, 1982]. В этой связи

представляется вполне обоснованной точка зрения, согласно которой потенциалзависимые каналы соматической мембраны могут быть одной из пластических структур нейрона. Вместе с тем, конкретные экспериментальные данные, подтверждающие эти предположения ограничены. Кроме того, использованные на клеточных аналогах методы исследования не позволили оценить происходит ли модификация каналов всей мембраны или возмо'жны такие локальные изменения. Ответ на поставленный вопрос имеет принципиальное значение для понимания организации сложных форм обучения и памяти. Такое положение свидетельствует о целесообразности поиска локальных мембранных механизмов пластичнОсти.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в поисках локальных мембранных механизмов пластичности на клеточной модели изменения эффективности нейрональной реакции. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: подобрать модели и методы для исследования локальных мембранных механизмов пластичности, исследовать влияние локальной модификации ионной проводимости на пластические свойства нейронов.

Научная новизна. В результате проведенных исследований:

1. Впервые были описаны условия,.позволяющие моделировать перестройку активности потенциалзависимых ионных каналов на части соматической мембраны нейрона под влиянием последовательных электрических раздражений.

2. Обнаружено, что локальное изменение кальциевой или калиевой проводимости может вызывать перестройку реакции нейрона на стимул. Однако изменение ответа нейрона проявляется только при воздействии на модифицированный участок мембраны.

3. Выявлено, что стабилизация иикрофиламентов цитоскелета может, не оказывая прямого воздействия на электрические характеристики соматической мембраны, изменять ее пластические свойства.

Научно-практическое значение. Обнаружение локальной мембранной пластичности имеет теоретическое значение для оценки информационной емкости нервной системы.

Реализация сложных форм обучения,1 вероятно, не возможна без - локальных перестроек функциональных структур нейрона. Полученные данные указывают на возможность исследования механизмов таких перестроек на простой модели изменения нейро-нального ответа.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти"-, Пущино, 1984; на I всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани", Пущино, 1984; на I всесоюзной конференции "Простые нервные системы и их значение для теории и практики", Казань, 1985; на II всесоюзной конференции "Простые нервные системы и их значение для теории и практики", Казань, 1988, на II всесоюзной конференции "Возбудиные клетки в культуре ткани", Пущино, 1989; на "XXVIII совещании по проблемам ВИД", Ленинград, 1989.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики, результатов экспериментов, их обсуждения, заключения, выводов н списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Библиография содержит источников, их них отечественных и зарубежных

МЕТОДЫ

Исследования проводились на изолированных нейронах [Кос-тенко и др.,1972] из окологлоточных ганглиев прудовика Ьут-паеа з1айпаИз. Изолированные нейроны помещались па стеклянное дно камеры, предназначенной для проведения электрофи-зиологнческих исследований и культивировались в физиологическом растворе без добавок аминокислот, при 1 6-12 С, в течение суток. Использовалась обычная микроэлектродная техника исследований. Для регистрации интегральных токов небольших участков мембраны использовали одну из версий "пэтч-кламп-метода" - метод микроотведений [йНЬег^ег е! а1,1982].

Стимуляция небольших участков соматической мгкбраны и регистрация интегральных ионных токов, протекающих через эти участки, проводилась с помощью стеклянных мнкропипеток (диаметром поры 5-10 мкм), которые подводились к мембране нейрона. Плотный контакт микропипетки с нейроном возникал за счет того, что в микропипетке, соединенной через специальный держатель с микрошприцом, создавалось небольшое отрицательное гидростатическое давление (1-10 гПа). Качество контакта оценивали по величине сопротивления утечки 100 ыОМ-1 ГОм. На нейроне устанавливали две или более таких микропипеток, что позволяло по ходу эксперимента контролировать ионные токи и

/

ответы на стимулы, подаваемые на электрически изолированные участки. Для регистрации токов командный потенциал подавался на хлорсеребряные электроды расположенные в микропипетке.4 Потенциал на индифферентном электроде поддерживался на нулевом уровне с помощью преобразователя ток-напряжение. Таким образом, на исследуемом участке, при подаче импульса, устанавливался потенциал равный разности между командным потенциалом и потенциалом покоя клетки. Импульсы калиброванной амплитуды подавались от специальных управляемых генераторов напряжения через повторители. Длительность импульсов Была 90-100 мсек. Электрическая стимуляция мембраны нейрона проводилась с использованием тех же микропипеток и аппаратуры, что и регистрация ионных токов участков.

Для того, чтобы вызвать переход надпороговых ответов в подпороговые проводилась стимуляция прямоугольными импульсами: величина тока 0,1-0,5 нА, длительность 50-100 мсек, интервал между стимулами 0,5-3 сек. В каждом конкретном эксперименте параметры стимуляции подбирались с учетом ответов нейрона, так чтобы клетка на стимул отвечала генерацией потенциалов действия (ПД).

Для вызова перехода подпорогового ответа в спайковый, проводили локальную внеклеточную стимуляции {через микропипетку) в сочетании с внутриклеточной (через внутриклеточный микрозлектрод). Параметры стимулов подбирались так, чтобы: на стимул, подаваемый на микропипетку, нейрон отвечал не большим, 1-2 мВ, деполяризационным изменением мембранного потенциала, а на стимул, подаваемый на микроэлектрод, генерацией ПД. Задержка между воздействиями, наносимыми вне- и внутриклеточно была, 50-100 мсек. Временная диаграмма импульсов формировалась на элекростимуляторе ЗСУ-2 и подавалась в следующем порядке: первым в паре подавался импульс на микропипетку, вторым - на внутриклеточный микрозлектрод. Для внеклеточной стимуляции применялись прямоугольные импульсы: величина тока 0,1-0,2 нА, длительность 50-100 мсек. Для внутриклеточной стимуляции применялись прямоугольные импульсы: величина тока 0,1-10 нА, длительность 50-100 мсек. Интервал между парами стимулов был 5-15 сек. В процессе подачи стимулов на один участок, на определенных этапах эксперимента, подавались тестирующие стимулы на другой участок нейрона через вторую микропипетку. Для каждой клетки параме-

тры стимулов, которые подавали на первую или вторую никропи-петку, подбирались до начала проведения стимуляции так, чтобы каждый из импульсов, при подаче на соответствующие участки вызывали либо подпороговые ответы одинаковой амплитуды, либо спайковые ответы с одинаковым количеством ПД. Другими словами, добивались того, что при нанесении раздражения как на первый, так и на второй участки исходные ответы сомы нейрона были одинаковыми.

Для визуализации сигналов использовали осциллограф С1-83, регистрация сигналов проводилась непрерывно или покадрово с экрана осциллографа на фоторегистратор ФОР-2, а так же с помощью аппаратуры САМАС и ЭВМ "Электроника-60".

Фармакологические вещества вводили непосредственно в раствор, омывающий участок мембраны, ограниченный микропипеткой, через капилляр, введенный в микропипетку. Вещества использовали в следующих конечных концентрациях: кальциевый ионофор А-23187 (Са1Ь1осЬ1т) 1х10-«М; хинин (Реахим) 1x10"«--1x10-' М; фаллоидин (ВоеЬг1пвег Mannhei.ii) 20-50 мкг/мл. При использовании солевых растворов, не содержащих ЫаС1,'для сохранения осмотичности вводили эквимолярное количество трис.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изменение ответов сомы изолированных нейронов, обусловленное многократным применением электрических воздействий._

В задачу данной работы входило исследование пластических свойств изолированных нейронов. Пластические изменения реакции вызывались электрической стимуляцией.участка сомы клетки. В случае применения парной стимуляции локальные воздействия сочетались с генерализованными. Рассматривали два вида изменений исходной реакции на стимул - переход спайко-вых ответов в подпороговые и переход подпорогового ответа в надпороговый. Известно, что тип, динамика и время сохранения пластических изменений реакции зависят от индивидуальных свойств нейронов и от способа применения воздействий (интенсивности применяемых стимулов, последовательности и частоты их применения [Кэндел, 1980]. Из всего многообразия возможных воздействий необходимо было выбрать те, при которых возникали необходимые изменения реакции, а новый ответ нейрона сохранялся в течение времени, необходимого для регистрации нонных токов на нескольких участках соматической мембраны.

Влияние многократного применения локальных электрических воздействий на спайковые ответы.

На. соме размещали две микропипетки и вводили внутриклеточный электрод. Параметры стимулов подбирали так, чтобы, исходно, при . раздражении первого или второго участка каждый из стимулов, поданный на соответствующую микропипетку, вызывал генерацию одинакового числа ПД в ответе. Многократное применение таких внеклеточных непериодических стимулов с межимпульсным интервалом 0,5-3 сек в ряде случаев вызывало переход спайковых ответов на стимул (фиксированных'параметров) в подпороговые. Вероятность и динамика уменьшения эффективности вызова ПД находилась в зависимости от интенсивности первоначального ответа нейрона. Нами была исследована динамика перестройки реакции на стимулы, первоначально вызывающие генерацию от 1 до 7 ПД.

В случае если внеклеточный локальный стимул вызывал генерацию нескольких ПД, то первоначально перестройка реакции проявлялась в постепенном сокращение числа ПД в ответе до одного. Продолжение стимуляции нейрона вызывало прекращение генерации ПД при подаче стимула на этот участок. Такая реакция сомы нейрона на подачу стимулов фиксированных параметров развивалась с вероятноятью 86% по критерию знаков (67 экспериментов). В остальных 14% случаев (11 экспериментов) стимуляция выбранного участка сомы нейрона не приводила к появлению подпороговых ответов. Хотя, по мере нанесения стимулов, наблюдалось уменьшение количества ПД на один-два в ответе. В этом случае, после нанесения 250-300 раздражений стимуляцию участка прекращали. Стимуляция в 90% случаев не вызывала изменения потенциала покоя (ПП), в остальных случаях если и наблюдались изменения, то они не превышали 1-2 мВ. Такие колебания ПП наблюдались и в случае отсутствия воздействий, применяемых для изменения реакции нейрона на стимул. В случае если исходно стимул вызывал более слабую реакцию 1-2 ПД, то стимуляция с большей вероятностью вызывала появление подпороговых ответов (95% по критерию знаков 42 эксперимента). В 5% случаев стимуляция не вызывала изменения реакции на стимул. После нанесения 50-100 воздействий стимуляция участка прекращалась.

Были проведены эксперименты на соме нейронов, помещенных в раствор, не содержащий ионов натрия. Замена физиологичес-

кого раствора, имеющего полный ионный состав, на Везнатрие-вый проводилась непосредственно перед проведением экспериментов. Часть нейронов в безнатриевом растворе отвечала на нанесение стимулов генерацией ПД. Локальная электрическая стимуляция была проведена на 10 нейронах, у которых исходной реакцией на стимул была генерация одного ПД. Во всех проведенных экспериментах стимуляция участков вызывала появление подпороговых ответов.

Если первоначально локальный электрический стимул, наносимый на участок сомы, вызывал генерацию нескольких ПД, то после применения 30-50 стимулов число ПД в ответе уменьшалось до одного. Затем появлялись первые подпороговые ответы. На этой стадии (8-10 предъявлений) подпороговые ответы были нерегулярными. Наблюдалось чередование генерации ПД и подпороговых ответов. Начиная с 40-60 стимулов генерация ПД полностью прекращалась. Стимуляция одного участка не оказывала влияния на ответы нейрона, вызванные подачей импульсов на контрольный участок (минимальное расстояние между участками было 10-15 мкм). Генерацию ПД можно было вызвать при подаче стимула на первую микропипетку, изменив его параметры (амплитуду, длительность или полярность). Для определения времени сохранения полученной модификации ответа нейрона подавали на этот участок сомы стимулы с интервалом 30-60 сек. Генерация ПД в ответе нейрона возобновлялась через 2-10 мин. Восстановление исходного количества ПД происходило 'через 15-20 мин. Если после восстановления спайковых ответов на стимул повторить стимуляцию с межстимульным интервалом 0,515 сек, то описанные стадии изменения ответа можно было вызвать применением меньшего числа воздействий. В результате применения 8-10 стимулов происходило уменьшение количества ПД в ответе, после 15-20 стимулов спайковые ответы становились не регулярными, после 20-25 стимулов наблюдались только подпороговые ответы.

Исследовали влияние стимуляции на несколько участков соиы одного нейрона. Для этого после подачи серии стимулов на первую микропипетку проводили подачу такой же серии стимулов на вторую микропипетку. Если стимуляция первого участка вызывала перестройку ответов, то подавать стимулы на вторую микропипетку начинали после восстановления исходной реакции (4-7 ПД) на стимул, подаваемый на первую микропипетку. Пос-

ледовательная стимуляция двух участков сомы позволила выявить, что многократное применение локальных воздействий может оказывать различное влияние на ответы нейрона. Были выявлены нейроны» у которых перестройка ответов происходит при стимуляции каждого из двух произвольно выбранных участков, и нейроны, у которых перестройка происходила при стимуляции только одного из выбранных участков. Стимуляция не вызывала изменения исходных ответов на одном из участков сомы нейрона в 14% случаев.

Если стимул вызывал более слабую спайковую реакцию (1-2 ПД), то подпороговые ответы появлялись после нанесения 8-11 стимулов. Стадия чередования ПД и подпороговых ответов состояла из появления одного-двух спайковых ответов после появления подпороговых ответов. После нанесения 12-15 раздражений генерация ПД полностью прекращалась. Необходимо отметить, что в этих экспериментах в связи с тем, что стадия чередования двух видов ответов была кратковременной, токи регистрировали только после полного прекращения вызова спайковых ответов. Стимуляция, проводимая через одну микропипетку, не изменяла ответов на стимулы, наносимые через вторую мик-рогшпетку. Спайковые ответы можно было вызвать изменив параметры стимула, наносимого через первую микропипетку. Перестройка ответов сохранялась 1-5 мин. Затем происходило восстановление первоначальной реакции, и для вызова изменений ответов под действием повторных раздражений требовалось применение меньшего числа стимулов (9-12). Влияние сочетанного применения локальных' и генерализованных электрических воздействий па подпороговые ответы.

Для того, чтобы вызвать переход подпороговых ответов в спайковые, использовали многократное применение парных стимулов. Стимуляцию участка сомы подпороговыми воздействиями проводили в сочетании с внутриклеточной стимуляцией. Стимулы, подаваемые на внутриклеточный микроэлектрод, вызывали спайковые ответы.

Внеклеточные локальные стимулы, подаваемые на каждую из микропипеток, первоначально ' вызывали подпороговые ответы амплитуда которых не превышала 1-3 мВ {потенциал покоя нейронов -55, -60 мВ). Внутриклеточные стимулы вызывали генерацию 1-2 ПД. Подпороговый и надпороговый стимула подавали попарно. Подпороговый стимул, при таких пр.еДьявле-

ииях воздействий, всегда подавался первым, а через определенный интервал (50-100 мсек), подавался иадпороговый стимул. Нанесение парных стимулов было нерегулярным интервал, изменялся от 5 до 15 сек. В 69% случаев (38 экспериментов) такая стимуляция вызывала переход подпороговых ответов в спайковые. В 17% случаев (10 экспериментов) изменялся ответ на второй стимул пары, он становился подпороговым. В 14% случаев (8 экспериментов) стимуляция не вызывала перестройки ответов. Парная стимуляция не вызывала изменений ПП сомы нейрона.

Если локальный электрический стимул, наносимый на участок сомы, вызывал подпороговый ответ, то в результате применения первых 15-20 сочетанных раздражений происходило увеличение амплитуды подпорогового ответа. При продолжении стимуляции на исходно подпороговые стимулы нейрон начинал отвечать генерацией ПД. На этой стадии (20-30 стимулов) спайковые ответы чередовались с подпороговыми ответами. После 303 5 сочетанных стимулов, генерация ПД в ответ на первый стимул становилась регулярной. Сочетанная стимуляция одного участка не вызывала изменений ответов на подпороговые стимулы, наносимые на другие (контрольные) участки нейрона. Подпороговые ответы при нанесении воздействий через первую микропипетку ^можно было вызвать при уменьшении интенсивности стимула. Для определения времени сохранения модификации ответа подавались одиночные стимулы с интервалом 0,5-1 мин. Спайковые ответы на первоначально подпороговый стимул сохранялись в течение 2-7 мин. Подача одиночных стимулов с такой же частотой, что и при парной стимуляции, позволила выявить, что генерация ПД сохранялась в ответе на 10-10 стимулов. Затем ответы на стимул, подаваемый через первую микропипетку, становились подпороговыми (как это было до проведения стимуляции), При повторной парной стимуляции изменение ответа (генерация ПД на первый стимул) наступало в результате применения меньшего количества (6-10) стимулов. Интегральные ионные токи, протекающие через участки соматической мембраны нейронов.

Регистрировали суммарные ионные токи, протекающие через участки соматической мембраны, ограниченные отверстием кончика микропипетки (5-10 мкм). При регистрации ионных токов, протекающих через различные участки одного нейрона, были об-

наружены значительные отличия по амплитуде и соотношению входящих и выходящих токов. В пределах одного нейрона можно было обнаружить участки, на которых были зарегистрированы либо только входящие, либо выходящие токи, а также участки, на которых были зарегистрированы оба компонента суммарных ионных токов.

Стимуляцию, изменяющую ответы нейрона, как правило, проводили на участках, ионные токи которых были-представлены входящими и выходящими компонентами. Ионные токи на этапе чередования надпороговых и подпороговых ответов на стимулы фиксированных параметров.

Регистрация ионных токов, протекающих через участки сомы нейрона (на этапе когда в ответах на воздействия наблюдалось чередование ПД и подпороговых ответов), не позволила выявить каких либо отличий в изменении токов обусловленных направлением перестройки и исходных видов ответов. В случае уменьшения и в случае увеличения эффективности вызова спайковых ответов, не зависимо от типа проводимой стимуляции, (локальная стимуляция участка или в сочетании с внутриклеточной стимуляцией) наблюдались сходные изменения ионных токов участков мембраны. При перестройке подпороговых и спайковых ответов наблюдались изменения входящих и выходящих компонент токов. Амплитуда входящих токов увеличивалась на 50-200% (в сравнении с токами, которые регистрировали до проведения стимуляции) . Уменьшалось время достижения пиковых значений этих токов. Медленные выходящие токи уменьшались на 10-15%. В 30% случаев на этой стадии перестройки нейрональной реакции на -кривой выходящего тока появлялся перегиб. Подобная форма выходящих токов не была зарегистрирована на участках нейрона до нанесения воздействий и на стадии стабильного состояния ответов.

Ионные токи, протекающие через участки, на которх не проводилась стимуляция, не изменялись. Ионные токи на стадии стабильного состояния ответов.

На этой стадии также не было обнаружено каких либо отличий изменений токов, обусловленных направлением перестройки и видом исходных ответов.

Амплитуды входящих токов, на этой стадии, по сравнению с токами, зарегистрированными на стадии нестабильной перестройки ответа уменьшались, но оставались Больше, чем до пере-

стройки ответов.' Время достижения максимума амплитуды входящего тока увеличивалось.

Выходящие токи изменялись относительно исходных незначи-' тельно, в 80% случаев недостоверно. В остальных случаях амплитуда выходящих токов уменьшалась на 10-15%.

Не изменялись ионные, токи, протекающие через участок, на котором не проводилась стимуляция.

В случае если, многократная стимуляция не вызывала изме-' нения эффективности ответа, не было зарегистрировано и изменения токов на участках мембраны сомы нейрона.

В растворе не содержащем ионов натрия как и в нормальном растворе перестройка ответов сопровождалась увеличением входящих токов.

Влияние на пластические свойства изолированных нейронов локальной модификации ионной проводимости мембраны.

Было исследовано влияние локальных модификаций ионной проводимости на пластические свойства сомы нейрона. Для этой цели были использованы кальциевый ионофор А-23187 и хинин. Молекулы кальциевого ионофора встраиваются в мембрану и значительно повышают вхождение кальция в клетку. Хинин является блокатором кальцийзависимых калиевых каналов. Известно, что оба эти вещества изменяют пластические свойства нейрона. В случае их введения в раствор, омывающий ганглий, кальциевый ионофор ускоряет развитие привыкания, хинин блокирует развитее этой реакции (Дьяконова, 1983, Дьяконова, 1984).

Исследовалось влияние локальной модификации мембраны этими веществами на перестройку спайковых ответов. Для определения области действия веществ проводили локальную стимуляцию двух участков мембраны. Минимальное расстояние между участками было 10-15 мкм.

В начале эксперимента проводили, последовательно, стимуляцию первого и второго участков сомы нейрона. Если стимуляция участков мембраны под первой и второй микропипетйами вызывала переход спайковых ответов (1-2 ПД) в подпороговые, то после восстановления исходного количества ПД в ответах нейрона в раствор, омывающий один из участков (под давлением, из капилляра, расположенного внутри микропипетки) вводили одно из веществ. И через 5-10 мин после введения вещества проводили повторные серии стимуляции.

В случае введения кальциевого ионофора было обнаружено,

что спайковые ответы на стимулы, подаваемые на первую микропипетку, прекращались после предъявления первых 4-5 воздействий. При проведении повторной стимуляции контрольного участка не было обнаружено изменений ранее описанной динамики перестройки ответов.

В случае введения хинина было обнаружено, что ответы на стимулы, наносимые через эту микропиПетку, не изменялись в течение 30-60 мин стимуляции. Обработка одного участка нейрона не оказывала влияния на развитие перестройки ответов, при стимуляции участка, не обработанного хинином.

В связи с тем, что хинин изменял проводимость потенциал-зависимых каналов на участках мембраны под микропипетками, проводили регистрацию потенциалзависимых ионных токов. Первую после введения хинина регистрацию токов на участке проводили после нанесения 15-20 воздействий. Такое количество стимулов, в обычных условиях, (до обработки мембраны хинином) было достаточно для вызова перестройки•ответов. Обработка участка мембраны хинином приводила к уменьшению амплитуда выходящих токов. Величина изменения амплитуды этих токов на разных нейронах и на участках одной клетки значительно варьировала - от 10-20% до почти полного подавления. Влияние стабилизации микрофиламентов на пластические свойства сомы нейрона.

Для исследования влияния состояния цитоскелета на пластические свойства нейронов в раствор микропипетки вводили фаллоидин. Известно, что это вещество стабилизирует полимерную форму белка актина - микрофиламенты. Мономерная и полимерная форма этих белков в клетке находятся в состоянии динамического равновесия. Фаллоидин нарушает реакцию деполимеризации и тем самым стабилизируется полимерная форма белка актина в клетке 1987 1.

Фаллоидином . действовали на участки сомы нейронов, у которых локальная электрическая стимуляция вызывала переход спайковых ответов, состоящих из 1-2 ПД, в подпороговые. Такая стимуляция проводилась на двух участках. В случае, если стимуляция каждого участка вызывала перестройку ответов, один из участков обрабатывали фаллоидином. В одних экспериментах вещество вводили после проведения стимуляции, вызвавшей прекращение генерации спайковых ответов, в других после самопроизвольного восстановления спайковых ответов,

В первом случае фаллоидин,начинали вводить в раствор, омывающий участок мембраны, сразу после прекращения вызова спайковых ответов. Введение вещества в раствор до конечной концентрации проводили в течение 20-25 мин и в это время продолжали подавать стимулы с интервалом 0,5-3 сек). Затем на этот участок, для определения времени сохранения перестройки реакции, начинали подавать стимулы с интервалом 1-2 мин. Восстановления первоначальной реакции на стимул не наблюдалось в течение периода регистрации 1-1,5 часа. На другом участке время восстановления спайковых ответов не изменялось. В других экспериментах' вводили вещество после восстановления исходных ответов и проводили повторную стимуляцию участка. В этом случае не наблюдалось перехода спайковых ответов в подпороговые после нанесения 100-150 стимулов. На контрольном участке для вызова перестройки ответа было достаточно нанести 10-15 стимулов.

Перед введением фаллоидина и в дальнейшем, в течение эксперимента, проводили регистрацию суммарных ионных токов на участке мембраны под микропипеткой. Не было обнаружено достоверных изменений токов, вызванных обработкой участка мембраны фаллоидином.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе исследовались условия возникновения локальных изменений возбудимости сомы изолированных нейронов. Из многообразна воздействий, вызывавших пластические перестройки ответов, были выбрани схемы стимуляции, модели7 рующие ослабление (привыкание) и условнорефлекторное усиление нейрональных реакций. Выбор определялся тем, что использование схем воздействий, имитирующих поведенческие методики выработки научения на клеточных аналогах позволяет вызывать изменения нейрональных реакций и поведения. На препаратах, состоящих из сомы изолированных нейронов, было показано,что использование этих схем воздействия вызывает биофизические и биохимические перестройки нейрональных реакций, адекватных тем, что были характерными для нейрона, который находился в составе ганглия [ Дьяконова, 1984, Осогг еХ, а!. , 1985, Castel-1иссх еЪ а1. , 1986 ].

Электрическая стимуляция небольших участков сомы, по выбранным схемам воздействий, вызывала перестройку ответов нейронов и являлась удобным приемом для практического создания

и выявления локальных пластических перестроек. Локальность изменения свойств электровозбудимой мембраны была обнаружена при сравнении ответов нейронов на раздражения, наносимые на участки нейрона, соседние с зоной применения многократных воздействий. Было обнаружено, . что стимуляция одного участка, вызывая изменение ответа нейрона, не оказывает влияния на ответы этой же клетки, вызванные нанесением тестирующих воздействий на другие участки и мембрану всей сомы. Минимальное расстояние между участками было 10-15 мкм. Сравнение перестроек ответов, вызванных одиночной и парной стимуляцией, позволило выявить, что в том и другом случае изменение возбудимости сомы нейрона происходит локально, хотя в случае парной стимуляции, локальные воздействия на мембрану сочетались с генерализованными воздействиями. Изменения свойств небольших зон хемочувствительной соматической мембраны были обнаружены в аналогичных условиях стимуляции при сочетании!! микроаппли-кацни и генерализованного электрического раздражения клетки [Греченко, Зинц, 1983).

Данные об участии локальных изменений проводимости мембраны в пластических процессах были получены так же на нейронах гиппокампа кролика с применением радиоактивного форболо-вого эфира. Этот молекулярный зонд позволяет определить распределение протеинкиназы С, которая ассоциирована с мембраной и модулирует ее проницаемость для ионов калия. Показано, что после обучения происходит перераспределение метки с сомы нейронов в область дендритов. Такое динамическое, гетерогенное распределение молекулярного зонда авторы считают отражением неоднородности изменения свойств электровозбудимой мембраны, связанных с процессам^ обучения и сохранения информации [Olds et al., 1989] .

Обнаруженные нами локальные изменения возбудимости не сопровождались изменением МП и порога генерации ПД при внутриклеточном нанесении стимулов. Изменение возбудимости участка мембраны изолированных нейронов сопровождалось и изменением ее проницаемости для ионов. Это было выявлено при регистрации ионных токов на участках мембраны. Обнаружено, что, исходно, на разных участках сомы одной клетки амплипуды как входящих, так и выходящих токов могут значительно отличаться. Были обнаружены участки с преобладанием либо входящих, либо выходящих токов. Полученные данные', вероятно, отражают

неравномерность распределения каналов соответствующих ионных токов нейронов1и, возможно, указывают на тот факт, что на соме изолированных нейронов, находящихся в течение суток вне состава ганглия, сохраняется неравномерное распределение ионных каналов. Такое гетерогенное распределение ионных каналов может быть как следствием сохранения пространственных структур дифференцированного нейрона, так и быть отражением процессов перестройки функциональных ансамблей, которые могут возникать в процессе культивирования нейронов. Известно, что распределение ионных каналов и рецепторов медиаторов на нервных клетках моллюсков является неоднородным и такое распределение рецепторов на соме нейронов виноградной улитки обусловливает различную динамику привыкания на микроаппликации ацетилхолина [Саганелндзе, Пивоваров, 1987].

Доводом в пользу того, что обнаруженные неоднородности в распределении ионных каналов, вероятнее всего, líe являются следствием сохранения распределения каналов, которое существовало до диссоциации нейрона, служит обнаруженное значительное и быстрое изменение регистрируемых токов, которое наблюдается при стимуляции клетки (перестройке ответа). Более вероятным кажется предположение, что функциональные ансамбли каналов и/или рецепторов медиаторов являются динамическими образованиями, возникающими и перестраивающимися р результате применения воздействий.

Изменение ионных токов может быть обусловлено как модификацией отдельных каналов [Alkon, Rasmusaen, 1988], так и изменением топографии каналов на участке мембраны [Lynch, Bau-dry, 1984]. Известно, что протеинкиназы и ионные каналы в клетке могут быть пространственно разобщены и для реализации фосфорилирования необходима их транслокация folds et al. 1989, Saiton, 1985]. Вероятно, в том и другом процессе может принимать участие цитоскелет. Нарушения функционирования ци-тоскелета, вызванные фаллоидином, на изолированных нейронах не изменяли ионных токов, но блокировали пластические перестройки ответов. Полученные результаты поддерживают предположения об участии цитоскелета в пластических процессах.

Обнаруженные локальные изменения возбудимости были обратимы. При прекращении стимуляции наблюдалось самопроизвольное восстановление исходного вида ответов. При повторении процедуры стимуляции перестройка ответов наступала при нане-

сении меньшего числа стимулов, что, вероятно, можно рассматривать как проявление процессов памяти. При изменении параметров стимула или • места нанесения раздражения вид ответа изменялся. Одним из возможных механизмов пространственной дифференцировки является локальное изменение ионной проницаемости мембраны нейрона. Совокупность полученных результатов показывает, что при последовательных электрических раздражениях участка сомы изолированного нейрона наблюдается ряд закономерностей изменения ответов, обнаруженных и при применении аналогичных алгоритмов воздействия (форм обучения> на менее редуцированных препаратах нервной системы моллюсков.

Было обнаружено, что разнонаправленные перестройки ответов сопровождались однотипными изменениями суммарных токов. Отмеченное локальное увеличение входящих токов наблюдалось в нормальной и безнатриевой среде, что свидетельствует об увеличениии кальциевой проводимости при разнонаправленных перестройках ответов.

На сенсорных нейронах аплизии изучены мембранные механизмы привыкания и условнорефлекторного усиления оборонительного поведения [Hawkins, 1984]. На фоторецепторах гермиссенды исследовались ионные механизмы повышения возбудимости при условнорефлекторном обучении [Alkon, Sakakibara, 1985]. Были выявлены следующие закономерности: при усилении нейрональной реакции уменьшается амплитуда выходящих токов, увеличивается входящий кальциевый ток. Привыкание на разных обьектах сопровождается разнонаправленными изменениями кальциевых токов. Так при привыкании в сенсорных нейронах аплизии отмечено уменьшение вхождения ионов кальция в клетки (Kandel, Schwartz, 1982].

На нейронах виноградной улитки увеличение, вхождения кальция в клетку, в некоторых случаях, способствует развитию привыкания. Хотя блокада калиевой проводимости, приводящая к увеличению вхождения кальция в клетку, блокирует развитие привыкания на этих клетках [Дьяконова,1983, Дьяконова,1984 ] .

Эти неоднородности влияния ионов кальция на пластические перестройки ответов наблюдались и при локальной модификации проводимости мембраны. Разнонаправленность перестройки ответов при увеличении вхождения кальция может свидетельствовать об участии в реакции нескольких механизмов, определяющих направление изменения клеточного ответа. Принимая во внимание

\

разнонаправленное влияния увеличения входящего тока на характер изменения электрической активности, можно предположить, что в реализации перестройки ответов решающую роль играет не ионизированный кальций, переносимый этим током, а определенные биохимические процессы, в регуляции которых пронимают участие эти ионы. Известно, что кальций может активировать ферментативные реакции, а в некоторых случаях он изменяет эффективность биохимических процессов, которые активируются другими факторами. Вероятно, при выбранных условиях стимуляции происходит активация ряда биохимических реакций, сопряженных, во-первых, собственно с действием внешних сигналов,-во-вторых, с ответами клетки на стимул. На начальных стадиях двух разнонаправленных модификаций ответа реакция клетки представлена ПД. Этот факт позволяет сделать предположение, что вызванное генерацией ПД повышение концентрации кальция в цитоплазме может инициировать изменение ионной проницаемости мембраны на участке применения локальных воздействий, в том числе и через потенциалзависимые кальциевые каналы.

В экспериментах было обнаружено, что период наибольшего увеличения ионных токов совпадает с появлением нового вида ответов на стимул. Кроме того необходимо подчеркнуть, что после появления нового вида ответа наблюдается чередование спайковых и подпороговых ответов на стабильные стимулы. Особо хочется отметить, что при раздельном использовании надпо-роговых или подпороговых стимулов с большей вероятностью развивается ослабление и полное прекращение ответов на стимул. При сочетанном предьявлении этих же стимулов на первое из парных воздействий развивается усиление ответов. Влияние двух воздействий при их парном предьявлении на поведенческие и нейрональные реакции были неоднократно описаны и ведутся интенсивные поиски механизмов, обусловливающих такие процессы. Полученные данные указывают, что такое взаимодействие может реализоваться на субклеточном уровне. Обнаруженная локальность изменения ионной проницаемости мембраны при перестройке ответов нейрона отражает локальное изменение* субклеточных процессов, обусловливающих реактивность нейрона.

Моделью для изучения локальных субклеточных механизмов пластичности может быть перестройка ответов изолированных нейронов, вызванная условиями стимуляции, имитирующими поведенческие методики обучения.

выводы

1. Впервые описаны условия, позволяющие вызывать изменения ионной проницаемости части соматической мембраны нейрона под влиянием последовательных электрических раздражений.

2. Обнаружено, что изменение реакции изолированных нейронов на локальные электрические воздействия могут сопровождаться изменением ионных токов.

3. Впервые обнаружено, что изменение ионных токов может быть локальным и ограничено зоной воздействий.

4. Показано, что разнонаправленные пластические изменения ответов нейрона могут сопровождаться локальным увеличение входящих кальциевых токов. (

5. Обнаружено, что экспериментально вызванное локальное изменение кальциевой или калиевой проводимости может вызывать перестройку реакции нейрона на стимул. Изменение ответа нейрона проявляется только при воздействии на модифицированный участок мембраны.

6. Обнаружено, что стабилизация микрофиламентов цитоске-лета может, не оказывая прямого воздействия на электрические характеристики соматической мембраны, изменять ее пластические свойства. Нарушение динамического состояния микрофиламе-нтоа блокирует развитие пластических изменений ответов и самопроизвольное восстановление исходной реакции на стимул сомы изолированных нейронов.

7. Получены прямые экспериментальные данные об участии локальных мембранных механизмов в пластических изменениях свойств электровозбудимой мембраны.

8. Разработан комплекс приемов, позволяющих локально модифицировать пластические свойства клетки и одновременно регистрировать физические параметры ее мембраны.

РАБОТЫ ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ратушняк A.C., Запара Т.А. Пластичность клеточной мембраны при хеморецепции. В сб. "Возбудимые клетки в культуре ткани." (Материалы 1 Всесоюзного симпозиума), Пущино, 1984, с. 152-155.

2. Запара Т.А., Ратушняк A.C. Локальные изменения ионных токов при пластических изменениях электрогенеза нейрона. Тез. Всесоюзная конференции "Простые нервные системы и их значение для теории и практики". Казань, 1985. с. 76-78.

3. Запара Т.А., Ратушняк A.C., Штарк М.Б. Локальные изме-

нения трансмембранных токов при пластических перестройках электрогенеза изолированных нейронов прудовика. Журнал высшей нервной деятельности. 1988, Т. 38, вып. 1, с. 140-145.

4. Запара Т.А., Ратушняк A.C. Моделирование на изолированных нейронах пластических перестроек функциональной активности. В сб. "Простые нервные системы" Л., Наука, 1988, с. 120-123.

5. Ратушняк A.C., Запара Т.А. Изолированные нейроны как объект для исследования базовых принципов переработки информации. В сб.- "Простые нервные системы" Л. Наука, 1988, с. 252-256.

6. Ратушняк A.C., Запара Т.А. Моделирование нескольких зон пластичности в пределах одного нейрона. В сб. "Имитация сисмем в биологии и медицине. (Материалы б-го Пражского международного симпозиума Социалистических стран). ЧССР. Прага.

7. Запара Т.А., Ратушняк А.С. Перестройка реакции нейрона при локальной модификации мембраны. Доклады Академии наук СССР, 1989, Т. 309, N 4, с. 1012-1014.

8. Zapara Т.А., Ratushnyak A.S., Stark М.В, Local changes of transmembrane currents at plastic reorganizations of ele-ctrogenesis of isolated neurones of the snail. Neuroscience and behavioral physiology, 1989, v. 19 rio. 3, p. 140-145.

9. Запара Т.А., Ратушняк А.С. Функциональные взаимодействия электровозбудимых и цитоскелетных структур при пластических реакциях нейрона. Тез. "XXVII совещания по проблемам ВНД ." л.: Наука, 1989, с. 17.

1988

Подписано к печати 0.3 сентября 1990 р.

Формат бумаги 60x90 1/16. Обьем 1,2 печ.л., 1 уч.-изд.л.

Тираж 100 экз. Заказ N 115

Отпечатано на ротапринте Института автоматики иэлектрометрии СО АН СССР. Новосибирск, 90