Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора"

На правах рукописи

Глинщнкова Ольга Анатольевна

Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора.

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Судариков Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Карякин Александр Вадимович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ.

заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г.Москва, Новозыковский пр-д, д.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гемаюлогического научного центра РАМН.

доктор медицинских наук, профессор Михайлов Михаил Иванович

Защита состоится «,

1с/А 2005г., в

1асов на

Автореферат разослан « лз »

2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Реук. В.Д.

20О6-4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы диссертации. Одним из основных методов молекулярной диагностики вирусных инфекций в последние годы стала полимеразная цепная реакция. Сложность использования ПЦР в количественном формате объясняется экспоненциальным характером нарастания концентрации продукта реакции. Преодолеть эту проблему помогает введение в реакционную смесь внутреннего стандарта, который амплифицируется с теми же праймерами, что и исследуемая мишень. Введение внутреннего стандарта делает реакцию амплификации конкурентной, позволяя проводить количественные оценки начальной концентрации исследуемой мишени по известной начальной концентрации внутреннего стандарта.

В литературе описаны и применяются на практике разные типы внутренних стандартов. Особые проблемы возникают при разработке РНК-внутренних стандартов. Это связано с тем, что молекулы РНК нестабильны, легко подвергаются рибонуклеазному расщеплению. Существует несколько типов внутренних РНК-стандартов. Это свободные РНК-стандарты, биологические стандарты (культивируемые вирусы, виремичная плазма), генноинженерные стандарты (рекомбинантные бактериофаги и вирусы животных).

Оригинальная разработка, описанная в диссертации, предлагает новый тип внутреннего РНК- стандарта - стандарт на основе ретровирусного вектора - для определения вируса гепатита С (НСУ).

В настоящее время во всем мире насчитывается 170 млн. человек -носителей вируса гепатита С. И это не только источник для новых заражений - хронический гепатит С приводит к развитию цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциноме. Основными прогностическими факторами для противовирусной терапии является генотип и динамика изменения концентрации вируса в течение первых недель лечения. Поэтому,

представляет интерес использование полученного внутреннего стандарта в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК НСУ, а так же его применение для количественного определения изменения концентрации РНК НСУ в ходе противовирусной терапии.

Использованный для создания внутреннего РНК-стандарта подход может быть применен при разработке современных тест-систем для ПЦР-диагностики любых РНК-содержащих патогенов.

Цель работы. Разработка внутреннего РНК-стандарта на основе ретровирусного вектора для конкурентной ПЦР, который позволяет оценивать количественные изменения концентрации РНК НСУ в сыворотке крови больных при терапии и контролировать прохождение реакции в каждой пробирке при качественном определении и генотипировании РНК вируса гепатита С.

Задачи исследования.

1. Создание генно-инженерной конструкции, представляющей собой ретровирусный вектор с клонированной в него модифицированной вирусной последовательностью, используемой для амплификации в полимеразной цепной реакции;

2. получение пакующей линии клеток, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом вирусного генома;

3. использование полученного внутреннего стандарта в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК НСУ;

4. применение полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК НСУ.

Научная новизна. Предложен новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР - это РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора.

Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РЖ HCV в сыворотке крови больных. Предлагаемый внутренний стандарт представляет собой рекомбинантные ретровирусные частицы в культуральной среде пакующих клеток. Концентрация внутреннего стандарта измеряется в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней. Изобретение запатентовано в России.

Практическое значение работы. Предложенный в работе подход целесообразно использовать при получении внутренних РНК- стандартов для конкурентной ПЦР и real-time ПЦР для диагностики любых РНК-содержащих патогенов. В ходе исследования получен внутренний РНК-стандарт для конкурентной ПЦР для определения и генотипирования РНК HCV.

Основные положения, выносимые на защиту. Разработан новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР - РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора. Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РНК HCV в сыворотке крови больных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (2000г.Москва) и на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении», проводимом в рамках международной научно-практической конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (2002г. Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 6 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2186388, Государственный реестр изобретений РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и

з

списка цитируемой литературы. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы. Список цитированной литературы включает 108 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав.лаб. - к.б.н. Судариков А.Б.).

Образцы сывороток. В работе использованы сыворотки крови больных вирусным гепатитом С, проходящих лечение в Гематологическом научном центре РАМН по поводу гемобластозов.

Выделение РНК вируса гепатита С из сыворотки крови. РНК HCV выделяли с помощью гуанидинтиоцианата. Сыворотку крови (50 мкл) растворяли в 450 мкл лизирующего буфера (5.5 М гуанидинтиоцианат, 0.3 М натрий ацетат, об/об фенол, насыщенный 0.1 М Трис, pH 6.5, транспортная РНК, 25мкг/мл). Добавляли 100 мкл хлороформа. Центрифугировали. К водной фазе добавляли равный объем изопропанола. После центрифугирования осадок отмывали 70% этанолом и растворяли в 25 мкл деионизованной воды. Для проведения ОТ-ПЦР использовали 5 мкл раствора РНК.

Обратная транскрипция и «nestedw-ПЦР. Обратную транскрипцию и ПЦР осуществляли в одном реакционном буфере, содержащем два фермента: ревертазу M-MLV и TAQ-полимеразу. Для амплификации использовали 5'-нетранслируемый район генома вируса гепатита С с универсальными и генотипспецифическими праймерами для «nested»-nUP, описанными в патенте РФ № 2150505. Все праймеры были синтезированы фирмой «Синтол», Россия.

Амплификационная смесь для проведения обратной транскрипции и первой стадии ПЦР (25 мкл) содержала 50мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 2мМ MgCl2, 4% формамид, 0,1 мкМ EDTA, 200 мкМ dNTP, 0,1 мкМ праймеры, 5мМ DTT, фермент M-MLV RT 10 ед., ингибитор рибонуклеаз

5ед., фермент TAQ-полимераза 1 ед.. Амплификационная смесь для проведения второй стадии ПЦР (25 мкл) содержала 50мМ КС1, 10 мМ Tris-НС1 (рН 8,3), 2мМ MgCl2, 4% формамид, 0,1 мкМ EDTA, 200 мкМ dNTP, 0,1мкМ праймеры, фермент TAQ-полимераза 1 ед..

Амплификацию проводили в программируемом термостате "Perkin Elmer Cetus" при следующем температурном режиме: обратная транскрипция - 42°С 60 мин; I стадия ПЦР (25 циклов) - 94°С ЗОсек., 42°С бОсек., 72°С 45сек.; II стадия ПЦР (25 циклов) - 94°С ЗОсек., 58°С бОсек., 72°С 45сек..

Анализ результатов осуществлялся методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Конструирование внутреннего стандарта (рис.1).

1. Клонирование фрагмента кДНК HCV дикого типа в вектор pGEM-TEasy (Promega). Выделили РНК из сыворотки крови больного вирусом гепатита С генотипа lb. Провели обратную транскрипцию и первую стадию ПЦР. Получили кДНК вируса гепатита С дикого типа, которую затем лигировали в вектор pGEM-TEasy (Promega) и клонировали в клетках E.coli (штамм ТВ 1). Селекцию клонов проводили на среде LB + 2% агар + x-GAL + IPTG + ампициллин. Выросшие белые колонии проверяли на наличие вставки 417 н.п. методом ПЦР.

2. Модификация кДНК HCV дикого типа. Удлинили кДНК HCV дикого типа вставкой 628 н.п. в сайт KpnI. Полученный продукт pGEM-TEasy/HCV* клонировали в клетках E.coli ( штамм TBI). Селекцию клонов проводили на среде LB + 2% агар + ампициллин. Выросшие колонии проверяли на наличие вставки 1045 н.п. методом ПЦР.

3. Переклонирование модифицированной кДНК НСУ в ретровирусный вектор рВаЬе-Риго. Вырезали из вектора рСЕМ-ТЕазу/НСУ* рестриктазой ЕсоШ модифицированный фрагмент к ДНК НСУ* размером 1126 н.п. и лигировали его в вектор рВаЬе-Риго, обработанный рестриктазой ЕсоШ

(единичный сайт).

Полученный продукт рВаЬе/НСУ* клонировали

в клетках Е.соН ( штамм ТВ1). Селекцию клонов проводили на среде ЬВ + 2% агар + ампициллин. Выросшие колонии

проверяли на наличие

вставки рестрикцией сайтам EcoRI.

по

Рис. 1. Схема получения внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора.

Все манипуляции с РЖ и ДНК осуществляли по стандартным методикам, описанным в Current Protocols in Molecular Biology (on CD). Измерения концентрации ДНК проводили спектрофотометрически.

Получение пакующей клеточной линии. Полученная конструкция pBabe/HCV* была трансфектирована в мышиную пакующую линию PG13 [АТСС CRL-10686] методом электропорации. После селекции клеток на пуромицине провели клонирование методом лимитирующих разведений в среде DMEM с добавлением 20% FBS. Культуральную среду клонов, содержащую упакованную в ретровирусные частицы РНК-матрицу

б

(внутренний стандарт) собрали, разлили по аликвотам, заморозили при -70°С и использовали для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР.

Титр ретровирусных частиц в культуральном супернатанте

оценивали по числу пуромицин-устойчивых колоний, выросших после инфицирования клеток-мишеней на селективной среде, по стандартной методике. Титр препарата определяли как количество колониеобразующих единиц (инфекционных единиц - инф.ед.) в 1мл вирусной суспензии.

Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК НСУ. Методом конечных разведений стокового раствора внутреннего стандарта известной концентрации определяли минимальную концентрацию внутреннего стандарта, при которой продукт его амплификации виден на электрофорезе.

В качественном методе внутренний стандарт в минимальной концентрации добавляли в лизирующий буфер для выделения РНК НСУ из сывороток крови больных.

Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК НСУ. Мы приготовили 5 разведений стокового раствора внутреннего стандарта с концентрацией 2x106 инф.ед./мл с шагом 5 (4x105 инф.ед/мл, 8х104инф.ед/мл, 1,6x104 инф.ед/мл, Зх103инф.ед/мл, 6x102 инф.ед/мл), добавили их в лизирующий буфер для выделения РНК из сыворотки крови. Получили набор из 6 лизирующих буферов:

Разведения

культурального супернатанта

Инфицирование

клетки \Vi38

Селекция на

пуромицине

Подсчет числа колоний

Рис.2. Определение титра ретровирусных частиц в культуральном супернатанте.

№1-№5 - содержали уменьшающиеся количества внутреннего стандарта, №6 - лизирующий буфер без стандарта.

Этот набор использовали для выделения РНК из HCV-положительных сывороток крови по стандартной методике. Таким образом, для каждого больного получили 6 образцов РНК, которые затем использовали для проведения ОТ-ПЦР по методике, описанной выше.

Статистическая обработка количественных измерений.

Приготовили 9 последовательных разведений РЖ HCV-положительной сыворотки крови (генотип lb) с шагом 2. Для разведения использовали РНК HCV-отрицательную сыворотку. Получили 10 образцов сыворотки, содержащих уменьшающиеся количества вирусной РНК. Каждый образец разделили на три части. Таким образом, всего получили 30 образцов сыворотки крови. Далее эти образцы были зашифрованы, и измерение титра вирусной РНК проводилось «вслепую» описанным выше способом. Для оценки эффективности количественных измерений был выбран ранговый коэффициент Спирмена с соответствующей оценкой его значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Использование внутренних стандартов в полимеразной цепной реакции позволяет контролировать прохождение реакции в каждой пробирке и проводить количественные определения концентрации амплифицируемой мишени.

Технология получения РНК-внутреннего стандарта для ОТ-ПЦР включает: получение кДНК амплифицируемой мишени; ее модификацию тем или иным способом; in vitro или in vivo транскрипцию с образованием модифицированной РНК; упаковку РНК в фаговые или вирусные частицы (для армированных стандартов); определение концентрации полученного внутреннего стандарта.

g

Фрагмент генома вируса гепатита С (5'UTR и часть гена Core) генотипа

1Ь был амплифицирован методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в качестве первой стадии и клонирован в вектор рОеш-ТЕаБу (Ргоп^а). Затем клонированная вирусная последовательность была модифицирована

tcaHI kpnl

введением вставки и переклонирована в ретровирусный вектор pBabe-Puro,

содержащий ген устойчивости к Рис 3 Карта внутреннего стандарта

конструкцию pBabe/HCV* (рис.3).

Была определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента (GenBank AY171560) (рис.4).

1 AATTCGATTG AGGGTGTCGA TGACCTTACC CAAATTACGC GACTTACGCC GGGGGTCCGT

61 GGGGCCCCAA CTAGGCCGGG AGCCGCGGGG TGACAGGAGC CATCCTGCCC ACCCCAAGCC

121 CTCATTGCCG TAGAGGGGCC AAGGGTACCA AGCGACACCT GCTAGGTAGA GTAGAGCATC

181 GGAGGAGCCA AGTTCTTTTA GCCTGAGGAG AGACTGTTGC ААТСТСТССТ TTAATAGCTG

241 GCTGCGGGTA САСТСТАСТА ATTTCAGTCT CCTGGATGCC AAGACTCCGT CAGCTGCCTG

301 CTGACAGATT GTCTTTTGAG CTTTACAATT CAGGAAGAGG TCTGCATTCT CTGCATGCTT

361 TCTATGGTTT TTCCAATGTA TTTGGAGGCG GGTTTCCTCT TTGCTACACT TTATGCATGA

421 AGGAACCTCT TTGGCAAAAT CAAGATAATA CCCCATAATT AACAGGGGAT CATCAAGGTT

4 81 GTTTTCTAGT GCAAAGTCTG CTACCATAAT CCAGTCTACT GCTTTCTGTT CTTCTGGCTC

541 GTCTGTAAAC TCGAATTGGT GGAGGCCGGC TTATTTTCTG TTATTAACTG AAATGGTGCT

601 GCGGTTACAA CTTGATAGCA TTCCATAGGC TTGGTGACTG CCTTACACAT TAGGAAGCTG

661 CGGCAAAGCT TAGAGCAATA АТТСТТААСТ GCTGAAACCC TGTGCTTAGT CATAGTTAGA

721 AAGAACAGCA TGCCCCCCTC CTCATAATGG ACCAGGCATT TGAATTCGAG CTCGGTACCC

781 AGGCTGAGCC CAGGCCCTGC CCTCGGGTTG GCGAGCCCTG GGGATGGGTT GTCGCCTTCC

841 ACGAGGTTGC GACCGCTCGG AAGTCTTCCT AGTCGCGCGC ACACCCAACC TGGGGCCCCT

901 GCGCGGCAAC AAGTAAACTC CACCAACGAT CTGACCACCG CCCGGAAACT TAACGTCCTG

961 TGGGCGGCGG TTGGTGTTAC GTTTGGTTTT TCTTTGAGGT TTAGGATTCG TGCTCATGGT

1021 GCÄCGGTCTA CGAGACCTCC CGGGGCACTC GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAAGG

1081 CCTTTCGCGA СССААСАСТА CTCGGCTAGC AGTCTCGCAT CACTAGTG

Рис.4. Амплифицируемая последовательность внутреннего стандарта.

Жирным шрифтом выделены последовательности HCV; обычным шрифтом - вставка (модифицированный фрагмент раннего района вируса мышиной полиомы)

Конструкцию pBabe/HCV* использовали для трансфекции в пакующую линию клеток. После селекции на пуромицине и клонирования отобрали

пуромицину. Таким образом, мы получили

pBabe/HCV*.

быстрорастущие клоны, устойчивые к пуромицину. Из культуральной среды этих клонов выделили РНК, провели реакцию обратной транскрипции и «пез1ес1»-ПЦР.

В случае проведения ПЦР без предварительной обратной транскрипции, амплификации не происходило, что указывает на то, что культуральная среда полученных после селекции клонов содержала упакованную в ретровирусные частицы РЖ-матрицу (внутренний стандарт), а не случайные фрагменты геномной или трансфектированной ДЖ (рис.5).

943 н п

1 2345678 12345678 Рис.5. ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы культуральной среды клонов пакующих клеток.

A. ОТ-ПЦР с генотипспецифическими праймерами.

B. ПЦР без ОТ для те же клонов.

1 — lkb Ladder, 2 - отрицательный контроль, 3 - 8 - разные клоны.

Отдельные клоны нарастили, собрали культурапьную среду в соответствии с протоколом, позволяющим получить максимальный титр ретровирусных частиц. Часть собранного супернатанта использовали для определения титра, остальное разлили по аликвотам и заморозили. Клетки клонов заморозили и в дальнейшем использовали для получения новых партий внутреннего стандарта.

Определение титра ретровирусных частиц. Титр ретровирусных частиц в культуральной супернатанте определяли в единицах инфекционности, как число колоний, выросших после инфицирования клеток-мишеней на селективной среде. Его величина для разных клонов находилась в пределах от 103 до 2x106 инф.ед./мл. Выбрали клон с

ю

максимальным титром (2x106 инф.ед./мл) и использовали его в дальнейших экспериментах.

Чувствительность метода. Чувствительность определяли в реакции ОТ-ПЦР методом конечных разведений стокового раствора внутреннего стандарта известной концентрации в инфекционных единицах /мл. Измеренная таким образом чувствительность метода составила 100 инф.ед./мл.

Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК НСУ. Использование внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора в качественном методе позволяет контролировать все стадии процесса и выявлять ложноотрицательные результаты, что имеет особое значение в тест-системах для скрининга донорской крови и ее компонентов, которые являются основными источниками вируса для лиц, получающих множественные трансфузии.

В качественном методе внутренний стандарт добавляли в лизирующий буфер в минимальной концентрации (100 инф.ед./мл), видимой на электрофорезе, чтобы избежать снижения чувтвительности метода. При этом возможно несколько вариантов получаемых результатов (рис.6).

1. В случае НСУ-отрицательной сыворотки на форезе видна одна полоса внутреннего стандарта.

2. В случае НСУ-положительной сыворотки на форезе видно две полосы: вирусная полоса и полоса внутреннего стандарта.

3. В случае НСУ-положительной сыворотки с высоким титром вируса на форезе видна только одна вирусная полоса.

4. Отсутствие на форезе полос говорит об отсутствии в этой пробирке реакции.

1045 нп 417 н п

943 н п

313 н п 189 н п-

I 23456789

Рис.6. Использование внутреннего стандарта при качественном определении (А) генотипировании (В) РНК НСУ.

Дорожки: 1 - НСУ-положительная сыворотка генотипа За; 2 -реакция не прошла; 3 - НСУ-отрицательная сыворотка; 4 - НСУ-отрицательная сыворотка; 5 - НСУ-положительная сыворотка генотипа 1Ь; б - НСУ-отрицательная сыворотка; 7 - НСУ-отрицательная сыворотка; 8 - вода; 9 - маркер 189, 219, 313, 343,417, 943 н.п.

Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК НСУ. Для количественных определений концентрации РНК НСУ мы использовали НСУ-положительные сыворотки крови гематологических больных. Все больные без интерфероновой терапии. С помощью набора лизирующих буферов, содержащих уменьшающиеся количества внутреннего стандарта, выделили РНК из сывороток крови по стандартной методике. Таким образом, для каждого больного получили несколько образцов РНК, с которыми затем проводили реакцию обратной транскрипции и пез1её-ПЦР.

Визуально на электрофорезе оценивали концентрацию вируса в образце, выбирая дорожку с одинаковой интенсивностью свечения полос (точка эквивалентности). Пример количественного определения РНК НСУ приведен на рис.7.

На электрофорезе виден конкурентный характер реакции. Во всех случаях концентрация сыворотки одинакова, но интенсивность свечения полос различна. На рис.7А точка эквивалентности находится на дорожке 2 и соответствует концентрации внутреннего стандарта 80000 инф.ед/мл. На рис.7В точка эквивалентности находится на дорожке 4 и соответствует концентрации внутреннего стандарта 3000 инф.ед/мл.

123456т 123456т

Рис. 7. Количественное определение РНК в сыворотке крови.

А - больной № 767 (генотип1Ь). Размер амплификата внутреннего стандарта 943 н.п., размер вирусного амплификата 313 н.п..

В - больной № 308 (генотип 2а). Размер амплификата внутреннего стандарта 943 н.п., размер вирусного амплификата 343 н.п.

Концентрация внутреннего стандарта: 1 - 4x105 инф.ед/мл, 2 - 8х104ннф.ед/мл, 3 -1,6x104 инф.ед/мл, 4 - Зх103инф.ед/мл, 5 - 6x102 инф ед/мл, 6 - сыворотка без стандарта, 7 - Ikb Ladder.

Мы использовали визуальную детекцию: на электрофорезе выбирали дорожку с одинаковой интенсивностью свечения амплификатов. Глазом невозможно точно определить разницу в интенсивности свечения, но можно легко выбрать точку с одинаковой интенсивностью свечения. Из-за визуальной детекции мы можем говорить только о полуколичественных оценках концентрации вирусной РНК. Из нескольких значений (число которых определяется числом разведений) мы выбираем значение наиболее близкое к реальной концентрации. Наличие постамплификационных шагов в количественных методах позволяет получить число, точно соответствующее измеренной концентрации. Но в процессе постамплификационных шагов

происходят неконтролируемые потери (например, на стадии отмывок), что приводит к дополнительным ошибкам.

Статистическая обработка результатов. Эта часть работы выполнена совместно с зав. лабораторией биостатистики и информационных систем к.ф.-м.н. Куликовым С.М.. Для оценки эффективности предлагаемого теста было необходимо сравнить его с некоторым эталоном или эталонным тестом. В качестве эталонного материала была использована заведомо инфицированная сыворотка разной степени разведения. При этом экспериментатор, проводящий тестирование, не знал заранее степень разведения. Это позволило избежать смещения в результатах, обусловленного явным или не явным стремлением улучшить характеристики теста.

Таким образом, для каждого из 30 образцов была известна объективная оценка относительной концентрации вирусного агента - это степень разведения. В результате тестирования для каждого образца были получены соответственные оценки в 3-х уровневой порядковой шкале: 0- "вирус не обнаружен", ¡-"средняя концентрация вирусного агента", 2-"высокая концентрация вирусного агента". Необходимо было ответить на вопрос: насколько результаты тестирования расходятся с "истинными" оценками. Так как обе величины: "истинная" концентрация и выход теста - измерены в порядковых шкалах, для оценки эффективности был выбран ранговый коэффициент Спирмена с соответствующей оценкой его значимости.

Для 5 образцов из 30 (рис.8) не удалось по объективным причинам получить результат теста, поэтому на рисунке - данные для 25 образцов. Как видно из графика четыре точки из 25 отклоняются от идеальной зависимости, то есть зависимости, при которой результат теста монотонно зависит от истинной концентрации. Коэффициент корреляции Спирмена 11=0.77 - высокий и сильно значимый (р=0.0002). Для сравнения для идеальной зависимости 11=0.92 (отличен от 1 так как величины измерены в

разных порядковых шкалах 3-уровневой и 10-уровневой).

1П00

п-25 р-0 0002

R врмптил «О 77

Рис. 8. Результаты "слепого" тестирования 30 контрольных образцов сыворотки разной степени разведения, от 1 до 1/1000.

По оси абсцисс отложена величина х=3-^Б, где И кратность разведения, по оси ординат результат тестировани в порядковой шкале: 0- вирус не

обнаружен,

1 -средняя

концентрация вирусного агента, 2-высокая концентрация. Сплошная линия - идеальная характеристика,

штриховая линия - линейная регрессия. Стрелочками помечены точки, в которых нарушена

разведение

монотонная

зависимость

результатов тестирования от концентрации вируса (4 из 25).

Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора. Предлагаемый нами способ получения внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора имеет несколько отличий от традиционной технологии. Первое отличие касается упаковки РНК стандарта в пакующих клетках в ретровирусные частицы. Благодаря наличию в векторе pBabe-Puro специфических ретровирусных последовательностей вектор вместе с модифицированной HCV последовательностью после попадания в делящуюся клетку встраивается в геном. И далее экспрессируется вместе с клеточными генами. После транскрипции в цитоплазму выходит РНК, содержащая модифицированную HCV последовательность. В цитоплазме происходит трансляция ретровирусной РНК, образуются необходимые для упаковки ретровирусных частиц белки. В пакующих клетках происходит сборка ретровирусных частиц и их выход из клеток в культуральную среду. Таким образом, происходит и vivo упаковка молекул РНК с модифицированной HCV последовательностью в ретровирусные частицы.

Внутренние стандарты на основе армированной РНК имеют неоспоримые преимущества перед внутренними стандартами в виде свободных РНК. Упаковка в белковую оболочку защищает стандарт от нуклеазного переваривания, делает его стабильным. Кроме того, упаковка позволяет контролировать все этапы обработки образцов РНК: выделение из вирусных частиц, обратную транскрипцию и ПЦР.

РНК-стандарты в виде армированной РНК на основе MS2 фага также образуются в результате трансфекции в клетки E.coli рекомбинантной ДНК и in vivo упаковки молекул транскрибированной РНК в фаговые частицы. Но между стандартом на основе ретровирусного вектора и стандартом на основе MS2 фага есть существенные отличия.

Ретровирусные частицы выходят в культуральную среду, и внутренний стандарт получают собирая среду культивирования клеток и центрифугируя ее на низких оборотах для удаления клеточного дендрита. При строгом соблюдении протокола наращивания клеток для получения внутреннего стандарта мы не обнаружили в нем рекомбинантной геномной или трансфектированной ДНК (рис.5). Вероятно, клетки в течение нескольких пассажей отмываются от вектора, используемого для трансфекции. Кроме того, возможные следовые количества геномной или трансфектированной ДНК не могут помешать дальнейшему подсчету концентрации внутреннего стандарта, которое осуществляется в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней.

Фаговые частицы остаются в цитоплазме клеток. И необходимы дополнительные этапы их выделения и очистки от клеточных нуклеиновых кислот, присутствие которых в данном случае недопустимо, так как измерение концентрации выделенных фаговых частиц осуществляется спектрофотометрически.

Второе отличие стандарта на основе ретровирусного вектора касается определения его концентрации в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней. Это одна из важных особенностей предлагаемого стандарта.

Измерение концентрации in vitro транскрибированных РНК и РНК в составе фаговых частиц осуществляют спекгрофотометрически.

Концентрацию ретровирусных частиц можно определить при инфицировании восприимчивых клеток-мишеней. Ретровирусный вектор содержит ген устойчивости к антибиотику (в данном случае - к пуромицину), что позволяет проводить отбор клонов инфицированных клеток на селективной среде. При этом концентрация ретровирусных частиц определяется как число колоний инфицированных клеток, выросших на селективной среде. При таком способе определения единицами измерения концентрации являются инфекционные единицы/мл.

Считается, что препарат ретровируса всегда содержит неинфекционные частицы, которые, тем не менее, будут определены в реакции обратной транскрипции и ПЦР. Кроме того, одна ретровирусная частица содержит две молекулы РНК. То есть 1 инфекционная единица - это 2 и больше молекул РНК. В связи с этим при абсолютных измерениях концентрации необходимо учитывать коэффициент пересчета инфекционных единиц в молекулы. Однако, в случае вируса гепатита С клиническое значение имеют не абсолютные значения концентрации, а изменение титра вируса в процессе терапии. И поэтому при определении изменения концентрации вируса в разных сыворотках одного больного в одном эксперименте, с одним и тем же препаратом внутреннего стандарта, коэффициент пересчета будет одинаковым. Тогда отношение концентраций, выраженных в инфекционных единицах, будет равно отношению концентраций, выраженных в вирусных геномах или интернациональных единицах.

Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера. В количественном методе эффективности амплификации

внутреннего стандарта и анализируемого образца должны быть одинаковыми. На эффективность амплификации могут оказывать влияние длина амплифицируемой последовательности, нуклеотидный состав, наличие внутренних участков с высокой температурой плавления. Предлагаемый нами внутренний стандарт имеет длину 943 н.п., а матрица дикого типа 313 н.п.. Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера проведено на ДНК-матрице дикого типа (рОЕМ-ТЕазу/НСУ) и ДНК-матрице модифицированной (рОЕМ-ТЕазу/НСУ*) в одностадийной ПЦР с праймерами для генотипа 1Ь (рис.9).

Концентрации плазмид определяли спектрофотометрически в мкг/мл и пересчитывали в копии/мл. При амплификации обнаруживается разная интенсивность свечения полос при одинаковых концентрациях матриц -матрица большего размера светится ярче.

Рис.9. Эффективность амплификации двух матриц разного размера.

Размер амплификата для матрицы дикого типа - 313 н.п., для модифицированной матрицы - 943 н п.. Точки с равными концентрациями двух матриц отмечены стрелками. Концентрация модифицированной матрицы А -Ю|0копий/мл, В - 107копий/мл концентрация матрицы дикого типа изменяется:

1 - 0 копий/мл, 2 - 10" копий/мл, 3- Ю|0копий/мл, 4 - 109копий/мл, 5 - 108копий/мл, 6 -107 копий/мл, 7 - 106 копий/мл.

Можно предположить, что такой эффект связан, во-первых, с разной эффективностью амплификации двух матриц, и во-вторых, с тем, что большая матрица связывает большее количество бромистого этидия и, в

итоге, светится ярче. По нашим резул£ татам в точках с одинаковой интенсивностью свечения (точках эквивалентности) концентрация меньшей матрицы оказывается в 10 раз выше концентрации большой матрицы. Этот коэффициент необходимо учитывать при абсолютных количественных определениях РНК НСУ.

Однако, при анализе динамики вирусной нагрузки рассматривается отношение двух концентраций, на которое этот коэффициент уже не оказывает влияния. Необходимо отметить, что по литературным данным концентрация РНК НСУ в крови является характеристикой, не связанной с вирусными свойствами или прогнозом разьития заболевания. Клиническую значимость имеет изменение концентрации РНК НСУ в ходе терапии. Особенно это важно для больных с генотипом вируса 1Ь. А именно, для больных с генотипом вируса 1Ь уменьшение концентрации вируса в течение первых 12 недель противовирусной терапии на два порядка является хорошим прогностическим признаком получения устойчивого вирусологического ответа в конце лечения. Представляет интерес уже на первых этапах лечения выделить группу пациентов, для которых вероятность получения ответа на лечение крайне низка, так как противовирусная терапия часто имеет тяжелые побочные эффекты и является дорогостоящей. Предлагаемый внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора помогает решить эту проблему.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Получен оригинальный внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора, который позволяет в конкурентной полимеразной цепной реакции количественно определять изменение концентрации вируса гепатита С.

Данный стандарт обладает следующими свойствами:

1) имеет ту же химическую структуру, что и вирус гепатита С;

2) его легко культивировать в пакующей клеточной линии и получать в необходимых количествах;

3) наличие селективного маркера (гена устойчивости к пуромицину) дает возможность вычислять титр внутреннего стандарта в независимых экспериментах по инфицированию клеточных культур;

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый принцип получения внутреннего РНК-стандарта для конкурентной ПЦР на основе ретровирусного вектора. (Патент РФ №2186388. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови).

2. Получена пакующая линия клеток мышиных фибробластов, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом генома HCV.

3. Внутренний стандарт введен в тест-систему, используемую в лаборатории молекулярной гематологии, в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV.

4. Показана возможность применения полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Глинщикова O.A., Макарик Т.В., Романова Е.А., Судариков А.Б. Определение генотипов вируса гепатита С у гематологических больных. Тез.докл. 3 Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика в современной медицине". 2000г. Москва. Электронная версия http://www.hepatitinfo.ru/confgend/indexl .htm

2. Глинщикова O.A., Романова Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б.. Количественное определение РНК вируса гепатита С в сыворотке крови больных. Тез.докл. Научно-практический симпозикм «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении».М.: НПО «Литех», 2002г. -с.34-36.

3. Глинщикова O.A., Куликов С.М., Судариков А.Б. Внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С в конкурентной полимеразной цепной реакции. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004. - №б - с.84-88.

4. Glinschikova O.A., Sudarikov A.B./ complete cds./GenBank AY171560.

5. Судариков А.Б., Глинщикова O.A. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови. Патент на изобретение №2186388. М.: Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

6. Макарик Т.В., Романова Е.А., Глинщикова O.A.,Судариков А.Б Вирусный гепатит С: новое в эпидемиологии, методах диагностики и терапии // Гематология и трансфузиология. - 2001. - №3 - с. 86-91.

7. Ядрихинская В.Н., Михайлова Е.А., Судариков А.Б., Глинщикова O.A., Булекова Ю.А., Куликов С.М., Савченко В.Г.. /Мониторинг инфицирования вирусами гепатитов В, С, G у больных апластической анемией и острыми лейкозами. // Проблемы гематологии и переливания крови. - 2002. - № 1. - с. 89.

Благодарности.

За помощь и поддержку в проведении работы выражаем искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН, зав. лабораторией биостатистики и информационных систем ГНЦ РАМН к.ф.-м.н. Куликову С.М..

4

U

I

Подписано в печать 12 04 2004 г Формат 60x90,1/16 Объем 1,25 п л Тираж 100 экз Заказ № 129

Отпечатано в ООО «Фирма Блок» 107140, г Москва, ул Русаковская, д 1 т 264-30-73 www blokOl centre narod ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций

À

I

»

ñ

4

i

í

I

РНБ Русский фонд

2006-4 2088

--17Î

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Глинщикова, Ольга Анатольевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Внутренние стандарты.

1.1.1 Амплификационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот.

1.1.2 Количественное определение нуклеиновых кислот.

1.1.3 Метод лимитирующих разведений.

1.1.4 Конкурентная ПЦР.

1.1.5 Real-time ПЦР.

1.1.6 Внутренние стандарты.

1.1.7 Свободные РНК и ДНК-стандарты.

1.1.8 Биологические стандарты.

1.1.9 Генноинженерные стандарты.

1.1.10 Армированные РНК-стандарты.

1.1.11 Стандарты для мутационного анализа.

1.1.12 Скрининг продуктов крови.

1.1.13 Стандарты для множественных методов.

1.2 Ретровирусы.

1.2.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы MuLV.

1.2.2 Принципы конструирования ретровирусных векторов.

1.2.3 Упаковывающие клетки.

1.3 Природа вируса гепатита С.

1.3.1 Организация генома HCV.

1.3.2 Вариабельность генома HCV и его генотипы.

1.3.3 Клиническое значение генотипов HCV.

1.3.4 Вакцина против НСV.

1.3.5 Вирусная репликация.

1.3.6 Репликационный цикл.

1.3.7 Динамика репликации.

1.3.8 Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С.

1.3.9 Мониторинг уровня РНК HCV в течение терапии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Образцы сывороток.

2.2 Определение РНК HCV в сыворотке крови.

2.3 Выделение РНК HCV из сыворотки крови.

2.4 Обратная транскрипция и «nestecb-ПЦР.

2.5 Детекция продуктов амплификации.

2.6 Праймеры.

2.7 Конструирование внутреннего стандарта.

2.8 Получение пакующей клеточной линии.

2.9 Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV.

2.10 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV.

2.11 Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными сыворотками.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Конструирование внутреннего стандарта.

3.2 Получение пакующей линии клеток.

3.3 Определение титра ретровирусных частиц.

3.4 Чувствительность метода.

3.5 Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV.

3.6 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV.

3.7 Статистическая обработка количественных измерений.

3.8 Анализ динамики вирусной концентрации на примере разведенных сывороток.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора.

4.2 Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера.

4.3 Полуколичественное определение.

4.4 Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов.

4.5 Использование внутреннего стандарта при качественном и количественном определении РНК HCV.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора"

В последние годы одним из основных методов молекулярной диагностики вирусных инфекций стала полимеразная цепная реакция. Это высокочувствительный и высокоспецифичный метод. Введение внутреннего стандарта, который амплифицируется с теми же праймерами, что и исследуемая мишень, делает реакцию амплификации конкурентной, позволяя проводить количественные оценки концентрации исследуемой мишени по известной концентрации внутреннего стандарта. Кроме того, внутренний стандарт играет роль контроля прохождения реакции в отдельной пробирке.

Широкое распространение конкурентная ОТ-ПЦР с использованием внутреннего стандарта получила при анализе экспрессии генов и при диагностике вирусных инфекций.

Особые проблемы возникают при разработке РНК-внутренних стандартов. Во-первых, в отличие от ДНК молекулы РНК нестабильны, легко подвергаются рибонуклеазному расщеплению. Упаковка РНК в белковую оболочку позволяет решить эту проблему. Кроме того, упакованная РНК, в отличие от свободной, имитирует по строению исследуемый вирус, что позволяет контролировать все стадии процесса выделения РНК и ОТ-ПЦР. Во-вторых, существует проблема подсчета концентрации внутреннего стандарта. Еще не предложено внутреннего РНК- стандарта, для которого эти проблемы были бы решены в полной мере, и который удовлетворял бы всем теоретическим требованиям. В связи с этим, предлагаемый в работе новый тип внутреннего РНК-стандарта - на основе ретровирусного вектора - является весьма актуальным.

Нами разработан внутренний РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С. Это рекомбинантный ретровирус, содержащий модифицированную последовательность РНК HCV, используемую для амплификации в ПЦР, и селективный маркер - ген устойчивости к пуромицину. Наличие последнего позволяет определять титр ретровирусных частиц стандарта в экспериментах по инфицированию клеточных культур. Предлагаемый ретровирусный стандарт получают из культуры пакующих клеток, просто собирая среду культивирования, в которой росли клетки.

Особое значение ПЦР-диагностика HCV имеет для скрининга донорской крови и ее компонентов, которые являются основными источниками вируса для лиц, получающих множественные трансфузии. Введение в диагностические тест-системы внутреннего стандарта позволяет выявлять ложноотрицательные результаты и становится, следовательно, острой необходимостью. Кроме того, введение внутреннего стандарта дает возможность проводить количественные оценки изменения концентрации HCV, что представляет несомненный клинический интерес, так как основными прогностическими факторами интерфероновой терапии являются генотип вируса и динамика изменения концентрации вируса в течение первых недель лечения.

В работе продемонстрировано применение внутреннего стандарта для качественных и количественных определений РНК HCV.

Использование рекомбинантного ретровирусного вектора - это новый подход в получении внутренних стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР, а также для нового количественного метода определения нуклеиновых кислот - real-time ПЦР.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Разработка РНК-внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора для конкурентной ОТ-ПЦР, который позволяет оценивать количественные изменения концентрации РНК HCV в сыворотке крови больных в ходе терапии и контролировать прохождение реакции в каждой пробирке при качественном определении и генотипировании РНК вируса гепатита С.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Создание генно-инженерной конструкции, представляющей собой ретровирусный вектор с клонированной в него модифицированной вирусной последовательностью, используемой для амплификации в полимеразной цепной реакции;

2. получение пакующей линии клеток, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом вирусного генома;

3. использование полученного внутреннего стандарта в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV;

4. применение полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Предложен новый тип внутреннего стандарта для конкурентной ОТ-ПЦР - это РНК-стандарт на основе ретровирусного вектора. Внутренний стандарт разработан для качественного и количественного определения РНК HCV в сыворотке крови больных. Предлагаемый внутренний стандарт представляет собой рекомбинантные ретровирусные частицы в культуральной среде пакующих клеток. Концентрация внутреннего стандарта измеряется в экспериментах по инфицированию клеток-мишеней.

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.

Предложенный в работе подход может быть использован при получении внутренних РНК- стандартов для конкурентной ОТ-ПЦР и real-time ПЦР. В ходе исследования получен внутренний РНК- стандарт для конкурентной ПЦР для определения и генотипирования РНК HCV.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликованы 6 работ. Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (2000г.Москва), на I Всероссийском съезде гематологов (2002г. Москва), и на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении (2002г. Москва).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 96 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 26 рисунков и 4 таблицы. Список цитированной литературы включает 108 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Глинщикова, Ольга Анатольевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый принцип получения внутреннего РНК-стандарта для конкурентной ПЦР на основе ретровирусного вектора. (Патент РФ №2186388. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови).

2. Получена пакующая линия клеток мышиных фибробластов, культуральный супернатант которой содержит ретровирусные частицы с модифицированным фрагментом генома HCV.

3. Внутренний стандарт введен в тест-систему, используемую в лаборатории молекулярной гематологии, в качестве контроля прохождения реакции при качественном определении и генотипировании РНК HCV.

4. Показана возможность применения полученного внутреннего стандарта для количественного определения изменения концентрации РНК HCV.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Глинщикова О.А., Макарик Т.В., Романова Е.А., Судариков А.Б.

Определение генотипов вируса гепатита С у гематологических больных. Тез.докл. 3 Всероссийская научно-практическая конференция "Генодиагностика в современной медицине". 2000г. Москва. Электронная версия http://www.hepatitinfo.ru/confgen<l/indexl.htm

2. Глинщикова О.А., Романова Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Количественное определение РНК вируса гепатита С в сыворотке крови больных. Тез.докл. Научно-практический симпозикм «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении».М.: НПО «Литех», 2002г. -с.34-36.

3. Глинщикова О.А., Куликов С.М., Судариков А.Б. Внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора для определения вируса гепатита С в конкурентной полимеразной цепной реакции. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004. - №6 - с.84-88.

4. Glinschikova О.A., Sudarikov А.В./ complete cds./GenBank AY 171560.

5. Судариков А.Б., Глинщикова О.А. Способ количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке крови. Патент на изобретение №2186388. М.: Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

6. Макарик Т.В., Романова Е.А., Глинщикова О.А.,Судариков А.Б. Вирусный гепатит С: новое в эпидемиологии, методах диагностики и терапии. // Гематология и трансфузиология. - 2001. - №3 — с. 86-91.

7. Ядрихинская В.Н, Михайлова ЕА., Судариков А.Б., Глинщикова OA., Булекова Ю.А., Куликов С.М., Савченко В.Г. /Мониторинг инфицирования вирусами гепатитов В, С, G у больных апластической анемией и острыми лейкозами. // Проблемы гематологии и переливания крови. -2002. - № 1. - с. 89.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Получен оригинальный внутренний стандарт на основе ретровирусного вектора, который позволяет в конкурентной полимеразной цепной реакции количественно определять изменение концентрации вируса гепатита С.

Данный стандарт обладает следующими свойствами:

1) имеет ту же химическую структуру, что и вирус гепатита С;

2) его легко культивировать в пакующей клеточной линии и получать в необходимых количествах;

3) наличие селективного маркера (гена устойчивости к пуромицину) дает возможность вычислять титр внутреннего стандарта в независимых экспериментах по инфицированию клеточных культур;

Полученный внутренний стандарт может быть использован для контроля прохождения реакции в отдельной пробирке, что позволяет избежать появления ложноотрицательных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Глинщикова, Ольга Анатольевна, Москва

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. - М.: Амипресс, 1999.

2. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. 2002. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). www.PCR.ru/bibliogr/articles.

3. Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. // Вопросы вирусологии, 1999, N2, с.79-82.

4. Львов Д.К., Миширо С., Селиванов Н.А. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях СевероЗападной и Центральной частей России. // Вопросы вирусологии, 1995, N6, с.251-253.

5. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С. (Серологические маркеры и методы их выявления). // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы Информационный бюллетень 2002, №2(15).

6. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. // Клиническая лабораторнаядиагностика. 2000, N 5.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. (Т. Maniatis, E.Fritsch, J.Sambrook. Molecular cloning: a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982)

8. Новое в клонировании ДНК. Методы. Пер.с англ./под ред. Д. Гловера.

9. М.: Мир, 1989. Стр.295-296.

10. Ю.Прасолов B.C., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии. //Вопросы медицинской химии. 2000, №3.

11. Судариков А.Б., Огрель О.Д. Способ выявления вируса гепатита С в сыворотке крови человека. 2000. Патент РФ № 2150505.

12. Alter H.J., Seeff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis С virus infection: a perspective on long-term outcome. Semin. Liver Dis. 2000; 20: 17-35.

13. Alter H.J., Sanchez-Pescador R., Urdea M.S., et al. Evaluation of branched DNA signal amplification for the detection of hepatitis С virus RNA. J. Viral. Hepat. 1995; 2(3): 121-32.

14. Amoroso P., Rapicetta M., Tosti ME, Mele A., Spada E., Buonocore S., Lettieri G., Pierri P., Chionne P., Ciccaglione A.R, Sagliocca L. Correlation between virus genotype and chronicity rate in acute hepatitis C. J. Hepatol. 1998 Jun; 28(6): 939-44.

15. Argetsinger J.E., Gussin G. Intact ribonucleic acid from defective particles of bacteriophage R17. J.Mol.Biol. 1966; 21: 421-434.

16. Aust G. Competitive rt-PCR to quantify small amounts of mRNA. Methods Mol. Biol. 2003; 249: 31-40.

17. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis С virus. J.Gen. Virol. 2000; 81: 1631-1648.

18. Baum C., Ostertag W., Stocking C., Laer D. in: Gene Therapy of Cancer, Academic Press. 1999; 51-76.

19. Bekkering F.C., Brouwer J.T., Schalm S.W., Elewaut A. Hepatitis С viral kinetics. Hepatology 1997; 26: 1691-1693.

20. Blight K.J., Kolykhalov A.A., Rice C.M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science 2000; 290: 1972-1974.

21. Boisvert J., He X.S., Cheung R. et al. Quantitative analysis of hepatitis С virus in peripheral blood and liver: replication detected only in liver. J.Infect.Dis. 2001 Oct 1; 184(7): 827-35.

22. Bonkovsky H.L., Woolley M., and the Consensus Interferon Study Group.Reduction of health-related quality of life in chronic hepatitis С and improvement with interferon therapy. Hepatology 1999; 29: 264-270.

23. Bouvier-Alias M., Patel K., Dahari H. et al. Clinical utility of total HCV Core antigen quantification: a new inderect marker of HCV replication. Hepatology 2002; 36; 1.

24. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus:quasispecies and genotypes. Semin. Liver Dis. 1995; 15: 41-63.

25. Busch M.P., Rawal B.D., Nowicki M. et al. HCV RNA and ALT patterns in seroconverting transfusion recipients, and correlation with donor ALT and RNA (abstract). Transfusion 1997; 37(Suppl):l 1 IS.

26. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 1989 Apr 21; 244(4902): 359-62.

27. CofFm J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. (eds.) (1997), Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

28. Cosset F.L., Takeuchi Y., Battini J.L., Weiss R.A., Collins M.K. J.Virol. 1995; 69: 7430-7436.

29. Davis G.L. Monitoring of viral levels during therapy of hepatitis C. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

30. Davis G.L., Lau J.Y. Factors predictive of a beneficial response to therapy of hepatitis C. Hepatology 1997 Sep; 26(3 Suppl 1): 122S-127S

31. DuBios D.B., WalkerPeach C.R., Pasloske B.L., Winkler M. Universal ribonuclease resistant RNA standards (Armored RNA) for RT-PCR and bDNA-base hepatitis С virus RNA assays. Clin.Chem. 1997; 43(11): 2218 (Abstract).

32. DuBios D.B., WalkerPeach C.R., Pasloske B.L. Ribonuclease resistant viral RNA standards. 1997. USA Patent No.5,677,124.

33. Farci P., Alter H.J., Wong D., Miller R.H., Shih J.W. et al. A long-term studyof hepatitis С virus replication in non-A, non-B hepatitis. N. Engl. J. Med. 1991;325:98-104.

34. Farci P., Govindarajan S., Wong D.C., Engle R. et.al. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С virus. Science 1992; 258: 135140.

35. Fields B.N., Knipe D.M. 1989. Fundamental virology.

36. Fried M.W., Shiffinan M.L., Reddy K„ Smith C., Marions G. et.al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis С virus infection. N. Engl. J. Med. 2002; 347: 975-982.

37. Fukutomi Т., Nakamuta M., Fukutomi M. et al. Decline of hepatitis С virus in serum during the first 24 h after administration of interferon -beta as a predictor of the efficacy of therapy. J. Hepatol. 2001; 34: 100-107.

38. Gerlach J.T., Zachoval R., Gruener N.H., Jung M-C., Ulsenheimer A., Schraut W., Waechtler M. et al. Acute hepatitis C: natural course and response to antiviral treatment Abstract. Hepatology 2001; 34: 341 A.

39. Germi R., Crance J.M., Garin D., Zarski J.P., Drouet E. Hepatitis С virus culture systems. Pathol. Biol. (Paris) 2001 Apr; 49(3): 255-61

40. Germi R., Crance J.M., Garin D. et.al. Mosquito cells bind and replicate hepatitis С virus. J.Med.Virol. 2001 May; 64(1): 6-12.

41. Gilliland G., Perrin S., Blanchard К., Вшт H.F. Analysis of cytokine mRNA and Dna: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad .Sci. USA. 1990; 87(7): 2725-2729.

42. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis С virus infection throughout the body. Semin. Liver Dis. 2000; 20(1): 85-102.

43. Grovatto M., Pozzato S., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis С virus infected patients are replication sites of the virus. Haemotologica. 2000; 85(4): 356-361.

44. Haberhausen G., Pinsl J., Kuhn C.-Ch., Markert-Hahn Ch. Comparative study of different standardization concepts in quantitative competitive reverse transcription- PCR assay. J.Clin.Microbiol. Mar. 1998; 628-633.

45. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

46. Kwok S., Sninsky JJ. PCR detection of human immunodeficiency virus type 1 proviral sequence. In Diagnostic Molecular Biology Principles and Applications. Persing D.H., Smith T. F., Tenover T.J., White T.J. Eds. ASM Press. 1993; Washington, DC.

47. Lai M.E., Mazzoleni A.P., Argiolu F., DeVergilis S., Balistrieri A. et.al. Hepatitis С virus in multiple episodes of acute hepatitis in polytransfused thalassaemic children. Lancet 1994; 343: 388-390.

48. Lam N.P., Neumann A.U., Gretch D.R. et al. Dose-dependent acute clearance of hepatitis С genotype 1 virus with interferon alfa. Hepatology 1997; 26: 226-231.

49. Lau D.T.-Y., Kleiner D.E., Ghany M.G., Park Y., Schmid P., Hoofiiagle J.H.I 0-year follow-up after interferon- therapy for chronic hepatitis C. Hepatology 1998; 28: 1121-1127.

50. Layden J.E., Layden T.J., Levi-Drammer R. et al. Early viral kinetics of

51. HCV predicting treatment response after only 24 hours (abstract). Gastroenterology 2001; 120: A30.

52. Layden J.E., Layden T.J. How can mathematics helps us understand HCV. Gastroenterology 2001; 120: 1546-1549.

53. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et al. Specific detection of hepatitis С minus strand RNA in hematopoetic cells. // J. Clin. Invest. -1996. V.97. -N3. - P.845-851.

54. Liang T.J., Rehermann В., Seeff L.B., Hoofiiagle J.H. Pathogenesis, natural history, treatment and prevention of hepatitis C. Ann. Intern. Med. 2000; 132; 296-305.

55. Lim F., Peabody D.S. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic. Acids. Res. 1994; 22: 3747-3752.

56. Lindsay K.L. Introduction to Therapy of Hepatitis С Hepatology 2002; 36(5); Suppl. 1.

57. Lohmann V., Koch J., Herian U., Theilmann L., Bartenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis С virus RNA in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-113.

58. Major M.E., Mihalik K., Fernandez J., Seidman J. et.al. Long-term follow-up of chimpanzees inoculated with the first infectious clone for hepatitis С virus. J. Virol. 1999; 73: 3317-3325.

59. Manns M.P., McHutchison J.G., Gordon S.C., Rustgi V.K.et.al. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment for chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet 2001; 358: 958-965.

60. Martell M., Gomez J., Esteban J.I., Sauleda S., Quer J., Cabot В., Esteban R., Guardia J. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis С virus RNA. J.Clin.Microbiol. 1999 Feb.; 327-332.

61. Martell M., Esteban J.I., Quer J., Genesca J.etal. Hepatitis С virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution. J. Virol. 1992; 66: 32253229.

62. McHutchison J.G., Gordon S.C., Schiff E.R., Shiftman M.L. et.al. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. N. Engl. J. Med. 1998; 339: 1485-1492.

63. Mehta S.H., Cox A., Hoover D.R., Wang X-H., Mao Q. et.al. Protection against persistence of hepatitis C. Lancet 2002; 359: 1478-1483.

64. Mercer D.F., Schiller D.E., Elliot J.F., Douglas D.N. et.al. Hepatitis С virus replication in mice with chimeric human livers. Nat. Med. 2001; 7: 927-933.

65. Mihm S., Fayyazi A., Hartmann H., Ramadori G. Analysis of histopathological manifestations of chronic hepatitis С virus infection with respect to virus genotype. Hepatology 1997 Mar; 25(3): 735-9

66. Miller A.D., Garcia J.V., von Suhr N., Lynch C.M., Wilson C., Eiden M.V. Construction and properties of retrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus. J.Virol. 1991 May; 65(5): 2220-4.

67. Mita E., Hayashi N., Kanazawa Y., Hagiwara H., Ueda K., Kasahara A., Fusamoto H., Kamada T. Hepatitis С virus genotype and RNA titer in the progression of type С chronic liver disease. J.Hepatol. 1994 Sep; 21(3):468-73.

68. Morgenstem J.P., Land H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res. 1990 Jun 25; 18(12): 3587-96.

69. Nagayama K., Kurosaki M., Enomoto N., Miyasaka Y., Marumo F., Sato C. Characteristics of hepatitis С viral genome associated with disease progression. Hepatology 2000 Mar; 31(3): 745-50.

70. Natarajan; Venkatachala, Germantown, Salzman M.D.; Norman P., Potomas M.D. 2000. US 1997000949333.

71. Nicoletti A., Sassy-Prigent C. An alternative quantitative polymerase chain reaction method. Anal.Biochem. 1996; 236(2): 229-241.

72. NIH Consensus Statement. Hepatology 2002; 36; 5; suppl.l.

73. Nubling C.M., Unger G., Chudy M., Raia S., Lower J. Sensitivity of core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion 2002; 42: 1037-1045.89.0kumura A., Yoshioka K., AiyamaT. et al. Different constitution of hepatitis

74. С virus population in peripheral blood mononuclear cells and plasma in patients with type С chronic liverdisease. Dig. Dis. Sci. 1998; 43(2): 377383.

75. Pasloske B.L., WalkerPeach C.R., Obermoeller R.D., Winkler M.W., DuBios D.B. Armored RNA technology for the production of ribonuclease resistant viral RNA controls and standards. J.Clin.Microbiol. 1998; 36(12): 35903594.

76. Pawlotsky J.M. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology 2002; 36(5; Suppl.l.

77. Pawlotsky J.-M., Bouvier-Alias M., Hezode C., Darthuy F., Remire J., Dhumeaux D. Standardization of hepatitis С virus RNA quantification. Hepatology 2000; 32: 654-659.

78. Piatak M.J., Saag M.S., Yang L.C., Clark S.J., Kappes J.C., Luk K.-C., Hahn B.H., Shaw G.M., and Lifson J.D. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR. Science 1993; 259: 1749-1754.

79. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., Levine D.M. Visualization ofhepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins. J.Viral.Hepat. 1996 Jan; 3(1): 11-7.

80. Radkowski M., Kubicka J., Kisiel E. et al. Detection of active hepatitis С vims and hepatitis G virus/GB virus С replication in bone marrow in human subjects. Blood 2000; 95(12): 3986-3989.

81. Sabin C.A., Telfer P., Phillips A.N., Bhagani S., Lee C.A. The association between hepatitis С virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men. J.Infect.Dis. 1997 Jan; 175(1): 164-8.

82. Saldanha J., Lelie N., Heath A. Establishment of the first international standard for nucleic acid amplificationtechnology (NAT) assay for HCV RNA. WHO Collaborative Study Group. Vox Sang 1999; 76:149-58.

83. Shimizu Y.K., Weiner A.J., Rosenblatt J., Wong D.C., Shapiro M. et.al. Early events in hepatitis С virus infection of chimpanzees. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1990; 87: 6441-6444.

84. Shiratori Y., Imazeki F., Moriyama M., Yano M., Arakawa Y., Yokosuka O., Kuroki T. et al. Histologic improvement of fibrosis in patients with hepatitisC who have sustained response to interferon therapy. Ann.Intern.Med. 2000; 132: 517-524.

85. Takaki A., Wiese M., Maertens G., Depla E., Seifert U. et.al. Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades afterrecovery from a single-source outbreak of hepatitis C. Nat.Med. 2000; 6: 578-582.

86. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M., Steiger C., Ray S.C., Chisari F.V. Determination of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection. J.Exp.Med. 2001; 194: 1395-1406.

87. Yuasa Т., Ishikawa G., Manabe S. et al. The particle size of hepatitis С virus estimated by fil-tration through microporous regenerated cellulose fibre. J.Gen.Virol. 1991 Aug; 72 ( Pt 8):2021-4.

88. Zeuzem S., Herrmann E., Lee J.H., Fricke J. et.al. Viral kinetics in patients with chronic hepatitis treated with standard and peginterferon alfa-2a. Hepatology 2001; 120: 1438-1447.

89. Zeuzem S., Lee J.H., Franke A. et.al. Quantification of the initial decline of serum hepatitis С virus RNA and response to interferon alfa. Hepatology 1998; 27: 1149-1156.

90. Zimmermann K., Mannhalter J.W. Technical aspects of quantitative competitive PCR. Bio.Tech. 1996; 21: 268-279.