Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частота интеграции генно-инженерных конструкций при различных способах введения их в эмбрионы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шишиморова, Мария Сергеевна

Введение.

1 .Обзор литературы.

1.1 Современные достижения и перспективы развития генно-инженерных технологий.

1.2. Основные способы введения генно-инженерных конструкций в эмбрионы животных.

1.3. Основные направления исследований по получению трансгенных животных.

1.4. Эффективность интеграции чужеродных генов в геном животных.

2. Объекты и методы исследований.

2.1. Материалы и объекты исследований.

2.2. Получение и хранение культуральной среды, содержащей ретровирусные конструкции.

2.3. Получение мышиных эмбрионов.

2.4. Микроинъекция различных генно-инженерных конструкций.

2.5. Культивирование мышиных эмбрионов in vifro.

2.6. Трансплантация зародышей псевдобеременным реципиентам.

2.7. Определение интеграции трансгена с помощью ПЦР-анализа на стадии эмбриона.

2.8. Определение интеграции трансгена в геном рожденного потомства.

3. Результаты собственных исследований.

3.1. Влияние микроинъекции в пронуклеусы мышиных зигот плазмидной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном хозяина

3.1.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генно-инженерной конструкции с рестриктазой Sali на жизнеспособность мышиных эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бластоцисты.

3.1.2. Приживляемость зигот, микроинъецированных генной конструкцией совместно с рестриктазой Sali в концентрации 0,01 ед/мкл, и интеграция трансгена в геном рожденного потомства.

3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот разных вариантов культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном мышей.

3.2.1. Влияние инъекции в перивителлиновое пространство зигот разных вариантов культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию aSl-Cn-G-CSF, встроенную в ретровирусный вектор, на развитие эмбрионов in vitro и частоту интеграции трансгена в геном бластоцист.

3.2.2. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъецированных генной конструкцией aSl-Cn-G-CSF, встроенной в ретровирусный вектор, и интеграция трансгена в геном рожденных мышей.

3.3. Влияние различных способов микроинъекции в зиготы мышей генно-инженерной конструкций, встроенной в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном хозяина на разных стадиях развития

3.3.1. Жизнеспособность мышиных зигот и частота интеграции трансгена, определенная на стадии бластоцисты, при различных вариантах микроинъекции среды, содержащей ретровирусный вектор

3.3.2. Влияние разных способов инъекции ретровирусной конструкции в зиготы мышей на приживляемость эмбрионов и интеграцию трансгена в геном полученного приплода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Частота интеграции генно-инженерных конструкций при различных способах введения их в эмбрионы"

Успехи, достигнутые в последние годы в области эмбриоинжене-рии и генетической инженерии, свидетельствуют о принципиальной возможности генетического улучшения животных путем прямого переноса дополнительных генов в их геном. Разработка эффективной технологии переноса генов открывает огромные перспективы для генетического совершенствования животных, с помощью которой за одно поколение жизни животных можно будет достичь большего генетического совершенствования, чем методами классической селекции за десятилетия.

В настоящее время основным способом получения трансгенных млекопитающих является микроинъекция плазмидных генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот. Несмотря на широкое использования метода микроинъекции, эффективность переноса генов остается на достаточно низком уровне, что является серьезной проблемой в получении трансгенных сельскохозяйственных животных. По современным представлениям низкая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных связана, во-первых, с низкой частотой интеграции рекомбинантных генов в геном животных, во-вторых, с пониженной выживаемостью зигот инъецированных генно-инженерными конструкциями в организме животных-реципиентов.

Одним из направлений, с помощью которого возможно повышение частоты интеграции трансгена в геном животных, является использование генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусные вектора. Однако, открытым остается вопрос о влиянии этих конструкций на жизнеспособность инъецированных эмбрионов.

Наряду с видоспецифическими особенностями осуществления основных эмбриоинженерных этапов технологии получения трансгенных животных имеются этапы, которые базируются на закономерностях общебиологического характера и являются общими для всех млекопитающих, поэтому принципы осуществления этих этапов могут быть свободно перенесены с лабораторных на сельскохозяйственных животных. К таким закономерностям относятся механизмы интеграции трансгена в геном хозяина, поэтому исследования направленные на повышение частоты интеграции трансгена целесообразнее проводить на мышах, как наиболее дешевом и удобном объекте.

Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных необходимо изучение факторов, влияющих на частоту интеграции трансгена в геном хозяина и на жизнеспособность эмбрионов на разных этапах технологии получения трансгенных животных и на основе полученных знаний совершенствование этой технологии.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось выяснение возможности повышения частоты интеграции трансгена в геном животных при различных способах введения генно-инженерных конструкций в эмбрионы.

Для достижения поставленной цели считали целесообразным решить следующие задачи:

- изучить влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмид-ной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном животных;

- изучить влияние генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов, при введении этих конструкций в перивителлиновое пространство мышиных зигот;

- исследовать интеграцию в геном эмбрионов и рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в периеителлиноеое пространство зигот;

- изучить влияние генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов при введении этих конструкций в цитоплазму мышиных зигот;

- исследовать интеграцию в геном эмбрионов и рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в цитоплазму зигот;

Научная новизна работы

Впервые получены трансгенные мыши с интегрированными в их геном человеческими генами гранулоцит-колониестимулирующего фактора (hG-CSF) или эритропоэтина (НЕРО) под промотером гена ötf/-казеина крупного рогатого скота путем микроинъекции в периеителлиноеое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор. Выявлены оптимальные варианты инъекции в перивителлиновое пространство зигот, культуральной среды, содержащей генно-инженерные конструкции, встроенные в ретровирусный вектор, сохраняющие высокую жизнеспособность эмбрионов и обеспечивающие повышенный уровень интеграции трансгена в геном рожденного потомства. Изучен характер интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства мышей генно-инженерных конструкций aSl-Cn-G-CSF и Еро человека, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в перивителлиновое пространство зигот. Впервые изучена интеграция трансгена в геном бластоцист и жизнеспособность зигот, микроинъецированных е цитоплазму генно-инженерными конструкциями, встроенными в ретровирусный вектор. Определена концентрация рестриктазы Sali, которая при введении в пронуклеусы зигот совместно с плазмидной генно-инженерной конструкцией aSl-Cn-G-CSF, существенно не снижает жизнеспособности эмбрионов и повышает частоту интеграции трансгена в геном мышиных эмбрионов и рожденного потомства.

Практическая значимость

Результаты исследований, направленных на изучение влияния генно-инженерных конструкций, встроенных ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и на частоту интеграции трансгена в геном рожденного потомства могут быть использованы в работах по получению как лабораторных, так и сельскохозяйственных трансгенных животных и существенно повысить общую эффективность технологии трансгеноза. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестриктазы Sail с генно-инженерной конструкцией могут быть использованы для повышения частоты интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию мышиных зародышей после различных биотехнологических манипуляций могут быть использованы при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих.

Положения, выносимые на защиту

1. Микроинъекция в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, способствует увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства, по сравнению с введением плазмид-ных конструкций в пронуклеусы зигот.

2. Микроинъекция в цитоплазму зигот культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, в значительной степени повышает интеграцию трансгена в геном эмбрионов, однако снижает их приживляемость в организме самок-реципиентов. 8

3. Рестриктаза Sali в концентрации 0,01ед./мкл., инъецированная в пронуклеусы зигот вместе с плазмидной генно-инженерной конструкцией aSl-Cn-G-CSF, не оказывает существенного отрицательного влияния на жизнеспособность эмбрионов и способствует повышению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства.

4. Основным фактором, снижающим жизнеспособность зигот, инъецированных средой, содержащей ретровирусы дефектные по репликации, является присутствие в инъекционной фрагментов разрушенных клеток-упаковщиц.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шишиморова, Мария Сергеевна

выводы

1. Получены первичные трансгенные мыши с интегрированными в их геном нуклеотидными последовательностями человеческих генов эритропоэтина и гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором «57-казеина крупного рогатого скота, путем микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных вретровирусный вектор.

2. Частота интеграции генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, определенная в геноме мышиных бласто-цист, развившихся in vitro из зигот, микроинъецированных в перивителлиновое пространство культуральной средой, снятой с монослоя клеток-упаковщиц линии клеток АМ12, колебалась от 19% до 41%. При этом, частота интеграции трансгенов, определенная методом ПЦР с использованием праймеров на структурную часть генов, расположенных на проксимальном (от промотора) конце конструкции, составляла 41%, а с использованием праймеров на спаренный ген пео, расположенный на дистальном конце конструкции - 19-22%.

3. Частота интеграции в геном рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в перивителлиновое пространство зигот, составила для гена hG-CSF - 17,5% и для гена эритропоэтина - 22,2%, при использовании для ПЦР - анализа праймеров на структурные гены.

4. Приживляемость мышиных эмбрионов, развившихся из зигот, инъецированных в перивителлиновое пространство, генно-инженерными конструкциями, встроенными в ретровирусный вектор дефектный по репликации, колебалась от 19,8% до 23,3% в расчете на всех реципиентов и от 40,5% до 46,9% - в расчете на беременных реципиентов.

5. Одним их факторов, снижающим жизнеспособность зигот, перенесших микроинъекцию средой, содержащей ретровирусный вектор, дефектный по репликации, является присутствие в инъекционной среде фрагментов разрушенных клеток-упаковщиц.

6. Микроинъекция е цитоплазму мышиных зигот генно-инженерной конструкции с геном эритропоэтина человека, встроенной в ретровирусный вектор, не оказала отрицательного влияния на развитие зигот до стадии бластоцисты и на выход бластоцист из блестящей оболочки in vitro, по сравнению с введением аналогичной конструкции в перивителлиновое пространство, однако достоверно снизила прижив-ляемость таких зигот в организме самок-реципиентов.

7. Частота интеграции трансгена в геном мышиных эмбрионов, определенная на стадии бластоцисты, имела тенденцию к повышению, при введении в цитоплазму зигот, генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор, по сравнению с введением этой конструкции в перивителлиновое пространство.

8. Введение в пронуклеус мышиных зигот плазмидной генно-инженерной конструкции aS 1 -Cn-G-CSF совместно с рестриктазой Sali, с помощью которой эта конструкция вырезалась из плазмиды, снижало развитие in vitro микроинъецированных зигот до стадии бластоцисты, по сравнению с введением только одной конструкции. При этом, с увеличением концентрации рестриктазы с 0,01 до 0,1 ед/мкл существенно снижалось количество бластоцист, вышедших из блестящей оболочки.

9. Совместное введение в пронуклеусы мышиных зигот генно-инженерной конструкции с рестриктазой увеличивает частоту интеграции трансгена в геном хозяина, определенную как на стадии бластоцисты, так и у рожденного потомства

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В работах по трансгенозу использовать генно-инженерные конструкции, встроенные в ретровирусные вектора дефектные по репликации, что позволяет в 2-3 раза повысить частоту интеграции трансгена в геном рожденного потомства, по сравнению с использованием плаз-мидных конструкций.

2. При использовании для получения трансгенных животных генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусные вектора, вводить в перивителлиновое пространство зигот культуральную среду, снятую с монослоя клеток, упаковывающих эти вектора, профильтрованную через фильтр не адсорбирующий белок с диаметром пор 0,22 мкм, стеклянной иглой с внешним диаметром кончика 2-3 мкм.

3. Для наработки ретровирусных векторов дефектных по репликации в титрах достаточных для получения трансгенных животных и повышения частоты интеграции может быть использована линия клеток-упаковщиц АМ12.

4. При получении трансгенных животных путем микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных конструкций целесообразно вместе с конструкцией вводить рестриктазу, с помощью которой эта конструкция вырезалась из плазмиды, что позволяет почти в 2 раза увеличить частоту интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шишиморова, Мария Сергеевна, Боровск

1. Андреева Л. Е., Серова И А. Влияние различных манипуляций,используемых для трансгеноза на развитие мышей. // Онтогенез, 1992, т. 23, № 6, с. 637-643.

2. Бондарчук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х., Прокофьев И.М.,

3. Носиков В.В. Обнаружение последовательностей гена фиб-робластного интерферона человека в трансгенных кроликах методом поимеразной цепной реакции. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции молодых ученых, г. Полтава, 1991 с. 47.

4. Бондарчук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х., Прокофьев М.И.,

5. Носиков В.В и др. Получение трансгенных кроликов, содержащих ген фибробластного интерферона человека и анализ их ДНК с помощью цепной полимеразной реакции. // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, 1995, т. 1, с.127.

6. Брем Г., Кройслих X., Штанцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. М.: Издание Российской с.-х. академии, 1995, с. 176-233.

7. Брем Г., Эрнст Э.К., и др. оценка роста и развития первого поколения трансгенных свиней (MT-1/hGRF) в процессе онтогенеза. // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, 1995, т.1, с.29.

8. Волкова H.A., Иолчиев Б.С., Титова В.А., Зиновьева H.A., Эрнст

9. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир, 1988, с. 538.

10. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Жданов А.Б., Морзунов С.П.,

11. Кленовицкий П.М., Эрнст Л.К. Изучение возможности использования рестриктивных эндонуклеаз для повышения частоты интеграции рекомбинантной ДНК в геном животных. // Доклады ВАСНИЛ, 1991, №12, с.24-26.

12. Гольдман И. Л., Кадулин С.Г., Букаров Н.Г. и др. Ксенотрансплантация свинья-человек. // Биотехнология, 1998, № 2, с. 3-17.

13. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Гоголевский П.А., и др. Теоретическиевопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах.//Сборник научных трудов, 1995, т.1, с.93-103.

14. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Гоголевский П.А., и др. Теоретическиевопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах.//Сборник научных трудов 1995, т.1, с.93-103.

15. Дыбан А.П., Городетская С.И. Трансгенные млекопитающие: узучение фенотипических эффектов гормона роста человека, индуцированного животным. // Биотехнология, 1987, № 2, с.352-357.

16. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. // Учебник Л.: Агропромиздат, 1989, с.171-194.

17. Зиновьева H.A., Безенфельд У., Мюллер С., и др. Использованиесинтетической среды яйцеводов при микроинъекции зиготкроликов в программах по получению трансгенных животных.//Сельскохозяйственная биология, 1998, №6, с.34-39.

18. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Мюллер С. и др. использованиесинтетической среды яйцеводов при микроинъекции зигот кроликов в программах по получению трансгенных животных. // Сельскохозяйственная биология, 1998, №6, с.34-39.

19. Зиновьева H.A., Эрнст JI.K., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования. // ВИЖ, 2001, с.128.

20. Кривохарченко А. С., Вильянович Л. И., Татаринова Л. В., Рябых

21. В.П. Развитие мышиных эмбрионов in vitro в среде без белка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды. // Онтогенез, 1993, т. 24, № 6, с. 53-60.

22. Кузнецов А. В., Кузнецова И. В. Связывание экзогенной ДНКpPK31acL сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбриона. // Онтогенез, 1995, т. 26, №4, с.300-310.

23. Кузнецова И.В., Щит И.Ю., Кузнецов A.B. Эффективность переносасперматозоидами рекомбинантных ДНК в яйцеклетки кроликов. // Сельскохозяйственная биология, 1998, № 6, с.40-44.

24. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987, с.492-495.

25. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984, с. 479

26. Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Босак Н.П., Бавин В.Г., и др. получение трансгенных кроликов и свиней, несущих ген релизингфактора гормона роста человека. // Сборник научных трудов, 1995, т. 1, с.104-110.

27. Попова Е.А., Кривохарченко А., и др. Изучение влияния различныхрастворов, используемых при микроинъекции генно-инженерных конструкций, на доимплантационное развитие мышиных эмбрионов//Онтогенез, 2002, т.ЗЗ, №2, с. 107110.

28. Попова Е.А., Кривохарченко А., и др. Развитие мышиных эмбрионов in vitro при различных вариантах микроинъекции. // Онтогенез, 2002, т.ЗЗ, №2, с.107-110.

29. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих. // Молекулярная биология, 1989, т. 23, №2, с.348-355.

30. Рябых В. П., Сапунова Е. Г., Трубицина Т. П., Маркина JI. И. Эффективность получения потомства кроликов из зигот, микро-инъецированных генно-инженерными конструкциями. // Сборник научных трудов ВНИИФБиП, 1999, т. 28, с. 546.

31. Рябых В.П., Сапунова Е.Г., Трубицина Т.П., Маркина Л.И. Эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъ-ецированных генно-инженерными конструкциями. // Сборник научных трудов ВНИИФБиП, 1999, т.28 с.256.

32. Свердлов Е. В. Очерки современной молекулярной генетики.

33. Трансгенез и новая молекулярная генетика // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1996, № 4.

34. Серова И. А., Андреева Л. Е., Кузнецов Ю. М. и др. Изменениеонкологической характеристики при трансгенезе у мышей, не обусловленное наличием трансгена. // Экспериментальная онкология, 1991, т. 13, №2, с. 33-35.

35. Сураева Н. М., Трухан Р. С. Некоторые методологические приемывведения чужеродного гена в зиготы животных. // Генно-инженерные животные, 1995, №1, с. 227-243.

36. Чистяков Д.А., Захарченко В.И., Мезина М.Н., Прокофьев М. И.,

37. Эрнст Л.К. Получение трансгенных кроликов, содержащих ген гамма-интерферона быка и анализ его интеграции в тканях. // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, 1995, №1, с.127-138.

38. Шихов И .Я., Эрнст Л.К., Некрасов A.A., и др. Получение трансгенных свиней. // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, 1995, №1, с.85-90.

39. Эрнст JI. К. Принципы применения популяционной и молекулярной генетики в селекции сельскохозяйственных животных. // С.-х. биология, 1990, №2, с. 3.

40. Эрнст Л. К., Прокофьев М. И., Мезина Б. И. и др. Наследованиегена химозина у трансгенных овец. // Тезисы докладов VIII конференции "Новые направления биотехнологии" Москва, 1998, с. 49.

41. Эрнст Л.К., Гольдман ИЛ., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца. // Биотехнология, 1993, т.5, с.2.

42. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Захарченко В.И., Сураева Н.М., и др.

43. Получение трансгенных кроликов инъекцией генов в зиготы. // Генно-инженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, 1995, № 1, с.111 -126.

44. Aguerre A., Castro-Palomino N., et. al. Expression of human erythropoetin transgenic and of the endogenous WAP gene in the mammary gland of transgenic rabbit during gestating and lactation. // Transgenic. Res. 1998, V.7, P.311-317.

45. Akami Т., Sawada R., Minato N., et. al // Transplant. Proc. 1992,1. V.24, P.485-489.

46. Anderson G. B. Isolation and of embryonic stem cells from livestockspecies // Animal Biotech. 1992, V.3, P. 165-175.

47. Archibald A.L., McClenagham M., Hosnsey V., Simons J.P., Clark AJ.

48. High-level expression of biologically active human al-antitripsin in the milk of transgenic mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990, V.87, P.5178.

49. Behringer R.R., Ryan T.M., Reilly M.P., Asakura et.al. syntesis of functional human hemoglobin in transgenic mice. // Science 1989, -V.245, P.971-973.

50. Benifer C., Vidal M., Grosveld F. and Sippel A.E. Tissue specific andposition independent expression of the complete gene domain for chicken lysozyme in transgenic mice. // J. EMBO 1990, V.9, P.2843-2849.

51. Bichoff R., Degzuse E., Perraud F., Dalemans W., et.al. A 17,6 kb region located upstream of the rabbit WAP gene direct high-level expression of a functional human protein variant in transgenic mouser milk //FEBS- 1992, V.305, P.265.

52. Biery K.A., Bondioli K.R., and DeMayo F.J. Gene transfer by pronuclear injection in the bovine. // Theriogenology 1988, V.29, P.224.

53. Bishop O.J., and Smith P., Mechanism of Chromosomal integration ofmicroinjection DNA. //Mol. Biol. Med. 1989, V.6, P.283-298.

54. Bondioli K.R. and Wall R.J. Transgenic livestock. 1997, P. 215, in agricultural biotechnologies: principles and practices. A. Altman, ed. Marsel Dekker, Inc., New York, NY.

55. Brem G and Muller M. Large transgenic mammals. // In Animals with

56. Novel Gene 1994, P.179-245.

57. Brem G., Brenig B., Goodman R.M., et.al. Production of transgenicmice, rabbit and pig by microinjection into pronuclei. // Zuchthygiene 1985, V20, P.251-252.

58. Brem G., Springmann K., Maier E et.al. Production of transgenic pigsand possible application to pig breeding. // Occ. Publ. Soc. Anim. Prod.- 1988, V.12, P.15-31.

59. Bremel R.D., Yom H.C., and Bleck. Alteration of milk composition using molecular genetic. // J. Dairy Sci 1989, V.72, P.2826.

60. Brinster R.L. The effect of cells transferred into the mouse blastocyst onsubsequent development. // J. Exp. Med. 1974, V.149, P.1049-1056.

61. Brinster R.L., Allen I.M., et.al. Factors affecting the efficience of introducing foreing DNA into mice by microinjecting eggs. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985, V.82, P4438-4442.

62. Brinster R.L., Chen H.Y. et.al. Factors affecting the efficience of introducing foreign DNA into mice by microinjection eggs. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1985, Y.82, P.4438-4442.

63. Buhler T.A., Bruyere T., Went D.F., Stranzinger G., et.al. Rabbit pcasein promoter direct secretion of human interleukin-2 into the milk of transgenic rabbit. // Biotechnology 1991, V.8, P.140-143.

64. Chada K., Magram J., Raphael K. et al. Specific expression of a foreign beta-globin gene in erytroid cells of transgenic mice. // Nature. 1985, V. 314, P. 377

65. Clark A.G., Bessas H., Bishop J., et.al. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep. // Bio/Technology-1989, V.7, P.487-492.

66. Constantini J., Lacy F. Introduction of a rabbit beta-globin gene into themouse germ line. //Nature 1981 V. 294, P.92-94.

67. Covarrubias L., Nishida Y., Terko M. et al. Cellular DNA rearrangement and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. // Mol. Cell. Biol. 1987, V. 7, P. 2243-2247

68. Covarrubias L., Nishida Y., Terco M., et.al. Cellular DNA rearrangement and early development arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos // Mol. Cell Biol. 1987, V.7, P.2243-2247.

69. Diamond L., McCurry K., Oldham E., et.al. // Transplant. Proc. 1996,1. V.61, P. 1241.

70. Dobrovolsky V.N., Lagutin O.V., vinogradova T.V., et.al. Human yinterferon expression in the mammary gland of transgenic mice // FEBS Lett- 1993, Y.319, P.181.

71. Denman J., Hayes M., O'Day C. et al. Transgenic expression of a variantof human tissue-type plasminogen activator in goat milk: Purification and characterization of the recombinant enzyme. // Bio/Technol. 1991, V. 9, P. 839-843

72. Ebert K.M., Selgrath J.P., DiTullio P., Denman J., Smith T.E., et.al.

73. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator of goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. // Biotechnology 1991, V.9, P.83 5-83 8.

74. Ernst L.K., Zakcharchenko, Suraeva T.I., et.al. Transgenic rabbit withantisenes RNA gene targeted at adenovirus H5 // Theriogenology 1991, V.35, P.1257-1271.

75. Fox P.F., Heat-induced coagulation of milk. // in: Developments ondairy chemistry- 1982, V.l, P. 189-228.

76. Fujiwava Y., Miava M., Takahachi et.al. High-level expressing YACvector for transgenic animals bioreactors. // Mol. Reprod. Dev. -1999, V.4, P.414-420.

77. Gazaryan K.G., Andreeva L.E., Serova I.A., et.al. Production of transgenic rabbit and mice containing the bovine growth hormone gene // Mol. Genetics, Microbiology and Virology 1988, V.10, P28-34.

78. Gordon J.W., Gordon J.W. Integration and stable germ line transmissionof genes injected into mouse pronuclei. // Science -1981, V.214, P. 1244-1246.

79. Gordon J.W., Scangos G.A., et.al. and Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, V.77, P.7380-7384.

80. Grosveld F., Van Assendelft G.B., Greaves D.R., et.al. Positionindependent, high-level expression of human (3-globin gene in transgenic mice. // Cell 1987, V.51, P.975-985.

81. Gutierrez A., Meade H.M., Jimenez-Flores R., Anderson G.B., et.al. Expression analyses of bovine k-casein in the mammary gland of transgenic mice.//Transgen. Res. 1996, V.5, P.271.

82. Hagemann L.J. Pronuclear injection of MOPS-buffered medium does notaffect bovine embryo development. // Theriogenology 1995, V.43, P.229.

83. Hammer R.E., Brinster R.L., palmiter R.D. Use of gene transfer to increase animal growth // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. -1985, V.50, P.379-387.

84. Hammer R.E., Pursel V., Rexroad C., et.al. Production of transgenicrabbit sheep and pigs by microinjection. // Nature 1985, V.315, P.680-683.

85. Hammer R.F., Pursel V.G., Wall R.J., et.al. Genetic engineering ofmammalian embryos. // J. Anim. Sci. 1986, V.63, P.269-278.

86. Harris S., McClenagham M., Simons J.P., Clark A. Gene expression inthe mammary gland. // J. Reprod. Fertil. 1990, V.88, P.707.

87. Harvey M.J., Hettle S.J., Cameron E.R., et.al Production of transgeniclamb fetuses by subzunal injection of feline leukaemia virus. // Transgenic Models in Medicine and agriculture 1990, V.116, P. 11-19.

88. Haskell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cattle byretroviral injection of early embryos. // Mol. Reprod. Dev. 1995, V.40, P.386-340.

89. Hagemann L. J. Pronuclear injection of MOPS-buffered medium doesnot affect bovine embryo development. // Theriogenology. 1995, V. 43, № 1, P. 229

90. Jaenisch R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Molony leukemia virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996, V.73, P.1260.

91. Jaenisch R. Infection of mouse blastosysts with SV40 DNA: Normal development of injected embryos and persistence SV40-specific DNA sequences in the adult animals. // Cold Spring Harbor Symp. 1974, V.39, P.375-380.

92. Jang Ho Ko, Chul-Sand Lee et.al. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat.//Transgenic. Res. 2000, V.9, P.215-222.

93. Janne J., Hittenen J.M., Peura T., et.al. Transgenic animal as bioproducers of therapeutic proteins. // Annals of Medicine 1992, V.24, P.273-280.

94. Jimenes-Flores R., et.al. Casein engineering of the caseins to modify thebehaviors of milk during processing. // J. Dairy Sci. 1988, V.71, P. 2640-2654.

95. Jost B., Vilotte J., Duluc I., et.al., // Nat. Biotechnol. 1999, V.17,1. P.160-164.

96. King D. and Wall R.J. Identification of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplification: Detection of a transgene. // Mol. Reprod. Develop. 1988, V. 1, P. 57-62.

97. Ko J., Lee C., Kim K., et.al // Transgen. Res. 2000, Y.9, P.215-222.

98. Krisher R. L., Gibbons J. R., Canseco R. S. et al. Influence of time ofgene microinjection on development and DNA detection frequency in bovine embryos. // Transgenic Res. 1994, V. 3, № 4, P. 226-231.

99. Korhonen V.P., Tolvanen V., Hittenen J.M., et.al. Expression of bovinebeta-lactoglobulin human erythropoetin fusion protein in the milkof transgenic mice and rabbit. // Eur. J. Biochem. 1997, V.245, P482-489.

100. Kripenfort P., Rademakers A., Eyestone W., et.al. Generation of transgenic dairy catlle using in vitro embryo production. // Biotechnology-1991, V.9, P.844-847.

101. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolsi S., et.al Sperm cells asvectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice.//Cell 1989, V.57, P.717-723.

102. Lin T.P. Microinjection of mouse eggs // Science 1966, V.57, P.717723.

103. Lo D., Pursel V., Linton P., et.al. Expression of mouse Ig A by transgenic mice, pigs, and sheep. // Eur. J. Immunology 1991, V. 26, P.1001-1006.

104. Lu Y.F., Tian C., Deng J.X., et.al. Cloning of human G-CSF genomicgene and its expression in transgenic mice mammary gland. // I Chuan Hsuch Pao 1999, V.26, №4, P.281-287.

105. Massoud M., Attal J., Thepot D. et al. The deleterious effects of humanerytropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promotor in transgenic rabbits. // Reprod. Nutr. Dev. 1996, V. 36, P. 555-563.

106. Maga E.A., Anderson G.B., and Murray J.D. The effect of mammarygland expression of human lysozyme on the properties of milk from transgenic mice. // J. Dairy Sci. 1996, V.78, P.2645.

107. Martin M.J., Houlz J., Adams C., et.al. Effect of pronuclear DNA microinjection on the development of porcine ova in utero. // The-riogenology V.46, №4, P.695-701.

108. Mintz B., Umenesee K. Normal genetically mosaic mice produced frommalignant teratocarcinoma cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1975, V.72, P.3585-3589.

109. Miroshnichenko O.L., Borisenco A.S., Ponomereva T.L., et.al. // Biomed. Sci- 1990, Y.l, P.267-273.

110. Muller J.D. and Brem G. Transgenic strategies to increase disease resistance in livestock // Reprod. Fertil. Dev. 1992, V.6, P.605-613.

111. Murrey J.D., Nancarrow C.D., Marshall J.T., Hazelton I.J., Ward K.A.

112. Production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothinein-ovine growth hormone fusion gene. // Reprod. Fertil. Dev. 1989, V.l, P.147-155.

113. Nimoniya T., Hoshi M., Mizuno et al. Selection of mouse preimplantation embryos earring DNA by polymerase chain reaction // Mol. Reprod. Develop.- 1989, V.l, P.242-248

114. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., et.al. Dramatic growth ofmice that develop from egg microinjection with metallothinein-growth hormone fusion gene. // Nature 1982, V.36, P.611-615.

115. Palmiter R.D., Norstedt G.M., Gelinas R., et.al. Metallothionein human GH fusion genes stimulate growth of mice. // Science 1983, V.222, P.803-814.

116. Palmiter R.D., Norstedt R.E., et.al. Metallothinein-human GH fusiongene stimulate growth of mice // Science 1983, V.222, P809-814.

117. Pascoe W.S., Kember K,m Wood S.A. Genes function trapping and targeting in embryonic sperm cell. // Biochim. Biophys. Act. 1992, V.l 14, P.209-271.

118. Persuy M.A., Legrain S., Printz C., Stinnakre M.G., et.al.High-level,stage and mammary tissue-specific expression of a caprine k-casein-encoding mini gene driven by a |3-casein promoter in transgenic mice. // Gene - 1995, V.165, P.291.

119. Peura T.T., Hyttinen J-M., Tolvanen M., et.al. Effects of microinjectionrelate treatment of the subsequent of in vitro produced bovine oocytes.//Theriogenology - 1994, V.42, №3.

120. Platenburg G.I., Kootwijk E.P., Kooiman P.M., Woloshuk s.L., et.al.

121. Expression of human lactoferrin in milk transgenic mice. // Transgen. Res. 1994, V.3, P.99.

122. Pursel V.G., Bolt D.J., Miller K.F., et.al. Expression and performance intransgenic pigs. // J. Reprod. Fert. 1990, V.40, P.235-245.

123. Pursel V.G., Cambell R.G., Miller K.F., et.al Growth potential of transgenic pigs expression a bovine growth hormone gene. // J. Anim. Sci. 1988, V.66, P.267.

124. Raymond L.P., Butler S.P., Johnson J.L., et.al. Transgenic mice by cytoplasmic injection of polylysine/DNA mixtures. // Transgen. Res. -1995, V.4, P.353-360.

125. Rexroad C.E., Pursel V.G., Pincert C., et.al. Progress on gene transfer inanimals. // Vet. Immunol. Immunopathol. 1987, V.17, P.303-312.

126. Rexroad C.E., Hammer R.E., Behringer R.R., Palmiter R.D., Brinster

127. R.L. Insertion, expression and physiology of growth-regulation gene in ruminants. // J. Reprod. Fert. 1990, Suppl. V.41, P.l 19-124.

128. Saiki R.K., Gelfand, Stoffel D.H. et al. Primer-detected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. // Science. 1988, V.239, P. 487-491.

129. Saiki R.K., Scharf s., Faloona f., et.al. Enzymatic amplification of |3globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Science 1985, V.230, P.1350-1354.

130. Kato M., Jwase R., Kasai K., et.al. Efficient selection of transgenicmouse embryos using EGFP as a marker gene. // Mol, Reprod. Dev. 1999, V.5, P.43-48.

131. Seo B.B., Kim C.H., Yamanouchi K., Takahashi M., et.al. Co-transfer ofrestriction enzyme with foreign DNA into the pronucleus for elevating production efficiencies of transgenic animals. // Animal Reprod. Sci. -2000, V.63, P.113-122.

132. Shapiro I.T., Leng Mand Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acidpolylysine complex, structure and nucleotide specificity. // Bio-chem I. 1969, V.8, P.3219-3232.

133. Simonet W.S., Bucay N., Lauer S.J., Wirak D.O., et.al In the absence ofa downstream elements the apolipoprotein E gene is expssed at high-level in kidneys of transgenic mice. // J. Biol. Chem. 1990, V.265, P.10809-10812.

134. Simons J.P., McCunagham M. And Clark A.J. Alteration of the qualityof milk by expression of sheep P-lactoglobulin gene in transgenic mice.//Nature- 1987, V.328, P.530-532.

135. Simons J.P., Wilmut I., Clark A.J., Archibald A.I., et.al. Gene transferinto sheep.//Bio/Technology- 1988, V.6, P179.

136. Soriano P., Cone R.D., mulligan P.C., Jaenisch R. tissue-specific andentopic expression of genes introduced into transgenic mice by retroviruses.//Science- 1986, V.234, P.1409-1413.

137. Soulier S., Stinnakre M., Lepourry L., et.al. // EUR. J. Biochem. 1999,1. V.260, P.533-539.

138. Seshagiri P. B., Bavister B. D. Clucose and phosphate inhibit respirationand oxidative metabolism in cultured hamster eight-cell embryos:evidence for the "Crabtree effect" // Mol. Reprod. Devel. 1991. -V. 30. - P. 105-111.

139. Stewart C.L., Vanek M., Wagner E.F. expression of foreign gene retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimaeras. // EMBO J. -1985, V.4, P.3701-3719.

140. Stewart L. C., Vanek M., Schuelze S., Wagner E. Expression of retroviral vectors in transgenic mice obtained by embryo infection // EMBO- 1987, V.6, P.383-388.

141. Sirard M. A. Development potential of early bovine zygotes submitted to centrifugation and microinjection following in vitro maturation of oocytes // Theriodenology. 1990. - V. 34. - P. 417 -425.

142. Swanson M.E., Martin M.J., O'Donnel J.K., Hoover K., Lago W., et.al.

143. Production of functional human hemoglobin in transgenic swine. // Biotechnology 1992, V.10, P.557-559.

144. Tada N., Sato M., Hayashi et.al., In vitro selection of transgenic mouseembryos in the present of G-418. // Trangenics. 1995, V.l, P. 535-540.

145. Uusi-Oukari M., Hittenen J.M., Korhonen V.P., et.al. Bovine alpha Slcasein gene stimulating factor in the milk of transgenic mice. // Transgenic. Res. 1997, V.6, P.76-84.

146. Van der Putten H., Botteri F.M., Miller A.D. et.al. Efficient insertion ofgenes into mouse germ line via retroviral vector. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, V.82, P.6148-6152.

147. Velander W.H., Iohnson J.L., Page R.L., et.al. High-level expression ofheterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992, V.89, P.12003.

148. Vize P.D., Michalska A.E., Ashman R., Lloyd B., et.al. Introduction of aporcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promoter growth//J. Cell Sci. 1988, V.90, P.295-300.

149. Wagner T.E., Hoppe P.C., et.al. Microinjection of a rabbit P-globin geneinto zygotes and its subsequent expression in adult mice and their offspring. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981, V.78, P.6376-6380.

150. Wall R. J., Siedel G.E. Transgenic farm animals a critical analysis. //

151. Theriogenology- 1992, V.38, P.337-357.

152. Wall R., Korr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. // J. Dairy Sci. 1997, V.80, P.2213-2224.

153. Wall R.D., Seidel G.E. Transgenic farm animals a critical analysis. //

154. Theriogenology- 1992, V.38, P.337-357.

155. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A., et.al. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary gland of transgenic swine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88. - P.1696.

156. Walton J.R., Murray J.D., Marshall J.M. et al. Zygote viability in genetransfer experiments // Biol. Reprod.- 1987. V. 37. - P. 67-957.

157. Ward K.A., Nancarrow C.D. The genetic engineering of production traitsin domestic animals.//Experimental-1991, V.47, P.913-922.

158. Welander W.H., Johnson J.L. et al. High level expression in the milk oftransgenic swine using the cDNA encoding human protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, V.89, P.12003

159. Wolf E., Jehle P.M., and Weber M.M. et.al. Human insulin-like growthfactor I produced in mammary gland of transgenic rabbit: yield, receptor binding, mitogenic activity and effect on IGF-binding proteins.//Endocrinology- 1997, V.138, P.307-313.121

160. Wong E.A., Capecchi M.P. Homologous recombination between coinjected DNA sequences peaks in early to mid-S phase. // Mol. Cell Biol. 1987, V.7, P.2294-2295.

161. Wright G., Carver A., Cottom D., Deeves D., Scott A., Wilmut I.,

162. Simons P., et.al. High level of expression of active human alpha 1-antutripsin in the milk of transgenic sheep. // Biotechnology -1991, V.9, P.830-834.

163. Yamada T., Kaneko H., Zuka R., et.al. Elevation of lymphocyte andhematopoetic stem cell number mice transgenic for human granu-locyte-CSF.//Lab. Invest.- 1995, Y.74, P.384-394.

164. Yom H.C., Bremel R.D. Genetic engineering of milk composition: modification of milk components in lactation transgenic animal. // Am. J. Clin. Nutr. 1993, V.58, P.299.

165. Yorifuji T., Mikawa H. Co-transfer of restriction endonucleases andplasmid DNA into mammalian fomation. // Mutation Res. 1990, V.243, P.121-126.

166. Zinovieva N.A., Lassnig C., Schams D., et.al // Transgen. Res. 1998,1. V.7, P43 7-447.