Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека

Тевкин, Сергей Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека"

На правах рукописи

ТЕВКИН Сергей Иванович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ - ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЧЕЛОВЕКА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская 2009 г.

003462183

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии и трансплантации эмбрионов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кленовицкий Павел Михайлович;

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита диссертации состоится 17 марта 2009 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская облает!., Подольский район, пос. Дубровицы, ВНИИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИЖ.

Автореферат разослан « » 2009 года.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Рябых Владимир Павлович

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки России Тараканов Борис Васильевич

Ученый секретарь совета Д 006.01

.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Получение трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения, считается в настоящее время одним из наиболее быстро окупаемых направлений трансгенной технологии, разработке которого уделяется наибольшее внимание.

Многие исследователи приходят к выводу, что очень удобным объектом для получения с молоком высокоактивных лекарственных веществ белковой природы является кролик. Основными достоинствами кролика для технологии получения суперпродуцентов биологически активных веществ с молоком являются его высокая скороплодность и одноразовое кормление крольчихами своего потомства, в результате которого от крольчихи можно получать до 150-200 мл молока в сутки. Исходя из этих соображений, возникает необходимость в разработке эффективной технологии получения трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения.

Для получения трансгенных животных наиболее широко используется метод микроинъекции плазмидных генно-инженерных конструкций в пронук-леусы зигот. Однако, при использовании этого метода общая эффективность переноса генов остается на низком уровне. По современным представлениям низкая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных обусловлена низкой частотой интеграции рекомбинантных конструкций в геном животных и снижением жизнеспособности зигот, микроинъециро-ванных различными генно-инженерными конструкциями, в организме животных-реципиентов.

Существует мнение, что использование генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусные вектора, является одним из направлений, с помощью которого возможно повышение частоты интеграции трансгена в геном животных. Однако вопрос о характере интеграции этих конструкций в геном эмбрионов и рождённого потомства остаётся ещё недостаточно изученным.

Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных необходимо изучение факторов, влияющих на интеграцию трансгена в геном хозяина и на жизнеспособность эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями, при получении трансгенных животных.

Цель н задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности эмбрионов и характера интеграции трансгена в геном кроликов при введении в зиготы различных генно-инженерных конструкций.

Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи: . ^

- изучить влияние некоторых физиолого-эмбриологических факторов на жизнеспособность и приживляемость зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными конструкциями;

- изучить влияние генно-инженерных конструкций, встроенных в ретро-вирусный вектор, на жизнеспособность кроличьих эмбрионов, при введении этих конструкций в перивителлиновое пространство зигот;

- исследовать частоту и характер интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в рет-ровирусный вектор, при введении их в перивителлиновое пространство зигот;

- изучить влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных конструкций на жизнеспособность эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном животных.

Научная новизна исследований. Получены трансгенные кролики с интегрированным геном гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека под промотором гена а£7-казеина крупного рогатого скота путем микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор (Лу-о£/-Сп-ИО-СБР). Изучен характер интеграции этой конструкции в геном рожденного потомства кроликов и передача трансгена по наследству. Установлено, что при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство зигот интеграция трансгена носит мозаичный характер.

Получены трансгенные кролики, несущие ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена сйгказеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота (с£гСп-М/ и PLg-hLf), путем микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных генно-инженерных конструкций. Изучена частота интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства кроликов генно-инженерных конструкций аБгСп-ИЬ/и fiLg-hLf человека при введении их в пронуклеусы зигот.

Практическая значимость. Результаты исследований, о влиянии генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов, частоту и характер интеграции .трансгена в геном рожденного потомства могут быть использованы в работах по получению трансгенных животных с целью повышения общей эффективности технологии трансгеноза. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестрик-тазы ХЬа1 с генно-инженерной конструкцией, могут быть использованы для дальнейшей разработки способов, повышающих частоту интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию кроличьих зародышей после различных эмбриоинженерных манипуляций могут быть использованы при разработке технологии трансгеноза и при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих.

Положения, выносимые на защиту

1. Микроинъекция в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, способствует увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства, по сравнению с введением плазмидных конструкций в пронуклеусы зигот, но интеграция трансгена в геном первичных трансгенных кроликов при этом носит мозаичный характер.

2. При микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций а5гСп-М./частота интеграции трансгена в геном первичного рождённого потомства кроликов достоверно ниже, чем частота интеграции в эмбрионы, определённая на стадии бластоцисты.

3. Крольчихи в возрасте до 2-х лет лучше реагируют на гормональную обработку при вызывании суперовуляции и являются лучшими реципиентами для транепланташш зигот, микроинъекцированиых генно-инженерными конструкциями.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ВНИИФБиП в период с 2004-2007 г., а также на:

- Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма» (г. Ставрополь, 2006 г.)

- IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (г. Боровск, 2006 г.)

- IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2006 г.)

- конкурсе молодых учёных в рамках IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2006 г.)

- VI Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (п. Дубровицы, 2006 г.)

- симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008 г.)

По материалам диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 работа в рецензируемом научном издании, рекомендованном ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 10 рисунков. Список литературы содержит 233 ссылки, в том числе 197 на английском языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории клеточной инженерии и трансплантации эмбрионов Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельско-

хозяйственных животных. Эксперименты были проведены на кроликах пород шиншилла, калифорнийский, серебристый и белый великан в условиях вивария института.

2.1. Получение кроличьих эмбрионов

В целях получения максимального количества зигот у крольчих-доноров вызывали суперовуляцию по схеме, отработанной в лаборатории.

Извлечение зиготу крольчих-доноров, проводили через 17-19 ч после покрытия их самцом и введения хорионического гонадотропина человека (ХГч), применяя стандартные хирургические методы. Для вымывания зигот использовали фосфатно-солевой буфер Дюльбекко фРВБ) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,04 мг/мл гентамицина.

Эмбрионы на стадии зиготы собирали и отмывали в каплях свежей манипуляционной среды ОРВ8 с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), 0,04 мг/мл гентамицина и 0,33 мМ натрия пирувата. После чего их переносили в свежеприготовленные капли манипуляционной среды под минеральным маслом.

2.2. Генно-инженерные конструкции использованные в работе

В работе были использованы плазмидные генно-инженерные конструкции содержащие кДНК структурного гена лактоферрина (£/) и нуклеотидные последовательности гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора (С-СБГ) человека с регуляторными областями генов ¡3-я а кто гло б у л и на или отказе и на крупного рогатого скота (Езерский В.А., ВНИИФБиП).

Концентрация ДНК используемая для микроинъекции составляла 5-7 нг/мкл в соответствующем буфере.

В работе также была использована генно-инженерная конструкция, включающая нуклеотидные последовательности гена гранулоцит - коло-ниестимулирующего фактора (й-СЯК) человека под промотором гена аБ1 -казеина крупного рогатого скота (Дворянчиков Г.А., ВНИИФБиП), встроенная в ретровирусный вектор. Ретровирусный вектор дефектный по репликации был получен из генома вируса лейкемии мышей Молони и введен в линию упаковывающих клеток АМ12 (Фомин И.К., БелНИИ переливания крови, г. Минск).

2.3. Получение культуральной среды, содержащей ретровирусную конструкцию

Для получения ретровирусных конструкций клетки-упаковщицы культивировали во флаконах в 5 мл среды БМЕМ с добавлением 10% инакти-вированной фетальной телячьей сыворотки в газовой фазе, содержащей 5% С02 в воздухе. Среду культивирования клеток-упаковщиц, содержащую ретровирусные вирионы, отбирали из культуральных флаконов и освобождали от клеток и клеточных фрагментов центрифугированием и фильтрованием.

Полученную среду, содержащую ретровирусные вирионы, использовали для введения в перивителлиновое пространство кроличьих зигот.

2.4 Микроинъекция генно-инженерных конструкций в зиготы

Морфологическую оценку зигот и микроинъекцию в них различных генно-инженерных конструкций осуществляли на установке включающей инвертированный микроскоп («OPTON», ICM 405, Германия) с дифференциально-интерференционным контрастом (DIC по Номарско-му) и комплект манипуляторов и микроинъекторов.

Микроинъекцию плазмидных генно-инженерных конструкций fiLg-hLf, aSl-C.n-hLf или /3Lg-hG-CSF в мужской пронуклеус кроличьих зигот проводили при х 400 увеличении стеклянной микроинъекционной иглой с внешним диаметром кончика 1,5-2 мкм. Объём вводимого в пронуклеус раствора составлял 1-2 пкл (около 1000 копий/пкл). Точность введения раствора ДНК контролировали по увеличению пронуклеуса.

Микроинъекцию в перивителлиновое пространство зигот среды, содержащей ретровирусный вектор, проводили стеклянными микроиглами с внешним диаметром кончика 2-4 мкм. Точность введения контролировали по увеличению перивителлинового пространства и смещению ци-топлазматической мембраны.

2.5. Культивирование кроличьих эмбрионов in vitro

Для культивирования зигот in vitro до стадии бластоцисты использовали сбалансированную свежеприготовленную среду Ham's F-10 с добавлением 20% ФТС. Культивирование проводили в стерильных пластиковых чашках Петри в каплях среды под легким минеральным маслом в газовой фазе, содержащей 5% С02 в воздухе, при t=37°C.

2.6. Трансплантация эмбрионов самкам-реципиентам

Синхронизацию полового цикла крольчих-реципиентов проводили гормонально одновременно с обработкой самок-доноров по отработанной схеме. Трансплантацию микроиньецированных зигот самкам-реципиентам проводили хирургическим методом. Эмбрионы трансплантировали в минимальном объёме среды во вторую треть каждого яйцевода.

2.7. Определение интеграции трансгена в геноме эмбрионов и роис-денного потомства

Для определения интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК из различных тканей животных проводили по методу Блина и Стаффорда с некоторыми модификациями (Blin and Stafford, 1976).

Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными конструкциями

В настоящее время при получении потомства кроликов из зигот, микро-инъецированных генно-инженерными конструкциями, исследователи исполь-

зуют отдельные этапы классической технологии трансплантации неинъеци-рованных эмбрионов поздних стадий развития, разработанные для изучения некоторых вопросов биологии развития. Однако применительно к технологии получения трансгенных животных к этим этапам предъявляются значительно более жёсткие требования в связи с тем, что в этой технологии используются эмбрионы на стадии зиготы, микроинъецированные различными генно-инженерными конструкциями.

Анализ результатов по стимуляции суперовуляции у крольчих-доноров (табл. 1) показал, что лучше на гормональную обработку реагировали крольчихи пород: шиншилла, калифорнийский и серебристый. Несколько хуже -белый великан. Эта закономерность сохранилась и при извлечении зигот у крольчих-доноров (36; 32; 30 и 25,8, соответственно).

Таблица 1

Порода кроликов Число животных Число овуляций Число извлечённых 1 эмбрионов I

Шиншилла 38 40,0±2,1 36,0+1,6

Калифорнийский 20 43,3±2,7 32,0±1,8

Серебристый 20 36,6±2,2 30,0±1,9

Белый великан 15 30,0±0,9 25,8±0,8 |

Наряду с этим была отмечена закономерность, что лучше суперовуляцией на гормональную обработку реагируют крольчихи всех пород в возрасте от одного года до двух лет, после чего ответная реакция на гормональную обработку достоверно снижается с 41,0±2,3 до 25,2±1,6 (табл. 2).

Таблица 2

Реакция суперовуляции у крольчих-доноров разного возраста

Возраст животных (год)

Число животных

Число овуляций

41,0±2,3

31,4±1,1

25,2±1,6

Результаты исследований по выяснению зависимости приживляемости эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генно-инженерными конструкциями, от числа зигот, трансплантированных крольчихам-реципиентам (табл. 3), показали, что с увеличением числа трансплантированных эмбрионов процент сукрольности реципиентов увеличивался с 30,4 до 66,6% при пересадке, соответственно, 18 и 34-ти зигот. Увеличивалась также и прижив-ляемость эмбрионов в расчёте на всех использованных реципиентов с 6,6 до 9,6%, соответственно.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что крольчихам-реципиентам наиболее целесообразно пересаживать от 30 до 40

зигот, микроинъецированных в пронуклеус плазмидными генно-инженерными конструкциями.

Таблица 3

Приживляемость эмбрионов, микроинъецирозанных плазмидными генно-инженерными конструкциями, в зависимости от числа зигот, трансплантиро-

ванных крольчихам-реципиентам

I Число Сукрольных Пересажено Получено Приживляе

транс- Число реципиентов зигот крольчат мость

планти- животных на 1 рецип. на 1 эмбрио-

рованных эмбрионов реципиентов п % п п сукрол. рецип. нов, %

14-20 23 7 30,4±9,5* 435 18,9 29 4,1 6,6

21-30 41 19 46,3±7,7* 952 23,2 91 4,8 9,5

31-40 9 6 66,6±10,6* 312 34,6 30 5,0 9,6

Примечание: *р<0,05.

Результаты проведённых исследований также свидетельствуют, что на сукрольность реципиентов и приживляемость эмбрионов оказывает влияние и возраст крольчих-реципиентов (табл. 4). Наименьшая сукрольность (20%) и приживляемость эмбрионов (4,2%) была отмечена у крольчих-реципиентов трёхлетнего возраста.

Таблица 4

Приживляемость микроинъецированных эмбрионов в зависимости от

возраста крольчих-реципиентов

Возраст реципиентов (год) Число животных Сукрольных реципиентов Пересажено эмбрионов Получено крольчат Приживляемост1 эмбрионов, %

п % п на 1 рецип. п на 1 рецип.

1 41 19 46±6,5* 902 22 115 2,9 12,7

2 23 16 59±9,7* 552 24 64 2,8 11,6

3 10 2 20±9,3* 240 24 10 1,0 4,2

Примечание: *р<0,05.

Наибольший процент сукрольности (59%) был отмечен у крольчих 2-х летнего возраста и несколько меньший (46%) у крольчих в возрасте 1 года. Поэтому, если учесть, что крольчихи в возрасте 1-го года лучше реагируют суперовуляцией на гормональную обработку, то их целесообразно использовать в качестве доноров эмбрионов, а крольчих до двухлетнего возраста -лучше использовать в качестве реципиентов. Крольчих в возрасте 3-х лет нецелесообразно использовать в работах по трансгенозу ни в качестве доноров, ни в качестве реципиентов.

3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном первичных трансгенных кроликов

В последнее время большое внимание уделяется изучению возможности использовании ретровирусных векторов для получения трансгенных животных. Однако, при использовании ретровирусных векторов получено очень мало трансгенных животных. Объясняется это тем, что ещё не достаточно изучены многие процессы, связанные с влиянием ретровирусных векторов на жизнеспособность эмбрионов и на характер интеграции трансгена в геном животных.

Анализ результатов исследований (табл. 5) показал, что при инъекции в перивителлиновое пространство кроличьих зигот профильтрованной культуральной среды, содержащей ретровирусную конструкцию, сукрольность реципиентов и приживляемость эмбрионов были достаточно высокими (71,4100% и 29-48%, соответственно).

Таблица 5

Сукрольность реципиентов и приживляемость зигот, инъецированных генно-инженерной конструкцией Яу-а31-Сп-ИС-СБР, встроенной в ретровирус-

ный вектор, в зависимости от количества трансплантированных зигот

Число Число Сукрольных Число родившихся Приживляемость

эмбрионов реци- реципиентов потомков эмбрионов, %

на 1 реци- пиен- п % п на 1сукрол. на всех на 1сукрол.

пиента тов рецип. рецип. рецип.

9(8-11) 3 3 100,0 13 4,3 48 48

14 (12-25) 7 5 71,4 27 5,4 27 38

28 (22-34) 7 5 71,4 41 8,2 20 29

Анализ интеграции трансгена в геном рожденного потомства у кроликов (табл. 6) показал, что частота интеграции трансгена в геном была достаточно высокой - 19,5%, при общей эффективности трансгеноза - 5,0%.

Таблица 6

Интеграция гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека в геном рожденного потомства после микроинъекции ретровирусной

Конструкция, содер- Родилось крольчат Общая

Гр. жащаяся в культу- всего из них трансгенных эффективность

ральной среде п п % трансгеноза, %

I ЯУ-сь^-СЛ-ЙС-С^ 81 16 19,5 5,0

Вследствие более высокой приживляемости эмбрионов и частоты интеграции трансгена в геноме рождённого потомства, общая эффективность трансгеноза при использовании ретровирусных конструкций оказалась в 2-3

раза выше, чем при использовании плазмидных генно-инженерных конструкций (табл. 11).

При детальном анализе интеграции трансгена в геном первичных трансгенных кроликов, полученых в результате микроинъекции в пери-вителлиновое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, выяснилось (табл. 7), что встраивание трансгена в геном рождённого приплода носит мозаичный характер. Интеграция трансгена у первичных трансгенных животных происходила, главным образом, в производные эктодермы, в небольшом проценте случаев в производные энтодермы и не была обнаружена в производных мезодермы.

Таблица 7

— Гр. Вид ткани Производные зародышевых листков Трансгенные животные

самки с?№87 ¿№072 +

I Ушная раковина Эктодерма + +

II Кровь Мезодерма - - -

III Семя Зародышевая энтодерма - - ± |

Получение потомства от этих первичных трансгенных животных показало, что передача трансгена по наследству составила 3,5% (3/86). Только небольшая часть потомков самца №072, у которого сигнал интеграции трансгена был обнаружен в зародышевой энтодерме (табл. 7), оказались трансгенными.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что при инъекции в перивителлиновое пространство зигот, генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, значительно повышается частота интеграции трансгена, по сравнению с инъекцией плазмидных генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот. Однако интеграция трансгена при этом носит мозаичный характер.

3.3. Изучение возможности получения трансгенных кроликов при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II

По всей вероятности, мозаичное встраивание трансгена в геном животных обусловлено небольшой продолжительностью фазы М клеточного цикла зиготы, в связи с чем, ретровирусная конструкция чаще всего не успевает попасть в ядро зиготы лишённое ядерной оболочки, а попадает уже в ядра 2-8-клеточных эмбрионов, при последующем дроблении бластомеров. Известно, что при созревании ооцита во время метафазы II (МП) ядерная оболочка отсутствует значительно больший период времени, по сравнению с фазой митоза соматической клетки. В связи с этим было выдвинуто предположение, что введение ретровирусной конструкции в ооцит в период до стадии МП может значительно увеличить время контакта её с хроматином и тем са-

мым повысить частоту интеграции трансгена в геном эмбриона. А введение конструкции в ооцит до момента оплодотворения должно обеспечить получение не мозаичного потомства. Для проверки этой гипотезы у крольчих-доноров была вызвана суперовуляция по схеме, отработанной в лаборатории, и через 12 ч после введения им ХГч (предполагаемое время овуляции), они были покрыты самцом. Через 0,5; 1,5 и 2,0 ч после осеменения самцом из яйцеводов крольчих разных групп были извлечены ещё не оплодотворённые яйцеклетки, находящиеся на стадии МИ. Яйцеклетки были частично освобождены от клеток кумулюса, инъецированы ретровирусной конструкцией в перивителлиновое пространство, и трансплантированы в яйцеводы тем же крольчихам.

При постановке данного эксперимента предполагалось, что после трансплантации яйцеклеток, инъецированных в перивителлиновое пространство генно-инженерной конструкцией, встроенной в ретровирусный вектор, они будут оплодотворены сперматозоидами, попавшими в репродуктивный тракт крольчих, при осеменении их самцами, и будет происходить их дальнейшее развитие.

Однако, результаты проведённого эксперимента показали, что сукроль-ность не наступала у крольчих, которым в яйцеводы были трансплантированы ещё не оплодотворённые яйцеклетки, извлечённые из яйцеводов этих же крольчих через 12,5-14,0 ч после введения им ХГч и через 0,5-2,0 ч после осеменения их самцом, что по-видимому, обусловлено целым комплексом причин:

- нарушением естественного состава яйцеводной жидкости;

- нарушением транспортной функции в яйцеводах;

- извлечением значительной части сперматозоидов при вымывании яйцеклеток.

3.4. Влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот различных плаз-мидных генно-инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном рождённого потомства

Для получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества человека фармакологического назначения в институте были созданы генно-инженерные конструкции, содержащие ген лактоферрина или гранул о цит колониестимулирующего фактора человека под контролем регуляторных элементов генов о£;-казеина или /?-лактоглобулина крупного рогатого скота.

В связи с этим возникла необходимость в проведении работ по изучению их влияния на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и эффективность интеграции в геном эмбрионов и рождённого потомства.

Результаты культивирования кроличьих зигот in vitro (табл. 8) свидетельствуют о том, что микроинъекция генно-инженерных конструкций содержащих ген hLf под контролем регуляторных элементов генов aSr казеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота достоверно снижала

способность зигот развиваться до стадии бластоцисты и выходить из блестящей оболочки, по сравнению с контрольной группой (I гр.).

Наибольшее отрицательное влияние на жизнеспособность кроличьих эмбрионов, после микроинъекции в пронуклеусы зигот, оказала генно-инженерная конструкция содержащих ген hLf под контролем регуляториых элементов гена «5гказеина крупного рогатого скота (табл. 8).

Таблица 8

Жизнеспособность зигот кролика in vitro при использовании различных

плазмидных генно-инженерных конструкций

Генно-инженерная конструкция Число зигот Бластоцист

Гр. Инъеци ровано перепело инъекцию дробилось развилось до бластоцисты вышло из блестящей оболочки

п п % п % п %

I Контроль - - 28 100 27 93±5,6 15 55,5±9,5

11 ßLg-hLf 103 91 89 98 43 47±5,2 132 Ьо,2±7,С

III aSrCn-hLf 88 63 48 76 221 35±7,1 2' 9,1 ±6,1

"Примечание: 1 - р<0,001;2 - р<0,05; 3 -р<0,001.

Все морулы и бластоцисты, полученные в результате культивирования микроинъецированных зигот кролика in vitro, были проанализированы на наличие интеграции трансгена методом ПЦР. Анализ полученных результатов (табл. 9) показал, что наибольшая частота интеграции трансгена в геном эмбрионов наблюдалась после микроинъекции плазмидной конструкции aSr Cn-hLf и составила 30,0%. После микроинъекции генно-инженерной конст-рукци pLg-hLf частота интеграции трансгена была значительно ниже - 10,4%.

Таблица 9

Частота интеграции чужеродного гена в геном эмбрионов при использо-

вании различных плазмидных генно-инженерных конструкций

Конструкция инъецированная в пронуклеус Исследовано эмбрионов f

Гр. всего из них трансгенных J

п п % I

I ßLg-hLf 67 7- 10,4±3,6*

II aSrCn-hLf 30 9 30,0±8,3 1

Примечание: *р<0,05.

Сравнительный анализ приживляемое™ эмбрионов в расчете на всех самок-реципиентов (табл. 10) показал, что между контрольной (I гр.) и опытными (II, III гр'.) группами нет статистически достоверных различий как по проценту сукрольности (72 против 50 и 33%), так и по приживляемости эмбрионов в организме самок-реципиентов (27,1 против 20 и 15%, соответственно). Однако наблюдается явная тенденция снижения как процента сук-

рольности, так и приживляемости эмбрионов у самок-реципиентов опытных групп.

Таблица 10

Приживляемость эмбрионов при трансплантации зигот, инъецированных разными плазмидными генно-инженерными конструкциями, в организме

Генно- Число Трансплантировано зигот Сукрольных Родилось Приживляемость эмбрионов

Гр. инженерная реципи- реципиентов по- на всех на 1 сукрол.

конструкция ентов том- рецип. рецип. 1

п % ков % % !

I Контроль 11 254 8 72±14,5 50 19,7 27,1 :

11 10 197 5 50±16,7 20 10,0 20

III сЗгСп-ИЬ/ 6 120 2 33±21,0 6 5,0 15

Примечание: р<0,1.

Полученные данные свидетельствуют, что при микроинъекции в пронук-леусы зигот плазмидной генно-инженерной конструкции аЪгСп-ЫД наблюдается более сильное отрицательное влияние на приживляемость эмбрионов в организме самок-реципиентов (15%), чем после инъекции ¡ÍLg-hLf (20%).

В результате определения интеграции чужеродного гена с помощью ПЦР-анализа ДНК, выделенной из тканей рождённых крольчат, с использованием праймеров на структурный ген и участок регуляторной области были выявлены трансгенные животные (рис. 1).

2000 п.н. --

а.

840 п.н.

А-

б.

Рис. 1. ПЦР-анализ ДНК кроликов с использованием праймеров №77/Ы5 (а) и ВЬ^М/ЬС (б), а: 1-12 - образцы ДНК тканей рождённого потомства кроликов, 5 и 6 - «+» ответы; 13 - маркёр молекулярных мае; 14 «-» контроль (деиони-зированная вода); 15 - «+» контроль (ДНК трансгенной по ИЬ/мыши), б: 4-15 -пробы ДНК рожденного потомства, 13 -«+» ответ; 2 -«+» контроль (разведённая конструкция 5 - «+» контроль (ДНК трансгенной по ИЬ/мышц); 1 -«~» контроль (деионизированная вода); 1 б - маркёр молекулярных масс.

Частота интеграции трансгена и геном рождённого потомства у кроликов при использовании конструкции /?/.#-и а$,-Сп-Ь1/составила 5,0 и 16,6%, соответственно, при общей эффективности трансгеноза 0,5 и 0,8 % (табл. 11).

Таблица 11

Частота интеграции чужеродного гена и эффективность трансгеноза при трансплантации кроличьих зигот, инъецированных разными плазмидными генно-инженерными конструкциями

Конструкция Родилось крольчат Общая эффектив-

Гр. инъецированная в всего из них трансгенных ность трансгеноза,

пронуклеус п п % %

I pLz-hLf 20 1 5 0,5

11 aSrCn-hLf 6 1 16,6 0,8

Таким образом, результаты проведённой серии экспериментов по микро-инекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций показали, что общая эффективность трансгеноза несколько выше при использовании конструкции aSrCn-hLf.

3.5. Влияние микроинъекцин в пронуклеусы кроличьих зигот плаз-миднон генно-инженерной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность и интеграцию трансгена в геном эмбрионов

Современные положения цитогенетики дают основание полагать, что встраивание чужеродной ДНК происходит в местах естественных разрывов хромосомной ДНК хозяина. Вследствие этого возникло предположение, что при микроинъекции в пронуклеусы зигот вместе с генно-инженерными конструкциями рестриктаз, с помощью которых осуществлялось вырезание этих конструкций из плазмиды, может способствовать разрезанию хромосомной ДНК с образованием липких концов комплиментарных липким концам вводимой генно-инженерной конструкции. В результате чего, может, возрасти, вероятность встраивания генно-инженерной конструкции. Исходя, из этого предположения при создании генно-инженерной конструкции fíLg-hG-CSF для вырезания её из плазмиды как на 5', так и на 3' концах была использована рестриктаза Xbal. Сама генно-инженерная конструкция не содержит сайтов рестрикции для рестриктазы Xbal.

Результаты культивирования зигот in vitro свидетельствуют о том, что при микроинъекции генно-инженерной конструкции вместе с рестриктазой Xbal, разведенной в буфере Tango до концентрации 0,1 (IV гр.), 0,01 (V гр.) и 0,001 (VI гр.) ед./мкл, достоверно снижалась способность зигот развиваться до стадии бластоцисты, по сравнению с контрольной группой (табл.12).

Таблица12

Влияние микроинъекции генно-инженерной конструкции вместе с

Раствор, инъецированный в про-нуклеус Число ЗИГОТ 1

Гр. циро-вано перенесло инъекцию дробилось развилось до 1 бластоцисты |

п % п % п % |

I Контроль - - 28 100 27 93±1,2

II Буфер Тащо 21 20 95 20 100 17 85±1,1

III РЬя-Ш-СБГ 67 60 90 56 93 481 80±5,3

IV ^-Ш-СЭР + ХЪа1 (0,1ед/мкл) 110 107 97 92 86 492 46±4,3

V РЬ^-ИО-СЖ + ХЬа1 (0,01ед/мкл) 89 83 93 63 76 2? 28±5,0

|vi /^Я-ЛС-СХГ + ХЬа1 (0,001ед/мкл) 19 19 100 17 89 141 74±9,7

Анализ интеграции трансгена в геном кроличьих бластоцист (табл. 13) показал, что частота интеграции генно-инженерной конструкции

в геном кроличьих эмбрионов, при совместной микроинъекции в про-нуклеус зигот конструкции и рестриктазы ХЬа1 достоверно не увеличилась и наблюдалась только в группе зигот, инъецированных pLg-hG-CSF+XЪal 0,01ед/мкл., что практически не отличалось от интеграции трансгена в зиготы, микроинъецированные только одной генно-инженерной конструкцией PLg-hG-CSF, и составила 3,7% против 4,0%, соответственно.

Таблица 13

Частота интеграции чужеродного гена в геном эмбрионов при использовании рестриктазы ХЬа!

| Раствор, инъецированный в пронуклеус Исследовано эмбрионов |

Гр- всего из них трансгенных j

п п % 1

I ßLg-hG-CSF 48 2 4,0 |

II ßLg-hG- CSF + Xbal (0,1ед/мкл) 49 - -

III ßLg-hG- CSF + Xbal (0,01ед/мкл) 23 1 3,7

IV ßLg-hG- CSF +XbaI (0,001ед/мкл) 14 - |

Увеличение концентрации рестриктазы ХЬа1 с 0,01 до 0,1 ед./мкл не способствовало увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов.

4. ВЫВОДЫ

1. Крольчихи пород шиншилла, калифорнийский и серебристый в возрасте до двух лет лучше реагируют на гормональную обработку при вызывании суперовуляции, по сравнению с крольчихами породы белый великан. Крольчихи этих же пород в возрасте до двух лет являются лучшими реципи-

ентами для трансплантации зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.

2. Приживляемость эмбрионов кролика, развившихся из зигот, инъецированных в перивителлиновое пространство генно-инженерной конструкцией, встроенной в ретровнрусный вектор, колебалась от 20% до 48% в расчете на всех реципиентов и от 28% до 48% в расчете на сук-рольных реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот. Частота интеграции в геном рожденного потомства гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека под промотором aSl-казеина крупного рогатого скота, встроенного в ретровирусный вектор, составила 19,5%.

3. Интеграция трансгена в геном первичных трансгенных кроликов, полученых в результате микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор, носила мозаичный характер.

4. Трансплантация крольчихам-донорам не оплодотворённых яйцеклеток, извлечённых из яйцеводов этих же крольчих, через 12,5-14,0 часов после введения им ХГч и через 0,5-2 часа после осеменения их самцами, не приводит к сукрольности этих крольчих.

5. Совместное введение в пронуклеусы кроличьих зигот генно-инженерной конструкции fiLg-hG-CSF с рестриктазой у Xbal не привело к увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов.

6. Частота интеграции плазмидных генно-инженерных конструкций (aSj-Cn-hLf и fiLg-hLf), микроинъецированных в пронуклеусы зигот, определенная в геноме кроличьих бластоцист, развившихся in vitro, составила 30% и 10,4%, соответственно. Частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства составила для гена лактоферрина под промотором гена й5/-казеина крупного рогатого скота - 16,6% и под промотором /?-лактоглобулина - 5%, при использовании для ПЦР-анализа праймеров на часть структурного гена и участок регуляторной области.

7. Получены трансгенные кролики с интегрированными в их геном нуклеотидными последовательностями гена лактоферрина человека под промотором гена аг5/-казеина и гена /?-лактоглобулина крупного рогатого скота, путем микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В работах по получению трансгенных кроликов в качестве реципиентов для трансплантации зигот, микроинъецированных различными - генно-инженерными конструкциями, наиболее целесообразно использовать крольчих пород калифорнийская, шиншилла и серебристый в возрасте до двух лет, а в качестве доноров эмбрионов крольчих тех же пород, в возрасте одного года.

2. Наиболее целесообразно пересаживать крольчихам-реципиентам от 30 до 40 зигот, микроинъецированных в пронуклеус плазмидными генно-инженерными конструкциями, и от 8 до 13 зигот, микроинъецированных в перивителлиновое пространство генно-инженерными конструкциями, встроенными в ретровирусный вектор.

3. Созданные во ВНИИФБиП генно-инженерные конструкции, включающие нуклеотидные последовательности гена лактоферрина человека, под контролем регуляторных элементов генов сй^-казеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота (а£гСп-И1/и fSLg-hLf) рекомендуем для использования в работах по получению трансгенных животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тевкин, С.И. Трансгенные кролики - продуценты биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека / С.И. Тевкин // Естественные и технические науки. - 2008. -№3. - С. 126-133.

2. Тевкин, С.И. Интеграция в геном мышей и кроликов генно-инженерной конструкции с геном лактоферрина человека / С.И. Тевкин, М.С. Шишиморо-ва, Т.П. Трубицина, В.А. Езерский, В.П. Рябых // Материалы V съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М., 2008. - С. 173-174.

3. Рябых, В.П. Получение человеческих биологических веществ фармакологического назначения с молоком трансгенных животных / В.П. Рябых, А.Г. Логинов, В.А. Езерский, Т.П. Трубицина, С.И. Тевкин, О.Б. Фаткулина, И.Г. Сметанина // Материалы симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств». - М., 2008.-С. 175-176.

4. Тевкин, С.И. Эффективность интеграции генно-инженерной конструкции с геном гранулоцит - колониестимулирующего фактора человека в пре-димплантационные эмбрионы кролика / С.И. Тевкин, М.С. Шишиморова,

B.А. Езерский // Материалы Н-й Открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Молодежь и наука XXI века». -Ульяновск, 2007,-4.1.-С. 179-182.

5. Рябых, В.П. Исследование физиолого-эмбриологических и молекуляр-но-биологических процессов, лежащих в основе трансгеноза у сельскохозяйственных животных / В.П. Рябых, М.С. Шишиморова, Т.П. Трубицина, О.Б. Фаткулина, С.И. Тевкин, И.Г. Сметанина // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - Калуга, 2007. - Вып. 11.-

C. 451-471.

6. Тевкин, С.И. Интеграция в геном кроликов ретровирусных конструкций, введённых в перивителлиновое пространство зигот / С.И. Тевкин, Т.П. Трубицина, В.А. Езерский, В.П. Рябых // Материалы международной научно-практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма». - Ставрополь, 2006. - С. 43-46.

7. Тевкин, С.И. Характер интеграции ретровирусной конструкции в геном кроликов, при введении её в перивителлиновое пространство зигот / С.И.

'Гевкин // Материалы IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - Пущино, 2006. - С. 258-260.

8. Тевкин, С.И. Особенности интеграции в геном кроликов ретровирусной конструкции, введённой в перивителлиновое пространство зигот / С.И. Тевкин, Т.П. Трубицина, В.А. Езерский, В.П. Рябых // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». -Боровск, 2006. - С. 280-281.

9. Тевкин, С.И. Развитие кроличьих зигот in vitro при различных вариантах микроинъекции / С.И. Тевкин, Т.П. Трубицина, Л.И. Маркина, В.А. Езерский, В.П. Рябых // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы в животноводстве». - Боровск, 2006. - С. 279-280.

10. Рябых, В.П. Интеграция в геном животных генно-инженерных конструкций встроенных в ретровирусный вектор при различных вариантах введения в зиготы млекопитающих / В.П. Рябых, М.С. Шишиморова, С.И. Тевкин, Т.П. Трубицина, О.Б. Фаткулина, Л.Б Иванова // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы в животноводстве». - Боровск, 2006.-С. 268-270.

11. Тевкин, С.И. Интеграция ретровирусной конструкции, введённой в перивителлиновое пространство кроличьих зигот / С.И. Тевкин, Т.П. Трубицина, В.А. Езерский, В.П. Рябых // Материалы VI международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». — Дубровицы, 2006. - С. 187-190.

12. Рябых, В.П. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот мнкроинъецированных генно-инженерными конструкциями / В.П. Рябых, Т.П. Трубицина, Л.И. Маркина, С.И. Тевкин, М.С. Шишиморова // Материалы V международной школы-конференции «Новые методы генной диагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, 2005. - С. 127-134.

13. Рябых, В.П. Анализ факторов, влияющих на приживляемость эмбрионов микроинъецированных генно-инженерными конструкциями у животных реципиентов / В.П. Рябых, Т.П. Трубицина, М.С. Шишиморова, О.Б. Фаткулина, С.И. Тевкин // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - Калуга, 2005. - Вып. 8. - С. 363-367.

Отпечатано в МУГ1 «Полиграфист» г. Боровск, пл. Ленина, 20 Подп. к печати 09.02.2009 г. Формат 60X84 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1 Заказ 167, тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тевкин, Сергей Иванович

Введение.

1.Обзор литературы.

1.1 Трансгенные кролики - источники биологически активных рекомбинант-ных белков и модели болезней человека.

1.2. Основные способы введения генно-инженерных конструкций в эмбрионы животных.

1.3. Эффективность интеграции трансгена в геном млекопитающих.

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Получение кроличьих эмбрионов.

2.2. Генно-инженерные конструкции использованные в работе.

2.3. Получение культуральной среды, содержащей ретровирусную конструк-цю.

2.4. Микроинъекция генно-инженерных конструкций в зиготы.

2.5. Культивирование кроличьих эмбрионов in vitro.

2.6. Трансплантация эмбрионов самкам-реципиентам.

2.7. Определение интеграции трансгена в геном эмбрионов и рождённого потомства.

3. Результаты собственных исследований.

3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными конструкциями.

3.1.1 Суперовуляция у крольчих доноров эмбрионов разных пород и разного возраста.

3.1.2. Приживляемость эмбрионов в организме крольчих-реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.

3.1.3. Влияние породы и возраста крольчих-реципиентов на сукрольность и приживляемость эмбрионов.

3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот культу-ральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном первичных трансгенных кроликов.

3.2.1. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъеци-рованных генно-инженерной конструкцией aSl-Cn-hG-CSF, встроенной в ретровирусный вектор, и интеграция трансгена в геном рожденных кроликов.

3.2.2. Передача трансгена потомству первичными трансгенными животными, полученными с использованием генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор.

3.3. Изучение возможности получения трансгенных кроликов при введении рет-ровирусной конструкции в перивителлиновое пространство яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II.

3.3.1. Приживляемость эмбрионов при трансплантации крольчихам-донорам извлечённых у них зигот (метод донор-реципиент).

3.3.2. Изучение возможности получения трансгенных животных при введении генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, в ещё неоплодотворённые яйцеклетки, извлечённые из яйцеводов крольчих, осеменённых самцом.

3.4. Влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот различных плазмидных генно-инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном рождённого потомства.

3.4.1. Влияние различных плазмидных генно-инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена на стадии эмбриона.

3.4.2. Приживляемость эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генно-инженерными конструкциями, в организме самок-реципиентов и частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства.

3.5. Влияние микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидной генно-инженерной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность и интеграцию трансгена в геном эмбрионов.

3.5.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генно-инженерной конструкции с рестриктазой Xbal на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бла-стоцисты.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека"

Получение трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения, считается в настоящее время одним из наиболее быстро окупаемых направлений трансгенной технологии, разработке которого уделяется наибольшее внимание. Принципиальная возможность получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества белковой природы, обусловлена механизмом тканеспецифической экспрессии трансгена в клетках секреторного эпителия молочной железы, определяемой регуляторными последовательностями генов основных белков молока, используемых в качестве промоторов при создании генно-инженерных конструкций.

Среди биологически активных веществ, имеющих терапевтическое значение, наибольшее внимание исследователей привлекают: колониестимули-рующие факторы, интерлейкины, антитромбин, урокиназа, эритропоэтин, фактор некроза опухолей и другие. Получение белков этого класса с помощью рекомбинантных бактерий в ряде случаев принципиально невозможно из-за неспособности прокариот осуществлять сложные посттрансляционные модификации синтезируемых белков (гликозилирование, карбоксилирование и др.), которые в совокупности обеспечивают функциональную активность этих белков.

Разработанные в настоящее время технологии получения некоторых лекарственных биологически активных веществ на основе использования культур клеток млекопитающих животных, которые способны в определенной степени осуществлять посттрансляционные модификации белков, являются слишком трудоемкими и дорогостоящими. Расчеты, основанные на результатах первых экспериментов, свидетельствуют, что разработка технологии получения трансгенных животных, продуцирующих лекарственные биологически активные вещества с молоком, позволит решить проблему более быстрыми темпами и с наименьшими затратами. Эти животные-суперпродуценты могут стать высокоэффективными экологически чистыми биофабриками по производству биологически активных веществ, необходимых для медицины и сельского хозяйства по несравненно низкой себестоимости. Кроме того, получение этих веществ из молока позволит устранить опасность заражения их вирусами гепатита, СПИДа и др., которая существует при традиционной технологии получения этих веществ из тканей человека.

В связи с тем, что некоторые лекарственные вещества имеют высокую биологическую активность и малые терапевтические дозы, а потребности их на мировом рынке исчисляются в граммах. Многие исследователи приходят к выводу, что очень удобным объектом для получения с молоком высокоактивных лекарственных веществ белковой природы является кролик. Основными достоинствами кролика для технологии получения суперпродуцентов биологически активных веществ с молоком являются его высокая скоро-плодность и одноразовое кормление крольчихами своего потомства, в результате которого от крольчихи можно получать до 150-200 мл молока в сутки. Исходя из этих соображений, возникает необходимость в разработке эффективной технологии получения трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения.

Для получения трансгенных животных наиболее широко используется метод микроинъекции плазмидных генно-инженерных конструкций в пронук-леусы зигот. Однако, при использовании этого метода общая эффективность переноса генов остается на низком уровне. По современным представлениям низкая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных обусловлена низкой частотой интеграции рекомбинантных конструкций в геном животных и снижением жизнеспособности зигот, микроинъеци-рованных различными генно-инженерными конструкциями, в организме животных-реципиентов.

В значительной степени эффективность технологии получения трансгенных животных зависит от жизнеспособности и приживляемости зигот, подвергнутых различным процедурам, связанным с введением в их пронуклеусы генно-инженерных конструкций.

В настоящее время при получении трансгенных кроликов исследователи используют отдельные этапы технологии трансплантации эмбрионов поздних стадий развития, разработанной ранее для изучения некоторых вопросов биологии развития. Однако применительно к технологии получения трансгенных животных к этим этапам предъявляются значительно более жесткие требования в связи с тем, что в этой технологии используются эмбрионы на стадии зиготы, которая имеет продолжительность всего 6-8 часов. В связи с этим для разработки эффективной технологии получения трансгенных кроликов микроинъекционным методом, необходимы исследования по изучению влияния различных факторов на жизнеспособность и приживляемость зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.

Одним из факторов, значительно снижающих эффективность технологии получения трансгенных животных, является низкий уровень интеграции чужеродных генов в геном хозяина. Это обстоятельство вынуждает использовать для получения одного трансгенного животного большое количество эмбрионов на стадии зиготы и большое число реципиентов, что значительно удорожает технологию.

Поиск путей, способствующих повышению интеграции рекомби-нантных ДНК в геном эмбрионов и рожденного потомства, является одной из главных проблем при разработке технологии трансгеноза.

Поэтому возникает необходимость в изучении влияния генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность инъецированных эмбрионов, а также в изучении характера интеграции трансгена в геном первичных трансгенных животных.

Современные достижения цитогенетики дают основание полагать, что встраивание чужеродной ДНК происходит в местах естественных разрывов хромосомной ДНК хозяина. Вследствие этого возникло предположение, что при микроинъекции в пронуклеусы зигот вместе с генно-инженерными конструкциями рестриктаз, с помощью которых осуществлялось вырезание этих конструкций из плазмиды, может способствовать разрезанию хромосомной ДНК с образованием липких концов комплементарных липким концам вводимой генно-инженерной конструкции. В результате чего может возрасти вероятность встраивания генно-инженерной конструкции.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности эмбрионов и характера интеграции трансгена в геном кроликов при введении в зиготы различных генно-инженерных конструкций.

Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

- изучить влияние некоторых физиолого-эмбриологических факторов на жизнеспособность и приживляемость зигот, микроинъецирован-ных различными генно-инженерными конструкциями;

- изучить влияние генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность кроличьих эмбрионов, при введении этих конструкций в перивителлиновое пространство зигот;

- исследовать частоту и характер интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в перивителлиновое пространство зигот;

Научная новизна исследований

Получены трансгенные кролики с интегрированным геном грануло-цит-колониестимулирующего фактора человека под промотором гена сь^У-казеина крупного рогатого скота путем микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор {Rv-aSl-Cn-hG-CSF). Изучен характер интеграции этой конструкции в геном рожденного потомства кроликов и передача трансгена по наследству. Установлено, что при введении ретровирус-ной конструкции в перивителлиновое пространство зигот интеграция трансгена носит мозаичный характер.

Получены трансгенные кролики, несущие ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена а5/-казеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота {aSi-Cn-hLf и fiLg-hLf), путем микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных генно-инженерных конструкций. Изучена частота интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства кроликов генно-инженерных конструкций aSj-Cn-hLf и fiLg-hLf человека при введении их в пронуклеусы зигот.

Практическая значимость

Результаты исследований, о влиянии генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов, частоту и характер интеграции трансгена в геном рожденного потомства могут быть использованы в работах по получению трансгенных животных с целью повышения общей эффективности технологии трансгено-за. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестриктазы Xbal с генно-инженерной конструкцией, могут быть использованы для дальнейшей разработки способов, повышающих частоту интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию кроличьих зародышей после различных эмбриоин-женерных манипуляций могут быть использованы при разработке технологии трансгеноза и при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих.

Положения, выносимые на защиту

2. При микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций /3Lg-hLf и aSrCn-hLf частота интеграции трансгена в геном первичного рождённого потомства кроликов достоверно ниже, чем частота интеграции в эмбрионы, определённая на стадии бластоцисты.

3. Крольчихи в возрасте до 2-х лет лучше реагируют на гормональную обработку при вызывании суперовуляции и являются лучшими реципиентами для трансплантации зигот, микроинъекцированных генно-инженерными конструкциями.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тевкин, Сергей Иванович

5. ВЫВОДЫ

2. Приживляемость эмбрионов кролика, развившихся из зигот, инъецированных в перивителлиновое пространство генно-инженерной конструкцией, встроенной в ретровирусный вектор, колебалась от 20% до 48% в расчете на всех реципиентов и от 28% до 48% в расчете на сукрольных реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот. Частота интеграции в геном рожденного потомства гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека под промотором aSl-казеина крупного рогатого скота, встроенного в ретровирусный вектор, составила 19,5%.

6. Частота интеграции плазмидных генно-инженерных конструкций {aSi-Cn-hLf и fiLg-hLf), микроинъецированных в пронуклеусы зигот, определенная в геноме кроличьих бластоцист, развившихся in vitro, составила

30% и 10,4%, соответственно. Частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства составила для гена лактоферрина под промотором гена aSy-казеина крупного рогатого скота — 16,6% и под промотором /?-лактоглобулина - 5%, при использовании для ПЦР-анализа праймеров на часть структурного гена и участок регуляторной области.

7. Получены трансгенные кролики с интегрированными в их геном нуклеотидными последовательностями гена лактоферрина человека под промотором гена aSl-казеина и гена /?-лактоглобулина крупного рогатого скота, путем микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В работах по получению трансгенных кроликов в качестве реципиентов для трансплантации зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными конструкциями, наиболее целесообразно использовать крольчих пород калифорнийская, шиншилла и серебристый в возрасте до двух лет, а в качестве доноров эмбрионов крольчих тех же пород, в возрасте одного года.

3. Созданные во ВНИИФБиП генно-инженерные конструкции, включающие нуклеотидные последовательности гена лактоферрина человека, под контролем регуляторных элементов генов с^-казеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота {cxSj-Cn-hLf и fiLg-hLf) рекомендуем для использования в работах по получению трансгенных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тевкин, Сергей Иванович, Боровск

1. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме. — М.: Мир, 1983.-263 с.

2. Андреева, JI.E. Влияние различных манипуляций, используемых для трансгеноза на развитие мышей / JI.E. Андреева, И.А. Серова // Онтогенез. -1992. -Т. 23, №6. С. 637-643.

3. Вирусология: в 3 т. / отв. ред.: Б. Филдс, Д. Найп. М.: Мир, 1989. -1 т.

4. Гены и геномы: в 2 т. / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир, 1998. - 1 т.

5. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. М.: Мир, 1988. -538 с.

6. Гловер, Д. Новое в клонировании ДНК. Методы / Д. Гловер. — М.: Мир, 1989.-368 с.

7. Езерский, В.А. Получение плазмиды, содержащей структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена asl-казеина быка / В.А. Езерский, Л.Б. Иванова, В.Г. Шевченко // Труды ВНИ-ИФБиП. Боровск, 2004. - Т. 43. - С. 52-67.

8. Зиновьева, Н.А. Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.13 / Зиновьева Наталья Анатольевна. Дубровицы, 1994.-25 с.

9. Зиновьева, Н.А. Трансгенные животные и возможности их использования / Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Г. Брем. ВИЖ, 2001. - 128 с.

10. Козикова, ЛВ. Структурно-функциональная организация хромосом и изменение генома у трансгенных сельскохозяйственных животных: автореф. дис.д-ра биол. наук: 03.00.15 / Козикова Лариса Васильевна. — Санкт-Петербург, 2005. 35 с.

11. Кузнецов, А.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов / А.В. Кузнецов, И.В. Кузнецова // Генноинже-нерные сельскохозяйственные животные. М., 1995. - №1. — С. 173-180.

12. Льюин, Б. Гены / Б. Льюин. М.: Мир, 1987. - 544 с.

13. Магда, И.И. Оперативная хирургия / И.И. Магда. М.: Агропромиз-дат, 1990.-333 с.

14. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис. М.: Мир, 1984.-479 с.

15. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под. ред. С. Хер-рингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 с.

16. Никитин, В.А. Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом / В.А. Никитин. — Пущино.: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986.- 123 с.

17. Общая вирусология / С. Лурия, Дж. Дарнел, Д. Балтимор, Э.- М. Кэм-пбелл; под ред. Ю.З. Гендона. М.: Мир, 1981. - 680 е.: ил.

18. Плохинский, Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский. Новосибирск.: СО АН СССР, 1961.-364 с.

19. Рябых, В.П. Эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями / В.П. Рябых, Е.Г. Сапунова, Т.П. Трубицина, Л.И. Маркина II Труды ВНИИФБиП. Боровск, 1999. - Т. 28. - С. 546-549.

20. Шишиморова, М.С. Частота интеграций генно-инженерных конструкций при различных способах введения их в эмбрионы: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / Шишиморова Мария Сергеевна. Боровск, 2003. - 27 с.

21. Шумаков, В.И. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы / В.И. Шумаков, В.Н. Блюмкин, Н.Н. Скалецкий и др. М.: Канон, 1995.-383 с.

22. Adams, С.Е. Studies on prenatal mortality in the rabbit, Oryctolagus cuniculus: the effect of transferring varying numbers of eggs / C.E. Adams // J. Endocrinology. 1962. - Vol. 24. - P. 471-490.

23. Adams, C.E. The influence of advanced maternal age on embryo survival in the rabbit / C.E. Adams // Proc. Vth. Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. Trento. — 1964.-Vol. 2.-P. 305-308.

24. Aguerre, A. Expression of human erythropoetin transgenic and of the endogenous WAP gene in the mammary gland of transgenic rabbit during gestating and lactation / A. Aguerre, N. Castro-Palomino // Transgenic Res. -1998. Vol. 7. — P. 311—317.

25. Aigner, B. Expression of the murinewild-type tyrosinasegene in ransgenic rabbits / B. Aigner, U. Besenfelder, I. Seregi // Transgenic Res. 1996. - Vol. 5. -P. 405-411.

26. Anderson, G.B. Isolation and of embryonic stem cells from livestock species / G.B. Anderson // Animal Biotech. 1992. - Vol. 3. - P. 165-175.

27. Auerbach, A.B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production / A.B. Auerbach, R. Norinsky, W. Ho, K. Losos, Q. Guo, S. Chatterjee, A.L. Joyner // Transgenic Res. 2003. - Vol. 12. - P. 59-69.

28. Bayna, E.M. Tissue-specific, high level expression of the rat whey acidic protein gene in transgenic mice / E.M. Bayna, J.M. Rosen // Nucl. Acids Res. — 1990.-Vol. 18.-P. 2977-2985.

29. Behringer, R.R. Synthesis of functional human hemoglobin in transgenic mice / R.R. Behringer, T.M. Ryan, M.P. Reilly, T. Asakura, R.D. Palmiter, R.L. Brinster, T.M. Townes // Science. 1989. - Vol. 245. - P. 971-973.

30. Berkel, P.H. Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows / P.H. Berkel, M.M. Welling, M. Geerts, V.V. Ha, B. Ravensbergen, M. Salaheddine // Nat. Biotechnol. 2002. - Vol. 20, № 5. - P. 484-487.

31. Besenfelder, U. Generation and application of transgenic rabbits / U. Besenfelder, B. Aigner, M. Miiller and G. Brem // In: A. Cid-Arregui and A. Garcia-Carranca, Microinjection and Transgenesis. 1998. - P. 561-586.

32. Biery, K.A. Gene transfer by pronuclear injection in the bovine / K.A. Biery, K.R. Bondioli and F.J. DeMayo // Theriogenology. 1988. - Vol. 29. - P. 224-231.

33. Biggers, J.D. Problems concerning the uterine causes of embryonic death, with special reference to the effects of ageing of the uterus / J.D. Biggers // J. Reprod. Fert. Suppl. 1969. - Vol. 8. - P. 27-32.

34. Bijvoet, A.G. Human acid alpha-glucosidase from rabbit milk has therapeutic effect in mice with glycogen storage disease type II / A.G. Bijvoet, H. Van Hirtum, M.A. Kroos // Hum. Mol. Genet. 1999. - Vol. 8. - P. 2145-2153.

35. Bishop, OJ. Mechanism of Chromosomal integration of microinjection DNA / O.J Bishop and P. Smith // Mol. Biol. Med. 1989. - Vol. 6. - P. 283-298.

36. Blin, N. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes / N. Blin and D.V. Stafford // Nucl. Acids Res. 1976. - Vol. 3. - P. 2303-2308.

37. Bozse, Z. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins / Z. Bozse, L. Hiripi, J.W. Carnwath and H. Nieman // Transgenic Res. 2003. - Vol. 12. - P. 541-553.

38. Brackett, B.G. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization / B.G. Brackett // PNAS. 1971. - Vol. 68, №2. -P. 353-357.

39. Brem, G. Production of transgenic mice, rabbits and pigs by microinjection into pronuclei / G. Brem, B. Brenig, H.M. Goodman // Zychthygience. 1985. -Vol. 20.-P. 251-252.

40. Brem, G. Transgenic animals. In: Puhler A, editor. Genetic engineering of animals / G. Brem // New York: VCH Publishers. 1993. - P. 84-170.

41. Brem, G. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulinlike growth factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits / G. Brem, P. Hard, U. Besenfelder // Gene. 1994a. - Vol. 149. - P. 351-355.

42. Brem, G. Large transgenic mammals / G. Brem and M. Muller // In Animals with Novel Gene. 19946. - P. 179-245.

43. Brem, G. Mammary gland-specific expression of chymosin constructs in transgenic rabbits / G. Brem, U. Besenfelder, N.A. Zinovieva, R. Pfaller //

44. Theriogenology. 1995. - Vol. 43. - P. 175-179.

45. Brem, G. YAC transgenesis in farm animals: rescue of albinism in rabbits / G. Brem, U. Besenfelder, B. Aigner // Mol. Reprod. Dev. 1996. - Vol. 44. - P. 56-62.

46. Brem, G. Transgenesis in rabbits. In F. Castro and J. Janne, Mammary gland transgenesis: therapeutic protein production / G. Brem, U. Besenfelder, F. Castro and M. Muller // Berlin: Springer-Verlag and Landes Bioscience. 1998. - P. 106142.

47. Brinster, R.L. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs / R.L. Brinster, H.Y. Chen, M.E. Trumbauer, M.K. Yagle and R.D. Palmiter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82. -P. 4438-4442.

48. Brousseau, M.E. Transgenic rabbits as models for atherosclerosis research / M.E. Brousseau and J.M. Hoeg // J. Lipid. Res. 1999. - Vol. 40. - P. 365-375.

49. Bucchini, D. В is lei cells of pancreas are the silc of expressionof the human insulin gene in transgenic mice / D. Bucchini, G. Madsen, P. Desbois // Exp. Cell Res. 1989. - Vol. 180. - P. 467-474.

50. Buhler, T.A. Rabbit beta-casein promoter directs secretion of human interleukin-2 into the milk of transgenic rabbits / T.A. Buhler, T. Bruyere, D.F. Went // Bio/Technology. 1990. - Vol. 8. - P. 140-143.

51. Burdon, T.G. Fate of microinjected genes in implantation mouse embryos / T.G. Burdon, R.J. Wall // Mol. Reprod. Dev. 1992. - Vol. 33. - P. 436-442.

52. Campbell, K.H. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line / K.H. Campbell, J. McWhir, W.A. Ritchie and I. Wilmut // Nature. 1996. - Vol. 380.-P. 64-66.

53. Chada, K. Specific expression of a foreign beta-globin gene in erytroid cells of transgenic mice / K. Chada, J. Magram, K. Raphael // Nature. 1985. -Vol. 314.-P. 377-381.

54. Chan, A.W. Transgenic cattle produced by reverse transcribed gene transfer in oocytes / A.W. Chan, EJ. Homan, L.U. Ballou, J.C. Burns and R.D. Bremel // Proc. Nat. Acad. Sci. 1998. - Vol. 24. - P. 14028-14033.

55. Chan, A.W. Timing of DNA integration, transgenic mosaicism and pronuclear microinjection / A.W. Chan, G. Kukolj, A.M. Skalka and R.D: Bremel // Mol. Reprod. Dev. 1999. - Vol. 52. - P. 406-413.

56. Chan, A.W. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into, mature oocytes / A.W. Chan, K.Y. Chong, C. Martinovich, C. Simerly, G: Schatten // Science. 2001. - Vol. 291. - P. 309-312.

57. Chen, C.M. Frequent detection and sequence aberration at the transgene junctions of transgenic mice carrying the papilloma virus and the SV40 Tag gene sequence / C.M. Chen, K.B. Choo and W.T. Chen // Transgenic Res. 1995. — Vol. 4. - P. 52-59.

58. Chesne, P. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells / P. Chesne, P.G. Adenot, C. Viglietta, M. Baratte, L. Boulanger and J.P. Renard // Nat. Biotechnol. 2002. - Vol. 20. - P. 366-369.

59. Chrenek, D.D. Detection of human protein С integration in transgenic rabbits by polymerase chain reaction / D.D. Chrenek, A.V. Makarevich, T.

60. Gajarska 11 Vet. Med. 1994. - Vol. 44. - P. 79-82.

61. Chrenek, P. Effects of superovulation, culture and microinjection on development of rabbit embryos in vitro / P. Chrenek, A. Makarevich, D. Vasicek, J. Laurineik, J. Bulla, T. Gajarska and J. Rafay // Theriogenology. 1998. - Vol. 50. - P. 659-666.

62. Constantini, J. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line / J. Constantini, F. Lacy // Nature. 1981. - Vol. 294. - P. 92-94.

63. Costa, C. Transgenic rabbits overexpressing growth hormone develop acromegaly and diabetes mellitus / C. Costa, G. Solanes, J. Visa and F. Bosch // FAS EBJ.- 1998.-Vol. 12.-P. 1455-1460.

64. Coulibaly, S. Human nerve growth factor beta (hNGF-beta): mammary gland specific expression and production in transgenic rabbits / S. Coulibaly, U. Besenfelder, M. Fleischmann // FEBS Lett. 1999. - Vol. 44. - P. 111-116.

65. Duby, R.T. Effect of milking frequency on collection of milk from nursing New Zealand white rabbits / R.T. Duby, M.B. Cunniff, J.M. Belak // Anim. Biotechnol. 1993. - Vol. 4. - P. 31-42.

66. Dunn, C.S. Human immunodeficiency virus type 1 infection of human CD4-transgenic rabbits / C.S. Dunn, M. Mehtali, L.M. Houdebine, J.P. Gut, A. Kirn, A.M. Aubertin // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1327-1336.

67. Duverger, N. Inhibition of atherosclerosis development in cholesterol-fed human apolipoprotein A-I-transgenic rabbits / N. Duverger, H. Kruth, F.

68. Emmanuel, J-M. Caillaud, C. Viglietta, G. Castro // Circulation. 1996. - Vol. 94. -P. 713-717.

69. Ebert, K.M. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminigen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression / K.M. Ebert, J.P. Selgrath, P. DiTullio // Bio/Technol. 1991. - Vol. 9.-P. 835-838.

70. Emi, N. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus / N. Emi, T. Friedmann and J-K.Yee // Virol. 1991. - Vol. 65. - P. 1202-1207.

71. Evans, M.J. Transgenic rodents. In: N. Maclean, editor. Animal with novel genes / M.J. Evans, D.T. Gilmour, W.H. Colledge // Cambridge, England: Cambridge University Press. 1994. - P. 138-178.

72. Fan, J. Overexpression of human apolipo-protein B-100 in transgenic rabbits results in increased levels of LDL and decreased levels of HDL / J. Fan, S.P. McCormick, R.M. Krauss // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. - Vol. 15. -P. 1889-1899.

73. Fan, J. Transgenic rabbit models for biomedical research: current status, basic methods and future perspectives / J. Fan, M. Challah and T. Watanabe // Pathol. Int. 1999. - Vol. 49. - P. 583-594.

74. Fan, J. Cholesterol-fed and transgenic rabbits for the study of atherosclerosis / J. Fan and T. Watanabe // J. Atheroscler. Thromb. 2000. - Vol. 7. - P. 26-32.

75. Fan, J. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models / J. Fan and T. Watanabe // Pharmacol. Therapeut. 2003. - Vol.99.-P. 261-282.

76. Fernandes, J.C. In vivo transfer of interleukin-1 receptor antagonist gene in osteoarthritic rabbit knee joints: prevention of osteoarthritis progression / J.C.

77. Fernandes, G. Tardif, J. Martel-Pelletier, V. Lascau-Coman, M. Dupuis, F. Moldovan, M. Sheppard, B.R. Krishnan, J.P. Pelletier // Am. J. Pathol. 1999. -Vol. 39.-P. 583-594.

78. Fujiwara, Y. High-level expressing YAC vector for transgenic animal bioreactors / Y. Fujiwara, M. Miwa, R. Takahashi, K. Kodaira, M. Hirabayashi, T. Suzuki and M. Ueda // Mol. Reprod. Dev. 1999. - Vol. 52. - P. 414-420.

79. Gandolfi, F. Characterization of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development / F. Gandolfi, T. Brevini, L. Richardson, C.R. Brown, R.M. Moor // J. Reprod. Fert. 1989. - Vol. 4. - P. 1017.

80. Gazaryan, K.G. Production of transgenic rabbit and mice containing the bovine growth hormone gene / K.G. Gazaryan, L.E. Andreeva, I.A. Serova // Mol. Genetics, Microbiology and Virology. 1988. - Vol. 10. - P., V. 28-34.

81. Giraldo, P. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals / P. Giraldo and L. Montoliu // Transgenic Res. 2001. - Vol. 10. - P. 83103.

82. Gordon, J. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA / J. Gordon, G. Scangos and F. Ruddle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77. - P. 7380-7384.

83. Gordon, J.W. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei / J.W. Gordon and J.W. Gordon // Science. -1981. -Vol. 214.-P. 1244-1246.

84. Graur, D. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies) / D. Graur, L. Duret and M. Gouy // Nature. 1996. - Vol. 379. - P. 333335.

85. Hagemann, L.J. Pronuclear injection of MOPS-buffered medium does not affect bovine embryo development / L.J. Hagemann // Theriogenology. 1995. -Vol. 43, № l.-P. 229-337.

86. Hammer, R.E. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection / R.E. Hammer, V.G. Purselt, C.E. Rexroad, R.J. Wall, D.J. Boltt, K.M. Ebert, R.D. Palmiter and R.L. Brinster // Nature. 1985. - Vol. 315. - P. 680-683.

87. Harper, M.J. The mechanisms involved in the movement of newly ovulated eggs through the ampulla of the rabbit Fallopian tube / M.J. Harper // Annual conference «Proceedings of the society for the study of fertility». 1961. - P. 522— 524.

88. Harvey, M.J. Production of transgenic lamb fetuses by subzunal injection of feline leukaemia virus / M.J. Harvey, S.J. Hettle, E.R. Cameron // Transgenic models in medicine and agriculture. 1990. - Vol. 116. - P. 11-19.

89. Haskell, R.E. Efficient production of transgenic cattle by retroviral injection of early embryos / R.E. Haskell, R.A. Bowen // Mol. Reprod. Dev. -1995. Vol. 40. - P. 386-340.

90. Henninghausen, L. The mammary gland as a bioreactor: Production of foreign protein in milk / Henninghausen L. // Protein expression and purification. — 1990.-Vol. l.-P. 3-8.

91. Hirabayashi, M. Viabilityof transgenic rat embryos after freezingand thawing / M. Hirabayashi, R. Takahashi, I. Sckiguchi and M. Ueda // Exp. Anim. — 1997a.-Vol. 46.-P. 111-115.

92. Hirabayashi, M. Factors affecting the producingefficiency of transgenic rats (in Japanese) / M. Hirabayashi, R. Takahashi, К. Ho // Reprod. Dev. 19976. -Vol. 43.-P. 15-19.

93. Hirabayashi, M. Production of transgenic rabbits using centrifuged pronuclear zygotes / M. Hirabayashi, M. Hirao, R. Takahashi, K. Kimura, K. Hirasawa, M. Ueda and S. Hochi // J. Vet. Med. Sci. 2000. - Vol. 62. - P. 10471052.

94. Hill, K. Production of transgenic cattle by pronuclear injection / K. Hill, J. Curry, F. DeMayo, K. Jones-Diller, J. Slapak, K. Bondioli // Theriogenology. -1992. Vol. 37. - P. 222-229.

95. Hofmann, A. Efficient transgenesis in farm animals by lentiviral vectors / A. Hofmann, B. Kessler, S. Ewerling, M. Weppert, B. Vogg, M. Stojkovic, M. Boelhauve, G. Brem, E. Wolf, A. Pfeifer // Embo. Rep. 2003. - Vol. 4, № 11. -P. 1054-1060.

96. Houdebine, L.M. The production of pharmaceutical proteins from the milk of transgenic animals / L.M. Houdebine // Reprod. Nutr. Dev. 1995. - Vol. 35. - P. 609-617.

97. Houdebine, L.M. Transgenic animal bioreactors / L.M. Houdebine // Transgenic Res. 2000. - Vol. 9. - P. 305-320.

98. Huang, Y. Apolipoprotein E2 transgenic rabbits / Y. Huang, S. Schwendner, S. Rail // J Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 22685-22694.

99. Huguet, E. Foreign DNA introduced into the vas deferens is gained by mammalian spermatozoa / E. Huguet, P. Esponda // Mol. Reprod. Dev. 1998. -Vol. 51.-P. 42-52.

100. Ignatowski, A.C. Influence of animal food on the organism of rabbits / A.C. Ignatowski // Izv. Imp. Voennomed. Akad. S. Petersbg. 1908. - Vol. 16. - P. 154-173.

101. Ikawa, M. A rapid and non-invasive selection of transgenic embryos before implantation using green fluorescent protein (GFP) / M. Ikawa, K. Kominami, Y. Yoshimura, K. Tanaka, Y. Nishimune and M. Okabe // FEBS Lett. 1995. - Vol. 375.-P. 125-128.

102. Iwakura, Y. Male sterility of transgenic mice carrying exogenous mouse interferon-/3 gene under the control of metallothionein enhancer-promoter / Y. Iwakura, M. Asano, Y. Nishimune and Y. Kawade // EMBOJ. 1988. - Vol. 7. -P. 3757-3762.

103. Jaenisch, R. Infection of mouse blastosysts with SV40 DNA: Normal development of injected embryos and persistence SV40-specific DNA sequences in the adult animals / R. Jaenisch // Cold Spring Harbor Symp. 1974. - Vol. 39. -P. 375-380.

104. Jaenisch, R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Molony leukemia vims / R. Jaenisch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. Vol. 73. - P. 1260-1267.

105. Kajiwara, N. Productionof transgenic rats using pregnant and pseudopregnant rats prepared at a breeding / N. Kajiwara, F. Sugiyama, Y. Goto // Exp. Anim. 1993. - Vol. 42. - P. 463^166.

106. Kane, M.T. Variability in different lots of commercial bovine serum albumin affects cell multiplication and hatching of rabbit blastocysts in culture / M.T. Kane // J. Reprod. Fertil. 1983. - Vol. 69. - P. 555-558.

107. Kato, Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult / Y. Kato, T. Tani, Y. Sotomaru, // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 2095-2098.

108. Kato, M. Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as a marker gene / M. Kato, K. Yamanouchi, M. Ikawa, M. Okabe // Mol. Reprod. Dev. 1999. - Vol. 54. - P. 43—48.

109. Kim, SJ. High-level expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice using genomic lactoferrin sequence / S.J. Kim, K.W. Lee, D.-Y. Yu // J. Biochem. 1999. - Vol. 126. - P. 320-325.

110. Kim, T. First gene transfer in bovine blastocysts using replication-defective retroviral vectors packaged with gibbon ape leukemia virus envelopes / T. Kim, L. Mary, Leibfried-Rutledge, L. Neal // Mol. Reprod. Dev. 1993. - Vol. 35. - P. 105-113.

111. Kim, J-H. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig / J-H. Kim, H-S. Jung-Ha, H-T. Lee, K-S. Chung // Mol. Reprod. Dev. 1997. - Vol. 46. - P. 515-526.

112. Lai, L. Transgenic pig expressing the enhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicine-treated fibroblasts as donor cells / L. Lai, K-W. Park, H-T. Cheong // Mol. Reprod. Dev. 2002. - Vol. 62. - P. 300306.

113. Lavitrano, M. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice / M. Lavitrano, A. Camaioni, V.M. Fazio, S. Doici, M.G. Farace, C. Spadafora // Cell. 1989. - Vol. 57. - P. 717-723.

114. Leno, M. HIV-l mediates rapid apoptosis of lymphocytes from human CD4 transgenic but not normal rabbits / M. Leno, B.F. Hague, R. Teller and T.J. Kindt //

115. Virology. 1995. - Vol. 213. - P. 450-454.

116. Lieshke, G.J. Mice lacking granulocyte colony-stimulating factor have chronic neutropenia, granulocyte and macrophage progenitor deficiency, and impaired neutrophil mobilization / G.J. Lieshke // Blood. 1994. - Vol. 84. - P. 1737-1746.

117. Limonta, J.M. Transgenic rabbits as bioreactors for the production of human growth hormone / J.M. Limonta, F.O. Castro, R. Martinez, P. Puentes, B. Ramos, A. Aguilar, R.L. Lleonart, J. De La Fuente // J. Biotechnol. 1995. - Vol. 40. - P. 4958.

118. Lonnerdal, B. Lactoferrin: molecular structure and biological function / B. Lonnerdal and S. Iyer // Annu. Rev. Nutr. 1995. - Vol. 15. - P. 93-110.

119. Lubon, H. Transgenic animal bioreactors-where we are / H. Lubon and C. Palmer // Transgenic Res. 2000. - Vol. 9. - P. 301-304.

120. Maclean, N. Transgenic animals in perspective. In: N. Maclean, editor. Animals with novel genes / N. Maclean // Cambridge, England: Cambridge University Press. 1994. - P. 1-20.

121. Mann, J. Factors influencing frequency production of transgenic mice / J. Mann, A. McMahon // Methods Enzymol. 1993. - Vol. 225. - P. 771-781.

122. Maurer, R.R. Maternal ageing and embryonic mortality in the rabbit I. Repeated superovulation, embryo culture and transfer / R.R. Maurer and R.H. Foote // J. Reprod. Fert. 1971. - Vol. 25. - P. 329-341.

123. Maurer, R.R. Maternal ageing and embryonic mortality in the rabbit II. Hormonal changes in young and ageing females / R.R. Maurer and R.H. Foote // J. Reprod. Fert. 1972. - Vol. 31. - P. 15-22.

124. Mead, H. Bovine alpha si-casein gene sequences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk / H. Mead, L. Gates, E. Lacy // Bio. Technol. 1990. - Vol. 8. - P: 443-446.

125. Mintz, B. Normal genetically mosaic mice produced from' malignant teratocarcinoma cells / B. Mintz, K. Umenesee // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1975. Vol. 72. - P. 3585-3589.

126. Murakami, H. Factors influencing efficient production of transgenic rabbits / H. Murakami, T. Fujimura, K. Nomura, H. Imai // Theriogenology. 2002. - Vol. 57.-P. 2237-2245.

127. Murrey, J.D. Production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothinein-ovine growth hormone fusion gene / J.D. Murrey, C.D. Nancarrow, J.T. Marshall // Reprod. Fertil. Dev. 1989. - Vol. l.-P. 147-155.

128. Murphy, L.J. Expression of human insulin-like growth factor-binding protcin-3 in transgenic mice / L.J. Murphy, P. Molnar, X. Lu and H. Huang // Mol. Endocrinol. 1995. - Vol. 15. - P. 29330-29333.

129. Nagano, M. Lentiviral vector transduction of male germ line stem cells in mice / M. Nagano // FEBS Letters. 2000. - Vol. 524. - P. 111-115.

130. Ninomiya, T. Functions of milk protein gene 5' flanking regions on human growth hormone gene / T. Ninomiya, M. Hirabayashi, J. Sagara, A.Yuki // Mol. Reprod. Devel. 1994. - Vol. 37. - P. 276-283.

131. Onishi, A. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei / A. Onishi, M. Iwamoto, T. Akita, S. Mikawa, K. Takeda, T. Awata, H. Hanada, A.C. Perry // Science. 2000. - Vol. 289. - P. 1188-1190.

132. Osman, G. SWR: an inbred strain suitable for generating transgenic mice /

133. G. Osman, D. Jacobson, S. Li, L. Hood, H. Liggitt, W. Ladiges // Lab. Anim. Sci. 1997.-Vol. 47.-P. 167-171.

134. Overstreet, J.W. Sperm transport in the reproductive tract of the female rabbit: II. The sustained phase of transport / J.W. Overstreet and G.W. Cooper // Biology of reproduction. 1978. - Vol. 19. - P. 115-132.

135. Palmiter, R.D. Metallothinein-human GH fusion gene stimulate growth of mice / R.D. Palmiter, R.E. Norstedt // Science. 1983. - Vol. 222. - P. 809-814.

136. Palmiter, R.D. Transmission distortion and mosaicism in an unusual transgenic mouse pedigree / R.D. Palmiter, T.M. Wilkie, H.Y. Chen, R.L. Brinster // Cell. 1984. - Vol. 36. - P. 869-877.

137. Palmiter, R.D. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice / R.D. Palmiter, E.P. Sandgren, M.R. Avarbock, D.D. Allen and R.L. Brinster // PNAS USA. 1991. - Vol. 188, № 2. - P. 478-482.

138. Paris, D. A comparison between an inbred strain and hybrid lines to generate transgenic mice / D. Paris, P. Toyama, P. Sinet, P. Kamoun, J. London // Mouse Genome. 1995. - Vol. 93. - P. 21-30.

139. Patel, R. Simvastatin induces regression of cardiac hypertrophy and fibrosis and improves cardiac function in a transgenic rabbit model of human hypertrophic cardiomyopathy / R. Patel, S. Nagueh, N. Tsybouleva, M. Abdellatif, S. Lutucuta,

140. H.A. Kopelen // Circulation. 2001. - Vol. 104. - P. 317-324.

141. Pascoe, W.S. Genes function trapping and targeting in embryonic sperm cell / W.S. Pascoe, K.M. Kember, S.A. Wood // Biochim. Biophys. Act. 1992. - Vol. 114.-P. 209-271.

142. Peng, X. Papillomas and carcinomas in transgenic rabbits carrying EJ-ras DNA and cottontail rabbit papillomavirus DNA / X. Peng, R. Olson, C. Christian, C.M. Lang and J. W. Kreider//J. Virol. 1993. - Vol. 67.-P. 1698-1701.

143. Peng, X. Methylation of cottontail rabbit papillomavirus DNA and tissue-specific expression in transgenic rabbits / X. Peng, C.M. Lang and J.W. Kreider // Virus Res. 1995. - Vol. 35. - P. 101-108.

144. Peng, X. Development of keratoacanthomas and squamous cell carcinomas in transgenic rabbits with targeted expression of EJras oncogene in epidermis / X. Peng, J.W. Griffith, R. Han // Am. J. Pathol. 1999. - Vol. 115. - P. 315-324.

145. Peng, X. Reinitiated expression of EJras transgene in targeted epidermal cells of transgenic rabbits by cottontail rabbit papillomavirus infection / X. Peng, J.W. Griffith and C.M. Lang // Cancer. Lett. 2001. - Vol. 171. - P. 193-200.

146. Popova, E. Comparison between PMSG-and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats / E. Popova, A. Krivokharchenko, D. Ganten, M. Bader // Mol. Reprod. Dev. 20026. - Vol. 63. - P. 177-182.

147. Prieto, P.A. Transgenic animals and nutrition research / P.A. Prieto, J.J. Kopchick and B. Kelder // J .Nutr. Biochem. -1999. Vol. 10. - P. 682-695.

148. Pursel, V.G. Recent progress in the transgenic modification of swine and sheep / V.G. Pursel and C.E. Rexroad // Mol.Reprod. Dev. 1993a. - Vol. 36. - P. 251-254.

149. Pursel, V.G. Status of research with transgenic farm animals / V.G. Pursel and C.E. Rexroad // Anim. Sci. 19936. - Vol. 71. - P. 10-19.

150. Raymond, L.P. Transgenic mice by cytoplasmic injection of polylysine DNA mixtures / L.P. Raymond, S.P. Butler, J.L. Johnson, B.W. Pogue // Transgenic Res. 1995. - Vol. 4. - P. 353-360.

151. Reigo, E. Production of transgenic mice and rabbits that carry and express the human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine alpha

152. SI casein promoter / E. Reigo, J. Limonta, A. Aguilar // Theriogenology. 1993. -Vol. 39.-P. 1173-1185.

153. Rexroad, C.E. Progress on gene transfer in animals / C.E. Rexroad, V.G. Pursel, C. Pincert // Vet. Immunol. Immunopathol. 1987. - Vol. 17. - P. 303312.

154. Robertson, E. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector / E. Robertson, A. Bradley, M. Kuehn and M. Evans // Nature. 1986. - Vol. 323. - P. 445-448.

155. Rodriguez, A. Expression of active human erythropoietin in the mammary gland of lactating transgenic mice and rabbits / A. Rodriguez, F. Castro, A. Aguilar // Biol. Res. 1995. - Vol. 28. - P. 141-153.

156. Rogart, J.N. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis / J.N. Rogart, H.J. Barrach and C.O. Chichester // Osteoarthritis Cartilage. 1999. - Vol. 7. - P. 539-547.

157. Rottmann, O.J. Tissue-specific expression of hepatitis В surface antigen in mice following hiposome-medicated gene transfer into blastocysts / O.J. Rottmann, C. Stratowa, M. Hornstein and J. Hughes // Zbl. Vot. Med. 1985. - Vol. 32. - P. 676-682.

158. Sakuma, Y. Repeated superovulation test by fsh on the same rabbits with special reference to antihormone production / Y. Sakuma, Y. Ishijima and K. Ishida // Jap. J. Fert. Steril. 1964. - Vol. 13. - P. 1-17.

159. Sato, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transferr / M. Sato, R. Iwase, K. Kasai // Animal Biotechnology. 1994. - Vol. 5, № 1. - P. 19-31.

160. Schnieke, A.E. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts / A.E. Schnieke, A.J. Kind, W.A. Ritchie,

161. К. Мусоск, A.R. Scott, М. Ritchie, I. Wilmut, A. Colman, K.H. Campbell // Science. 1997. - Vol. 278. - P. 2130-2133.

162. Seo, B.B. Co-transfer of restriction enzyme with foreign DNA into the pronucleus for elevating production efficiencies of transgenic animals / B.B. Seo, C.H. Kim, K. Yamanouchi // Animal Reprod. Sci. 2000. - Vol. 63. - P. 113— 122.

163. Sethupathi, P. Lymphoid and non-lymphoid tumors in E kappa-myc transgenic rabbits / P. Sethupathi, H. Spieker-Polet, H. Polet // Leukemia. 1994. -Vol. 8.-P. 2144-2155.

164. Shen, J. Macrophage-mediated 15-lipoxy-genase expression protects against atherosclerosis development / J. Shen, E. Herderick, J. Cornhill // J. Clin. Invest. -1996. Vol. 98. - P. 2201-2208.

165. Snyder, B.W. Mammary gland specific expression of chymosin constructs in transgenic rabbits / B.W. Snyder, G. Brem, U. Besenfelder // Theriogenology. -19956.-Vol. 43.-P. 175-181.

166. Sperandio, S. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species / S. Sperandio, V. Lulli, M.L. Bacci, M. Forni, B. Maione, C. Spadafora, M. Lavitrano // Animal Biotechnology. 1999. - Vol. 7, № 1. - P. 59-77.

167. Spieker-Polet, H. Rabbit monoclonal antibodies: Generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas / H. Spieker-Polet, P. Sethupathi, P-C. Yam and K. Knight // Proc. Null. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 9348-9352.

168. Stewart, C.L. Expression of foreign gene retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimaeras / C.L. Stewart, M. Vanek, E.F. Wagner // EMBO J. — 1985. Vol. 4. - P. 3701-3719.

169. Stewart, C.L. Expression of retroviral vectors in transgenic mice obtained by embryo infection / C.L. Stewart, M. Vanek, S. Schuelze // EMBO J. 1987. -Vol. 6.-P. 383-388.

170. Takcto, M. An inbred mouse strain preferable for transgenic analyses / M. Takcto, A. Sehroeder, L. Mobraaten // Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88.-P. 2065-2069.

171. Takahashi, R. Production of transgenic rats using cryopreserved pronuelear-stage zygotes / R. Takahashi, M. Hirabayashi and M. Ueda // Transgenic Res. -1999. Vol. 8. - P. 397-400.

172. Talbert, G.B. Effect of maternal age on reproductive capacity / G.B. Talbert // Am. J. Obstet. Gynec. 1968. - P. 451-463.

173. Taylor, M. Transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis / M. Taylor and J. Fan // Front. Biosci. 1997. - Vol. 2. - P. 298-308.

174. Van den Putten, H. Efficient insertion of genes into mouse germ line via retroviral vector / H. Van den Putten, F.M. Botteri, A.D. Miller, M.G. Rosenfeld,

175. H. Fan, R.M. Evans, I.M. Verma I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82.-P. 6148-6152.

176. Van den Hout, H.H. Recombinant human alpha-glucosidase from rabbit milk in Pompe patients / H.H. Van den Hout, A.J. Reuser, A.G. Vulto, M.C. Loonen, A. Cromme-Dijkhuis, A.T. Van der Ploeg // Lancet. 2000. - Vol. 356. -P. 397-398.

177. Vicente, J.S. Effect of recipient does genotype on survival rate at birth of frozen rabbit embryos / J.S. Vicente and F. Garcia-Ximenez // Reprod. Nutr. Dev. 1993. - Vol. 33. - P. 229-234.

178. Viglietta, C. The generation of transgenic rabbits. In: L.M. Houdebine Transgenic Animals: Generation and Use / C. Viglietta, M. Massoud and L. Houdebine // Harwood, New York. 1997. - P. 1-3.

179. Vize, P.D. Introduction of porcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promotes growth / P.D. Vize, A.E. Michalska, R. Ashman, B. Lloyd, В .A. Stone, P. Quinn, J.R. Wells, R.F. Seamark // Cell Sei. 1988. - Vol. 90. - P. 295-300.

180. Wakayama, T. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei / T. Wakayama, A.C. Perry, M. Zuccotti, K.R. Johnson, R. Yanagimachi // Nature. 1998. - Vol. 394. - P. 369-374.

181. Wall, R.J. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection / R.J. Wall, V.G. Pursel, R.E. Hammer and R.L. Brinster // Biol. Reprod. 1985. - Vol. 32. - P. 645-651.

182. Wall, R.J. Transgenic farm animals a critical analysis / R.J. Wall, G.E. Siedel // Theriogenology. - 1992. - Vol. 38. - P. 337-357.

183. Wall, R.J. Synthesis and secretion of the mouse whey acidic protein in transgenic sheep / R.J. Wall // Transgenic Res. 1996. - Vol. 5, № 1. - P. 67-72.

184. Wall, R.J. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale / R.J. Wall, D.E. Korr, K.R. Bondioli // J. Dairy Sci. 1997. - Vol. 80. - P. 22132224.

185. Wall, R.J. DNA preparation method can influence outcome of transgenic animal experiments / R.J. Wall, R.K. Paleyanda, J.A. Foster, A. Powell, C. Rexroad, H. Lubon // Anim. Biotechnol. 2000. - Vol. 11. - P. 19-32.

186. Wang, X. Development of cloned embryos from fetal transgenic rabbit fibroblasts: a study on factors that may influence the rabbit cloning by nuclear transfer / X. Wang, M. Challah, T. Watanabe // Cytotechnology. 2003. - Vol. 40. - P. 237-257.

187. Ward, K.A. The genetic engineering of production traits in domestic animals / K.A. Ward, C.D. Nancarrow // Experimental. 1991. - Vol. 47. - P. 913-922.

188. Wilmut, I. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells /1. Wilmut, A.E. Schnieke, J. McWhir, A.J. Kind, K.H. Campbell // Nature. 1997. -Vol. 385.-P. 810-813.

189. Wilki, T.M. Germline and somatic mosaicism in transgenic mice / T.M. Wilki, R.L. Brinster and R.D. Palmiter // Developmental Biology. 1986. - Vol. 118. T P. 9-18.

190. Wright, G. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep / G. Wright, A. Carver, D. Cottom, D. Reeves, A. Scott,

191. P. Simons, I. Wilmut, I. Garner, A. Colman // Bio/Technol. 1991. - Vol. 9. - P. 830-834.

192. Yee, J.K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range / J.K. Yee, T.F. Friedmann and J.C. Burns // Methods Cell Biol. 1994. - Vol. 43. - P. 99-112.

193. Yom, H.C. Genetic engineering of milk composition: modification of milk components in lactating transgenic animals / H.C. Yom, R.D. Bremel // Am. J. Clin. Nutz. 1993. - Vol. 58. - P. 2995-3065.

194. Yorifuji, T. Co-transfer of restriction endonucleases and plasmid DNA into mammalian formation / T. Yorifuji, H. Mikawa // Mutation Res. 1990. - Vol. 243.-P. 121-126.

195. Ziomek, C.A. Commercialization of proteins produced in the mammary gland / C.A. Ziomek // Theriogenology. 1998. - Vol. 49. - P. 139-144.

Информация о работе

Тевкин, Сергей Иванович
кандидата биологических наук
Боровск, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы