Внеклеточные низкомолекулярные гликопротеины из сыворотки крови быка и печени крыс

Виноградов, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточные низкомолекулярные гликопротеины из сыворотки крови быка и печени крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные низкомолекулярные гликопротеины из сыворотки крови быка и печени крыс"

•МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

Виноградов Алексей Александрович

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ГЛИКОПРОТЕИНЫ ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БЫКА И ПЕЧЕНИ КРЫС

(биохимия - 03.00.04)

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН.

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор

Ямсков И. А.

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Доктор химических наук

Синицын А.П. Варламов В.П.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «Зо» 2000 в 16 часов на

заседании Диссертационного совета Д 053.05.76 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан «19» 2000.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск и исследование биорегуляторов, осуществляющих контроль за такими важнейшими процессами как клеточная адгезия, пролиферация, дифференцировка и морфогенез, продолжают оставаться актуальными задачами современной биохимии. Из внеклеточного пространства печени и из сыворотки крови млекопитающих были выделены адгезивные белковые фракции, в сверхмалых дозах вызывающие самые разнообразные биологические эффекты. Среди последних можно назвать: влияние на вязко-упругие свойства плазматической мембраны гепатоцитов и ее проницаемость; на адгезивные свойства фибробластов и их выживание при культивировании in vitro; на пролиферативный статус клеток; на ход внутриклеточных синтетических процессов. Изучение характера этих эффектов способствовало изучению влияния выделенных веществ на процессы восстановления и регенерации. Эти и другие данные явились основой для формирования концепции, согласно которой выделенные фракции содержат белки, являющиеся биорегуляторами органно-тканевого гомеостаза.

Несмотря на достаточно активное исследование биологических свойств выделенных адгезивных белковых фракций, до сих пор оставались мало изученными их молекулярные свойства, состав и структура. Также, до сих пор не были идентифицированы молекулярные факторы, влияющих на биологическую активность этих веществ. Такие исследования представлялись актуальными, так как их проведение : способствует пониманию молекулярных механизмов биологических процессов, на ход которых оказывают влияние исследуемые в данной работе белки.

Цель работы. Целью данной работы являлось: во-первых, провести очистку до гомогенного состояния биологически активных компонентов трех адгезивных белковых фракций из сыворотки крови быка и внеклеточного пространства печени крыс; во-вторых, после получения гомогенных препаратов, охарактеризовать их молекулярный состав, структуру, физико-химические и биохимические свойства. В-третьих, определить и изучить факторы, влияющие на проявление биологической активности исследуемых белков.

Научная новизна. Научная новизна данной работы определяется, в первую очередь, новизной объектов исследования. Фракции адгезивных внеклеточных белков сыворотки крови и печени крыс

были обнаружены благодаря использованию оригинальных методов выделения и тестирования биологической активности. Из этих фракций были выделены в индивидуальном состоянии и проанализированы, соответственно, три бежа - внелеточные низкомолекулярные гликопротеины: кислый гликопротеин из экстракта печени крыс (АГП), нейтральный гликопротеин из экстракта печени 1фыс (НГП), гликопротеин из сыворотки крови (СГП). Разработаны подходы, впервые позволившие охарактеризовать их молекулярный состав. Обнаружен и охарактеризован сывороточный белок, инактивирующий СГП в условиях in vivo (нСГП). Полученные данные позволяют идентифицировать нСГП как бычий сывороточный преальбумин, а внелеточные низкомолекулярные гликопротеины являются ранее не описанными в литературе белками. Данная работа является первой в изучении структуры данных веществ.

По способности не осаждаться при 100% насыщении раствора сульфатом аммония, СГП, НГП и АГП сходны с группой белков, имеющих наименование S-100. В ходе настоящей работы предстояло разрешить вопрос: являются ли они структурно родственными.

Практическая значимость. Изучаемые нами белки способны оказывать влияние на важнейшие биологические процессы (биосинтез, деление, миграцию, выживаемость клеток). Анализ этих данных дал толчок исследованию биомедицинского потенциала низкомолекулярных внеклеточных гликопротеинов. Оказалось, что данные вещества могут быть использованы в качестве основы для создания новых фармакологических препаратов. На основе СГП была создана серия фармакологических препаратов «Адгелон» и показана их эффективность в офтальмологии, травмотологии, гастроэнтерологии, при лечении ряда тяжелых патологий суставов (артрозы), для восстановления поврежденных кожных покровов (при лечении ожоговой болезни, пролежней), и в других областях медицины. Фармакологические препараты серии «Гепалон» на основе гликопротеинов из печени (НГП и АГП) показаны в качестве протекторов, предотвращающих развитие циррозов разной этиологии, а также как лекарственное средство в реабилитационный период после ряда тяжелых заболеваний печени. Особым свойством изучаемых нами гликопротеинов является их способность оказывать фармакологическое действие в сверхмалых дозах.

В этой связи, изучение структуры, молекулярных свойств данных белков и выявление факторов, влияющих на проявление их биологической активности, имеет огромное значение для понимания

молекулярных механизмов наблюдаемых феноменов. Это, в свою очередь, необходимо для более эфективного применения имеющихся и для разработки новых фармпрепаратов на основе внеклеточных низкомолекулярных гликопротеинов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции «Биокагализ-98» (Пущино-на-Оке, 1998), симпозиуме «Теория и практика хроматографии и электрофореза» (Москва, 1998), третьей ежегодной конференции The Society for Glycobiology (Балтимор, США, 1998), международной конференции «Эндогенные соединения в морфогенезе и восстановительных процессах - интегрирующие и регуляторные системы: теория и практика» (Москва, 1999).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 19 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Предметом исследования в настоящей работе являлись четыре белковые фракции: кислая фракция из экстракта печени крыс, нейтральная фракция из экстракта печени крыс, слабокислая фракция из сыворотки крови, и фракция, содержащая инактиватор слабокислой фракции из сыворотки крови. Все фракции, кроме содержащей инактиватор, выделяли по ранее разработанной методике, включающей высаливание 100% насыщенным раствором сульфата аммония и препаративное изоэлектрофокусирование полученных таким образом супернатантов. Фракцию, инактивирующую биологическую активность слабокислой фракции сыворотки крови, тоже выделяли по методике, разработанной ранее и включающей высаливание 80% насыщенным раствором сульфата аммония, ультрацентрифугирование до появления флоттирующей фракции и аффинную хроматографию на иммобиллизованном Конканавалине А.

В данной работе из кислой фракции экстракта печени крыс был выделен гликопротеин, названный АГП; из нейтральной

фракции экстракта печени крыс - гликопротеин, названный НГП; из слабокислой фракции сыворотки крови - гликопротеин, названный СГП; очищенный инактиватор (или носитель) СГП был назван нСГП.

Очистка и исследование методами ВЭЖХ и ДДС-!УА-электрофореза

После предварительных стадий выделения, дальнейшая очистка фракций с целью получения индивидуальных белков, производилась методом обращенно-фазовой и анионообменной ВЭЖХ. При обращенно-фазовой хроматографии разделение происходит по принципу гидрофобных взаимодействий, то есть, как правило, зависит от структуры и экспонированности гидрофобных доменов белка. Напротив, при анионообменной хроматографии наибольшее значение имеют ионные взаимодействия. Анионообменная хроматография часто используется для разделения смесей Сахаров.

Как было установлено с помощью анионообменной ВЭЖХ, фракция АГП содержит один мажорный и несколько минорных компонентов (Рис. 1а). Площадь хроматографического пика, соответствующего мажорному компоненту, равна 76% от суммы площадей всех пиков. Причем, было показано, что все компоненты, как главный, так и минорные, проявляют биологическую активность. При рехроматографировании мажорного пика в тех же условиях, можно вновь наблюдать присутствие минорных компонентов приблизительно в том же соотношении. В то же время, исследование фракции АГП методом обращенно-фазовой ВЭЖХ выявило только один (не менее 95%) главный пик (Рис. 2а). Полученные данные указывают на то, что АГП в условиях анионнообменной хроматографии имеет склонность к образованию межмолекулярных ассоциатов, имеющих различное сродство к использованному хромагографическому сорбенту. При обращенно-фазЬвой ВЭЖХ, где в качестве элюента используется смесь 0.1% ТФУ в воде/ ацетошприл, такое явление не наблюдается.

При исследовании фракции СГП было установлено, что судя по оптическому поглощению при длине волны 280 нм, она содержит около 15% примесей, не обладающих биологической активностью. Именно такое соотношение получается при анализе методом анионообменной ВЭЖХ (Рис. 16). Примесные компоненты имеют крайне низкое сродство к анионообменному сорбенту - они элюируются практически в свободном объеме колонки, до начала градиента №С1. При обращенно-фазовой ВЭЖХ также наблюдается

t, мин

Рисунок 1. ^

Исследование методом ионообменной ВЭЖХ: А) АГП. Колонка ТеБвек верагоп N1^2, элюент - нитратный буфер 20 мМ рН 3,5. Содержание основного пика -76%; Б) СГП. Колонка Диасорб 1000 ЭЕАЕ, элюент -20 мМ Трис рН 8, градиент №С1 от 0 до 1М. Содержание основного пика - 85%; В) НГП. Колонка Теякек Яерагоп ЫНг, элюент - нитратный буфер 20 мМ рН 4,5.

некоторое количество (не менее 10%) примесных компонентов (Рис. 26). Они элюируются главным образом уже после главного компонента. Для дальнейших исследований был отобран мажорный пик СГП, свободный от примесей.

Исследование фракции НГП методом анионообменной ВЭЖХ (Рис. 1в) выявило несколько соизмеримых по величине пиков, проявляющих биологическую активность. В то же время,при обращенно-фазовой ВЭЖХ был обнаружен единственный мажорный компонент - он оценивается в 77% от общего объема (Рис. 2в). Минорные компоненты тоже являются биологически активными. Мы считаем, что данный феномен объясняется микрогетерогенностью углеводной части НГП, который, как будет показано в следующей главе, является гликопротеином. То есть, вероятно, в данных хроматографичеких условиях происходит разделение глико-изоформ НГП. При обращенно-фазовой хроматографии разделение зависит главным образом от структуры и экспонированности гидрофобных доменов белка, а при анионообменной - в значительной степени от структуры углеводных цепей.

По результатам исследования методом гель-проникающей хроматографии препараты НГП, АГП, СГП и нСГП содержали один мажорный компонент. Молекулярная масса СГП была оценена как 25-27 кДа, АГП - около 17 кДа, НГП - около 22 кДа, нСГП - 65-70 кДа (Рис. 3). В случае НГП наблюдался также минорный пик (1520%) в области больших молекулярных масс, но при рехроматографии мажорного компонента он проявлялся вновь. Очевидно, этот компонент обусловлен присутствием межмолекулярных ассоциатов.

Применение ДДС-Ш - электрофореза для исследования гликопротеинов, особенно при высокой степени гликозилирования, бывает сопряжено с трудностями. В частности, по литературным данным, кажущаяся и истинная молекулярные массы гликопротеинов могут весьма сильно (до 50%) различаться; встречаются сложности с прокрашиванием полос гликопротеинов; полосы часто получаются размытыми и нечеткими. С аналогичными проблемами столкнулись и мы при попытке исследовать АГП, СГП и НГП методом ДДС-Ыа-элекгрофореза. Тем не менее,.нам удалось подобрать условия, в которых исследуемые белки можно достоверно детектировать. НГП проявляется в виде двух полос: кажущаяся молекулярная масса мажорной - около 15 кДа; и минорной - около 33-35 кДа. Молекулярную массу СГП можно оценить как ~ 35-37 кДа (Рис. 4). Результаты, полученные с помощью ДДС-Ыа -электрофореза и гель-проникающей хроматографии, как можно

MeCN, %

Рисунок 2.

Исследование

методом обра-щенно - фазовой ВЭЖХ: А) АГП.

Колонка

t, мин

Lichrospher 300 RP8. Содержание основного пика -

не менее 95% ; Б) СГП. Lichrospher 300 RP8. Содержание основного пика - около uf > 90%; В) НГП. Separan С18. Содержание основного пика - 77%; Г) нСГП. Колонка Altex RPSC. Объем мажорного пика -95%. Во всех случаях элюент — 0.1% ТФУ в воде, градиент ацетонитрила.

Молекулярная масса, Да Рисунок 3. Гель-хроматография препаратов НГП, АГП, СГП и нСГП на колонке ТЭК 3000. Молекулярная масса СГП оценена как 25-27 кДа, АГП - около 17 кДа, НГП - около 22 кДа, нСГП - 65-70 кДа.

•20

I- 14,4

Маркеры НГП СГП

(-94

"67 94

•43 67

30 20

Рисунок 4. ДДС-Ма электрофорез Рисунок 5. ДДС-Иа

НГП и СГП. элекрофорез нСГП.

видеть, отличаются весьма существенно. Это обусловлено вышеперечисленными причинами. Для нСГП, который, как будет показано в следующей главе, не является гликопротеином, молекулярная масса была оценена как ~ 70 кДа (Рис 5), что совпадает с результатом, полученным методом гель-фильтрации.

Установление наличия гликозилирования. определение углеводного состава.

Ранее было получено несколько экспериментальных указаний на то, что внеклеточные низкомолекулярные белки, исследованные в настоящей работе, являются гликопротеинами. Во-первых, при ДДС-МА-электрофорезе СГП обнаруживается полоса, окрашиваемая Шифф-реагентом. Во-вторых, СГП обладает способностью взаимодействовать с Конканава-лином А, что было использовано ранее как одна из стадий. его очистки методом аффинной хроматографии.

В настоящей работе для подтверждения ранее полученных данных мы использовали метод, включающий мягкое перйодатное окисление гликоконъюгата и введение на образовавшиеся диальдегидные группы флуоресцентной «метки», в качестве которой был взят динитрофенилгидразин (ДНФГ). Это один из подходов, с помощью которых можно определить, действительно ли данный белок является гликопротеином, или, как это бывает при выделении из биологического материала, нековалентно связан, например, со свободными олигосахаридами. После обработки периодатом натрия специфичность нековалентного углевод-белкового взаимодействия, если таковое имело место, теряется. Таким образом, если предполагаемый гликоконъюгат приобретает характерное для производных ДНФГ оптическое поглощение на длине волны 365 нм

Рисунок 6. Установление наличия гликозилирования СГП. А) СГП, модифицированный ДНФГ, в сравнении с СГП до модификации. Б) ДНФГ (контроль). Нековалентное комплексообразование между нативным СГП и ДНФГ в данных хроматографических условиях не наблюдается._

и при этом его время удерживания изменяется незначительно, можно полагать, что он действительно является гликопротеином.

В данной работе метод был вначале апробирован и отработан на модельных белках, в качестве которых были использованы: бычий сывороточный альбумин (контроль), альбумин куриного яйца, овомукоид, Б - карбоксиметилированный муцин, родопсин-связывающий гликопротеин из яичного желтка. Детекция продуктов проводилась с помощью гель-проникающей ВЭЖХ. Во всех случаях были получены правильные результаты. После этого метод применили к АГП, СГП, НГП и нСГП. На рисунке 6 показано, что после модификации СГП приобретает оптическое поглощение на длине волны 365 нм, при этом его время удерживания изменяется незначительно. Аналогичный результат был получен для АГП и НГП. Таким образом, можно полагать, что эти три белка являются гликопротеинами. Напротив, для нСГП можно заключить, что он гликопротеином не является.

Для очищенного препарата СГП был проведен анализ углеводного состава, который показал, что данный белок сильно гликозилирован, - он содержит около 50 вес.% углеводов. Из углеводов были детектированы Ы-ацетилгдюкозамин и манноза в соотношении 2:5. При таком соотношении, принимая во внимание пути биосинтеза гликопротеинов, можно полагать, что СГП содержит маннозобогатые Ы-связанные олигосахаридные цепи.

Структурно-функциональная идентификация по данным аминокислотного состава.

Аминокислотный состав - одно из фундаментальных свойств при исследованиях белков. В настоящее время, благодаря развитию биоинформатики, для структурно-функционального анализа белков стало возможным использовать как данные по первичной структуре, так и по аминокислотному составу. Это бывает полезно, например, если исследуемый белок не подвержен прямому секвенированию. Как известно, около 50% природных белков имеют заблокированную М-концевую аминокислоту.

Попытки определить аминокислотную последовательность в интактных СГП, АГП и НГП не увенчались успехом. Провести специфический гидролиз, например, с помощью трипсина, и изучить структуру полученных пептидов тоже невозможно. Из-за высокой степени гликозилирования белки не гидролизуются протеазами. После очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ был исследован аминокислотный состав СГП, АГП и НГП. Результаты, представленные в Таблице 1, были получены в результате усреднения данных нескольких анализов, проведенных на разных

приборах. Обращает на себя внимание большое содержание глицина и серина в составе СГП и особенно АГП.

Таблица 1. Аминокислотный состав исследованных белков.

Аминокислота СГП (%) АГП (%) НГП (%) нСГП (%)

А1а 6.62 8.13 8.14 8.97

А$х(0+1Ч) 7.72 6.14 9.41 9.83

О1х(Е+0) 13.23 13.75 11.37 15.38

РЬе 2.43 0.79 4.16 4.70

в1у 19.85 21.00 11.15 3.85

На 1.98 1.64 2.51 2.99

Не 3.31 2.16 5.63 2.56

Ьуэ 3.20 7.20 7.13 10.26

Ьеи 5.51 3.25 8.84 10.68

Ме1 1.54 0.00 2.01 0.85

Рго 3.31 3.86 3.61 5.13

А^ 1.65 1.23 3.78 4.27

вег 16.54 21.76-1 6.36 5.56

ТЬг 4.41 4.39 5.26 5.98

Уа1 6.50 3.77 7.33 5.98

Туг 2.21 0.94 3.31 2.99

Таблица 2. Вероятность родства между данным (известным) и исследуемым белком как функция фактора ОШТ, вычисляемого с помощью алгоритма РЮРБЕАКСН.

Фактор ОКТ Вероятность родства, %

0.0- 1.0 > 99

1.0- 1.2 >=94

1.2- 1.4 >=88

1.4 1.6 >=82

1.6- 1.8 >=75

1.8- 2.0 >=68

>2.0 < 68

Таблица 3 а Результаты поиска гомологов СГП с помощью алгоритма PROPSEARCH.

ОШТ - Условная величина, отражающая степень гомологии между данным и исследуемым белком согласно алгоритму РЛОРБЕАКСН (См. Табл 2); ЬЕИ - Количество аминокислотных остатков в полипептидной цепи._

DIST LEN PI Описание

1 3.82 111 5.00 Иммуноглобулин лямда цепь V-II, регион Mgc.

2 3.84 111 4.92 Иммуноглобулин лямда цепь V-I, регион Vor.

3 3.85 75 4.72 Мегаллотионен-подобный белок 1 (Mt-1).

4 3.92 126 5.68 Иммуноглобулин тяжелая цепь V-Ш регион Kol.

5 4.05 74 4.63 Мегаллотионен-подобный белок 1.

6 4.08 118 4.02 Крипарин (предшественник).

7 4.09 110 5.78 Иммуноглобулин лямда цепь V-II регион Nig-58.

8 4.10 78 4.64 Металлотионен-подобный белок тип 2.

9 .4.11 128 5.65 Гипотетический 13.1 kD белок интергенной области

Mopa-Efp

10 4.11 179 4.24 Предшественник корового белка секреторного.

протеогликана

11 4.12 151 4.94 Предшественник главной субъеданицы Курлина.

12 4.14 111 5.09 Иммуноглобулин каппа цепь V-Ш, регион Рс 2413.

13 4.14 87 4.20 Цитохром Сб (Цитохром С553).

14 4.18 111 4.52 Иммуноглобулин лямда цепь V-I регион Nig-64.

15 4.24 75 4.33 Металлотионен-подобный белок 1.

Таблица 3 б. Результаты поиска гомологов АГП с помощью алгоритма PROPSEARCH.

БШТ - Условная величина, отражающая степень гомологии между данным и исследуемым белком согласно алгоритму PROPSEARCH (См. Табл 2); ЬЕЫ - Количество аминокислотных остатков в полипептидной цепи._

DIST LEN PI Описание

1 4.24 206 10.4 Белок, относящийся к твистиигу (M-TWIST).

2 4.25 74 6.78 Металлотионен-подобный белок 1.

3 4.35 182 8.77 Кератин, тип II, цитоскелегный, 59 kD, компонент IV

(Кератин Кб гамма)

4 4.40 78 4.64 Металлотионен-подобный белок, тип 2.

5 4.44 71 6.40 Металлотионен-подобный белок 1.

6 4.46 182 8.38 Кератин, тип II, цитаскелетный, 68 kD, компонент IA.

7 4.50 202 10.2 Белок, относящийся к твистингу (H-TWIST).

8 4.70 442 5.28 Цистеин протеиназа 4, предшественник (ЕС 3.4.22.-).

9 4.70 118 4.02 Крипарин, предшественник.

10 4.72 97 8.04 Белок 7Е.

11 4.79 75 4.33 Металлотионен-подобный белок 1.

12 4.84 169 7.70 Сверх-сульфатированный кератин матрикса (Uhs

Keratin).

13 4.85 110 5.78 Иммуноглобулин, лямда цепь V-П, регион NIG-58.

14 4.91 174 4.74 Поверхностный антиген В, предшественник (Vlpb

пролипопротеин).

15 4.93 128 5.65 Гипотетический 13.1 kD белок интергенной области

Mopa-Efp

Используя алгоритм PROPSEARCH, по аминокислотному составу СГП, АГП и НГП был проведен поиск структурно-функциональных гомологов среди известных белков (база данных SwissProt). При этом использовались «взвешенные» процентные содержания 16-ти аминокислот: D+N, E+Q, S, G, H, R, Т, А, Р, Y, V, M, I, L, F, К. Аспарагин и глутамин в процессе гидролиза превращаются в соответствующие кислоты, а триптофан и цистеин не рассматривались из-за низкой достоверности определения. «Взвешенное» содержание аминокислот отражает систематическую ошибку определения той или иной аминокислоты по результатам наблюдений в нескольких десятках лабораторий разных стран. DIST - условная величина, отражающая вероятность родства между данным (известным) и исследуемым белком согласно алгоритму PROPSEARCH (См. Табл2).

Можно заметить, что среди первых пятнадцати наиболее родственных СГП и АГП наблюдается большое количество совпадений (Таблица 3 а, б). Хотя родственными их можно назвать весьма условно, - величина DIST слишком велика. Это наблюдение говорит о схожести аминокислотного состава СГП и АГП. Большая величина DIST, вероятно, указывает на новизну данных белков.

Удивительно, что при достаточно схожем аминокислотном составе, изоэлектрическая точка СГП и АГП отличается приблизительно на две с половиной единицы. Более того, если представить себе, что все Asx (Asp + Asn) и Glx (Glu + Gin) в составе АГП являются соответственно аспарагиновой и глутаминовой кислотами, значение pi, полученное в результате теоретических расчетов (vww.embl-heidelberg.de/cgi/pi-wrapper.pl), будет равно 4,1. Таким образом, аномально низкую изоэлектрическую точку АГП можно объяснить наличием сульфатированных или/и фосфорилированных аминокислот и/или олигосахаридов.

Согласно результатам анализа с помощью алгоритма PROPSEARCH, вероятность родства НГП с Предшественником Дельта Субъединицы Поверхностного Гликопротеина Т - Клеток (CD3 delta), составляет около 70% (Табл. Зв). CD3 delta представляет собой гликопротеин и является составной частью олигомерного белкового CD3 комплекса, который экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов. Пептидная цепь состоит из 173 аминокислот и имеет изоэлектрическую точку 6.89. Указание на возможное родство НГП и CD3 delta на основании сходства аминокислотного состава, молекулярной массы и изоэлекгрической точки пока следует считать предварительным, однако, при построении дальнейших экспериментов полученную информацию необходимо учитывать.

Таблица 3 в. Результаты поиска гомологов Hi 11 с помощью алгоритма PROPSEARCH.

ПКТ - Условная величина, отражающая степень гомологии между данным и исследуемым белком согласно алгоритму РИОРЗЕАЯСН (См. Табл 2); ЬЕЫ - Количество аминокислотных остатков в пояипептидной цепи._

DIST LEN Pi Описание

1, 1,88 173 6.89 Поверхностный гликопротеин Т-клеток CD3,

дельта цепь, предшественник

2 2.13 152 7.44 Нуклеозид дифосфат киназа А (ЕС 2.7.4.6)

3 2.16 177 6.52 Протеин 2 из железы Фон Эбнера,

предшественник.

4- 2.22 187 6.64 ДНК-З-метиладенин гликозидаза I (ЕС 3.2.2.20)

5 2.22 177 6.53 Протеин 1 из железы Фон Эбнера,

предшественник.

6 2.30 158 7.05 Патогенез-связанный белок 1 (AOPR1)

7 2.31 159 6.70 Главный аллерген цветочной пыльцы CAR В 1,

изоформа 2.

8 2.33 193 6.96 ГТФ-связывающий белок SAR2

9 2.34 148 6.99 Фрукгозо-подобный-1 ПА компонент PTS системы

10 2.35 160 6.96 Нитрат редукгаза (ЕС 1.6.6.1)

11: 2.39 147 6.12 Гипотетический 16.6 Ш протеин Luxg 3'region.

12 2.40 197 6.53 Гуанилат киназа (ЕС 2.7.4.8)

13 2.40 148 6.98 Нуклеозид дифосфат киназа В (ЕС 2.7.4.6)

14 2.41 159 7.31 Минорный фнбриальный белок, предшественник

(PILIN)

15 2.43 152 6.13 Нуклеозид дифосфат киназа А (ЕС 2.7.4.6)

Таблица 4. Предсказание содержания элементов вторичной структуры в исследованных белках с помощью алгоритма вБСР (1).__

Элемент вторичной структуры СГП АГП НГП нСГП

Альфа-спяраль 0.0% 0.0% 25.6 % 71.9

Бета-слой 0.0 % 0.0 % 16.1 % 0.0

Клубок 100.0% 100.0% 58.3 % 28.1

Класс белка неупоря- неупоря- смешанный альфа

доченный доченный

Нельзя игнорировать сходство СГП, НГП и АГП по ряду характеристик с семейством гомологичных белков, имеющих наименование Б-100. Среди таких характеристик можно назвать: способность не осаждаться при 100% насыщении раствора сульфатом аммония; небольшой молекулярный вес; значение

изоэлектрической точки в области слабокислых рН; сродство к Са; влияние на ход самых разнообразных биологических процессов. С другой стороны, в отличие от СГП, АГП и НГП Б-100 белки не являются гликопротеинами, содержат значительное количество а-спиралей (см. следующую главу). На аминокислотном уровне гомология между белками, исследованными в данной работе, и Б-100 белками не прослеживается.

Исследование вторичной и третичной структуры физико-химическими методами.

Ранее было установлено, что исследуемые гликопротеины, в особенности СГП, характеризуются некоторыми необычными физико-химическими свойствами. Помимо упомянутой ранее способности не высаживаться в насыщенном растворе сульфата аммония, среди таких свойств можно назвать высокую устойчивость к термоденатурации. Эти и другие данные подтолкнули к необходимости исследования структуры СГП, АГП, НГП и нСГП с помощью методов КД и ДСК.

Анализ содержания элементов вторичной структуры - один из важных шагов при характеризации структуры нового бежа. Обычно для этого проводят изучение спектров КД в дальней УФ-области. Изучение этих спектров привело нас к достаточно неожиданному выводу: все три гликопротеина (СГП, АГП и НГП) состоят в основном из статистического клубка, а количество альфа- и бета-структур не может быть достоверно оценено. По КД-спектру нСГП содержание альфа-спирали было оценено как 79%, бета структур -2%, и оставшиеся 19% - статистический клубок. Такой результат представляется правдоподобным если считать, что нСГП является сывороточным преальбумином. Сывороточные альбумины обычно содержат большое количество альфа-спиралей (около 80%).

Интересно, что аналогичное предсказание может быть проведено из данных аминокислотного анализа (Табл. 4). Было показано, что для большинства белков общее содержание элементов вторичной структуры определяется аминокислотным составом. Как видно из результатов компьютерного предсказания, вторичная структура НГП и в еще большей степени СГП и АГП представлена в основном статистическим клубком.

Получив такие результаты, мы решили исследовать третичную структуру СГП с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Как было показано ранее, этот белок чрезвычайно устойчив к термоденатурации - он сохраняет биологическую активность после инкубации в воде при 100°С в течение 20 минут. Кривая, полученная методом ДСК, не позволяют

говорить о наличии кооперативного перехода третичной структуры, характерного для большинства глобулярных белков. Этот результат находится в соответствии с данными по изучению вторичной структуры, о которых говорилось выше. Полученные данные указывают на то, что СГП, по-видимому, обладает высокой конформационной подвижностью, низкой структурированностью.

Дегликозилирование и определение фрагмента первичной структуры.

Информация, без которой неизвестный белок нельзя считать

liso-

2988 27 26 25 24 23J 22 21 20 19

Mass (m/z)

Рисунок 7. Молекулярная масса фрагмента полипехггидной цепи, выделенного из СГП после дегликозилирования и очищенного с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ по данным MALDI-TOF масс-спектрометрия оказалась равна 1338.7 Да.

до конца охарактеризованным - это его первичная структура. Обычно, после выделения и очистки нового белка, проводят определение частичной последовательности на автоматическом секвенаторе. Имея последовательность бежа или гена, осуществляют поиск линейных гомологий в электронных базах данных известных последовательностей. Для этого можно использовать ряд свободно доступных алгоритмов (BLAST, Fasta, Genebee и др.).

Чтобы получить образцы, пригодные для секвенирования из СГП, НГП и АГП, мы осуществили их химическое дегликозилирование с помощью безводной

трифторметансульфокислоты. В ходе реакции гидролизуются гликозильные связи периферийных Сахаров, мешающих секвенированию полипептидной цепи с N-конца. Химический метод был выбран потому, что исследуемые вещества оказались мало подвержены действию эндогликозидаз и протеаз. Вероятно, это может быть связано с высокой степенью гликозилирования.

Итак, СГП после дегликозилирования и удаления низкомолекулярных примесей был очищен с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Молекулярная масса выделенного таким образом пептида по данным MALDI-TOF масс-спектрометрии (Рис.7) оказалась равна 1338 Да. А анализ первичной структуры полученного пика выявил последовательность из 12 аминокислот. Очевидно, это всего лишь часть молекулы, выделившаяся из СГП в результате дегликозилирования, при котором все же происходит частичный гидролиз пептидных связей. Этот факт был обнаружен в процессе отработки методики на модельных белках. Тем не менее, полученную последовательность СГП, можно использовать для поиска гомологичных аминокислотных последовательностей по электронным базам данных.

Среди предполагаемых ближайших гомологов первые две позиции занимают предшественник препроадреномедуллина быка (пппАМБ) и предшественник адреномедуллина свиньи (пАМС). Оба белка не являются гликопротеинами, состоят из 188 аминокислот и имеют изоэлектрическую точку около 6.0. Адреномедуллины экспрессируются преимущественно в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, хотя с помощью антител были найдены и во многих других тканях. Их функции в настоящее время до конца не известны.

СГП DTPKLEIAAAFK

пппАМБ MKLVPVALMYLGSLAFLGVDTARLDVAAEFRKKWNKWALSRGKR

10 20 30 40

СГП DTPKLEIAAAFK

ПАМС MKLVPVALMYLGSLAFLGADTARLDVAAEFRKKWNKWALSRGKRELRLS 10 20 30 40

¿с» указывает на идентичные аминокислоты; «.» указывает на схожие аминокислоты.

Полагают, что они связаны в превую очередь с регуляцией сердечно-сосудистой системы. Адреномедуллин, а также пептид (РАМР), состоящий из N-концевого фрагмента проадреномедуллина (20 аминокислот), вызывают гипотонический эффект на крысах in vivo, а также ряд других биологических эффектов, влияющих в первую очередь на гомеостаз сердечно-сосудистой системы. У больных гипертонией уровень адреномедуллина в крови повышен.

Предполагаемые гомологи СГП по аминокислотному составу и фрагменту первичной структуры по сумме свойств являются гомологами весьма «далекими». Скорее всего, данный гликопротеин является новым, ранее не изученным сывороточным белком. Благодаря установлению фрагмента аминокислотной последовательности, открывается возможность исследовать полную первичную структуру СГП с помощью генно-инженерных методов.

Исследование сывороточного белка - ингибитора СГП.

Поиск факторов, влияющих на проявление биологической активности СГП, привел к выделению сывороточного белка, являющегося в условиях органного культивирования обратимым ингибитором. Данный ингибитор получил наименование нСГП. Он не является гликопротеином и имеет молекулярную массу около 70 кДа (см. главу "Выделение, очистка, определение молекулярной массы").

После очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ до состояния кажущейся гомогенности был исследован аминокислотный состав нСГП (Табл. 1). Анализ этих данных показал очень высокую вероятность родства нСГП с предшественником Бычьего Сыворотого Альбумина (пБСА) (Табл. 5). Кроме того, девять из десяти наиболее близких «схожих» с нСГП белков относятся к семейству альбуминов. Альбумины - мажорные белки сыворотки крови млекопитающих. Функции, которые им приписывают, весьма разнообразны. Альбумины осуществляют регуляцию коллоидно-осмотического давления крови, кроме того связывают ионы Са, Na и К, а также жирные кислоты, гормоны и лекарства. Можно сказать, что альбумины являются универсальными носителями. В этом случае само предположение о том, что нСГП является «носителем» для СГП выглядит оправданно.

Ранее было установлено, что в сыворотке крови ранних эмбрионов СГП находится в неингибированной форме. То есть, сама эмбриональная сыворотка проявляет биологическую активность на принятой нами тест-модели. Но начиная с позднего плодного

Таблица 5. Результаты поиска гомологов нСГП с помощью алгоритма РШЭРЗЕАКСН.

В1ЭТ - Условная величина, отражающая вероятность родства между данным (известным) и исследуемым белком согласно алгоритму PR.OPSE.ARCH (См. Табл 2);

ЦЕК - Количество аминокислотных остатков в полипептидной цепи.

DIST LEN PI Описание

1 1.59 607 6.11 Сывороточный преальбумин быка.

2 1.64 438 5.30 Сывороточный преальбумин мыши.

3 1.67 607 6.08 Сывороточный преальбумин овцы.

4 1.69 608 6.44 Сывороточный преальбумин крысы.

5 1.85 607 6.30 Сывороточный преальбумин лошади.

6 1.90 353 4.90 ГАГ полипротеин

7 1.98 609 6.23 Сывороточный преальбумин человека.

8 1.99 605 6.25 Сывороточный преальбумин свиньи.

9 2.00 608 5.49 Сывороточный преальбумин Felis catus.

10 2.03 609 6.11 Сывороточный преальбумин Mongolian gerbil.

11 2.09 556 6.55 Аспартил-тРНК синтетаза, цитоплазматическая (Ее

6.1.1.12)

12 2.11 508 4.59 Дисульфид изомераза, предшественник (Pdi) (Ее

5.3.4.1)

13 2.12 509 4.61 Дисульфид изомераза, предшественник (Pdi) (Ее

5.3.4.1)

14 2.14 430 6.50 Т-кининоген I (мажорный белок акутной фазы)

(Alpha-1-Map)

15 2.14 370 6.05 Галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза (Ее

2.7.7.10).

периода эта биологическая активность пропадает и каких-либо отличий от «взрослой» сыворотки по определяемым в биологическом тесте параметрам обнаружить не удается. Кроме того, после добавления нСГП из «взрослой» сыворотки к эмбриональной сыворотке, её биологическая

активность пропадает. В Рисунок 8. из^ образование комплекса ходе эмбриогенеза синтез сш.нсгп в условиях in vitro с помощью сывороточных альбуминов гель-проникающей ВЭЖХ не удалось, включается только начиная

с позднего плодного периода, то есть совпадает с фазой

исчезновения биологической активности СГП в эмбриональной сыворотке. До включения синтеза альбуминов главным сывороточным белком является а-фетопротеин. Таким образом, открывается чрезвычайно интересная перспектива: выяснить механизм и биологический смысл данного явления.

Мы предположили, что инактивация СГП может происходить за счет образования нековалентного комплекса с нСГП и попытались изучить образование этого комплекса in vitro. Для этого была использована гель-хроматографическая система, уравновешенная физиологическим буфером. Однако, какого-либо изменения с течением времени положения или соотношения пиков, соответствующих нСГП и СГП, зафиксировано не было (Рис. 8).

Это может быть обусловлено тем, что взаимодействие данных двух белков либо происходит по более сложному механизму, либо константа диссоциации предполагаемого комплекса высока. То есть, имеет место очень слабое взаимодействие, которое следует фиксировать с помощью более чувствительных методов.

Выводы.

1. Очищен до индивидуального состояния низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота (СГП). Установлены его молекулярная масса, аминокислотный и углеводный состав, последовательность 12-ти аминокислот фрагмента первичной структуры, исследованы физико-химические свойства (изоэлектрическая точка, КД, ДСК). На основании анализа этих данных, показано, что исследованный гликопротеин является новым, ранее не описанным в литературе.

2. Очищен до индивидуального состояния и охарактеризован по молекулярной массе, аминокислотному составу, наличию гликозилирования и физико-химическим свойствам (изоэлектрическая точка, КД, ДСК) кислый внеклеточный низкомолекулярный гликопротеин из экстракта печени крыс (АГП). На основании анализа полученных данных показано, что исследованный гликопротеин является новьм, ранее не описанным в литературе.

3. Очищен до индивидуального состояния и охарактеризован по молекулярной массе, аминокислотному составу, наличию гликозилирования и физико-химическим свойствам (изоэлектрическая точка, КД, ДСК) нейтральный внеклеточный низкомолекулярный гликопротеин из экстракта печни крыс (НГП). На основании анализа полученных данных показано, что исследованный гликопротеин, вероятно,

является гомологом Предшественника Дельта Цепи Поверхностного Гликопротеина Т - Клеток (CD3).

4. Поиск факторов, влияющих на проявление биологической активности СГП, привел к выделению сывороточного белка, являющегося его обратимым ингибитором. Данный ингибитор получил наименование нСГП. Он был очищен до индивидуального состояния и охарактеризован. На основании анализа полученных данных можно полагать, что нСГП является бычьим сывороточным преальбумином.

5. Изучение биологических и физико-химических свойств низкомолекулярного гликопротеина из сыворотки крови быка (отсутствие инактивации при кипячении в воде при 100 °С в течение 20 минут, отсутствие элементов вторичной структуры по данным КД, отсутствие характерного для глобулярных белков пика плавления, соответствующего переходу в состояние «расплавленная глобула» по данным ДСК) позволяв полагать, что данный белок является не глобулярным и обладает высокой конформационной подвижностью.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Ямсков И.А., Виноградов A.A., Даниленко А.Н., Маслова JI.A., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства. Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 1 (в печати).

2. Виноградов A.A., Ямсков И.А. Дегликозилирование гликопротеинов. Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 11. С. 803-815.

3. Виноградов A.A. Структурно - функциональная характеризация белков по данным аминокислотного анализа. Материалы международной конференции «Эндогенные соединения в морфогенезе и восстановительных процессах -интегрирующие и регуляторные системы: теория и практика». 1-2 Декабря 1999, Онтогенез 2000 Т. 31. № 4 (в печати).

4. Vinogradov A.A., Yamskova V.P., Yamskov I.A. Low-weight extracellular glycoproteins from rat liver. Abstracts of 3rd Annual Conference of The Society for Glycobiology, Baltimore, USA, November 11-14,1998. Glycobiology. 1998. V. 8. № 2. Abs. 64.

5. Виноградов A.A., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Выделение и исследование сывороточных гликопротеинов с помощью ВЭЖХ. Материалы конференции "Теория и практика

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Виноградов, Алексей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Адгезивные белковые фракции из сыворотки крови крупного рогатого скота и внеклеточного пространства печени крыс.

1.1.1. Выделение

1.1.2. Биологическая активность

1.1.3. Возможные механизмы биологического 11 действия в сверхмалых дозах.

1.1.4. Медицинское применение

1.2. Первичная структура гликопротеинов

1.3. Ферментативные методы дегликозилирования

1.4. Подходы к изучению первичной структуры 33 пептидной части гликопротеинов.

1.4.1. Химические методы дегликозилирования

1.4.2. Изучение первичной структуры с 36 использованием генно-инженерных методов.

1.4.3. Секвенирование и идентификация белков с 37 помощью масс-спектрометрии.

1.4.4. Идентификация и характеризация белков 43 по данным аминокислотного анализа.

1.5. Изучение структуры углеводной части 49 гликопротеинов

1.5.1. Обнаружение гликозилирования белков

1.5.2. Химические методы выделения олигосахаридов из гликопротеинов

1.5.3. Методы исследования структуры олигосахаридов.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. 1. Материалы

II. 2. Методы

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Очистка и исследование адгезивных белковых фракций методами ВЭЖХ и ДДС-Na электрофореза.

Ш.2. Установление наличия гликозилирования и углеводного состава.

111.3. Структурно-функционалиный анализ по данным аминокислотного состава.

111.4. Исследование с помощью методов кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии.

111.5. Дегликозилирование и исследование первичной структуры гликопротеина из слабокилой фракции сыворотки крови.

111.6. Исследование сывороточного белка - ингибитора гликопротеина из слабокилой фракции сыворотки крови.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточные низкомолекулярные гликопротеины из сыворотки крови быка и печени крыс"

Поиск и исследование биорегуляторов, осуществляющих контроль за такими важнейшими процессами как клеточная адгезия, пролиферация, дифференцировка и морфогенез, продолжают оставаться актуальными задачами современной биохимии. Из внеклеточного пространства печени и из сыворотки крови млекопитающих были выделены адгезивные белковые фракции, способные вызывать самые разнообразные биологические эффекты. Среди последних можно назвать: влияние на вязко-упругие свойства плазматической мембраны гепатоцитов и ее проницаемость; на адгезивные свойства фибробластов и их выживание при культивировании in vitro; на пролиферативный статус клеток; на ход внутриклеточных синтетических процессов. Анализ характера этих эффектов способствовал изучению влияния выделенных веществ на процессы восстановления и регенерации.

Оказалось, что данные фракции могут быть использованы в качестве основы для создания новых фармакологических препаратов. На основе фракции из сыворотки крови крупного рогатого скота была создана серия фармакологических препаратов «Адгелон» и показана их эффективность в офтальмологии, травмотологии, гастроэнтерологии, при лечении ряда тяжелых патологий суставов (артрозы), для восстановления поврежденных кожных покровов (при лечении ожоговой болезни, пролежней), и в других областях медицины. Фармакологические препараты серии «Гепалон» на основе белковых фракций из внеклеточного пространства печени показаны в качестве протекторов, предотвращающих развитие циррозов разной этиологии, а также как лекарственное средство в реабилитационный период после ряда тяжелых заболеваний печени. Особым свойством изучаемых нами веществ является их способность оказывать биологическое действие в сверхмалых дозах.

Однако, несмотря на активное исследование биологических свойств выделенных белковых фракций, до сих пор оставались мало изученными их молекулярные свойства, состав и структура. Также, до сих пор не были идентифицированы молекулярные факторы, влияющих на биологическую активность этих веществ. Такие исследования необходимы, так как их проведение способствует пониманию молекулярных механизмов биологических процессов, на ход которых оказывают влияние исследуемые в данной работе белки. Это, в свою очередь, необходимо для более эфективного применения имеющихся и для разработки новых фармпрепаратов.

Целью данной работы было выделение в индивидуальныом состоянии и изучение компонентов указанных белковых фракций, ответственных за проявление их биологической активности. Для этого предполагалось решить следующие задачи:

• Провести очистку до гомогенного состояния биологически активных компонентов трех адгезивных белковых фракций из сыворотки крови быка и внеклеточного пространства печени крыс.

• После получения гомогенных препаратов, охарактеризовать их молекулярный состав, структуру, физико-химические и биохимические свойства.

• Определить и изучить факторы, влияющие на проявление биологической активности исследуемых белков.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Виноградов, Алексей Александрович

Выводы.

2. Очищен до индивидуального состояния и охарактеризован по молекулярной массе, аминокислотному составу, наличию гликозилирования и физико-химическим свойствам (изоэлектрическая точка, КД, ДСК) кислый внеклеточный низкомолекулярный гликопротеин из экстракта печени крыс (АГП). На основании анализа полученных данных показано, что исследованный гликопротеин является новым, ранее не описанным в литературе.

5. Изучение биологических и физико-химических свойств низкомолекулярного гликопротеина из сыворотки крови быка (отсутствие инактивации при кипячении в воде при 100 °С в течение 20 минут, отсутствие элементов вторичной структуры по данным КД, отсутствие характерного для глобулярных белков пика, плавления, соответствующего переходу в состояние «расплавленная глобула» по данным ДСК) позволяет полагать, что данный белок является не глобулярным и обладает высокой конформационной подвижностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Виноградов, Алексей Александрович, Москва

1. ВП Ямскова, ММ Резникова // Журн. Общ. Биол. 1991. Т. 52. №2. С. 181-191.

2. ВП Ямскова, НВ Нечаева, НБ Туманова, ЮГ Юровицкий, ТЕ Новикова, ВИ Фатеева, ИГ Гвазаева // Изв. акад. наук, сер. Биол. 1994. №2. С. 190-195.

3. ИА Ямсков, ВП Ямскова // Росс Хим журн (ЖРХО им. ДИ Менделеева). 1998. Т 42. № 3. С. 85-90.

4. ВП Ямскова, ИА Ямсков // Росс Хим журн (ЖРХО им. ДИ Менделеева). 1999. Т 43. № 2. С. 74-79.

5. ВП Ямскова, НБ Туманова // Изв. акад. наук, сер. Биол. 1994. № 5. С. 732-737.

6. Ямскова ВП (1977) Мол. Биология Т11, N5:1147

7. ВП Ямскова, ММ Резникова (1984) Журн общ биол, Т45, N 3: . 373-382.

8. АВ Евстратов, ВП Ямскова, ЭИ Буеверова, ЕВ Брагина, ММ Резникова (1988) Журн Общ биол Т49, N5: 704-708.

9. Davenas Е, Poitevin В, Benveniste J // Eur J Pharmacol. 1987. V135(3). P. 313-319.

10. Benveniste J // Nature. 1988. V.335 (6193). P.759.

11. Бурлакова ЕБ, Кондратов AA, Худяков ИВ // Изв. Акад. наук сер. Биол. 1990. № 2. С. 184-193.

12. Belougne-Malfatti Е, Aguejouf О, Doutremepuich F, Belon Р, Doutremepuich С (1998) Thromb. Res. V90(5):215-221

13. Topchieva IN, Erokhin VN, Osipova SV // Biomedical Science 1991. V 2, p 38-44.

14. Davis JM, Svendgaard DJ// J. Toxic. & Env. Heth. 1990. V30, p 71-83

15. Богатыренко TH, Редкозубова ГП, Конрадов AA (1989) Биофизика. T34 №26, с 327-329.

16. Пальмина НП, Мальцева БД, Курнакова НВ, Бурлакова ЕБ // Биохимия. 1994. Т. 59. № 2. С. 193-200.

17. Блюменфельд J1A // Биофизика 1993 №1 с. 129-132

18. Fletcher N. The chemical physics of ice. Cambridge University Press. 1970.

19. Lo SY. The proceedings of the first international symposium on physical, chemical and biological properties of stable water (Ie) clusters. Los Angeles, USA. December 1997. World Scientific. P. 3-45.

20. Connective Tissue Desease, Molecular Pathology of the Extracellular Matrix. Ed. J.Uitto, A.Perejda. N.-Y., Basel, 1987, 12, p. 473.

21. Гундарева P. А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова E.B. и др. Вопросы офтальмологии. 1997, Т113, № 2, с.12—15.

22. Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins. Ed. T. Kreis, R-Vate, O.-Y.-T., Oxford University Press, 1993,176 p.

23. Ямсков ИА, Виноградов AA, Даниленко АН, Маслова ЛА, Рыбакова ЕЮ, Ямскова ВП // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т. 37. № 1 (в печати).

24. Glycoproteins, The New Comprehensive Biochemistry, V.29B, /Eds. J.Montreuil, H.Schachter, J.F.G.Vliegenthart. Amsterdam: Elsevier Science B.V., 1995.

25. Carlsson S.L.R.// Glycobiology: A Practical Approach. /Eds. M.Fukuda, A.Kobata Oxford: Oxford University Press, 1993. P. 126.

26. Хьюз Р. Гликопротеины: Пер. с англ. М.: Мир, 1985 (Hughes R.C. Glycoproteins. London; New York: Chapman and Hall Inc. 1983).

27. Kisailus E.C., Allen HJ.// Glycoconjugates: Composition, Structure and Functions/ Eds. E.C. Kisailus, H.J. Allen. N.Y.: Marcel Dekker Inc. 1992. P. 13-32.

28. NC IUPAC-IUB // Eur. J. Biochem. 1986. V.159. P. 1-6.

29. Lis H., Sharon N.// Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. P. 1-27.

30. Montreuil J.// Pure Appl. Chem. 1975. V. 42. P. 431 -477.

31. Hart G.W., Haltiwanger R.S., Holt G.D., Kelly W.GM Annu. Rev. Biochem. 1989. V.58. P. 841-874.

32. Деревицкая В.AM Биоорган, химия. 1988. T.14. С. 1605-1625.

33. Hofsteenge J., Muller D.R., De Beer Т., Loffler A., Richter W.J., Vliegenthart J.F.G. // Biochemistry 1994. V.33. P.13524-13530.

34. Montreuil IM Comprehensive Biochemistry V. 19B. Part II./ Ed. A. Neuberger, Amsterdam: Elsevier. 1982. P. 1-190.35. . T. Feizi (1993) Curr. Opin. Struc. Biol. 3, 701-710

35. Wang F.F., Hirst C.H.W. (1977) J. Biol. Chem. 252, #23, p. 83588361.

36. Калиберда E.H.// Биоорган. Химия. 1991. T.17. С. 581-595.

37. Risley J.M., Van Etten R.L.// J. Biol. Chem. 1985. V.260. P. 15488-15494.

38. Siguyama K., Ishihara H., Tejima S., Takahashi N.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V.l 12. P. 155-160.

39. Калиберда E.H., Шемякин B.B., Антонов B.K.// Биоорган. Химия. 1990. T.16. С. 751-757.

40. Taga Е., Waheed A., Van Etten R.// Biochemistry 1984.V.23. P. 815-822.

41. Suzuki Т., Seko A., Kitajima К., Inoue Y., Inoue SM J. Biol. Chem. 1994.V.269. P. 17611-17618.

42. Suzuki, Т., Seko, A., Kitajima, K., Inoue, Y., Inoue, SM Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993.V.194. P. 1124-1130.

43. Plummer Т.Н.Jr., Phelan A. W., Tarentino A.L.// Eur. J. Biochem. 1987. V.163.P. 167-173.

44. McGovern M.M., Aula P., Desnick RJ.// J.Biol.Chem. 1983. V.258, P. 10743-10747.

45. Plummer T.H.Jr., Tarentino A.L.// J.Biol. Chem. 1981.V.256. P. 10243-10246.

46. Tretter V., Altmann F., Marz L.// Eur. J. Biochem. 1991 .V. 199. P. 647-652.

47. Chu F.K.// J. Biol. Chem. 1986. V.261. P. 172-177.

48. Tarentino A.L., Plummer T.HJr.// J. Biol. Chem. 1982. V.257, P. 10776-10780.

49. Tarentino A.L., Plummer T.H.Jr.// Fed. Proc. 1984. V.43, P. 1552.

50. Tarentino A.L., Gomez C.M., Plummer T.HJr.// Biochemistry 1985.V.24. P. 4665-4671.

51. Nuck R., Zimmermann, M. Sauvageot D., Josic D., Reutter WM Glycoconjugate J. 1990.V.7. P. 279-286.

52. Maley F., Trimble R.B., Tarentino A.L.// Anal.Biochem. 1989.V.180. P. 195-204.

53. Küster, В., Wheeler, S.F., Hunter, A.P., Dwek, R.A., Harvey, DJ. (1997) Anal. Biochem. 250, 82-101.

54. Tarentino A.L., Maley F.// J. Biol. Chem. 1974.V.249. P. 811-817.

55. Tarentino A.L., Plummer T.HJr., Maley F.// J. Biol. Chem.1974.V.249. P. 818-824.

56. Tarentino A.L., Plummer Т.Н.// Methods in Enzymology 1994.V.230. P.44-57.

57. Tai T., Yamashita K., Ogata-Arakawa M., Koide N., Muramatsu T., Iwashita S., Inoue Y., Kobata A.// J. Biol. Chem. 1975. V.250. P. 8569-8575.

58. Ito S., Muramatsu T., Kobata A.// Arch. Biochem. and Biophys. 1975. V. P. 78-82.

59. Kobata AM Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V.78. P. 434437.

60. Elder J., Alexander S.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1982.V.79. p. 4540-4545.

61. Trimble R., Atkison P., Plummer T.H.// J. Biol. Chem. 1981. V.261.P. 12000-12007.

62. Trimble R.B., Tarentino A.L.// J. Biol. Chem. 1991.V.266. P. 1646-1651.

63. Tarentino A.L., Quinones G., Schräder W.P., Changchien L.-M., Plummer T.H.,Jr.//J. Biol. Chem. 1992.V.267. P. 3868-3872.

64. Tarentino A.L., Quinones G., Changchien L.-M., Plummer . T.H.,Jr.// J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 9702-9708.

65. Kadowaki S., Yamamoto K., Fujisaki M., Kumagai H., Tochikura T.// Agric. Biol. Chem. 1988.V.52. P. 2387-2389.

66. Kadowaki S., Yamamoto K., Fujisaki M., Izumi K., Tochikura T., Yokoyama T.H Agric. Biol. Chem. 1990.V.54. P. 97-106.

67. Edge A.S.B., Faltynek C.R., Hof L., Reichert L.E., Weber Jr.// Anal. Biochem. 1981. V.118. P. 131-137.

68. Aitken A., Geisow M.J., Findlay J.B.C., Holmes C., Yarwood A. (1989) in Protein Sequencing: A practical guide (Findlay J.B.C., Geisow M.J., Ed.) IRL Press, Oxford.

69. H. Hirano, S. Komatsu, H. Kajiwara, Y. Takagi, S. Tsunasawa (1993) Electrophoresis, 14, 839-846.

70. N. Rao Thotakura, LiCalzi L., Weintraub B.D.// J. Biol. Chem. 1990. V.265. P. 11527-11534.

71. Rusiniak M.E., Bedi G.S., Back N.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1991. V.179. P. 927-932.

72. Shantha Raju Т., Davidson,E.A.// Biochem. and Mol. Biol. Int. 1994. V.34. P. 943-954.

73. Gerken T.A., Rekha Gupta, Jentoft N. // Biochemistry 1992. V.31. P.639-648.

74. Woodward H.D., Ringler N.J., Selvakumar R., Simet I.M., Bhavanandan V.P., Davidson E.A.// Biochem. 1987. V.31. P. 639648.

75. JW Tams, KG Welinder (1995) Anal Biochem 228, 48-55

76. JM Bailey (1995) J. Chromatogr. A, 705,47-65

77. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Москва. Мир. 1994. Т. 2.

78. Nguyen DN, Becker GW, Riggin RM (1995) J Chromatogr A, . 705(1): 21-45.

79. G Johnson, A Hedin, P Hakansson, B.U.M. Sunquist, H. Bennich, P. Roepstorff (1989) Rapid Commun Mass Spectrom., 3, 190.

80. Tsabopoulos, G.W. Becker, J.L. Occolowitz, I. Jardine (1988) Anal. Chem., 171,113-117.

81. M. Mann, G. Talgo (1996) Curr. Opin. Biotechnol., 7: 11-19.

82. M. Mann, CK Meng, JB Fenn (1989) Anal. Chem. 61: 1702-1704.

83. Küster B, Mann M (1998) Curr Opin Struct Biol, 8: 393-400

84. WJ Henzel, TM Billeci, JT Stults, SC Wong, С Grimley, С Watanabe (1993) Proc Nätl Acad Sei USA, 90: 5011-5015

85. J.R. Yates, S. Speicher, P.R. Griffin, T. Hunkapiller (1993) Anal. Biochem., 214: 397-408.

86. M Mann, Wilm M (1994) Anal. Chem., 66:4390-4399

87. AA Tuinman, GR Pettit (1990) Int J Pept Prot Res, 36: 331-334.

88. Shevchenko A, Chernushevich I, Ens W, Standing KG, Thomson B, Wilm M, Mann M (1997) Rapid Commun Mass Spectrom, 11: 1015-1024

89. Bork P., Ouzounis C., Sander C., Scharf M., Schneider R., Sonnhammer E. (1992) Protein Sei. 1,1677-1699

90. Nakashima H., Nishikawa K., Ooi T. (1986) J. Bioehem. 99,153162.

91. Muskal S., Kim S.-H. (1992) J. Mol. Biol. 225, 713-727.

92. U. Hobohm, T. Houthaeve, C. Sander (1994) Anal. Bioehem. 222, 202-209

93. Strydom D., Tarr G.E., Pan Y.-C. E., Paxton R. (1992) in Techniques in Protein Chemistry, III (Angeletti, R.H., Ed.), Academic Press, New York

94. U. Hobohm, C. Sander (1995) J. Mol. Biol. 251, p 390-39996. van Heel M., (1991) J. Mol. Biol. 220, 877-887.

95. Kell DB, King RD (2000) Trends Biotechnol. V18. P.93-98.

96. Brent R. (2000) Cell. V100. P. 169-183.

97. Abbott A. (1999) Nature. V402. P. 715-720.

98. Opdenakker G, Rudd PM, Ponting CP, Dwek RA // FASEB J. 1993. V 7. № 14. P. 1330-1337.

99. Dwek RA // Bioehem Soc Trans. 1995 Feb;23(l):l-25

100. Rudd PM, Dwek RA // Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):488-97

101. Rudd PM, Dwek RA // Crit Rev Bioehem Mol Biol. 1997;32(1):1-100

102. Eckhardt A.E., Hayes C.E., Goldstein I.J. // Anal. Bioehem. 1976. V. 73. № 1. P. 192-197

103. Н.К. Кочетков, А.Ф. Бочков, Б.А. Дмитриев, А.И. Усов, О.С. Чижов, В.Н. Шибаев. Химия углеводов. Издательство «Химия». Москва. 1967.

104. Bayer ЕА, Wilchek М // Methods Biochem. Anal. 1980. V26. P. 145

105. Bigge J.C., Patel T.P., Bruce J.A., Goulding P.N., Charles S.M., Parekh R.B. (1995) Anal. Biochem. 230, 229-238

106. Lis H., Sharon N., (1986) Annu. Rev. Biochem. 55, p. 35-67

107. Dwek RA, Edge CJ, Harvey DJ, Wormald MR, Parekh RB // Annu Rev Biochem 1993; V62: 65-100

108. OgataS., Lloyd K.O.//Anal. Biochem. 1982. V.l 19. P. 351-359.

109. Pater Т., Bruce J., Merry A., Bigge C., Wormald M., Jaques A., Parekh R.// Biochemistry 1993. V. 32. P.679-693.

110. Iyer R.N., Carlson D.M.// Arch. Biochem. Biophys. 1971. V.142. P. 101-105.

111. Argade S.P., Daves G.D., Van Halbeek H., Alhadeef J.A.// Glycoconjugate J. 1989. V.6. P. 45-56.

112. Lee Y.C., Scocca J.R.// J.Biol.Chem. 1972. V.247. P.5753-5758.

113. Likhosherstov L.M., Novikova O.E., Piskarev V.E., Trusikhina E.E., Derevitskaya V.A., Kochetkov N.K.// Carbohydr. Res. 1988. V.l78. P. 155-163.

114. Likhosherstov L.M., Novikova O.S., Derevitskaya V.A., Kochetkov N.K.// Carbohydr. Res. 1990. V. 199. P. 67-76.

115. Patel T.P., Parekh R.B. // Meth. Enzymol. 1994. V.230. P. 57-66.

116. Allan E.-L., Merry T. // Glycobiology 1992. V.2. P.267.

117. Rudd P.M., Guile G.R., Kuster В., Harvey D.J., Opdanakker G., Dwek R.A. (1997) Nature 338, 205-207

118. Kobata A., (1979) Anal. Biochem. 100, 1-14

119. Kobata A., Ginsburg V.// Arch. Biochem. Biophys. 1972. V. 150. P. 273-281.

120. Nishigaki M., Yamashita K., Matsuda I., Arachima S., Kobata A.// J. Biochem. (Tokyo) 1978. V.84. P. 823-834.

121. Jacob G.S., Scudder P. // Methods in Enzymology. 1994. V. 230. P. 280-299

122. Ogata A.M., Muramatsu T., Kobata A.// Arch. Biochem. Biophys. 1977. V.181. P. 353-358.

123. Yamashita K., Tachibana Y., Kobata A.//J. Biol. Chem. 1977. V.252, P.5408-5411.

124. Tai T., Yamashita K., Ogata A.M., Koide N., Muramatsu T., Iwashita S., Inoue U., Kobata A.// J. Biol. Chem. 1975. V.250. P. 8569-8575.

125. Arakawa M., Ogata S., Muramatsu T., Kobata A.// J. Biochem. (Tokyo) 1974. V.75. P. 707-711.

126. Brady R.O., Gal A.E., Kanfer J.N., Bradley R.M.// J. Biol. Chem. 1965. V.240. P. 3766-3770.

127. Fukuda M.N., Matsumura G.// J. Biol. Chem. 1976. V.251 . P. 6218-6225.

128. Fukuda M.N., Hakomori S.// J. Biol. Chem. 1982. V.257. P. 446455.

129. Takasaki S., Kobata A.//J. Biol. Chem. 1976. V.251. P. 36063609.

130. Takahashi N., Nakagava H., Fujikawa K., Kawamura Y., Tomiya N., (1995) Anal. Biochem. 226,139-146.

131. N Takahashi (1996) J Chromatogr A, 720: 217-225

132. N. Takahashi, Y. Wada, J. Awaya, M. Kurono, N Tomiya (1993) Anal. Biochem., 208: 96

133. Kanazawa К, Ashida К, Itoh M, Nagai H, Sasaki H, Fukuda M (1999) Biol Pharm Bull (1999) 22(4):339-46

134. Wormald M.W. (1997) Biochemistry 36,1370-1380

135. Guile G.R., Wong S.Y.C., Dwek R.A. (1994) Anal. Biochem. 222, 231-235

136. Guile G.R., Rudd P.M., Wing DR., Prime S.B., Dwek R.A. (1996) Anal. Biochem. 240, 210-226

137. PrimeS, Merry T//Methods Mol Biol 1998; 76: 53-69

138. Iourin O. (1996) Glycoconjugate J. 13,1031-1042

139. PM Rudd, BP Morgan, MR Wormald, DJ Harvey, CW van den Berg, SJ Davis, MAJ Ferguson, RA Dwek (1997) J. Biol. Chem. 272, 7229-7234

140. Lemus D., Lemus R., Romero S., Arancibia N., Fuenzalida M. . (1997) J. Morphol. 231, 175-184

141. Orntoft T.F., Jepsen J., Hansen P.V., Raundahl U., Langkilde N.C. (1997) Glycoconjugate J. 14,191 -199

142. M. Wilchek, E.A. Bayer // Anal. Biochem. 1988. V171. p. 1-32.

143. A. Haselbeck, E. Schickaneder, H. von der Eitz, W. Hozel (1990) Anal. Biochem. 191, 25-30

144. J.P. McCoy Jr., J. Varani, I.J. Goldstein (1983) Anal. Biochem. 130, 437-444

145. Sata Т., Zuber С., Roth J. (1990) Hystochemistry 94, 1-11

146. Roth J, Goldstein IJ (1995) Glycoconj J, 12(2): 142-149

147. Endo T, (1996) J Chromatogr A, 720(1-2): 251-61

148. Harvey DJ (1996) J Chromatogr A; 720(1-2): 429-446

149. RS Annan, SA Carr (1997) J. Protein Chem, 16: 391-402

150. Практическая химия белка, Ред. А.Дарбре, Москва «Мир», 1989

151. Laemmli UK (1970) Nature, 227: 680-684

152. CR Merril (1990) Meth Enzymol. 182: 477-486.

153. AP Reisner, P Nemes, С Bucholtz (1975) Anal Biochem., 64: 590

154. Andrade, M.A., P. Chacon, JJ. Merelo and F. Morän. (1993) Prot. Eng. 6, 383-390.

155. Резникова M.M., Ямскова В.П. //Журнал общей биологии. 1985.Т.46, N3, с.389-400.

156. Wilson СМ (1983) Meth. Enzymol. 91: 236-247

157. Correa MR, Ochoa AC, Ghosh P, Mizoguchi H, Harvey L, Longo DL (1997) J Immunol 158(11): 5292-5296160. van Leeuwen JE, Kearse KP (1996) J. Biol. Chem., 271 (16): 9660-9665

158. Moore, BW (1965) Biochemical and Biophysical Research Communications 19: 739-744.

159. Kretsinger, RH (1976) Annual Review of Biochemistry 45: 239266.

160. Donato R.// Biochim Biophys Acta. 1999. 1450(3): 191-231.

161. Schafer, BW, Wicki, R, Engelkamp, D, Mattei, M-G, & Heizmann, CW (1995) Genomics 25:638-643.

162. В. Berger, D.B. Wilson, E. Wolf, T. Tonchev, M. Milla, P.S. Kim // PNAS USA, V. 92, pp. 8259-8263.

163. Eisenhaber F., Imperiale F., Argos P., Froemmel C. (1996) Proteins: Struct., Funct., Design, 25 N2, 157-168.

164. Eisenhaber F., Froemmel C., Argos P. (1996) Proteins: Struct., Funct., Design, 25 N2, 169-179.

165. Privalov P.L., Tiktopulo E.I., Venyaminov S.Yu., Griko Yu.V., Makhatadze G.I., Khechinashvili N.N. // J. Mol. Biol. 1989. V. 205. № 4. P. 737-750.

166. Altschul SF (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402

167. W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448

168. Kitamura К, Eto T (1997) Curr Opin Nephrol Hypertens; 6(l):80-7

169. McGillivray R.T., Chung D.W. and Davie E.W. (1979) Eur. J. Biochem. 98:477-485.

170. Brown J.R. //Fed. Proc. 1975. 34, 591-591.

171. Elysee-Collen B, Lencki RW // Biotechnol. Prog. 1997.13(6):849-56.

172. Рыбакова ЕЮ, Ямскова ВП // Онтогенез. 2000. ТЗ1. №4. (в печати).

173. Adinolfi A, Adinolfi М, Lessof// J Med Genet. 1975.12(2):138-51.

Информация о работе