Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков

Белозерова, Наталья Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков"

На правах рукописи

БЕЛОЗЕРОВА Наталья Сергеевна

Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков

03.01.05 — физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 янв 2371

Москва-2010

4843463

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Пожидасва Елена Станиславовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Одинцова Маргарита Семёновна

Доктор биологических наук Клячко Нелла Леопольдовна

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится «25» января 2011 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

Факс:(499)977-80-18; электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «¿-Н » 010 года

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,

кандидат биологических наук у М.И. Азаркович

-/¡уу/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Фитогормоны оказывают влияние на различные стороны развития растений, включая рост, дифференцировку и морфогенез (Кулаева, 1973; Кулаева, Кузнецов, 2002). При этом неизбежно возникают существенные изменения в интенсивности и характере основных процессов клеточного метаболизма, включая дыхание. Поскольку митохондрии занимают центральное место в метаболизме клетки, в первую очередь, как основные поставщики энергии и промежуточных метаболитов, маловероятно, чтобы регуляция их активности оказалась вне сферы действия фитогормонов.

Митохондрии растений, наряду с основным цитохромным путем окисления, обладают альтернативным путем переноса электронов, шунтирующим два пункта сопряжения в ЭТЦ. Постулируется, что функционирование шунтирующих механизмов увеличивает способность растений к адаптации при изменении эндогенных и экзогенных факторов (см. обзор Грабельных, 2005). В этой связи возрастает интерес к изучению механизмов регуляции энергетики дыхания, включая изучение роли фитогормонов в этом процессе.

Выбор в качестве объекта исследований люпина желтого обусловлен его чувствительностью к экзогенным гормонам, в частности цитокинину. Для него оптимизирована схема постановки экспериментов, которая позволила изучить регуляцию фитогормонами экспрессии ядерных и хлоропластных генов, и биогенеза хлоропластов (см. обзор Кулаева, Кузнецов, 2002; см. обзор Романов, 2009). Однако крайне мало известно о механизмах действия фитогормонов на митохондрии растений, в частности люпина, о гормональной регуляции митохондриального генома, а также о регуляции митохондриальных генов ядерного кодирования, включая гены альтернативной оксидазы (АО) (Miller et al., 2010). Дополнительные сложности создает отсутствие полной нуклеотидкой последовательности ядерного, митохондриального и пластидного геномов люпина.

Цели и задачи исследования. С целью выяснения механизмов действия фитогормонов на функциональную активность митохондрий растений на примере

этиолированных семядолей Lupinus luteus L. в данной работе были поставлены следующие основные задачи:

1) Для семядолей L. luteus провести подбор оптимальных условий действия цитокинина (6-бензиламинопурина, 6-БАП) и салициловой кислоты (СК) (концентрации гормона, способы обработки растительного материала);

2) Изучить влияние экзогенных 6-БАП и СК на интенсивность дыхания в семядолях L. luteus и на активность различных путей митохондриального окисления в условиях in vivo;

3) Исследовать методом run-on транскрипции влияние 6-БАП и СК на регуляцию интенсивности транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания, тРНК и рРНК у L. luteus;

4) Идентифицировать гены альтернативной оксидазы цианид-резистентного пути окисления у L. luteus для дальнейшего анализа эффекта 6-БАП и СК на экспрессию АО.

Научная новизна работы. Впервые для семядолей L. luteus изучено влияние 6-БАП и СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания. Показана дифференциальная регуляция интенсивности транскрипции изучаемых генов при воздействии указанных фитогормонов.

При помощи ПЦР с парой вырожденных праймеров изолированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов АО, предположительно, относящиеся к двум разным подсемействам.

На фоне активации альтернативного пути окисления в ответ на обработку СК показана положительная регуляция АО на уровне мРНК и белковых продуктов. 6-БАП не оказывает достоверного влияния на экспрессию АО и на альтернативное дыхание, но 6-БАП усиливает окисление по цитохромному пути.

Практическое значение работы. Полученные в диссертационной работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Показанные данные способствуют формированию целостного представления о путях действия фитогормонов на митохондрии растений - от гена до функции. В настоящее время нет

информации о регуляции гормонами транскрипции митохондриальных генов, а также о влиянии цитокинина на экспрессию генов митохондриальных белков ядерного кодирования. Идентификация генов АО у L. luleus позволяет изучить регуляцию альтернативного пути дыхания и дополняет информацию об эволюции этих генов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Международной конференции «Plant Abiotic Stress - from signaling to development» (Эстония, Тарту, 2009), Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), в приглашенном докладе на Зимней студенческой школе «Биология растительной клетки» (Пущино, 2009), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010) и на Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: i

традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на ¿¿3? страницах машинописного текста, содержит ]]__ таблиц, А?~рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись этиолированные семядоли и проростки Lupinus luteus (сорт «Дружный»), проростки Glycine max (L.) Meer.

Обработку гормонами проводили согласно схеме, описанной для люпина (Kusnetsov et al., 1994). Проращивание семян и экспонирование семядолей производили в климатической камере, в темноте при температуре 24 С. Семядоли

экспонировали на воде или на водных растворах, содержащих 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.0), СК + 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0), 6-БАП + 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) в течение 12 ч.

Дыхательную активность определяли по поглощению кислорода, которое регистрировали полярографическим методом на полярографе LP 7 (Чехия) (Шольц, Островский, 1975). Семядоли или суспензию митохондрий вносили в полярографическую ячейку, термостатируемую при 25°С в воде или буфере выделения митохондрий, соответственно. Для определения общей скорости дыхания (Vt), скорости цианид-резистентного (Vkcn) и остаточного (Vres) дыхания применяли ингибиторный анализ с использованием цианида калия и салицилгидроксамовой кислоты (СГК) в концентрациях для семядолей 4 мМ и 20 мМ, соответственно; для изолированных митохондрий - 1 мМ и 3 мМ, соответственно (Moller et al., 1988). Максимальную активность альтернативного дыхания (Valt), определяли по изменению скорости дыхания ткани после добавки СГК в присутствии KCN, а уровень цитохромного дыхания (Vcyt) - по изменению скорости поглощения кислорода после добавки цианида на фоне СГК (McDonald et al., 2002). Вычисление уровня цианид-резистентного дыхания (ЦРД) проводили по формуле: ЦРД = (Vkcn / Vt) * 100%. При измерении дыхания семядолей скорость поглощения кислорода выражали в нг-атомах О2 в мин на г сухого/сырого веса. В случае измерения дыхания в суспензии митохондрий - в нг-атомах 02 в мин на мг белка.

Митохондрии выделяли по Giege et al. (2000) методом дифференциального центрифугирования и последующей очисткой в градиенте плотности сахарозы с изменениями. В данной работе для изучения интенсивности транскрипции митохондриальных генов был оптимизирован метод run-on транскрипции (Giege et al., 2000; Binder et al., 1995). Подбор праймеров для исследуемых генов осуществляли при помощи программы Vector NTI. Характеристика праймеров представлена в таблице 1.

Для биоинформационного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали следующие программы и интернет ресурсы: Vector NTI, SeqScanner, BioEdit, NCBI, CDD на сервере NCBI, ExPASY и MITOPORT.

Таблица 1. Список праймеров, использованных для ПЦР.

№ название гена последовательность праймеров (5'-3') темп, отжига длина ПЦР продукта, п.н. исходная последовательность

1 atp9 s - aaatcaataggtgccggagctgcta as - tgcgatcggaaaacgaatgaga 60 217 Arabidopsis thaliana, D82062

2 сстВ s - aggagaggaatacccaatcgatgaa as - cataagcagatcttcccctccacac 60 ¿ъ СО A. thaliana, NC 001284, region: 30463-31083

3 cob s - ggtgcgatgagtctcatccgtgta as - ggttcggttcgttagcaggtattt 62 1071 A .thaliana X67736

4 coxl s - cttcggtgccattgcaggagtgat as - tgatcatggtagctgcggtgaagta 62 875 A. thaliana, NC 001284, region: 349830-351413

5 сохЗ s - aatgggaataaccgaaccacgtcta as - aagggggtgcaacacttctcagtt 60 649 A. thaliana, NM 126741

б nad9 s - tgcggagttgattatccctctcg as - ctacgctgttcccaaggactagcaa 64 386 L ¡uteus, AF279446

7 nadó s - cgagccctgctttggtctct as - tcgtcggaaaacatcctgtctt 64 536 L. luteus, AF279439

8 nad3 s- atcccactcggtcttccttttc as - tgccctatcactatggattactccc 64 317 L. luteus, AF035355

9 rpsl2 s- gagcgatgcctacattcaatcaa as - gcctcttcttcgatccggaa 70 348 L. luteus, AF035355

10 rpsl3 s - gaatttgcttgcgagcagtcctt as - ggagctagatcacttcccgatgaac 60 329 Zea mays, AF079549

11 rrn¡8 s - cagcgtcggtagggacccaga as - gcacgtaggcggtgaatcgg 60 186 L. luteus, Z11512

12 rrn26 s - tcctggaagtttcaaccttc as - tggagcgaattggatgat 48 300 A. thaliana, NC 001284, region: 8848-11415

13 írnl s - taaggggtggtaggcttagtagggc as - ttgggcattcctgggaagagg 60 183 A. thaliana, NC 001284

14 atpE s - ttcgcttcaaccaaatatttcgtc as - cgtattaccaaaccacgccccta 58 225 Зубо Я.О. (не опубл. данные)

15 nadF s-tggaccagaagcaagcaaga as - tcgcaactgcaccaaggaat 60 551 Зубо Я.О. и др., 2008

16 rrnló s - gattgggcgtaaagcgtctgtagg as - ccatttgctcccctagctttcgt 60 224 A. thaliana, NC 000932 region: 101012-102502

17 rrn 23 s - ggtaggggagcgttccgcc as - ccctgactcaccctccgtgga 61 164 A. thaliana, NC 000932 region: 104691-107500

18 Vbq s - gggaggaatgcaaatctttgtgaa as - cacggagacgtaaaacaaggtgaa 72 190 Lupinus polyphyllus, X54381

Таблица 1. Список праймеров, использованных для ПЦР (продолжение).

JV» название гена последовательность праймеров (5'-3') темп, отжига длина ПЦР продукта, п.н. исходная последовательность

19 Aoxl s - atgaccttcatggaagtggcaa as - gtgtgcgaatttaggtgacaacaa 64 120 A. thaliana, D89875, NM 113135, D89875, NM 113134, АВ003175, АВ003175, NM 113678, NM 102968 G. max X68702

20 Аох2а s - actatggtggaacttgtgaagccta as - tgagccaccttcggggag 69 120 A. thaliana AB003176, NM 125817 G. max U87906

21 Аох2Ь s - ccatggtggagcttgtgaagcctgt as - tgtgcccctttggcgaga 68 120 A. thaliana AB003176, NM 125817 G. max U87907

22 Аох(Р1) (Р2) s - gargcnkanaaygarmgnatgcayyt as - gcytcytcytcnarrtancc 70-64 68-54 176 см. текст

23 LlAox s - ttcctcctcgaagtagccgacaa as - ggcggaaaatgaaagaatgcal 65 172 LlAoxl, LlAox2, см. главу

Примечание: № 1-13 гены митохондриального кодирования; N° 14-17 гены пластидного кодирования; 1!Ьд и Аох гены ядерного кодирования; в - прямой праймер; обратный праймер.

Выделение ДНК, ПЦР-анализ, выделение РНК и иммунохимический анализ проводили по стандартным методикам (Sambrook е! al., 1989; Chomczyncski el al., 1987; Laeramli, 1970). Клонирование фрагментов генов проводили в вектор pTZ57R/T согласно рекомендациям фирмы-производителя («Fermentas»). Секвенирование проводили на оборудовании Applied Biosystems в ЗАО «Синтол» (Москва). Анализ методом ОТ-ПЦР проводили согласно рекомендации фирмы-производителя обратной транскриптазы («Fermentas»). В качестве референтного гена использовали ген убиквитина (Ubq).

Количество белка определяли по Бредфорд (Bredford, 1976) или бицинхониновым методом (Stoscheck, 1990), в качестве стандарта использовали БСА.

Содержание белка АО определяли с использованием коммерческих поликлональных антител (ЛУ04054, «А§пзега»).

Все эксперименты проводили в 3-кратной биологической и аналитической повторное™. Для всех полученных данных были рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение действия СК и 6-БАП на дыхание семядолей Ь. 1и(си$.

Изменение скорости различных путей митохондриального окисления является одной из главных характеристик, демонстрирующих изменения в функционировании митохондрий. В данной работе была разработана схема экспериментов, которая опиралась на данные по действию гормонов на биогенез пластид £. /и/емя (Клип^боу е! а!., 1994). В качестве контроля использовали семядоли, инкубированные в течение 12 часов на растворе 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.0), который также добавляли в раствор фитогормонов для улучшения их проникновения в ткани. В предварительных экспериментах была показана активация скорости дыхания по цитохромному пути (УсуО при инкубации семядолей на 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.0) по сравнению с показателями дыхания семядолей, инкубированных на воде, что учитывали при пересчете данных.

1.1. Влияние СК на активность различных путей митохондриального окисления в тканях этиолированных семядолей 1Шеиъ. Для подбора действующей концентрации СК было изучено влияние 100 мкМ, 500 мкМ и 1 мМ СК на интенсивность дыхания этиолированных семядолей £. /в/ш (рис. 1 А, Б).

В качестве действующей концентрации СК был выбран 1 мМ раствор, который активирует общее дыхание на 43 %. Это происходит за счет увеличения максимальной скорости альтернативного пути окисления (УаК) на 131 % по сравнению с контролем (рис. 1Б). Увеличение общего дыхания при действии 1 мМ СК отчасти может быть связано и с активацией остаточного окисления (УгеБ). Данный эффект СК сохраняется и при пересчете скоростей дыхания на сырой вес семядоли.

120

100

СГ 60

о.

=г 40

1+1

К 100 500 1000 концентрация СК, мкМ

к X 1600

X X и 1400

ф 3" 1— 1200

О ц га Ч X S 1000

U О о а 5 аз о 800

С Л ь о о с. о X * б 2 о о а 600 400

о а. t- 7 200

о -j: о lL X 0

К 100 500 1000 концентрация СК, мкМ

Рис. 1. Влияние салициловой кислоты на показатели скорости дыхания и соотношение дыхательных путей семядолей люпина желтого: изменение доли цианид-резистентного дыхания (А); изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете на сухой вес (Б). Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Ц - Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А - Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О -Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Подтверждением правильности выбора концентрации гормона служило также то, что аналогичные данные с использованием I мМ СК получены Matos et ai (2008) на гипокотилях G. max. Кроме того, активация АО при действии СК показана на различных видах растений (Clifton et al., 2006; Fung et al., 2006; Norman et al., 2004). Выбор такой высокой концентрации СК может обуславливаться, в том числе, быстрым поглощением и интенсивной метаболизацией этого фитогормона в клетках растений. В частности, в работе Chen et al. (2001) было показано, что более 85 % СК, поглощенной клетками табака, метаболизируется в течение 5 часов. Это свидетельствует, что выбор в качестве действующей концентрации СК 1 мМ, является вполне оправданным и именно такая концентрация позволила получить в данном исследовании отчетливый эффект этого фитогормона на определяемые параметры дыхания семядолей.

Необходимо отметить, что при использовании 100 мкМ СК в данном исследовании выявлено увеличение скорости окисления по цитохромному пути (Vcyt), однако эти отличия были недостоверными при сравнении с контролем (рис. 1Б). Отсутствие достоверного увеличения Valt при действии 100 мкМ может быть следствием недостаточной концентрации гормона или ограниченностью его

проникновения в ткани семядолей (Norman et а!., 2004). Как при воздействии 500 мкМ, так и 1 мМ CK наблюдается достоверное увеличение доли цианид-резистентного дыхания (ЦРД) (рис. 1А). Это происходит за счет увеличения Valt, рассчитанной на грамм сухого веса, на фоне уменьшения Vcyt (рис. 1Б). Однако при действии 500 мкМ CK это не приводит к увеличению общего дыхания.

1.2. Влияние 6-БАП на активность различных путей митохондриального окисления в тканях этиолированных семядолей L. luteus. Литературные данные об эффекте различных концентраций 6-БАП противоречивы и неоднозначны. В частности, существуют сведения о подавлении альтернативного пути митохондриального окисления (Miller, 1979, 1980; Musgrave, Siedow, 1985), либо о подавлении общего дыхания за счет ингибирования НАДН-дегидрогеназ (Miller, 1982; Sue el al., 1997) при действии цитокининов. В большинстве работ используемые концентрации гормона значительно превышали эндогенное содержание цитокининов в растительном соке, которое составляет десятки нМ (см. обзор Романов, 2009). Поскольку диапазон используемых концентраций весьма широк, то в ходе этого исследования было использовано несколько концентраций данного гормона: 1 мкМ, 10 мкМ, 22 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ.

К 1 10 22 SO 100 200 концентрация 6-БАП, мкМ

22 50 100 200

концентрация 6-БАП, мкМ

Рис. 2. Влияние 6-бензиламинопурина на показатели скорости дыхания и соотношение дыхательных путей семядолей люпина желтого: изменение доли цианид-резистентного дыхания (А); изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете на сухой вес (Б). Контроль (К) - 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.0). Ц - Усу1, скорость цитохромного пути окисления; А - УаИ, максимальная активность альтернативного пути окисления; О -УгеБ, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Обнаружено, что 6-БАП уменьшает долю ЦРД в общем дыхании изолированных этиолированных семядолей L. luteus при действии всех выбранных концентраций, за исключением концентрации 100 мкМ (рис. 2А). Однако, наблюдаемый эффект достигается за счет различных механизмов. В малых концентрациях гормон (1-22 мкМ) вызывает постепенную активацию общего тканевого дыхания (рис. 2Б). Это происходит из-за увеличения активности цитохромного пути окисления. Повышение концентрации приводит к исчезновению эффекта 6-БАП на цитохромный путь дыхания. Цитокинин в концентрации 50 мкМ и 100 мкМ подавлял общее тканевое дыхание за счет значительного снижения по сравнению с контролем Valt на 73 % и 97 %, соответственно (рис. 2Б). Отсутствие эффекта 200 мкМ 6-БАП может быть следствием смены метаболических путей и, как результат, смены окисляемого субстрата. В работе Dizengremel et al. (1982) на препарате митохондрий показано, что при окислении сукцината и малата концентрации 6-БАП, подавляющие дыхание, различаются.

Увеличение уровня ЦРД (рис. 2А) на фоне уменьшения максимальной активности альтернативного окисления (рис. 2Б) происходит за счет увеличения уровня остаточного дыхания. При действии 100 мкМ 6-БАП происходит активация Vres на 27% (по сравнению с контролем) и Vres составляет 55 % от общего дыхания ткани. Известно, что 6-БАП активирует обменные процессы, включая окислительные процессы (Dezsi, Farkas, 1964; Kuper et al., 1991, 1992; Кулаева, 1973), что, видимо, и является причиной активации остаточного дыхания ткани. Кроме того, длительная инкубация с высокими концентрациями 6-БАП вызывает синтез эндогенного этилена и оксида азота (Carimi et al., 2005; Vogel et al., 1998), которые являются важными сигнальными молекулами растений. Вероятно, наблюдаемый эффект при действии различных концентраций 6-БАП является совместным эффектом различных регуляторных компонентов, таких как цитокинин, этилен и оксид азота.

Проанализировав полученные данные, и сопоставив их с ранее опубликованными исследованиями по влиянию 6-БАП на интенсивность дыхания митохондрий, концентрация 22 мкМ 6-БАП была выбрана для дальнейшей работы на изолированных этиолированных семядолях L. luteus. В этой концентрации 6-БАП не

вызывает изменения Valt по сравнению с контролем (рис. 2Б), в то время как Vcyt увеличивается на 128 %, что может быть следствием активации метаболизма клетки. Достоверность этих результатов сохраняется и при пересчете скоростей дыхания на сырой вес семядоли. Таким образом, в данной работе впервые показана активация митохондриального дыхания синтетическим аналогом природного цитокинина 6-БАП.

2. Изучение влияния 6-БАП и CK на скорость транскрипции митохондриальных генов. Поскольку метод run-on транскрипции позволяет изучить интенсивность синтеза индивидуальных мРНК, то при помощи этого метода можно получить, хотя и не окончательный, но ответ на вопрос, как под влиянием фитогормона изменилось содержание мРНК. Были отобраны гены, кодирующие компоненты различных комплексов ЭТЦ: комплекс I - ndh\ комплекс III - cob; комплекс IV - сстВ и сох гены; АТФ-синтазный комплекс - atp9, а так же гены белоксинтезирующей системы митохондрий: рибосомальные РНК - ггп26 и ггп18 гены, рибосомальные белки - rpsl2 и rpsl3 гены, ген транспортной РНК для изолейцина - trnl. Все отобранные для изучения гены митохондриального кодирования. С целью оценить возможный вклад пластидных транскриптов были выбраны пластидные гены, экспрессирующиеся с высокой интенсивностью iatpE, nadF, rrnl6, rrn23). Следует подчеркнуть, что возможная перекрёстная гибридизация была исключена путем проверки на гомологию фрагментов митохондриальных генов с четырьмя пластомами, а пластидных - с четырьмя митохондриальными геномами.

На первых этапах работы использовали митохондрии, полученные дифференциальным центрифугированием. Однако органеллы, выделенные таким образом, имели очень низкую транскрипционную активность in vitro и в дальнейшем использовали митохондрии, очищенные в сахарозном градиенте.

2-фракция ДК = 2.4 АДФ/О = 3.0

1 - фракция —J" | ¡—

MX СК АДФ

х 21.3 т мкМ 02

сохЗ т сохз - « nad9

nad9

з-фракция

Щ* rrn16 Ф ггп16

atp9 atp9

Рис. 3. Данные полярографических исследований различных фракций, полученных в результате очистки митохондрий люпина в градиенте плотности сахарозы (А) и радиоавтограф run-on транскрипции с митохондриями 2-й фракции в оптимизированных условиях (Б). Фракции, содержащие митохондрии (MX), инкубировали в реакционной среде, куда дополнительно вносили 200 мкМ АДФ и 10 мкМ сукцината (СК). Численные значения кривых показывают скорость поглощения кислорода митохондриями в нг-атомов Ог/(мин мг белка) (В). сохЗ, nad9, о//>9, - митохондриальные гены, rrnló - пластидный ген.

Функциональную активность органелл определяли полярографическим методом (рис. ЗА, В) и затем использовали данную фракцию митохондрий для подбора транскрипционной системы (Giege et а!., 2000), которая отличалась от других систем (Binder et al., 1995; Зубо и др., 2008) повышенным содержанием солей магния и калия. В ходе экспериментов в составе отобранной транскрипционной системы (Giege et ai, 2000) было увеличено содержание нуклеотидов. Время транскрипции составляло 10 мин, что позволило получить наибольшую интенсивность сигналов (рис. ЗБ).

2.1. Влияние экзогенной СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов. Согласно экспериментальным данным, полученным в данном исследовании, воздействие СК не влечет за собой изменения интенсивности цитохромного пути дыхания. Однако в работе показано, что СК изменяет интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования, при этом, СК может, как ее увеличивать, так и уменьшать (рис. 4). Наибольшее влияние СК оказывала на интенсивность транскрипции митохондриальных генов nadó, nad9 и rpsl2. Интересно отметить, что изменение интенсивности транскрипции генов субъединиц комплекса I ЭТЦ (nad3, nadó, nad9) происходит прямо противоположно: если для nad3 и nadó она подавляется, причем в случае nadó практически в 2 раза, то

интенсивность транскрипции паЛЯ усиливается в 2 раза. На культуре клеток А. /ИаНапа также показана разнонаправленная регуляция генов, кодирующих субъединицы этого комплекса при обработке перекисью водорода и актиномицином А (ингибитором комплекса III) (8шее11оуе е/ а/., 2002). По-видимому, регуляция экспрессии генов данного комплекса носит сложный характер. Для выявления механизма и физиологического смысла такой регуляции необходимы дополнительные исследования. Интенсивность транскрипции двух пластидных генов ШрЕ и ггп!6, уменьшалась более чем в 2 раза под воздействием СК.

кiv ki

.........а....

hlp

0.3 J О л

°> J> •о íí г? & г? к1, •?•?> /Ра <> «S>

ñnli. J nñ.ñ

Изменение транскрипции свидетельствовать

интенсивности может об изменении

-О.з, -0,6 J

-0,9

ЧГТ

экспрессии генов, что, в конечном итоге, приводит к изменениям в содержании соответствующих белков. Однако анализ литературы показал, что изменение интенсивности транскрипции митохондриальных генов в течение циркадного цикла не

Рис. 4. Эффект 1 мМ СК на интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования. Значения приведены в виде десятичного логарифма изменения скорости транскрипции относительно контроля (Ig X). К IV и К I -гены субъединиц четвертого и первого комплексов ЭТЦ соответственно. БСС - гены приводит к изменениям содержания белок-синтезирующей системы митохондрий, „ГГ1.

hlp - хлоропластные гены. Бары отражают мРНК соответствующих генов, а в

стандартные отклонения при трех независимых случае необХОдимости может служить повторах эксперимента.

для обеспечения достаточного уровня мРНК. (Okada, Brennicke, 2006). Поэтому нельзя утверждать, что изменения интенсивности транскрипции в ответ на действие 1 мМ СК действительно влекут за собой изменения на уровне количества мРНК и соответствующих белков.

2.2. Влияние 6-БАП на интенсивность транскрипции митохондриальных генов. Согласно полученным данным по изменению скорости дыхания в системе in vivo на изолированных семядолях, цитокинин активирует цитохромный путь дыхания. Для изучения эффекта цитокинина на цитохромный путь изучили влияние 6-БАП на интенсивность транскрипции соответствующих генов. Полученные

...Л-

hip

Я &-o -O-^píb <é>>. <r, л

a | o C " D^" [| - D P 0'u

результаты убедительно демонстрируют снижение интенсивности транскрипции практически всех изученных генов, за исключением rpsl2, интенсивность транскрипции которого незначительно увеличивалась (рис. 5). Наибольшее подавляющее действие гормон оказывал на транскрипцию гена aíp9, кодирующего субъединиц)' АТФ-синтазы. Кроме того, 6-БАП более чем в 2 раза уменьшал интенсивность транскрипции генов coxl и сохЗ (комплекс IV); сстВ (связанный с биосинтезом цитохромом с); nadó (комплекс I); rpsI3, rrn26 и trnl (белок-синтезирующая система митохондрий); atpE и rrnló (пластидные гены).

к IV ni бсс hip Подавление интенсивности

транскрипции при действии 6-БАП на фоне активации цитохромного пути дыхания можно объяснить увеличением времени полураспада мРНК соответствующих генов. Накопление матриц, вероятно, приводит к подавлению нового синтеза данных мРНК. Кроме того, увеличение скорости дыхания по цитохромному пути при воздействии цитокинина, возможно, является результатом увеличения

ферментативной активности

комплексов ЭТЦ, а также результатом формирования суперкомплексов, существование которых показано (Dudkina et al., 2006). Не исключена возможность, что при 12-часовом воздействии гормона удалось уловить кратковременный и долговременный эффекты, которые являются прямо противоположными. При этом кратковременным эффектом является активация гормоном цитохромного пути окисления, вероятно связанной с активацией метаболизма, в то время как в клетке начинают развиваться процессы (подавление транскрипции генов компонентов цитохромного пути), предшествующие реализации долговременного эффекта, а

X о

■51-0.3 41.6 -0.9 •1.2 -1.5 -1.8 •2.1

Рис. 5. Эффект 22 мкМ 6-БАП на интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования. Значения приведены в виде десятичного логарифма изменения скорости транскрипции относительно контроля (lg X). К IV и КI -гены субъединиц четвертого и первого комплексов ЭТЦ, соответственно. БСС - гены белок-синтезирующей системы митохондрий, hip - хлоропластные гены. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

именно гибели клеток. На культуре клеток А. thaliana (Carinii et al., 2004) и Medicago truncatula (Zottini ei al., 2006) показано, что длительное культивирование (от 24 часов и более) в среде, содержащей 27 мкМ 6-БАП, вызывает гибель клеток. Известно, что при программируемой клеточной смерти, наряду со многими изменениями на молекулярном уровне, происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и активация альтернативного дыхания (Sun et ai, 1999), следствием чего является изменение интенсивности цитохромного дыхания. Однако на сегодняшний день экспериментальных данных, имеющихся в литературе, недостаточно для объяснения результатов, представленных в данной работе.

Таким образом, в ходе настоящего исследования впервые продемонстрировано изменение интенсивности транскрипции генов митохондриального кодирования в ответ на обработку фитогормонами. Показано, что 1 мМ CK оказывает разнонаправленное влияние на интенсивность транскрипции ряда генов. Причём даже при отсутствии эффекта, детектируемого на уровне скорости дыхания, 1 мМ CK изменяет интенсивность транскрипции генов, кодирующих субъединицы комплексов ЭТЦ. Также обнаружено, что обработка 22 мкМ 6-БАП вызывает снижение интенсивности транскрипции этих же генов, хотя на физиологическом уровне продемонстрировано увеличение интенсивности дыхания по цитохромному пути.

3. Влияние 6-БАП и CK на альтернативный путь переноса электронов у L. luteus. Альтернативная оксидаза является основным компонентом альтернативного пути переноса электронов, которая катализирует поглощение кислорода, нечувствительное к цианиду. В задачи данного исследования входило выявить формы АО в клетках L. luteus и изучить возможное влияние фитогормонов CK и 6-БАП на экспрессию генов АО. Анализ методом ПЦР с ген-специфичными праймерами Aoxl -s, -as; Аох2а -s, -as и Aox2b -s, -as к уже идентифицированным растительным генам АО (табл. 1), где в качестве матрицы использовали ДНК и кДНК L. luteus, показал отсутствие синтеза ДНК или синтез фрагмента, размер которого не соответствует ожидаемому результату. На основе сравнительного анализа последовательностей

ДНК и кДНК генов АО A.thaliana (D89875, NMJ13135, АВ003175, NM_113134, АВ003175, NM_113678, АВ003175, NM_102968, АВ003176, NM_125817), Nicotiana tabacum (AB281425), Solanum tuberosum (AB176953), G. max (X68702, U87906, U87907), Phasoleus vulgaris (AB236953) и Vigna unguiculata (DQ100440, DQ100441, EF187463, AJ319899, DQ100439, AJ421015) были подобраны вырожденные праймеры (Р-1 и Р-2, табл. 1).

В результате ПЦР с вырожденными праймерами, где в качестве матрицы использовали ДНК L. luteus был получен фрагмент ожидаемой длины около 180 п.н. (рис. 6, дорожка 1), который соответствует размеру фрагмента, полученного при проведении контрольного ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК G. max (рис. 6, дорожка 4).

Рис. 6. Результаты электрофореза продуктов ПЦР с вырожденными праймерами к генам АО. 1 - в качестве матрицы использовали ДНК L. luteus; 2 - в качестве матрицы использовали кДНК L. luteus; 3 - в качестве матрицы использовали ДНК G. max; 4 - в качестве матрицы использовали кДНК G. max; К - отрицательный контроль; М - маркер молекулярной массы.

Секвенирование полученных фрагментов показало, что с использованием указанных праймеров амплифицируется, по крайней мере, две последовательности размером 177 п.н. и 179 п.н. (V-2 и V-3 соответственно), которые имеют 70% идентичных нуклеотидов. Биоинформационный анализ показал высокое сходство обеих последовательностей с последовательностями АО высших растений различных видов. К примеру, фрагмент V-2 имеет 74 % и 80 % идентичности нуклеотидного состава с генами GmAox2a и GmAox2b, соответственно, и 68 % - с геном GmAoxl. Фрагмент V-3 имеет 83 % идентичности нуклеотидного состава с геном GmAoxl, и 69 % и 65 % с GmAox2a и GmAox2b, соответственно. На основе анализа взаимного сходства GmAoxl, GmAox2a и GmAox2b было сделано предположение, что V-2 (LlAox2) относится к подсемейству Аох2, a V-3 (LlAoxl) к Aoxl.

юоо п.н.__ ^^

700 п.н__. 55;

— —

400 п.н.—Ы*

200 п.н__.■ |gj«

100 п.»

-180 пл.

3.1. Изменение содержания мРНК генов АО у L. Intens под действием CK и 6-БАП. Во многих работах показано накопление мРНК различных генов АО при действии CK (Matos et al., 2009; Norman el al., 2004; Rhoads, Mcintosh, 1992; Clifton et al., 2006; Djajanegara et al., 2002; Fung et al., 1997). Для выявления влияния CK на экспрессию генов АО был проведен анализ методом мультиплексного ПЦР после обратной транскрипции с использованием праймеров (LlAox -s, -as; табл. 1), подобранных на основании консервативных последовательностей LIAoxl и LlAox2 для изучения суммарного количества мРНК генов АО.

м к 500- ¿SZí 400— ;,„. mi СК м 500 -esa» 400- «и», К 6-БАП

300- «»»л 200- ** Ubq i-ШШШ- 300 _ 200- Ubq Witöifc шшш

> А ох VАох

А В ...

•¿ 200 X

% 150

I 100

S 50

а.

S 0

100 %

контроль

113 % ± 14

/olí í 12U 100 % Г-Н

40 ..........1 0

контроль

6-БАП

Рис. 7. Влияние 1 мМ СК (А, Б) и 22 мкМ 6-БАП (В, Г) на экспрессию генов АО. А и В - электрофореграмма результатов мультиплексного ПЦР; Б и Г - содержание мРНК, вычисленное на основании интенсивности сигнала, содержание в контрольном варианте принято за 100%. В качестве референтного гена использовали ген убиквитина (ЦЬц). М -маркер молекулярной массы, К - контроль (без обработки гормоном); СК - обработка 1 мМ СК; 6-БАП - обработка 22 мкМ 6-БАП. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Результаты экспериментов показали, что при воздействии 1 мМ СК происходит накопление мРНК генов АО более чем в полтора раза (рис. 7А, Б). Результаты анализа влияния 22 мкМ 6-БАП на экспрессию генов АО показали отсутствие какого-либо достоверного эффекта (рис. 7В, Г).

3.2. Характеристика белка АО у I.. 1шеи%

Идентифицированные нуклеотидные последовательности фрагмента ИАох1 и ИАох2 были транслированы (ЫАОХ1 и ЫАОХ2, соответственно) для поиска

гомологичных белков и сравнения их аминокислотных последовательностей.

Обнаружены многочисленные гомологи, относящиеся к семейству белков АО. Идентифицированная область является консервативной для всех обнаруженных гомологов и включает в себя домен, характерный для ферритин-подобных белков. Сравнение транслируемой аминокислотной последовательности с последовательностями белков АО с определенным положением консервативных аминокислотных остатков в активном центре (81ес1о\у еГ а/., 1995) позволил определить положение таковых в последовательности Ь. 1Шеш (рис. 8).

L1ACK2 L1AOX1 GaAOXl GsAOX2a

G.tAOX2b

acaoxia Агаохзв AtAOXlC ataoxld AtAOX2

(1) (1 I (184) (197) <1901 (2181 (139) (1931 (1521 (217)

eaei:

EADli EAEN EAEII ЕДЕН EAEH

eaei£

EAEii

ЕДЕН

rmf. RMH RXK rkblk' RXHpi RMS RMHlLJi:

rkhlk: rxh|lh: rkh

MVELVKS S HHE RLIVIIAfii VFFHG FFVFYLI. FMEViKFRKYER&LVISVSeViT'i&YFLGYHS 'FHEVMtfKWYER&lVITVSSVFiUiirierbLS KVE1VKPKiiYERLLVLAVSJSViГЯЛFFVLY IL5 «VELVM SKHERL11 ГТ&в5УГП1Л FFVFYLL ■rHETOKfiO(YERAlVHV8SVFilIAYrieYbIS F«EVSKP!.-WY£RALVIAV2C-IFF!JAYF1«Y1IS FKEVAKFKXYERM.VISVasVFFH!lYbXeYIIS EI ELSQF KftYERAI VFIVQGVFFIi&YELA':'VI КИЕ LVKFK XYEaU.VMLV3S IFFHS F FVCYVI

fkiahrfvgyfeee-fkfaksmvgyi.eee& «fakrhfsyleeea fkv'akrivsyleeea

HttMSFVSiLEEEA

fkfakrhvsyleeea FKFMSMVeYLEEEA fkfakrmvoybeeeb fklakrit5yleeea rwsyleeea

Рис. 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных клонов (LlAoxI, LlAox2) АО L. luteus с последовательностями белков АО Л. thaliana (At) и G. max (Gm). Аминокислотные последовательности (L1AOX1, L1AOX2) были транслированы с нуклеотидных последовательностей (LlAoxl, LlAox2) с помощью программы ExPASY. (*) -консервативные аминокислотные остатки активного центра, участвующие в связывании ионов железа, рамкой выделен консервативный мотив ЕххН.

Согласно анализу профилей гидрофобности (Kyte, Doo little, 1982) аминокислотных последовательностей уже идентифицированных АО организмов, таких как A. thaliana и G. max, АО является гидрофильным белком, с двумя гидрофобными участками в С-концевой области. Это указывает на его мембранную локализацию. В наших экспериментах с поликлональными антителами против АО (рис. 9) продемонстрирована ассоциация АО с внутренней мембраной митохондрий.

М вн Мт вш

Рис. 9. Локализация белка АО в митохондриях 1меш. — Очищенные митохондрии разрушали и фракционировали на

~ растворимую (Мт - общий белок матрикса) и мембранную (вн, вш

- общий белок внутренних и внешних мембран соответственно) 41.9 _ . фракции. После разделения белков (по 15 мкг) с помощью

денатурирующего гель-электрофореза и их иммобилизации на . нитроцеллюлозной мембране, присутствие АО во фракциях

27.8 - . определяли иммунохимическим анализом с антителами против

АО. М - маркер молекулярной массы.

20.6-

3.3. Влияние CK и 6-БАП на содержание белка АО у L. luteus. С

использованием вестерн-блотгинга изучено содержание белка АО при 12-часовом воздействии гормонов: 1 мМ CK и 22 мкМ 6-БАП. Показано, что при действии CK количество белка АО возрастает в два раза по сравнению с контролем (рис. 10А, Б, В), что полностью согласуется с уже известными данными (Clifton et а!., 2006; Norman et а!., 2004; Rhoads, Mcintosh, 1992).

При изучении влияния 6-БАП на экспрессию АО не обнаружено достоверного изменения количества этого белка (рис. ЮГ, Д, Е). Нужно отметить, что в работах других исследователей, иллюстрирующих подавление цитокинином альтернативного дыхания, содержание мРНК и белка АО не изучалось. Это является отличительной особенностью данной работы.

м К СК м К СК 5? 206 %± 19

104—., 104- ¡¡шив и 250

59—и 41.9— - } т 5941.9- 33 кДа 01 ю ф 200 150 100 %

27.8—ж, ШФ 1. * 27.8- • / АО 5 X га * о. 100 50

20.8—® 20.8- О)

ч и *

А к *ёшШШ о в ü К СК

М К 6-БАП

104—.- ■„:,.

59—М ;

41.9—. Х ' Р

27.8__ -л ¡и«-

20.8—,

Рис. 10. Влияние 1 мМ СК (А, Б, В) и 22 мкМ 6-БАП (Г, Д, Е) на содержание белка АО. Суммарный митохондриальный белок (40 мкг) разделяли с помощью денатурирующего гель-электрофореза и иммобилизовали на нитроцеллюлозную мембрану. Количество АО определяли иммунохимически с антителами против АО. А и Г - окрашивание геля раствором кумасси синий Я-250; Б и Д - результаты вестерн-блотгинга; В и Е - содержание белка, подсчитанное по интенсивности сигнала; содержание белка в контрольных пробах принято за 100%. К - контроль (без обработки гормоном); СК - обработка 1 мМ СК; 6-БАП - обработка 22 мкМ 6-БАП. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

М К 6-БАП

10459"

41.9-

27.820.8-Д

33 кДа АО

а 160

102 % ± 17

120 80 40

100 %

К 6-БАП

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения диссертационной работы были последовательно решены три основные задачи. Во-первых были выбраны и оптимизированы условия биологического эксперимента, включая выбор объекта исследований, действующие концентрации гормонов, а также условий и времени инкубации растений, при которых можно было обнаружить эффект экзогенных гормонов на метаболизм митохондрий. Во-вторых, были отработаны и частично модифицированы биохимические и молекулярно-биологические методы исследования, например, отработан метод выделения и очистки интактных митохондрий из семядолей люпина, оптимизирован метод run-on транскрипции и ряд других методов. Наконец, были проведены опыты по изучению влияния фитогормонов на дыхание семядолей в условиях in vivo и транскрипцию генов, кодирующих некоторые белки митохондрий.

В ходе экспериментальной работы, был проверен широкий спектр концентраций гормонов, и были выбраны их действующие концентрации: для СК -это 1 мМ, а для 6-БАП - 22 мкМ. Результаты, приведенные в диссертации, убедительно показывают, что данные фитогормоны оказывают заметное влияние на измеряемые параметры дыхательного метаболизма, а также на экспрессию митохондриальных генов.

Полученные в диссертационной работе результаты свидетельствуют, что обработка СК индуцирует увеличение скорости поглощения кислорода семядолями люпина, преимущественно за счет активации альтернативного цианид-резистентного дыхания. Показано также, что эта активация достигается за счет СК-индуцируемой экспрессии генов АО и накопления белка АО в митохондриях. Кроме того, СК оказывает разнонаправленное действие на экспрессию митохондриального генома, в том числе генов, кодирующих субъединицы комплекса I.

В диссертационной работе также было изучено влияние цитокининов на дыхание семядолей и сделана попытка охарактеризовать возможные молекулярно-генетические основы данного эффекта. На примере синтетического аналога 6-БАП было проведено изучение его влияния на интенсивность дыхания и скорость транскрипции митохондриальных генов. Анализируя полученные результаты,

следует, отметить два момента. Во-первых, впервые были получены данные, которые убедительно демонстрируют снижение под влиянием 6-БАП интенсивности транскрипции практически всех изученных генов. Такой результат может говорить о влиянии цитокинина как на общие факторы транскрипции, так и на белковые факторы, регулирующие транскрипцию индивидуальных генов. Во-вторых, обнаруженное снижение интенсивности транскрипции генов, кодирующих некоторые субъединицы компонентов цитохромного пути переноса электронов, происходило на фоне заметной активации цитохромного дыхания семядолей, что было показано впервые. Одним из объяснений такого феномена может быть предположение о том, что активация под влиянием 6-БАП цитохромного пути дыхания семядолей была обусловлена активацией клеточного метаболизма и перехода митохондрий в более активное состояние. Таким образом, важным результатом всей работы является обнаружение того факта, что экзогенный цитокинин оказывает регуляторное влияние на экспрессию не только хлоропластного генома [Zubo et а!., 2008], но также на транскрипцию митохондриальных генов.

Обобщая изложенное, в диссертационной работе впервые продемонстрировано влияние СК и 6-БАП на дыхание семядолей люпина. Несмотря на то, что вопрос о детальном механизме действия фитогормонов на дыхание остается открытым, из представленных результатов следует, что действие изученных гормонов оказалось комплексным, затрагивающим активность основного (цитохромного) и альтернативного (CN-резистентного) пути электронного транспорта в ЭТЦ митохондрий. При этом фитогормоны могут оказывать свое влияние на дыхание как непосредственно, активируя или ингибируя активность или биосинтез компонентов ЭТЦ, в частности, активность и биосинтез АО, так и, по-видимому, опосредовано, изменяя напряженность клеточного метаболизма. При этом характер действия экзогенных гормонов на дыхание растений в значительной степени зависит от условий эксперимента, концентрации гормонов, времени инкубации ткани и т.д.

выводы

1. Экзогенные 6-БАП и СК влияют на интенсивность дыхания и на активность различных путей митохондриального окисления целых семядолей L. luteus. В ответ на обработку 1 мМ СК происходит активация альтернативного пути окисления. 22 мкМ 6-БАП усиливает окисление по цитохромному пути.

2. Идентифицированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов митохондриального кодирования L. luteus-. atp9, сстВ, cob, coxl, сохЗ и rpsli.

4. Впервые показан дифференциальный эффект 1 мМ СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания, тРНК и рРНК методом run-on транскрипции.

5. Впервые установлено, что 22 мкМ 6-БАП снижает интенсивность транскрипции практически всех изученных генов митохондриального и пластидного кодирования, в том числе кодирующие компоненты различных комплексов ЭТЦ.

6. Идентифицированы частичные нуклеотидные последовательности двух генов АО у L. luteus, относящиеся к подсемействам АОХ1 и А0X2.

7. На фоне активации альтернативного пути окисления в ответ на обработку 1 мМ СК методом ПЦР после обратной транскрипции и вестерн-блоттингом показана положительная регуляция экспрессии АО на уровне мРНК и на уровне белков.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Белозерова Н.С., Зубо Я.О., Кузнецов В В. Регуляция транскрипции митохондриальных и хлоропластных генов цитокинином И Международная конференция «Физико-химические основы структурно-функционачьиой организации растений». Екатеринбург, 2008. с. 68-69.

2. Belozerova N., Shugaev A.G., Pojidaeva Е., Kusnetsov V.V. «Influence of cytokinin on capacity and protein Ievel of mitochondrial AOX protein in lupin cotyledons» II Международная конференция «Plant Abiotic Stress - from signaling lo development». Эстония, Тарту, 2009. с. 46.

3. Белозерова Н.С., Пожидаева Е.С., Шугаев А.Г., Кузнецов В.В. Влияние цитокинина на цианид-резистентное дыхание в митохондриях семядолей люпина (Lupinus luteus L.) // Международная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера». Апатиты, 2009. с. 57-58.

4. Белозерова Н.С., Зубо Я.О., Шугаев А.Г., Кузнецов В.В. «Метод изучения интенсивности транскрипции индивидуальных митохондриальных генов у растений» // Вестник РУДН, серия «Агрономия и животноводство» 2009 г., №1, с. 65-72.

5. Белозерова Н.С., Бапашкина J1.B. Влияние цитокинина на функционирование электрон-транспортной цепи в митохондриях семядолей люпина (Lupinus luteus L.) II XV 11 Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010». Москва, 2010. с. 248.

6. Белозерова Н.С., Баик A.C., Шугаев А.Г., Пожидаева Е.С., Кузнецов В.В. Регуляция энергетической функции митохондрий салициловой кислотой // Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», Москва, 2010. с.57.

7. Белозерова Н.С., Пожидаева Е.С., Кузнецов В.В. Идентификация генов альтернативной оксидазы у Lupinus luteus // Материалы Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. А.М. Горького «Биология будущего: традиции и : традиции и инновации», Екатеринбург, 2010. с. 107-108.

8. Белозерова II.C., Баик A.C., Пожидаева Е.С., Шугаев А.Г. Изменение дыхания под действием фитогормонов // Материалы Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Урачьского государственного университета им. А.М. Горького «Биология будущего: традиции и инновации», Екатеринбург, 2010. с. 123-124.

9. Белозерова Н.С., Пожидаева Е.С., Шугаев А.Г., Кузнецов В.В. Метод run-on транскрипции для изучения экспрессии митохондриального генома // Физиология растений, 2011. № 1, с. 133-138 (принята в печать).

Подписано в печать:

23.12.2010

Заказ № 4763 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белозерова, Наталья Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ.

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Организация и функционирование митохондрий растений.

2.1.1. Общие представления о структуре и функциях митохондрий растений.

2.1.2. Пути переноса электронов в дыхательной цепи митохондрии.

2.2. Организация митохондриального генома.

2.2.1. Особенности организации генома митохондрий растений.

2.2.2. Основные пути регуляции экспрессии митохондриальных генов растений.

2.3. Альтернативная оксидаза.

2.3.1. Структура и функция белка.

2.3.2. Роль АО при воздействии на растение биотических и абиотических факторов.

2.4. Роль фитогормонов в регуляции интенсивности дыхания растений.

2.5. Характеристика люпина жёлтого (Ьиртш \uteus Ь.) как модельного объекта исследования.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и объекты, используемые в работе.

3.2. Определение скорости дыхания в семядолях Ьиртш Шеш.

3.2.1. Анализ и обработка данных полярограммы.

3.3. Выделение митохондрий методом дифференциального ^ центрифугирования.

3.3.1. Очистка митохондрий в сахарозном градиенте.

3.3.2. Фракционирование митохондрий . 1.

3.4. Бактериальные штаммы.!.

3.5. Клонирование фрагментов ДНК в вектор рТ757Я/Т.

3.5.1. Подбор праймеров к гену исследования.

3.5.2. Биоинформационный анализ подобранных зондов для генов.

3.6. Выделение тотальной растительной ДНК.

3.7. Выделение митохондриальной ДНК.

3.8. Выделение плазмидной ДНК Е. coli.

3.8.1. Микровыделение плазмидной ДНК.

3.8.2. Макровыделение плазмидной ДНК.

3.9. Определение количества и оценка качества препаратов нуклеиновых кислот

3.10. Полимеразная цепная реакция.

3.11. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.12. Очистка фрагментов ДНК из геля.

3.12.1. Очистка фрагментов ДНК из геля с помощью набора «Silica Bead DNA

Gel Extraction Kit» фирмы Fermentas.

3.12.2. Элюция фрагментов ДНК электрофоретическим методом.

3.13. Нитрование ДНК.

3.14. Приготовление компетентных клеток.

3.14.1. Приготовление компетентных клеток согласно рекомендации фирмы

Fermentas.

3.14.2. Приготовление компетентных клеток с использованием СаС12.

3.15. Трансформация бактериальных клеток.

3.16. Рестрикция ДНК.

3.17. Секвенирование ДНК.

3.18. Метод run-on транскрипции.

3.18.1. Иммобилизация фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану.

3.18.2. Определение количества белка в препарате митохондрий.

3.18.3. Синтез меченых транскриптов в лизате митохондрий.

3.18.4. ДНК-РНК гибридизация.

3.18.5. Оценка результатов гибридизации.

3.19. ПЦР после обратной транскрипции.

3.19.1. Выделение суммарной растительной РНК с помощью тризола.

3.19.2. Электрофорез РНК в агарозном геле.

3.19.3. Обратная транскрипция.

3.19.4. ПЦР после обратной транскрипции.'.

3.19.5. Анализ результатов.

3.20. Вестерн-блоттинг.

3.20.1. Выделение суммарного белка из митохондрий растений.

3.20.2. Определение количества белка.

3.20.2.1. Определение белка по Бредфорд.

3.20.2.2. Определение белка бицинхонином.

3.20.3. Разделение белков с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях

3.20.4. Окраска белковых гелей.

3.20.5. Перенос белков на мембрану.

3.20.6. Иммунохимический анализ.

3.21. Биоинформационный анализ

3.22. Статисический анализ

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние СК и 6-БАП на интенсивность дыхания в тканях семядолей люпина желтого.

4.1.1. Оптимизация постановки эксперимента.

4.1.2. Влияние СК на физиологические показатели дыхания в тканях этиолированных семядолях Lupinus luteus.

4.1.3. Влияние 6-бензиламинопурина на показатели дыхания в тканях этиолированных семядолей Lupinus luteus.

4.2. Изучение влияние 6-БАП и СК на интенсивность транскрипции ^ митохондриальных генов.

4.2.1. Клонирование фрагментов митохондриальных генов.

4.2.2. Оптимизация выделения митохондрий для метода run-on транскрипции

4.2.3. Оптимизация метода run-on транскрипции.

4.2.4. Влияние СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов

4.2.5. Влияние 6-БАП на интенсивность транскрипции митохондриальных генов.

4.3. Влияние 6-БАП и СК на альтернативный путь переноса электронов у Lupinus luteus.

4.3.1. Идентификация генов АО у Lupinus luteus.

4.3.2. Изменение содержания мРНК генов АО у Ьиртш Шеш под действием

1 мМ СК и 22 мкМ 6-БАП.

4.3.3. Характеристика белка АО у Ьиртш 1Шеш.

4.3.4. Характеристика предсказанных продуктов экспрессии ЫАох2 и ЫАох1.

4.3.5. Влияние 1 мМ СК и 22 мкМ 6-БАП на содержания белка АО у Ьиртш 1Шеш.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков"

Известно, что фитогормоны оказывают влияние на все стороны развития растений: рост, дифференцировку, морфогенез. Их функция 'проявляется на всех этапах онтогенеза растений, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая процессами старения и гибели организма (Кулаева, 1973, 1982). При этом неизбежно возникают существенные изменения в интенсивности и характере основных процессов клеточного метаболизма, включая дыхание. Поскольку митохондрии занимают центральное место в метаболизме клетки, в первую очередь, как основные поставщики энергии и промежуточных метаболитов, маловероятно, чтобы регуляция их активности оказалась вне сферы действия фитогормонов.

В настоящее время установлено, что митохондрии растений обладают рядом уникальных особенностей, в частности, наличием альтернативных нефосфорилирующих путей электронного транспорта, шунтирующих все пункты энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Постулируется, что наличие разветвленной ЭТЦ обеспечивает большую лабильность энергетического метаболизма, увеличивает способность растений к адаптации при изменении эндогенных и экзогенных факторов {см. обзор Грабельных, 2005). В этой связи возрастает интерес к изучению механизмов регуляции энергетики дыхания, включая изучение роли фитогормонов в этом процессе. Значение этой проблемы возрастает также в связи с успехами, достигнутыми в последнее время в выяснении молекулярных механизмов действия фитогормонов на клетки растений и путей передачи гормонального сигнала (Dodd, 2003; Кулаева, Прокопцева, 2004;), особенностей строения и функционирования митохондриального генома растений (Giege, Brennicke, 2001; Хворостовский и др., 2002; Даниленко, Давыденко, 2003), а также ядерно-митохондриальных взаимодействий (Rhoads, Subbaiah, 2007, Yang et al., 2008; Юрина, Одинцова, 2010). Однако следует отметить, что, несмотря на очевидные успехи, достигнутые в последнее время, например, в изучении рецепторов фитогормонов, передачи гормонального сигнала, а так же регуляции фитогормонами экспрессии ядерных и хлоропластных генов, а так же биогенеза хлоропластов (Кулаева, Кузнецов, 2002; Романов, 2009), аналогичные исследования механизмов действия фитогормонов на митохондрии, гормональной регуляции митохондриального генома, а так же ядерных генов, кодирующих белки митохондрий, включая гены, кодирующие АО, практически отсутствуют (Miller et al., 2010).

С целью выяснения фундаментальных путей действия фитогормонов на функциональную активность митохондрий растений на примере этиолированных семядолей- Lupinus luíeus L. в данной работе были поставлены следующие основные задачи исследования:

1) Провести подбор оптимальных условий действия цитокинина на примере 6-бензиламинопурина (6-БАП) и салициловой кислоты (СК) (концентрации гормона, способы обработки растительного материала) для семядолей L. luteus;

2) Изучить влияние экзогенных б-БАП и СК на интенсивность дыхания в семядолях L. luteus и на активность различных путей митохондриального окисления в условиях in vivo;

3) Исследовать влияние 6-БАП и СК на регуляцию интенсивности транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания, тРНК и рРНК у L. luteus методом run-on транскрипции;

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Белозерова, Наталья Сергеевна

6. выводы

2. Идентифицированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов митохондриального кодирования L. luteus: atp9, сстВ, cob, coxl, сохЗ и rpsl3.

3. Впервые показан дифференциальный эффект 1 мМ СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания, тРНК и рРНК методом run-on транскрипции.

4. Впервые установлено, что 22 мкМ 6-БАП снижает интенсивность транскрипции практически всех изученных генов митохондриального и пластидного кодирования, в том числе кодирующие компоненты различных комплексов ЭТЦ.

5. Идентифицированы частичные нуклеотидные последовательности двух генов АО у L. luteus, относящиеся к подсемействам АОХ1 и АОХ2.

6. На фоне активации альтернативного пути окисления в ответ на обработку 1 мМ СК методом ПЦР после обратной транскрипции и вестерн-блоттингом показана положительная регуляция экспрессии АО на уровне мРНК и на уровне белков.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной; функцией митохондрий, как в растительной, так и в животной клетке является дыхание, в, результате последовательных этапов которого происходит окисление дыхательных субстратов и использование накопленной энергии на синтез АТФ; обеспечивающей, жизнедеятельность любого живого организма; Кроме этого, ранее уже была отмечена центральная роль митохондрий'в; поддержании других важнейших биологических функций клетки; в частности, процессов биосинтеза, превращения? и транспорта! веществ;, транспорта ионов, термогенеза. В литературе накапливаются данные о ключевой роли митохондрий в процессах старения, апоптоза, в формировании ответа растений на стресс и т.д. С другой: стороны; практически все указанные выше функции и процессы, протекающие в растениях, начиная с клеточного уровня и заканчивая целостным организмом,, находятся- под тонкой: регуляцией" гормонов и других сигнальных молекул. Несмотря? на значительные: успехи, достигнутые в последнее время в изучении механизмов' рецепции и передачи гормонального;' сигнала у растений;, количество' работ по- изучению' влияния; фитогормонов на функционирование митохондрий весьма ограничено: При г этом , практически нет данных о «точках приложения» действия;того или; иного^гормона, а информация о влиянии гормонов, на количественные ш качественные- показатели- дыхания и метаболическую активность выделенных митохондрий; нуждается в существенном, уточнении- и дополнении. На сегодняшний^ день в литературе отсутствуют данные, обрисовывающие общую картину возможного эффекта фитогормонов;, как на альтернативный, так; и на основной? путь митохондриального окисления на молекулярно-генетическом уровне. Даже имеющиеся работы, характеризующие влияние некоторых гормонов, в частности СК, на альтернативный путь окисления часто не прослеживают всю цепочку реализации генетической информации (от гена до-белка и'его функции); Это'делает данное: направление перспективным и открытым для новых научных изысканий.

В ходе выполнения диссертационной работы были последовательно решены три основные задачи. Во-первых, были выбраны и оптимизированы условия биологического эксперимента, включая выбор объекта исследований, действующие концентрации гормонов, а также условий и времени инкубации растений, при которых можно было обнаружить эффект экзогенных гормонов на метаболизм митохондрий. Во-вторых, были отработаны и частично модифицированы биохимические и молекулярно-биологические методы исследования, например, отработан метод выделения и очистки интактных митохондрий из семядолей люпина, оптимизирован метод run-on транскрипции и ряд других методов. Наконец, были проведены опыты по изучению влияния фитогормонов на дыхание семядолей в условиях in vivo и транскрипцию генов, кодирующих некоторые белки митохондрий.

Как уже отмечалось в разделе Материалы, и Методы, выбор в качестве основного модельного объекта-изолированных семядолей люпина был обусловлен, прежде всего, низким содержанием* в них эндогенных цитокининов (Kusnetsov et al., 1994), а также возможностью измерения скорости дыхания семядолей прямо в полярографической ячейке, не подвергая их повреждению. Выбор цитокинина (его синтетического аналога 6-бензиламинопурина) и салициловой кислоты был обусловлен тем, что действие именно этих гормонов, судя по литературным данным, оказывает наиболее ярко выраженное действие на дыхание растений и выделенных митохондрий, а, кроме того, они действуют противоположным образом на некоторые параметры метаболизма митохондрий растений, в частности, на активность альтернативной CN-резистентной оксидазы (АО) (Miller, 1980; Dizengremel et al., 1982; Rhoads, Mcintosh, 1993).

В ходе экспериментальной работы, был проверен широкий спектр концентраций гормонов, и были выбраны их действующие концентрации: для СК -1 мМ, а для 6-БАП - 22 мкМ. Результаты, приведенные в диссертации, убедительно показывают, что данные фитогормоны оказывают заметное влияние на измеряемые параметры дыхательного метаболизма, а также на экспрессию митохондриальных генов в выбранных концентрациях. Ранее, в нашей лаборатории было показано, что аналогичная концентрация БАЛ оказывала регуляторное действие на транскрипцию хлоропластных генов в листьях ячменя (Зарипова и др., 2008, Zubo et al, 2008).

В качестве действующей концентрации СК был выбран 1 мМ раствор, который активирует общее дыхание семядолей за счет увеличения максимальной скорости альтернативного окисления. Подтверждением правильности выбора концентрации гормона служило также то, что аналогичные данные с использованием 1 мМ СК получены Matos et al. (2008) на гипокотиле G. max. Кроме того, активация АО при действии 0.5-1 мМ СК показана на различных видах растений (Rhoads, Mcintosh, 1992, 1993; Lennon et al., 1997; Djajanegara et al, 2002; Norman et al, 2004; Cliñon et al, 2006; Fung et al, 2006). Выбор такой высокой концентрации СК обусловлен также тем, что неоднократно было показано быстрое поглощение и интенсивная метаболизация этого фитогормона в клетках растений. В частности, в работе Norman et al, (2004) было показано, что более 85% поглощенной клетками табака СК метаболизируется в течение 4 часов. Очевидно также, что для достижения физиологического эффекта требуется гораздо большая концентрация экзогенной СК, чем эндогенной (Xie, Chen, 1999). Суммируя вышесказанное, принятие в!качестве действующей концентрации СК 1 мМ раствор является вполне оправданным, и именно такая концентрация позволила получить отчетливый эффект этого фитогормона на определяемые параметры дыхания семядолей.

Предполагается, что многие эффекты СК на растение определяются ее способностью модулировать работу митохондрий (Rhoads, Mcintosh, 1992, 1993). Несмотря на большое количество работ, показывающих активацию альтернативного пути данным гормоном и» роли данного феномена при стрессовых воздействиях, немногие показывают полную характеристику и прослеживают всю цепочку реализации генетической информации (от гена до белка и его функции). В данной работе, на фоне заметной активации СК цианид-резистентного дыхания

131 семядолей, показано существенное, в 1.5 раза, увеличение уровня мРНК семейства генов АО, обуславливающих функционирование альтернативного пути митохондриального окисления, и накопление соответствующих белков АО в 2 раза.

Впервые было" изучено^ влияние СК на экспрессию генов, кодирующих компоненты комплексов цитохромного пути переноса электронов. Применение метода run-on транскрипции позволило установить дифференциальную регуляцию интенсивности транскрипции митохондриальных генов. Наибольший интерес среди результатов, полученных в данной части работы, представляет разнонаправленная регуляция трех генов субъединиц принадлежащих к комплексу НАДН-дегидрогеназы, при этом экспрессия двух из них (nad3 и nad6) подавляется при обработке семядолей СК, а одного (nad9) - усиливается. Разнонаправленная регуляция субъединиц этого комплекса nad2 и nadll показана также при обработке перекисью и- антимицином А (ингибитором комплекса III) культуры1 клеток A. thaliana (Sweetlove, 2002). По-видимому, регуляция экспрессия генов данного комплекса носит сложный характер. Для выявления механизма и физиологического смысла такой регуляции необходимы, дополнительные исследования. Известно также, что на. фоне подавления i окисления НАДН митохондриями in vitro под действием. СК не происходит изменения содержания внешних ротенон-нечувствительных НАДН-дегидрогеназ.

Таким образом, полученные в диссертационной работе- результаты свидетельствуют, что обработка СК индуцирует увеличение скорости поглощения? кислорода семядолями люпина, преимущественно за счет активации альтернативного цианид-резистентного дыхания. Показано' также, что эта активация достигается* за счет СК-индуцируемой экспрессии генов АО и накопления белка АО в митохондриях. Кроме того, СК оказывает разнонаправленное действие на экспрессию митохондриальногоs генома, в том' числе генов, кодирующих субъединицы комплекса I.

Механизм индукции АО под влиянием СК остается неизвестен. Показано, что в высокой концентрации СК ингибирует каталазу (Chen et al., 1993). На основании этого высказывается предположение, что CK может увеличивать в клетках уровень перекиси, которая действует как вторичный мессенжер в индукции АО (Wagner, 1995). В последнее время, показано также, что CK и ее производные способны оказывать, в зависимости от концентрации, как разобщающее, так и ингибирующее действие на дыхание и ингибировать перенос электронов по цитохромному пути митохондрий (Norman et al., 2004). Этими вторами было высказано предположение, что CK, являясь по структуре фенольным соединением, в миллимолярных концентрациях может действовать как аналог убихинона и связываться с НАДН-дегидрогеназным комплексом. Таким образом, происходит ингибирование транспорта электрона от комплекса I к убихинону. Однако в нашем случае данный процесс, по-видимому, не имел места, поскольку он бы приводил к подавлению дыхания, как по цитохромному, так и по альтернативному пути: Известно, что увеличение генерации АФК при ингибирование цитохромного пути переноса электронов, например; в присутствии антимицина А также индуцирует AO (Vanlerberghe, Mcintosh, 1997, Maxwell* ei al., 1999). Анализируя имеющуюся литературу можно заключить, что одной из основных «мишеней» действия CK в клетках растений являются4 митохондрии. При этом CK может вызывать глубокие изменения в энергетическом метаболизме митохондрий, затрагивающем снижение уровня АТФ и мембранного потенциала, повышения уровня АФК и других параметров, способных оказывать влияние на экспрессию многих генов, включая гены АО.

Помимо эффекта CK, роль которой в активации альтернативного пути при различных биотических и- абиотических стрессах неоднократно продемонстрирована в современной научной литературе, в диссертационной работе также было изучено влияние цитокининов на дыхание семядолей и сделана попытка охарактеризовать возможные молекулярно-генетические основы данного эффекта. В 1962 году R. Dedolph предположил существование взаимосвязи между эффектом задержки старения ткани, отделенной от растения и обработанной цитокинином, и подавлением дыхания. На протяжении 50-ти лет ведется изучение влияния цитокининов на интенсивность дыхания митохондрий, однако в большинстве работ используются высокие концентрации гормонов, на порядки превышающие их действующие концентрации для других физиологических процессов. За исключением весьма спорной гипотезы о возможности прямого ингибирования цитокининами активности АО (Dizengremel et al., 1982, Miller, 1980, 1982, Musgrave et al., 1987), до сих пор нет других предположений о механизме действия данного гормона на дыхание растений. Поскольку в литературе присутствуют неоднозначные результаты, и исследование эффекта цитокининов является одним из основных направлением нашей лаборатории, поэтому, используя 6-БАП, было проведено изучение его влияния на интенсивность дыхания семядолей люпина.

Несмотря на то, что эндогенное содержание цитокинона - зеатина в семядолях люпина в возрасте 3 дней составляет 14 нМ (Kusnetsov et al., 1994), в экспериментах диапазон концентраций 6-БАП варьировал! от 1 мкМ до 200 мкМ. Было обнаружено, что синтетический цитокинин уменьшает долю цианид-резистентного дыхания в общем дыхании- семядолей люпина. Однако это изменение происходит за счет различных механизмов — в малых концентрациях гормона (1-22 мкМ) за счет активации общего дыхания, точнее, цитохромного пути митохондриального окисления, повышение же концентрации БАЛ (50 мкМ и 100 мкМ) приводило к снижению именно максимальной скорости альтернативного пути окисления.

Известно, что добавление 6-БАП к суспензии митохондрий приводит к подавлению дыхания, которое происходит за счет подавления альтернативного пути окисления (Miller, 1979, 1980; Vankova et al., 1991), либо за счет ингибирования ротенон-чувствительной НАДН-дегидрогеназы (комплекса I) (Chauveau et al., 1983; Sue et al., 1997). В данной работе впервые продемонстрирована активация общего дыхания семядолей низкими концентрациями БАЛ за счет активации цитохромного пути окисления, поэтому t изучение именно этого эффекта стало приоритетным направлением дальнейших исследований.

С целью изучения возможного механизма действия цитокинина на дыхание было изучено влияние 22 мкМ БАЛ на экспрессию митохондриальных генов, а также ядерных генов, кодирующих интересующие нас белки митохондрий, в первую очередь АО. Предполагалось, в частности, обнаружить изменение экспрессии генов АО, ответственных за функционирование данного пути. Ранее на культуре клеток A. thaliana, М. truncatula и N. tabacum было показано, что длительная культивация (от 24 часов и более) в среде, содержащей 27 мкМ 6-БАП, вызывает гибель клеток, которая может превышать гибель в необработанной культуре в два раза. Известно, что при ПКС наряду со многими изменениями на молекулярном уровне, происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, и активация альтернативного дыхания. Экспериментальная система, используемая нами, предполагает 12-ти часовое воздействие гормона на ткань, что, в контексте вышеизложенных фактов, не исключает возможной активации альтернативного дыхания и индукции АО. Однако обработка семядолей люпина 22 мкМ 6-БАП не выявила достоверных изменений на уровне накопления мРНК и содержания белка АО, что согласуется с результатами экспериментов по определению эффекта гормона на уровне дыхания ткани.

Изучение влияния цитокинина на цитохромный путь было проведено на уровне интенсивности транскрипции индивидуальных митохондриальных генов -первом этапе реализации генетической информации, для чего были выбраны гены, кодирующие субъединицы различных комплексов ЭТЦ: комплекса I - ndh3, ndh6, ndh9; комплекса III - cob; комплекса IV - ccmB, coxl и сохЗ; а, кроме того, ген, кодирующий субъединицу АТФ-синтазного комплекса - atp9. Кроме того для анализа также использовались компоненты собственной белок-синтезирующей системы: рибосомные РНК - ггп26 и ггп18 гены, рибосомные белки - rpsl2 и rpsl3 гены и ген транспортной РНК для изолейцина - trnl.

Анализируя полученные результаты, следует, отметить два момента. Во-первых, впервые были получены данные, которые убедительно демонстрируют снижение под влиянием БАЛ интенсивности транскрипции практически всех изученных генов. Такой результат может говорить о влиянии цитокинина как на общие факторы транскрипции, так и на белковые факторы, регулирующие транскрипцию индивидуальных генов. Таким образом, важным результатом всей работы является обнаружение того факта, что экзогенный цитокинин оказывает регуляторное влияние на экспрессию не только хлоропластного генома (Zubo et al., 2008), но также на транскрипцию митохондриальных генов.

Во-вторых, показанное снижение интенсивности транскрипции генов, кодирующих некоторые субъединицы компонентов цитохромного пути переноса электронов, происходило на фоне заметной активации цитохромного дыхания семядолей. Первым очевидным объяснением такого феномена может быть предположение о том, что активация* под влиянием БАП цитохромного пути дыхания семядолей была обусловлена активацией клеточного метаболизма. Известно, например, стимулирующее действие цитокинина на дифференцировку клеток, биосинтез белка (Кулаева, 1973; Мок and Мок, 2001), ассимиляцию нитрата (Parcash, 1982; Кулаева, Кузнецов, 2002), активность цитоплазматической АТФазы (Kuiper et al., 1992; Kotyk et al., 1996) и (Других энергопотребляющих процессов. В таком случае, заметное увеличение активности цитохромного пути митохондриального окисления под влиянием цитокинина, может быть вызвано, не столько активацией каких-то компонентов самой ЭТЦ, сколько переходом митохондрий в более активное состояние (состояние 3), вследствие увеличения потребности клеток в энергии. Возможно также, что активация цитохромного дыхания происходит за счет активации экспрессии генов субъединиц комплексов данного пути на уровне увеличения синтеза белка или активности самого фермента. Согласно данному предположению под действием 6-БАП происходит увеличение времени полураспада мРНК и на фоне увеличения ее стабильности отпадает необходимость в интенсивной транскрипции соответствующих генов.

Однако, очевидно, что необходимы новые экспериментальные данные для объяснения механизма действия цитокинина на дыхание.

Таким образом, в данной диссертационной работе впервые продемонстрировано влияние СК и 6-БАП на дыхание семядолей люпина. Несмотря на то, что вопрос о детальном механизме действия фитогормонов на дыхание остается открытым, из представленных результатов следует, что действие изученных гормонов оказалось комплексным, затрагивающим (причем, иногда дифференцированно) активность основного (цитохромного) и альтернативного (ОчГ-резистентного) пути электронного транспорта в ЭТЦ митохондрий. При этом фитогормоны могут оказывать свое влияние на дыхание как непосредственно активируя или ингибируя активность или биосинтез компонентов ЭТЦ, в частности, активность и биосинтез АО, так и, по-видимому, опосредовано, изменяя напряженность клеточного метаболизма. При этом характер действия экзогенных гормонов на дыхание растений в значительной степени зависит от условий эксперимента, концентрации гормонов, времени инкубации ткани и т.д.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белозерова, Наталья Сергеевна, Москва

1. Ванюшин Б.Ф. (2001) Апоптоз у растений. Успехи биологической химии, 41, 338

2. Грабельных О.И. (2005) Энергетические функции митохондрий растений в стрессовых условиях. Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 1, 37-54.

3. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2003) Митохондриальный комплекс I. Успехи биол. химии, 43, 19-58.

4. Даниленко Н.Г, Давыденко О.Г. (2003) Миры геномов органелл. Мн.: Технология, 494 с.

5. Зарипова Н.Р., Зубо Я.О., Кравцов А.К., Холодова В.П., Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В. (2008) Тяжелые металлы вызывают дифференциальную регуляцию транскрипции пластидных генов и блокирование сплайсинга мРНК. Докл. АН, 423, 124-128.

6. Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2008) Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома. Физиология растений, 55, 114122.

7. Колеснеченко О.А., Энтелис Н.С., Крашенинников И.А., Мартэн Р.П., Тарасов И.А. (2004) Импорт тРНК в митохондрии. Успехи биологической химии, 44, 53-78:

8. Кулаева О.Н (1973) Цитокинины, их структура и функция М.: Наука, 422 с.

9. Кулаева О.Н. (1982) Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. 41-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 83 с.

10. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2002) Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. Физиология растений, 49, 626-640.

11. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. (2004) Новейшие достижения в изучении механизмов действия фитогормонов. Биохимия, 69,293-310.

12. Ленинджер А. (1966) Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции. М.: Мир, 43 с.

13. Лузиков В.Н. (2009) Принципы контроля за формированием структур, осуществляющих дыхательные функции митохондрий. Успехи биологической химии, 49, 77-106.

14. Одинцова М.С., Юрина Н.П. (2002) Геном митохондрий протестов. Генетика, 38, 773-788.

15. Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Грабельных О.И. (2004) Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез. М.: НПК Промэкобезопасность, 99.

16. Полесская О.Г. (2005) Дыхание растений. Физиология растений, под ред. Ермакова И.П. М.* Академия, 212-276.

17. Романов Г.А. (2009) Как цитокинины действют на клетку. Физиология растений, 56, 295-319.

18. Хворостовский И.Б., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. (2002) Митохондриальный геном высших растений: регуляция генной экспрессии. Молекулярная биология, 36, 408-417.

19. Ченцов Ю.С. (2004) Введение в клеточную биологию. Общая цитология. М.: Академкнига, 495 с.

20. Шугаев А.Г. (1999) Альтернативная CN-резистентная оксидаза митохондрий растений: структурная организация, механизмы регуляции активности и возможная физиологическая роль. Физиология растений, 46, 307-320.

21. Юрина Н.П., Одинцова М.С. (2010) Сигнальные системы митохондрий, ретроградная регуляция у растений. Физиология растений, 57, 7-19.

22. Albure M.S. Elliot С., Moore A.L. (2009) Towards a structural elucidation of the alternative oxidase in plats. Physiol. Plant., 137, 316-327.

23. Alvarez M.E. (2000) Salycil acid in the machinery of hipersensetive cell death and disease resistant. Plant Mol. Biol., 44,429-442.

24. Amor Y., Chevion M., Levine A. (2000) Anoxia pretreatment protects soybean cells against H202-induced cell death: possible involvement of peroxidases and of the altarnative oxidase. FEBSLett., 477, 175-180.

25. Andre C., Levy A., Walbot V. (1992) Small repeated sequences and the structure of the plant mitochondrial genomes. TRENDS in Genetics, 8, 128-132.

26. Arnholdt-Schmitt В., Costa J.H., de Melo D.F. (2006) AOX a functional marker for efficient cell reprogramming under stress? TRENDS in Plant Science, 11,281-287.

27. Backert S., Nielsen B.L., Borner T. (1997) The mystery of the rings: structure and replication of the mitochondrial genomes from higher plants. TRENDS in Plant Science, 2, 477-483.

28. Bendall' D.S., Bonner W.D.Ir. (1971) Cyanid-insensitive respiration in plant mitochondria. Plant Physiol., 47, 236-245.

29. Berry E.A., Guergova-Kuras M., Huang L.S., Crofts A.R. (2000) Structure and function of cytochrome be complexes. Annu. Rev. Biochem., 69, 1005-1075.

30. Berthold D.A., Stenmark P, (2003) Membrane-bound diiron carboxylate proteins. Annu Rev. Plant. Biol., 54, 497-517.

31. Berthold D.A., Voevodskaya N., Stenmark P., Graslund A., Nordlund P. (2002) EPR studies of the mitochondrial alternative oxidase: evidence for a diiron carboxylate center. J. Biol. Chem., 277,43608-43614.

32. Binder S., Brennicke A. (2002) Gene expression in plant mitochondria: transcriptional and post-transcriptional control. Philos. Trans. R. Soc. bond. B. Biol. Sci. B, 358, 181-189.

33. Binder S., Marchhfelder A., Brennike A. (1996) Regulation of gene expression in plant mitochondria. Plant Mol. Biol., 32, 303-314.

34. Borsani O., Valpuesta V., Botella M.A. (2001) Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by nacl and osmotic stress in arabidopsis seedlings. Plant Physiol., 126,1024-1030.

35. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal Biochem., 72, 248-54.

36. Braun H.P., Emmermann M., Kruft V., Bodicker M., Schmitz U.K. (1995) The general mitochondrial processing peptidase from wheat is integrated into the cytochrome be J complex of the respiratory chain. Planta, 195, 396-402.

37. Carimi F, Zottini M, Costa A, Cattelan I; De Michele R, Terzi M, Lo Schiavo F.2005) NO signalling in cytokinin-induced programmed cell death. Plant, Cell Environment, 28, 1171-1178.

38. Chauveaui M:,. Dizengremel P., Roussaux J: (1983) Interaction of benzylaminopurine with electron transport in plant mitochondria during malate oxidation. Plant Physiol., 73, 945-948.

39. Chen H.J., Hou W.C., Kuc J:, Lin Y.HI (2001) Ca2+-dependent and Ca2+-independent excretion modes of salicylic acid in tobacco cell suspension culture. J. Exp. Bot., 52, 1219-1226.

40. Chen* Z., SilvaH., Klessig D.F. (1993) Active oxygen species in the induction of plant systemic acgiiired resistance by salicylic acid. Science, 262, 1883-1886.

41. Claros M.G., Vincens P. (1996) Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur. J. Biochem., 241, 779-786.

42. Clifton S.W., Minx P., Fauron C.M.R., Gibson M:, Allen JiO., Sun H., Thompson M:, Barbazuk W.B:, Kanuganti S., Tayloe C., Meyer L., Wilson R.K.,

43. Newton K.J. (2004) Sequence and comparative analysis of the maize NB mitochondrial genome. Plant Physiol 136, 3486-3503.

44. Considine M.J1, Holtzapffel R.C., Day D.A., Whelan J., Millar A.H.(2002)

45. Molecular distinction between alternative oxidase from monocots and dicots. Plant Physiol., 129, 949-953.

46. Cruz-Hernmdez A., Miguel Angel Gjmez-Lim M.A. (1995) Alternative oxidase from mango (Mangifera indica, L.) is differentially regulated during fruit ripening. Planta, 197, 569-576.

47. Day D.A., Millar A.HJ, Wiskicht J.T., Whelan J. (1994) Regulation of alternative oxidase activity by pyruvate in soybean mitochondria. Plant Physiol, 106, 1421-1427.

48. Dizengremel P., Chauveau M., Roussaux J. (1982) Inhibition by adenine derivatives of the cyanide-insensitive electron transport pathway of plant mitochondria. Plant Physiol, 70, 585-589.

49. Dodd I.G. (2003) Hormonal interaction and stomatal responses. J. Plant Growth Regul, 22, 32-46.

50. Douce R. (1985) Mitochondria in higher plants. In: Functions of Plant Mitochondrial Membranes, London: Academic Press, 77-153.

51. Douce R., Bourguignon J., Brouquisse R., Neuburger M. (1987) Isolation of Plant Mitochondria. Methods Ezymol., 148, 403-415.

52. Douce R., Moore A.L., Neuburger M. (1977) Isolation and oxidative properties of intactmitochondria isolated from spinach leaves. Plant Physiol, 60, 625-628.

53. Dudkia N.V., Heinemeyer J., Sunderhaus S., Boekema E.J., Braun H.P. (2006) Respiratori chain supercomplexes in the plant mitochondrial membrane. TRENDS in plant Science, 11, 232-240.

54. Dudkina N.V., Heinemeyer J., Keegstra W., Boekema E.J., Braun H.P. (2005) Structure of dimeric ATP synthase from mitochondria: an angular association of monomers induces the strong curvature of the inner membrane. FEBS Lett., 579, 57695772.

55. Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. (2006) Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis: intraorganelle location and expression. Plant Cell. Physiol., 47," 43-54.

56. Elthon.T.E., Mcintosh L. (1987) Identification of the alternative terminal oxidase of higher plant mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8399-8403.

57. Elthon T.E., Nickels R.L., Mcintosh L. (1989) Monoclonal antibodies to the alternative oxidase of higher plant mitochondria. Plant Physiol, 89, 1311-317.

58. Elyhon T.E., Nickel R.L., Mcintosh L. (1989) Mitochondrial events during development of thermogenesis in Sauromantum giittatum (Shott). Planta. 180, 82-89.

59. Fay J:, Marechal-Drouard L. (1999) Compilation and analysis of plant mitochondrial promoter sequences: an illustration of a divergent evolution between monocot and dicot mitochondria. Biochem Biophys Res Commtin, 256, 409-414.

60. Ferreira A.L., Arraba?a J:D., Vaz-Pinto V., Lima-Costa M;E. (2008) Induction of alternative oxidase chain under salt stress conditions. Biol. Plant., 52, 66-71.

61. Finnegan P.M., Whelan J., Millar A.H., Zhang Q., Smith M.K., Wiskich J.T., Day DiA. (1997) Differential expression of the multigene family encoding the soybean mitochondrial alternative oxidase. Plant Physiol, 114, 455-466.

62. Folkerts O., Hanson M. (1991) The male sterility-associated pcf gene and the normal atp9 gene in Petunia are located on different sub-genomic mitochondrial DNA molecules. Genetics, 129, 885-895.

63. Gaston»S., Ribas-Carbo M., Busquets S.M., Berry J.A., Zabalza A., Royuela M.2003) Changes in mitochondrial electron partitioning in response to herbicides inhibiting branched-chain amino acid biosynthesis in soybean. Plant Physiol, 133, 1351-1359.

64. Giege P., Brennicke A. (2001) From gene to protein in higher plant mitochondria. Life Sciences, 324,209-217.

65. Giege P., Hoffmann M., Binder S., Brennicke A. (2000) RNA Degradation Buffers Asymmetries of Transcription in Arabidopsis Mitochondria. EMBO J., 1, 164170.

66. Guillot-Salomon T., Remy R., Cantrel C., Demandre C., Moreau F. (1997) Phospholipids and Polypeptides in the Outer Membrane of Maize Mitochondria. Phytochemistry, 44,29-43.

67. Halden C., Lind C., Bryngelsson T. (1989) Minicircle variation in Beta mitochondrial DNA. Theor. Appl. Gen., 77, 337-342.

68. Hall R.H. (1973) Cytokinins as a probe of developmental processes. Annu. Rev. Plant Physiol., 24,415-444.

69. Hedtke B., Borner T., Weihe A. (2000) One RNA polymerase serving two genomes. EMBO Rep., 1, 435^140.

70. Hedtke B., Wagner I., Börner T., Hess W.R. (1999) Inter-organellar crosstalk in higher plants: impaired chloroplast development affects mitochondrial gene and transcript levels. The Plant Journal., 19, 635-643.

71. Hanson M., Folkerts O. (1992) Structure and function of the higher plant mitochondrial genome. Int. Rev. Citol., 141, 129-172.

72. Horsefleld R., Iwata S., Byrne B. (2004) Complex II from a structural perspective. Curr. Protein Pept. Sei., 5, 107-118.

73. Humphreygs G.O., Willshaw G.A., Brownm G.M., Saunderjs R. (1979). Plasmid transformation in Escherichia coli. In Transformation, S. W. Glover and L. 0. Butler (ed.), Cotswold Press, Oxford, 254- 279.

74. Ikeda T.M., Gray M.W. (1999) Identification and characterization of T3/T7 bacteriophage-like RNA polymerase sequences in wheat. Plant Mol. Biol., 40, 567-578.

75. Jukes T.H., Osawa S. (1990) The genetic code in mitochondria and chloroplasts. Experientia, 46,1117-1126.

76. Juszczuk I.M., Rychter A.M. (2003) Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polanica, 50, 1257-1271,

77. Kemble R.J., Bedbrook J.R. (1980) Low molecular weight circular and linear DNA in mitochondria from normal and male sterile Zea mayz cytoplasm. Nature, 284, 565-566.

78. Kerscher S.J. (2000) Diversity and origin of alternative NADH:ubiquinone oxidoreductases. Biochim. Biophys. Acta., 1459, 274-283.

79. Kotyk A., Kaminek M., Pulkrabek J., Zahradnicek J. (1996) Effect of in vivo and in vitro application of the cytokinin N6-(m-hydroxybenzyl)adenosine on respiration and membrane transport processes in sugar beet. Biologia Plantarum, 38, 363-368.

80. Kulinsky V.I., Kolesnichenco L.S. (2007) Regulation of metabolic and energetic functions of mitochondria by hormones and signal transduction systems. Biomedical Chem., 1,95-113.

81. Kurlovich B.S. (2002) Lupins. Geography, classification, genetic resources and Breeding. St. Peterburgrlntant, 468 p.

82. Kyte J., R.F. Doolittle (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol., 157 105-132.

83. Lacomme Ch., Roby* D. (1999)> Identification of new early markers of the hypersensitive response in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 459,' 149-153.

84. Leslie C.A., Romani R.J. (1988) Inhibition of Ethylene Biosynthesis by Salicylic Acid. Plant Physiol, 88, 833-837.

85. Marzluff W.F. (1978) Transcription of RNAin isolated nuclei. Methods Cell Biol., 19,317-331.

86. Matos A.R., Mendes A.T., Campos P.S., Arraba?a J.D. (2008) Study of the effects of salicylic acid on soybean mitochondrial lipids and respiratory properties using the alternative oxidase as a stress-reporter protein. Physiol Plant., 137,485-497.

87. Maxwell' D.P., Nickels R., Mcintosh L. (2002) Evidence of mitochondrial involvement in the transduction of signals required for the induction of genes associated with pathogen attack and senescence. Plant J., 29, 269-79.

88. Meeuse B.J.D. (1975) Thermogenic respiration in aroids. Annu. Rev. Plant Physiol, 26, 117-126.

89. Melo A.M.P., Duarte M., Mailer I.M. (2001) NDE1 is the external calcium-dependent NADPH dehydrogenase in Nearospora crassa mitochondria. J. Biol. Chem., 276, 3947-3951.

90. Melo A.M.P., Roberts T.H., Moller I.M. (1996) Evidence for the presence of two rotenone-insensitive NAD(P)H dehydrogenases on the inner surface of the inner membrane of potato tuber mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 1276, 133-139.

91. Millar A.H., Eubel Hi, Jansch L., Kruft V., Heazlewood J.L., Braun H.P. (2004) Mitochondrial cytochrome c oxidase and succinate dehydrogenase contain plant-specific subunits. Plant Mol. Biol., 56, 77-89.

92. Millar A.H., Heazlewood J.L., Kristensen B.K., Braun H:P., Moller I.M. (2005) The plant mitochondrial proteome. Trends Plant Sci 10, 36-43.

93. Millar A.H., Wiskich J.T., Whelan J., Day D.A. (1993) Organic acid activation of the alternative oxidase of plant mitochondria. FEBSLett., 329, 259-262.

94. Miller C.O. (1979) Cytokinin inhibition of respiration by cells and mitochondria of soybean, Glycine max (L.) Merrill. Planta, 146, 503-511.

95. Miller C.O. (1980) Cytokinin inhibition of respiration in mitochondria from six plant species. Proc Natl Acad Sci USA., 77, 4731-4735.

96. Miller C.O. (1982) Cytokinin modification of mitochondrial function. Plant Physiol, 69,1274-1277.

97. Miller G., Suzuki N., Ciftic-Yilmaz S., Mittler R. (2010) Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant, Cell & Environment, 33,453-467.

98. Mok D.W.S., Mok MiC. (2001) Cytokinin metabolism and actions. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 52, 89-118.

99. Moller I.M. (2001) Plant mitochondria and oxidative stress. Electron transport, NADPH turnover and metabolism of reactive oxygen species. Annu Rev Plant Physiol Plant. Mol. Biol., 52, 561-591.

100. Moore A.L., Albure M.S. (2008) Furthe insights into the structure of the alternative oxidase: from plants to parasites. Biochem. Society Transactions, 36, 1022-1026.

101. Mulliga R.M., Lau G.T., Walbot V. (1988) Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase./Voc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7998-8002.

102. Neill S.J., Desikan R., Clarke A., Hancock J.T. (2002) Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signaling in stomatal guard cells. Plant Physiol, 128,13-16.

103. Nicholls, D.G., Ferguson, S.J. (2002). Bioenergetics. Academic Press, London. 297 P

104. Noguchi K., Yoshida K. (2008) Interaction between photosynthesis and respiration in illuminated leaves. Mitochondrion, 8, 87-99.

105. Norman, C., Howell, K. A., Millar, A. H., Whelan, J. M., Day, D. A. (2004) Salicylic acid is an uncoupler and inhibitor of mitochondrial electron transport Plant Physiology, 134, 492-501.

106. Nunes-Nesi A., Fernie A.R. (2007) Mitochondrial Metabolism. Annual Plant Reviews Plant Mitochondria, 31, 212-277.

107. Okada S., Brennicke A. (2006) Transcript levels in plant mitochondria show a tight homeostasis during day and night. Mo. Gen. Genomics, 276, 71-78.

108. Palmer J.D., Shields C.R., Cohen B.D., Orton T.G. (1983) An unusual mitochondrial DNA plasmid in the genus Brassica. Nature, 307, 437-440.

109. Panicker L., Mishra K.P. (2005) Salicylic acid-induced effects in the mixed-lipid (dipalmitoyl phosphatidylcholine-dipalmitoyl phosphatidylethanolamine) model membrane. Journal of Colloid and Interface Science, 290, 250-258.

110. Parcash V. (1982) Involvement of cytokinins and other growth regulating substances in in nitrate assimilation — a review. Plant Physiol Biochem., 9, 48-53.

111. Polidoros A.N., Mylona P.V., Arnholdt-Schmitt B. (2009) Aox gene structure, transcript variation and expression in plants. Physiol Plant., 4, 342-53.

112. Prasad T.K., Anderson M.D., Stewart C.R. (1994) Acclimation, hydrogen peroxide, anr abscisic acide protect mitochondria against irreversible chikking injury in maize seedlings. Plant Physiol, 105, 619-627.

113. Purvis A.C., Shewfelt R.L. (1993) Does the alternative pathway ameliorate chilling injury in sensitive plant tissues? Physiologia Plantarum, 88, 712-718.

114. Rachmilevitch R., Xu Y., Gonzalez-Meier M.A., Huang B.R., Lambers H. (2007) Cytochrome and alternative pathway activity in roots of thermal and non-thermal Agrostis species in response to high soil temperature. Physiol Plant., 129: 163-174.

115. Raskin I., Turner I.M., Melander W.R. (1989) Regulation of heat production in the inflorescences of an Arum lily by endogenous salicylic acid. Proc. Natl Acad. Sci. 86, 2214-2218.

116. Rasmusson A.G., Heiser V., Zabaleta E., Brennicke A., Grohmann L. (1998) Physiological, biochemical and molecular aspects of mitochondrial complex I in plants. Biochim. Biophys. Acta., 1364,101-111.

117. Rasmussonv A.G., Soole K.L., Elthon T.E. (2004) Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria. Annu. Rev. Plant. Biol., 55, 23-39.

118. Reisner D., GrossH.J. (1985) Viroids. Annu. Rev. Biochem., 54, 531-564.

119. Rhoads D.M., Chalivendra C.S. (2007) Mitochondrial retrograde regulatin in plants. Mitochondrion, 7, 177-194.

120. Rhoads D.M., Mcintosh L. (1992) Salicylic acid regulation of respiration in higher plants: Alternative oxidase expression. Plant Cell, 4, 1131-1139.

121. Richter O.M., Ludwig B. (2003) Cytochrome c oxidase structure, function, and physiology of a redox-driven molecular machine. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 147, 47-74.

122. Richter U., Kiessling J., Hedtke B., Decker E., Reski R., Borner T., Weihe A.2002) Two RpoT genes of Physcomitrella patens encodephage-type RNA polymerases with dual targeting to mitochondria and plastids. Gene., 290, 95-105.

123. Robson C.A., Vanlerberghe G.C. (2002) Transgenic plant cells lacking mitochondrial alternative oxidase have increased susceptibility to mitochondria-dependent and-independent pathways of programmed cell death. Plant Physiol, 129, 1908-1920.

124. Schardl C.L., Lonsdale D.M:, Pring D.R., Rose K.R. (1984) Linearization of maize mitochondrial chromosomes by recombination with linear episomes. Nature, 310, 292-296.

125. Schonbaum R.G., Bonner W.D.Ir., Storey BiT., Bahr J.T. (1971) Specific inhibition of the cyanide-insensitive respiration pathway in plant mitochondria by hidroxamic acids. Plant Physiol, 47, 124-128.

126. Schuster W., Brennicke A. (1994) The plant mitochondria genome: physical structure, information content, RNA editing and gene migration to the nucleus. Annu. Rev. Plant Physiol PlamtMol Biol, 45, 61-78.

127. Seymour R.S., Schlultze-Motel P. (1996) Thermoregulating lotus flowers. Nature, 383, 305.

128. Siedow J.N., Umbach A.L:, Moore A.L. (1995) The active site of the cyanide-resistent oxidase from plant mitochondria containt a binuclear iron center. FEB S Lett., 362, 10-14.

129. Small I.D., Suffolk R., Leaver C.J. (1989) Evolution of plant mitochondria genomes via substoichiometric intermediates. Cell, 58, 69-76.

130. Stock D., Gibbons C., Arechaga I., Leslie A.G., Walker J.E. (2000) Rotaiy mechanism of ATP synthase. Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 672-679.

131. Stoscheck C. (1990) Quantification of Protein. Methods in Enzymology, 182, 50-68.

132. Tanudji M., Sjoling S., Glaser E., Whelan J. (1998) Signals Required for the Import and Processing of the Alternative Oxidase into Mitochondria. J. Biol. Chem., 214,, 1286-1293.

133. Taylor N.L., Heazlewoodt J.L., Day D.A., Millar A.H. (2005) Differential impact of environmental stresses on the pea mitochondrial proteome. Mol. Cell. Proteomics, 4, 1122-1133.

134. Unseld;Mi, Marienfeld J.R., BrandtoP., Brennicke A. (1997) The mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana contains 57 genes in 366924 nucleotides. Nat. Genet., 15, 57-61.

135. Van- Aken: O:, Giraud' E., Clifton R;, Whelam JL (2009) Alternative oxidase: a target and regulator of stress responses. Physiol. Plant., 137, 354-361.

136. Vankova R., Hsiao K.C., Bornman C.H., Gaudinova A. (1991) Effects of synthetic cytokinins on levels of endogenous cytokinins and respiration Patterns of Beta vidgaris cells in suspension. Plant Growth Regulation., 10,197-199.

137. Vanlenberge G.C., Yip J.Y.H., Parsons H.I,. (1999) In organelle and in vivo evidence of the importance of the regulatory sulfhydryl/disulfide system and piruvate for alternative oxidase activity in tobacco. Plant. Physiol., 100, 115-119.

138. Vanlerberghe G.C., Robson C.A., Yip J.Y.H. (2002) Induction of mitochondrial alternative oxidase in response to a cell signal pathway down-regulating the.cytochrome pathway prevents programmed cell death. Plant Physiol., 129, 1829-1842.

139. Vercesi A.E. (2001) The discovery of an uncoupling mitochondrial protein in plants. Biosci. Rep., 21, 195-200.

140. Vojnikov V., Korzun A., Pobezhimova T., Varakina N. (1984) Effect cold shock on the mitochondrial activity and on the temperature of winter wheat seedlings.B/oc/z/V». Physiol. Pflanz., 179, 327-330.

141. Wagner A.M. (1995) A role for active oxygen species as second messengers in the induction of alternative oxidase gene expression in Petunia hybrida. FEBS Lett., 368, 339-342.

142. Wallace D.C. (2005) A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Ann. Rev. Genet., 39, 359407.

143. Wang H., Liang X., Huang J., Zhang D., Lu H., Liu Z., Bi Y. (2010) Involvement of Ethylene and Hydrogen Peroxide in Induction of Alternative Respiratory Pathway in Salt-Treated Arabidopsis Calluses. Plant Cell Physiol 51, 1754-1765.

144. Weihe A. (2004) The transcription of plant organelle genomes. In: Molecular Biology and Biotechnology of Plant Organelles. Chloroplasts and Mitochondria. H. Daniell, C. Chase (eds.) Springer, Dordrecht, 213-237.

145. Yang J., Zhang M., Yu J. (2008) Mitochondrial retrograde regulation tuning fork in 1 nuclear genes expressions of higher plants. J. Genet. Genomics, 35, 65-71.

146. Yoshidal K., Noguchi K. (2009) Differential gene expression profiles of themitochondrial respiratory components in illuminated Arabidopsis leaves. Plant Cell1. Physiol., 50, 1449-1462.

147. Zhang- L., Xing- D.' (2008) Methyl Jasmonate Induces Production of Reactive Oxygen Species and Alterations in Mitochondrial Dynamics that Precede Photosynthetic Dysfunction and Subsequent Cell Death. Plant Cell Physiol., 49, 1092-1 111.

148. Zhang Y., Chen K., Zhang S., Ferguson I. (2003) The role of salicylic acid in , postharvest ripening of kiwifruit. Postharvest Biology and Technology., 28, 61-1 A.

149. Zottini M., Alex Costal A., De Michele R., Ruzzene M., Carimi F., Lo Schiavo. F. (2007) Salicylic acid activates nitric oxide synthesis in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 58, 1397-1405.

150. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (дополнение).

151. Лакин Г.Ф. (1973) Биометрия. М.: Высшая школа, 343 с.

152. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (1999) Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений. Биохимия, 64, 1457-1472.

153. Шольц К.Ф.,Островский Д.Н. (1975) Ячейка для амперометрического определения кислорода. Методы современной биохимии, Под. ред. Кретовича В.Л., Шольца К.Ф. М.: Наука, 52-58.

154. Dezsi L., Farkas G.L. (1964) Effect of kineti on enzymes of glycolic acid metabolism i cereal leaves. Acta Biol. Hung., 14, 325-332.

155. Djajanegaral I., Finnegan P.M., Mathieul C., McCabel Т., Whelanl J., Dayl

156. D.A. (2002) Regulation of alternative oxidase gene expression in soybean. Plant Molecular Biology, 50,735-742.

157. Eubel et al., 2003 = Millar A.H., Eubel H., Jansch L., Kruft V., Heazlewood J.L., Braun H.P. (2004) Mitochondrial cytochrome с oxidase and succinate dehydrogenase contain plant-specific subunits. Plant Mol. Biol., 56, 77-89.

158. Hunte C., Koepke J., Lange C., Rossmanith Т., Michel H. (2000) Structure at 2.3 A resolution of the cytochrome bc(l) complex from the yeast Saccharomyces cerevisiae co-crystallized with an antibody Fv fragment. Structure, 8, 669-84.

159. Krause K., Dierckmann C.L. Analysis of transcription asymmetries along the tRNAE-COB operon: evidence for transcription and rapid rna degradation between coding sequences. Nucleic Acids Res., 32,6276-6283.

160. Kuiper D., Sommarin M., Kylin A. (1991) The effects of mineral nutrition and benzyladenine on the ATPase activity from roots of wheat and plantago major ssp. Pleiosperma. Physiol. Plantarum, 81, 169-174.

161. Kuiper D., Sommarin M., Kylin A. (1992) The modulation effects of pH and benzyladenine on the Ca2+ and Mg2+ ATPases in the plasmalemma of wheat root cells. Physiol. Plantarum, 84, 367-373.

162. LaemmllU.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

163. Lennon, A.M., Neuenschwander, U.H., Ribas-Carbo, M., Giles, L., Ryals, J.A., and Siedow, J.N. (1997) The effects of salicylic acid and tobacco mosaic virus infection on the alternative oxidase of tobacco. Plant Physiol. 115, 783-791.

164. Moller I.M., Berczi A., van der Plas L.H.W., Lambers H. (1988) Measurement of the activity and capacity of the alternative pathway in intact plant tissues: identification of problems and possible solutions. Physiol. Plant., 72, 642-649.

165. Schlax P.J, Worhunsky D.J. (2003) Translational repression mechanisms in prokaryotes. Mol Microbiol, 48, 1157-1169.

166. Sue M., Miyoshi H., Iwamura H. (1997) Specific interactio of cytokiins and their analogs with rotenone-sensitive internal NADH degidrogenase in potato tuber mitochondria. Biosci. Biotech. Biocchem., 61, 1806-1809.

167. Sun Y.L., Zhao Y., Hong X., Zhai Z:H. (1999). Cytochrome c release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants. FEBS Lett., 462, 317-321.

168. Xie Z., Chen Z. (1999) Salicylic acid induces rapid inhibition of mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation in tobacco cells. Plant Phys., 120, 217225.

169. Zottini M., Barizza E., Bastianelli F., Carimi F., Schiavo F.L. (2006) Growth and senescence of Medicago truncatula cultured cells are associated with characteristic mitochondrial morphology. New Phytologist, 172, 239-247.

Информация о работе

Белозерова, Наталья Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы