Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина"

На правах рукописи

ВЕЛИЧКО Артём Константинович

ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА РЕПЛИКАЦИЮ ДНК, СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА И СТРУКТУРУ ХРОМАТИНА

03.01.03 - молекулярная биология 03.01.07 — молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 НОЯ 2012

Москва - 2012

005054115

005054115

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Разин Сергей Владимирович

член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор

Кантидзе Омар Леванович кандидат биологических наук

Коробко Игорь Викторович доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной онкогенетики

Гиоева Фатима Константиновна кандидат биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится ¿^ноября 2012 года в 11 час. на заседании

диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан IX октября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизмы реакции эукариотической клетки на стресс сложны и многообразны. Тепловой шок является одним из наиболее агрессивных типов стресса, поскольку он оказывает повреждающее действие практически на все клеточные компоненты. При тепловом стрессе происходит остановка процессов макромолекулярного синтеза, денатурация и агрегация белков, дестабилизация систем регуляции клеточного цикла, нарушение процессов сплайсинга, репарации и др. При этом для предотвращения фатальных последствий клетки запускают экспрессию высококонсервативных белков, известных как белки теплового шока. На нескольких модельных организмах было показано, что в условиях гипертермии более сотни генов начинают активно транскрибироваться. Однако экспрессия многих других генов может быть репрессирована. К ним относятся гены, кодирующие компоненты сигнальных путей, ферменты метаболизма РНК и биосинтеза нуклеотидов, компоненты систем транскрипции, трансляции, контроля клеточного цикла и др. Долгое время механизмы специфичной термоиндуцируемой репрессии генов оставались неясными. Сейчас стало известно, что РНК, кодируемая А1и-повторами (один из типов ЭПЧЕ), может выступать в роле транскрипционного репрессора, ингибируя РНК-полимеразу II в условиях гипертермии. Однако до сих пор нет сведений об участии репрессорных белков в регуляции транскрипции при тепловом шоке. На роль таковых лучше всего подходят белки гетерохроматиновых доменов, осуществляющие сайленсинг специфичных генов. Один из них, белок НР1а (гомолог белка НР1 Ого.юркПа melanogaster) не связывается с ДНК напрямую, а образует макромолекулярные комплексы с метилированным остатком лизина 9 в гистоне НЗ и гистонметилазой ЭиУ39Н1, что является сигналом для инактивации транскрипционно-активных хроматиновых доменов. Между тем, функциональная активность НР1а и других репрессорных белков при гипертермии практически не изучена. Поэтому исследование роли белка гетерохроматина НР1а в клеточном ответе на тепловой стресс, позволит лучше понять фундаментальные механизмы, лежащие в основе масштабной транскрипционной репрессии генов. Более того, изучение поведения белка НР1а при гипертермии расширит наше представление о структуре хроматина и изменениях в ней, связанных с клеточным ответом на стресс.

Кроме белков, тепловой шок имеет ещё одну возможную мишень - ДНК. В истории изучения действия высоких температур на клетку был период, когда считалось, что тепловой шок не приводит к возникновению двуцепочечных разрывов ДНК (ДЦР), а

1

вызывает только однонитевые разрывы, связанные исключительно с ингибированием репликации. Однако за последние десять лет несколько исследовательских групп продемонстрировали, что тепловой шок может индуцировать фосфорилирование гистона Н2АХ, что является одним из первых событий в процессах узнавания и репарации ДЦР. Тем не менее, интерпретация этих результатов достаточно противоречива: некоторые исследовательские группы утверждают, что фокусы фосфорилированного гистона ШАХ (уН2АХ) маркируют исключительно двуцепочечные разрывы ДНК, индуцированные температурой; другие авторы склонны считать, что тепловой шок сам по себе не приводит к повреждению ДНК, а уН2АХ в этом случае является побочным продуктом клеточного ответа на стресс. Исходя из этого, изучение роли фосфорилирования Н2АХ при тепловом шоке представляет значительный интерес. Потенциально это может раскрыть новые функциональные свойства уН2АХ, а также лучше понять принципы поддержания структурной и функциональной стабильности генома в условиях стресса.

Хотя настоящая работа имеет четко выраженный фундаментальный характер, полученные результаты могут иметь и определенное практическое приложение. Гипертермия является общеизвестным методом лечения онкозаболеваний. Сочетание химиотерапии и гипертермии увеличивает эффективность терапии различных форм опухолей. Поэтому результаты настоящей работы могут быть использованы для создания более эффективных терапевтических стратегий. Все сказанное определяет актуальность темы данной диссертационной работы, которая посвящена изучению эпигенетических механизмов клеточного ответа на тепловой стресс.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияния теплового шока на структуру хроматина, репликацию ДНК и целостность генома.

Для реализации поставленной цели были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучение ядерной динамики белка гетерохроматина НР1а в условиях теплового шока;

2. Исследование возможности температурной индукции двуцепочечных разрывов ДНК;

3. Изучение влияния теплового шока на репликацию ДНК;

4. Идентификация функциональной роли фосфорилирования гистона Н2АХ в процессе репликации ДНК и механизмах поддержания стабильности генома при тепловом шоке.

Научная новизна и практическое значение работы. Нами впервые продемонстрировано, что при острой гипертермии (45,5°С, 30 мин) большая часть пула белка гетерохроматина НР1а диссоциирует из центромер и перераспределяется по другим (возможно, эухроматиновым) компартментам. Важно, что при этом степень компактизации центромерного гетерохроматина не изменяется. Результаты наших наблюдений позволяют предположить, что HPla не является необходимым компонентом для поддержания компактной структуры прицентромерного гетерохроматина, и в собранных гетерохроматиновых доменах НР1 выступает скорее как транскрипционный репрессор, чем структурный компонент.

Наше исследование доказывает способность гипертермии индуцировать образование двуцепочечных разрывов ДНК. Продемонстрировано, в частности, что эффект температурной индукции ДЦР зависит от стадии клеточного цикла, и характерен только для клеток, находящихся в G1- и С2-фазах. Эти двуцепочечные разрывы маркируются фосфорилированным Н2АХ, причем в данном случае фосфорилирование является ATM-зависимым. Кроме того, наши результаты позволяют однозначно утверждать, что тепловой шок приводит к аресту репликации в клетках человека. Мы продемонстрировали, что при тепловом стрессе в сайтах репликации также происходит фосфорилирование гистона Н2АХ. Однако такое фосфорилирование осуществляется не ATM, а ДНК-зависимой протеинкиназой. В работе впервые показано, что формирование доменов уН2АХ в сайтах репликации предотвращает репликативный арест при умеренной гипертермии (42, 44°С), а при остром тепловом шоке (45,5°С) «спасает» остановленные вилки от коллапса, который может служить причиной формирования двуцепочечных разрывов ДНК.

Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах поддержания структурной и функциональной стабильности генома, и процессов макромолекулярного синтеза в условиях стресса.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на пятнадцатой международной Путинской школе-конференции молодых учёных (Пущино,

2011), на международной конференции «22nd Wilhelm Berhard Workshop» (Рига, 2011), международной конференции «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Из них статей - 2, материалов конференций - 3.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах, содержит 21 рисунок, 2 таблицы и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Постановка задачи и методические подходы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» (219 цитированных работ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Роль белка гетерохроматина 1 в клеточном ответе на тепловой стресс

1.1. Кратковременный тепловой стресс не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека.

Для анализа ядерной динамики НР1 в условиях теплового стресса было использовано несколько культур клеток человека. Основные эксперименты были проведены на культуре клеток рака молочной железы (линия тс£7). Однако наиболее важные результаты были подтверждены с использованием двух других клеточных культур: иммортализованных Т-лимфоцитов (линия .Гигка!) и первичной культуры фибробластов. В работе был использован короткий тепловой стресс (30 минут) в диапазоне 42-45,5°С. На первом этапе работы необходимо было выяснить, индуцируется ли в таких условиях классическая реакция клеток на тепловой стресс, т.е. увеличивается ли уровень транскрипции генов белков теплового шока (Н5Р). Для этого с помощью количественной ОТ-ПЦР мы измеряли уровень мРНК Н8Р70, ШР40 и ЮР 105/110 в контрольных клетках и клетках, подвергнутых гипертермии. Было показано, что уровень всех перечисленных выше мРНК резко возрастал в каждой из проверенных температурных точек.

Было также необходимо проверить, влияют ли использованные нами условия теплового шока на жизнеспособность клеток. С использованием двух экспериментальных подходов - окраски трипановым синим и МТТ-теста мы показали, что клетки остаются живыми после 30-минутной инкубации при температурах 42-45,5°С. Более того, после возвращения в нормальные условия подвергнутые тепловому стрессу клетки продолжали делиться и сохраняли контрольный уровень пролиферативной активности через 3, 6 и 24 часа после стресса.

1.2. Белок гетерохроматина 1а (НР1а) диссоциирует из центромерных областей хромосом в условиях теплового стресса

С использованием метода иммуноокрашивания мы проанализировали ядерную локализацию белка гетерохроматина НР1а в клетках линии тс£-7, культивируемых в обычных условиях и подвергнутых тепловому стрессу (45,5°С, 30 минут).

НР1 alpha DAPI

Рис. 1. Перераспределение белка HPla в ядре при тепловом шоке.

(А) Распределение HPla в ядрах контрольных и подвергнутых тепловому шоку при 45,5° клетках mcf-7. Клетки окрашивали с помощью моноклональных антител против HPla. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Фотографии получены с помощью сканирующего конфокального микроскопа Leica. Масштабная полоса - 5 мкм. (Б) Вестерн-блот анализ HPla в ядрах контрольных (С) и подвергнутых тепловому шоку (HS) клеток mcf-7. Ламин В1 был использован как внутренний контроль.

НР1а1рЬа

Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 1А. Можно видеть, что в контрольных клетках НР1а организован в кластеры конденсированного хроматина. Основываясь на предыдущих исследованиях, мы предположили, что такие кластеры НР1а могут соответствовать центромерному гетерохроматину. Чтобы подтвердить это предположение, мы провели двойное иммуноокрашивание клеток антителами против НР1а и СЕМР-А, центромерного варианта гистона НЗ. В самом деле, оказалось, что регионы окрашенные антителами против НР1а колокализуются с СБИР-А-содержащими компартментами (Рис. 2А). Интересно, что в условиях острого теплового шока (30 минут 45,5°С) кластеры, сформированные НР1а, распадаются (Рис. 1А). При этом сам НР1а практически равномерно распределяется по всему пространству ядра, в то время как гистон СБИР-А сохраняет свою локализацию в ограниченном числе компартментов (Рис. 2А). На основании этого можно утверждать, что особая организация центромерного хроматина сохраняется в условиях теплового стресса несмотря на диссоциацию из него белка НР1а. Подобный эффект не был уникален для клеток тс^7. Аналогичные результаты были получены на лимфоидных клетках .Гигка! и первичных фибробластах человека. Удаление НР1а из центромерного гетерохроматина в клетках, подвергнутых тепловому стрессу, можно объяснить двумя способами. В силу тех или иных причин может происходить релокализация белка в другие геномные локусы. С другой стороны, наблюдаемый эффект может быть и следствием деградации НР1 а. Чтобы

проверить, какая из возможностей реализуется на самом деле, мы сравнили с помощью вестерн-блот анализа общее количество белка НР1а в контрольных клетках, и клетках после теплового шока. Кроме того, мы сравнили количество связанного с хроматином НР1а, который остаётся в ядрах контрольных и подвергнутых стрессу клеток после мягкой солевой экстракции (0,5М №С1). Полученные результаты показывают, что в условиях теплового стресса не происходит деградации НР1а (Рис. 1Б). Более того, количество связанного с хроматином НР1а до и после теплового шока остаётся неизменным (Рис. 1Б). Эти данные говорят о том, что тепловой шок приводит именно к перераспределению НР1а из центромер в другие геномные локусы. Следует отметить, что перераспределение НР1а является не перманентным событием, а носит обратимый характер. С использованием техники иммуноокрашивания мы продемонстрировали, что в подвергнутых тепловому стрессу клетках центромерная локализация НР1а восстанавливается после 20 часов культивирования в нормальных условиях.

1.3. Диссоциация НР1а из центромерныхучастков хромосом не связана с деметилированием остатков лизина 9 гистона НЗ (НЗК9)

Белок НР1а содержит хромодомен, благодаря чему способен распознавать и связывать ди- и триметилированный по лизину в 9 позиции гистон НЗ (НЗК9ше2 и НЗК9теЗ). Предполагается, что взаимодействие между НР1а и НЗК9теЗ необходимо для сборки и стабилизации гетерохроматина. Также известно, что у эукариотических клеток существуют ферменты способные удалять метальные группы из НЗК9. В этой связи нам представлялось интересным выяснить, происходит ли временное деметилирование НЗК9 в центромерных областях в условиях теплового стресса. Для этого контрольные и подвергнутые тепловому стрессу клетки фиксировали и окрашивали с помощью антител против НЗК9теЗ. В контрольных клетках НЗК9теЗ иммуноцитохимически выявляется в виде компактных фокусов, колоколизующихся с НР1а и СЕКР-А (Рис. 2А,Б). После теплового шока не происходит видимых изменений в характере распределения НЗК9теЗ. Иными словами, тепловой шок не вызывает массированного деметилирования НЗК9 в центромерных районах хромосом (Рис. 2Б). В полном соответствии с этим результатом, общее количество НЗК9теЗ, которое мы оценивали с использованием техники вестерн-блота, оказалось примерно одинаковым в контрольных и подвергнутых гипертермии клетках (Рис. 2В). Таким образом, ясно, что диссоциация НР1а из центромерных участков

хромосом при тепловом стрессе не связана с деметилированием НЗК9. Это свидетельствует о том, что метилирование НЗК9 в центромерных областях само по себе не является достаточным условием для депонирования НРІа в центромерном гетерохроматине.

Рис. 2. Перераспределение НР1а в условиях теплового шока не приводит к декомпактизации центромерной ДНК.

(A) Контрольные и подвергнутые тепловому шоку при 45,5°С клетки mcf-7 были иммуноокрашены антителами против HP la и CENP-A. Колокализация фокусов CENP-A и НР1 представлена жёлтым цветом на совмещённом изображении (merge).

(Б) Контрольные и подвергнутые тепловому шоку (cenp-a +'нзкэтез) клетки mcf-7 были иммуноокрашены антителами против HP la и гистона НЗ триметилированного по лизину 9 (НЗК9шеЗ). Колокализация фокусов CENP-A и НЗК9шеЗ представлена жёлтым цветом на совмещённом изображении (merge). В (А и В) ДНК окрашена с помощью DAPI. Фотографии получены с помощью мультифотонного микроскопа Zeiss LSM 510 МЕТА NLO. Масштабная полоса - 5 мкм

(B) Количество гистона НЗ метилированного по лизину 9 (НЗК9теЗ) не изменяется при тепловом шоке. Гистоны экстрагировали из контрольных (С) и подвергнутые тепловому шоку (HS) при 45,5°С клеток mcf-7. Разделение гистонов проводили с помощью гель-электрофореза в системе уксусная кислота/мочевина с последующей визуализацией НЗК9теЗ на вестерн-блоте.

1.4. Диссоциация НР1а не приводит к декомпактизации центромерных участков

Согласно современным представлениям, НР1а играет ключевую роль в

формировании гетерохроматина. В силу этого представлялось интересным выяснить,

изменяется ли степень компактизации центромерных участков хромосом после

индуцированной тепловым стрессом диссоциации НР1а. Чтобы получить ответ на этот

вопрос мы сравнили чувствительность к ДНКазе I центромерных повторов в контрольных

и подвергнутых гипертермии клетках шсГ-7, используя количественную ПЦР. Этот

8

0.5 1.0 10 100

ДНКаза I, Ед

Рис. 3. Чувствительность центромерных повторов к ДНКазе I не изменяется при тепловом стрессе.

(A) Схема организации центромерных альфа-сателлнтных повторов. Позиции праймеров, использованных для количественной ПЦР, показаны маленькими стрелками. Большая чёрная стрелка обозначает один мономер альфоидного сателлита.

(Б) Динамика расщепления сателлитной ДНК с помощью ДНКазы I в контрольных (пунктирная линия) и подвергнутых тепловому шоку (сплошная линия) при 45,5°С клетках mcf-7. 50 нг геномной ДНК, экстрагированной из ядер, было использовано в реакции расщепления с увеличивающимися концентрациями ДНКазы I. ДНКазная

чувствительность представлена как процент нерасщеплённой матрицы, рассчитанный с помощью ПЦР в реальном времени.

(B) Чувствительность к ДНКазе I гена «домашнего хозяйства» gapdh и тканеспецифичного гена beta globin в клетках mcf-7.

подход основывается на допущении, что при обработке ядер увеличивающимися концентрациями ДНКазы I, скорость деградации тестируемых ампликонов будет обратно зависима от степени компактизации ДНК.

Результаты предыдущих исследований демонстрируют, что с использованием этого подхода можно дифференцировать активно транскрибируемые и

репрессированные гены. Более того, мы применяли эту технику на клетках mcf-7, используя в качестве геномной модели /?-глобин, как неактивный в этой клеточной линии ген, и GAPDH, как активный ген «домашнего хозяйства». Мы обнаружили ожидаемую разницу в чувствительности этих генов к ДНКазе I (Рис. ЗВ). Для оценки чувствительности центромерных регионов к ДНКазе I были тестированы ампликоны внутри DlZ7-noBTopa. Центромерный гетерохроматин всех хромосом человека состоит из тандемно-повторяющихся последовательностей так называемой альфа-сателлитной ДНК, элементарной единицей которой является мономер длиной 171 н.п. (Рис. ЗА). Используемый нами альфоидный повтор D1Z7, присутствует в центромерных областях нескольких хромосом, включая хромосомы 1, 5 и 19. Мы сравнили чувствительность к ДНКазе I этого ампликона в контрольных и

подвергнутых гипертермии клетках. Представленные на рисунке ЗБ результаты ясно демонстрируют, что уровень чувствительности к ДНКазе I тестируемого ампликона не изменяется в условиях теплового шока. Таким образом, можно утверждать, что диссоциация белка НР1а из центромерных областей хромосом, не приводит к их декомпактизации в условиях гипертермического стресса.

Полученные нами результаты ставят под сомнение ключевую роль белка НР1а в поддержании компактного состояния центромерного гетерохроматина. Можно предположить, что в центромерных участках хромосом этот белок функционирует прежде всего как транскрипционный репрессор, а не как архитектурный белок гетерохроматина. Чрезвычайно интересным представляется вопрос о биологической роли делокализации НР1а из центромер в условиях теплового шока. Одной из интригующих возможностей является то, что НР1 перераспределяется из центромерного гетерохроматина в эухроматиновые компартменты, репрессируя в них транскрипцию специфичных генов. В 2012 году, была опубликована работа, в которой демонстрируется, что белки НР1а и НР1Р связывают промоторы некоторых гОТ-белков, блокируя таким образом их экспрессию. Другими словами, перераспределение белка НР 1а предполагает существование механизма изменения транскрипционного статуса гетеро- и эухроматиновых компартментов при стресс-реакции на тепловой шок.

2. Роль гистона уН2АХ в клеточном ответе на тепловой стресс

2.1. Тепловой шок индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ в клетках человека

Вариантный гистон Н2АХ составляет около 10-15% от общего пула гистона Н2А. Простой подсчет показывает, что этот вариантный гистон должен присутствовать примерно в каждой пятой нуклеосоме. Ранее было показано, что индукция двунитевых разрывов в ДНК стимулирует фосфорилирование Н2АХ в протяженном геномном домене вокруг точки разрыва. В последние годы было показано, что домены (фокусы) фосфорилированного Н2АХ (уН2АХ) могут формироваться в клетках, подвергнутых тепловому шоку. При этом оставался неясным вопрос о том, связано ли это и в данном случае с внесением двунитевых разрывов в ДНК. Мы проверили, насколько общим для различных клеток является феномен температурной индукции фокусов уН2АХ. Для этого

YH2AX

Lamin B1

Рис. 4. Тепловой шок индуцирует фосфорилирование Н2АХ по серину 139 в клетках mcf-7.

(А) Вестерн-блот анализ уН2АХ в контрольных (С) и подвергнутых тепловому шоку при 45,5С° (HS) клетках mcf-7. Ламин В1 использовали в качестве внутреннего контроля. (Б) Иммунофлуоресцентный анализ уН2АХ в подвергнутых тепловому шоку (45,5°С) клетках mcf-7. Фотографии получены с помощью сканирующего конфокального микроскопа Leica. Масштабная полоса - 20 мкм. В правой части рисунка представлены увеличенные клетки с двумя профилями распределения уН2АХ (масштабная полоса - 5 мкм). ДНК окрашена с помощью TO-PRO 3 иодида.

мы использовали три типа клеток: ,1игка1 и

первичную культуру

фибробластов человека. Клетки подвергали

воздействию теплового шока в температурном диапазоне от 42 до 45,5°С и иммуноокрашивали с

помощью антител против уН2АХ.

Полученные результаты, свидетельствуют о том, что тепловой шок в

температурном диапазоне от 42 до 45,5°С приводит к формированию фокусов уН2АХ, которые отсутствуют

в контрольных клетках (рис. 4Б). Дополнительно, с помощью вестерн-блот анализа мы показали, что фосфорилированная форма гистона Н2АХ обнаруживается в ядерных экстрактах, полученных из клеток, подвергнутых воздействию гипертермии (Рис. 4А). Таким образом, наши данные дают повод предполагать, что индуцируемое тепловым стрессом фосфорилирование Н2АХ является общим феноменом для различных клеток человека.

2.2. Профиль распределения уН2АХ, индуцированного тепловым шоком, зависит от стадии клеточного цикла

Наше внимание привлёк тот факт, что в несинхронизированной культуре клеток шсґ-7, подвергнутой тепловому стрессу, можно было чётко выделить две группы клеток, отличающиеся по профилю распределения уН2АХ в ядрах. Первую группу составляют клетки, имеющие небольшое число (от 5 до 30) крупных фокусов уН2АХ, а вторую -клетки с большим количеством (более 100) мелких фокусов (Рис. 4Б и Рис. 5А). В

к

-av

w

5 10 15 20 25 30 40-50

Число фокусов уН2АХ

G1

L-

S фаза 45-50%

VH2AX BrdU DAPI Merqe

5 % <B

VH2AX Cycline B1 EdU Merge

популяции присутствовало примерно равное количество клеток обеих групп. В этой связи мы обратили внимание на то, что около половины всех клеток находится в фазе 8 клеточного цикла, как было определено с помощью проточной цитометрии (Рис. 5Б).

Это позволило

предположить, что

выявленные нами группы клеток, характеризующиеся разным распределением

возникающих в ответ на тепловой стресс фокусов уН2АХ, соответствуют

клеткам, находящимся в фазе и вне Э-фазы. Для проверки этого

предположения мы провели эксперимент с включением аналога нуклеотида бромодезоксиуридина (ВгсШ) в ДНК. Так как ВгсШ встраивается в ДНК в процессе репликации, Б-фазные клетки можно дифференцировать от всех остальных с помощью непрямой иммунофлуоресцентной окраски антителами против ВгсШ. Для этого культуру клеток тс£7 инкубировали в среде, содержащей бромодезоксиуридин, после чего подвергали гипертермии и иммуноокрашивапи антителами против уН2АХ и ВгсШ. Результаты, представленные на рисунке 5В, демонстрируют, что клетки с большим количеством мелких фокусов уН2АХ являются

12

Рис. 5. Профиль распределения уН2АХ при тепловом шоке зависит от стадии клеточного цикла.

(A) Клетки mcf-7 подвергнутые тепловому шоку (45,5°С) содержат разное число фокусов уН2АХ. Проанализировано более 200 клеток, иммуноокрашенных антителами против уН2АХ.

(Б) Распределение по фазам клеточного цикла для подвергнутых тепловому шоку (45,5°С) клеток mcf-7, полученное с помощью метода проточной цитометрии. Для анализа использовали популяцию несинхронизированных клеток.

(B) Клетки mcf-7 инкубировали с BrdU (100 мкМ, 20 мин), подвергали тепловому шоку при 45,5°С и иммуноокрашивали антителами против BrdU и уН2АХ. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 20 мкм.

(Г) Клетки mcf-7 инкубировали с EdU (10 мкМ, 30 мин), подвергали тепловому шоку при 45,5°С и иммуноокрашивали антителами против циклина В1 и уН2АХ. EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 20 мкм.

исключительно S-фазными (включают BrdU). Более того, в этих клетках уН2АХ практически полностью колокализуется с сайтами включения аналога нуклеотида (Рис. 8А). И наоборот, клетки, формирующие при тепловом шоке небольшое количество крупных фокусов уН2АХ, не включают BrdU, т.е. относятся либо к G1, либо к G2, либо к обеим из этих фаз. Чтобы установить, какая из этих возможностей реализуется мы проводили иммуноокрашивание клеток антителами против уН2АХ, циклина В1 (маркера 02-фазы) и EdU, другого аналога тимидина, которым маркировали S-фазные клетки перед тепловым шоком. Было продемонстрировано, что присутствие небольшого числа крупных фокусов уН2АХ характерно как для G1- (EdU-отрицательные, циклин-отрицательные), так и для G2- (EdU-отрицательные, циклин-положительные) клеток (Рис. 5Г).

2.3. Тепловой шок индуцирует формирование двуцепочечных разрывов ДНК в G1- и С2-клстках

Как отмечалось выше, уН2АХ является маркером двуцепочечных разрывов (ДЦР)

ДНК. Представлялось интересным выяснить, связано ли фосфорилирования Н2АХ в

условиях теплового стресса с появлением в этих условиях ДЦР. Для решения данной

задачи мы использовали так называемый «метод ДНК-комет», также известный как

электрофорез одиночных клеток (SCGE). Мы использовали нейтральную версию этой

техники, позволяющую детектировать в отдельных клетках только двуцепочечные

разрывы ДНК. На наш взгляд, наиболее показательным из измеряемых параметров комет

является «момент хвоста» (tail moment, ТМ), равный произведению длины хвоста и

процента ДНК в нем. Этот критерий мы использовали для оценки степени повреждения

ДНК. В качестве положительного контроля мы использовали клетки mcf-7, обработанные

этопозидом - ингибитором ДНК-топоизомеразы II, способным индуцировать ДЦР.

Тепловому шоку клетки подвергали при 45,5°С в течение 30 мин. Несмотря на

масштабное фосфорилирование Н2АХ в таких температурных условиях, мы обнаружили

очень незначительное увеличение величины ТМ для общей популяции клеток (Рис. 6А).

Принимая во внимание тот факт, что тепловой шок индуцирует два типа фокусов уН2АХ

в зависимости от стадии клеточного цикла, мы решили проанализировать количество ДЦР

после гипертермии отдельно в S-фазных и He-S-фазиых клетках. Для этого мы

использовали иммунофлуоресцентную версию нейтрального SCGE, позволяющую

дискриминировать кометы, полученные из S-фазных клеток, по включению BrdU в их

ДНК (Рис. 6Б). Результаты эксперимента с использованием этого подхода демонстрируют,

13

Метод ДНК-комет (нейтральная версия) BrdU-позитивные клетки BrdU-негативные клетки

30 50 70 90 110 150 250 350

Момент хвоста

Propidium iodide

Merge

момент хвоста момент хвоста _Метод ДНК-комет (щелочная версия)

BrdU-позитивные клетки

BrdU-негативные клетки

момент хвоста

момент хвоста

Рис. 6. Анализ индуцированного тепловым шоком повреждения ДНК с помощью метода SCGE («ДНК-комет»)

(A) Контрольные, подвергнутые тепловому шоку (45,5°С) и обработанные этопозндом (5 мкг/мл, 30 мин) клетки mcf-7 анализировали с помощью нейтральной версии SCGE. На рисунке представлено распределение клеток по величине «момента хвоста» (Tail moment). По оси «У» показан процент клеток с определённым значением «момента хвоста», по оси «X» указаны величины «момента хвоста». (Б) Репрезентативные фотографии BrdU-позитивных и BrdU-негативных комет полученных с помощью нейтральной версии SCGE из клеток mcf-7 подвергнутых тепловому шоку.

(B) и (Г) Асинхронно делящиеся клетки mcf-7 инкубировали с BrdU (100 мкМ, 60 мин), подвергали тепловому шоку (45,5°С 30 мин) и использовали для иммунофлуоресцентной версии нейтрального или щелочного SCGE. BrdU-позитивные и -негативные клетки анализировали раздельно.

что тепловой шок индуцирует ДЦР только в G1- и 02-клетках (Рис. 6В). Удивительно, что

величина ТМ для S-фазных клеток, несмотря на значительно большее количество уН2АХ

в этих клетках, остается неизменной по сравнению с контролем (Рис. 6В). В то же время в

S-фазных клетках после теплового шока обнаруживается большое количество

однонитевых разрывов. Мы продемонстрировали это с помощью иммунофлуоресцентной

версии щелочного SCGE, которая позволяет детектировать как дву-, так и

одноцепочечные разрывы ДНК (Рис. 6Г).

Полученные с помощью метода «ДНК-комет» результаты были воспроизведены с

помощью техник мечения концов ДНК in situ (в пермеабилизированных клетках). Для

этого мы использовали два различных фермента: бактериальную ДНК-полимеразу I (Pol

I), и терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT). Pol I может распознавать и

достраивать только одноцепочечные разрывы, используя для этого неповрежденную цепь

ДНК в качестве матрицы, в то время как TdT, для работы которой матрица не требуется,

просто добавляет нуклеотиды к дву-, и одноцепочечным концам ДНК. Результаты этой

серии экспериментов представлены на рисунке 7.

Б fluor-dTTP (TdT)

yH2AX

DAPI

Merge

Оба фермента включают флуоресцентно-меченные нуклеотиды (fluor-dUTP) в клетках с S-фазным профилем распределения уН2АХ (Рис. 7А,Б), но в отличие от Pol I, TdT также хорошо включает fluor-dUTP в ядрах не-S-фазных клеток (Рис. 7Б). Важно, что TdT включает нуклеотиды точно в сайтах фос форилирования Н2АХ (Рис. 7Б). Суммируя, можно

заключить, что тепловой шок индуцирует

двуцепочечные разрывы ДНК только в клетках, находящихся в G1- и 02-стадиях клеточного цикла. Эти повреждения маркируются фокусами уН2АХ, которые в дальнейшем мы будем называть D-фокусами (от англ. Damage-associated foci).

Рис. 7. Анализ индуцированного гипертермией повреждения ДНК с помощью мечения ДНК in situ. Контрольные и подвергнутые тепловому шоку (45,5°С) клетки mcf-7 фиксировали, пермеабелизировали и проводили ограниченный синтез ДНК с помощью ДНК полимеразы I Е. coli (А) и терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (Б). После реакции мечения, клетки иммуноокрашивали антителами против уН2АХ. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 20 мкм и 5 мкм для нижней секции.

2.4. Тепловой шок оказывает пропорциональный своей силе эффект на репликацию ДНК

Наблюдая большое количество одноцепочечных разрывов ДНК в Б-фазных клетках после теплового шока (Рис. 6Г, Рис. 7А,Б), мы предположили, что этот эффект может указывать на дестабилизацию репликации ДНК.

уН2АХ

Merge

Время после теплового шока, ч

Рис. 8. Тепловой шок оказывает пропорциональный своей силе эффект на репликацию.

(A) Клетки mcf-7 инкубировали с BrdU (100 мкМ 20 мин), подвергали тепловому стрессу (30 мин, 45,5°С) и иммуноокрашивали антителами против BrdU и уШАХ. Масштабная полоса - 5 мкм.

(Б) Клетки mcf-7 инкубировали с BrdU (100 мкМ 20 мин), обрабатывали афидиколином (6 мМ, 60 мин) и иммуноокрашивали антителами против BrdU и уН2АХ. Масштабная полоса - 20 мкм.

(B) Определение скорости репликации в условиях теплового шока с помощью метода ДНК-нитей (молекулярного комбинга). Клетки mcf-7 подвергали тепловому стрессу (30 мин, 42, 44 и 45,5°С) и затем инкубировали в нормальных температурных условиях в течение 0, 0.5, 3, 6 и 24 часов. После указанных временных интервалов клетки инкубировали с BrdU (100 мкМ 20 мин) и использовали для молекулярного комбинга. Треки включения BrdU выявляли иммуноокрашиванием. В левой части рисунка, представлены репрезентативные фотографии треков BrdU. Справа показана зависимость скорости репликации от времени её восстановления после теплового стресса. По оси «X» указаны временные промежутки после теплового шока, по оси «Y» - рассчитанная скорость движения репликативных вилок, выраженная в мкм/мин.

Как уже отмечалось, в S-фазных клетках фокусы уН2АХ колокализуются с кластерами репликации (Рис. 8А). Это особенно наглядно продемонстрировано в клетках с небольшим количеством сайтов репликации (Рис. 8А). Фокусы уН2АХ, маркирующие такие сайты при тепловом шоке, в дальнейшем мы будем обозначать как R-фокусы (от англ. Replication-associated foci). Известно, что фосфорилирование ШАХ может быть индуцировано агентами, ингибирующими репликацию, например, афидиколином или гидроксимочевиной (Рис. 8Б). Можно было предположить, что тепловой шок приводит к аресту активных репликативных вилок, что, по тем или иным причинам, индуцирует фосфорилирование ШАХ. Для проверки справедливости этого предположения нужно было ответить на вопрос, сохраняют ли клетки после теплового шока различной силы (42, 44 и 45,5°С) способность включать BrdU в фокусы репликации. Результаты проведенных нами экспериментов продемонстрировали, что после теплового шока при 45,5°С репликация в клетках полностью останавливается, чего не происходит при меньших значениях температур (42 и 44°С). Для детального изучения этого феномена, мы применили метод ДНК-нитей, известного также как метод «молекулярного комбинга». Эта процедура заключается в «растягивании» на микроскопическом стекле отдельных

16

нитей депротеинизированной ДНК, и визуализации на них треков включения аналогов нуклеотидов с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Длина таких треков является адекватным критерием для оценки скорости репликации. Клетки линии mcf-7 подвергали тепловому шоку при 42, 44 и 45,5°С. Сразу после воздействия или после дополнительного культивирования в нормальных условиях в течение различных временных интервалов (0.5, 3, 6, 24 часа) клетки инкубировали с BrdU в течение 15 мин и затем использовали для молекулярного комбинга. Для каждой из вышеуказанных временных точек измеряли длины не менее 150 треков включения BrdU и вычисляли среднее значение скорости репликации (Рис. 8В). Полученные результаты демонстрируют, что тепловой шок оказывает зависящий от температуры эффект на репликацию (Рис. 8В): при 45,5°С происходит полный арест репликативных вилок, в то время как при 42 и 44°С скорость репликации замедляется пропорционально температуре (Рис. 8В). Возобновление (restart) репликации для всех температурных точек начинается после 30 минут культивирования клеток в нормальных условиях, причем скорость репликации достигает контрольного уровня приблизительно через 6 часов. Интересно, что после шестичасового периода восстановления, скорость движения репликативных вилок начинает превышать контрольный уровень (Рис. 8В), что может являться компенсаторным механизмом обеспечивающим своевременное завершение репликации.

2.5. Молекулы Н2АХ, формирующие D- и R-фокусы, фосфорилируются с помощью разных кип аз

Известно, что за фосфорилирование Н2АХ отвечают фосфатидилинозитол-3-киназа-подобные киназы - ATM, ATR и DNA-PK. Целью следующего цикла экспериментов было выяснение вопроса о том, какие именно киназы осуществляют фосфорилирование Н2АХ в D- и R-фокусах при тепловом шоке. Для проверки этого предположения мы провели ингибиторный анализ с использованием кофеина, специфичного ингибитора киназ ATM и ATR, и NU7026, ингибитора ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK). Клетки mcf-7 инкубировали в течение 3-6 часов при 37°С в среде с ингибиторами, после чего S-фазные клетки метили включением BrdU. Тепловой шок осуществляли при 45,5°С, и затем проводили двойное иммуноцитохимическое окрашивание антителами против BrdU и уН2АХ. Результаты экспериментов представлены на рисунке 9. В клетках, обработанных кофеином, после теплового шока формируются

только R-фокусы, в то время как в клетках, обработанных NU7026, уН2АХ образует только фокусы типа «D». На основании данных результатов можно заключить, что при тепловом стрессе фосфорилирование Н2АХ в окрестностях сайтов двуцепочечных разрывов ДНК (D-фокусы) осуществляется ATM, либо ATR. В R-фокусах, ассоциированных с арестом репликативных вилок, Н2АХ фосфорилируегся DNA-PK. Этот вывод был дополнительно подтвержден в экспериментах с подавлением экспрессии генов ATM, ATR и DNA-PKcs с помощью РНК-интерференции (Рис. 10). Более того, данный подход позволил дифференцировать роли ATM и ATR в формировании D-фокусов уН2АХ. Мы продемонстрировали, что в этих фокусах фосфорилирование ШАХ осуществляет ATM, но не ATR (Рис. 10).

vH2AX BrdU DAPI Merge

Рис. 9. Характеристика фокусов уН2АХ индуцированных тепловым шоком.

Клетки тсґ-7 обрабатывали ингибитором АТМ/АТЯ (кофеином; 10 мМ 3 часа) или ингибитором ОКА-РК (N07026; 10 мкМ, 6 часов). Затем клетки инкубировали с Вгёи (100 мкМ, 20 мин), подвергали тепловому шоку при 45,5°С и иммуноокрашивали антителами против ВгсШ и уН2АХ. Масштабная полоса - 20 мкм.

yH2AX EdU DAP I Merge

Рис. 10. Фосфорилирование H2AX в сайтах двуцепочечных разрывов ДНК осуществляет ATM.

Клетки mcf-7 были трансфецированы наборами миРНК для подавления экспрессии ATM, ATR и DNA-PKcs. Спустя 48 часов клетки инкубировали с EdU (10 [дМ, 30 мин), подвергали тепловому шоку при 45,5°С и иммуноокрашивали антителами против уН2АХ. EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 15 мкм.

2.6. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок

Заключительный цикл экспериментов был проведен с целью выяснения вопроса о функциональном значении фосфорилирования Н2АХ в 8-фазных клетках при тепловом стрессе. Мы проанализировали эффект теплового шока на репликацию ДНК в условиях ингибирования БКА-РК, при котором фосфорилирование Н2АХ в Я-фокусах не происходит. Для этого клетки тс£7 были обработаны ингибитором N117026 и подвергнуты тепловому шоку при 42, 44 и 45,5°С. Затем клетки инкубировали с бромодезоксиуридином, после чего анализировали скорость движения репликативных вилок с использованием молекулярного комбинга. Из результатов, представленных на рисунке 11 А, следует, что в условиях ингибирования ЭМА-РК скорость репликации падает приблизительно в 2 раза уже при 42°С, в то время как при 44°С происходит полный

19

арест репликации. Недавние исследования показали, что DNA-PK критически необходима для предотвращения ДЦР в условиях репликативного стресса, индуцированного афидиколином. Поэтому оправдано было предположить, что при отсутствии уН2АХ, в сайтах остановленных репликативных вилок могут возникать двуцепочечные разрывы ДНК. Для проверки этого предположения мы использовали иммунофлуоресцентную версию нейтрального SCGE на клетках, подвергнутых тепловому шоку в условиях ингибированния DNA-PK. Величина «момента хвоста» для таких клеток сильно возрастала (Рис. 11 Б). Этот результат позволил нам заключить, что фосфорилирование Н2АХ в сайтах репликации предотвращает формирование в них ДЦР, и тем самым «спасает» вилки репликации от полного коллапса.

Рис. 11. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок.

(А) Определение скорости репликации при тепловом шоке в условиях ингибирования DNA-PK. Клетки mcf-7 обрабатывали ингибитором DNA-PK (NU7026; 10 мкМ, 6 часов). Затем клетки подвергали тепловому шоку при различных температурах (42, 44 and 45.5°С), после чего инкубировали с BrdU (100 мкМ, 20 мин) и анализировали скорость движения репликативных вилок с помощью молекулярного комбинга. Треки включения BrdU выявляли иммуноокрашиванием. Для каждой точки измеряли длину не менее 80 - 100 треков и рассчитывали среднее значение скорости движения репликативных вилок. (Б) Анализ повреждения ДНК при тепловом шоке в условиях ингибирования DNA-PK. Клетки mcf-7 обрабатывали ингибитором DNA-PK (NU7026; 10 мкМ, 6 часов), после чего инкубировали с BrdU (100 мкМ, 20 мин). Затем клетки подвергали тепловому шоку при 45,5°С и анализировали с помощью

иммунофлуоресцентной версии нейтрального SCGE. Анализировали только BrdU-позитивные клетки. На рисунке представлено распределение клеток по величине «момента хвоста». По оси «Y» показан процент клеток с определённым значением «момента хвоста», по оси «X» указаны величины «момента хвоста».

0,3

ii

- NU7026 >• NU7026

1

42°С 44°С 45.5°С

тепловой шок -ш- NU7026 ♦ тепловой шок NU7026

100 150 200

Момент хвоста

С момента открытия уН2АХ считается универсальным маркером двуцепочечных разрывов ДНК, служащим для привлечения и сборки факторов репарации в сайте повреждения. Однако результаты, полученные за последние несколько лет независимыми исследовательскими группами, заставляют переосмыслить эту аксиому. В частности было показано, что фосфорилирование ШАХ происходит независимо от образования ДЦР в условиях гипоксии, теплового шока или же при репликативном стрессе. Тем не менее, представление об индукции уН2АХ безотносительно ДЦР, не является на сегодняшний день общепринятым. Мы продемонстрировали, что при тепловом шоке в одной клеточной популяции формируются два типа фокусов у112АХ: первые являются ассоциированными с двуцепочечными разрывами ДНК, вторые не имеют к ДЦР никакого отношения. Более того, Н2АХ в разных типах фокусов фосфорилируется с помощью разных PIKK-киназ (ATM или DNA-PK). Таким образом, между ферментами существует своеобразное разделение обязанностей по фосфорилированию Н2АХ в зависимости от ситуации. В случае теплового шока таких ситуации две. Первая - это образование двуцепочечных разрывов ДНК, которые маркируются уН2АХ при помощи ATM-зависимого механизма. Вторая - это репликативный арест, индуцирующий DNA-PK-зависимое фосфорилирование Н2АХ. В первом случае уН2АХ выступает в роли классического сенсора повреждений ДНК. В случае же репликативного ареста фосфорилирование Н2АХ необходимо для защиты вилок репликации и предотвращения их коллапса. Таким образом, мы демонстрируем двойственную роль уН2АХ в условиях теплового стресса. Не подлежит сомнению, что при определённых условиях фосфорилированный Н2АХ нельзя рассматривать как универсальный маркёр двуцепочечных разрывов ДНК.

выводы

1. Продемонстрировано, что в условиях теплового шока белок НР1а диссоциирует из центромерного гетерохроматина. Диссоциация НР1а не влияет на структурную целостность центромерного гетерохроматина.

2. Тепловой шок индуцирует образование двуцепочечных разрывов ДНК в 01- и 02-фазах клеточного цикла. Эти разрывы маркируются с помощью АТМ-зависимого фосфорилирования гистона Н2АХ.

3. В зависимости от температуры тепловой шок приводит к торможению или полному аресту движения вилок репликации, что стимулирует ОЫА-РК-зависимое фосфорилирование Н2АХ в сайтах репликации.

4. Впервые продемонстрировано, что формирование доменов уН2АХ в сайтах репликации предотвращает репликативный арест при умеренной гипертермии (42, 44°С) и образование двуцепочечных разрывов в Б-фазе клеточного цикла при остром тепловом шоке (45,5°С).

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Velichko А.К.. Kantidze O.L., Razin S.V. 2011. НР1 is not necessary for the structural maintenance of centromeric heterochromatin. Epigenetics 6, 380-387.

2. Velichko A.K.. Petrova N.V., Kantidze O.L., Razin S.V. 2012. Dual effect of heat shock on DNA replication and genome integrity. Molecular Biology of the Cell 23, 3450-3460.

Тезисы конференций:

3. Величко A.K.. Каитидзе O.JI., Разин С.В. Диссоциация белка HP 1 alpha из центромерных областей не приводит к их декомпактизации. 15 международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. 2011. Пущино, Россия, с. 66-67.

4. Velichko А.К.. Kantidze O.L., Razin S.V. HPlalpha is not necessary for the structural maintenance of centromeric heterochromatin. 22nd Wilhelm Berhard Workshop, August 25-29, 2011, Latvia, Riga, p.l 18

5. Величко A.K.. Петрова H.B., Разин C.B., Кантидзе О.Л. Роль гистона уН2ЛХ в клеточном ответе на стресс. Международная конференция «Хромосома 2012». 2012. Новосибирск, Россия, с. 65.

Заказ № 10-П/10/2012 Подписано в печать 02.10.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,2

ГПу,

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Величко, Артём Константинович

СОДЕЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Уровни системного ответа организма на тепловой стресс.

1.1.1. Клеточный уровень.

1.1.1.1. Мембраны.

1.1.1.2. Цитоскелет.

1.1.1.3. Цитоплазма и клеточные органеллы.

1.1.1.4. Тепловой шок и клеточная смерть.

1.1.1.5. Клеточный цикл.

1.1.2. Молекулярный уровень.

1.1.2.1. Белки и факторы теплового шока.

1.1.2.2. Транскрипция и метаболизм РНК.

1.1.2.3. Репарация ДНК.

1.1.2.4. Репликация.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.2. Материалы.

2.2.1. Клеточные линии.

2.2.2. Антитела.

2.2.3. Химические реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Культивирование клеток человека.

2.3.2. Включение аналогов нуклеотидов.

2.3.3. Иммуноцитохимия.

2.3.4. Выделение РНК.

2.3.5. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени на матрице кДНК.

2.3.6. Приготовление белковых экстрактов:.

2.3.6.1. Приготовление клеточных экстрактов:.

2.3.6.2. Приготовление ядерных экстрактов.

2.3.6.3. Экстракция гистонов.

2.3.7. Вестерн-блот гибридизация.

2.3.8. Анализ чувствительности к ДНКазе 1.

2.3.9. Проточная цитофлуориметрия.

2.3.10. З'-Концевое мечение ДНК с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы.

2.3.11. Ник-трансляция in situ (мечение ДНК с использованием ДНК-полимеразы I)

2.3.12. Получение препаратов ДНК-нитей (DNA combing).

2.3.13. РНК-интерференция.

2.3.14. Метод ДНК-комет (гель-электрофорез одиночных клеток).

2.3.14.1. Нейтральная версия.

2.3.14.2. Щелочная версия.

2.3.14.3. Иммунофлуоресцентная версия.

2.3.15. Метод оценки жизнеспособности клеток (МТТ-тест).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Роль белка гетерохроматина 1 в клеточном ответе на тепловой стресс.

3.1.1. Кратковременный тепловой стресс не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека.

3.1.2. Белок гетерохроматина la (HP 1а) диссоциирует из центромерных областей хромосом в условиях теплового стресса.

3.1.3. Диссоциация HP 1 а из центромерных участков хромосом не связана с деметилированием остатков лизина 9 гистона НЗ (НЗК9).

3.1.4. Диссоциация НР1а не приводит к декомпактизации центромерных участков

3.1.5. Обсуждение результатов.

3.2. Роль гистона уН2АХ в клеточном ответе на тепловой стресс.

3.2.1. Тепловой шок индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ в клетках человека

3.2.2. Профиль распределения уН2АХ, индуцированного тепловым шоком, зависит от стадии клеточного цикла.

3.2.3. Тепловой шок индуцирует формирование двуцепочечных разрывов ДНК в Gl - и 02-клетках.

3.2.4. Тепловой шок оказывает пропорциональный своей силе эффект на репликацию ДНК

3.2.5. Молекулы Н2АХ, формирующие Б- и Я-фокусы, фосфорилируются с помощью разных киназ.

3.2.6. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок.

3.2.7. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина"

Терапевтические свойства высоких температур были известны с древних времен. Однако только в двадцатом веке учёные и медики стали исследовать и применять гипертермию для лечения онкологических, иммунологических, вирусных и других заболеваний. Необходимость в развитии и совершенствовании технологии гипертермии объясняется недостаточной эффективностью хирургических, фармакологических и прочих подходов. Согласно современной точке зрения, гипертермия рассматривается как универсальный и наиболее эффективный модификатор лучевой и химиотерапии, способный повысить их эффективность в 1.5-2.5 раза [1, 2], и только в случае невозможности применения этих подходов рассматривается как монометод. Эффективность локальной гипертермии доказана при подавляющем большинстве видов солидных опухолей и их метастазов в различные органы [1]. Основанием для клинического применения гипертермии является её общее цитотоксическое действие на раковые клетки, включая ингибирование синтеза ДНК, нарушение кальциевого гомеостаза, индукция ареста клеточного цикла и апоптоз. Базисом для терапии рака с помощью высоких температур является понимание физиологической реакции опухоли на тепловой стресс. Микроокружение опухоли характеризуется редукцией кровеносных сосудов, сопровождаемой гипоксией и ацидозом [2]. Клиническая практика показывает, что умеренная гипертермия, в диапазоне 41-42°С, улучшает кровоснабжение опухолей и усиливает их оксигенацию, что способствует более эффективному действию химио- и радиотерапии [2]. Однако понимание молекулярных основ эффекта теплового стресса на клетку по-прежнему остаётся не полным. Считается, что первичными сенсорами температуры в клетке являются б белки. Температурная дисфункция белков обусловлена нарушением термолабильных водородных связей и неполярных гидрофобных взаимодействий, дестабилизацией а-спиралей и Р-структур, приводящей к нарушению вторичной и третичной конформаций белков. Для предотвращения денатурации в ответ на стресс, клетки запускают экспрессию белков теплового шока (от англ. Heat Shock Proteins, HSPs), которые, являясь в частности молекулярными шаперонами, осуществляют стабилизацию и рефолдинг денатурированных молекул белка [2-4]. Однако изменение транскрипционного статуса клетки при тепловом шоке отнюдь не ограничивается повышением экспрессии HSPs. В ряде работ продемонстрировано усиление или, наоборот, уменьшение (прекращение) экспрессии различных групп генов в условии гипертермического стресса [5, 6]. Если за специфическую активацию транскрипции при тепловом стрессе ответственны факторы теплового шока (от англ. Heat Shock Factors, HSFs) [7], то системы обеспечивающие транскрипционную репрессию остаются неизученными. Мы предположили, что в процессе индуцированного стрессом сайленсинга генов могут участвовать структурные белки гетерохроматина, и в частности белок HP 1а. В первой части работы, мы попытались ответить на вопрос, какова функциональная динамика белка HP la, его роль в эпигенетическом контроле и масштабной транскрипционной репрессии генов в клетках человека при гипертермии.

ДНК также является мишенью для высоких температур. Исследования последних лет демонстрируют, что гипертермия индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ по 139 серину [8-14]. Эта модификация, известная как уН2АХ, на сегодняшний день считается универсальным маркёром двуцепочечных разрывов

ДНК [15-17]. Сотни молекул модифицированного Н2АХ аккумулируются в сайте разрыва, фланкируя его на несколько десятков тысяч пар оснований и образуя цитологичсеки детектируемые фокусы. В фокусах уН2АХ непосредственно связывает факторы репарации МБС1 и ЫВ81, которые позволяют набору других белков, в том числе МЕЩ, В11СА1 и 53ВР1 аккумулироваться в сайтах поврежденной ДНК и запускать каскад репарационных процессов [18]. В этой связи логичным представляется предположение о том, что формирование фокусов уН2АХ в условиях гипертермического стресса связано с индуцированными температурой двуцепочечными разрывами ДНК. Хотя это кажется очевидным, исследования ряда авторов демонстрируют, что уровень повреждения ДНК после гипертермического стресса не коррелирует с количеством индуцированных им фокусов уН2АХ. Таким образом, можно полагать, что, помимо маркирования двуцепочечных разрывов ДНК, существуют иные функции фосфорилирования гистона Н2АХ и другие каскадные механизмы индукции его фосфорилирования при гипертермии. Во второй части работы мы попытались охарактеризовать эти механизмы, как элементы эпигенетического контроля и поддержания геномной стабильности клетки в условиях температурного стресса.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Величко, Артём Константинович

5. Выводы

1. Продемонстрировано, что в условиях теплового шока белок НР1а диссоциирует из центромерного гетерохроматина. Диссоциация НР1а не влияет на структурную целостность центромерного гетерохроматина.

2. Тепловой шок индуцирует образование двуцепочечных разрывов ДНК в 01- и 02-фазах клеточного цикла. Эти разрывы маркируются с помощью АТМ-зависимого фосфорилирования гистона Н2АХ.

3. В зависимости от температуры тепловой шок приводит к торможению или полному аресту движения вилок репликации, что стимулирует ОЫА-РК-зависимое фосфорилирование Н2АХ в сайтах репликации.

4. Впервые продемонстрировано, что формирование доменов уН2АХ в сайтах репликации предотвращает репликативный арест при умеренной гипертермии (42, 44°С) и образование двуцепочечных разрывов в 8-фазе клеточного цикла при остром тепловом шоке (45,5°С).

Личный вклад:

Автором работы самостоятельно были проведены все эксперименты, а также обработка и анализ результатов исследования.

4. Заключение

Тепловой шок оказывает на клетку многосторонний эффект, затрагивающий работу практически всех клеточных систем. Некоторые клеточные компоненты, выполняющие в нормальных условиях специфические функции, могут менять свою функциональность при стрессе. В нашей работе мы показали, что подобный феномен характерен для белка НР1а, который в норме функционирует как структурный компонент гетерохроматина, а в условиях теплового стресса перераспределяется по другим, возможно эухроматиновым, компартментам. Пока мы можем только строить предположения по вопросу о функциональной и адаптивной значимости этого явления. Удар теплового шока приходится также на ДНК-ассоциированные процессы, в частности репликацию, которая в зависимости от силы гипертермии либо замедляется, либо полностью останавливается. Тем не менее, клетка имеет механизмы надёжной протекции репликативной машины в стрессовых условиях. Как продемонстрировано в нашей работе, одним из таких механизмов, срабатывающим при тепловом шоке, является фосфорилирование гистона Н2АХ. В целом считается, что главной мишенью гипертермии, в том числе и при использовании ее в клинических целях, являются белки. Однако ДНК также подвержена действию теплового стресса. Мы продемонстрировали, что гипертермия провоцирует образование в клетках человека двуцепочечных разрывов ДНК.

В настоящее время гипертермия является одним из методов лечения онкологических заболеваний. Сочетание химиотерапии и гипертермии увеличивает эффективность лечения различных форм опухолей, включая рак груди и головного мозга. Эффективность локальной гипертермии доказана при подавляющем большинстве видов солидных опухолей и их метастазов в различные органы. Очевидно, что изучение молекулярных механизмов клеточного ответа на тепловой стресс не только расширяет наше фундаментальное понимание механизмов адаптации и защиты клеток при стрессе, но и является необходимым для выработки оптимальной стратегии использования гипертермии в клинических целях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Величко, Артём Константинович, Москва

1. Falk М.Н. and Issels R.D. 2001. Hyperthermia in oncology. Int J Hyperthermia, 17(1): 118.

2. Hildebrandt В., Wust P., Ahlers O., Dieing A., Sreenivasa G., et al. 2002. The cellular and molecular basis of hyperthermia Crit Rev Oncol Hematol, 43(1): 33-56.

3. Lindquist S. and Craig E.A. 1988. The heat-shock proteins. Annu Rev Genet, 22: 631-77.

4. Gething M.J. and Sambrook J. 1992. Protein folding in the cell. Nature, 355(6355): 3345.

5. Murray J.I., Whitfield M.L., Trinklein N.D., Myers R.M., Brown P.O., et al. 2004. Diverse and specific gene expression responses to stresses in cultured human cells. Mol Biol Cell, 15(5): 2361-74.

6. Streffer C. 1982. Aspects of biochemical effects by hyperthermia Natl Cancer Inst Monogr, 61: 11-7.

7. Akerfelt M., Morimoto R.I., and Sistonen L. 2010. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(8): 545-55.

8. Hunt C.R., Pandita R.K., Laszlo A., Higashikubo R., Agarwal M., et al. 2007. Hyperthermia activates a subset of ataxia-telangiectasia mutated effectors independent of DNA strand breaks and heat shock protein 70 status. Cancer Res, 67(7): 3010-7.

9. Laszlo A. and Fleischer I. 2009. The heat-induced gamma-H2AX response does not play a role in hyperthermic cell killing. Int J Hyperthermia, 25(3): 199-209.

10. Roti Roti J.L. 2008. Cellular responses to hyperthermia (40-46 degrees C): cell killing and molecular events. Int J Hyperthermia, 24(1): 3-15.

11. Roti Roti J.L., Pandita R.K., Mueller J.D., Novak P., Moros E.G., et al. 2010. Severe, short-duration (0-3 min) heat shocks (50-52 degrees C) inhibit the repair of DNA damage. Int J Hyperthermia, 26(1): 67-78.

12. Takahashi A., Matsumoto H., Nagayama K., Kitano M., Hirose S., et al. 2004. Evidence for the involvement of double-strand breaks in heat-induced cell killing. Cancer Res, 64(24): 8839-45.

13. Takahashi A., Mori E., Somakos G.I., Ohnishi K., and Ohnishi T. 2008. Heat induces gammaH2AX foci formation in mammalian cells. Mutat Res, 656(1-2): 88-92.

14. Takahashi A. and Ohnishi T. 2005. Does gammaH2AX foci formation depend on the presence of DNA double strand breaks? Cancer Lett, 229(2): 171-9.

15. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., and Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol, 146(5): 905-16.

16. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., and Bonner W.M. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem, 273(10): 5858-68.

17. Sedelnikova O.A., Rogakou E.P., Panyutin I.G., and Bonner W.M. 2002. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res, 158(4): 486-92.

18. Bonner W.M., Redon C.E., Dickey J.S., Nakamura A.J., Sedelnikova O.A., et al. 2008. GammaH2AX and cancer. Nat Rev Cancer, 8(12): 957-67.

19. Vigh L., Maresca B., and Harwood J.L. 1998. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? Trends Biochem Sei, 23(10): 369-74.

20. Carratu L., Francescheiii S., Pardini C.L., Kobayashi G.S., Horvath I., et al. 1996. Membrane lipid perturbation modifies the set point of the temperature of heat shock response in yeast Proc Natl Acad Sei USA, 93(9): 3870-5.

21. Lin P.S., Lui P.S., and Tsai S. 1978. Heat induced ultrastructural injuries in lymphoid cells. Exp Mol Pathol, 29(3): 281-90.

22. Lin P.S. and Butterfield C.E. 1977. Hyperthermic treatment (43 degrees C) rapidly impedes attachment of fibroblasts to culture substrates. Cell Biol Int Rep, 1(1): 57-61.

23. Sato C., Nakayama T., Kojima K., Nishimoto Y., and Nakamura W. 1981. Effects of hyperthermia on cell surface charge and cell survival in mastocytoma cells. Cancer Res, 41(10): 4107-10.

24. Mikkelsen R.B. and Koch B. 1981. Thermosensitivity of the membrane potential of normal and simian virus 40-transformed hamster lymphocytes. Cancer Res, 41(1): 20915.

25. Park H.G., Han S.I., Oh S.Y., and Kang H.S. 2005. Cellular responses to mild heat stress. Cell Mol Life Sei, 62(1): 10-23.

26. Wrabl J.O., Larson S.A., and Hilser V.J. 2002. Thermodynamic environments in proteins: fundamental determinants of fold specificity. Protein Sei, 11(8): 1945-57.

27. Stevenson M.A., Calderwood S.K., and Hahn G.M. 1987. Effect of hyperthermia (45 degrees C) on calcium flux in Chinese hamster ovary HA-1 fibroblasts and its potential role in cytotoxicity and heat resistance. Cancer Res, 47(14): 3712-7.

28. Kiang J.G., Gist I.D., and Tsokos G.C. 2000. Regulation of heat shock protein 72 kDa and 90 kDa in human breast cancer MDA-MB-231 cells. Mol Cell Biochem, 204(1-2): 169-78.

29. Moulin M. and Arrigo A.P. 2006. Long lasting heat shock stimulation of TRAIL-induced apoptosis in transformed T lymphocytes. Exp Cell Res, 312(10): 1765-84.

30. Moulin M., Carpentier S., Levade T., and Arrigo A.P. 2007. Potential roles of membrane fluidity and ceramide in hyperthermia and alcohol stimulation of TRAIL apoptosis. Apoptosis, 12(9): 1703-20.

31. Huang J., Zhang X., and McNaughton P.A. 2006. Modulation of temperature-sensitive TRP channels. Semin CellDev Biol, 17(6): 638-45.

32. Patapoutian A., Peier A.M., Story G.M., and Viswanath V. 2003. ThermoTRP channels and beyond: mechanisms of temperature sensation. Nat Rev Neurosci, 4(7): 529-39.

33. Pollard T.D. 2003. The cytoskeleton, cellular motility and the reductionist agenda Nature, 422(6933): 741-5.

34. Armour E.P., McEachern D., Wang Z., Cony P.M., and Martinez A. 1993. Sensitivity of human cells to mild hyperthermia Cancer Res, 53(12): 2740-4.

35. Luchetti F., Mannello F., Canonico B., Battistelli M., Burattini S., et al. 2004. Integrin and cytoskeleton behaviour in human neuroblastoma cells during hyperthermia-related apoptosis. Apoptosis, 9(5): 635-48.

36. Pawlik A., Nowak J.M., Grzanka D., Gackowska L., Michalkievvicz J., et al. 2012. Hyperthermia induces cytoskeletal alterations and mitotic catastrophe in p53-deficient HI299 lung cancer cells. Acta Histochem.

37. Vidair C.A., Doxsey S.J., and Dewey W.C. 1993. Heat shock alters centrosome organization leading to mitotic dysfunction and cell death. J Cell Physiol, 154(3): 443-55.

38. Nakahata K., Miyakoda M., Suzuki K., Kodama S., and Watanabe M. 2002. Heat shock induces centrosomal dysfunction, and causes non-apoptotic mitotic catastrophe in human tumour cells. Int J Hyperthermia, 18(4): 332-43.

39. Wang T.T., Chiang A.S., Chu J.J., Cheng T.J., Chen T.M., et al. 1998. Concomitant alterations in distribution of 70 kDa heat shock proteins, cytoskeleton and organelles in heat shocked 9L cells. IntJBiochem Cell Biol, 30(6): 745-59.

40. Coss R.A., Alden M.E., Wachsberger P.R., and Smith N.N. 1996. Response of the microtubular cytoskeleton following hyperthermia as a prognostic indicator of survival of Chinese hamster ovary cells. IntJRadiat Oncol Biol Phys, 34(2): 403-10.

41. Wang Y., Guan J., Wang H., Leeper D., and Iliakis G. 2001. Regulation of dna replication after heat shock by replication protein a-nucleolin interactions. J Biol Chem, 276(23): 20579-88.

42. Vanderwaal R.P., Maggi L.B., Jr., Weber J.D., Hunt C.R., and Roti Roti J.L. 2009. Nucleophosmin redistribution following heat shock: a role in heat-induced radiosensitization. Cancer Res, 69(16): 6454-62.

43. Boulon S., Westman B.J., Hutten S., Boisvert P.M., and Lamond A.l. 2010. The nucleolus under stress. Mol Cell, 40(2): 216-27.

44. Jolly C., Konecny L., Grady D.L., Kutskova Y.A., Cotto J.J., et al. 2002. In vivo binding of active heat shock transcription factor 1 to human chromosome 9 heterochromatin during stress. J Cell Biol, 156(5): 775-81.

45. Biamonti G. 2004. Nuclear stress bodies: a heterochromatin affair? Nat Rev Mol Cell Biol, 5(6): 493-8.

46. Anderson P. and Kedersha N. 2002. Stressful initiations. J Cell Sci, 115(Pt 16): 3227-34.

47. Anderson P. and Kedersha N. 2008. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends Biochem Sci, 33(3): 141-50.

48. Kedersha N., Stoecklin G., Ayodele M., Yacono P., Lykke-Andersen J., et al. 2005. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol, 169(6): 871-84.

49. Vidair C.A. and Dewey W.C. 1988. Two distinct modes of hyperthermic cell death. Radial Res, 116(1): 157-71.

50. O'Neill K.L., Fairbairn D.W., Smith M.J., and Poe B.S. 1998. Critical parameters influencing hyperthermia-induced apoptosis in human lymphoid cell lines. Apoptosis, 3(5): 369-75.

51. Falcieri E., Luchetti F., Burattini S., Canonico B., Santi S., et al. 2000. Lineage-related sensitivity to apoptosis in human tumor cells undergoing hyperthermia Histochem Cell Biol, 113(2): 135-44.

52. Amarante-Mendes G.P., McGahon A.J., Nishioka W.K., Afar D.E., Witte O.N., et al. 1998. Bcl-2-independent Bcr-Abl-mediated resistance to apoptosis: protection is correlated with up regulation of Bcl-xL. Oncogene, 16(11): 1383-90.

53. Milleron R.S. and Bratton S.B. 2006. Heat shock induces apoptosis independently of any known initiator caspase-activating complex. J Biol Chem, 281(25): 16991-7000.

54. Palzer R.J. and I-Ieidelberger C. 1973. Studies on the quantitative biology of hyperthermic killing of HeLa cells. Cancer Res, 33(2): 415-21.

55. Westra A. and Dewey W.C. 1971. Variation in sensitivity to heat shock during the cell-cycle of Chinese hamster cells in vitro. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 19(5): 467-77.

56. Bhuyan B.K., Day K.J., Edgerton C.E., and Ogunbase O. 1977. Sensitivity of different cell lines and of different phases in the cell cycle to hyperthermia Cancer Res, 37(10): 3780-4.

57. Valenzuela M.T., Nunez M.I., Villalobos M., Siles E., McMillan T.J., et al. 1997. A comparison of p53 and pi6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation. Int J Cancer, 72(2): 307-12.

58. Furusawa Y., Iizumi T., Fujiwara Y., Zhao Q.L., Tabuchi Y., et al. 2012. Inhibition of checkpoint kinase 1 abrogates G2/M checkpoint activation and promotes apoptosis under heat stress. Apoptosis, 17(1): 102-12.

59. Madlener S., Rosner M., Krieger S., Giessrigl B., Gridling M., et al. 2009. Short 42 degrees C heat shock induces phosphorylation and degradation of Cdc25A which depends on p38MAPK, Chk2 and 14.3.3. Hum Mol Genet, 18(11): 1990-2000.

60. Nitta M., Okamura H., Aizawa S., and Yamaizumi M. 1997. Heat shock induces transient p53-dependent cell cycle arrest at Gl/S. Oncogene, 15(5): 561-8.

61. Fuse T., Yamada K., Asai K., Kato T., and Nakanishi M. 1996. Heat shock-mediated cell cycle arrest is accompanied by induction of p21 CKI Biochem Biophys Res Commun, 225(3): 759-63.

62. Nunes E. and Siede W. 1996. Hyperthermia and paraquat-induced G1 arrest in the yeast Saccharomyces cerevisiae is independent of the RAD9 gene. Radiat Environ Biophys, 35(1): 55-7.

63. Rowley A., Johnston G.C., Butler B., Werner-Washburne M., and Singer R.A. 1993. Heat shock-mediated cell cycle blockage and G1 cyclin expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 13(2): 1034-41.

64. Ritossa F.M. 1962. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila Experientia, 18: 571-573.