Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние температуры, рН и интенсивность УФА-излучения на фотогемолитические эффекты фурокумаринов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние температуры, рН и интенсивность УФА-излучения на фотогемолитические эффекты фурокумаринов"

йздклерсгво здравоохранения и недифтосой прошшенности го российский государственньн одиртнский уи1верстигст

о 8 авг 1994 На правах рукописи

УЖ 612.014.4: 514.14

камедов ильгар салех оглы в/ввн« температуры, рН И иггеношосги ува- ИЗЛУЧЕНИЯ

на «отогаюлитичшас эвюсш «урокумаринов

03.00.02.-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степе»! кандидата медаршсхих наук

Москва - 1994

Работа выполнена кэ кэфедре медицинский и биологической фю Российского Государственного Медицинского Универститета

Научный руксеодитель: доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко.

Официальные спгтоюгш: дхяор медицинских наук, гл. н. с. Л. Г. Коркига, к.кадидаг биологических наук , ст. н. с. В. С. Шэров

Ведугцее учреждение: Московский Государственный Универогитет.

Зашита диссертации оостсмтся " ".....1994 г. в 14 часов на вас

Специшмзироеанного Совета К. 084.14.04. в Российском Государстве Медицинском Университете по адресу: 117869, г.Москва, Оогрсштгянова, д. 1.

С диссертацией мсисно азнэмсииться в библиотеке Российского I 'осу дарственного Медицинского Универститета.

Автореферат разослан " "........1994 г.

Ученый секретер» Специализированного совета

К. 084.14.04.

кандидат медицинских наук дарит

И. В. Буромский

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

В последние годи, большем интерес, у исследователей вызывает изучение свойств фурскумаргакж (СН). Совместное воздействие ФК (их называют также пооселенЕми ) и УФА-излучения (ПУФА-воздействие) индуцирует в коке два клинически важных эффекта: подавляет деление базальных клеток (Ландгалер и др. , 1979) и Т-лю-фэцигое (Рменик, 1984) и в то же время стимулирует пролиферацию и дифференциацию мелзнгхдитов (Парриш, 1976). В евши с этим ПУФА-терзлия ( ка-1бинирсванное воздействие псораленов и ближнего ультрафиолетового света (УФ-А обшетгь , 315-400нм) широко применяется для лечения многих кожных заболеваний, теких как псориаз, кежнзя Т-клеточная лимфема, витилиго и др. (Пэтак и Фитцпэтрик, 1991).

Наряду с лошжителькьми терапевтическими эффектами при ПУФА-терапии индуцируктгея и побочные эффекты, такие как эритема, удема и 1 щ ifi.ii ад ментация.

В современных исследованиях прио^тгетнъм явлизтея направление изучению реакций фотоприсхединения псорэленов к нуклзиновьм кислотам, как 1-*члекуля[*см основе всех фотобиолэгических эффектах при ПУФА-терепии (Далл'Акуа и др., 1986).

Реакции Фстга^лисоешнения ФН к ДНК (образование 1-ою - и дизеддуктов ФК с пирнмидинеязьми сосваншии) являотся киагюрод нездвисимьб.м реекциши (Родигьеро и др.... 1970).

Наряду с вышеуказанными, важное место занимают ф .тгоокисгмтель11ые реакции ФК. В исслодовашяк ГЪшпенко и др. [1980]', и П'-п'ксп Г19833, была выявлена существенная роль фага^даслительпых реакций пепехдлегов в индукции фоютсксичесхих проявлений ПУФА- воздействия.

Однеко, в последнее врежет появились данные о тем, что некоторые фсггоскислительные реакции ФК играют важную роль и в ПУФ А-терапии. Например, в нашей лаборатории установлено, что Фотсскис-ленный поорапен (ФОЛ) скидает терапевтическим действием (Потапенко и др.., 1992). Виишг-ическая роль фотодинамических реакций ФН мэжэт емгь имре, чем считалось раньше.

Неттршер в исх-ледаваниях ¡Яефферта и др С год] псказано что при ПУФА-воздействии I» киетки большая часть фогопродуктсв ФК

локализуется в цитоплазме и на мембранах, а не в ядре.

В работах Лэскина и др. С1989] показано, что 8-МОП и УФА-облучение индуцирует фосфорялирование рецепторов зпидермального фактора роста (ЭФР), локализованных на мембранах клеток млекопитающих. В результате этого происхедат ингибирование пролиферэтив-ной активности кератиноцитсв, а также активация мелзнацигов и стимуляция мелэногенеза. Авторы расценивают это как указание на важную роль модификации бисмембран пси ПУФА-терапии.

Известно что ряд соединений , (аскорбат, востоновленный глугатион и ионы двухвалентного железа) выступает в роли химических регуляторе® мембранотоксических эффекте® фурокумаринэв. Однако до настояи)его времени остается не ясньм вопрос о влиянии на такие эффекты изменения рН среды.

Показан механизм индукции фототсктчесхих эффектов через стадию образования фотсекисленных ФК (ФОФ). Однако свойства ФОФ- продуктов, не исследованы, не ясны механизмы, посредством которых ФОФ -продукты псереждают биосубстреты.

Для других ФК биолэгическая активность их продуктов фотоскисления не исследована.

В настоящее время в клинике используется Э-4 фурскумарина. Актуальной является задача поиска новых эффективных и нетоксичных фурокумаринсв. Изучэние фотобиолэгичестсих свсйств новых фурскумаринов кокет проводиться на мембранных системах в »•сдельных экспериментах. Полученная информация мсисет служить основой для ссвершенствсвания ЛУФА-терапии.

Целью настоящей работы явилось:

1. Изучить способность различных ФК индуцировать темновое и фогосенсибилизирсенное повреждение мембран эритроцитов по гемолитическому эффекту и проверить выполнимэсть закона взаимозаменяемости интенсивности и длительности облучения в атсм процессе.

2. Исследовать гемэльтгическую эффективность продуктов фогоо-кисления различных ФК и сопоставить эти эффекты с эффектами предварительно фотоокисленного псоралена.

3. Изучить влияние рН на фотогемолиз, сенсибилизированный

фурскумэрвими, а также на гемзгаз, индуцирсеанньы предварительно фотоакислисты псоролзнсм.

4. Охарактеризовать Ьиэлэгическй-екпсвные продукта фоггоокиглвния псор&лена го энергии ааивоции термэдеструкции, с целью выяснения юс химической природа. -

Научная нсеизна работы:

В исследованиях на фстгогеьсгатгичосксй модели при розных ин-теисишюсгях У в А-излучения, бшю исследовонэ влияние изменение ишгенсивнсхли УФАгизлучвния нэ фагогемзлпические эффекты 12 фу-ракумэринов. Только в 6 случвях ( ксантосашн, пейгрденин, 5'-иэопропитсоролен (5*-ИПП), енгадромзриезин, 4,5',5-трю«тит-ооралзн, дельтоин ) нэ выполнялся закон взаимозаменяемости интенсивности и длительности - облучения Бунэенэ-Росмо, что явилась слздсявием переклвчэния механизма реакций с сджквантавого на двухбайтовый при повшении интенсивнхти от 20 до 300 Вт/м2.

Обкэдокенэ, что фагогемзлкгические эффекты фурокумэрюаз сильно зависят, от рН среда- Установлено влияние рН на образование ^стгопррдукгов. Показано влияние рН на гемолитическую эффективность фагопродукгав пссрвлено, пейцеданика и 8-МОП при высокой и низкой интенсивностях УФА- излучения. Опыт по изучению влияния рН ш умазывают на различную природа фошпрццугсшы пиирашна, пейцеданина и в-МОП.

Рассчитана анергия активации термэдеструга^м продуктов фстхкисления псорвлзна, полученные данные указывают на пероскгидкую природуШ!.

-установлено, что креме леорелвна, еар А фурокумзрина (5'-ИПП, енгидремг^меэин, дельтоин, ксенюголин) образуют нембра-нэгоксичные ФОФ-продукгы.

- псквэонэ, что в сухом виде (в отличие от роелворев) ООП при хронении не теряет свою вйэлогичеекуп вкяшносхь в течзние 3 месяцев ноблпдения.

Научгсь практическая анвшадсть исследования

Результата проведенных исследований с использованием физических (интенсивность УФА-излучэния) и хюдачесхих (рН) факторов рас-

ширяют наш представления об особенностях фсггодинамического повреждения мембран, сенсибилизированного псорашнзми, что важно при разработке новых подходов для совершенствования ПУФА-терапии. Изучение свойств (анергии активации термздэструкции) , а также стабильности продукте® фурскумэринсв при их хранении в розных существенно для разработки новых фармпрепаратов на основе ФОФ для лечения аутоФмуннных и кожных заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались на Всесоюзной конференции "Биологические мембраны в норме и патологии" (Тбилиси, 1989), на 4 и 5 конгрессах Европейского фогобиоло-гического оби|ества (Амстердам 1991, Ыэрбург 1993), на 2 Международном конгрессе по фотобиологии (Киото 1992), на Международной конференции по клинической хемилсминесценции (Берлин, 1994), на заседаниях кафедры медицинской и биологической физики РГМУ.

Публикации

По тема диссертации опубликовано 5 работ.

Объем диссертации.

Диссертация изложена на 194 страницах машинописи и состоит из введения (5 сяр), обзора литературы (51 стр), описания материалов и методов исследования (8 стр), изложения полученных результате» и их обсуждения (95 cip), выводов и библиографического указателя. Работа содержит 54 рис, 3 таблицы, список цитированной литературы (227 источнкизв).

Содержание диссертации.

Материалы и методы исследования.

В работе использовались следующие фурокумэрины: псорален (Институт химии растительных вецеста АН Узбекистана, г. Ташкент), ксантопажн, 5-МОП (5-метоомсипоорален), мэрмезин, гидрат скси-пейцеданина, прангенин, гидрат пренгёнина, сксипейцеданин, пейце-данин, пранчимгин, дельтоин (Ботанический институт РАН , Сэнга^ Петербург).

Триметилпоорален предоставлен профессорсм В.Адемэм г. Бюрц-бург, ФРГ.

Б'-иэопропилпоорален, ангвдрсмармезин (ВИЛАР г.Москва)

е-МОП, (1БА).

№С1, К2НР04, МаОН,НС1, ГеБ04 7Н20, КОН, РеС13 6Н203,

№№Р04, . N=№04 - Реахим, ХЧ или ЧДА.

- Феррйиюхыыг кииин - сингьЕзнриван и» »цши жышаа и лкив-лзга калия 1,10 фенвнтрашн-( "Реохим" ЧДА). Гвпэрин ("Рихтер", Венгрия). Для приготовления рестворсе использовались перегнанный этанол/ дисхюшировеннэя и бидисгилхирсвэгакзя вода.

• Спектральные юмеренюг провещали та спектрофотометрах "Весктап СХЬ7Н (США).

Исхочшмсм УФ-иэлучвшя служила ртугно^кварцевав лампа сверхвысокого давления ДРШ-250-3.

УФ-А область излучения темпы выделялась с помощью светофильтра "НвМоп 366"(К.Цейсс, ФРР).

Облучение суспензии зритрсц>ггсв производилось в стеклянных 2 см кюветах при непрерывна* перемешивании на магнитной мешатке. Измерение интенсивности УФ-иэлучения проводили методом жидкостей ферисксалягной актинометрии (ГЪркер, 1972). Оцежа гемолитических эффектов фурскумаринов проводилась на эритроците« человека методами турбидиметрик и спегарофогсметрии.

Исследование свойств фогоскисленных фурскумзринсв (ФОФ) методом хемилкминесценции проводили ш хемшжмтометре, собранном в лабереггерии.

РЕЗЗШЬТАТЫ И СБСУДЕЯИВ.

1. Гемшитчеасие эффекты « без облучения.

Данные о темновых гемолитических эффектах ФК представлены в

В кстрольных пробе« к эритроцитам добавляли атанзл (IX), после чего суспензия инкубировалась при 37 С до наступления гемзлиза.

Все ФК из переделенных в табл. 1, кроме пейцеданина, увеличивали скорость гемолиза без изменения сигмзидной форм* кривых гемолиза.

Тсшьмо пейцеданин изменял вид кривых гемолиза. .После его добавления происходил быстрый (в течении 1 часа) лизис прыврнэ

трепл клвтск. Для оставшихся клеток наблодалэсь обычная сигмсидтая кривая завершенного гемолиза.

Г........ .....1 | Фурскумарин, | Скорость 1 1 |Темж»сй геиолотичеа

1 10-^4 | гемолиза, ч-1, ¿3.4. (эффект ФК, % к контр 1

1 1 ! 1 | Этанол, 17. (кешрель) | 0.017 + 0.001 1 I | 100

( Нсангогалин | 0.0Э6 + 0.002 | 211.7

| 5-МОП | 0.041 + 0.001 | 241.2

| ТриметилпссрагЕН ) 0.038 + 0.0015 | 223.5

| Дельтсин | 0.051 + 0.002 | 300

} 8-М0П | 0.039 ± 0.002 | 229.4

| Пейцеданин | 0.036 + 0.001 | 211.8

| Пссралвн | 0.035 + 0.001 | 205.8

| 5'-ИПП | 0.034 + 0.001 | 300

| Ангидромэрмезин | 0.025 + 0.002 | 147

) Гидрах оксипейцеданина 0.023 + 0.001 | 135.3

| Оксипейцеданин { 0.02 + 0.001 | 117.6

) Гидрах пренгенина | 0.022 + 0.001 | 129.4

| Пронгенин ( 1 . 1 0.018 + 0. 018 ( 105.9 1

Примечание 1*. Тёмновые гемолитические эффекты представлены в таблице 1, сии рассчитывались по формуле [ (УфкУк) /\Лс]*1007., где Ук и Уфк -скорости гемолиза в ксгарольнсй пробе и в пробе с 10-4М ФК, соответственно.

В табл. 1 не приведены данные по пранчимгину т.к. индуцировадаьм им гемслиз дасил особый характер. Пренчимгин в интервале концентрации от 10-5М да 1,25 10-4М вызывал быстрый (аа 5 минут) незавершенный гемэлиз. Доля лиэираеава)их кшток линейно росла с концентрацией данного ФК.

Мсжно предположить, что незавершенный гемолиз, вызванный пранчимгином и пейцедэкинам, носит механический харасгер. Эти ФК плохо растворимы в веще аа счет наличия боковых гидрофобных

групп, и при концентроциях 10-5-10-4 Н кристаллизуются, эта агрегата разрывают мембрану механически*

2. Влиишю ингенишышлм УСА-облучи«* на гемилиз сеисибклизиравжашА различии« 4К.

Влияние ингикзшности на гемолитические эффекты пссралензв изумись на примере 12 фурскэнпргоюв. Шесть из изученных ФК» ш фотооенсибюизирэвала гемэлиз в изученном наг« интервале интенсивностей УФА-света от 20 да 200 Вг/м2 (мэрмезин, 5-Ю1, гкдрсгг првшънинв, . нренгенин, гидрзг акгжпейцеданинэ, принчимгин). ,

Обнаружено, что Э-Н0П, хотя - и обладая слэйьы фшии**н11м£илиэираванньм эффектом, ю эют эффект не эавиаш от интенсивности . Фурокуиерины, которые подэЬю пооралвну не шеюг боковых заместителей в бензольном кольце, фотасензибилизировали гемолиз и эффект эевисел от интенсивности действукхцего УФ-А излучения в интервале используемых в нашем исследовании интенсивностей 20-200 Вт/м2. К нш относятся следующие ФК; фотосенсибилизиралсцре гемолиз (поорален, 8-МОП

(Э-метооксипооралЕН, 5*-ИПП, АШ (ангвдрамярмезин), дельтаин, пейцедэнин, сисипейцедзнин, ксвкгогалин, ТШ (триметилпссрален).

При внимательном россмохреиии становится очевидно, что они в свою очередь делятся на 2 группы по характеру гемолиза.

К одной из них охнхзпся ФК, способные индуцировать незавершенный гемолиз при действии УФА-облучэния высокой интенсивности, это 5'~Ш1, АГМ, дельтоин, ТШ и ксантоголин.

Так, например, при выссксй интенсивности УФА-света 152 Вт/м2 (рис 1, кривая 1) при дозах облучэния ниже 50 кДх/м2 гемолиз, сенсибилизированный 5*-ИПП, носит неэавершенньй характер, т. е. лизирует только часть клеток. С увеличением дозы доля лизировавших клетск увеличивалась, достигая 100Й при дозах 50 Вг/м2 и вше. В то же время при ниэмзикгенсивном облучении (20 Вт/м2) индуцировался мзллзидьо-со^этический гемолиз, который оценивался по скорости гемздаэа (рис 1 крй).

рис 1. Зависимость скорости гемолиза(1) и скорости геюлиза (2,3) сенсибилизированного 5'-ИПП при резных ингенсивносхях света. Кснценгрсция 5* -ИПП 10-4К1, содержание в пробах этанола 17.. 1-амгивпуда гемолиза при 1»150 Вт/м2.

2,3-кривая зависимости скорости фотогемолиза при 1=20 Вт/м2. Э-после УФА облучения добавлены ионы железа 10-2М.

Другую группу <СК составляли пейцеданин и сксипейцеданин , которые при любой из использовавшихся интенсивностей вызывали завершенный гемолиз.

Невыполнимость закона Вунзеда - Роско объясняется переключением механизмов фотсиимичесхсй реакции с оджквешсвого на двухк-вантсвый при гсвьшении интенсивюсхи света, как это показано на схеме:

hvl hv2 Ж-...А-Р2

N !

pi

где А - дабильный промежуточный продукт; Р1 и Р2-фогопроду>сгы

обреесваициеся в хода одго и двухквантсвых реакций, оосяветсвеннэ, К-кюнсгенга скорости темновой реакции превращения А в Р1.

По-видимому, фотопродукты Р1 и Р2 обладают роэличкьми гемолитическими свойствами.

Наши данные показали, что, для псоролена, ATM, 5*-ИПП (рис 1), дельтсюна, ТШ, ксенгогалина выооксингенсивньй фотопродукт (Р2) эффективнее ниэмоинтенсивного продукта (Pi), а для пейцедэкина и оксипейцвдэнина - наоборот.

ФК второй группы сенсибютвирсвали завершенный геюлиз, как при высокой, тек и при низкой ингенсивнэсгях. Ш первой группы индуцировали завершенный гемолиз только при низкой интенсивности облучения УФА светом.

Учитывая смодство механизмов низмзинтеношнэго гемэлиэа для всех исследованных ФК, мокнэ расположить их в порядае убьвания активности при низмоинтенсизнь« условиях облучения; триметилпсорвлвн > пейцеданин > ксектоголин > АП4 > поорадан > прекгенин > сксипейцеданин > 5*-ШП > дельтоин.

Оьресрет на себя внимание, что СК, содервзцие боковые -радикат-в 5-подакении,- обладают обьггю низкой активностью. Раа личия в фотогемзлитическЕЙ эффективности исследованных ФК не селены с вариациями еЭ66, так как в наших опытах использовались растворы с высокой коцентрецией ФК и коэффициент поглощения (1-Т)366 был всегда не ниже 0.6.

Следовательно различия в активности, могут быть объяснены влиянием боковых радикалов ка фогофизичэскиэ свойства ФК и на их способность связываться с критическими для индукции фотогемэлиэа мишеням в мембоензх.

3. Гемолиз, вдава«ый действием предварительно облучаяых Ш ie биологические мембраны.

Ранее в нашей таборепории было показано, что добавление к суспензии эритроцитов в солевом растворе зтадального раствора псоралена 10-2М), предварительно облученного в присутствии кислорода, вызывает гемолиз С Потапенко, 19913.

В настоящей работе подтверждены эти результаты и проведена

серия опытов то выявлению гемолитических свойств таких фогоскисленных ®К как АГЫ, 5'-ИПП, дельтаин, ксангоголин, ТМП. Выбор этих фуракумэрижя объясняется тем, что при УФА-облучении суспензии эритроцитов в присутствии этих фатосенсибилизаторав, спи ведут себя сходно псорелену, т. е. при высокой интенсивности действующего излучения индуцируют незавершенный гемолиз.

Все исследованные фотоокислвнные ФК индуцировали гемолиз (креме ТМП).

На рис 2 для примера показано доэовая зависимость скорости гемолиза вызванного фотоскисленным ангидрсмармезинсм. Кривые гемолиза имели сигмзцдный вид- Гемолиз носил завершенный харектер (данные не приведены). Прсцесс оценивали по скорости гемолиза V-1/1507..

0.12

рис 2.

доэовая зависимость скорости гемолиза индуцированного фотоскис-ленньм ангиярокармези-ном. Раствор ATM предварительно облучен в разных дозах Ы52 Вт/м2 Кснцешреция 10-4М.

•I » i i » i i » i | i i « i i i i i i I I i i i i i i i г i

fio lit tie

дааа аблучяятж^фрс. и

Отсутствие гемолитического эффекта у облученного ТМП не означает, что сн совсем не образует продукты фсясхкисления. Из литературы известно что при фотокиелвнии образуются диэосетаны в фурансесм колыр TW1 [60]. Наои хемилсминесцентные исследования показали, что при езлеизивании этанэльных рестворов облученного ТИП с водой возникала вспыгкд хемшминесценции, тэтою как ранее.было псказано для пссралена С 3. Добавление в ростаор облученного ТШ ионов Fe2+ приводило euje к одней вспьике ХЛ, свидетельствующей о при-

- и -

сутствии пероксидов ТШ.

Кгк мм видам,' все 4 исследованных 204Н вызывают зявершегшъй гемолиз при лобсй дозе облучения, это в керне отличается от гемолиза вызванного фогоокислЕННШ посраленом, сходный с ВИПУФАг гемолизом, т.е когда лизируют не все клепки суспензии.

4. Лучение стабильности высушите« препаратор ДОП. Ранее считалось, что ойцученда гтссролена в этаноле, ацетоне или СС14, приводит к образованию продуктов, устойчивых в органических растворителям, но рпврушааых водой. - Продукт» фотоскисления посралена, будучи добовленньми в водную среду распадаются, что и было пскаэано в опытах по регистрации хемиломинесценции С Лысенко, 19893. При атом образуются свободные радикалы, которые взаимодействуя с мембраннши структурами, повреждает их, что и приводит к гемолизу.

В иасгощей работе, облученный в деве 18 кДж/м2 этанодьдай раствор Пс (1О-а0, добавлялся к эритроцитам в разное время после

- облучения. Обнаружено, что за время наблодения 18 часов гемолитическая эффегаиыюсть ФШэг падала в 100 роз. Дальнейшее наблюдение было невевмзжньм по причине низкой биологической активности хранившихся фотопродуктов (хотя теоретически эффект но пропадал). Потеря эффективности этонольного раствора ФОЛ, по-видимому, свявано с- прододжвюцр»ся медленны* распадом фогоскисленных продуктов в воде, кшерая присутствует в 9€й эгсеноле.

В кэсюторй работе Пс (10-31) обладали дозой 18 кДж/м2 в 9 Ей

- этаноле, затем полученньй раствор - ФШ вырушшш. После определенного временя хранения, растворяли кристаллы ФСП в 96Х.

* этаноле и добавляли к суспензии эритроцитов. Определяли гемолитическую эффективность "сухого" ФОТ от времени хранения. Показано,- что хранение вплоть до 82 сутск - не изменяло гемолитической эффективности "сухого" ФОТ.

Таким образом, ФОТ после' кристализации " сохраняет свою эффективность при всем использованных временах наблодения (2.5 месяца). Проблема сохранения биалогичэсксй активности ФОТ важна в

практическом отношении, тек как известно что ФОТ обдадает терапевтическим действием.

Очевидно, что сохранение свойств ООП в высушенньм виде открывает хорошие перспективы дЬя соедания новей лекарственной формы.

5. Зависпюсхь от рН гемолиза, вызванного различным 4ИС*

Комбинированное воздействие псоралена и УФА излучения при Н.И. света (23 Вг/м2), как известно, вызывает фотогемолиз по кол-лзидиэ-осмэтичесмому механизму.

В опыте (рис За) клетки облучались в присутствии поорелена при резных рН. Оказалась что скорость гемолиза существенно зависела от рН.

рН рН

рис За. Зависимость скорости низкоинтенсивного псора-лен+УФАг гемолиза от рН суспензии эргарсцитав.

1-фотогемолиз, 1*23 Вт/м2., 2-без облучения. Концентрация По» 10-4М

рис 36. Зависимость скорости гемолиза вызванного пейцеданином от рН. 1-темнавой гемолиз. 2-фоггогемолиз, 1=152 Вт/м2. Э-фотогемолиэ, 1-23 Вт/м2. Кснцентрация пейцеданина 10-4 М.

Оообенно резкое увеличение скорости наблюдалось при эокиильние среди. 1Ък, при pll 6.7 скириилъ гемилиэд была и 10 рсы вьше, чем при {£3. Криваяй на рис Завыглядит кек типичная кривая итриьаним, харвктеризуюирцсм знамением рК* 7,3. Твкое значение рК могут шеть остатки гастидана, вхрдяцие в состав белков-мемЬрон эритроцитов. С другой стороны, не исхлочено,1 что при изменении рН происходит титрование фогопродуктов пссралена, которые после диссоциации становятся более эффективны« гемолитаками.

Так или иначе всвникает вспрос не приводит да - резкое псвыпение скорости фагогемолиза -в кислей области к изменению семгах» механизма нгексинтенсивного ПУФАг гемолиза.

' Известно-; что при рй 7.4 зависимость скорости фогогемолгоа от дозы кващягачкзя. Чтобы прсверить, сскракяется т кттсиднэ-саетичвский механизм мы измерили доеовые зависимости сксрости фагогемолиза при рй 7.0 и 7.4, когда скорости очень существенно отличаются друг от дрота. Оказалось что при рН 7.0, также как и рН 7.4, гемолиз носил завершенный' харектер и тангенс угла наклона обеих кривых ( показатель степени, при дозе облучения практически одинвксе и равен . при рН 7.4»1.78+0.25 при рН 7.0-1.9010.18).

То, что значен»» показателя степени при дозе сказались немного ниже двух, это моею объяснить чэстичньм выцветанием пссралена в ходе облучения [Верокезе, 19893.

Мскнэ сделать вывод, - что несмотря на скачок скорости в интервале рН 7.0-7. б механизм гемолиза качественно не изменился и остался 1оллс»адно-аэспичесхим.

Для количественной-сцеши влияния рН, на ВИПУФА гемолиз нами определялся параметр "гемолихичвекей эффективности".

Параметр гемолитической эффективности представляет собой величину, обратную доее облучения» при мэгорой'амплитуда гемолиза равнялвсь 50Х.

Кэк видно на рис 4 (кривая 1) зависимость гемолитическсй эффективности ЕИ1УФА гемолиза от рН сильно отличается от кривей эяаисимосяи скорости гемолиза от рН при низкой интенсивности.

Гемолитическая эффективность имеет максимум при рН»7.4 и

уменьшается как в более кислых средах, так и в более 1целсчных.

Как известно [Потапенко, 19893, ВИПУФА-гемолиз по характеру отличается от НИПУФА-гемолиза. Предположительно эти процессы протекают через образование равных фотопродукгов (образующихся в мода двухквангавых и одасквантсвых фотохимических реакций псоралешв.

Таким образам, моисно сделать вывод, что различия в механизмах НИПУФА и ВИПУФА гемолиза проявляется не только в характере их дозсеой зависимости или в размерах образующихся каналов [Потапенко, 1989, а также в совершенно различных эффектах рН на эти 2 типа фсггогемолиза, сенсибилизированного псореленам.

«9 йЗ

0

м

в

1

г

«

о.ов

0.04

0.00

На рис 4 (кривая 2) показаны результаты экспериментов, когда

рис 4. Зависимость гемолитической эффективности ВИПЬУФА -(1) и ФОЛ - гемолиза (2,3) от рН. 1.Эритроциты подвергали ПУФА-об-лучению 152 Вг/м2. 2. К эритроцитам, находящимся 1 при разных рН, добавляли (ФОПэт). 3. ФОПэт смещива-ли с буфером при резных рН смесь инкубировали 5 минут и затем добавляли к эритроцитам при рН 6.3

9.0

1 I I 1 1 г

» I I I I

7.0

14 » I I I I > | I I »

АО

рН

9.0

определяли зависимость гемолитической эффективности фотокиспенно-го псоралэна. Сравнивая зависимость от рН ВШУФА (рис 4, нфивая 1) и ФОПэт гемолиза (рис 4, кривая 2) мы видам, что эта кривые пахши друг на друга

Это еще одно доказательство того, что высскоингенсивный ПУФА-гемолиз реализуется путем образования ФОЛ. ГЬ-видимому, высскоинтенсивное ПУФА-воздействие и ФШ-повреждение имеют одинаковые молекулярные мишени в мембрвнах эритроцитов.

Гемолиз, ицдуцирсвонный этвнольньм раствором ФОЛ, представляет собой очень сложный процесс.

Связано это с тем, что образующиеся фотопродукты пссралвна очень гетерсгенны. Там есть несколько соединений, каждое из которых обладает гемолитической активностью.

В аиий смиси фогопрсдугасв- удалэсь выявить фоггопродукхы, которые устойчивы в водной среде, т. е. та гидролизирукпся.

Есть фсггопрсяукгы, которые подвергается гидролизу в водной среде, образуя лабильные промежуточные, реекцисннэспособныэ сиедининии, ошвчмда^йе чгалмчни во гемолиз.

Проведена серия опытов, когда ФОПэт сначала смешивался с буферам» растворами, умевшими резные рН в дтагсосне от 6.0 до . 8.5. И затем офевцы гидрогиэовавазегося фстскисленного гтсоралена добавлялись к эритроцитам в солевом буферном растворе. Эритроциты находились в растворе с более высокой буферной еьжсстыо. После их смешивания с раствареми ФОТ рй оставался теким же, каким сн был в суспешии зригрсцитов.

На рис 4 (кривая 3) приведи« данные одного данные одного из опытов, когда суспензия зригрстртгсв находилась при рН 6.3 и к клеткам добавляли растворы ФОПэт, предварительно гидролизсванные при разных рН.

В других опытах, когда рН суспешии аргароцигов составлял 7.4 ил» 8.0 форма кривых зависимости от рН гидролиза практически не отличались (данные не приведении). Отсюда мокнэ эеклочить, что рН влияет та гидролиз ФОПэт в воде, и не влияет на взаимодействие продуктов гидролиза ФОПэт с мембранами эриграцитое;

Приведенные опыты с предварительны* гидролизом ФОТэт существенно отличается от опыте®, когда к суспензии эритроцитов, находгаацихся при - разных рН, добавлялся ФОТэг и его гидролиз происходил в присутствии клеток (рис 4, кривая 2).

В последнем случав эритроциты подвергались воздействию как стаОшьных, ток и переходных, лабильных (гк>-видимсму,

свобсдноредикальнсй природы) продуктов гидролиза ФШэт. Сспостз&ление формы кривых 2 и 3 (рис 4) позволяет предположить, что лабильные продукты гидролизу ФОПэт действуют та эритроциты только при рН 7.4, тогда как при рН 6.9 и 8 за гемлдиз отве^еют толькостабильные в воде продукты гидрсмиза ФОПэт.

6. Влишие рН среда на фотогемолиз сенсибилизированы^ 8-МОП и пейцедаммом.

Ферма кривых зависимостей скорости гемолиза от рН как для пейцедэнина, тек и для 8-МОП была одинаковой. В качестве примера на рис Эб представлены, данные по пейцедэнину.

Г^и увеличении рН от 6.6 до 9.0 скорость фотогемэлиза, сенсибилизированного 8-МШ и пейцеданином монотонна роста.

Оба этих ФК вызывают гемолиз, который протекает по коллоидно-осмотическому механизму. Если же сопоставить дозевую зависимость скорости фогогемолиэа, индуцированного поороленом (рис За) при низкой интенсивности УФА облучения от рН, и гемолизом, инду-цировенньм пейцедэнинэм (рис Эб), мы видим суи)ественные различия, сходство проявляется только при рН> 7.4. В кислой же области для псоралена наблюдается резкое увеличение эффективности гемолиза. Тогда как у пейцеданина эффективность продолжает падать.

По-видимому, пейцеданин и &-МСЯ1 не образуют в кислей среде фогопродуктов, которые приводили бы к заметному усиления повреждения мембран.

Сходство эффектов пейцеданина, 8-МОП и Пс в цепочной области объясняется тем, что как известно [93], фурскумэрины способны вызывать фотолиз БН-соединений, который протекает более эффективно при рН>8.

7. Влияте тешерягуры на продукта фотоокислежя псоралена.

В нашей лаборатории было показано, что гемолитический эффект фагокиелвнного псоралена уменьшался с увеличением времени, про-шедоего между концом облучения псоралена и моментом смешивания с эритроцитами. При увеличении времени хранения эффективность ФОЛ снижается, причем этот процесс выражается сланной кривой. В течэ-

кии первых 40 минут наблодается снижение гемэжгачесмзй эффективности в 2 раза. Затеи оставшаяся гемолитическая эффективность выходит на шито и дальнейшее снижение прсисходиг очень медленно. Это мсиет указывать на то, что за гемолиз отве^сют несколько фотопродуктов пооралена С Потапенко, 1992 3.

Однако, химическая природа этих- фотопродуктов не ясна. Одним из подходов для выяснении природы фотопродуктов мскет быть , определение энергии екгавации термического разрушения фогопродукгов. С зтсй цель» использовались 2 • метода: 1) метод регистрации индуцированной иона»« Ге2+ хемилсминесценции растворов фогоскисленного пооралена хранившихся при разных температурах; 2) метод определения гемолитической эффективности ФОЛ после его хранения при резных темперепурах.

7.1.' Хемшкм»еа|енп9& метол определения энергии акхивафм продуктов фстгоокисленин Пс.

Для выяснения химической природы продуктов фотскисления поороиьна мы изучали завииммиить ем итуды ылыики хеышюмшесцьнции ш времени хранения 5ОТ при рааных температурах.

На рис 5, представлены кривые зависимости амплитуды УЛ от времени хранения при разных температурах. Энергга активации рассчитывались из нами из кривых, полученных при температурах ниже 20оС. Эти кривые представляют собой суьму двух зкспоненхциальных ("быструю и "медленную"), что отражает, по-видюсму присутствие как минимум двух фотопрадуктсв. Для каждой из этих экспонент энергия активации рассчитывалось отдельно по формуле;

Для продуктов огаечаоцих за быструю составляацую экспоненты она равна Еага> 17,81 аЮЗДж/моль. В случае же медленней экспоненты Еэкт» 2.81*104 Дж/мэль.

Однако не известно позволяет ли метод ХЛ определять энергию активацию термореспеда продуктов фсгтоскисления , отвечающих за гемолиэ.

Поэтому нами определялась энергия "еютвации терюраспада фотопродуктов- гемолизинов по снижению гемолитической эффективности ФОЛ.

Рис. 5. Зависимость амплитуды вспьики УЛ раствора ФОЛ индуцированной ионгми Ге2+ от времени хранения при разный температурах. ***** |20 оС - температура хранения ФОЛ ♦♦♦♦♦ 45 оС - температура хранения ФОЛ :37 оС - температура хранения ФОП ' 67 оС - температура хранения ФОП

7.2. Гемолитическая эффективность МП при разных температурах.

В наших опытах температура инкубации суспензии эритроцитов не изменялось и составляла во всех опытах 37оС.

Таким обрезом, исключалось влияние температуры на структуру и функциональное состояние мембран.

ФОП хранили при разных тешеретурех, и в определенное время добавляли к эритроцитам для определения гемолитической эффективности.

Энергию активации термораспада оп ределяли при хранении ФОТ при температурах от О С до 20 С.

Еб.п.= 12,6*103 Дж/мэль; Емедл.пр.» 6.2*104 Дк/моль.

Определенная в данной работе энергия екгавации термодеструкции фотопрсдукгав соответствует энергии аюиазции вец)еслв персксидной природы С Адам, 1992].

Похоже, что фогспродукгы пооралена которые распадаются под воздействием ионов ?е2+ и дакгг вспьюку хемилюминесценции, по величине энергии активации термораспада идентичны фотопродуктом пооралена, вызывающим гемзлитичэсюй эффект.

вывода.

1. Проведено сравнительное исследование фогогемэлотической эффективтехл-и 12 различных фурхжумаргаке. Пскачаю, что в услоглтах Jtmtx onuraa (365нм, 20-200 Вг/м2) премчимгин, 5-ЮТ, гидрах прангенина, мэр-езин, гидрат сксипейцеданина, првнгении, сксипсйцеденин не сенсибилизировали фогогемолиз. Дельтоин, кгантог-олин, иртае-тлпсорален, адгидромэрмезин, 5'-иэопрогпишсорален, обладали фогогемолитической эффектишюстью, причет-» их эффекты сильно зависели сгг интенсивности УФА- излучи гля. Гкг-видга.гму, при рееных интенсив» юсттях УФА-света у этих ФК образуется различные продукта, что вероетно связано с переключением механизма фогореэкции с однсквантсвого на даухквантовый,

2. Обнаружена, что добавлеше к эритроцитам предварительно фэтоскислежых ксантогсшикз, дельтсм ia, ангидромэрмезина и 5'-ИПП, приводил:! к индукции гемолиза.

Гем:шотичесхие эффекты продуктов фотскисления указанных фурскумармгов отличались от списанных в литершуре эффекгав фотсс»<исленного пссралена. В исследуемом шгтереале доз (до 100 кДж/м2) гемолиз носил завершенный харектер и скорость гемолиза [.¡осла с увеличением девы облучения фурасумэрилсв. Псроговая доза отсутствовала.

3. Изучено влияние рй на фотогемолиз, вызванный облучением уритрощтк® в присутствии поорапена, 8-МОП и пейцеданина при резных ингенсивностях УФА- излучения ( 20 Вг/м2 и 150 Вт/м2). Установлено, что характер зависимости гемолитических эффектен £h МОП и пейцеданина от рН был одннековьм при 20 и 150 Вт/мй. Зжисимосги от рН фотогемопиза, сенсмбилизираваннсго пссреленсы при низкой шггенсзшности УФА- излучения, совпадала с эависимостши для 8-КЮП и пейцеданина при значениях рН выше 7.4. Однако при снижении от 7.4 до 7.0 (р№=7.3) скорость фотогемолиза Еозрестате примерно в 10 саз.

Таким сххаэсм, обнаружено, что у псоралена, в отлише от 8-МОП и пейцеданина в кислей среде образуются значительно бешее уффективние фагопродукгы- гемолизины, чем в нейпрешьной и шелэчной

средах.

Небольшое увеличение гемолитических эффектов в (целзчной среде макет быть обусловлена увеличением вклада в фотоповреждение мембран сенсибилизированного фурокумэринэми фотолиза £Н- групп бел<св.

При высскот интенсивности УФА-излучения (150 Вг/м2) характер зависимости от рН сенсибилизированного поорзленом фотогемолиза резко менялся. Максимальная гемолитическая эффективность была при рН 7.4.

Таким обраэсм, изучение зависимости от рй позволяет выявить различие механизмов высоко и низкоинтенсивного поорапен +УФА-гемолиза.

' 4. Обнаружено, что зависимости от рН выоокоинтенсивного (150 Вт/м2) псорашн + УФА-гемолиза и гемолиза индуцируеюго предварительно фотоакисленньм в этаноле псораленом, близко совпадают. Эхо указывает на то, что ВН. ПУФА-гемолиз осуществляется через стадию образование фотоскисленного псоралена.

Установлено, что эффекты рН на Ф0П-гемолиз обуслзалекы влиянием рН на фоггопродукты псоралена, а не на мембрану эритроцитов. Явно замедлятся процесс гидролиза фотопродукгсв псоралена при кислых и (цепочных рН.

5. Определены энергии активации тер-юдесгрукции продуктов фотоокисления псоралена в интервале температур ОСЬ -ЙООо. Количественное определение фотопродуктов и их деструкция при разных температурах проводилась двумя методами: 1) по интенсивности индуцированной ионами Fe2+ вспьики хемиломинесценции 2) по гемолитической эффективности. Энергия активации тесмздеструкции фсиопродукгов, определенная обоими методами составляет 2.81+0.22*104, 6.2+0.3*104 Дж/мэль, соответсвенно, и по порядку величины указывает на перокпидную природу фстопродукгсв псоралена.

6. Изучена стабильность продукте© фотоокисления пооралена в жидких растворах и в кристаллическом виде.

Установлено, что фспоокисленный в жидких растворах псорапен теряет свою гемолитическую эффективность по экспоненте с

1=4.6+0.19 ч-1. Если после облучения фсггсххисленный псорален высушить, то сухой кристаллический ФОП сохраняет гемолитическую эффективность неизменной за все время »еаблюдения (до 82 сутск). Этот факт является важнш в де^в создания новой лекарственной

фС1рМЫ.

ПУШКАШИ ПО ТЕМЕ /¡ИССЕРТА1?«.

1. А. I. Nawiev, I. S. Msroecbv, S. VVuuierlich, G. A. Kuznetsova, L. I. Eiragcva, and A. Ya Potapenko. Phyui ihiiu i yy i seirsi lized by toucedaniri, iroperatcrin, isoimperatorin end pranchimgm. //j.Chera.Biol.Kinetics.- 1992 -, V. 2, N. 1/2, pp.3-9

2. A. Ya. Potapenko, L. N. Bezdetnaya, E. P. Lysenko. A. A. Kyeeova, S. M Saparcv, A. I. Necriev, I.S.Mamecfov, M. I. Ismailcva. frlrocounwrin sensitized photcmodifiration of bionemfcranes. 4th Ctmsrress of the European Society for Photobiology. Abstracts September 1-6, Amsterdam RAI. The Netherlands. Elsevier Seqjoia, ¡.лхветпе 199 i, p. 104.

3. A. Ya. Potapenko, L. N. Bezdetnaya, E. P. Lysenko, A. A. Kyaecwa, S. M S&iottv, I. S. Miroetfov, R. E. f.tol layev, I. V. telichenKo and Zhunavel N. Merritrano toxic photodinemic effects f psoralen./11th International Cfcrgress of photobiology. Program and abstracts, 7-12 September., 1992., Kyoto, Japan.

4. A. Ya. Potapenko, E. P. Lysenko, A. A. Kyseova, S.M. Saforw.. I.S.Hamedov, N.Zhuravel. Psoralen sensitized photohaeirololysis

is a helpful model for elucidation of mechanisms of ptotodinsmic effects of psoralens in PUVA therapy. /Fi fth Ctoncress of the European Society for ph°tobiolcwy., Sept. 19-26, Marburv, Germany.

5. A. Ya. Potocenko, L. N. Bezdetnaya, F.. P. Lysenko, A. A. Kyagova, I.S. Mamedov, hi. V. f.faiakhcw, N. N. Zhunavel. Cheau luminescent (CHI.) investigations of photodynemic reactions of psoralens in FWA-therapy. / International Cfcmference on clinical chemiItitiinescenc»., Berlin, April 25-28, 1994.