Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние температуры и осмотических факторов средына транспорт анионов в эритроцитах
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние температуры и осмотических факторов средына транспорт анионов в эритроцитах"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ШСТИШТ ПРИЩЕМ КРІОБІОЛОПЇІКРІОМЕДИЦИНИ

МЕЛЬНИК ЕДУАРД СТАШСЛАВОВИЧ *7

УДК:612.111.1:57.043:577.352.4

ВПЛИВ ТЕМПЕРАТУРИ І ОСМОТИЧНИХ ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА НА ТРАНСПОРТ АНІОНІВ В ЕРИТРОЦИТАХ

03.00.19 - кріобіологія і кріомедиціша

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня капдндата біологічних наук

ХАРКІВ - 2000

Дисертацією є рукопис. -

Роботу виконано на кафедрі фізіології людини та тварин Харківського Національного Університету ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти України та в Інституті проблем кріобіології 1 кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор БОНДАРЕНКО ВАЛЕРІЙ АНТОНОВИЧ

Харківський Національний Університет ім. В. Н. Каразіна, зав. кафедрою фізіології людини та тварин,

ІПКіК НАН України, зав. відділом кріофізіології клітини.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ГОРДІЄНКО ЄВГЕН ОЛЕКСАНДРОВИЧ

зав. відділом низькотемпературного консервування ШКіК НАН України.

Доктор біологічних наук, професор КАЛ ІМАН ПАВЛО АВКСЕНИЙОВИЧ

зав. кафедрою біохімії Харківського Національного Університету ім. В. Н. Каразіна.

Провідна установа:

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, м. Київ.

<■^0

Захист відбудеться « ■2Ь» _ 2000 року о. \о . годині

на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

61015, м. Харків -15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України,

61015, м. Харків -15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий « *2.0 » Сх.УАф&ДОІ. 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради докт. мед. наук, професор

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми

Успішне рішення проблем низькотемпературного зберігання клітин та тканин в кріобіологічній практиці нерозривно зв’язане з необхідністю подальшого вдосконалення багатокомпонентних середовищ. Саме від вибору композиційного складу консервуючих середовищ залежить, в кінцевій лічбі, наприклад, подовження терміну гіпотермічного зберігання органів і тканин [Pegg D. Е., 1986, Mitchell S., 1996, So P. W., 1998]. При цьому електролітному складу таких середовищ приділяється основна увага. Однак, якщо вибір катіонного складу розчинів, що використовуються для гіпотермічного зберігання органів, в головному, обмежений іонами натрію і калію, то аніонний склад перфузійних і промивних розчинів широко варіює як у видовому, так і у концентраційному відношенні.

Такий підхід не випадковий. В умовах гіпотермічного зберігання органів і тканин, кати робота систем активного транспорту катіонів значно блокується, функціонування аніонтранспортної системи, робота якої не залежить від рівня АТФ і внутрішньоклітинного рівня Са2+ [Bennekou P., 1988], триває, як показують і наші експерименти [Мельник Е. С., 1998], ще на досить високому рівні. В цих умовах потоки аніонів можуть бути визначальними у встановленні нового рівноважного стану клітин з навколишнім середовищем.

Одним з підходів, регулюючих роботу аніонтранспортної системи, є включення у захисні розчини непроникаючих або поволі проникаючих аніонів. Так, з використанням захисного середовища UW, що в якості непроникаючих аніонів містить лактобіонат або глюконат, час гіпотермічного зберігання органів значно поширився [Southard J. Н., 1990, Kurzawinski Т., 1994]. Такий підхід виявився виправданим і для людських еритроцитів [Бондаренко В. А., 1988].

В гой же час, структурно-функціональний стан самої аніонтранспортної системи, від якого, в кінцевій лічбі, залежить транспортний процес, залишається без уваги і практично не досліджується, особливо у вітчизняних роботах. Залишається відкритим питання і про включення в захисні середовища сполучень, здатних модифікувати функціональну активність аніонтранспортної системи. Між тим на еритроцитах було показано, що застосування, наприклад, інгібігора аніонного транспорту ДІДС може служити одним із засобів, контролюючих чутливість клітин до дії як холодового, так і гіпертонічного впливу [Рамазанов В. В., 1993].

В зв’язку з цим вивчення функціональних особливостей аніонного переносника в умовах гіпотермічного впливу, підвищеної осмолярності середовища, при чинності модифікаторів і інгібіторів представляє інтерес не тільки в плані розкриття механізмів, контролюючих тривкість клітин до гіпотермічного впливу, але і в плані підбору специфічних компонентів, здатних підвищити тривкість клітин та тканин до наступного гіпотермічного зберігання.

Зв’язок роботи з науковими темами

Дана дисертаційна робота виконана на кафедрі фізіології людини та тварин Харківського національного університету у межах теми «Дослідження процесів вікових змін адаптації і гомеостазу на різних етапах індивідуального розвитку організму», № держреєстрації 0198Ш05801 та в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини згідно з планом науково-дослідних робіт щодо теми «Клітинні механізми контролю холодової і осмотичної чутливості» /№ 2.2.6.53/.

Мета і задачі дослідження

Метою даної роботи являється визначення чутливості вихідних та вхідних потоків аніонів, які сполучаються з транспортом протонів, до дії підвищеної осмолярності середовища, зниження температури, модифікації цитоскелетних білків і поверхневого заряду еритроцитів.

Згідно поставленій меті були виділені наступні експериментальні задачі:

1. Оцінити характер впливу осмолярності середовища і зниження температури на швидкість вихідних та вхідних потоків аніонів хлору, які сполучаються з транспортом протонів.

2. Визначити вплив модифікації цитоскелетних біжів і змін поверхневого заряду мембрани на аніонтранспортну функцію еритроцитів.

3. На основі аналізу параметрів транспорту двох класів аніонів у нормі і при дії інгібітора аніонного транспорту ДІДС, виявити основні особливості роботи ані онтранспортної системи в залежності від виду присутнього в середовищі аніону.

Наукова новизна отриманих результатів

Отримані в роботі результати дозволяють зробити висновок про різну чутливість вихідних і вхідних потоків аніонів в залежності від ушкоджуючих факторів середовища і після обробки еритроцитів хімічними модифікаторами.

з

У випадку нативних сріггроцитів виявляється адитивний ефект зниження температури і підвищення осмолярності середовища на блокування вхідних потоків аніонів. Однак після модифікації цитоскеліетних білків геміном цей ефект спостерігається і у випадку вихідних потоків аніонів. При цьому було вперше виявлено, що обробка еритроцитів геміном блокує котранспорт аніонів та протонів. Даний ефект геміну значно посилюється при зниженні температури і зростанні осмолярності середовища. Вперше показано, що дія інгібітора аніонного транспорту ДІДС на котранспорт аніонів та протонів суттєво посилюється з підвищенням осмолярності середовища, зниженні температури та модифікації геміном. При цьому ступінь блокування ДІДС транспорту аніонів залежить від виду аніону, що транспортується. Зміни у поверхневому заряді еритроцитів під впливом катіонів латану не впливають на інгібуючу дію ДІДС.

Теоретичне та практичне значення о триманих результатів

Проведені дослідження дозволяють обгрунтувати нові підходи щодо підбору складу консервуючих середовищ з урахуванням видів аніонів і модифікаторів структурно-функціонального стану аніонтранспортної системи. Врахування спрямованості аніонних потоків при корекції осмотичного стану клітин за допомогою модифікаторів направленої дії може застосовуватися, враховуючи поширеність ізоформ аніонного переносника, не тільки для еритроцитів, але і для інших клітин організму.

Знайдені особливості транспорту різних видів аніонів в умовах модифікації аніонтранспортної системи припускають використання засобу рН-метрії, поряд з іншими біохімічними показниками, для оцінки структурно-функціонального стану аніонного переносника, що може знайти своє застосування в діагностиці ряду патологічних станів організму, які зв’язані з структурною модифікацією білка смути 3.

Особистий внесок здобувана

Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Автор самостійно вирішив поставлені експериментальні задачі, провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки. Роботи, які мають відношення до теми дисертації, що опублікувалися у співавторстві з Рама-зановим В. В., Бондаренко В. А. відображають результати, що стосуються загального планування експерименту та підготовки матеріалів до друку. Автор вдячний співробітникам кафедри біофізики ХНУ Попову А. Н. та Древалю В. І., а також Рошалю О. Д. з НДІ хімії при ХНУ за допомогу в проведенні експериментів.

Апробація результатів дисертації

Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: Конференціях молодих вчених ХДУ (м. Харків, 1996, 1997 р.), II з’їзді Українського біофізичного товариства (м. Харків, 1998 р.)

Публікації

За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, 4 з яких - у центральних фахових журналах.

Обсяг та структура дисертації

Матеріали викладено на 140 сторінках друкованого тексту і містять вступ, огляд літератури (1 розділ), матеріали і методи досліджень (2 розділ), результати досліджень та їх обговорення (3 розділ), заключення, висновки, 23 ілюстрації і 10 таблиць, розміщених по тексту, списка літератури, який містить 180 літературних джерел (20 сторінок), додатки (6 сторінок).

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У першому підрозділі огляду літератури зроблено аналіз даних, що стосуються іонного складу основних перфузійних та промітних розчинів, які використовуються для гіпотермічного зберігання органів. У другому підрозділі, який складається з двох пунктів, наведені дані про структурний стан білка смуги 3 та деяких його ізоформ; розглядається механізм транспорту аніонів та вплив на нього параметрів середовища, інгібіторів, модифікаторів; показано, яку роль білок смуги 3 відіграє у морфологічному і метаболічному стані еритроцитів. У третьому підрозділі розітнута роль поверхневого заряду клітин у транспорті іонів та структурному стані компонентів мембрани. Наведені дані про вплив факторів середовища на зміни у поверхневому заряді клітин.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експерименти проводили на еритроцитах свіжої донорської крові людини, отриманої з Харківської обласної станції переливання крові.

Однонаправлені потоки аніонів, які сполучаються з транспортом

- протонів, досліджували методом рН-метри. Еритроцити з гематокритом 2% вміщували в термостатовану кювету з рН-електродом і різними концентраціями сахарози. Після встановлення рН вносили аніони: С1~, Вг~ , І-,

NOJ, SO^_, катіони La3+, а також інгібітор аніонного транспорту ДІДС

фірми «Sigma» (США). Функціонування аніонного каналу еритроцитів оцінювали по динаміці зміни pH суспензії клітин і реєстрували за допомогою самописця Ендім (ГДР).

Обробку еритроцитів (20% гематокрит) геміном здійснювали по [Shaklai N.. 1986].

Вихід іонів калію з еритроцитів визначали за допомогою валіпоміцинового електроду ОР-К-07113 (Венгрія).

Для аналізу зміни форми еритроцитів під дією ізотонічних і гіпертонічних розчинів сахарози та хімічних модифікаторів при 37°С і при 0°С використовували мікроскопію.

Електрофоретичну швидкість еритроцитів визначали .методом мікроелектрофорезу у прямокутній комірці [Харамоненко С. С., 1974]. Дзе-та-потенціал розраховували по формулі Ейнштейна-Смолуховського.

Флуоресцентні дослідження здійснювали на спектрофлуориметрі Hitachi F-4010, використовуючи флуоресцентний зонд ДІДС та 1,8-АНС фірми «Serva» (СІЛА). Статистичну обробку результатів проводили за методом Ст’юдента-Фішера [Лакин Г. Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження транспорту аніонів хлору, який сполучається з транспортом протонів

Тривкість клітин, збереження та підтримання клітинного гомеостазу контролюється складним комплексом транспортних систем, серед яких значна роль належить аніонтранспортній системі. В умовах різкої зміни параметрів зовнішнього середовища (pH, осмолярність, температура), що відбувається на етапах консервування клітин, осмотичний стан еритроцитів контролюється, насамперед, потоками води і аніонів хлору [Glazer R., 1983]. Це стало посилкою проведення експериментів по вивченню, в першу чергу, однонаправлених потоків аніонів, а не обмінного транспорту аніонів, в залежності від різних параметрів середовища.

З приведених даних на рис. 1, на якому криві закислення та залуження суспензії еритроцитів відображені у напівлогарифмічній формі, можна зробити висновок, що котранспорт аніонів хлору та протонів з клітин, якому відповідає закислення суспензії, не залежить від осмолярності середовища як при 37°С (криві 2 і 3), так і при 3°С (криві 5 і 6). В той же час, котранспорт аніонів хлору та протонів в клітини, якому відповідає залу-

ження суспензії еритроцитів, виявляє більшу чутливість як до зміни осмо-лярності середовища (криві 1 і 4), так і до зниження температури (криві 7 і 8) в порівнянні з котранспортом аніонів хлору та протонів з клітин (криві 5 і 6). Однак, слід відзначити, в ізотонічних умовах при 37°С швидкість котранспорту аніонів хлору та протонів в клітини та із клітин практично однакова (криві 1 і 2).

Рис. 1. Вплив температури і осмолярносгі се-1 ^ ^ Час, хв. родовища на швидкість закислення і залужен-

-----ая суспензії еритроцитів. Транспорт хлорвд-

іону і протону: 1- в клітину в 0.3М сахарозі при 37°С; 2 - із клітини в 0.3М сахарозі при 37°С; 3 - із клітини в 0.86М сахарозі при 37°С;

4 - в клітину в 0.86М сахарозі при 37°С; 5 - із клітини в 0.3М сахарозі при 3°С; 6 - із клітини в 0.86М сахарозі при 3°С; 7 - в клітину в О.ЗМ сахарозі при 3°С; 8 - клітину в 0.86М сахарозі при 3°С.

Дія інгібітора аніонного транспорт}' ДІДС, як це видно з табл. 1, на котранспорт аніонів хлору та протонів в клітини та із клітин, також виявляє відмінності. Котранспорт аніонів хлору та протонів з клітини інгібується ДІДС в більшій мірі ніж котранспорт аніонів в клітини, особливо у гіпертонічних розчинах сахарози. Такі відмінності зберігаються і при зниженні температури. Крім того видно, що підвищення осмолярності середовища значно посилює інгібуючу дію ДІДС на транспорт аніонів.

Таблиця 1

Вплив інгібітора аніонного транспорту (ДІДС) на котранспорт хло-рид-іопів і протонів

Середовище и °С Котранспорт хлорид-іонів і протонів

із клітини, % в клітину, %

О.ЗМ сахароза 37 27 21

0.86М сахароза 37 52 ЗО

О.ЗМ сахароза 3 42 43

0.86М сахароза 3 57 38

Обробка еритроцитів модифікатором цитоскелетних білків геміном, під вгшшом якого, як було показано [Рамазанов В. В., 1993], значно знижується

чутливість еритроцитів до холодового та гіпертонічного шоку, не приводять до значних відмінностей у транспорті аніонів при 37°С (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив обробки геміном на блокування швидкості закислення та залуження суспензії еритроцитів. (%)

Середовище 1, °С Закислення Залуження

О.ЗМ сахароза О.ЗМ сахароза+ДІДС 37 - -

46 40

0.86 М сахароза 0.86 М сахароза+ДІДС 37 - 12

79 54

О.ЗМ сахароза О.ЗМ сахароза+ДІДС 3 18 50

73 72

0.86 М сахароза 0.86М сахароза+ДІДС 3 42 51

90 81

Але зниження температури середовища до 3°С виявляє інгібуючий ефект обробки еритроцитів геміном на котранспорт аніонів та протонів, який посилюється в гіпертонічних умовах. Інгібуючий ефект геміну на два потоки аніонів в клітину та із клітини при 3°С також відрізняється. Закислення суспензії оброблених геміном еритроцитів, якому відповідає котранспорт аніонів та протонів з клітин при 3°С, виявляє залежність від осмоляр-ності середовища (табл. 2). В той же час, залуження суспензії гемін-оброблених еритроцитів, якому відповідає котранспорт аніонів та протонів в клітини, блокується при 3°С в більшій мірі і вже не залежить від осмоляр-ності середовища.

Інгібуюча дія ДІДС на котранспорт аніонів та протонів в гемін-оброблених еритроцитах по зрівнянню з нативними еритроцитами значно посилюється як при 37°С, так і при 3°С (табл. 2). В даному випадку спостерігається адитивна дія двох реагентів - геміна і ДІДС - на блокування котранспорту аніонів та протонів.

Для більш детального вивчення функціонування аніонного переносника в умовах модифікації геміном, ДІДС та гіпертонічного впливу, були проведені експерименти, в яких використовувались два різних класи аніонів.

Транспорт двох класів аніонів в умовах модифікації аніон-транспортної системи

Відомо, що швидкість транспорту аніонів залежить не тільки від заряду молекули, але також і от структури аніону, яка визначає енергію активації процесу переносу. Аніонний переносних, який здійснює транспорт великої кількості неорганічних та органічних аніонів, виявляє високу специфічність до транспорту двох таких різних за структурою фізіологічних

субстратів - СГ і НСО3 . При цьому структура галогенід-зв’язуючого сайту може значно відрізнятися від структури оксианіон-зв’язугочого сайту, що обумовлює включення у процес транспорту різних сегментів білкової молекули аніонного переносника.

Виходячи з цього, для вивчення функціонального стану аніонного переносника в умовах його модифікації, було обрано два класи аніонів -

_ _ 2— сферичні галогеніди (СІ , Вг~, І~) і несферичні оксианіони (N03 , Б04 ).

Отримані дані проілюстровані у таблиці 3.

Таблиця З

Інгібування швидкості залуження суспензії оброблених геміном ерит-

роцитів у присутності різних видів аніонів, (%

Середовище 1, °С N05 БО^- СГ Вг“ .Г

О.ЗМ сахароза 37 14 26 - - -

О.ЗМ сахароза+ДІДС 37 29 65 40 45 36

0.86М сахароза 37 21 28 12 12 16

0.86М сахароза+ДІДС 37 41 81 54 60 48

Видно, що обробка еритроцитів геміном приводить до більшого гальмування швидкості транспорту оксианіонів по зрівнянню з гало-генідними аніонами. При цьому дані особливості спостерігаються як в ізотонічних розчинах сахарози, так і в гіпертонічних. Треба відмітити, що транспорт оксианіонів при 37°С блокується під впливом геміну і без присутності ДІДС, що не спостерігається для галогенідних аніонів. Тобто модифікація аніонного переносника відбувається, але виявляється не для всіх видів аніонів.

Виявляються відмінності у транспорті різних аніонів, як це видно з даних таблиці 3, і при дії інгібітора аніонного транспорту ДІДС. Так, найменше іні'ібування спостерігається для транспорту нітрат-іонів, а найбільше

- для транспорту сульфат-іонів. Підвищення осмолярності середовища приводить до зростання блокуючої дії ДІДС на транспорт усіх видів аніонів.

Такі особливості у транспорті аніонів під впливом модифікації геміну і ДІДС можно обгрунтувати у межах гіпотези Лаботка-Галантер, в якій характер взаємодії аніонів з транспортним сайтом залежить, в першу чергу, від висоти молекули, а не від її заряду. Тобто, можна припустити, що обробка геміном модифікує аніонний канал в якомусь одному вимірі. Незалежність цієї модифікуючої дії від підвищення осмолярності середовища, в випадку транспорту сульфат-іонів (табл. 3), вказує на можливість включення інших механізмів, які приймають участь у регуляції транспорту аніонів. Це можуть бути зарядові ефекти (теорії Ганна, Зевса).

З метою виявити такі ефекти, оцінити вплив змін у поверхневому заряді клітин і гідратному шарі мембрани на транспорт аніонів, були використані катіони лантану. Виявлено, що катіони лантану у концентрації ЗО мкмоль/л не приводять до значних змін у транспорті одновалентних аніонів, годі як швидкість транспорту сульфат-іонів значно знижується, особливо в ізотонічних розчинах сахарози на 36% (табл. 4).

Таблиця 4

Зниження швидкості залуження суспензії еритроцитів після додавання різних видів аніонів у присутності іонів Ьа3+, (%).

Середовище t, °С NOJ soz4~ Cl" Вг~ J"

О.ЗМ сахароза 37 5 36 - - -

О.ЗМ сахароза+ДІДС 37 - - - - -

0.86М сахароза 37 12 19 - 11 9

Q.86M сахароза+ДІДС 37 - - - - -

При цьому вплив ДІДС на транспорт аніонів у присутності катіонів лантану не змінюється, що вказує на незалежний механізм блокування транспорту аніонів цими двома реагентами. Крім того, під впливом катіонів лантану змінюється також і pH-залежний транспорт сульфат-іонів (рис. 2).

Це дозволяє припустити, що катіони лантану зв’язуються з карбоксильними групами білка смуги 3, які приймають участь у рН-залежному транспорті сульфат-іонів [Jennings М. L., 1988].

Для того, щоб оцінити можливий взаємозв’язок змін, що відбуваються у структурі мембрани еритроцитів під впливом різних модифікацій з процесом транспорту аніонів, були виконані наступні дослідження.

Рис. 2. Вплив катіонів лантану на котранспорт аніонів і протонів в еритроцити в середовищі, що містить О.ЗМ сахарозу при 37°С. (1 - контрольні еритроцити; 2 - нативні еритроцити у присутності катіонів лантану (30 мкмоль/л);

З - нативні еритроцити у присутності ДІДС (2 мкмоль/л); 4 - нативні еритроцити у присутності катіонів лантану і ДІДС (2 мкмоль/л)).

Морфологічні і електрокінетичні особливості еритроцитів у сахароз-них середовищах

Проникливість мембрани до різних сполук, робота мембрано -зв’язаних ферментів та взаємодія цитоскелетних білків в значній мірі залежить від фізичних якостей ліпідної фази мембрани, в першу чергу, поверхневого заряду та мікров’язкості. В цьому відношенні, оцінка змін макроскопічної структури клітин (форма) і мікроскопічної (електростатичні параметри) можуть служити додатковими показниками, що впливають на транспортні процеси в клітинах.

Результати мікроскопії свідчать, що після обробки геміном більшість еритроцитів приймає форму сфероехіноцитів, яка вже не змінюється під впливом інших реагентів і факторів середовища. Це вказує на значне руйнування нативних конформацій білків цитоскелету.

Спостерігається схожа направленість морфологічних змін еритроцитів під впливом ДІДС і лантану, що виявляється і при зниженні температури, і з підвищенням осмолярносгі сахарозшіх середовищ. Це може свідчити про те, що вказані реагенти, враховуючи їх дію на транспорт аніонів, можуть впливати на одну структурну компоненту мембрани. В той же час, дія ДІДС та лантану на поверхневий зарад еріироцитів значно відрізняється (табл. 5).

Якщо ДІДС не викликає змін у дзета-потенціалі еритроцитів, то катіони лантану суттєво знижують його. В гемін-оброблених еритроцитах також спостерігається зниження дзета-потенціалу. Це вказує на те, що блокування транспорту аніонів після обробки геміном може відбуватися за рахунок модифікації аніон-адсорбуючих сайтів, які розташовані біля входу аніонного каналу.

Час, хв.

Таблиця 5

Електроісінетичні властивості еритроцитів в залежності від складу середовища

Суспензіонне середовище ЭФП, см2В-і-сМ ^-потенціал, мВ

О.Змоль/лсахароза+О.ОІ моль/л КаСІ к -1.97І0.10 -32.11

г -1.85І0.10 -30.15

03 мош^л сахароза-Н3.025 мош/л N аО к -1.68+0.06 -27.38

г -1.49І0.06 -24.28

0.3 моль/л сахароза+0.05 моль/л ЫаС1 к -1.48І0.05 -24.12

г -1.26І0.06 -20.53

0.3 моль/л сахароза+ЩО моль/л NаСІ к -I.34i0.05 -21.84

г -I.09i0.05 -17.76

0.3 моль/л сахароза+0. 15 моль/л N аСІ к -I.18i0.03 -19.23

І’ -0.95i0.03 -15.48

Забуферений фізіологічний розчин pH 7.4 к -I.10i0.03 -15.76

г -0.8910.07 -12.51

Забуферений фізіологічний розчин pH 7.4 +ДІДС 2мкмоль/л к -1.08+0.03 -15.64

г -0.92+0.03 -12.78

0.86 магпУл сахарсш+0,01 моль/л №іС1 к -1.02+0.10 -29.18

г -0.87+0.10 -24.89

0.86 моль/л сахароза+0.025 маль/л N аСЗ к -0.81+0.07 -23.17

г -0.71+0.07 -20.31

0.86 моль/Ст сахароза+й05 мсль/л N30 к -0.54+0.05 -15.44

г -0.42+0.05 -12.01

0.86 моль/л сахнраза+0.10 мсдьйі N30 к -0.67+0.04 -19.16

г -0.55i0.05 -15.73

0.86 маль/л сахараза+0.15 моль/л №іСІ к -0.61І0.03 -17.11

г -0.49i0.05 -14.02

Тріс.-НСІ буфер pH 7.4 +30 мкмоль/л Ьа+3 к -0.81І0.08 -11.64

г - -

к - контрольні еритроцити; г - еритроцити, що оброблені геміном.

Експерименти по вивченню електрофоретичної швидкості нативних еритроцитів у сахарозних середовищах з різною концентрацією хлориду натрію виявляють область різкого зниження дзета-потенціалу клітин у розчинах 0.86 М сахарози+10-50 мМ ИаСІ (рис. 3).

концентрація №С1, ммоль/л Рис. 3. Дзета-потенціал еритроцитів в сахарозних середовищах з різною концентрацією N30 при pH 7.4 і / 25°С (1 - О.ЗМ сахароза; 2 - 0.86М сахароза).

Це вказує на зміни електростатичної структури поверхні мембрани в умовах гіпертонічного впливу. Такі зміни у перерозподілі зарядів під впливом гіпертонічних розчинів сахарози та геміну можуть викликати зміни і структурного стану аніонного каналу. Вивченню цього питання присвячений наступний розділ досліджень.

Дослідження структурного стану аніонного каналу флуоресцентним методом

Важливою характеристикою як мембрани, так і окремих її компонентів може служити перерозподіл флуоресцентного зонду між мембраною та зовнішнім середовищем, на яке впливають різні структурні зміни у мембрані. Використання інгібітору аніонного транспорту ДІДС в якості флуоресцентного зонду, 90% якого специфічно і незворотньо зв’язується з білком смуги 3, може дати важливі свідчення з стану аніонного каналу в умовах різних модифікуючих впливів.

Дані флуоресцентного аналізу показують (рис. 4), що зв’язування молекул зонду з нативними еритроцитами супроводиться значним зниженням інтенсивності флуоресценції (криві 4, 5, 6). При цьому, якщо в

ізотонічних розчинах сахарози та фізіологічному розчину значення інтенсивностей флуоресценції співпадають (криві 5 і 6), то в гіпертонічних (0.86 М) сахарозних розчинах спостерігається суттєве підвищення інтенсивності флуоресценції ДІДС (крива 4), що вказує на структурні зміни аніонного каналу нативних еритроцитів.

Рис. 4. Спектри флуоресценції ДІДС (2 місМ) у залежності від концентрації сахарози (1 - без еритроцитів в 0.86М сахарозі; 2 - без еритроцитів в О.ЗМ сахарозі; 3 - без еритроцитів у фіз. розчині; 4 - з нативнимп еритроцитами в 0.86М сахарозі; 5 - з нативними еритроцитами в О.ЗМ сахарозі; 6 - з натив-нимн еритроцитами у фіз. розчині).

Підвищення інтенсивності флуоресценції ДІДС спостерігається і при зв'язуванні зонду з гемін-обробленими еритроцитами в порівнянні з натив-ннми, особливо у гіпертонічному середовищі (рис. 5, криві 1 і 4). При зв’язуванні ДІДС з гемін-обробленими еритроцитами змінюється також і форма спектру флуоресценції (крива 1), що свідчить про значну структурну модифікацію аніонного каналу під впливом геміну. Про такі структурні зміни після обробки еритроцитів геміном свідчать також і зміни в інтенсивності флуоресценції ДІДС в умовах зростання трансмембранного потенціалу еритроцитів після виходу аніонів хлору (рис. 5). Якщо в нативних еритроцитах відбувається незначне підвищення інтенсивності флуоресценції (криві 3 і 4), то в гемін-оброблених навпаки - зниження інтенсивності флуоресценції зонду і зміна форми спектру флуоресценції (криві 1 і 2).

Рис. 5. Спектри флуоресценції ДІДС (2 мкМ) в 0,86 М сахарозі (1- з еритроцитами, що оброблені геміном; 2- з еритроцитами, що оброблені геміном (ДІДС додавався через дві хвилини після еритроцитів); 3- з нативними еритроцитами (ДІДС додавався через дві хвилини після еритроцитів); 4- з нативними еритроцитами).

ВИСНОВКИ

1. Транспорт аніонів, ж фактор, контролюючий осмотичний стан клітин, обумовлює їх чутливість до змін температурних та осмотичних параметрів середовища. Отримані результати дозволяють розширити уявлення щодо механізмів чутливості транспорту аніонів до несприятливих умов середовища, а також щодо можливостей регулювання процесів, які контролюють потоками аніонів. Показано, що котранспорт аніонів та протонів в клітину виявляє більшу чутливість до зниження температури, гіпертонічного впливу, модифікації геміном по зрівнянню з котранспортом аніонів та протонів з клітин.

2. Зниження температури, підвищення осмолярності середовища та модифікація еритроцитів геміном приводить до зростання блокуючої дії інгібітора аніонного транспорту ДІДС на котранспорт аніонів та протонів. При цьому вхідні потоки аніонів блокуються значно менше вихідних. Інгібуюча дія ДІДС залежить від виду аніону, який транспортується, що вказує на можливість регулювання аніонного складу клітин.

3. Зниження температури середовища до З'С виявляє інгібуючу дію модифікатора цитоскелетних білків геміну на котранспорт аніонів та протонів, яка значно зростає з підвищенням осмолярності середовища.

_ 'у _

4. Транспорт оксианіонів (N03 , ) після обробки еритроцитів

модифікатором білків цитоскелета геміном блокується в більшій мірі п.о

зрівнянню з транспортом галогенідних аніонів (СІ-, Вг~, І-), що говорить про більшу залежність транспорту оксианіонів від стану цитоскелет-них білків.

5. Катіони лантану не викликають значного гальмування транспорту одновалентних аніонів (СГ, Вг~ , Г, Ж>з ), тоді як швидкість транспорту сульфат-іонів значно гальмується, що вказує на більшу чутливість процесу транспорту сульфат-іонів до зниження поверхневого заряду клітини.

6. Обробка еритроцитів геміном, лантаном приводить до зниження дзета-потенциалу, годі ж ДІД С не впливає на нього. У 0.86М сахарозі+ІО-50мМ ЫаС1 виявляється область різкого зниження дзета-потеїщіалу натив-них еритроцитів, що не спостерігається у О.ЗМ розчинах сахарози+10-50мМ N301. Це відображає зміну просторового розподілу заряджених груп на поверхні мембрани у гіпертонічних умовах.

7. В умовах гіпертонічного впливу (0.86М сахарози), а також після обробки еритроцитів геміном, інтенсивність флуоресценції ДІДС зростає, що говорить о структурних змінах аніонного каналу під впливом даних факторів.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Рамазанов В. В., Семенченко А. Ю., Воловсльская Б. Л., Мельник Э. С., Бондаренко В. А. Влияние прочности связи периферических белков с мембранами на гипертонический шок эритроцитов. // Проблемы криобиологии. - 1996. - №3. - С. 8-11.

2. Рамазанов В. В., Семенченко А. Ю., Воловельская Е. Л., Мельник Э. С., Бондаренко В. А. Действие протеолитической обработки на Холодовой шок эритроцитов. // Проблемы криобиологии. - 1998. - №2. - С. 46-49.

3. Мельник Э. С. Осмотически индуцированные потоки хлорид-аниона и протона в контроле температурного воздействия на эритроциты. // Проблемы криобиологии. - 1998. - №3. - С. 42-45.

4. Рамазанов В. В., Мельник Э. С., Бондаренко В. А. Функционирование анионного канала эритроцитов в условиях модификации и гипертонического воздействия. // Проблемы криобиологии. - 1999. - №2. - С. 44-49

5. Мельник Э. С. Влияние прочности связи периферических белков с мембранами на гипертонический шок эритроцитов. // Труды конф. молодых ученых ХГУ.: Харьков, 1996. - С. 38.

6. Мельник Б. С., Рамазанов В. В., Бондаренко В. А. Модифікуюча дія геміну на аніонтранспортну систему еритроцитів. // II з’їзд Українського біофіз. тов-ва. - Тез. доп., Харків. - 1998. - С. 76.

АНОТАЦІЇ

Мельник Е. С. Вплив температури і осмотичних факторів середовища на транспорт аніонів в еритроцитах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2000.

Дисертацію присвячено вивченню аніонного транспорту еритроцитів, який сполучається з рухом протонів, у сахарозно-солевих середовищах і впливу на цей транспорт зниження температури до 3°С, осмолярності середовища, інгібітору аніонного транспорту ДІДС, модифікатора білків цитоскелету геміну та поверхневого заряду клітин. Проведено порівняння чутливості вхідних та вихідних потоків аніонів до вказаних факторів. Отримані результати дозволяють зробити висновок, що котранспорт аніонів та протонів в клітину більш чутливий до зниження температури, гіпертонічного впливу та модифікації геміном. У роботі показана можливість рсгулюваніш потоками різних видів аніонів, що може знайти своє практичне використання в умовах гіпотермічного зберігання органів і тканин.

Ключові слова: еритроцит, транспорт аніонів, охолодження,

гіпертонічний вплив, ДІДС, гемін.

Мельник Э. С. Влияние температуры и осмотических факторов среды на транспорт анионов в эритроцитах. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2000.

Диссертация посвящена изучению анионного транспорта эритроцитов, сопряженного с движением протонов, в сахарозно-солевых растворах и влиянию на этот транспорт снижения температуры до 3°С, осмолярности среды, ингибитора анионного транспорта ДИДС, модификатора белков цитоскелета гемина и поверхностного заряда клеток. Проведено сравнение чувствительности входящих в клетку и выходящих из клетки потоков анионов к указанным воздействиям. Полученные результаты позволяют сделать

вывод о том, что котранспорт анионов и протонов в клетку более чувствителен к снижению температуры, гипертоническому воздействию и модификации гемином. В работе показана возможность управления потоками различных видов анионов в клетку, что может найти свое применение при ги-потермическом хранении органов и тканей.

Объектом исследования служили эритроциты свежей донорской крови человека.

В работе проведены: изучение действия на индуцированный изменением ионной силы среды транспорт анионов хлора ингибитора анионного транспорта ДИДС и модификатора белков цитоскелета гемина при 37°С и 3°С в изотонических (О.ЗМ сахароза) и гипертонических (0.86М сахароза)

средах; сравнение транспорта оксианионов (N03 , ) с транспортом

галогенидных ионов (СГ, Вг_ , I-) в тех же условиях; измерение выхода из клеток катионов калия в присутствии ДЙДС и после обработки эритроцитов гемином в сахарозных средах; измерение электрофоретической подвижности эритроцитов и расчет величины дзета-потенциала; расчет мембранного потенциала из данных измерения pH; изучение влияния изменений в поверхностном заряде клеток в присутствии катионов лантана на транспорт различных видов анионов; микроскопическое изучение формы клеток в условиях различных воздействий; оценка состояния анионного канала по флуоресценции ДИДС и 1,8-АНС в сахарозных средах различной осмолярности и после обработки клеток гемином.

Обнаружено, что блокирующее действие ингибитора анионного транспорта ДИДС может значительно усиливаться при снижении температуры, гипертоническом воздействии и модификации цитоскелетных белков эритроцитов. В то же время снижение поверхностного заряда клеток и перестройка гидратного слоя мембраны под влиянием катионов лантана не изменяет ингибирующей способности ДИДС на транспорт всех видов используемых анионов. Кроме этого, отличительной особенностью ингибирующего действия ДИДС по сравнению с другими модифицирующими воздействиями на транспорт анионов, которые использовались в работе, является большее блокирование выходящих потоков анионов, а не входящих. Если учитывать еще и тот факт, что блокирование ДИДС транспорта анионов зависит от вида транспортируемого аниона, то создаются возможности для регуляции проницаемости клеток к различным видам присутствующих в среде анионам, а значит, и осмотическим состоянием клеток на разных этапах консервации.

Снижение температуры среды до 3°С или повышение осмолярности сахарозных растворов вызывают также и ряд других модификаций структурно-функционального состояния анионтранспортной системы эритроцитов. Так, снижение температуры среды, кроме общего торможения транспорта анионов, выявляет ингибирующее действие обработки эритроцитов модификатором белков цитоскелета гемина на транспорт анионов, которое не наблюдалось при 37°С. А повышение осмолярности среды до 0.86М значительно усиливает эффекты других модифицирующих воздействий (ДИДС, гемина, снижения температуры) на транспорт анионов в эритроцитах. Данное обстоятельство может быть обусловлено, с одной стороны, как модификацией структурного состояния анионного переносчика, на что указывают данные по исследованию флуоресценции ДИДС, так и, с другой стороны, изменениями пространственного распределения заряженных групп на поверхности мембраны клеток, на что указывают данные по изучению электрофоретической подвижности эритроцитов в сахарозносолевых средах.

Ключевые слова: эритроцит, транспорт анионов, охлаждение, гипертоническое воздействие, ДИДС, гемин.

Melnik Е. S. The influence of temperature and osmotic factors of medium on anionic transport in erythrocytes. - Manuscript.

The thesis for scientific degree of candidate’s biological sciences on speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Science of Ukraine, Kharkov, 2000.

The dissertation is devoted to the study of cotransport of anions and protons in erythrocytes in sugar - saline - water media. The influence of decrease of temperature up to 3°C, osmotic properties of media, anionic transport inhibitor (DIDS), hemin and surface charge of cell on the anionic transport has been studied. The comparison of sensitivity of ingoing and outgoing streams of anions in cell under the abovementioned actions has been made. On the basis of obtained results, the conclusion has been made that cotransport of anions and protons into a cell is more sensitive to temperature decrease, hypertonic influence and hemin modifications. The possibility to control the streams of different anions in ccll has been shown. This possibility to control the streams of anions could be useful for cell and tissue storage.

Key words: erythrocyte, anionic transport, cooling, hypertonic effect, DIDS, hemin.