Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемолиз эритроцитов детергентами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гемолиз эритроцитов детергентами"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

УДК 577.352

СЕНЬКОВИЧ Ольга Алексеевна ГЕМОЛИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ДЕТЕРГЕНТАМИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1998

Работа выполнена в Лаборатории физико-химии биологических мембран Института фотобиологии HAH Беларуси

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор ЧЕРНИЦКИЙ Е.А. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик НАНБ, профессор КОНЕВ C.B. кандидат физико-математических наук, доцент ХМЕЛЬНИЦКИИ А.И.

Оппонирующая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится " 'V " марта 1998 г. в 77 часов на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.37.01 в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси.

Автореферат разослан" $ " февраля 1998 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

Л.Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Эритроциты представляют удобный и широко используемый объект исследований мембранной биофизики. Кроме того, являясь составной частью крови, они несут информацию о патологических изменениях в организме и их часто используют для диагностики ряда заболеваний. Важным параметром, характеризующим структурное состояние эритроцитов, является их устойчивость к гемолизу, индуцированному различными факторами (теплом, светом, изменением ионной силы и pH среды, добавлением химических агентов и др.). Особое место среди всех видов гемолитических воздействий занимает гемолиз ам-фифильными веществами и, в частности, детергентами. Эти вещества обладают ярко выраженным мембранотропным действием на клетку, их также используют для обеззараживания плазмы крови от лшхнд-окутанных вирусов, в том числе вируса иммунодефицита человека [Horowitz, 1992]. Вместе с тем механизм гемолиза этими веществами остается невыясненым и в отличие от осмотического и коллоидно-осмотического механизмов его часто пазьшают "детергенто-подобным" [Rowe, Welch, 1994]. Такая классификация только запутывает картину, поскольку недавние исследования [Bielawski, 1990] подтвердили уже частично забытые данные [Rideal, Taylor, 1957; 1958], что детергенты в зависимости от их концентрации (в домицел-лярной области) могут вызывать два различающихся по механизму вида гемолиза.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Различные этапы этой работы выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по теме: "Изучение молекулярных механизмов старения эритроцитов" (Регуляция 05), Государственной программы фундаментальных исследований по теме: "Изучение механизмов окислительного повреждения мембран клеток крови" (Функционирование биосистем 25), а также гранта для молодых ученых М96-005 Белорусского республиканской фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь по теме: "Везикулярно-гемолитические эффекты под воздействием детергента Na-додецилсульфата".

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснить механизмы гемолиза детергентами, а также установить связь между параметрами гемолиза и структурно-функциональным состоянием мембран эритроцитов. Поставленная цель включала решение следующих задач:

- изучить параметры (процент и скорость) быстрого и медленного гемолиза эритроцитов двумя детергентами: анионным Ма-додецичсулъфятсг.г ~ неионным тритоном Х-100 в различных условиях (при изменении температуры и концентрации гемолитика, а также при добавлении в среду одно- и двухвалентных катионов);

- оценить размеры пор, ответственных за быстрый и медленный гемолиз указанными детергентами;

- установить причину гетерогенности эритроцитов в популяции по отношению к быстрому гемолизу Na-додецилсульфатом, а также выяснить, является ли данный процесс по своей природе коллоидно-осмотическим;

- выявить возможность использования параметров гемолиза Ка-додецилсуль-фатом для оценки структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.

Научная новизна полученных результатов» Показано, что в зависимости от концентрации тритона Х-100 в мембране эритроцитов мохут образовываться 3 вида пор, характеризуемых различным количеством молекул гемолитика, необходимых для образования одной поры (с кажущимися порядкам реакции гемолиза п=3-5; п=11-12;п=9-10).

Получены доказательства в пользу того, что поры, ответственные за быстрый гемолиз Ш-додецилсульфатом (п=3-4), образуются с участием фосфагидалхолина.

Показано, что поры, ответственные за быстрый и медленный гемолиз детергентами, обладают сходными свойствами: их проницаемость меняется аналогичным образом при добавлении в среду одно- и двухвалентных катионов Ъъ "), а величины энергий активации соответствующих гемолитических процессов имеют близкие значения.

Установлено, что диаметр пор, ответственных за медленный гемолиз детергентами, составляет около 35 А, а размер пор, соответствующих быстрому гемолизу N а-додецилсульфатом, гораздо больше этой величины.

Обнаружен необычный эффект осмотических протекторов, заключающийся в ингабировании образования крупных пор.

Показано, что детергент-индуцируемая везикуляция является процессом, конкурирующим с образованием пор, а быстрый гемолиз Ыа-додецнлсульфатом отбирает эритроциты по их способности к везикуляции.

Установлено, что механизм быстрого гемолиза Ыа-додецилсульфатом является не коллоидно-осмотическим; дана схема процессов, участвующих в гемолизе детергентами.

Предложен чувствительный метод оценки структурно-функционального состояния мембран по параметрам быстрого гемолиза Ш-додецилсульфатом.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные в работе данные значительно расширяют и углубляют существующие в настоящее время представления о гемолизе эритроцитов детергентами, а также демонстрируют возможность применения последнего в медико-биологических исследованиях в качестве простого и удобного метода оценки структурно-функционального состояния мембран данных клеток. Быстрый гемолиз Ыа-додсцилсульфатом может быть использован для разработки новых экспресс-способов диагностики функциональных сдвигов в организме.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Различные виды гемолиза эритроцитов детергентами в домицеллярных концентрациях обусловлены образованием сходных по своим свойствам, но различающихся по размеру пор, возникающих в разных липидных областях мембраны.

2. Медленный гемолиз детергентами протекает по коллоидно-осмотическому механизму, а быстрый гемолиз №-додецил сульфатом обусловлен образованием в

мембране пор, достаточно больших для выхода через них гемоглобина.

3. Существенное влитие на параметры быстрого гемолиза оказывает детер-гент-индуцировшшая везикуляция эритроцитов. Являясь процессом, конкурирующим с процессом образования пор, она защищает эритроциты от гемолиза я определяет их различную устойчивость к быстрому гемолизу детергентом.

4. Широко используемый в мембранологии для оценки размера пор метод осмотических ингибиторов малоприменим в случаях быстропротекающего гемолиза амфифильными веществами, поскольку ингибиторы сами влияют на скорость процессов, приводящих к лизису клеток.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор условий эксперимента, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на 1-ом и 11-ом Съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 22-23 ноября 1994; Минск, 25-27 июня 1996).

Опубликоваиность результатов. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих: обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты и их обсуждение (2 главы); выводов. Список цитируемой литературы включает 175 источников. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 33 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования служили эритроциты человека, выделенные из донорской крови. Отмытые эритроциты ресуспендировали в одной из рабочих сред (в 105, 155 или 205 мМ растворах NaCl, или изотонических буферах: ИБ1- 145 мМ МаС1, 8,1 мМ Na2HP04 и 1,9 мМ NaH2P04 (рН 7,2); ИБ2 - 145 мМ NaCI, 0,0085 н НС1 и 10 мМ трис-(оксиметил)-аминометана (рН 7,3)). Тени эритроцитов получали но методу Доджа с сотр. [Dodge et al., 1963]. Истощение эритроцитов по АТФ и К+ проводили путем выдерживания их соответствешю в 1 мМ растворе иодоацетата татрия ("Sigma", США) в течение 1 часа при 37°С [Feo, Mohandas, 1977] и в 0,1 мМ эастворе валиномнципа ("Sigma", США) в течение 4 часов при 37°С [Bielawsky, iwinto, 1975].

Кинетику гемолиза эритроцитов под воздействием Na-додецилсульфата "Serva", США) и тритона Х-100 ("Ferak", Германия) изучали либо по поглощению емоглобкна (А.=540 нм) в супернатанте после осаждения негемолизировавшихся слеток, либо по изменению светопропускания суспензии эритроцитов при А,=670 ш. Скорость гемолиза оценивали либо по наклону нормированных кинетических

кривых в полулогарифмических координатах - V, либо по времени, за которое происходил гемолиз половины находящихся в образце клеток - 1/т5о(см. рис.1).

Оценку размера пор, индуцируемых детергентами, проводили путем ингиби-рования гемолиза осмотическими протекторами различных размеров [\Vemer е! а1., 1985; 8сЬбпЬегг ег а!., 1994]. В качестве таких протекторов использовали сахарозу и полиэтиленгликоли 600, 1500,4000.

Степень везякуляции эритроцитов оценивши по содержанию в их суперна-тантах ацетилхолишстеразы [Черпицкий и др., 1994]. Активность ацетилхолинэ-стеразы определяли методом Элмана [ЕЛтап е1 а1., 1961].

Определение белка осуществляли по модифицированному методу Лоури [Магк\уе11е1а1., 1978].

Спектрофотометр ическис измерения проводили на спектрофотометрах Бресой М 40 и иУ-УК (Германия). Спектры флуоресценции регистрировали на установке, описанной в работе [Черннцкий, Конев, Бобрович, 1963]. Измерите концентрации ионов К+ и Ыа+ осуществляли на пламенном фотометре КЬАРНО-4 (Германия).

Достоверность хода кривых зависимостей параметров гемолиза от различных воздействий проверялась по крайней мере в трех опытах.

Основные результаты и их обсуждение

Параметры гемолиза эритроцитов 1Уа-додеиилсулыЬатом и тритоном Х-100.

Кинетические кривые гемолиза и их параметры. На рис.1 схематически представлены кинетические кривые гемолиза эритроцитов №-додецилсульфатом и тритоном Х-100 при различных концентрациях детергентов в среде. При низких концентрациях гемолитиков (соответственно примерно до 80 и 160 мкМ при 20°С) кинетика гемолиза описывается Э-образной кривой с отчетливо выраженными стационарной и логарифмической стадиями. Переход от стационарной к логарифмической фазе сопровождается частичным падением оптической плотности суспензии,

Рис. 1. Схематическое изображение кинетических кривых гемолиза эршро-цитов детергентами. Концентрация детергента возрастает от С1 до се. По оси ординат отложена оптическая плотность суспензии эритроцитов.

которое вызвано предгемолитическим набуханием клеток. Логарифмическая фаза, на которой происходит лизис эртроцитов, описывается экспонентой.

Когда концентрация детергента в суспензии эритроцитов становится выше пороговой, на кинетической кривой гемолиза появляется новый, более быстрый компонент; кинетика приобретает сложный вид и возникает необходимость характеризовать оба компонента по отдельности. В дальнейшем будем называть более ранний компонент гемолиза "быстрым", а более поздний - "медленным". Быстрый компонент (в отличие от медленного, который всегда достигает 100%), может быть частичным, поэтому его будем характеризовать, во-первых, процентом в общем гемолизе и, во-вторых, - как и медленный - полувременем (тзо) или скоростями гемолиза (1/т50) и лизиса (v).

Зависшюсть параметров гемолиза эритроцитов от концентрации детергентов. Для медленного гемолиза тритоном Х-100 (в области до 150 мкМ) зависимость его скорости от концентрации детергента в двойных логарифмических, координатах имеет линейный характер с наклоном п, варьирующим для разных образцов крови от 3 до 5 (рис. 2 а, кривая 2), что согласуется с литературными данными [Bonsall, Hunt, 1971]. Вместе с тем оказалось, что и в пределах одного компонента существует определенная неоднородность. Так, при дальнейшем увеличении концентрации тритона Х-100 примерно до 170 мкМ форма кинетической кривой сохраняет S-образность, однако график зависимости скорости гемолиза от концентрации детергента испытывает излом и приобретает больший наклон: n = 11-12 (см. рис. 2 а, кривая 2). Поскольку кажущийся порядок реакции гемолиза п пропорционален количеству молекул гемолитика, участвующих в образовании

Рис. 2. Зависимости доли быстрого компонента в общем гемолизе (1), а также скоростей медленного (2) и быстрого (3) гемолиза от концентрации тритона Х-100 (а) и Na-додецилсульфата (б) в суспензии эритроцитов (гематокрит 0,062%, 155 мМ NaCl; t=20°C). Время полугемолиза - -с5о - выражено в секундах.

одной поры [Bonsall, Hunt, 1971; Калер, 1985], то резкое изменение п при определенной концентрации детергента может был. связано с изменением свойств мембраны при достижении определенного количества сорбированных молекул тритона Х-100 или с началом заполнения качестаенно новых мест связывания. Зависимость скорости медленного гемолиза Na-додецилсульфатом от концентрации детергента в двойных логарифмических координатах, в отличии от медленного гемолиза тритоном, во всем диапазоне концентраций гемолитака близка к прямой с наклоном п = 3 (см. рис 2 б, кривая 2).

При увеличении концентрации детергента в суспензии эритроцитов выше порогового значения появляется быстрый компонент гемолиза (не только для анионного Na-додецилсульфата, что уже отмечалось другими исследователями [Rideal, Taylor, 1957; Bielawski, 1990], но и для неионного тритона Х-100) и его доля в общем гемолизе растет (кривые 1 на рис. 2 а и б), а наклон графика зависимости lg (1/tso) = n lg с дает значение п, равное 3-4 - для Na-додецилсульфата и 9-10 - для тритона Х-100 (кривые 3 на рис. 2 а и б).

Зависимость гемолиза детергентами от температуры. Аррениусовские графики для медленного гемолиза Na-додецилсульфатом и обоих компонентов гемолиза тритоном Х-100 в области температур 15-30°С представляют собой прямые, а соответствующие гемолитические процессы характеризуются близкими значениями энергии активации (см. таблицу). Полученные значения энергии активации характерны для проницаемости лилидных бислоев к одновалентным катионам [Черницкий, Воробей, 1981], что указывает на лшшдшга характер пор, ответственных за эти виды гемолиза. •

Значения энергий активации медленного гемолиза Ыа-додецнлсульфатом и обоих видов гемолиза тритоном Х-100 в области 1 = 15-30°С

детергент Иа-додецилсульфат тритон Х-100

п 3-4 3-5 11 - 12 9-10

Еа, кДж/моль 75 ±8 65 ±6 84 ±8 70 ±10

*(в таблице приведены средине значения по данным 3х опытов).

Принципиально другие температурные зависимости регистрируются для быстрого гемолиза Ка-додсцилсулъфатом. Скорость гемолиза в этом случае увеличивается (Е„=50 ± 10 кДж/моль) только до определенной температуры, после чего или не изменяется, или падает; графики Аррениуса имеют излом при температуре, которая изменяется от 25 до 18°С по мере увеличения концентрации детергента (рис. 3). Такую необычную зависимость скорости гемолиза от температуры можно объяснить, предположив, что гемолитические поры образуются с участием фосфа-тидилхолина, поскольку известно, что димиристоилфосфатидилхолин в бислойкых структурах (липосомах и эритроцитарных мембранах) испытывает переход гель-

жидкий кристалл при 22,5°С, а в присутствии белков или полипептидов в зависимости от концентрации добавленного вещества переход может сдвигаться по оси температур и расширяться [Levin, Lavialle, 1982; Moore et al., 1996]. Такое объяснение хорошо согласуется со сделанным ранее Ридеалом и Тейлором выводом, что данный тип гемолиза связан с изменением состояния фосфолипида, возможно лецитина [Rideal, Taylor, 1957].

In 1/tjo -2,2

-2,6

-3.0

Рис. 3. Аррениусовскне графики быстрого гемолиза эритроцитов N3-додецилсульфатом. Концентрации детергента: 1 - 88; 2 - 94; 3 - 101; 4-107 мкМ (гематокриг 0,062%; 155 мМ№С1).

3,30 3,35 3,40 3,45 liTxlO^K"1

Зависимость гемолиза от концентрации одно- и двухвалентных катионов. На основании представленных выше данных можно заключить, что Na-додецил-сульфат и тритон Х-100 могут вызывать как медленный, так и быстрый гемолиз, которым соответствуют различные поры, возникающие в разных липидных областях мембраны. В литературе практически нет сведений о свойствах этих пор. Известно лишь, что ряд амфифильных гемолитиков, в том числе и тритон Х-100, вызывают увеличение проницаемости плазматических мембран клеток, которое ингибируется двухвалентными катионами и усиливается при увеличении содержания в среде одновалентных катионов [Bashford et al., 1986; 1989].

Известно, что ионы Zn2+ более эффективно (по сравнению с Са2+ и Mg2+) ин-гибируют гемолиз эритроцитов катаонными белками и токсинами [Bashford et al., 1989; Руденко, Нилот, Павлюк, 1995], поэтому мы изучили именно их влияние на гемолиз Na-додецилсульфатом и тритоном Х-100. Оказалось, что катионы Zn2+ в области 5 - 150 мкМ уменьшают скорость быстрого и медленного гемолиза, индуцированного обоими детергентами, концентрационно-зависимым образом, Максимальное ингибирование(при [ZnS04] = 150 мкМ) соответствовало уменьшению скорости в 1,3-2 раза по сравнению со скоростью гемолиза в отсутствии Zn1+, что согласуется с литературными данными по ингибированию ионами Zn2+ гемолиза мелиттином и тритоном Х-100 [Bashford et al., 1986; 1989; Portlock et al., 1990].

С целью изучения влияния одновалентных катионов на гемолиз эритроцитов обоими детергентами мы исследовали зависимость скорости его быстрого и медленного компонентов от концентрации NaCl при различных температурах.

Увеличение содержания в среде NaCl должно приводить к двум различным эффектам. Во-первых, с увеличением концентрации ионов Na+ должен ускоряться процесс катионного обмена в эритроцитах и сокращаться время гемолиза [Bashford et а!., 1986]. Во-вторых, рост концентрации NaCl приводит к сжатию клеток и, следовательно, к увеличению времени гемолиза, протекающего по коллоидно-осмотическому механизму. Проведенные опыты показали, что первый эффект - увеличите скорости катионного обмена - является преобладающим, и только для медленного гемолиза при пониженной температуре (19°С) в условиях, когда скорость катионных потоков невелика - проявляется и второй - осмотический эффект.

Полученные данные свидетельствуют, что оба компонента гемолиза эритроцитов как тритоном Х-100, так и Na-додецилсульфатом обусловлены образованием в мембране сходных катион-зависимых пор.

Чувствительность параметров быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом к структурно-функциональному состоянию мембран эритроцитов. Для выявления чувствительности параметров гемолиза эритроцитов детергентами к структурно-функциональным перестройкам в мембране мы изучили зависимости процента и скорости быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом от времени инкубации клеток в безглюкозной среде при 37°С, приводящей к модификации эритроцитов и моделирующей процесс их старения [Черницкий и др., 1994].

Проведенные опыты показали, что при длительном выдерживании эритроцитов при 37°С наблюдаются полифазные изменения процента их быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом: сначала (примерно до 30 часов инкубации) происходит рост указанного параметра, далее падение и после 50 часов инкубации - снова увеличение степени гемолиза. Аналогичные полифазные изменения процента быстрого гемолиза наблюдаются и для эритроцитов, предварительно истощенных по АТФ, но в этом случае все фазы изменения степени гемолиза наступают раньше, чем для контрольных эритроцитов. Полученные данные хорошо согласуются с наблюдениями, что между 30 и 50 часами инкубации в указанных условиях происходит основная стадия везикуляции эритроцитов [Черницкий и др., 1994].

Исходя из гипотезы, что быстрый гемолиз анионными детергентами обусловлен взаимодействием последних со свободным фосфолшшдом эритроцитарной мембраны [Rideal, Taylor, 1957], первую фазу повышения процента гемолиза по мере инкубации клеток при 37°С можно соотнести образованию свободного фосфолипида в мембране. Возможно, появление такого свободного фосфолипида обусловлено отделением липидного бислоя от спектринового скелета мембраны. В пользу такого предположения свидетельствуют следующие данные: прогревание эритроцитов при 48°С в течение 20 минут приводит к почти предельному увеличению процента быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом, а изучение зависимости этого эффекта от температуры, при которой предварительно прогревались эритроциты, показало, что уменьшение устойчивости эритроцитов к быстрому гемолизу

Na-додецилсульфатом обусловлено именно денатурацией спектрнна, ослабляющей его взаимодействие с липидным бислоем (указанный эффект наблюдается только, когда температура предварительного прогрева достигает 48°С).

Дальнейшие исследования показали, что при длительном выдерживании эритроцитов при 37°С изменяется не только процент, но и скорость быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом, причем совместный анализ обоих параметров может дать дополнительную информацию о структурных преобразованиях в эритроците.

Механизмы гемолиза детергентами.

При изучении механизмов любого вида гемолиза основным является вопрос о размере пор: установив диаметр пор, ответственных за тот или иной гемолитический процесс, можно говорить о природе гемолиза - является он коллоидно-осмотическим или нет.

Оценка размера пор. Оценку эффективного размера пор, индуцируемых в мембране эритроцитов Na-додецилсульфатом и тритоном Х-100, проводили путем ингибирования гемолиза протекторами различных размеров [Weiner et al., 1985]. В случае медленного гемолиза обоими детергентами при добавлении в суспензию эритроцитов сахарозы, а также полиэтиленгликолей 600, 1500 и 4000 в концентрации 30 мМ наблюдалось уменьшение скорости данного процесса, но поскольку практически полностью его нншбировал только полиэтиленгликоль 4000, имеющий диаметр молекулы 35 А, то можно считать, что поры, ответственные за возникновение медленног о гемолиза как Na-додецилсульфатом, так и тритоном X-100, порядка этой величины.

Попытка оценить размер пор, соответствующих быстрому гемолизу обоими детергентами, используя данный метод, оказалась неудачной. Добавив в гемолитическую среду осмотические протекторы в концентрации 30 мМ, мы не зарегистрировали указашюго компонента гемолиза даже для образца, содержащего полиэтиленгликоль 600, т.е. формально оказалось, что поры, ответственные за быстрый компонент меньше тех,' которые приводят к медлегаюму гемолизу. В связи с этим мы сочли целесообразным изучить зависимость параметров быстрого гемолиза обоими детергентами от концентрации осмотических протекторов в гемолитической среде. Оказалось, что все протекторы в различной степени ингибировали скорость быстрого гемолиза, но и уменьшали также величину его процента. В случае динамического ингибирования протектор должен уменьшать только скорость гемолиза, но не его процент. Поэтому создается впечатление, что протектор просто уменьшает действующую концентрацию детергента в мембране. Возможно также, что сахароза и полиэтиленгликоли, взаимодействуя с мембранами эритроцитов и модифицируя их свойства [Arnold et al., 1985; Bashford et al., 1996], приводят к изменению способности клеток противостоять гемолизу [Palecz, Jozwiak, 1994].

Чтобы исключить возможность влияния протекторов на процесс образования пор, мы использовали другой метод оценки их ингибирующего действия, который заключается в том, что протектор добавляется в суспензию уже после образования пор (например, на стадии лизиса) [ВетЬешег, 1947]. Как видно из рис. 4, для медленного гемолиза эритроцитов Ыа-додецилсульфатом ингибирующий эффект сахарозы хорошо проявляется и в том случае, когда ее добавляют в суспензию эритроцитов после образования пор в их мембранах. В случае же быстрого гемолиза не только сахароза, но даже полиэтиленгликоль 4000 не уменьшают скорость гемолиза, если их добавлять в суспензию на стадии лизиса клеток. Эти данные ясно указывают яа то, что размеры пор, ответственных за возникновение быстрого гемолиза, больше диаметра молекулы полиэтиленгликоля 4000, т.е. больше 35 А.

Роль везикуляции эритроцитов в гемолизе детергентами. Действие протекторов на параметры быстрого гемолиза, аналогичное уменьшению концентрации детергента в мембране является непонятным и загадочным. Поскольку непосредственное взаимодействие протектора с детергентом маловероятно, остается предположить, что эффект опосредуется через структуру мембраны. В общем виде уменьшение скорости гемолиза (и связанное с ним уменьшение процента) можно объяснить ускорением некоторого процесса, конкурирующего гемолизу. Из литературы известно, что Ыа-додецилсульфат, как и другие амфифилы, вызывает везикуляцию эритроцитов, обусловленную включением его молекул в плазматическую мембрану [НацегеПапс!, Ьотаа, 1992; 1994]; исходя из этого мы предположили, что процессом, конкурирующим быстрому гемолизу, может бьггь детергепт-индуцированная везикуляция. Если это так, то тогда протекторы, ингибирующие быстрый гемолиз, должны ускорять везикуляцию, причем скорости обоих процессов должны быть примерно равными. На рис. 5 представлены кинетические кривые везикуляции эритроцитов под воздействием Иа-додецилсульфата при различном содержании в среде полиэтиленгликоля 4000. Из рисунка видно, что по мере увеличения концентрации полготиленгликоля 4000 увеличивается скорость

1

D

0,6 F

0,4

0,2

Рис. 4. Кинетические кривые медленного гемолиза Na-додецилсу-льфатом (с=Ю7 мкМ) без сахарозы (К) и при добавлении ее (с = 150 мМ) в моменты, указанные стрелками (ге-матокрит 0,062%; 155 мМ NaCl; t=30°C).

0 2 4 6 8 10 t, мин

везикуляции, оцениваемая по т5о (скорость везккуляции увеличиваемся также и в присутствии сахарозы и полютиленгликолей 600 и 1500). Эти результаты согласуются с литературными данными о том, что полиэтиленгликоли пертурбируют мембранные бислои и облегчают их фрагментацию в присутствии диметилсуль-фоксида, лизолецитина, полилизина и др. с одновремешюй защитой, мембран от разрушающего действия указанных веществ [Hui et al., 1985].

Таким образом, представленные данные демонстрируют, что скорости процессов везикуляции и быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом, близки между собой (т5о - порядка минуты), а действие протекторов выявляет их конкурирующий характер.

Рис. 5. Зависимости активности (А) ацетилхо-лидастеразы в суперна-тантах от времени инкубации эритроцитов в растворах, содержащих 25,7 мкМ Na-додецил-сульфата и различные концентрации полиэти-ленгликоля 4000: 1-0; 2-5; 3 - 10 мМ (гема-токрит 6,25%; ИБ1; t= 10°С). Стрелками указаны моменты времеш, когда активности АХЭ в супернатантах равны половине максимальных.

0

10

15

t, мин

О том, что везикуляция влияет на быстрый гемолиз Ыа-додецилсульфатом прямо свидетельствуют следующие данные. Эритроциты, полученные после инкубации их различное время при 8°С в 25 мкМ растворе детергента, т.е. клетки, различающиеся по степени везикуляции (супернатанты таких образцов использовались для получения кривой 1 на рис. 5), подвергали гемолизу 90 мкМ додецшгсульфатом. Параметры гемолиза этих эритроцитов представлены на рис. 6. Видно, что с увеличением времени инкубации клеток (а следовательно, с увеличением степени их везикуляции) ингибируются скорость и процент быстрого гемолиза, т.е. клетки, испытавшие везикуляцию, становятся более устойчивыми к быстрому гемолизу детергентами.

Возникает вопрос: может ли везикуляция оказывать влияние на медленный гемолиз Ма-додецилсульфатом? Поскольку везикуляция заканчивается гораздо раньше, чем начинается медленный гемолиз, то ускорение ее протекторами не должно повлиять на скорость гемолиза и, следовательно, на результаты оценки раз-

Рис. 6. Зависимости процента (1) и времени полугемолиза (2) быстрого гемолиза Ка-додецилсуль-фатом (с = 90,3 мкМ) от времени инкубации эритроцитов в условиях, указанных для кривой 1 на рис. 5 (гематокрит 0,062%; ИБ1; 1=Ю°С).

0

10

15

1, мин

мера соответствующих пор. Однако, так как по нашим данным степень везикуля-ции зависит от концентрации ЭДа-додецилсульфата (по мере роста последней степень всзикуляции увеличивается и достигает максимального значения примерно при 80 мкМ На-додецил сульфата при 1=20°С), то некоторые эффекты при изучении концентрационных зависимостей гемолиза не исключены. Действительно, оказалось,' что эритроциты, предварительно выдержанные 2 минуты с более высокой концентрацией детергента, чем та, которой затем вызывали гемолиз, были более устойчивыми к медленному гемолизу Ма-додецилсульфатом по сравнению с эритроцитами, которые не подвергались предварительной обработке и были менее везикулированы. Эти данные ясно показывают, что везикуляция защищает эритроциты не только от быстрого, но и от медленного гемолиза детергентом. Нельзя также ожидать полной обратимости действия детергентов, поскольку везикуляция является необратимым процессом.

Еще одним важным следствием, вытекающим из полученных данных, является то, что метод осмотических протекторов, широко используемый в настоящее время для определения размера пор, возникающих в эритроцитах под воздействием различных гемолитиков, можно с уверенностью применять только в тех случаях, когда скорость гемолиза значительно меньше скорости везикуляции, индуцируемой данным гемолитиком (в противном случае необходимо убедиться, что ингиби-рование происходит не в результате изменения свойств мембраны).

Общая картина гемолиза эритроцитов детергентами. В случае медленного гемолиза - при малых концентрациях гемолитиков в суспензии клеток - детергенты формируют в мембранах эритроцитов предгемолитические поры, максимальный диаметр которых для Ыа-додецилсулъфата и тритона Х-100 составляет примерно 35 А (размер пор, вероятно, может меняться, поскольку по мере увеличения концентрации детергента в среде, возрастает кажущийся порядок реакции порообразования). Через такие поры не могут проходить молекулы гемоглобина, имеющие боль-

ший размер (« 60 Â в диаметре [Иржак, 1975]), и, следовательно, механизм данного вида гемолиза должен быть коллоидно-осмотическим. Этот же вывод вытекает из данных, представленных на рис. 4 и демонстрирующих, что эффект уменьшения скорости медленного гемолиза при добавлении в суспензию эритроцитов протекторов обусловлен именно динамическим ингибированием данного процесса.

При достижении пороговой концентрации детергента в суспензии эритроцитов на кинетической кривой гемолиза появляется быстрый компонент. Большое различие в скоростях медленного и быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом заставляет рассмотреть возможность того, что быстрый компонент может представлять собой просто выход гемоглобина через гемолитические щели подобно осмотическому гемолизу. Однако, если бы это было так, то увеличение количества гемолизированных клеток не сопровождалось бы увеличением скорости гемолиза. Поскольку же скорость гемолиза увеличивается с ростом кнщетрации гемолитика (независимо от процента гемолиза) (см. рис. 2 б, кривая 3), нужно принять, что в эритроците образуется не одна щель, а ряд пор (или размер поры увеличивается по мере роста концентрации детергента).

Попытка определить размеры пор, ответствешгых за быстрый гемолиз детергентами, путем ингибирования этого процесса протекторами не дала желаемого результата: мы установили лишь, что поры, ответственные за быстрый гемолиз Na-додецилсульфатом довольно большие - их диаметр больше 35 А. Однако, вопрос о том, является ли механизм данного гемолиза коллоидно-осмотическим, остался открытым. Для ответа на него мы изучили как изменяются кинетические кривые быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом при уменьшении концентрации детергента, после воздействия его на эритроциты, путем разбавления реакционной смеси раствором ИБ1. Удобно выбрать такое разбавление, при котором концентрация детергента в суспензии становится меньше пороговой, вызывающей быстрый гемолиз. Тогда, если разбавление проводить до образования в эритроцитах пор, быстрого гемолиза мы не будем наблюдать; а если поры уже сформировались, то в случае коллоидно-осмотического гемолиза мы должны регистрировать лизис соответствующей части эритроцитов.

Как показано на рис. 7, если разбавление проводить сразу после добавления эритроцитов в раствор, содержащий детергент, то кинетическая кривая представляет собой горизонтальную прямую 1. Такая же прямая 2 получается при разбавлении в конце лаг-фазы, что можно было бы связать с тем, что предгемолитические поры (если механизм коллоидно-осмотический) еще не образовались. При уменьшении концентрации детергента в суспензии на стадии лизиса эритроцитов некоторые изменения процента гемолиза во времени наблюдаются, однако они небольшие и могут быть обусловлены кинетикой выхода гемоглобина из той части клеток, которая лизируется за время разбавления суспензии (кривые 3 и 4). Эти данные свидетельствуют, что если коллоидно-осмотический механизм и дает вклад

в быстрый гемолиз Ыа-додецилсульфатом, то этот вклад незначителен. Вероятно, поры, ответственные за быстрый гемолиз детергентом, достаточно большие для того, чтобы гемоглобин мог выходить через них из клетки, т.е. являются не пред-гемолитическими, а гемолитическими; при этом вероятность их открытия зависит от концентрации детергента и от времени взаимодействия его с клеткой.

Рис. 7. Кинетические кривые быстрого гемолиза Na-додецилсульфа-том (с=75 мкМ) для контрольного образца (К), а также для образцов, разбавленных в 1,7 раза ИБ1 в моменты времени, обозначенные стрелками 1 - 4 (кривые 1-4 соответственно) (гематокрит 0,124%; ИБ1; t=15°C).

Тот факт, что быстрый гемолиз может быть частичным, говорит, что эритроциты в популяции гетерогенны по отношению к действию детергента. Такая гетерогенность может быть обусловлена различной мембранной концентрацией детергента у разных эритроцитов, которая определяется различной способностью разных эритроцитов связывать детергент (из-за разного содержания в их мембранах некоторого свободного фосфолшшда [Ridcal, Taylor, 1957], которым, как было показано выше, может быть фосфолипид не взаимодействующий со спектрином). Кроме того,' эритроциты могут различаться но их способности активировать конкурирующий с гемолизом процесс везикуляции. Соотношение этих гетерогенностей и определяют параметры (процент и скорость) наблюдаемого нами быстрого гемолиза.

Обобщая всё сказанное выше, процесс гемолиза эритроцитов детергентами можно представить в виде схемы, изображенной на рис. 8. При добавлении детергента в суспензию эритроцитов (1), его молекулы инкорпорируют в мембрану клеток. В результате преимущественного увеличения площади одного слоя мембранного бислоя происходят морфологические изменения эритроцитов (образуются эхиноциты (2) или стомациты) и начинается везякуляция эритроцитов, которая устраняет излишек мембранной поверхности (возможно, тех ее фрагментов, где могла бы образоваться пора, приводящая в последствии к гемолизу). В следствие близости величин скоростей быстрого гемолиза и везикуляции эти два процесса конкурируют друг с другом: если скорость образования гемолитической лоры больше скорости везикуляции, то эритроцит лизируется и события развива-

12 3 4

ются по луга 3"; если же больше скорость везикуляции - то эритроцит не разрушается в ходе быстрого гемолиза и развитие процесса происходит по пути 3' - медленный гемолиз: сначала имеет место набухание (4) и только после достижения

критического объема эритроцит лопается и его содержимое выходит наружу (5). • • *

Ъч НЬ

°о а

Рис. 8. Схема процесса гемолиза эритроцитов На-додецилсульфатом.

ВЫВОДЫ

1. Кинетические кривые гемолиза тритоном Х-100, так же как и Ыа-додецил-сульфатом, имеют два компонента - быстрый и медленный. Скорости обоих компонентов гемолиза сходным образом зависят от концентрации одно- и двухвалентных катионов, имеют близкие значения энергии активации, однако различаются по зависимостям от концентрации детергента, из которых определены кажущиеся порядки реакции соответствующих гемолитических процессов. Образование пор, ответственных за быстрый гемолиз Ка-додейилсульфатом, происходит при участии димиристоилфосфатидилхолина. Вышеприведенные данные свидетельствуют, что поры, ответственные за медленный и быстрый гемолиз детергентами, возникают в различных липидных областях мембраны.

2. Показано, что кинетические параметры быстрого гемолиза Ка-додецил-сульфатом можно использовать в качестве чувствительного теста на изменение структурно-функционального состояния эритроцитов.

3. Методом осмотических ингибиторов оценены размеры пор, ответственных за медленный гемолиз тритоном Х-100 и Ма-додецилсульфатом, - диаметр этих пор оказался равным примерно 35 А. Установлено, что поры, ответственные за быстрый гемолиз Ыа-додецилсульфатом, имеют значительно большие размеры.

4. Обнаружен необычный эффект осмотических ингибиторов на быстрый гемолиз N а-до дс цилсу л ьф ато м — уменьшение скорости последнего при добавлении ингибиторов в суспензию эритроцитов одновременно с детергентом и отсутствие такого уменьшения в случае, если ингибитор добавлялся после детергента (после образования нор), который объяснен существованием процесса, конкурирующего с

процессом образования пор и ускоряющегося в присутствии ингибиторов. Получены доказательства, что таким процессом, конкурирующим с образованием пор, является детергент-индуцируемая везикуляция эритроцитов.

5. Показано, что индуцируемая Na-додецилсульфатом везикуляция не только ингибирует процесс быстрого гемолиза, но и защищает эритроциты от повторного действия детергента (как в случае медленного, так и быстрого гемолиза).

6. Установлено, что быстрый гемолиз Na-додехдалсульфатом является не коллоидно-осмотическим, а обусловлен образованием в мембране пор, достаточно больших для выхода через них гемоглобина. Предложена схема процесса гемолиза детергентами.

7. Метод осмотических ингибиторов, широко используемый в мембранологии для оценки размера пор, малоприменим в случаях быстропротекающего гемолиза амфифильными веществами, поскольку ингибиторы сами влияют на скорости процессов, приводящих к лизису клеток.

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. Сеньковяч O.A., Черницкий Е.А. О гетерогенности пор, возникающих в эритроцитах под воздействием тритона Х-100. // Весщ АН Беларусь Сер. б1ял. навук. - 1996, № 2. - С. 120-122.

2. Черницкий Е.А., Сенькович O.A., Козлова Н.М. Гетерогенность пор, образуемых в мембране эритроцитов липофильными гемолитиками. // Биофизика. -1996. - Т. 41, вып. 6. - С. 1270-1274.

3. Черницкий Е.А., Розип В.В., Болодон В.Н., Сенькович O.A., Зубрицкая Г.П., Козлова Н.М., Слобожанина Е.И. Сублитические эффекты фотосенсибялизи-рованных реакций в эритроцитах. // Весщ АН Беларуси Сер. бил. навук - 1997, № 1. . с. 65-69.

4. Черницкий Е.А., Сенькович O.A. Гемолиз эритроцитов детергентами. // Биол. мембраны. - 1997. - Т. 14, № 4. - С. 385-393.

5. Сенькович O.A., Черницкий Е.А. О размерах пор, возникающих в эритроцитах под воздействием детергентов. // Биол. мембраны. - 1997. - Т. 14, №5. - С. 549-556.

6. Сенькович O.A., Черницкий Е.А. О порядке реакции гемолиза эритроцитов различными веществами. // Тез. докл. 1-го Съезда белорусского общества фотобиологов и биофизиков. - Минск, 1994. - С. 161.

7. Сенькович O.A., Черницкий Е.А. Зависимость параметров гемолиза эритроцитов детергентами от температуры. // Тез. докл. 2-го Съезда белорусского общества фотобиологов и биофизиков. - Минск, 1996. - С. 122.

8. Сенькович O.A., Черницкий Е.А. Об определении размера пор, индуцируемых в эритроцитах детергентом Na-додецилсульфатом. // Тез. докл. 2-го Съезда белорусского общества фотобиологов и биофизиков. - Минск, 1996. - С. 123.

РЭЗЮМЭ

Сннькопг! Вольга Аляксееуиа ГемолЬ эрытрацытау дэтэргентам!

Ключавыя словы: эрытрацыты, мембрана, дэтэргенты, Ыа-дадэцылсульфат, трытон Х-100, гсмо.'ш, поры, пратэктары, шпб1раванне, иез^куляцыя.

3 мэтан вызначэння мехашзмау гемолизу эрытрацытау чалавека дэтэргентам! вывучшш кгнетычныя крывыя гэтага працэса метадам спектрафотаметрьп. Паказа-на, што два вщы гемол1зу (хула 1 павольны) можа выкткаць не тольи атонны дэтэргент Ка-дадэцылсульфат, але i неюнны трытон Х-100. У залсжнаао ад канцэнтрацьп дэтэргента у мембране эрытрацытау могуць узшкаць поры, характа-рызуемыя рознай колькасцю малекул гемал(тыка, неабходпых для утварэння адной поры. Уяуныя парада рэакцьп порауггварэння для Ма-дадэцылсульфату п=2-3 (павольная кампанента) 1 3-4 (хуткая), а для трытону Х-100 - п=3-5, 11-12 (павольная кампанента) 1 9-10 (хуткая). Ахарактарызаваны поры, адказныя за павольны 1 хуш гемоллз абодвума дэтэргентам!, I знойдзена, што яны узншаюць у розных лйпдных абласцях мембраны, але валодаюць падобньпц уласщвасцям1. Атрыманы доказы, што норы, адказныя за хула гемоли Na-дaдэцылcyльфaтaм, узшкаюць з удзелам дьшipыcтaiлфacфaтыдьIлxaлiнy.

Вызначана, што павольны гемолгз абодвума дэтэргентам1 працякае па ка-лощна-асматычным мехашзме (дыяметр прадгемалгшчных пор каля 35 А), а хула -звязаны з залежным ад дэтэргент-шдуцыраванай везпсуляцьп адкрьщцём вялшх пор, дастатконых для выхаду малекул гемаглабшу. Знойдзена, што везшуляцыя ¡нпб1руе працэс хуткага гсмолгзу 1 абараняе эрытрацыты ад пауторнага уздзеяння датэргенту. Наказана, што метад асматычных шпбггарау, яга шырока выкары-стоуваецца для вызначэння памеру пор, малапрымяшмы у выпадку хуткапраця-каючага гемошзу амф1ф1льным1 рэчывам1, паколыа шпбпары сам! уздзешачаюнь на хуткасць працэсау, ягая прыводзяць да лiзicy клетак. Прадэманстравана адчу-вальнасць параметрау хуткага гемолизу Ка-дадацылсульфатам да змяненняу структурна-функцыянальнага стану мембран эрытрацытау.

Вынпа работы могуць быць вьпсарыставаны у медьшйлялапчных даследа-ваннях, а таксама для распрацоуи экспрэс-метадау дыягностыы розных захворван-няу.

РЕЗЮМЕ

Сснысович Ольга Алексеевна Гемолиз эритроцитов детергентами

Ключевые слова: эритроциты, мембрана, детергенты, Иа-додецилсульфат, тритон Х-100, гемолиз, поры, протекторы, ингибирование, везикуляция.

С целью выяснения механизмов гемолиза эритроцитов человека детергентами изучены кинетические кривые данного процесса методом спектрофотометрии. Показано, что два вида гемолиза (быстрый и медленный) может вызывать не только анионный детергент N а-додсцилсудьфат, но и неионный тритон Х-100. В зависимости от концентрации детергента в мембране эритроцитов могут возникать поры, характеризуемые различным количеством молекул гемолитика, необходимых для образования одной поры. Кажущиеся порядки реакции порообразования для Иа-додецилсульфата п=2-3 (медленный компонент) и 3-4 (быстрый), а для тритона Х-100 - п=3-5, 11-12 (медленный компонент) и 9-10 (быстрый). Охарактеризованы поры, ответственные за медленный и быстрый гемолиз обоими детергентами, и установлено, что они возникают в различных липидных областях мембраны, но обладают сходными свойствами. Получены доказательства, что поры, ответственные за быстрый гемолиз Nа-додещшсульфатом, образуются с участием димиристоилфосфатидилхолшта.

Установлено, что медленный гемолиз обоими детергентами протекает по коллоидно-осмотическому механизму (диаметр предгемолитнческнх пор около 35 А), а быстрый - связан с зависимым от детергеш'-индуцированной везикуляции открытием больших пор, достаточных для выхода молекул гемоглобина. Обнаружено, что везикуляция ингибирует процесс быстрого гемолиза и защищает эритроциты от повторного действия детергента. Показано, что метод осмотических ингибиторов, широко используемый для определения размера пор, малоприменим в случае быстропротекающего гемолиза амфифильными веществами, поскольку ингибиторы сами влияют на скорость процессов, приводящих к лизису клеток. Продемонстрирована чувствительность параметров быстрого гемолиза Ка-додецилсулъфатом к изменению структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.

Результаты работы могут быть использованы в медико-биологических исследованиях, а также для разработки экспресс-методов диагностики различных заболеваний.

SUMMARY

Olga A. Senkovich

Hemolysis of erythrocytes by detergents

Key words: erythrocytes, membrane, detergents, sodium dodecylsulphate, Triton X-100, hemolysis, pore, protectors, inhibition, vesiculation.

To determine mechanisms of hemolysis of human erythrocytes by detergents kinetic curves of this process have been studed by method of spectrophotometry. It is shown that two kinds of hemolysis (fast and slow) can be induced by not anionic detergent sodium dodecylsulphate only but also by nonionic detergent Triton X-100. Depending on detergent concentration different pores can arise in the erythrocyte membrane; they are characterized by various quantity of hemolytics molecules necessary for formation of one pore. Apparent orders of a reaction of pore formation are for sodium dodecylsulphate n=2-3 (slow component) and 3-4 (fast component) and for Triton X-100 - n=3-5, 11-12 (slow component) and 9-10 (fast component). The pores responsible for a slow and fast hemolysis by both detergents were characterized and it was established that they arise in various lipid areas of the membrane but have similar properties. The proofs that the pores responsible for a fast hemolysis by sodium dodecylsulphate are formed with participation of dimyristoylphosphatidylcholine was received.

It was established that the slow hemolysis by both detergents proceeds by the colloid-osmotic mechanism (diameter of prehemolytic pores is about 35 A) and fast hemolysis is connected to large pores which are sufficient for an output of hemoglobin molecules and opening of which are dependent on a detergent-induced vesiculation. It was shown that the method of osmotic protectors widely used for determination of the pore sizes is not employed in cases of a rapid hemolysis by amphophilic substances because inhibitors modify the speed of processes resulting to lysis of cells. Sensitivity of parameters of the fast hemolysis by sodium dodecylsulphate to change of the structural state of erythrocyte membranes was shown.

The results of work can be used in medical and biological studies and for development of express-methods of diagnostics of various diseases.

Сенькович Ольга Алексеевна

Гемолиз эритроцитов детергентами

Автореферат диссертац ии на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 5.02.98 г.

Формат 60x84 1/16 Усл.печ л. 1,31

Усл. кр. - отг. 1,51. Уч.-изд.л. 0,9. Тираж 100 экз. Заказ ^

Институт физики им. Степанова НАНБ 220072, Минск, пр-т Скорины, 68 Отпечатано на ризографе ИФ НАНБ Лицензия ЛП № 20 от 20.08.97 г.