Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма лизиса эритроцитов под влиянием порообразующих гемолитиков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Бессонова, Светлана Валерьевна, Ташкент

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

62 12/27

на правах рукописи

БЕССОНОВА СВЕТЛАНА ВАЛЕРЬЕВНА

УДК: 615. 919: 577.352. 26

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ЛИЗИСА ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПОРООБРАЗУЮЩИХ ГЕМОЛИТИКОВ.

03.00.02.- Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: доктор биологических наук Сабиров Р.З.

Ташкент- 2000

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АВ- амфотерицин В, полиеновый антибиотик СТ- а-стафилотоксин- экзотоксин, продуцируемый Staphylococcus aureus.

М- мелиттин, токсический компонент яда медоносной пчелы.

Km- константа Михаэлиса.

Vmax- максимальная скорость транспорта.

ПА- полиеновые антибиотики.

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ДМСО - диметилсульфоксид

К.З.М.С.- количество замкнутых мембранных образований

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений............................................................................. 2

ОГЛАВЛЕНИЕ .......................................................................3

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................... 6

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................11

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР..........................................................11

1.1. Механизмы регуляции объема эритроцитов...........................11

1.2 Нарушение регуляции объема эритроцитов

порообразующими агентами и механизм гемолиза...............17

1.3. Характеристика объектов исследования..................................21

1.3.1.Мелитти н.....................................................................................21

1.3.2. Амфотерицин В..........................................................................23

1.3.3. Стафилотоксин............................................................................29

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.......................................................................................35

2.2 Методы.............................................................................................35

2.2.1 Получение суспензии эритроцитов и определение гемолитической активности

порообразующих веществ....................................................................35

2.2.2. Кондуктометрический метод определения количества замкнутых мембранных структур

в суспензии эритроцитов...........................................................37

2.2.3. Определение осмотической стойкости эритроцитов............38

2.2.4. Определение размера эритроцитов и их теней........................39

2.2.5.Регистрация гемолиза с помощью видеоцифровой микроскопии........................................................................39

2.2.6. Метод измерения спектров флуоресценции............................39

2.2.7. Математическая обработка данных..........................................40

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Агрегатное состояние мелиттина при его действии

на эритроциты и размер мелиттиновой поры................................... 41

3.1.1. Влияние анионов на гемолитическую активность мелиттина и его агрегатное состояние при

действии на эритроциты.......................................................................42

3.1.2. Коллоидно-осмотический механизм гемолиза

и размер мелиттиновой поры...............................................................48

3.1.3. Обсуждение..................................................................................55

3.2. Исследование пост-литических стадий коллоидно-осмотического лизиса эритроцитов....................................................56

3.2.1. Лизис клеток путем гипотонического шока............................57

3.2.2. Лизис клеток под действием детергента..................................58

3.2.3. Лизис клеток порообразующими гемолитиками..................62

3.2.4. Визуальное наблюдение пост-литического формирования теней эритроцитов......................................................64

3.2.5. Регистрация гемолиза с помощью

видео-цифровой микроскопии.............................................................69

3.2.6. Обсуждение.................................................................................74

3.3. Чувствительность эритроцитов человека и различных видов животных к коллоидно-осмотическому лизису.................78

3.3.1. Кинетика лизиса эритроцитов различных видов под действием амфотерицина В.................................................................79

3.3.2. Осмотическая стойкость различных типов эритроцитов......81

3.3.3. Роль системы Ыа-К-2С1 котранспорта в коллоидно-осмотическом лизисе эритроцитов.....................................................91

3.3.4. Обсуждение.................................................................................95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................99

ВЫВОДЫ...............................................................................................102

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................104

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Живая клетка является высокоорганизованной системой, способной к саморегуляции в условиях меняющихся параметров окружающей ее среды. Сохранение целостности клетки тесно связано с ее способностью к активному поддержанию постоянства объема. Изучение механизмов регуляции объема живой клетки является одной из центральных проблем современной клеточной физиологии и биофизики. Этому вопросу посвящено большое количество исследований, что отражено в многочисленных обзорах на эту тему ( Strange et al., 1996; Nilius et al, 1996; Okada, 1997; Lang et al, 1998). Различные типы клеток по разному регулируют свой объем в условиях осмотического стресса, который является стимулом к активации хлор-и калий-селективных ионных каналов, системы Na/Н-обмена, сопряженного Na/K/2C1 и К/С1 котранспорта, хлор/бикарбонатного обмена и некоторых других.

Так как стабильный объем клетки достигается за счет поддержания ионной асимметрии клеточного состава и тонкой регуляции селективной мембранной проницаемости, то очевидно, что любая модификация ионной проницаемости плазматической мембраны клеток будет приводить к изменению ее объема, а в крайних случаях - к нарушению ее целостности и цитолизу. Это явление широко используется в природе, когда одни клетки в качестве орудия нападения секретируют в окружающую среду вещества, способные формировать ионные каналы в мембранах других клеток,

тем самым нарушая ионный и осмотический баланс клеток-мишеней. Результатом является цитолиз (гемолиз в случае эритроцитов) -широко распространенный в биологии феномен. Он используется бактериями и грибами как орудие в борьбе одних штаммов с другими: колицины (Stroud et al., 1998), грамицидины, полиеновые антибиотики (Егоров, 1986), а так же как орудие в выживании паразитов (патогенных и непатогенных) в макроорганизме- хозяине (бактериальные токсины - стафилотоксин, стрептолизин, тетанолизин др., см. Bhakdi et al., 1996. Ядовитые животные используют каналоформеры как орудие нападения на жертву - мелиттин из яда медоносной пчелы (Tosteson et al., 1985), кардиотоксин из яда кобры (Fletcher & Jiang, 1993), каналообразующие токсины из яда пауков (Usmanov et al,. 1985; Krasilnikov & Sabirov, 1992) и др. В свою очередь, человеческая иммунная система использует каналообразующие белки (компоненты комплимента, перфорины, секретируемые Т-киллерами) для обезвреживания патогенных микроорганизмов, а также для уничтожения клеток, инфицированных вирусами, а также раковых клеток (Ashcroft, 1999).

Несмотря на то, что гемолиз очень часто используется как тест цитолитической активности при описании тех или иных физиологически активных веществ, относительно небольшое число работ посвящено молекулярным и клеточным механизмам цитолиза вообще, и гемолиза в частности. Общие вопросы цитолиза как биологического феномена изучены крайне недостаточно и еще далеки от окончательного решения. Это в особенности относится к постлитической фазе цитолиза, которая в настоящее время остается

практически неизученной. Вышесказанное определило актуальность темы настоящего исследования.

Цель и задачи работы:

Целью настоящей работы было изучение механизма коллоидно-осмотического гемолиза под действием каналообразующих гемолитиков (мелиттина, амфотерицина В, стафилотоксина), исследование пост-литических стадий лизиса и выявление роли мембранных транспортных процессов в определении устойчивости клеток крови к коллоидно-осмотическому гемолизу.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. Изучить роль агрегатного состояния молекул каналообразующего гемолитика мелиттина в водной фазе и в мембране в процессе лизиса эритроцитов человека; оценить размер мелиттиновой поры и число молекул полипептида, необходимых для ее формирования.

2. Исследовать процесс лизиса эритроцитов при гипотоническом шоке и под действием каналообразующих веществ (полипептидов, антибиотиков и токсических белков) с использованием комбинации фотометрических, кондуктометрических методов и световой микроскопии; выявить и охарактеризовать мембранные формирования, образующиеся в постлитической стадии процесса.

3. Провести сравнительное исследование чувствительности эритроцитов земноводных, птиц и человека к осмотическому шоку, а также к коллоидно-осмотическому лизису в изотонических

условиях. Выявить роль системы Ыа/К/2С1 котранспорта в определении чувствительности эритроцитов различных видов к лизису в гипотонических и изотонических условиях.

Научная новизна работы.

В процессе исследования механизма мелиттин-индуцированного гемолиза установлено, что факторы, способствующие агрегации полипептида в растворе, подавляют его литическую активность, в то же время для формирования литической поры в эритроцитарной мембране необходима агрегация 6-9 молекул мелиттина.

Впервые показано, что коллоидно-осмотический гемолиз под действием порообразующих веществ не вызывает полное разрушение эритроцита с исчезновением тела клетки, а приводит к формированию замкнутых мембранных образований- теней эритроцитов, регистрируемых как визуально, так и кондуктометрическим методом. Впервые обнаружено явление постлитического сжимания теней эритроцитов, имеющего неосмотическую природу.

Впервые показано, что в ряду «земноводные - птицы -человек» изменение осмотической резистентности эритроцитов обратно изменению их устойчивости к коллоидно-осмотическому гемолизу, индуцированному полиеновым антибиотиком амфотерицином В. Впервые показано участие буметанид-чувствительной системы Ка/К/2С1 котранспорта в определении устойчивости эритроцитов человека к коллоидно-осмотическому лизису.

Научно-практическая ценность работы.

Выявленные в работе новые особенности коллоидно-осмотического лизиса клеток необходимы для построения общей теории взаимодействия порообразующих физиологически активных веществ с живыми клетками. В практическом отношении результаты работы будут представлять интерес для разработки путей предотвращения патологического действия каналообразующих факторов патогенности микроорганизмов, а также в практической фармакологии для уменьшения нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов-гемолитиков.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на международной конференции "Проблемы экологической физиологии", Фергана - 1997, на симпозиуме "Cellular and Molecular Physiology of Ion Channels and Trans porters"( Ташкент- 1999), на семинарах лаборатории молекулярной физиологии Института физиологии и биофизики АН РУз.

Публикации результатов исследования Основные положения диссертации изложены в 4 печатных работах.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР. 1.1. Механизмы регуляции объема эритроцитов.

Эритроциты являются наиболее доступными клетками и в течении ряда лет служили классическим объектом мембранологии и клеточной физиологии. Известно, что в средах с различной осмотичностью эритроциты ведут себя как неидеальные осмометры. Это означает, что они меняют свой объем соответственно осмотическому давлению среды, однако в меньшей степени, чем это можно было бы ожидать для идеального осмометра. Обычно это объясняется наличием осмотически неактивного объема внутри клеток, который приписывается белкам цитоплазмы (Solomon et al., 1986). Следует однако отметить, что осмотическое набухание или сжимание клеток наблюдается лишь в начальный период (несколько секунд) после изменения осмотичности среды. Вслед за этим эритроциты (так же как и большинство других клеток) начинают активно изменять свой объем, приспосабливаясь к новым условиям (Cala, 1977; Ellory & Hall, 1988). Способность регулировать объем является фундаментальным свойством клеток крови. При попадании в гипотоническую среду (с низкой осмотичностью) клетки сначала набухают, что является пассивным ответом, а затем начинают сжиматься и восстанавливают свой изначальный объем. Этот процесс носит название регуляторного уменьшения объема (RVD - regulatory volume decrease). В случае гипертонической среды (с повышенной осмотичностью) клетки сначала сжимаются (пассивный ответ в течении нескольких секунд), а

затем медленно восстанавливают свой объем. Этот процесс называется регуляторным увеличением объема (RVI - regulatory volume increase).

Следует подчеркнуть, что даже в изотонической среде клетка не находится в термодинамическом равновесии с окружающей средой. Это связано с наличием ионных градиентов через плазматическую мембрану, который активно поддерживается с помощью АТФ-зависимого активного транспорта и пассивной ионной проницаемости плазмалеммы. Теоретические принципы и мембранные механизмы гомеостаза клеточного объема были проанализированы в классических работах Tosteson & Hoffman, 1960; Freedman & Hoffman, 1979; Milgram & Solomon,1977; Jakobson, 1980; Solomon et al., 1986. При этом за основу принимается модель «насос-утечка», в которую включается как активная составляющая, описывающая активный транспорт, так и пассивная Гольдмановская утечка.

В условиях гипотонического или гипертонического стресса наблюдаемая регуляция объема является результатом активации большого числа мембранных транспортных процессов, деятельность которых направлена на выравнивание возникшего осмотического дисбаланса. Так, когда клетка оказывается в среде с низкой осмотичностью, она вынуждена "освободиться" от излишка внутриклеточных осмолитов. Наиболее часто используемыми осмолитами для выброса наружу являются ионы К+ и Cl" (Dickman & Goldstein, 1990) В случае клеток крови показано, что гипоосмотический стресс приводит к активации системы выброса ионов калия и хлора в эритроцитах лягушки (Agalakova et al., 1997;

Gusev et al., 1995, 1997, 1999), саламандры Amphiuma (Cala et al., 1992), форели (Bourne & Cossins, 1984), кролика (al Rohil & Jennings, 1989), овцы (Bize & Dunham, 1994), собаки (Fujise et al., 1997), мыши (Armsby et al., 1995) и человека (Ellory & Hall, 1988). Хлористый калий может выбрасываться через две альтернативные системы. С одной стороны, это сопряженный К-С1 котранспорт, чувтсвительный к фуросемиду, как это чаще всего наблюдается в эритроцитах (см. например Fujise et al., 1997). С другой стороны, независимая активация ионных каналов, селективных для калия и хлора (обзор см. Okada, 1997, 1998) также приводит к выбросу хлористого калия, однако это более характерно для неэритроидных клеток.

Наряду с ионами калия и хлора, из клеток в ответ на гипотонический стимул могут также выбрасываться и другие осмотически-активные вещества. Практически все типы клеток, включая эритроциты, содержат нейтральную аминокислоту таурин. Эта аминокислота не входит в состав белков. Относительно недавно было установлено, что таурин выбрасывается из клеток крови в условиях гипотонического стресса. Данные в основном были получены на эритроцитах рыб (Fincham et al., 1987; Garcia-Romeu et al., 1991, 1996), хотя аналогичные явления наблюдались и при исследовании эритроцитов лошади (Gibson et al., 1993). Предполагается, что белок полосы 3 мембраны эритроцитов, являющийся хлор бикарбонатным обменником, ответственен за объем зависимый выброс таурина из эритроцитов (Perlman, 1996).

При попадании в среду с высокой осмотичностью клетки должны увеличить осмотичность внутриклеточного содержимого для

того, чтобы выжить. Поскольку основным внеклеточным ионом является натрий, то это достигается путем активации сопряженных систем транспорта натрия. Так, было показано, что гипертонический стресс вызывает активацию амилорид-чувствительного Na/H обмена в эритроцитах саламандры (Cala, 1983), форели (Bourne. & Cossins, 1984) и лягушки (Gusev, 1997). Поскольку протоны в цитоплазме находятся в основном в связанной форме, обмен их на натрий приводит к общему повышению внутриклеточного осмотического давления и росту клеточного объема.

Нетто-перенос осмотически-активных ионов натрия, калия и хлора может также осуществляться системой Na/K/2C1 котранспорта. Эта система опосредует однонаправленный электронейтральный поток катионов натрия и калия вместе с двумя ионами хлора. Особенностью этой системы является то, что в норме градиенты калия и натрия имеют противоположную направленность и гораздо больше по абсолютной величине, чем градиент ионов хлора. Следовательно, общее направление потока осмолитов зависит от того, какой из градиентов (Na или К) превалирует. Так как в норме градиент ионов калия (140-160 мМ в цитозоле против 2-5 мМ в плазме и интерстициальной жидкости) несколько выше, чем градиент ионов натрия (10-15 мМ в цитозоле против 140-150 мМ в плазме и интерстициальной жидкости), активация Na/K/2C1 унипорта в норме будет приводить к сжиманию клеток. Действительно, в работах Ferrari et al. (1992), Fernandes & Dewey (1994) и Armsby et al. (1996), было показано, что объем эритроцитов из гипертензивных линий мышей, которые обладают повышенной активностью Na/K/2C1

системы, существенно меньше, чем объем клеток из нормальных животных. Можно было бы ожидать, что при гипотоническом стрессе будет происходить �