Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние состояния белковой молекулы стафилотоксина на параметры формируемых ионных каналов в мембранах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние состояния белковой молекулы стафилотоксина на параметры формируемых ионных каналов в мембранах"

ЛКАДЕЛШЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

РГ5 ол

2 3

На правах рукописи

АЗИМОВА РУШАНИЯ КАМАЛОВНА

УДК 577.352.26

ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ СТАФИЛОТОКСИНА НА ПАРАМЕТРЫ НОРМИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ В МЕМБРАНАХ

03.00.02 — БИОФИЗИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Ташкент — 1097

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУ.

Научный руководитель: д. б. н. Красильников О: В:

Научный консультант: акад. Ташмухамедов Б. А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Салахутдинов Б. А.

Кандидат биологических наук Казаков И.

Ведущая организация: Ташкентский Государственный Университет-.

Защита состоится « чЗ » ьиорс^ 1997 года в ' ^ часов на заседании Специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ннязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан « » 1МСи<? 199 7г.

Ученый секретарь Специализированного совета б. и. ^аликулов Д:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В настоящее время не вызывает сомнения, что специфические транспортные системы - ионные каналы, представляющие собой особый класс мембранных белков, определяют и принимают непосредственное участие в процессах рецепции, генерации и передачи нервного импульса, секреции и многих других.

Многие из продуцируемых микроорганизмами токсинов, которые не только ответственны за клинические проявления заболевания, но и создают условия для существования самих бактерий, осуществляют свои функции через формирование в мембранах клеток-мишеней трансмембранных ионных каналов. Одним из таких токсинов,' изучению которого в последние годы уделяется пристальное внимание, может быть признан а-стафилотоксин (СТ). являющийся одним из важных факторов патогенности Staphylococcus aureus. Интенсивное исследование взаимодействия зтого токсина с мембранами связано еще и с тем. что образуемые' СТ ионные каналы в липидных бислоях являются одной из весьма удачных моделей ионных каналов, существующих в биомембранах.

Содружество между биофизикой, молекулярной физиологией и генной инженерией привело к впечатляющим успехам в изучении олигомерного строения СТ-канала и установления зависимости формирования,, функционирования и свойств канала от рН. липид-ного состава мембран и величины трансмембранного потенциала. Однако еще и сегодня молекулярные механизмы, определяющие биологические эффекты токсина, остаются во многом неясными. Гипотетична и роль отдельных частей (доменов) молекулы СТ в обеспечении свойств канала.

Цель и задачи работы:

. Цель») настоящей работа было изучение влияния изменений в структуре стафилококкового а-токсина на свойства формируемых им ионных каналов с биоигических и искусственных мембранах.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. оценить влияние мягкой протеолитической обработки токсина трипсином и протеиназой К на его биологическую и канало-Формерную активности.

2. Провести сравнительный анализ свойств (проводимость, кзтион-пнионная селективость. вольтамперные характеристики и др.) игашнх каналов, формируемых натнвным и протеолитически разрезанными Формами токсина в лнпидных бислоях.

3. определить геометрические параметры трансмембранных пор формируемых нативным и протеолитически разрезанными форма-«» токсина в биологических и искусственных мембранах.

Научная новизна полученных результатов. ■

В настоящей работе впервые установлено, что:

1) несмотря на практически полную потерю а-стафилотокси-ном (в результате трипсинолиза) гемолитической активности летальная и каналоформерная активности сохраняются на относительно высоком уровне:

2) мягкая обработка токсина протеиназой И. уменьшая вдрое гемолитическую активность токсина, не только не уменьшала, но даже (при малых временах обработки) слегка увеличивала его каналоформерную активность;

.3) ионные каналы, формируемые препаратами СТ, после ограниченного протеолиза различными ферментами имеют в несколько

раз меньшую проводимость, чем каналы, формируемые нативным токсином, хотя максимальные диаметры их водных пор отличаются незначительно;

4) свойства каналов формируемых нативными и протеолити-чески разрезанными молекулами СТ резко отличаются: так, их вольт-амперные характеристики менялись от почти линейных до резко асимметричных, а селективность - от анионной до катион-ной.

Компьютерный анализ математической модели канала позволил выявить, что основные различия между каналами, сформированными нативным и разрезанными молекулами токсина, локализуются на "транс"-входе в канал, где увеличивается влияние групп,' несущих отрицательные заряд. Так как общим местом 'действия обеих использованных протеаз является глицин-богатая .центральная часть молекулы токсина, то эта часть очевидно проникает через липидный бислой и принимает участие в формировании "транс"-входа в канал.

Практическая ценность работы:

Полученные экспериментальные данные углубляют знания о структурно-функциональных взаимосвязях между структурой молекулы а-стафилотоксина и свойствах формируемого им ионного канала.

Установленные различия в свойствах каналов, образуемых нативными и протеолитически разрезанными молекулами токсйна. очевидно лежат в основе отдельных биоэффектов токсина ln viva и должны приниматься во внимание при разработке новых методов терапии при стафилококковой инфекции.

Результаты работы представляют интерес для специали~70в. занимающихся проблемами ионного транспорта, и могут найти применение в биофизике, биохимии и медицине.

Апробация работы: Результаты работы были доложены на IV съезде физиологов Узбекистана (Ташкент - 1988).на 2-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины".' - (Юрмала, Латвия -1939), на научной конференции "Структура и функции биологических мембран" ( Ташкент - 1995 ), на семинарах лаборатории молекулярной Физиологии Института физиологии и биофизики АН ГУз.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, нклэтаэднх обзор литературных данных, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитнр'танний литературы, содержащего 163 наименований. Диссертация ссдс'ргшт Г5 рисунков.

Публикации результатов исследования. Основные полоне -ния диссертации изложены в 7 печатных работах. .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы:

- коммерческий препарат стафилотоксина производства ИЭМ АМН СССР им. Н.1?. Гамалеи с и* 0.1.. очищенный в нашей лаборатории по Wat.arwl.is (1979)

у

- лррпзрат алыЬз-токсина Э.аит'еиг. любезно предоставленный

проф. К. D. Hungerer (лаборатория Behringwerke, Marburg,D).

- Трипсин фирмы Boehringer. Mariheim GmB.

- Протеиназа К (Sigma)

- фенилметилсульфонилфторид (ингибитор протеаз) (Sigma)

- Хроматографически чистые фосфатидилхолин(ФХ) из яичного желтка и фосфатидилсерин (ФС) из мозга быка, получали по методам, описанным Бергельсоном с соавт. (1981)

- Полиэтиленгликоли (ПЭГ) со молекулярной массой 300-4000 Да.

- Холестерин (ХЛ) (Sigma),

ИзоФокусирование в горизонтальных пластинах агарози проводили в .1% геле, содержащем амфолиты (LKB. Швеция), в диапазоне рН 3.5-10.5 ( Остерман, 1983).

.' Бислойные лкпидные мембраны (БЛМ) Формировали по методу Мюллера (Mueller et.al.,1963) из 2%-ного раствора липида в н-октане и по методу Монтала-Мюллера путем сведения конденсированных липидных монослоев (Montai and Mueller, 1972).Электрические параметры измеряли в режиме фиксации потенциала. Катион-анионную селективность БЛМ оценивали по потенциалам нулевого тока в условиях наличия градиента концентрации ионов, с учетом коэфициентов активности ионов в растворе. Радиус водной поры каналов в бислоях определяли по методу, разработанному нашей лаборатории (Krasilnikov O.V. et al.. ,1992; Сабиров Р.З.и др., 19916, 1993). основанному на определении влияния гидрофильных неэлектролитов на проводимость одиночных ионных каналов,с использованием параметра F-наполнение. Гемолитическая активность СТ определялась в 256— ой суспензии кроличьих эритроцитов в,лунках платы микротитратора при 37 С0.

- В -

I

по общепринятым метопам.

Выход ионов калия из эритроцитов во внеклеточную среду оценивали по концентрации ионов калия в межклеточном растворе.измеряемой с помощью пламенного Фотометра ПФМ-УХЛ 4.2. Летальную активность (дозу) - ЛД 50 определяли на белых линейных мышах с массой 1Я-23 гр. пои внутривенном (в хвостовуп вену) введении 50-ЮЗ мкл исследуемого препарата. Результаты

I I

учитывались через сутки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Известно, что СТ хотя и состоит из одной полипеппшной цепи, однако имеет дьухдоменное строение. Н- и С-концевые домены стаФилотокоииа соединены друг с другое небольшим неструктурированным участком (" глвдш-обогащеь'нш! петля"). которай обычно и подвергается атаке лротеиназ (В1опкр/1з1. ТПе1ез!.ат; 1986 к причем подобный протеолиз может происходить и 1п Пго. Активности образующихся при протеолнзе пептидов представляют несомненный ннтерес по действию как на природные, так н на ис-кусственние мембраны.

I Для того, чтобы установить меняются ли каналоформерная активность СТ (активность, которая лежит с основе биологических аффектов токсина) и свойства каналов, образованных протео-литически разрезанным СТ ¡ш подвергли СТ обработке различиями протеазанн и провел» детальный сравнительный анализ биологических активностей и свойств индуцируемых полученными препаратами ионных каналов в бнслойми лшшдных мембранах со свойствами каналов, образуемых интактнсй молекулой токсина.

Свойства препарата, полученного в результате трипсинолиза СТ.

Триптическое расщепление стафилотоксина в мягких условиях проводили в течение 4 часов при 37 С0(10 мМ трис-НС1, рН 7,П), при соотношении токсин/фермент равном 50:1 (по массе).

Аналитический электрофорез в присутствии ДДС выявлял в исходном триптическом гидролизате, кроме следов нативного токсина. основной компонент с молекулярной массой 1612 кД и несколько минорных. Протеолиз останавливали разделением образовавшейся смеси препаративным изоэлектрофокусированием в ага-розном геле. Для дальнейшей работы использовали полосу с р1=8.2±0.2, которая на ДДС-электрофорезе соответствовала молекулярной массе 16 кДа. В дальнейшем этот пептид-будет обозначатся как РСТ-1 - разрезанный а-стафилотоксин-1.

Обнаружено, что Ю50 РСТ-1 была в 3 раза больше, чем аналогичный параметр токсина, и составляла 11,4 мкг/гр, в отличии от 3,8 мкг/гр для СТ.при внутривенном введении.

Установлено, что гемолитическая активность РСТ-1 практически отсутствовала и составляла менее 0.01% от активности исходного нативного токсина (рис.1). Механизм гемолиза как для СТ так и для РСТ-1 - коллоидно-осмотический, что подтверждается опережающим выходом ионов калия в обоих случаях.

Триптическая обработка СТ вызвала уменьшение его гемолитической активности приблизительно в 1000 раз по сравнению с нативным токсином, что могло Сыть связано с потерей им в процессе протеолиза ка^лообразующих свойств.

Однако. РСТ-1 сохранял около 10% исходной способности токсина увеличивать проводимость БЛМ. Установлено, что добав-

г

Р.г

-12 -а -з -4

Рис Л. Гемолиз и выход ионов К*иэ

эритроцитов под дейстрием СТ и РСТ-1 амплитуд п, сводимости ионных кп-

- СТ, - РСТ-1, темные - гемолиз, налов для СТ(темная) и РСТ-1. срелое - емход К*.

ление РСТ-1 с одной стороны бнслойной лнпндаой мембраны из ФХ вплывало увеличение ее проводимости на несколько порядков -вследствие образования конных каналов. Амплитуда проводимости образуемых иокшх каналов были значительно меньше (55±4 пСм), чем у каналов, индуцированных при тех же условиях стафилоток-/сином (110*2 пСм). Гистограммы распределения амплитуд проводи. мости одиночных ионных каналов для СТ и РСТ-1 представлены на рис. г.

Возможные причины уменьшения амплитуды проводимости каналов, такие как - 1)уменьшение сечения водной поры канала: 2)изменение - зарядового статуса канала: 3) появление дополнительных барьеров для прохождения ионов через канал - была проверены экспериментально.

Для проверки 1-го предположения был измерен радиус водной поры каналов, образованных СТ и РСТ-1 в бнелоях с помощью гидрофильных неэлектролитов различной молекулярной массы. 05нару-

¡юно, что внесение в омывающий БЛМ водный раствор молекул неэлектролитов с малыми гидродинамическими радиусами (глицерин, этиленгликоль. сахароза, ПЭГ 300) уменьшало проводимость каналов обоих типов практически пропорционально уменьшению удельной электропроводности растворов, что указывает на свободное проникновение этих неэлектролитов в водные поры каналов, при этом состояние ионов в канале близко к их состоянию в объеме раствора. Это подтверждается тем. что проводимости сравниваемых каналов при различных концентрациях КС1 в среде пропорциональны электропроводностям водных растворов (рис.3). Следовательно. для описания транспорта ионов через эти каналы применим диффузионный подход.

' При использовании неэлектролитов с гидродинамическим ра-.диусом г >13А, они уже не уменьшали проводимость сравниваемых каналов, хотя продолжали эффективно уменьшать электропроводности водных растворов.

Используя параметр наполнения (П, мы оценили значение диаметра водной поры ионного канала формируемого РСТ-1 как равное 2,4 ± 0,2 нм. в отличии от 2,7 ±0.2 нм для СТ(рис.4). Такое уменьшение вряд ли достаточно для объяснения потери гемолитической активности и уменьшения токсичности РСТ-1.

Для оценки применимости 2-го и 3-го предположений мы изучили зависимость катион-анионной селективности и ВАХ каналов, образованных РСТ-1 от рН среды. Обнаружено, что если стафило-токсиновые каналы были анионселективнь при физиологичеоййх значениях рН, то каналы, образованные РСТ-1 обладали выраженной катионной селективностью. Значение рН, при котором происходит смена катионной избирательности образованных РСТ-1 кана-

La а <мИ>

1'ис.З Зависимость проводимости CT ¿'PCT-I каналов и олектропро-рояности от активности KCl.

Рис.4 Паране'р наполнения Г и . .. циаметр водной поры CT и PCT-I канала.

W0 - "п

и - ст

и - PCI-»

Рис.5 Влияние pH среды на катион-пмиониую селективность БЛМ, модифицированных СТ и PCT-I.

......"111

а

Lg а(нН)

Рис.6 Зависимость коэффициента асимметрии ВАХ БЛМ, ко-ифнг -popamwx CT и PCT-I.от активности электролита р среце.

I Г

лов на анионную значительно сдвинуто в кислую область рН от 10.0 (для СТ каналов) до 5.5-6.0 (рис.5). Это свидетельствует о качественном различии ионогенных групп у входов сравниваемых каналов, а именно, о преобладании отрицательно заряженных груш в селективном фильтре каналов, образованных РСТ-1.

Сравнительный анализ вольт-амперных характеристик каналов при различных рН показал, что неравномерность распределения ионогенных групп каналофориеров, определяющая свойства открытого канала между его двумя входами, существенно более выражена у РСТ-1 каналов. Так. вольт-амперные характеристики РСТ-1 имели коэффициент асимметрии -5. в отличии от СТ — 2. причем роль ионогенных групп каналообразующих белков в определении этого параметра доказывается его изменением при смене рН среды и повышении активности электролита (рис.6). При этом зависимость от рН является следствием титрования ионогенных групп белка (т.к. цвиттер-ионный ФХ не изменяет заряда в используемом диапазоне рН). а зависимость от активности электролита является отражением экранирующего влияния ионов раствора на заряды у входов в канал.

Свойства препарата, полученного в результате прогеолиза СТ протеиназой К

Обработка протеиназой К токсина проводилась при добавлении фермента к токсину(0.5 мг/мл в буфере, содержащем 150 мМ NaCI, 2 мМ КС1, 10 мМ чатрий фосфата. рН 7.4) в конечной концентрации 1.5 мкг/мл. Время инкубации при 37°С определялось задачами эксперимента.

СТ разрушается протеиназой К с образованием полосы 17-18

кЛа (при ДДС-ПААГ-электрофорезе) с образованием двух йовг^лко мигрирующих фрагментов с примерно равным размером, которые могут бнгь разделена электрофорезом в ПААГ в присутствии 6М мочевины без ДДС. Реакция прекращалась добазлением PMFS (фенил-метилсульфонилфторид) в конечной концентрации 2 мМ.

Данный препарат (РСТ-2; разрезанный а-стафилотоксин -2), в котором интактный токсин не обнаруживается с помощью ДДС-электрофореза. использовался в дальнейшей работе.

После 70 мин обработки протеиназой К CT в препарате не обнаруживается, однако. РСТ-2 продолжал показывать -50% гемолитической активности от исходного (рис.7).

Для измерения размера порг, образованной CT и РСТ-2 в эритроцитарной мембране, анализировались кинетики гемолиза (до 6 часов) в присутствии осмопротекторов-неэлектролитов. Было показано, что только ПЭГи с молекулярной массой >2000 Да способны полностью защищать клетки от лизиса (рис.8),' из чего следует, что кажущиеся диаметры водных пор. образуемых РСТ-2 и CT в мембране эритроцитов, измеряемые указанным методом, близки между собой и составляют -2.4 нм.

Применяя метод определения размера пор. использующий значения половинного времени гемолиза, который предполагает, что время необходимое для лизиса 50% клеток представляет собой время необходимое для диффузии неэлектролита внутрь клетки через нндуцированну» токсином водную перу. - т.е. "подвинности" неэлектролита внутри поры, был количественно оценен Функциональный размер пор. График Ренкина (Renkin, 1054: Ginsburg Ь Stein.1987) определяет диаметр индуцированной поры для CT равным 3.06 ± 0.06 нм. и для РСТ-2 равным 2.86 i 0.06 н.ч (рис.9).

1еФ

1Нг

Гс/пг

100-1

Б0-

О

120

Ш

—г—

0,5

1,5

СМ

Г"

0

жн

Рис.7 Дкнпника изменения гемоли- юд. тической активности СТ при обработке протеинвлой К.

50'

О-«

О

—I—

120

—I—

240

ЭЙО

НИН

120

240

т

ЭЙО

Рис.8 Протекция лизиса под действием СТ(Л) и РСТ-2(Б) неэлектролитами: I-контроль; 2-глицерин; 3-глпкоза; 4-сахароза; 5-ПЭГ-4С0; 6-НОГ-600; 7-П'ЗГ-ЮОО; 841ЙГ-1450; 9-ПЗГ-£000,2000,4000.

1

Рис.9 Подвижность молекулы неэлектролита в кенале, формируемом СТ и РСТ-2 при гемолизе - ГраЗ'ик Рен«инп.

Вне зависимости от того, что данный метод явно завышает диаметр пор формируемых в мембране эритроцитов, видимо поры образуемые РСТ-2 меньше в ~1:15 раза, чем поры формируемые СТ.

Каналообразующая активность РСТ-2 была больше по сравнению с СТ (180 каналов/мин и ,60 каналов/мин соответственно)при одинаковом содержании препарата в растворе.

Были изучены свойства ионного канала, индуцируемого РСТ-2 в БЛМ в зависимости от времени протеолиза и оценен диаметр его водной поры. Протеолиз изменял слабую анионную селективность каналов на выраженную катионную примерно через 1 час (рис.10 А). Ассиметрия ВАХ в течении первых 15-20 мин обработки увеличивалась с ~ 1.7 (соответстующей СТ) до 4.5 и затем медленно уменьшалась до уровня -3.5 (рис.10 Б). Проводимость одиночного канала РСТ-2 составляла 23 ± 5 пСм а отличии от 110 ± 2 пСм для СТ (рис.10 В).

Для экспериментов по определению размеров каналов концентрация KCl в стандартном растворе была увеличена до 730 мМ для улучшения соотношения сигнал/шум при регистрации одиночных каналов. Использование параметра F позволило установить, что диаметр водной поры ионного канала, формируемого РСТ-2 меньше ~ 1.25 раза относительно канала, формируемого СТ и равен 2.28 ± 0.26 нм, в отличии от 2.88 ± 0.3 нм для СТ (рис.11). Завышение диаметра поры СТ возможно связано с более высакщи концентрациями KCl. использованных в этих экспериментах.

- 1.7 -

б.пСм

Й 75 50 25

<н

Б

.3 2 3

60

ТЯГ

180 мин

0 ¿0 121 - и0,пВ

6

П О -61 -12 -18

120

180 пин

<50

120

зш

пин

2П

1.

п-а в-РСТ-2

■|||11П*М1Н*

• ].«: ¡1.«

Г,№

О

I

2

Рис.11 Параметр нппочнения Г и ципиетр водной поры СТ и РСТ-2 канала.

Рис.10 Динамика изменения параметров БЛМ, модифицированных препарптяг.ь СТ, в зависимости от времени его протеолиза? А - кятион-анионнпя селектпеност! В - коэффициент асиметрии ВАХ; В - проводимость одиночного нп-нала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все вышесказанное позволяет предположить, что :

1. Каналы, образованный РСТ-1 и РСТ-2. является водонапол-ненной порой, в которой ионы движутся путем свободной диффузии.

2. Радиус водной поры этих канала несколько меньше соответствующего значения для канала, образованного нативным токсином.

3. Свойства канала, образованного РСТ-1 и РСТ-2. определяются преимущественно ионогенными группами его аминокислотных

остатков, экспонированных в водрую фазу, однако состав их нес' у

колько отличается от групп.определяющих свойства канала формируемого СТ, что приводит к резкому изменению свойств ионных каналов. • " '

Однако РСТ-2 сохраняет относительно высокую гемолитическую активность в отличии от РСТ-1.

Вопрос о разделении частей молекулы СТ по функциональным параметрам неоднократно поднимался в литературе. Попытки охарактеризовать фрагменты молекулы проводились.с применением как биохимических, так и молекулярно-генетических методов. Исходя из данных литературы по молекулярно-генетическому моделированию молекулы СТ, а так же по результатам электрофореза в 6 II мочевине, наиболее вероятным представляется, что ограниченный протеолиз молекул СТ в растворе не сопровождается диссоциацией образованных (1- и С-концевых фрагментов и при взаимодействии таких разрезанных молекул СТ с мембраной оба фрагмента СТ принимают участие в образовании трансмембранных олигомерных пор.

Суммируя полученные нами данные и сравнивая их с данными

о структуре СТ. можно заключить, что расщепление молекулы СТ в зоне глицин-обогащенной петли - там же, где существуют сайты рестрикции эндогенными протеазами. приводит к изменению свойств ионных каналов, формируемых СТ. Причем, основные изменения касаются селективности ионных каналов при незначительном изменении геометрических параметров ионного канала. Изменения свойств ионных каналов, по-видимому, связано с изменением зарядового статуса в зоне глицин-обогащенной петли, основываясь на наших данных, вполне возможно, что конец (J-структуры в этой ■ зоне проходит через гидрофобные зоны мембраны и может быть расположен близко ко второй поверхности липидного бислоя и принимать . участие в определении эквивалентного потенциала на транс-входе канала, образуемого СТ. В этом случае появление некоего отрицательного заряда у входа в канал может привести к . наблюдаемому изменению катион-анионной селективности и чсеи-метрпн вольт-амперных характеристик в соответствии с расчетам модели СТ-какала, произведенном в кашей лаборатории. Последние изменения могут быть ответственны в проявлении биологических зМектов РСТ-1- и РСТ-2.

Потеря же гемолитической активности РСТ-1 можэт объясняться роль» М-конаесого участка молекул« СТ с 1-8 аминокислоту в соответствии с данными Walker et al. А так как именно после L15-3 расположен еще один сайт рестрикции трипсином, то отсутствие именно этого участка приводит к отсутствию гемолитической активности СТ.

Р Н 8 Р Д Н

1. Выявлено, что ограниченный протеолиз СТ (33 кДа) в растворе, расщепляя пептидную связь вблизи Оконца и в гли-, цин-обогащенной центральной части молекулы (в случае трипсина) и преимущественно в глицин-о&огащенной центральной части молекулы ( в случае протеиназы К), приводит к выявлению ( ДДС-,ПААГ-злектрофорез) пептидов с молекулярной массой 16 - 17 кДа.

: 2. Показано, что в результате трипсинолиза практически полностью теряется гемолитическая активность СТ при сохранении относительно высокого уровня летальной и каналоформерной активности.

Ограниченный Протеолиз ХТ ' протеиназой К уменьшал лишь вдвое гемолитическую активность токсина при полной сохранности его каналоформерной активности. 1

3. Установлено, что проводимость ионных каналов образуемых РСТ-1 и РСТ-2 в БЛМ составляет 50% и 2155 от проводимости каналов формируемых нативным СТ, хотя максимальный диаметр РСТ-1 и РСТ-2- каналов всего лишь на 855 и на 26%. а сечение на 15 % и на 37% меньше, чем у каналов формируемых нативным СТ.

В зритроцитарных мембранах диаметр и сечение РСТ-2 пор было найдено также меньшим (на'8% и на 13%), чем у СТ-пор.

4. Обнаружено,' что РСТ-1 и РСТ-2 формируют каналы с выраженной катиснной селективностью, тогда как каналы образованные нативным токсином обладают слабой анионной селективностью при нейтральных величинах рН в мембранах сформированных из фоофатидилхолина. , ;

5. Показано, что формируемые РСТ-1 и РСТ-2 каналы резко отливаются от СТ-каналов по Их вольт-амперным характеристикам

(коэффициент асимметрии -5.0: 4.5 и 1.7, соответственно).

6. Предположено, чго обнаруженные различия свойств РСТ-1 и РСТ-2 каналов от свойств каналов формируемых ннтактннм СТ могут лежать в основе установленных ранее различий биозффектов СТ на разных типах клеток. Эти изменения могут описать Механизмы инактивации СТ в организме.

Список работ.. опубликованных по теме диссертации.

• 1. Красильников 0.В.. ТерновскнП В. И.. Сабиров Р. 3.-, Зарипова Р.К.. Тзшмухамедов Б.А. Катион-анионная селективность ста-Фнлотоксиновых каналов в липняном бислое. // Биофизика. -1980,- Т. 31. ВШ1.4. - С.606-610.

2. Красильников 0.В., Сабиров Р.3.. Терновский В.И.. Зарипова Р.К., Мерзляк П.Г. Распределение амплитуд проводимости ток-снниндулировашшх ионных каналов в липидном бислое.// Биофизика.- 1987,- Т. 32. ВЫП. 4.- С.681-682.

3. Красильников 0.В.. Мерзляк П.Г., Сабиров Р.3., Терновский В. и.. Зарипова Р. К. Влияние рН-средн на потенциал-зависимость функционирования стафилотошшовых каналов в фоофати-дилхолинсвом бислое.//Укр. биохим. журнал. - 1988,- Т. 60, 116.

- С.60-66. ,

4. Зарипова Р.К. Каналообразуише свойства продуктов протеоли-тичрскоП деградации альфа-стафилотоксина. // Тезисы IV съезда физиологов Узбекистана,- Ташкент.: 1988, - С. 168-169. .

5. Зарипова Р.К..Териовсгей В.И., Кошеева И.Г. Влияние протео-литическсй деградации 'нз порообразование и гемолитические свойства аль|'1-стзфилотексина. // Тезисы Яой Всесоюзной кон-

ференции "Бактериальные токсины". - Юрмала: 1989. - С. 42.

6. Терновский В.И., Зарипова Р.К., Красильников О.В.. Корнеев A.C. Сравнительный анализ свойств ионных каналов, образованных стафилотококковым альфа-токсином и его N-концевым фрагментом 16 кДа.//Бщл. мембраны.- 1991.- Т,8, N3.-С.271-279.

7. Зарипова Р.К., Азимов P.P., Терновский В.И., Красильников О.В. Механизм гемолитического действия стафилотоксина и его триптического фрагмента.// Тезисы научной конференции • "Структура и функции биологических мембран",- "Ташкент: 1995,- С. 45

R.K.Azlmova

Data obtained In our studies enhance the ,knowleledge of structural-functional interrelations in the molecule of staphylotoxin (ST). It was found out that a limited proteolysis ST (33 kDa) in a solution, while dissolving a peptld bond closer to «-terminal and In glycln-rlch central part of the molecule (as In the case of trypsin) and In a mainly glycln-rlch central part of the molecule (as In the case of proteinase K). has resulted in revealing (SDS -•PAAG electrophoresis) of peptlds with the molecular wleght of 16-17 kDa.

The hemolytic activity of ST has been shown to be practically completely lost as a result of trlpslnolysls, while conserving high levels of' lethal and channel forming activities. The proteolysis ST restricted by the proteinase K decreased the hemolytic activity of the toxin only twice as low while fully maintaining its channel-forming activity.

The conductance of the ion channels formed by RST-1 and RST-2 in BLM was found to constitute 50% and 21% of the conductance of the channels formed by native ST, though the maximum diameter of the RST-1 and RST-2- channels was only 8% and 26 %, ' and 15% and 31% in section, smaller than that of the channels formed by the native ST.

Rsr-l and RST-2 formed channels with a pronounced cation selectivity, whereas the channels formed.by the native toxin, showed a weak anion selectivity at neutral values of pH in the membranes formed from phosphatidylcholine.'

л

SUMMÁRY

Channels formed by RST-1 and RST-2 are significantly different of from the ST-channels by their volt-ampere characteristics (the coefficient of asymmetry ~ 5.0; 4.5 and 1.7 respectively).

Found differences in the traits of RST-1 and RST-2 channels from those formed by native ST are suggested to form a basis of differences previously recorded of bloeffects or ST on different types of cells. These changes may describe the '..lechanlsms of ST inactivatlon in an organism.

ХУЛ0СА

Р.К.Азимова

Биз олиб борган тадкикотлар натижаси стаФилогоксин моле-кулэсидаги структуравий-Функционал узаро богликлик тугрнсндаги билимларни бойитади. Аникланишича. эритмадаги СТСЗЗ кЛт)тгмг чегараланган протеолизнинг охпргп Н-учи яюшидаги ва молекула-нинг глицинга бой марказий кпсми (трипсин мисолила). апникса молекуланинг глицинга бой марказий кисмилаги (протеиназа К ;<о-латида) пептид богини парчалаш бнлзн молекуляр сглрлиги 16-17 кДа булгач пептндларни (ДДГ-ПААГ>электрофорез) паило булигага олиб келди.

Трипсинолиз натижаснда нпсбатан юкори дзражадаги летал пэ каналофорчерлик фаоли сакланган холда СТшшг гемолигик Фаолпгп деярли бутунлаЛ иуколмши курсатилди. СГнинг протеиназа К билан чегараланган прстеолиги унинг каналеФормерлик хусуспятшш ту-лик саклаган холда токснмнинг гемолитик фаолипши бер-йуги 2 марта камайтпради.

Аникланишича, ГСТ-1 ва РСТ-2 каналларинпмг тксгопл ли-' метрп бор-Пуги 87, ва 26?. сеченигси оса натгв СТ чпеил гллгэи каиалга нпсбатан 15'-? ва 373 га кам бу.пишнга карамап. ик.чи каг-ламли липид нембраналчрла РСТ-1 ва рст-2 ллр хосил килглн ион каналларииинг утказувчзнлиги натив СТ хосил ки.пгаи ргшаллэр утказувчэнлнгига нпсбатан 50? га 21? ни тапкил килали.

Натив токсин хосил килгзн ододлар фосф.чтидплхолиндан хосил килингян мембрзнзлаги рНнннг нейтрал мухптпда кучепз анион селектнпдигига эга пайтпда ГСТ-1 ва ГСТ-2 катион селектиялигн юкори булган кзналларни хосил килишгаи аниклачди. .

РСТ-1 ва РСТ-2лар хосил кплган каналлар уларнинг сольтэм-пер характеристикаснга кура СТ-камаллардан Фарк килн'ли (асимметрия коэфйшиенти -5.0; 4.5 вэ 1,7) курсатилди.

Тахминимизчз. РСТ-1. РСТ-2 каналлари ва ингакт СТ хосил килган каналлари хусусиятларидаго фарклар илгарн анккланган турлп тип хужайралардап! СТ Риоэффектининг Фзркларига асос бу-ли'А'н муу.чин. Ушбу узгаришлар органпзмда СТ инактивацияси меха-низмларини баен килиб берим мумкин.