Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние грамицидина S, мелиттрина и стафилотоксина на барьерную функцию мембран эритроцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние грамицидина S, мелиттрина и стафилотоксина на барьерную функцию мембран эритроцитов"

Сг

¿^АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН'. ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

^ На правах ругоииеи

УДК 677. ЗМ. 4

ЗАХИДОВА ЛОЛА ТИШАЕВНА

ШШЯНИЕ ГРАМИЦИДИНА 3, МЕЛИТТИНА И СТАФИЛОТОКСИНА • НА БАРЬЕРНУЮ ФУНКЦИЮ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ.

(ОЗ.С0.02 -биофизика).

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - :199В г.

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУ.

Научный руководитель: доктор биологических.•'наук Сабиров'Р.3. Официальные сггоненты:

доктор биологических наук, профессор Мирходжлев У.З. кандидат биологических наук Казаков И.

Ведущая организация: ■ • Институт биохимии АК РУ.

Л^ОЯ 1398 гсдз

Защита состоится » " ' 1398 гсда в ' ^ часов

на заседании спешалиэированного совета Д 015.01.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени докгсрз наук при Институте физиологии и биофизики.АН РУз по ад-ресу:700035, Талжент.ул. Нилзова.1.

'^V- G, II/ . ■

Автореферат разослан '* —— 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета -/¿лё и д. б. н. Калику зов Д:

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЬ). ,

Актуальность темы: К настоящему времени наиболее надежные дяннао а структурных параметрах фуккцксвирущях ионных кана-xos, сфсдоирсвгзяых пе-рообраэующгши токсинами я антабиотикаш, получены с йспольгсегнкеи таких искусственных. фосфолипидных мембран, как лхпсссмы и пггнаряыг гикадше Сиалоа. Однако очевидно, что геометрические параметры таких травсмембразак вор, еСрагоэаяиыХ г мсде.з! вых и биологических мембранах, могут Сыть регдячкыдо. Сдедовьтельно, для понимания физиологических и фзрм-зкзлспгаегках зффгктсв канаяосбраэуЕизст токсинов л аятиби-' стнкэв необходимо установить размер нормируемых имя пор з природных мембранах. Детальнке аканиг' о размерах индуцированных водных дер также необходимы для экспериментальной биологии (к, в будущем, для медицины), где каналефермеры все '55нтвнсивнее испод! зувтея для контролируемого увеличения проницаемости клеточных ькибрав (Bhakdi et'sl., 1993). Актуальность исследований-по установления точных размеров индуцированных пор и выявления возможности кх регулирования подчеркивается рядом исследователей (Hildebrand bt si., 1991; Waiev et al., 1S93; Jonas et al., 1994;'Walker et si., 1S95; Chang- et al., 1995; Eayley,-1935). ■

E настоящей работе исследовано взаимодействие с мембранами эритроцитов трек различных какалссбрззуюцих веществ: зль-фа-токсина патогенных, бактерий Staphylococcus aureus, мелиттн-на из яда медоносной пчелы Apis mellifera и грамицидина' 5 -одного из внеклеточных 'компонент почвенных бактерий Bacilus' /brevis. В фкзиго-хшичеейизм и биохимическом отношении они достаточно хорошо охарактеризована, однако молекулярный механизм их физиологической активности изучен недостаточно. Общим свойством для этих трех веществ является ярко выраженное мекб-^анотропное действие. При взаимодействия с клеточными структурами они увеличивают их мембранную проницаемость, что в случае с эритроцитами приводит к их лизису.

Цела и задачи работы: Ссковкой целью ргСогы является -тановление конкретного шлекулярвегс мехатагна процессов, про-; зснс-дяздк яря лпзисе кзетск под действием трех каналсобрагук-. сах веществ. : Б процессе иеозедованяя. реаагиег йлгдужаяг задачи:

1. Яоследовазь' влияние моноклснальных еятитая на процесс, гемодага, гндуюдзуешгс альфа-тсксагсм 5. аигзиз.

'3. Вкгаипг оатшальные условия. необходим*« мя юясль-асваюгя 'яеэгевгроднгов в качестве тест-молекул при- определен»» размера ккдухи'фоззнншс еодных пор з эритроцитарных мембрана;'.

3. Научи» влияние неэлектролитов разноге ртюра «а процесс гемолиза, етдуцяруеыого альфз-тсксиксм 3. аигеиз, литгинси А.в»Ш£ега к грздагеддпком 5 из В. Ьге-/:а.

4. Исследовать возможность формирования едшгм к тем-ке каналефермероы водных пер разаичакх размеров.

5. Выявить • значение таких факторов» .как -температура .я концентрация какаясформера га формирсвазие' в мемб£акач 'здаауяа-резанных водных, пор' с различным эффективным' диаметром.

Научная новизна работы. Детально неучен процесс геислига, индуцированного тремя мембране-активными- пептидам . с рззяшп физика-химическими свойствами. Установлено, что существуют такие неэлектролиты, "в присутствии которых яндуцкревакный £яа-фа-стайилотоксином, мелиттином и гра»шцидннш- 2 лизис эритроцитов не происходят, несмотря на увеличенную проницаемость иг. • мембран для' ионов". Тем сеши: -

' 1- подтверждено предположение о коллоидво-осмотическс« механизме индуцированного использованными пептидами гемолиза;

2- показано, что минимальный размер молекул неэлектролитов, -обладающих таким аффектом, может быть принят равным (близким) эффективное размеру индуцированных водных пор. .

Впервые обнаружено, что, в зависимости от .условий эксперимента, один кааадоформер в мембранах одного типа может формироватьгодные поры различного размера.

Вперьые выявлено, что температура и концентрация канзло-формеров являются параметрами, которые (совместно с типом мекбрая) определяют вффективйый размер' индуцированных водных пор.

Впервые обнаружено отчествевззжв' гвгижза, • спссовгьк уся-дизгтъ цитолитичесзгую акиаяоста е?а$ндс»ювкозогс амфа-хокс»-'

на,

Практическая ценность- работы, йойучвннке дгннке уггу&ивг знаний о структурво-функгрсналаках гваимссвдаях з поро-овра&у-юцих агентах. Высокая фнэиалспгаескйя активность ксследован}ж веществ предопределяет точка практического прлаоиен;«5 пьаучеа-нш результатов. -Так, данные о рагмерач стафилотснсинсвой пс-ры. и закономерностях е? изменений необходимы как для докимззиа механизмов патогенеаа стафилококков, так и при яопсльгсзания токсина для натравленной пермеабилйэаааи клеточных мембран.' • Данные а механизме мембранной актива ости антибиотика грамицидина Б и пептидного токсина ыелиттина и о размерах фсркируешх ими. водных пор необходимы для надразлеввогч войска новых, . вы-• сскоактивных лекарственных форм этих препаратов.

Апробация работы. По результатам исследовании опупликова-но 3 работ. Материалы диссертации были доложены на: 4-м съезде физиологов Узбекистана (Тадкент, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Лонные каналы в биологических мембранах" (Кара-Лаг, 1990); Нзучяой конференции, посвяцеваой Ш лелш АН Республики Узбекистан (Тгжгйт, 1993}} Научной конференции "Структура к функции биологических меыбраь" (Теокент, 1985).

Структура и объем работа. Диссертация наложена на 93 страницах машинописи, .содержит 32 рисунка и 1 таблицу. ЕиСли-бграфия содержит 115 дагёчвика^ " Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, грех глав с изложением собственных результатов и их обсуждением, а также краткого заключения и вызодоз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

, В работе использована:

- альфа-токсин S. aureus и мсйокаояальные антитела, любезно предоставленные доктором . К. Е. Hungerer (лаборатория

- g -

Eehrinsverk*, Marburg, беяглпу);

.» иежйглк. ээдмйшй из яда меяоиаекзб зчежл Apis Kelliiera домгсрсм 2.Г.Ксехржеааисй (Яяс«иуз Скохзажи . Зиишадана, каеа, Украяна);

- грашда&й S, добв»£8 яредост.зея5Кй лектором А.П.Еару-<йайй (габорагзриа загибжягакез, МГУ, моекзв, Рсссяя);

- • яегюпавиглякаяа (ПЭГ) со средней медакуляраей маезезй (да>iазе(Stocn-Liffht>} 4CCKSftuci*irdt,. München); 1СCO (Auswart! Präparats) > 1500,' 2200, • 2CC0, ' 4000, SCOO (Uta Chemie). Ери. к«сб:<гдимос«! пгГй с читаясь 'шкзсСшнйсй хрсмотсгрг$«вй

о аскельвогавдам аяаерта Aß-21;

- Тряс HCl (Са1ЫссЬе»-ггЬг1йе Corp., Герман®);

- Нв8яек5рояатыг глжкезз, Сахарова (Institute oi Omistr/, ^ех0"Сазйак»а)|}'

- другие pea-Sttßti была каалифйкзцяя «ВА а хч.

Определение геысдй~а«есксй актявносяи каналоферкерев

прозодиаа в пробирка* или а дунка>: алахк ьскротатратсра при 27° О «о ¿бя^сринятш мегедзи' (Tostescn et ai., 1S8S) с модификз-•'Лйми. 8 качестве сойоакой среда использовали раствор, седер-жазий ISO нМ.-HaCl/ S цМ «рис, рИ 7,8. Kpcsa в этой среде отмывай! гр5кды. РйСочу» (гг.) суспевгао клаток инкубировали с гемолагикамя и неэлектролитами о конечными концентрациями (мМ): сахароза -40, ИЭГЗОО - 40, ШГ1СС0 - 22, ПЭГ1500 - 27,5, ПЭГ2СС0 - 23, ЛЙГ2СС0 - 20, 12ЭГ4000 - 15,5, ПЭГОСОО - 12. Яз-быяйчнай осмоаярносхь, соедазаеыгя попользованный концентрациями неэлектролитов, была одинаковой и равней 40 ыОсм/л. Вели-<шз з 40 мОсм/л выбрзиа для компенсации онксикесксго .давления, создаваемого внутри-зритроцитарнны гемоглобином. Величину геиолиэа оценивали по выходу гемоглобина, спектрофото-мегрячаска кри E4Ö а». Величину, ооогаехотвущую 1002 гемолизу, определяли после осмотического лизиса аликвоты клеток (200 ika) дкетгшироаааой водой. Требуемая температура при проведении аксперимвтой поддерживалась о аомоадю ультратермостага с $04Н0СТЬ'Я Ч).2*С.

Гидродинамические радиусы неэлектролитов, определенные в мазей лабораторииаискоэиметрическим негоден, были (А): Сахарова - 4,7; ПЗГ200 - 6,0;, ПЗГ1000 - 9,1; ПЗГ1Б00 - 10,6; ПЗГ2000 -12,2$ ВаГЗООО -14,4; ПЗГ4000 -19,2; ПЭГВОСО - 25,0.' '

За ?р}гкп'хн(}ГО raznyva гх~м вряинмахя

гвдрсжяамаяесэяг© psyr/sa ^сяекула ?.ексго »гглектрзлятв, Г-р5; кзт-грс-м вевзякве?«: яйгиСхрсггвке геедзкгз. £ сслзем сгу-

!13»: опрзделяешй «мккея о? греке»? инкубации кг»»'

яьСсриерсв с ер5«гскжтямя.. Каи «кзо ycrsssfxtno в отя«»««* яаа*глия» аедедедоя э сяределлемсм радиус? scs нсСд-дгл/'сг н г»рк» жкуСзцЙ;, ¡Й&гсму so sie;: случае

гремя Ськр гнОрзйо дсжтзтгчгьм якх^дге SD-;j?5

длд xzzt.WW.:?. здн-етичрск:^: «рядок ВЕЛИЧИН, ол/^^ях к сгащгсйзрккк, Б »?ск вре^екло: гйтгрвззе маоу я&зучзеиию дзшзи ке ггрткаю ll.

Еыхсд покоя каг;п к? вригрскктов га»»я??ли то 2едич;ггя кгяцексрацак этих ксасз з сукернатакте с nwcas« гу$йи«кксгг> фотсметр.3 JOOJ-aä выход поков к&ви определяйся после

полного лизиса зритроиитсв в д;;ст;;лл;'роъЕ1-:кс.л ¡'л:* з ¿2. рзствсре тритона X-iOO. Перед измерением irpsinp калибровали рзстворэ.::: KCl в диапазон* 0,3 - С, 5 Ж.

На рисунках, как ррсзжо, гр&я&зд снаяенаа яг

трех параллельных измерении. уд* к«г увзгвйо, стноси?ель-_

вая ссибка <jocramsa Я-Si, Екдазза* стандартны:', отклонен::;! (S), ргсчитывазись иг ооохкозит« 5« t(Vi-Yop)',23/'(M-i)>'>0. 8 где Уср-среднее значена« аадаеретаой величины: «-число измерении. Ст&тиетичесвзя осработи» экспериментальных дачных проведала:»- яо стййдвртиш форидам я программам на макро SSM IBM ?е/г>т,

. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

. Сга|кл(иш<5ки.

Влгятае антител.

Начальные этапы формирования ствфшотокятсгвой по^ы зклв-чртт связывание молекул токсина о мембраной и их их. интерната-' агцив в липидкых. мзтрлкс. На этик стадиях следует ожидать, что специфические антитела будут иметь внакятммшй эффект кз мембранные эффекты токсина. Нами исследовано влияние 20 раз-'-личных • акта-CT мококлокадьных 'антител. (MAB) на гемсдатическуй актизкось СТ. Были исследованы как'высокочувствительные зрит- л роциты кролика, так и относительно устойчивые к действие ток-

- s -

авва зряхроциты человека.

. -Как и сшаалссь, мы .обнаружили, что -все исследованные мав •были способны ингибярсвать .(хотя л с равличвой эффективностью) •СТ-.1шдуцировааньй лизкс зысскочувствитедышх к токсину эритроцитов кролика. Лепредвкдезкыи .результат бш получек.-нами i¡px исаледозаваи влияния МАБз аз СТ-индуцированныи лигко устойчивых к .действия токсяка' .эритроцитов- человека. Один иг -ШВ (EVíS56/'90/i) не ингабирозад, а значительно .усаливая гемолитическое действие СТ. Иными слова^Я1,..эти моноклснаяьные антитела (АМАВ) обладали спосойнэсзгыо активировать' СТ.. При концентрации ■л мкг/кз» АМА8 измачивали «двое активность CT, испольвоЕанко-го в оптимальной для данной тест-системь; концентрации 10 мкг/мл. Активирующий аффект АМДБ -проявлялся угкке -а в опытах с бислонными лшхидными мембранами (-проведены .совместно о к.-б. к. Мерзлякам П.Г.), что свидетельствует о том., что активация происходит на уровне взаимодействия токсина о жгапднш -мэтрикссм мембрана к для этого не требуется ^каких-либо -белковая -компонент. Интересно, что при повышении соотношения АМйЕ/СТ концентрации токсина,-вызывающие'БОЯ гемолиз (C5DX) -этих двух типов эритроцитов (исходно отличающиеся -приблизительно в 100 раз), сближались. Таким образом, AÍ.ÍAB устраняет избирательность геиолотического действия СТ. Действие других иследован-ных MAS не зависело от того, какие эритроциты были' использованы при тестирован™ цитолитической активности СТ. Они всегда проявляли икгибиругиций тип.активности.

-.-Коллоидно-осмотический механизм -лизиса. - Осмотический подход к определению размера индуцированных .' СТ-водяых пор в мембране эритроцитов.

Известно, что альфа-стафилотсксин (CT) является одним из основных, токсических • компонентов,:'". • выделяемых клетками Staphylococcus aureus во внешнею среду. Этот , токсин при системном введении в организм экспериментальных животных взаимодействует о.различными клетками, в том числе и с эритроцитами, призсдя последние к лизису.' Кинетика СТ-'-икдуцированного гемолиза изучалась в экспериментах.in vitro. Ока достаточно сложна. Б ней можно выделить лаг-период, за которым следует фаза бьгтрого рсота уровня гемолиза."Для описания таких прсцгсссв в качестве усредненной кинетической характери-: тики удобно ио-

пользовать макспыгльну» скорость гемоллгг. Установлено, что вазисимость этого параметра от концентрации токсина в двойных логарифмических косрдикатач имеет линейный учзстск о к*кгснгм, равные 1,9+0,1 и 3.4±0,1 (га SO минут. гемол»&) на кроличьих на человеческих эритроцитах, соответственно. Тот *«кт, что ге-личпнн наклонов Сьяи бользе единицы, указывает на агрегаци;.; молекул тскоияа при обраговазая им .годных пор в вритрсагтарют мембранах. Различия в значениях наклонов, подученных в гке-пе-риментах на кроличьих и .человеческих эритроцитах, могут служить косвенным указание:,; на различия в -количестве, молекул • токсина, участвуют-: а образовании 'поры в этих двух тип?«: i ран.

При коллоидно-осмотаческсм типе гемолиза потеря клетками аонов К+ предшествует собственно лизису. Такое "запаздывание" было обнаружено нами и для СТ-индуцированного гемолиза. следе-вательно, в этом случае увеличение проницаемости эритроцитгр-ной мембраны определяет скорость протекания всех псследу»и;их стадий, так;« как набухание клетки и ее посдеду*а.г-!Й лизис.

Как известно, одним иэ основных критериев коллоиднс-pet,готического механизма гемолизз является его предотвраяекне инертными вещеетвами, выравнивающими онкотический градиент через зритроцятарну» мембрану . (Weir.er et al., 1385; K&tsu et al., 1983; Palmer .et al., 1993). В опытах со стафилотоксином было установлено, что введение в среду инкубацик 10 мм (40 мОсм/л) пелиэтиленгликоля с м.м. 4С0С (ПЗГ-4000) было достаточно для эффективного предотвращения СГ-индуцированного лизиса как кроличьих, так и"человеческих эритроцитов (рис.1). Эффект ПЭГ-^ОСО не завше#-ни от концентрации токсина, .рсторая' могла быть ¡'увеличена до величин, з 100 раз превыгасщих- 'концентрацию,- вызывающую 60X гемолиз, ни от времени ваазшодейс-твия токсина с эритроцитами, которое могло достигать 3 часов, Перенос эритроцитов, обработанных литическимн концентрациями ci в присутствии залетающих концентраций ПЭГ4000 в среду без неэлектролита приводило к быстрому лизису клеток (рис.а), что подтверждает предполагаемый осмотический механизм вретекдая:. Это позволяет утверждатьчто сечение СТ-поры я зритрецктзрийк мембране меньше, чем размер молекулы ПЭГ4000, а 10 Ш концентрация ПЗГ-iOCC, создающая избыточную осколярность в 40 «Сом/л,

• достаточна для' шр®кавакяя; ояйогкчмкзго градиента, создагг«?-' .мого..внутриклеточный'гейомобинок. Поэтому во вое;; последухсиИ ■'эксяершёктах все'. неэлектролите использовались в концентрациях, у&гдачавазди. осмолярность 'стандартного 150 ш раствора'

; /Нас: на 40 мСсм/ду ■■■'.' .

Влияние различных ввэлектрслатов на СТ-индуцированный

. лкгно 5СИ7СОЦПТОЙ.. Размер пор.;__

Установлено, что зевкс;а:'сть степени СТ-индуцировайког гемолиза (?,)' от гидродгйгнмнческого'редяусз неэлектролитов к-,;; -ет гш<«идкую форму (рис. 2) . Аиалиеяруй эту зависимость и принимая величину гидрсдшамтшвзгд'' радиуса молекулы неэлектролита, при котором наблюдается•605-е ингабирование гексдкза, в качестве эффективного радиуса поры, обнаружено, что ра;;:ус стафилотокспновой поры при концентрации токсина г,0 мкМ равен пр1йерйо, 44. А как на кроличьих, та« и на человечески:-: эритро-фгг'ах. Умекьшенй'е' концентрации токсина'и температурь- не меняло ййгкоидалькой формы зависимости уровня гешдиэа от гидродляа--¿¿ЯНуса неэлектролитов, но сдвигало зависимость в

• а$б$сйу'-йеньяйк знаний радиусов. Такой сдвиг с очевидностью

на 1<8йекекй? эффективного размера токсин-гадуцнро-МиШюй Пори в '^итроцитарзсз1 мембране. Еол& .ка^цейтращв: токсина.

; Ка.<йг (5£йо об мру же ко ,■ что, как на эритроцитах кролика, так й йа э'ргйроц;тт2х Человека эффективный радиус стафилотокси-йояой воры йшйсел от концентрации токсина (рис.3). В области

• беи&яйк; гавцентраЕрйй таксика, где была вогможность анализа раэ'йёра С1-?педуцированных пор,, форма зависимостей была практи-' чески" одинакова для обоих типов клеток: радиус имел свое максимальноеЗначение (плато при А) в области больших концентраций токсинз и 'уменьшался, когда концентрация токсина становилась ШМътё (1 мкм) . В экспериментах с эритроцитами ролика удалось установить, что при дальнейшем уменьшении концентрации тйкснка рад:1ус ОТ-индуцированных пор такие уменьшался я достигав Йоаого стационарного значения, близкого к А. Обрыв на кривой; '

я •о Б X Т1 ■и >< о. <р э а:

о ж р Я 3 з;

V—V ь •"1 к ч.

ы г\э у: С1 Я со С»

1 ГГ СП о ы [в

» рз а Ь

ДЗ Й о <Я 1-5

Л Ей Е7 •-1 01' а

к и* И о 09

*—' О —1 § о О м

о» К 01 | и!

■о я в ш

Ь; ?=• о О о

И 13 о 01

Л П 5 п -}

«в О 3! о да ь*

М г 1 г: к

о V* ф Г1)

ш И К ¿Й

8 •1» 1 .Й а о Ь •Л X: 1 а г

и

Радиус ОТ-поры, А са о N *

1

о м

Ы Ф О* о

со га

I I

со о

II

о а ч

- о н

ч-

а

-1

О -С'

•и о • * ы

о* &

П Ь) я ы

.С о

а: ч Г1 ■V

и С» О Си

а

с» и а

а Го •-3

С« м

я о о §

о 5 6 ш

О

я Я8 ¡3

гз 2 "V

а '4) к

Р Е) Й

ч X Ф

Ф ■л

3 в А

Я О О л>

а> 1 ж 1 а 1 ■ 0 1

•9 II п

3 Ф о о -о ь»

и

;со и.

Гемолиз, %

К

СП

о.

'О

-О.

о

а хл ■ ■К

о

л «

.8

ь

ж

л.' о

сл

(О

о<

I '» I '»

■о с»

I

СТ1 ы ч '¡г1 ГП : Й "А

к 3* | О 1

Г! Й & ж >1 Е <3

а: Ъ тт Г5 • Й •рь

о >< о ё ■Д1 о V. (

.<0 >1 •с а А*

Т! »•3 о а О и 3 X ГЗ О о

Ж И •а г: о КЗ о §

<3 К О ч

о ■3 СП и -л, и 40 X , Г5

ш о Я г>1 »с й> . Я

>-3 » 1 В § а; : 0>

•й ж 8: ш; сз сь

Й 1 Л » г) •¡Й. ■го га ' к ; 1

с. № о ►И , а

О С? Д о % 9 '• о

ч а О о О ¿С н о гв

1 1 1 Не

■е. I

я 3 •о

за

1

О «

43 £

-к я

„ъ %

,'3.

Гемолиз-,%

м ^ ® а о о о о о о о

о

а> о

45

- АС "

соответствующей человеческим'эритроцитам, связан с тем, что"-при меньших концентрациях токсин уже не лиэирует гтот тип клеток. Наличие двух плато из зависимости (при -14 А л при -9 А) укзвывзет из возможное существование двух.ферм канала, отличающихся по размеру. При ккэкей концентрации токсина формируется пора с меньшим радиусом, равным 9 -А, а увеличение содержание токсина в среде создает условия для формирования большей поры -с радиусом 14 А. Можно предположить, что переходная зона, расположенная в области 0,1-1 мкМ, соответствует одновременному существованию обоих типов ОТ-пор.

Влияние температуры.

Выявлено, что при низкой концентрации ОТ, понижение тем-перзтуры инкубации с 37°С до 4*0 приводит к закономерному уменьшена определяемого радиуса пор с 9,0 А до 7,Б А (рис.. 4; кривая 3). При использовании больших концентраций ОТ (ЗмкМ), независима от типаиспользованных эритроцитов, установлено белее значительное уменьшение эффективного радиуса токсин индуцированных пор при уменьшении температуры, от -14 А при 37"С до 8-9 А при 4®0 (ряс.4; кривая 1 Й 2).

Необходимо отметить, что гидродинамические радиусы молекул ЛЗГ слабо,., но зависят от температуры. В качестве примера" на рис.4 (лиши 4) приведена такая зависимость для ПЗГ1500. Поэ- , тому экспериментальные кривые зависимости радиуса пор от температуры могут содерлать некоторую систематическую ошибку,, приводящую к еавыаекизр определяемой температуры перекодз на 0,6.'-1,0еС и реального.,радиуса самих;водных пор приблизительно На 0,6 А. ■■''•',•.■";• ;

Пори, образуемые в мембране грамицидином

В согласии с опубликованными ранее данными нами.показано, Ч.то грамицидин 5 (ГрЗ) в микромолярных концентрациях вызывает лизко эритроцитов. Кинетика этого процесса изучалась. как на кроличьих, так и на человеческих эритроцитах, чувствительность которых к действия ГрЗ оказалась примерно одинаковой. Как: и в случае стафклстсксина, скорость индуцированного ГрБ выхода ионов К из .эритроцитов Была вше скорости гемолиза. Рзэличия отчетливо проявлялись ври низких концентрациях ГрЗ (<16 мкм).

При таких концентрациях лизис эритроцитов происходил заметке медленнее по сравнению с зыходом ионов калия, подтверждая тем саам как формирован;« грамицидином- 3 в эрвтроцитерзой мембране водных пор яеба&вого размера, так и коллоидно-осмотический, механизм геюдияпеского. действия1 ГрЗ. При беяьаих концентра- ' ция:г ГрЭ (>15 мкм) различия а кинетике выхода исков К и лизяса клеток были неБначгтельны,, что мажет косвенно указывать на, увеличение размера индуцированных пор при большж концентрщи-ях ГрЗ. •

Для определения.ксшчестаа молекул ГрЗ, участвушк а фор-штровании трансмемСранккх пор, мы провели анализ зависимостей величины гемолиза и выхода ионов кЧпри.ЗО и 50 минутной, инкубации) от концентрации ГрБ. В двойных логарифмических координатах величины наклонов (п, го всех случаях грезьгпали 1. . Сле- , доЕЗтельно, несколько молекул ГрЗ могут участвовать а образовании транс-мембранных водных пор.

Неэлектролиты и размер Гр5-порк.

Зависимость степени ГрЗ-индуцировазного геюлига (%) от гидродинамического радиуса молекулы неэлектролитов, так же как и для случая с СТ, имела сигмсиднуп форму (рио. 5). Неэлектролиты загущали клетки от литкческсго действия ГрБ по осмотическому механизм, о чем свидетельствует практически лолнсе. разрушение эритроцитов после перенесения клеток в среду без задищзясего неэлектролита, но с той же концентрацией ГрЗ, что . и а присутствии неэлектролита. Если в среде, в котируя переносились клетки, отсутствовал не только аащщввйий неэлектролит, но и ГрЗ, уровень гемолиза возрастал,, однако полного лизиса клеток не наблюдалось. Это свидетельствует- о том, что антибиотик связывается о мембраной эритроцитов обратимо, а сила евя- , аызанил достаточно мзда, и при понижении концентрации ГрЗ в среда его эффективная концентрация в плоскости кембракы так*е бь^зтро уменьшается.

Влияние концентрации ГрЗ на размер образуемых

им водных пор.

При изучении зазисшости радиуса ГрЗ-псры от концентрации антибиотика было установлено, что прималых'концентрациях (начиная от наименьших- иггяческих я вплоть дс 30 '»«Я) размер поры- >

о

оставался относительно стабильным и близким к Б+1 А (рис.б).

Лрй дагадаейкем увеличении ¡крнцен^рации здщбиояяка -э^КЖИВДУЙ ••радиус ааконсжерно /увеладашаяся-л .яри '.ксищентрацаях »бодав 5РР мкМ уже не менялся, сохрант» ага уровне 12+9,3 -к. Та«иы ¡обра- . вом, налицо оудастиованае давга «зостоявкй Д]рЗ лорн с фздиусемн б и 13 а. соответственно. -.Сбавота -на чдеэой с доа^Ауташвд аффективными радиусами может соответствовать ¡как .одновременному сучестаоЕзнет обоих типов пор, тгй~:и присутствию-на ФЧмЗра-не лор с промежуточны) размером.

Температура к размер УрЗ-индуцированных дар в :мемсраке

эритроцитов.

При .први»вкии температуры .инкубации. .определяемый ;радяуа EpS-nop-вакономврно уменьшался с ¡12,7 до .7,7'А (рис.7), температура половинного -изменения радиуса'была/близка к ;i9üC. :Ste величина несколько отличается от гтагавой, установленной -вами п экспериментах со стефилотоксиновым лакал см, одна» лежит в пределах гоны температурного перехода лапидного матрикса арит--роитарной .иекбраны (17-20°С, Черницккии, Воробей, 1S81). Поэтому можно полагать, что для формирования' грамицидиновой поры важное значение имеет состояние липидного бислоя клеточных мембран.

4. Влияние температуры на величин'/ элективного радиуса образуемых CT пор'и иа ' гидродинамический радиус молекул ПЭГ1500.' 1 и 2 -Эритроцита человека и кролика, ССТ1 -- 3' мкМ; 3- Эритроциты кролика, ССТ0,03 мкМ; 4 - Гидродинамический радиус ПЭГ1500. PW3-.&. Зависимость стационарного уровня Гемолиза от гидродинамического радиуса ¡^электролита при различных .. концентрациях

й,температурах,

1- 60 икМ rpS, 37*Cj 400 mkí»f fpS, 37°C; Й- 60 мкМ rpS, 10 °C; KáK i, во с последу-перенесением эритроцитов в раствор, содержаний: неэлектролитов. Время инкубации-2 чзса.

futí. в. Зависимость зД-' Зектизного радиуса индуцированных пор _от

концентрации ГрЗ. Инкубация 2 часа при 37*с.

ос

1 ..г л о.

0 с

1

н о

0

1

«

14 12 10 9

U 12 10 а

О 10 20 30 4Ф Температура, С°

И О i

Ч X а (ц

а к

И R

■t* S

к

^ Sí'

100

£

о a к 50

3 a

о í-r 0

О -1 D -2 ^ -3 Г..Д..4: А -5

< 0 ' 5 10; 15 20

о

Гидродинамический радиус, А

«<¡

Я1® а,

Д10

а >i

и ■. ■ «

л . а*

0.6 1 1.6 2 №pS],mhM

2.6

Поры, {юрммруемые мелиттином в зритроцнтарной мембране.

Ыелиттзн - • одкв4 кг. основных вдтотскс-ячэсккх кояпонектов яда медоносной пчелы Apis ¡r.elliíers. Лиелс эритроцитов под действием мелиттина изучался многими автора),«! (De Orstío et ai., 1982, Tos^eson et al., 1S6S, fettsu et al., 1986). Предполагается, что иехгназм этого процесса мелет быть связан как с .образованием больших пор, проницаемых для гемоглобина -СБе i-ráelo et ai, 1982), так и с формированием небольших'каналов, ::;-•--нацаемых для веды и кизкемолекуллрных ионов. Нарушение коллоидно -осмотического равновесия клеток будет являться причиной гемолиза Юль ко в случае 'образования мелихтином водных пор, ' рагмер которых меньае, чем размер молекул гемоглобина.

Нами обнаружено, что, "как и в случае с Гр5, выход ионов кадия заметно предшествовал лиэису эритроцитов только при :тс-. пользования малых концентрации (<Ю мелиттина. Яря больших коацвнграцаях мелиттина оба процесса происходили почти синхронно.

Ееличиш наклонов зависимостей цитояитических эффектов (выхода ионов калия и лизиез эритроцитов) от концентрации мелиттина в , двойных лсгзрифмических координатах были всегда. больше .1. Так, при 20-минутном взаимодействии мелиттина с • эритроцитами величины наклонов зависимостей уровня выхода ионов калия к гемолиза от концентрации токсина были равны l,6tD,l и 3,2¿0,1 , соответственно (рис.8). Следовательно, з образовании трансмембранзых пер принимают участие.- несколько молекул мелиттина. ■'•';

. Неэлектролиты и мелиттир-индуцнруемыи лизис, эритроцитов.

.Нами установлено, что, так же, как и в случае с.другими изученными нами мембрако-активными пептидами (СТ и ГрЗ), гид-ррфильные неэлектролиты о большим гидродинамическим радиусом предотвращали лизис эритроцитов, индуцированный мелкттиком. 'Защита клеток . происходила по коллоидно-осмотическому механизму, 'о "чем свидетельствует значительный лизис клеток после их перенесения... в физиологический раствор, не содержащий неэлектролиты. Бледует отметить, что, так же как а случае с ГрЗ, концентрация мелиттивд в згой, не содержащем неэлектролиты реет-

вер1? f должка была поддерживаться ■ неизменной, иначе восстановления исходного.уровня гемолязз не происходило. Этот факт свидетельствует об обратимом связывании мелиэтика с мембраной эритроцита, з также о быстром уменьвения.эффективной концентрации токсина на меи&ргне с понижением его .концентрация в среде. Следовательно, мелиттин действительно образует -в мембране гритроцитоз водные поры огракйче}зя$с размеров.

Газыер «елитткч-индупирозанкых пор,. ■

Использование неэлектролитов с ¡раадаод&да -гидродинамическими размерами позволило определить эффективней -радиус мелит-тин-формвруемых пер и установить, что -этот параметр поры зависит от концентрации полипептндг -(рие.-д-). Наличие, двух . ква-зи-стацяонерных значений радиуса в области -концентраций мелот-тика 2-4 мкМ'и 20-50 .чкМ указывает на формирование км двух достаточно стабильных структур (пор) в зритроцитг.рвьк мембранах. Эффективные радиусы таких пер могут Сыть приняты равшьк: 12 А и 26 А. Следует отметить, что поры больших размеров формировались при концентрациях мелиттина, значительно преБЫзаю-щих минимально необходимую для 100?. лигкез клеток.

В отличие _от действия СТ и ГрЗ элективный радиус индуцируемой мелиттинсм поры не зависел от темперзтуры в диапазоне от 4 до 37°С.

Рш.7. влияние турСы (р и ьга.-еня як-куавиии (2,3) т эел:;-

чкну. эффективного радиуса Г-3-П01).

11 Гр5 - гас*' МЙ4. Йнку-

Згккз 2 .часа. 2 и 3 получены при 37*3 и 4*"с,-ооогегтстагано.

Ь<5

1 м

о, 14 К П

<210

£Г 8

о -6

«и й

,« А

Время, мин О 30 60 60 120

О 10 20 за 43 Температура, С

Рис.8. Зависимость вк-

.туод:а ионов_К4 к

уровня гемолиза (") от .

Ишкубациа 30 минут;37*0.

Рис.9. Зависимость аф-. «ективного радиуса индуцированных пор от концентрации мелиттина. . Инкубация.20 минут; 37°С.

25.

го

-1.5 -1 -0-5

ЫмёлиттинК мкМ

У

ю

1.Ь

■¿О, [»МВТТЙН^Ш«

ВЫВОДИ

1. После деваю влияние двадцати ионокленальнык анитите* из ггишштическую функция амфа-ст&Ьяатскта. Обнаружено мз-кокловальвее антитело, оказывающее-■ активирующее влияние вз взаимодействие альфа-тгасина с человеческими эритроцитами и бвслэйнши мембранами. Нее остальные антитела хштибирсизли активность токсина г/км связывания в-ведяои фаге.

2.Деталь но исследована кинетика лигиса эритроцитов под действием альфа-токсина З.гитеиз, ыелаттина и грамицидина 3. Установлен коллсидио-ссмстический механизм гемолпва. Локзваао, что инертные яепроникаояме неэлектролиты в концентрации- 40 мСсм способны предотвращать лизис клеток.

3. Установлено, что кинетический порядок процесса стафи-дстсксин-индуцирсванйсго гемолиза равен 1,75+0,10 для эритроцитов крол:кз и 2,66+0,10 для эритроцитов человека. Показано, что размер аюфа-стафилотоксиновой поры в эритроцитаркой мембране может варьировать в зависимости от типа клеток, концентрации токсина и температуры. Выявлено три основных типа пор с радиусом -7,5 А, 8-9 А и 14-15 А. Обнаружены температуре-зависимые переходы между ними.

4. Установлено, что доза-зависимость^уровня лизиса эритроцитов кролика под действием-грамицидина 2 имеет порядок по концентрации антибиотика, разный 1,9+0,1. Установлено, что грамицидин 5 образует поры двух размеров: 6А и 13 А. Выявлены теыпературо-эависише изменения размера-грамицидиновой поры.

Б. Гемолиз человеческих эритроцитов под действием мелит-тина имел порядок по концентрации токсина, равный ¡1,5. Установлено формирование двух 'типов мелиттиковых пер''-:с радиусом

и 26А и переходы.медду ними в зависимости, откоцентрации токсина. Установлено, что размер мелиг'тинсвой поры является температуро-незааисимсй величиной. ■

стж pmrt аттшттвт ш теш диссертации.

1. Сабиров P.S., Захидова Л.Т.,. Муратходжаев Д.Н. Дейстзке Грамицидина- 5 ка- природные и искусственные мембраны.. Тез. дока, научных сообщений IV' съезда физиологов Узбекистана, Ташкент, 9 -11 ноября 19S3, с, 132-183.

.2. Сабиров Р. 3., Красйльников О.В., Захидовз Л.Т. Избира-■ feibHocTb. цитолитэтеского дейгтвюпгтафйлотоксйнз и структура образуемых им водных пор з эритроцитарных мембранах. - Яж:-. ;АН СССР., 1990, t.315.N6, с. 1479-1481.

3.-'Сабиров Р.З., Красилькиксв О.В., Зарубина A.n.-, Згхадозз Л.Т., А!уратход»зев Д.Н., Юдина Т.П. Действие грамицидина S на клеточные и модельные мембраны. Вестник Московского университета, 1990, сер 16,'Биология, И?, с. Е1-Б6.

4.Сабиров Р.З..Захздовз Л.Т., Красилънйкеь D.B. Зависимость эффективного радиуса индуцируемой ялзьфа-*токсином S.aureus в .зритроцитараых мембранах водной поры от концентрации канало-формера и температуры.Тез.докл.всесоюз.сй^йоз."Ионные каналы в биол.мембранах"» (24-27 апр.1990, Kapa-Даг),-Москвз, 1990, с.73

Б/. Сабиров Р.З., Красильников О.В., захздоваЛ.Т. Три типа пор, образуемых • в эритроцитарных мембранач альфа-токсином Staphylcococeus aureus. Биологические иеибраны, 1991, т.8, с. 149-754. • '

5/ Krasilnikov O.V., Temo-sky V,l,, IfersHak P.O.. Zachi-бб</й L.T,, fcingsrer K.-D. Effects of jftönoclcnal antibodies cn älphastaihyiotoxir, äotlon against erythrocytes and model phosphöi'ipid ifteftbranes. Eioaherr.ica et Biophysica Acta. 1993, > V.1182, P.94-100. . -„■

7. Сабиров P.S., Звхйдова Л.Т. Зависимость размера пор, формируемых грамицидином S, от концентрации антибиотика и температуру. Тег.докл.научной конференции посвященной БО-летига АН Реоаублйки Узбекистан (октябрь 1993), Ташкент, с. 79. . ^8. Сабиров Р.З., Захидова Л.Т, Влияние мелиттина на форми-роазние . пор в мембране эритроцитов. Тез. научной конференции. Ctpykr/pa и функции биологических мембрри, (23-24 марта 1995), Теикен*. о, 9?,

- 7.Х -

ХУЛОСА

Л.Т.го.угдсзв.

Грамицидин заедите® ва стгф;иогсксгош:кг эритроцит , . мемСракаларикинг барьер функциясиг?, тзьсири.

УяЗу идти tic;?, .грамицидин S, мелнттнн ва стафилотоксин-к;:кг зрптроцктларкии- бар^ерлж функциясига таъсири моноклоная: антителолар у,а<да ссмотик .'протекция метода ердамида тащщ ф-лпкди. Натяиеда ^йдагздар анзпмаядя:

1. Ургажиган ЕОтз антитёлодан. баттаои S, «шгеиз бактерп-ягариниЕГ альфа-гокзива функцпясики (одаы зритрсцнтлари гемо-ли?п ва еунгик лиаад мембраналзрда канал урсщ галкши) куча;"!- .,, тиреди. Долган 19гася узбу функщгягларки- камайтариши анлклзнди. '

2. S.aufeus аюфа-токсина . мелиттш ва грамицидин 5'таг-снридаги гемолиз кгаетакаса чунур урганилди. Ушбу жграен кол-доид-осштик межзнязми буйича кечипи курсатилда. Лоралар opt-¿3-\ ли утмавдиган ккерт неэлектролит моддалгр 40 мОсм мотрорида ояинтанда -хуяайрз лиэясгаш бартараф агава яююфяяжя.

3. Стзфиготоксин ткьеярида кечздиган гемолизякнг кииети!-;. даражаси 1^уеи эрктроцитларкда 1,75+0.10 ва ода.« зритрсцитлари-да 2,63+ОЛСни таикил этиаи аяи^гиди.. Стафплстокоин псраси-яянг катталагя лужгЯра тури, токсин, ксяцегтргкияси ва температуры з fjapsfi узгяризк курсатнлди. П&раяаркикг учта асосий ту-ряакг'раяяуси А, 8-9 А ва 14-15 Агз «нгляга 8ни§ланд1ь. Температурага берлй^ .рввяада уибу радиуолар бир-бирига' утиб ■ Т/рКЕИ тспилдл. ■..,.•■

4.Грамицидин 3- тааьсиридзги гемолиз юдда концентргцкяси-ккйг 1,9+0,1 дарзжзекга богликлиги курсатилда.. Ушбу антибиотик икка типдаги лора грскл ^кзди,';;;ва'улзрнивг. радиусе 6 А ва 13. А га текгд:гр за инкубация .темлературасига бордик раяишда узга-ргдя. . ' ■ ..... '

5. Мелптгин тагсиридаги одам еритроцитларк гемолиза токсин кокцентрациясияинг 1,5 чи даражзоига бомикдиги аниранди. Еу яептвд хам икки г/рдаги пора з^эсиз Vjssuíü, "■ уларнинг радиус-лари 12 А ва 26 А га тенгдир. .Мелит тин порзсияикг радиуси тем- • пературага боглик эмас деб топилди. .... *

; S1MMKY

i ■ L.r.Zahidovs

. The influence of ¡rrsmicidir. S, swllttin and staphylotoxin on the barrier function of erythrocyte membranes.

The interaction of three different pore-forcing substances* alpha-toxin of 3. aureus, melit-Mn of honey bee Apis nel-1 if era and antibiotics ffraroiciiin S poroduced by bacteria Be., cillus brevis with erythrocytes was studied usinr'- monoclonal antibodies and osmotic, protection . method. Only one cut cf twenty:monoclonal antybedies was found to activate the alpha-toxin lytic activity on human erythrocytes and lipid bilayers. • All other antibodies had profound inhibiting- effect.

The kinetics cf cell lysis was studied m detail for these three pore-formers. It was shown that the- mechanism of hemolysis was of coloid-osmotic type. The inperpeable inert r,o-nelectrclytes at the concentration of 40 jrCsra were shewn to protect cells froir, lysis.

The kinetical order of staphylotoxin-induced cell lysis was found to be 1.75+0.10 for rabbit and 2.65^0.10 for hunan red blood cell3 respectively. The size of toxin-formed pore w83 shown to be variaole depending on cell type, protein concentration and temperature. Th'ee main types of size were found to be -7.6 A, 8-9 A and 14-15 A, Temperature-dependent si-, ze transitions were shown for alpha-toxin channel.

In case of gramicidin S, the.dose dependence was found to have the order of 1.9+0.1 on the-.peptide concentration. The antibiotics4 was found to form chiefly two types of pores with sizes of 6. A h 13 A. The pore also exibited temperature-dependent transitions in'radius.'

, The order of 1.5 was found for the hemolysis induced by ine^ittin. Like gramicidin S, this peptide toxin'formed two types of pore with radius of 12 A and 25 A. However, the radius cf inelittin channel was independent of incubation, temperature.

3 A