Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние сАМР и протеолиза на транспорт кальция в саркоплазматическом ретикулуме миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние сАМР и протеолиза на транспорт кальция в саркоплазматическом ретикулуме миокарда"

Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени А.А.Жданова

На правах рукописи УДК 577.352.45

Д И Ж Е Галина Петровна

ВЛИЯНИЕ сАМР И ПРОТЕОЛИЗА НА ТРАНСПОРТ КАЛЬЦИЯ В САРКО-ПЛАЗААТИЧЕСКОМ РШКШИЕ МИОКАРДА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград

1988

Работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета Ленинградского государственного университета им.А. А.Уланова

Научный руководитель доктор биологических наук

А.Е.АНТИПЕНКО

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

М.Н.МАСЛОВА.

доктор биологических наук

Н.Б.ГУСЕВ

Ведущее учреждение Институт цитологии АН СССР.

Защита состоится у1 Су^р198 г. в часов на

заседании специализированного совета К 063.57.09 по присуждению ученей степени кандидата биологических наук в Ленинградском государственном университете им.А.А.Жданова (199164, Ленинград, Университетская набережная, 7/9, ауд,90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинградского государственного университета им.А.А.Жданова

Автореферат разослан " " .МХХ^Сч 196иРр.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук В.КЛ1АВЛЕНК0

¡¡.'üelii*:'! j

. ' j ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:гртации1 Актуальность теш. Известно, что регуляция сократительной " способности сердечной мышцы осуществляется, в частности, путем сАМР-зависимого фосфорилирования белков-миаепей б саркоплазматиче-OEOU ретикулуме (CP). Так, для расслабления необходим концентрационный градиент Са2+ "CP-саркоплазма", равный I03. Этот градиент создается работой Са-иасоса CP; скорость переноса кальция через мембрану АТРазой ретикулуме монет быть увеличена в 3-5 раз посла максимального фосфорилирозания фосфоламбана - низкомолекулярного кон-понента мембраны CP /Gasser et al., 1986/. Таким ооразом в миокарде осуществляется нейрогуморальыый контроль полноценности диастолы и, следовательно, систолы.

В настоящее время в субъединицах фосфоламбана обнаругены участки для фосфорилирования с помощью с AMP - нальмодулин - и фосфоли-пид-заваокккх протеинкиназ /лед^пег, Jones, 1984/, a также ауто-фосфатазная активность /¡iranias, Salvo, 1286/. Установлено, что критически!.; фактором развития как обратимых, так а необратимых изменений з кардиокиоцитах при премии является переполнение саркоплазмы ионаин кальция / Carhonin rt al., ISEO; Rubin, 1985/. Коль скоро концентрация этого кона в миоцпте б процессе сокрааднип-расслаб-ления контролируется фосфорплкрованием соответствующих Оелксв-мисе-ней, значение этих реакций в развитии инемического поранения миокарда становится весьма вероятный.

Наряду с протеинфосфорилпрованием ванным путей функциональной и структурной модификации бегхоьых молекул является, как известно, протеолиз. Поэтому исследование в миокарде системы "фосфорилярова-ние - протеолиз - транспорт Са2* в CP" мозег иметь существенное значение для понимания молекулярных основ регуляции расслабления как здорогого сердца, так и в ииокардиальных зонах иаеаии с повышенной протеолитической активностью.

Цель и задачи исследования. Целы) работы явилось изучение взаимного влияния протеинфосфсрилирозания и протеолаза на регуляцию транспорта кальция в С? как неповрежденного, так и ишемизиро-ванного миокарда.

Исходя из поставленной цели, ресзлксь следующие задачи:

I. Изучить устойчивость к протеолязу фосфоламбана в связи с его сАМР-зависгиии фосфорилированаем.

2. Исследовать влияние сАЫР, протеинкиназы, ингибиторов фос-фопротеинфосфатзз и трипсина на процесс транспорта кальция кал в неповрежденной сердечной маице, так и в иаеыизированном миокарда.

Основные полояения и результаты, Еыносицые на защиту. Фосфо-рилированио регулятсрного белка саркоплазматического ротикулума -фосфолаыбана является стабилизирующий фактором по отношению к устойчивости этого белка к протеолазу з.п т^го. Стабилизация к про-теолизу проявляется в присутствии экзогенного сАМР ("эндогенное" фосфорилирование) в здоровой миокарде собак, экзогенных сАМР в протеинкиназы ("экзогенное" фосфоралирование) в обратило пораженной сердце (циркуляторная гипоксия) и отсутствует в СР необратимо пораженного сердца (экспериментальный инфаркт) в этих условиях.

Степень как "эндогенного", так и "экзогенного" фосфорилирования фосфолаыбана коррелирует с уровнем накопления 5Са в везикулах мембран СР миокарда. "Эндогенное" фосфоралирование стимулирует транспорт кальция в неповрегденнои сердце в течение более длительных интервалов времени обработки макросом трипсином, инги-бируюдии этот процесс, чей в СР обратило поракенного миокарда, В случае "экзогенного" фосфорилирования стимуляция транспорта кальция в микросомах интактного и ишемизированного миокарда на фоне действия трипсина имеет однонаправленный характер.

Нолиблат аммония наиболее эффективно (по сравнению с различными концентрациями спермина и фторида натрия) ингибаруег эндогенную фосфопротеинфосфатазную активность в СР миокарда. В присутствии мольОдата аммония существенно увеличивается скорость как Оазального, так и сАМР-зависимого накопления ^Са в микросомах.

Научная новизна, в работе впервые установлено, что нарушение сЛМР-зависимого фосфорилирования фосфоламбана в СР ишемизированного сердца ведет к снижению устойчивости этого регуляторного белка к протеолазу. При этом степень нарушения протеинфосфорилн-рования и соответствующего сиикения стимуляции Са ^-транспортирующей способности везикул ретикулума коррелирует с уровней увеличения протеолигической активности в СР. Впервые установлено "разобщение" процесса транспорта Са2+ в микросомах СР ииемизирован-ного сердца при действии трипсина (ингибирование) и Са-АГРазной активности мембран СР (активация). Впервые показана возможность относительной стабилизации к протеолизу стимулируемого транспорта кальция в СР здорового и пораяенного сердца при "эндогенном" а

"экзогенной" протеинфосфорилировании. Для стимулирования скорости как базального, так и сАМР-зависииого накопления в везику-

лах С? впервые применен колибдат симония, эффективно ингибирувций фосфопротеинфосфатазную активность в CP миокарда.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования вносят определенный вклад в существующие представления о молекулярных основах регуляции расслабления как здорового, так и ишеип-знрованного миокарда. Выявленные нарушения в системе протеинфос-форилировакия в CP, очевидно, являвтся одним из факторов, определявших развитие поражения системы сопряжения возбуждения с сокращенней уге на обратимой стадии ипекиа миокарда. Полученные результаты позволяют рекомендовать новый подход в области экспериментальной коррекции метаболической недостаточности сердца, основанный на использовании для этой целя ингибиторов фосфопротеинфосфа-таз.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следуацих конференциях и симпозиумах: на 1У Всесоюзной симпозиуме по циклический нуклеотидан (Минск, 1982); на П Всесовзной конференции "Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии (Ленинград, 1983); на К симпозиуме Советской секции Цегдунсродного общества по изучению сердца "Метаболизм, структура и функция сердечной клетки" (Баку, I98S); на УВ Всесоюзной симпозиуме "Ыофи-зика и биохимия иыаечного сокращения" (Пуцино, 1987).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глаз ("Обзор литературы"; "Экспериментальная часть", включающая разделы "Объект и методы исследования" и "Результаты работы"; "Обсуждение результатов"), выводов и списка литературы. Работа из-лохена на 124 страницах машинописного текста, включая 15 рисунков и 9 таблиц,и список литературы из 203 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Стабилизация к протеолазу при сАМР-зависамом фосфорила-ровавии фосфолацбава сердца.

Объектом исследования слупили собаки обоего пола массой 1520 кг. Необратимую форау иаеиии - инфаркт миокарда вызывала перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии. Через 24 часа делали реторакотоиш и иссекала иаемизированкые участки левого гелудочка. Развитие инфаркта миокарда контролировали по ЭКГ и по-

явлению изофермента MB креаишшназы в сыворотке крои. Обратиыув форцу ишеник - циркуляторную гипоксию вызывала эксфузией крови из левой бедренной артерии с расчеток, чтобы систолическое артериальное давление удераиваяось на уровне 50-70 мы рт. ст. в течение 3-х часов. Затем осуществляли торакотошю и иссекали участки левого яелудочка. О тяаести циркуляторной гипоксии судили по газовому составу крови и изменению некоторых биохимических показателей. Контролен в обоих случаях слугили такие ке участки миокарда здоро-еых животных. Результаты исследования фосфорклироввдия фосфоламба-на с обработкой и без обработки трипсином представлены в табл.1. За I00JJ принимали уровень фосфорилирования этого белка интактных иикросои за 10 иин при SO0 С в присутствии Ю~6 U. сАМР и 0,2 иг/ил экзогенной протеинкиназы. Проведенные исследования доказали, что через 10 пин инкубации уровень "базального" фосфорилирова-

Таблкца I

Фоофорилировазие фосфолаабана сердца собак при циркуля-торной гипоксии в отсутствие и з присутствии трипсина

Состав проб

% связавшегося с белком ^Зр

Норма

Гипоксия

В отсутствие сАИР, протеинкиназы и трипсина

В присутствии;

CAMP

cAÜP+протеинкиназа

трипсин, затеи ингибитор, затем сАЫР+протеинкиназа

-сАМР, затеи трипсин

с А!.!!* про т е и н к и н аз а, затеи трипсин

19±3 (9)« гач (8)

71-7 (IE) (10)

100*6 (10) 94±8 (8)

8±I,I (6) 6*1,3 (8)

67-8 (S) 28±4Й О)

98*9 (12) 89±7 (8)

- различия по отношению к контролю достоверны (р < 0,05), ях - число животных в эксперименте.

пия (в отсутствие экзох'енных сАЫР, протеинкиназы и трипсина) фосфо-лаабаиа интактных кикрооом составлял примерна 19% (2,5541,4 ниоль 33Р/иг белка) от стимулируемого Ii сДЦ? и зкзогеииой протеин-киназой за это se время (контрольный уровень - "экзогенное" фосфо-ридарование); в присутствии 10""^ К сАЫР и отсутствие экзогенной протеинкиназы ("эндогенное" фосфоралированио) уровень фосфорилиро-

ваная достигал 71% от контрольного. Сравнение уровней фосфориди-роваяия фосфэлаабана из интакгного и пораненного (циркуляторная гипоксия) миокарда показало примерно одинаковую базальнуи степень фосфорилирования, существенную разницу (в 1,5 раза) при сА1!Р-сти-цуяируемоц "эндогенное" фосфорплирозании и выравнивание уровней "экзогенного" фосфорилирования (13,8^,8 и 12,9^1,1 ниоль ^/Ю мин на I «г белка в контроле и при гипоксия соответственно). Полученный результат по экзогепноыу фосфорялярозанив фосфолаа&ша ааеаизаровакной и здоровой нкыцы позволяет предполоаить равноценную способность к фосфатной кодификации молекул бзлков-ииаеней в этих случаях.

В следующей серии (табл.1) иикросомк обрабатывала трипсинси при соотношении трипсин/белок макросом = 1/10, в среде для фосформирования, не содержащей сАМР, прогеинкиназу и АТР. После 5 кип инкубации добавляли ингибитор трипсина - фенилметидсульфснилфто-рад (0,5 иМ). Предварительная обработка трипсином приводит практически к полной потере фосфолацбакоа способности к фосфоралирова-нпв как в иаеиазирозаннои, так к в неповрен денном циокарде. Как "экзогенное", так и "эндогенное" фосфорилароваяие фосфэламбана здорозой аыацы оказывает абсолютный закатный эффект по отношении к действии трипсина - в случае царкулнториой гипоксии этот эффект наблюдается только при "экзогенной" фосфорилирозанаи. Приведенные данные свидетельствуют о корреляции цезду степеньо фосфорплированая пораженного и ¡штактного ииокарда и его уязваиостьо для трипсина. При згой каков бы ни был результат структурной реорганизации фосфолаыбана, обусловленной его фосфориларованкеа, очевидно, при этой модифицируются участки молекулы этого белка, чувствительнее s протеиназкой атаяе.

Результаты исследований по фоефорилировапию фосфолаабана на необратимой стадии ишемии представлена в табл.2 а 3.

Добавление евкр сгиаулируе? фосфорнлирование, хотя и в иеиь-зей степени, чем сАИР. Сзикение уровней как "эндогенного", так и "экзогенного" фосфорилирования свидетельствует о фосфатной иоди-факации фосфолаабана на необратимой стадии ииеини. Бри этой отсутствует защитный эффект обоих типов фосфорилирования по отношению к действию трипсина.

Выявленное нарушение способности к "эндогенному" фосфорилиро-ванип фосфолаыбана при цирнуляторной гипоксии я инфаркте и к "эк-

Таблица 2

Сосфорилирование фосфолгыбака сердца собак в норме и при инфаркте ыиокарда

Сост;-^ проб

% связавшегося с белком

Нору а Инфаркт

22Ч (б)235 20-5 (9)

49-8 (9) 24*6* (9)

68-7 (12) (12)

100*6 О) т^-е35 (9)

Контроль

В присутствии: Ю-6 И сСМР Ю"6 М оАМР

ИГ6 М сАМР+протеинкинава

35 - различия по отношению к контроля достоверны (р < 0,05), зех - число животных в эксперименте.

Таблица В

Сосфорилирование фосфолаыбана сердца собак в норме и при инфаркте миокарда в сочетании с обработкой трипсипои

та

Состав проб

Связаваийся с белкой (за 100% -фосфорилкрование в контроле нормальной и пораженной мыицы)_

Норма

Инфаркт

сАМР, затеи трипсин 94*8 (И)82 е?1-8з: (12)

сАИР+протеишшнава, затем трипсин 97^9 (12) (12)

трипсин, затем ингибитор, затеи сАМР+проте-инкинзза 7^0,9 (9) 9*1,3* (9)

* - различия по отношении к контролю достоверны (р < 0,05), хж - число киютншс в эксперименте.

зогепноыу" фосфорилированию этого бедка при инфаркте, обусловливающее его большую по сравнению с фосфолаибаноц из интактной иып-цы уязвимость для трипсина, ыохет быть геи более вешно в связы°вы-явленной повышенной протеиназной активностью в саркоплазыатическоц ретикулуые пораженных иашц. Так, по нашки данный, суммарная актив-нооть протеиназ, определяемая по накоплению аргиииновых остатков в средо,как в случае автолиза микросоиальной фракции, так и в присутствии 1% тотального гистона в ореде инкубации, увеличивается при переходе от обратимой к необратииой стадии ишемии от 3,8 до

15 раз(рН 7,0, 7 нмоль аргкнина/час на I иг белка в микросомах неповрежденного сердца), в последней случае выявляется еще 2 пика протеиназной активности - в кислой (рН 3,4) я щелочной (рН 8,9) областях. При инфаркте миокарда по данный электрофореза наблюдали частичную деградацию белковых компонентов мембран ретикулума (рис. I).

Рлс.Ь Денснто-грамкы гелей с ыикро-сомальныш фракциями.

а - норма, б -циркуляторная гипоксия, в - инфаркт миокарда (88, 104 и 55 мкг бедна на гель соответственно).

Установлено (табл.4), что базальное содерганке с4\1Р в миокарде собак при цяркуляторной гипоксии не изменяется по отношении к контроля (здоровые животные) - 547-43 и 625^51 глюль/г ткани соответственно; но снижается при экспериментально« инфаркте (485*40 пмоль/г ткани). В отгет на увеличение концентрации адреналина в среде инкубации до М-1* М наблюдали повышение содержания еАНР в цитозолыюй фракции как интактного (в 1,8 раза по отношению к соответствующему базальнсму уровню), так, хотя и в меньаей степени, пораженного миокарда (циркуляторная гипоксия и инфаркт). Эти данные соответствуют результатам экспериментов по определения стимулируемой адреналином активности адевилатциклазы в этих ге условиях. Таким образом, при исследованных формах порзления сердца фермент (аденилатциклаза) частично сохраняет сАМБ-синтезирующую способность.

Таблица 4

Влияние адреналина (5*Ю~5 и 5"10~4 М) на уровень САМ? в сердце собак при циркулярной гипоксии и •экспериментальном инфаркте

Уровень сАМР (шодь/г : гкани)

0 5'Ю-5 М 5-Ю"4 К

Норма 625-51 (12) 70О-6О55 (12) 943*56* (10)

Циркуляторная гипоксия 547-48 (7) 615±55 (S) 721*38* (S)

Инфаркт 435*40 С?) 431*52 (6) 573*36* (S)

3£ - различия по отнопению к контроля достоверны (р< 0,05) (контроль - соответствующие значения в отсутствие адреналина) ,

¡at - число аивотиых в эксперименте.

Обнаруженное ранее /А.Е.Антипенко, С.Н.Лызлова, 1384/ изменение способности холоферыенга протеинкиназы активироваться под влиянием сАМР может Сыть, в частности, обусловлено увеличением проте-олатической активности в зоне ишемии, в этой связи тем более значимой представляется повыиенная уязвимость для трипсина фосфодаа-бана при гипоксии, связанная с нарушением "эндогенного" фосфорили-роваиия этого белка. При этом, во всяком случае на обратимой стадии ишемии, снижение фосфорилкруввдй активности является определяющим факторам нарушения "эндогенного" фосфорилирования фосфоламба-на. Зтот вывод подтверядаат результаты определения фосфопротеин-фосфатазной активности в интактнои и поврекааннои миокарде. Так, через 5 ив инкубации фосфорилированного с помощью (\ - Р) AIP гистона с препаратами микросом как интактного, так и поврежденного (циркуляторная гипоксия) миокарда, % связанного с белком ^Р составлял примерно 4S-26J5 в обоих случаях. В то ке время при инфаркте миокарда в этих не уоловнях с гистоном оказалось связано примерно 27% от исходного уровня (рас.2).

П. Влияние трипсина, сАИР-завиеиаой протеинкиназы и ингибиторов фосфопротеинфосфатазы на активный традспорт кальция в оаркопдавматическом ретикулуме сердца.

В предшествующей разделе показана положительная корреляция меаду степенью фосфорилирования фосфолаибана как интактного,-так

Ряс.2. Скорость дефосфори-ларованиа иикросои интактной '.и пораненных сердечных ишц в присутствии Ю~6 М сАйР.

I - норма, 2 - циркулятор-нан гипоксия, 3 - инфаркт. По оси ординат - включение ^ в % по отношению к контролю.

и ииеиизирозанного «иокарда, и устойчивостью этого балка к действии трипсина. Такай образом, очевидно, протеикфосфорилирование в мембранах СР сердца имеет в&таое физиологическое и патофизиологическое значение. В этой связи представляет интерес исследование система "фосфоритровавие - прогеолиз - транспорт са2+ з СР" как неповрегденкой, так и в обратит пораненной (цирку ляторная гипоксия) сердечной мысды.

Проведенные исследования на иикросоиах антактного сердца показала (табл.5) увеличение (в 1,8 раза) в присутствии в среде инкубации Ю~° М с АИР океалатэазвсяной Са-зравслортирующеЯ способности мембран саркоплазаатичесного ретикулуаа по сравнению с базаль-нш! (нестЕиулируеынц) уровнен скорости транспорта этого иона. В случае присутствия в среде для фосфорилирозания наряду с 10"^ сАНР 0,2 иг/ил экзогенной протеашганазы скорость накопления ' Са в везикулах макросом возрастает в 2 раза по сравнении с базальниа уровнем. Трипсин оказывает ингибирувщее влпявие на процесс накопления кальция в везикулах СР во всех исследованных интервалах времени обработки кикросои этан фераентом. Предварительное фосфорили-рование меибран СР в присутствии 10~® а сАМР в неповреаденнок миокарде обладает защитный эффектом в отношении стинулируеыой нуклео-тидоы Са-транспортирующей способности ретикуяуиа до 10 иан обработки трипсаноы включительно. При добавлении в среду инкубации наряду с сАМР экзогенной протеинкияазы защитный эффект фосфориля-рования сохраняется в течение всего исследованного периода обработки СР трипсином (4,33^,27 и 4,50*0,37 ыкиоль 45Са/ыг -белка

Таблица 5

Влияние трипсина на накопление '(,Са микросочачи чиокарда (мкчоль/чг бзлкз-5 мин)

Проба, Участки Обмботка трипсином ( мин)

среда чиокз^да 0 2,5 5 10 15

Баз сАМР и поотеинки-назы Н 2,4310,34 1,9810,27 1,6610,21* 1,31Ю,36* 0,9810,30*

Г 2,3310,35 2,1810,54 1,8910,34* 1,2110,43* 0,8510,31х

С сАМР н г 4,17Ю,44 3,2710,20 3,9510,23 3,11*0,31 3,6410,27 2,3410,52* 3, ЗОЮ, 55 1.54Ю, 36* 2,0310,50я 1,2710,40«

С сАМР и про- н 4,9310,27 '>,8410,28 4.78Ю.30 4,5510,36 4,5010,37

теинкиназой г 3,7210,% 3,5010,32 3,4410,39 3,1710,46 2,8410,36*

Примечание: и = 8-9; Н - неповрежденный миокард; Г - циркуляторная гипоксия;

* - р < 0,05.

5 газ во время "О" и 15 мин соответственно). Во время "О" трипсин и ингибитор вносили одновременно. Установлено, что трипсин ингиби-рует нестимулируемый транспорт са2+ в СР ишекизирозанного се8дца вплоть до 15 мин инкубации. Во время "О" уровень накопления 4йСа в везикулах СР в этой случае не отличается от такового в неповреа-денном миокарде (2,£5-0,55 и 2,43^0,34 мкмоль ^5Са/Мг белка-5 мин соответственно). Защитный эффект фосфорилирования в присутствии Ю-6 М оАКР по отноиению к стимулируемому транспорту кальция в мембранах иаемлэзрованного сердца наблюдали лииь до 2,5 мин обработка трипсином; при этой стимуляция накопления кальция во время "О" менее выраггена (в 1,4 раза), чем в СР кепозреядезного сердца. Отметив, что стимуляция фосфорояроваяия фоефэламбана в эгоа случае была почти в 2 раза более низкой, чей в контроле (здоровый миокард). Однако, в присутствии экзогенных сАМР п лротеишмназы динамика защитного эффекта фосфорилирования в отноаении стимулируемого нуклеотидом накопления в везикулах СР до Ю шш была такой зв, как и в случаи неповрежденного миокарда на фоне более низких величин скорости транспорта кальция во время "0я в С? ишеиизированного сердца :га сравнению о интакткым.

Таким образом, очевидно, что уровень протеинфосфорилирозания СР определяет не только устойчивость х лротеолизу фосфолаыбана, но и уязвимость к ингибируыщеау действию трипсина сАМР-стимулируе-мого процесса транспорта через мембрану СР.

Отметим, что нарушение сАМР-завя самой регуляции Са-транспор-тирувщей системы в СР при ишемии происходит на фоне практически неизменного уровня Са-АТФазной активности СР (1,654),44 и Х.г!*-^0,50 икиоль РвеоргУиг ЙеЛка'МИв в неповреаденной а пораженном миокарде соответственно), то есть имеет место "разобщение" активности Са-навоса СР и его сАМР-зависимой регуляции. В условиях ин-гибировакия транспорта кальция в С? под действием трипсина (15 мин обработки) активность Са-АТФазн как неповредденного, так и ишеаизироваиного миокарда повышается (табл.6). При ишемии миокарда на фоне увеличения протеолитической активности и выраженного дефицита макроэргов такая "пробуксовка" Са-насоса ыоает иметь весьма неблагоприятное влияние на сократительную функцию сердца.

Данные о значительном увеличении Са-транспортирувздй способности СР миокарда в присутствии "экзогенных" сАМР и протеинкиказы и снижении при этом фзсфориларутщей активности в микросоиах узе

- и -

Таблица 6

Влияние трипсина на Са-активируемую АТРазнув активность в микросомах миокарда (шыоль Рне0ргуиг белка'шш)

Участки МИО-

.Обработка трипсином (айн)

О

2,5

5

10

15

Н 1,65^0,44 1,75*0,40 1,88*0,20 2,12*0,24 3,II±0,3SE

(7) (?) (7) (7) (7)

Г 1,21*0,50 1,29*0,24 1,70*0,40 2,10*0,20 2,50*0,60*

(6) С 6) (6) 46) (6)

Примечание: В скобках приведено число опытов; Н - неповрегсленный миокард; Г - циркуляторная гипоксия; - р < 0,05.

па обратимой стадии иаемического поражения сердца послужили основой для серии экспериментов по изучению влияния различных ингибиторов фосфопротеннфосфагаз на эндогенную активность ферментов и скорость транспорта кальция в СР. Исследовали возможность модулирования скорости активного транспорта через мембрану ретикулуыа крысы с помощью молибдата аммония и спермина. Как видно из таблицы ?, в присутствии ИГ6 М сАМР скорость транспорта 45Са через мембрану ре-тикулума возрастает более, чем в 2 раза по отношению к базалыюму (нсстиаулируемому) уровню и увеличивается еще в большей степени (почти в 3 раза) в присутствии 0,25 мМ молибдата;скорость базальпо-го накопления кальция такае существенно возрастает. В присутствии

^Са не отличается от базально-

0,1 uU спермина уровень накопления

го и уменьшайся в присутствии 10~б И сАМ? по отношению к стимулируемому с помощью этого нуклеотида. Напротив, присутствие 10 uii спермина в среде инкубации не отражается на стимулируемом и приводит к незначительному увеличению базалыюго уровня накопления ""Са в ре-тикулуме. Полученные данные в определенной степени согласуются с имеющимися сведениями о том, что полиамины (в частности, спермин) в концентрациях > 2 ы£1 ингибирувт, а в меньших - стимулируют активность фосфопротеинфосфатаз типа I и 21 / Tung ot al., IS85/.

Мохяо думать, что увеличение скорости как базального, так и стимулируемого транспорта кальция через мембрану сарноплазиагиче-ского ретпкулума сердца з присутствии молибдата аамокия7и возрастание бэзального накопления 45Са в везикулах в присутствии 10 мМ

Таблица 7

Оксалат-зависимое накопление ^Са микросомааи сердца* в присутствии модуляторов фосфопротеинфосфатазной активности (нмоль ^Са/мг белиа-10 мин)

Контроль Молабдат аммония 0,25 util Спермин• Спермин 0,1 ка ю мм

Базальный уровень 0,81^0,07 1,41-0,IIй 0,74*0,10 1,06^0,09й

(S)®5 (5) (5) (6)

В поисутствии I0~S II сАЧР I,70-5D,I5S 2,4030,23* 1,31*0,12й 1,74*0,18

(S) (6) (5) ( б)

s - разлитая по отношению к контролю достоверны (р < 0,05),

зое - число кивотных в эксперименте.

спермина связано с уменьшением дефосфорилирования фосфолакбана.

Действительно, иягибирование 0,25 мМ колибдатоа аммония эндогенной фосфопротеинфосфатазной активности в СР по напац данный достигает 80%, что значительно превосходит ингибироваяие 40 uîi фторидом натрия и примененными концентрациями спершна.

Весьма интересно, что при обработке мембран СР деаоксихолатои почти 90J» потери их Са-транспортирувдей способности предотвращается сАМР-зависишш фосфорилированием фосфоламбана - эффект продемонстрирован недавно indu и соавт. (1986). Таким образом, универсальность защитного эффекта фосфорилирования мембран СР, по отноаеняи г разнофакторному повреждению транспорта Са2+ мозет иметь всмое патофизиологическое и клиническое значение.

Выявленные в нашей работе нарушения^ системе "протеинфосфори-лирование - дротеолаз - транспорт са"+ в СР", очевидно, являются определяющими в развитии поражения системы сопряжения возбуждения с сокращением yse на обратимой стадии ишемии. Полученный результат позволяет обосновать новый подход в экспериментальной коррекции метаболической недостаточности сердца, основанный на использовании для этой цели ингибиторов фосфопротеинфосфатаз.

ВЫВОДЫ

I. В неповрежденном миокарде ааиитный эффект фосфорилирования фосфоламбана по отноиенив к протеолизу проявляется в присутствии насыщающей концентрации оАМР. При обратимой анемии (циркуляторная-

гипоксия) такой эффект воспроизводится в присутствии в ерэде инкубации, наряду с САПР, экзогенной протеинкиназы. При необратимой ишемии миокарда (экспериментальный инфаркт) защитный эффект cAiiP-зависимого фосфоридирования фосфоламбана по отношению к действию трипсина отсутствует.

2. Установлено активирующее действие трипсина на Са-АТРазнуа активность саркоплазаатического ретикулуиа и ингибирующее влияние на процесс транспорта кальция в везикулах как неповрежденного, так и обратимо пораженного сердца.

3. В присутствии сЖР стимулирование транспорта кальция в неповрежденном сердце сохраняется в течение более длительных интервалов времени обработки микросои трипсином по сравнению с активацией этого процесса при циркуляторной гипоксии. Стимуляция транспорта кальция в микросомах йактного к ишемизированного миокарда на фоне действия трипсина имеет однонаправленный характер при наличии в среде инкубации, наряду с сАМР, экзогенной протеинкиназы.

4. В присутствии модибдата аммония, эффективно ингибирующего фосфопротеинфосфатазнув активность в саркоплазаатическом ретикулу-ме сердца, увеличивается скоробь как базального, так и сАМР-зави-сииого накопления кальция в микросомах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зависимее от циклических нуклеотидов фосфорилирование фосфоламбана миокарда в условиях циркуляторной гипоксии/ Антипенко

А.Е., Скворцова Г.П., Лызлова С.Н. - В кн.: Циклические куклеотида. Тез. докл. 1У Всесоюзного симп. Минск, 1982, с.9-10.

2. Влияние кетсмина на потребление кислорода при массивной кровогюгере / Уваров B.C., Шанин В.В., Скворцова Г.П. - Анестезиология и реаниматология, 1982, Й5, с.15-16.

3. Сосфорилирозание фосфоламбана при экспериментальном инфаркте миокарда, стабилизация к протеолизу при фосфорилнровании / Антипенко А.Е., Гончаров О.Г., Скворцова Г.П., Лызлова С.Н. - Балл, эксперии. биол. мед., т.96, №9, 1983, с.42-45.

4. Изменение сАМР-зависимого фосфоридирования фосфоламбана сердечной мышцы при инфаркте миокарда / СкЕорцова Г.П. - Тез. докл. У1 Всесоюзной конференции. В кн.: Актуальные вопросы анестезиологии и реаниматологии, Л., 1983, с.63-64.

5. The effect of nolybdate and spermine on the cAilP-stimulatcd

transport of Ca in cardiac sarcoplasmic reticulum / Antip'enko A. E., Lyslova S.N., Skvortsova G.P. - In Abstr. Ill Symposium "Metabolism, Structure and function of cardiac cell", Baku, 19Я6, p.46.

6. сАНР-зависииое изменение устойчивости и про-еолизу транспорта Са в саркоплазиатическом ретикулуме сердца / Скворцова Т.П., Антипенно А.Е., Красовсная И.Е., Лыэлова С.Н. - В кн.: Вюфизика я биохимия ыыаетаой подвижности. Тез. докл. УИ Всесоюзного аяип., Пущано, 1987, с.62-63.