Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние репродукции цианофага А-1 на метаболизм аминокислот в клетках цианобактерии Anabaena variabilis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние репродукции цианофага А-1 на метаболизм аминокислот в клетках цианобактерии Anabaena variabilis"

г » и V "

1 П ЛПР

л Р Л".АЛВ51Я }1&ФРЙЗЙ$ЕЯШ УЗБЕКИСТАН У Г Р V Л _

п . - ИНСТИТУТ :-ГгГ-иК1аюш

На правах рукописи

шиши я

УДК 579.852:232,578.81

ВЛИЯНИЯ РЕПРОДУКЦИЙ ЩАНОФАГА А-1 НА МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ В КЛЕТКАХ ЦИАНОВАКТЕРЙЙ АКАВАЕНА УАР1№!Ы2

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степстш

кандидата биологических наук

Ташкент

Ш5

Работа выполнена б лаборатории вирусологии Института микробиологии АН РУз и в отделе вирусов водорослей Институт» микробиологии И ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д.К. ЗабОЛОТНОГО АН У|фйЛНЫ

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

-доктор биологических наук Myрадов M.W.

-локтор биологических наук, профессор Менджул М.И.

-доктор биологических наук Ходжибаева С.М.

-кандидат биологически наук Камилова Ф.Д.

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУз

Залщта диссертации состоится " " : л5£ г

в часоз ка заседании Специализированного Совета Л. 015.02.21 пэ зааите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ь Ии~-титуте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Таскент-12о, ул. А. Кадыри, 76. Fax: (ЗГ712) 41-71-29

С диссертацией можно о&ндксмнться в биглп:теке Института микробилогии АН РУз.

Автореферат разослал " JO" AlXiptUtf 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук, профессор ^¿¿сг^^г^С

Актуальность темы:- Последние десятилетия развития вирусоло-: ;:и •гспрср.здзались большими успехами в области исследований раз-л;пчш проск-ссоь и механизмов, обеспечивающих репродукцию вирусов и бактериофагов. Так установлено, что после проникновения вирусного гf.нома в клетку-хозяина возникает качественно новая биологическая система, функциональная организация которой слагается взаимо-Д'.-й-тъием вирусных и клеточных функций. Вирусы з подавляющем своем

C OXl V.lHCTbe состоят ИЗ НуКЛеИНОВОЙ КИСЛОТЫ И беЛКОВ. И"1"1 ""2^..+ на мысль, о высокой vnillcw я нмиыпь-ТГГГ" *>

м"1" ""гтг"—. чпнаип_ « время практически не известно,

какие молекулярные механизмы лежат в основе активации метаболических путей и отдельных ферментных систем, участвующих в синтезе ciоль значительного набора субстратов, кофакторов, активаторов и эффекторов, использующихся в биосинтезе предшественников вирусспе-цифических компонентов. И как следствие, в мировой литературе до сих пор не существует обобщающих сводок о физиологии, биохимии и энергетике вирусных инфекций, о механизмах вирусиндуцированной ре-гулпь-ги ключевых Ферментов метаболических путей, прямо иди опосредованно связанных с синтезом вирусспецифических нуклеиновых кислот л белков. Успех з решении поставленных задач во многом определяется выбором объекта исследований. Система цианофаг-цианобактерия может оказаться ценной в расшифровке механизмов реализации генети--'он информации ЛНК-геномных вирусов.

Исследование роли некоторых метаболических путей и компоненте- фотооисте-м в репродукции цианофагов, выполненное проф. М.И. Менлхулсм, позволило в общем виде сформулировать стратегию функционирования генома пианофога на ранних этапах инфекции. Речь идет с н-пг- М.-ИЯО ьаадом ^¡акторе инфекции - формировании de novo дополь-мт- .v. ;.ux м-хз:.::!омоь, способствующих образованию соответствующеге пула субстратов, кофакторов, коферментов, эффекторов и повышении, восстановительной силы системы вирус-клетка.

Установлено, что по мере развития цианофаговой инфекции т.нутр№г.-точнад протеолитическая активность цианобактерий сущест-г.( ннэ изменяется, коррелируя с уровнем аминокислотного пула и содержанием пептидов (Колтукова и др.,1993). Это говорит о том, что на ранних этапах инфекции в системе цианофаг-цианобактерия формируются принципиально новые, функционально отличающиеся от существующих в не зараженной клетке механизмы регуляции потока метаболитов, основным назначением которых является обеспечение синтеза ви-

русспецифических компонентов. Поэтому исследования, посвященные изучению особенностей аминокислотного обмена в инфицированной циа-нофагоы клетках Anabaena variabilis представляют большой научный и практический интерес и несомненно актуальны.

Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния репродукции цианофага А-1 на метаболизм аминокислот в клетках цианобактерий Anabaena variabilis. Достижение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

- изучить компонентный состав и активность протеолитических ферментов в системе цианофаг-цианобактерия в ранний период развития вирусной инфекции;

- определить состав аминокислотного пула в зависимости от стадии развития цианофага А-1 в клетках A. variabilis;

- изучить активность ключевых ферментов биосинтеза аминокислот аспартатного и глутаматного ряда;

- выделить и очистить из клеток Anabaena variabilis на ранних стадиях развития цианофага А-1 ферменты с аспартаткиназной активностью и исследовать их ретроингибирование.

Научная новизна. Впервые установлено наличие протеиназ в составе цианофагов и существование нескольких вирусспецкфических протеиназ в ранний период развития инфекции. Получены подтверждения активации ключевых ферментов биосинтеза аминокислот de novo (глутаминсинтетазы, аланиндегидрогеназы. аспартаткиназы) и одного из возможных механизмов их вирусспецифической модификации путем снятия эффекта ретроингибирования.

Практическая ценность. В связи с развитием фотобиотехнологии наметилась реальная переспектива использования цианобактерий в качестве дешевого источника для. получения различных метаболических ферментов, включая и протеиназы. 'Поэтому очистка и первичная характеристика свойств внутриклеточных протеиназ одного из широко распространенных в природных-водоемах видов сине-зеленых микроводорослей - A.variabilis, представляет несомненный практический интерес.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждались на конкурсах работ секции молекулярной биологии и биохимии Института микробиологии и вирусологии им. Заболотного АН Украины (Киев,1391; 1S92), IV Украинском биохимическом (Киев,1992), I (VIII) Украинском микробиологическом съезде (Одесса,1993).

Публикации. Основные положения диссертационной работы опуб-

ликованы в 9 печатных работах. Выражаю глубокую благодарность кандидату би.г.сгических наук Н.в. Колтуковой и Т.Г. Лысенко за оказанную i^cMcsb при выполнении диссертационной работы.

Структура я объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 10 таб-лип . Еибллсгрг^ил включает 105 наименований (из них 34 отечест-r.n»nw авторов и ?1 -иностранных). Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов испл»-

дований. гл™»*--.....~ »»иплпт. » ~iicuarvpM,

r-ягтота ^ осотв*тствют с проблемно-теоретическим

планом лаборатории вирусологии Института микробиологии АН РУа по теме (ИР:"Выявление, идентификация, изучение биологических и физико-химических свойств вирусов и взаимоотношение их с культурами хозяев", регистрационной N 0186009002 (1986-1990);"Изучение циа-нофагов, плазмид азотфиксирующих цианобактерий и их роль в изменчивости культуры хозяина", регистрационной N 019Э0001765 (1991-1995).

Краткое содержание работы

Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы излагаются особенности вирус - клеточной :и:теч<; циянс^лг А-1 - цианобактерия Anabaena variabilis, сведения ;с.г,! ::ро:;ессо?, проттаяига в развитии вирусной инфекции, вирусде-терминирсванных литических ферментах, а также о протеолитическсм

Глава 2. Объекты и методы исследования Все исследования проведены с культурой Anabaena variabilis, синхронизированной затемнением и зараженной цианофагом А-1 с мно-10 БОБ/кл^тку. Отсчет времени инфекции начинали че-р-? :') vhh после внесения цианофага - период адсорбции вируса на клетках цианобактерии Менджул и др.,1985]. Отбор проб проводили с ¿•¡гг^гссм 0; 0,5; 1; 2 и 3 час, что соответствовало длительности

Протеолитическую активность (ПА) определяли модифицированным методом Ансона [Nemoto et. al.,1959) с применением в качестве субстрата 10 7. раствора казеина в 0,05 М борно-боратном буфере, рН

7.4. .

Содержание белка на всех этапах получения и очистки ферментов определяли по [Bradford, 1976], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Активность аспартаткиназы (АСК) определяли калориметрически (Х-535) гидроксаматным методом [Black et.al., 1955], активность аланиндегидрогеназы (АДГ) - по lYosnlda,1990], а активность глу-таминсинтетазн (ГС) в биосинтетической реакции по образованию г -глутамилгидроксамсвой кислоты при 535 нм [Black et.al. ,1955].

Для выделения и очистки ферментов использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЗ-или КМ-сефадексах А-50 или ДЗАЭ-целлюлозе, (Бондарчук и др.,1982); изоэлектрофокусирование вели в борат-поли-ольной системе в диапазоне значений pH 9,5 - 4,5 и 9,5 - 7,0 (Троицкий и др.,1076) на колонке объемом 50 мл при силе тока 2 - 2,5 мА на колонку.

Гомогенность ферментных препаратов определяли диск-электрофорезом в нативной системе при pH 8,9 по [Маурер, 1971).

Для определения молекулярной массы очищенных ферментов проводили злектрофоретическое разделение в ПААГ с ДДС-Na [Fairbanks et.al., 1971) с использованием маркеров "D1APR0T" - 1.

Зависимость активности ферментов от значения pH инкубационной смеси определяли в диапазоне pH 4 - 11, для создания которого использовали 0,05 М систему аммиачно-ацетатных буферов.

Температурный оптимум действия ферментов определяли в диапазоне 25 - 60° С.

Содержание аминного азота и пептидов опре-еллли по (ГОСТ 13805-76).

Для концентрирования вируса использовали полизтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6 ООО дальтон по [Elmerich et.al., 1982). Очистку цианофага А-1 проводили в ступенчатом градиенте CsCl.

Качественный и количественный анализ свободных аминокислот проводили после предварительного осатсдения белкоЕ 10 Z- ной суль-фосалицшювой кислотой на анализаторе Biotronic LC 5001. а суммарное содержание свободных аминокислот определяли нингидринсвым методом [Ward et.al., 1982].

Для изучения специфичности активных центров протеиназ ис пользовали следующие ингибиторы в концентрации 10~3 М:- фенилметил

сульфонилфторид (Ш), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), дитиотрей-тол ГЛТТ) и парахлормеркуриСенэоат (ПХМБ).

Ллл изучения регуляции активности аспартаткиназы использовали аминокислоты, являювшеся продуктами биосинтеза этого метаболического пути: Ь-лизин, Ь-треонин, Ь-изолейцин и 1-мет;;онин в концентрации 10" 4 - 10~2 М и их эквимолярные смеси.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

.■>- «иаяофзга А-1 на некоторые стороны

белкового обмена в клетках А. уапаШэ

На рис.3.1 и 3.2 приведены данные о динамике протеолитической активности, содержании аминокислот, пептидов и аминного азота в -период 0 - 3 ч развития инфекции. Внутриклеточная ПА повышается в течении 1-го часа 1,5-2 раза, что указывает на несомненную роль протеиназ в вирусиндуцированной деструкции клеточного содержимого. Анаяопгшом образом увеличивается содержания продуктов белкового обмена.

Рис.3.1,Динамика белкового обмена в экстрактах А-1 variabilis. 1 - протеолитическая активность, нокислотныи пул, 3 - содержание пептидов

- Anabaena 2 - ами-

«к Чь

в -

300- 300 200

100 100 100

200-

0

0

1

2

3 ч,инфекции

Рис.3.2.Динамика содержания белкового обмена в экстрактах ' , A-l-Anabaena variabilis. 1 - свободные аминокислоты, 2 - пептиды, 3 - аминный азот Анализ изменения количества свободных амиьокислот в ранний период развития вирусной инфекции показал, что в системе А-1 -A.v^riafciills повышение содержания свободных аминокислот регистрируется сразу Jfte после адсорбции цианофага (0 ч инфекции), количество свободных аминокислот по сравнению с таковым нативной (N) культурц возрастает в 2 - 3 раза. В динамике развития цианофаговой инфещда в системе А-1 - A.variabilis качественный состав аминокислот в периоды, соответствующие первому (О ч инфекции) и второму (2 ч инфекции) максимумам, имеет значительные различия. Первый максимум обеспечивается преимущественно за счет повышения содержания аминокислот аспартатного семейства в 2,3-4,5 раза, алифатических аминокислот в 2,3-3,5 раза, тирозина, фенилаланина в 4,2-5,6 раза. Концентрация пролина и цистеина" резко увеличивается - 450 и 1783 Z соответственно. Дальнейшее повышение суммарного содержания . аминокислот на 2 ч инфекции обусловлено накоплением аспартата, лизина, треонина, диадонопимединовой кислоты, орнитина и ароматических аминокислот в З раза. Таким образом, уже на первом этапе исследовании были получены убедительные свидетельства важной роли процессор протеолиза, и возможно, ферментов биосинтеза аминокислот de novo да репродукции цианофага А-1.

Установлено, что нативная культура A.variabilis содержит дга фермента с протеолитической активностью. Протеиназа 1 (П!) и го*1 теиназа 2 (П2) нативной культуры обнаруживали значительные' о;.г ;

по физико-химниеск«» "?cfirrr.<v: • ■ до откошено к ингибиторам

Таблица 1

Некоторые физико-химические свойства протеиназ АлаЬаепа variaoiiis

рН- " ,.<■ !.''лле.1г>'лшрная

оптимум оптгогу?.<,°С масса, дальтсн

15330+2500 8,25 80350+5003

Таблица 2

Влияние некоторых соединений на протеолитическуп активность изоферментов нативной культуры A. variabilis, 7. к исходной

Препарат ЭДТА «МО® дтт ПХМБ

гп 215 57,7 76,9 119,2

141 ч 76.9 141,9 131,4

Таблица 3

Сравнительная характеристика эдектрофоретической подвижности (Rf) протеолитической активности препаратов нативной и инфицированной цланофагом А-1 культуры A. variabilis

иротеолитическая активность А^уе

Rf Шативная I Время развития инфекции

Iкультура I

I I 7 0 ч I I 0,5 ч 1 - 2 4

0,06-0 ¿37 I -— I — I 0,23 0,17

0,15-0,17" i — : — I 0,40 0,38

0,33-0,36 i --- i 0,45 1 0,37 0,35

0.72-0,73 10,26 (III) J --- I --- ---

0,80-0,83 I — I 0,15 I 0,36 0,30

0,90-0,93 10,30 (П2)1 0,40 I 0,08 —.

in

го

8,5

В процессе развития цианофага А-1 сразу после адсорбции (О ч инфекции) в клетках культуры бьша обнаружена дополнительный пик с протеолитической активностью. Максимальная ПА на 0,5 ч инфекции соответствовала наличию в клетках 5 ферментов, в интервале 1 - 2 ч развития вируса в клетках отсутствовали >"протеиназы. характерные для нативной культуры (табл.3).

Глава 4. Внутриклеточные протеолитические ферменты в . системе А-1 - Anabaena variabilis

В связи с тем, что дополнительный, предположительно, вирус-' детерминированный протеолитический фермент обнаруживается в клетках A.variabilis сразу после адсорбции цианофага А-1 (0 ч инфекции) , . было проведено определение протеолитической активности структурных белков цианофага А-1.

Установлено, что один из белков действительно обладает ПА, имеет значение р! в сильно щелочной области и аналогичен дополнительной внутриклеточной протеиназе. Очевидно» этот фермент играет большую роль при проникновении вируса и в наблюдаемой б клетках A.variabilis быстрой деградации клеточного содержимого.

Дальнейшее выделение и очистка 4-х вирусспецифических ферментов из препарата, соответствующего 2 ч развития инфекции (рис.2) .показало, что эти ферменты, вероятно, кодируемые фагом, существенно отличаются от протеиназ нативной культуры (табл.4) и, что наиболее, важно, по строению активного центра 3 из них относятся к редкому типу тиолсериновых протеиназ (табл.б).

. • Таблица 4

Некоторые физико-химические свойства вирусдетер-минированных протеиназ Anabaena variabilis

Препарат pi рН Молекулярная Количества

оптимум масса,дальтон субъединиц

П1 8,4 9,5 39 ООО 1

Т32 9,2 7 - 10,5 21 ООО 1

на . 7,2 .8,5 18 ООО 1

П4 ' 5,8 7,5 98 ООО 4

Таблица 5

Влияние некоторых соединении на ПА изоферментов вирусде-терминированных протеиназ A.variabilis, X к исходной

Препарат ЭДТА ОМСФ ДТТ ПХМБ

П1 116,1 г> пл »• Й

ГШ с г* л нн.о Л о 100,0

ii3 127,3 0 18,2 4,5

П4 175.0 0 0 0

Таким образом, установлено, что в клетках A. variabilis в ранний период развития цианофага А-1 функционирует 4 вирусдетерми-нированных протеиназы, одна из них является структурным белком цианофага и, вероятно, играет роль при внесении вирусной ДНК в клетку Сдитический эффект) и на первых этапах деградации клеточного содержимого (протеолиз). Присутствие 3-х других ферментов - тиолсе-риновых протеиказ - вызвано, вероятно, особенностями репродукции цианофагов, развитие которых включает этапы синтеза ранних, средних и поздных вирусных белков. Вероятно, этот факт может объяснить потребность вируса к нескольких протеиназах, осуществляющих соответственно протеолитический процессинг всех выше названных вирусных белков из полипептидного предшественника.

Глава 5. Изменения активности ключевых ферментов биосинтеза аминокислот под влиянием цианофага А-1

В связи с тем, что представленные на рис.3.1 и 3.2 данные указывали, что только за счет процессов протеодиза вирусспецифи-ческий биосинтез не может быть в достаточной мере обеспечен аминокислотами-предшественниками, было проведено изучение активности ключевых - ферментов биосинтеза аминокислот de novo в ранний период репродукции*цианофага А-1.

Ъ процессе вирусной инфекции удельная активность ГС, АДГ и АСК значительно изменяется. Для изучения возможного вирусспецифи-ческогс механизма воздействия на данные ферменты бшо проведено, их выделение и очистка.

Выделение и очистку ГС. АДГ и АСК-ферментного комплекса из

бесклеточного экстракта A.variabilis, проводили используя двухста-дийную ионообменную хроматографию на ДЗАЭ- и КМ-сефадексе А-50 с последующим изозлектрофокусированием полученных препаратов и проверкой их гомогенности методом диск-электрофореза. Было установлено, что ГС в клетках A. variabilis представлена двумя изсфермента-ми, сорбционные свойства которых в норме и при вирусной инфекции идентичны. Это свидетельствует об отсутствии в процессе развития цианофага А-1 синтеза новых вирусдетерминированных ГС. При изучении влияния значений рН среды на активность и стабильность комплексного препарата ГС цианобактерий A.variabilis было установлено, что фермент имеет высокую активность в диапазоне значений рН среды 7 - 7,5. Определение температурного оптимума ГС-реакции показало, Что фермевт относится скорее к терыостабильному типу - оптимум действия находится при 60° - 65°С. АДГ - представлена одним ферментом, физико-химические свойства которого также- не изменяются под влиянием цианофага. рН оптимум АДГ реакции - 8,5, а температурный оптимум действия 40° - 45°С. Следовательно, увеличение удельной активности этих ферментов обусловлено их относительно большим содержанием в инфицированной культуре.

Типичный зхюцйонный профиль разделения комплексного препарата на ДЗАЭ-сефадексе д-so представлен на рис.3. 3 состав комплексного препарата входят три фермента с аспартаткмназной активностью.

Рис.5.s.Типичный злюцйонный профиль разделения комплексного .препарата на ДЗАЭ-сефэдексе А-50 в 0,05 Ы трис-HCl буфере, рН 8,5. 1 - белок. Агео; 2 - ас-партаа знззавая активность, А535; 3 - градиент Нас]

Типичный злюцйонный профиль изоферментов АСК, инфицированной цианофагом А-1 культуры A.variabilis представлен на рис 4. Из инфицированной культуры A.variabilis гдаанофагом А-1 выделены 5 игс-

•««»иннтов аапартатч:'на.зн,

НаС1 ,М

? .о

:c>v;- ."/pi л : ¿vlr.'-ji! !!;:знсфагс!л Д-! на ос--]

!

•'■■'ок, лщо;

'v 4 ~ градиент ;!aCi

".'•■К"-' ::.■:••;..:•!' /'.п^р,:-: .вали pa;:v4:'>: or ■ Н-сл: /,:'•;

к-(т;-бл.6,7), а таг?.- по от::оие];;:о -

кислотам аспгртатного семейства, которые,как известно'являются ре-

a.1 i lii iчлi i J

iм;i".'i.x ч с: < ;'.

Таблица-б

Некоторые свойства очищенных аспартаткиназ A.variabilis. •

П-i'pi,! :\о;/.п.:Ci.!■:-.; j проларат ДСК-1

' У^г-льнан

рН-оитимум 8,0 и 11,0

Pi ___

¡Молек.вес

I кД __

2,74 10,0 5,0

130

7,2". 17,П и 6.17 ;

11,0 . 8 и 11 ! 8,2 8;2 и 5,3 |

150

56 и ISO 1

Таблица 7

Некоторые физико-химические свойства изоферментов аспартат-киназы инфицированной культуры Anabaena variabilis

Фракция рГ . рН R f Молекулярная

оптимум оптимум масса,дальтон

АСК-1 8.7 11,0 0,070 ' 97 ООО

АСК-2 8,2 .10,0 0,219 67 ООО

АСК-3 V.5 8.0 0,161 78 ООО

АСК-4 ~ 5.2 8.0 и 11,0 0,133 84 ООО

АСК-5 4,0 10.0 0,091 93 ООО

- Глава 6. Вирусиндуцированные изменения регуляции АСК комплекса A,variabilis

Подучены данные об отсутствии выраженного ингибирующего эффекта со стороны отдельных аминокислот на АСК-активность • бескде-точного экстракта (та5л.8).' Высокая степень подавления ферментативной активности модет быть достигнута только при одновременном внесении .в инкубационную' смесь всех аминокислот, являющихся конечными продуктами этого метаболического пути.

В процессе развития циакофага А-1, выраженный ингибиторный эффект со стороны аминокислот аспартатного семейства наблюдался только для АСК-1 (табл.8), остальные изоферменты не подавлялись ни отдельными аминокислотами, ни их смесями.

Таким образом, при изучении системы цианофаг А-1 - цианобак-терий Anabaena variabilis установлено, что одним из возможных механизмов вирусдетерминированной регуляции активности метаболических ферментов клетки-хозяина является снятие эффекта регроингиби-рования, что позволяет сохранять высокую скорость биосинтеза аминокислот de novo на фоне увеличения аминокислотного пула. Изложенный экспериментальный материал позволил установить ряд особенностей репродукции цианофага А-1 в клетках цианобактерий Anabaena variabilis, которые свидетельствуют о глубокой перестройке метабо-

•/ - ' Таблица 8 Влияние аминокислот аспартатного семейства (Ю-2) М на активность изоферментов аспартаткиназы нативной и инфицированной цианофагом А-1 культуры A.variabilis

I Остаточная активность, Z к исходной

Фракция ' I_

I Л М Т Ид Т+Ил Л+Т+М Л+Т+Ил _1 -_■ _ _______

АСК-1 I Oi ~ . -ii ;•> оо л -• » ¿1,0 55,0 40,0 38,0

ДСЗч-ii 1 4 |~ ! 00,0 80,0' 100,0 87,0 ■ 57,0 45,0

АСК-3 I 100,0 . 83,0 100,0 67,0 • 80,0 48,0 47,0

АСК-1 1 80,0 20,0 70,0- 100.0 1.10.0 100,0 128,0

АСК-2 I 88,0 95.0 95,0 96,0 105,0 94,0 106,0

АСК-3 I 87,0 93,0 89,0 84,0 91,0 104,0 100,0

АСК-4 1 101,0 98,0 93,8 100,0 116,0 112,0 115,0

АСК-5 ! I 98,0 97,0 92,5 92,5 116,0 106,0 125,0

Примечание: Л - лизин, М - метионин, Т - треонин, Ил -кзолейцин ■

лизма з ранний период инфекции, целью которой является обеспечение

пула предшественников зкрусспецифического биосинтеза и, в конечном

счете, реализации природы вирусного генома.

Выводы • '

1. Максимальная активация внутриклеточного протеолиза наблюдается через СО ;.<ин. после заражения клеток Anabaena variabilis цианофагом -А-1 и коррелирует с изменениями в них содержания амино-

■ кислот и пептидов.

2. Установлено, что нативная культура A. variabilis содержит два протеолитических фермента, различающихся по физико-химическим и каталитическим свойствам: рН оптимум - 6,5 и 0,5; Т оптимум -40 - 45°С и 35°С; р! - 8,75 и 8,25 соответственно. "

3. Впервые показано, что сразу после адсорбции цизнофага в кпчтксс< A.variabilis обнаруживается протеиназа, которая ло электрофор«-

тическим свойствам сходна со структурным белком цианофага А-1.

4. В конце раннего периода развития цианофага (2 ч инфекции) в клетке появляются еще три новые вирусспецифические протеиназы, которые отличаются от клеточных энзимов и между собой по ряду физико-химических и каталитических свойств.

5. Экспрессия вирусного генома сопровождается значительной активацией процессов биосинтеза аминокислот de novo.Усиление биосин-тетичёских' процессов осуществляется путем увеличения суммарной активности клеточных ферментов (глутаминсинтетаза, аланиндегкд-рогеназа) и появлением вирусдетерминированных изоф«рыэктов Сас-партаткинаэа).

6. Показано, что иаофермент аспартаткиназы нативкых и инфицированных цианофагом А-1 клеток Anabaena variabilis отличается по физико-химическим .и регуляторным свойствам.

7. Установлено, что в процесс;*: вирусной инфекции происходит подав-• ление механизма ингибирсвания аспартаткиназной реакции конечными продуктами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации "

1. Колтукова Н.В., Перепелиця C.I., Кадирова Г.Х. Протеол1тичн1 ' комплекси трихомних ШанобактерШ/Тез.докд. IV Укр.б1ох1м.

зъ1зду KniB, 1992. -с.27

2. Колтукова Н.В., Кадырова Г.Х., Менджул М.И.. Мурадов М.М. Влия-<H»..<|№ipiMj кыяи цианофага А-1 на процессы протеолиза в клеткз> Anateena variabilis//Микробиология, 1993. Т.62. N6.-C.1079-10S4

3. «йсенко Т.Г., Колтукова Н.В., Кадырова Г.Х., Шаинская О.А. Ас-партаткиназная активность цианобактерии Anabaena variabilis// Укр.биохим.журн.,1993. Т.65. N6.-С.61-66

4. КолтукоЕа Н.В., Лисенко Т.Г., Перепелиця С.I., Кадирова Г.Х. Вплив щанофагово! инфекц!i' на процеси пpoтeoлiзy в кл!тинах щанобактер1й//Тез.1 (VIII) зъ1зду УЫТ - Одесса, 1993.-с14.

5. Колтукова Н.В., Перепелиця С.I., Кадирова Г.Х. В1дм1нност1 в ретрорегуляцп аспартатк!назно1 '-peaR^i'У деяких вид!в Ц1ано-бактер1й//Тез. I (VIII) зъ1зду УМТ - Одесса, 19ЭЗ.-с25.

5. Колтукова Н.В., Кадырова Г.X., Лысенко Т.Г. , Менджул М.И. Ас-пзртаткиназный комплекс Anabaena variabilis в ранний период развития цианофага А-1//Укр.бохим.журн., 1994.Т.66. N2.-С.46-76

7. КолтукоЕа Н.В., Лысенко Т.Г., Менджул М.И., Перепелица С.И., Кадырова Г.Х. Динамика аминокислотного пула цианобактерий в ранний период развития цианофэговой инфекции//Микробиол.журн., 1994,Т.Ь6. N3.-С.44-50

8. Колтукова Н.В., Кадырова Г.Х., Менджул М.И., Мурадов М.М. Лро-теолитические ферменты диаяпЛя!««"»»» ,-«ir »»*« » js/ ¿махи« » . ¿¿«4. т.A). ?J2.

Г-. Кадырова Г.Х., Мурадов М.М., Халмурадов А.Г., Колтукова Н.В., Менджул М.И. Динамика аминокислотного-пула цианобактерий Anabaena variabilis в ранний период развития цианофага А-1// Микробиология, 1995, Т.64. N4. -С.00-00 (в печати)

«

УЗБЕКИСТОН ФАНЛАР АКАДЕМИЯСИ МИКРОБИОЛОГИЯ ИНСТИТУТ!! фДИРОВА ГУЛЧЕХРА XAKJMOBHA

Биология фанлари номзоди клмий даражасини олиш учун х^кмоа (ршишга тавсия зтилган

"Anabaena variabilis цианобактерияси хужайраларида аминокис-лоталар алмашинувига А-1 цианофаги ривожланиш жараёнининг таъсири" мавзуидаги диссертациянинг

ХУЛОСАЛАРИ

Дастлаб диссертацияда A. varlabllia цианобактерияси хужайра-ларида А-1 цианофагининг ривожланши жараёнидаги протеолитик фер-ментлари фаодлигининг узгариши аншу1анган. Протеолитик ферментлари нинг энг юузри фаоллиги цианобактерия хужайраларида цианофагнинг 0,5 соат тара^ёти жараенидан кейин кузатилди. Цианофагнинг ке-йинги ривожланиш даврида бу ферментнинг фаоллиги бирмунча камаядй ва цианофаг дастлабки тара^ети даврининг охирига бориб. Фермент фаоллиги пасайлб цианофаг билан таьсирланмаган цианобактерия ху-жайрадаридаги (Я1ни бирламчи культура) даражасига к^йтади.

Цианофагнинг О- соат (20 мин сунги - адсорбция ва^ти) ва 2 соат ривожланиш жароёнида аминокислоталар таркибий к^сми энг куп мшуюрнй ташкид »^оди. Сифати жи^атидан ^ам бирламчи культура аминокислоталар таркибидан фар^яанади.

A, v&riabllls бирламчи культурасига физик-кимъевий хоссалари • жи^атидан бир-биридан тубдан фарц калган иккита протеиназа фермен-ти борлиги анш^анди.

Цианофаг А-1 нинг ст^сил таркйби фаоллигини урганиш натижаси-да унинг казеин моддасини парчалаш хусусияти борлш'и, яъни протео- . литик фаолликка зга эканлиги- маълум булди.

Цианобактерияда цианофаг А-1 ривожланиш жараёни 2 соат давом зтгандан кейин эса 4-та протеолитик фермент ажратиб олинди ьа то-заланди. Бу ферментлар з^тимол цианофаг ривожланиш жараёнида хосил булган булиб, бирламчи культура фотеиназаларидан фар^ «уьпади ва энг мухдми бу ферментларнинг 3-таси узининг фаоллик марказининг тузилиш б^йича тиолсеринли протеиназадар типига киришидир.

Булардан таяи^ари, яна цианофаг А-1 нинг ривожланиш жараекилгч цианобактерияда глутачинсинтетаза, аланиндегидрогеназа ва .'лак

таткиназа (АСК) ферментлари фаоллигннинг оиганлиги анк^уланди.

A. variabilis бирламчи культурасида АСК бирикмаси 3-та фер-ст.:.'» исспат 6улиб, щшсфаг таран^иети жараёнида зса 5-та фермент хоскл буладк. Бу каоферментлар маълум pH даги фаоллиги, р! 'Ч-л^пои ьа лунингдек аспартат оиласига кирувчи аминокислотааарга a^í-xaión муносабати билан бир-биридан фар^ланмви урганилди. A. va. ас г.»:рламчи культураси изоферментлари: АСК-1 - Им, АСК-2 -" .v.::-;-."; xa ыодда алмашинишида хосил булган, эхтимол кандай-днр еразик; модда таъсирила г4.-^-::г:: о "'"""ir А 1 --.c,<i аспартат оиласидаги

• •.««»(.г.ислстаяар таъсиридан факуэт АСК-1 ферменти фаоллигини йукрл-гакляги кузатилди, бош^а изоферментдяр зса айрим аминокислоталар б план хал ва уларнинг бирлашмалари тяьсарк :'«ан хам узгармади.

!лц/ндай Куииб, А-1 цианофаги - АлаЬаепа variabilis цианобак-терияси системасини урганишда куйидагилар анин^анди: вирусдетер-минланган Ферментларнинг фаоллигини тартибга солиш механизмларидан бкри ретрозгцарланиш зффектини олиб ташлаш булиб, бу зса уз навба-av'/'.:",л-г:с,-ар таркибининг усишида de novo аминокислоталар и.. гик" ининг > я\-.ри т(-алигини cajviaß колади.

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, UZBEKISTAN ACADEMY OF SCIENCE: TASHKENT

KADIROVA GYLCHEKHRA HAKIMOVNA

Influence of cyanophage A-l reproduction on metabolism of ami-

noacids in cell of cyanobacteria Anabaena variabilis

SUMMARY

From experimental date it follows that, maximum proteolytic activity was observed on 0,5 h infection. Further, in the process of development of cyanophage A-l, proteolytic preparation activity decreased, and in the late of early infection period it practically returhed to the starting level.

Maximum concentration of aminoacid pool was marktd on 0 h (after 20 min - time of adsorbtion ) infection and on 2 h infection. Qualltlve composition of amlnoacids, corresponding to there periods have significant differences.

By studying of process conditions of proteolysis in native culture of A.variabilis, it is established, that native preparation contains - 2 proteinase, which essentially differ on physical and chemical properties. ..

By studying of proteolytic activity of désintégrant of structural cyanophage proteins A-l it is established, that it have ability to hydrolise casein.

Subseqlent extraction and purification of 4 virusspecific proteolytic en2ymes of suitable 2 h infection development showed, that there enzymes, probably, encoded by phage, essentially differ from proteinase of native culture, and that the most important., on the structure of active centre - 3 from them are related to the rare type .of thlolserine proteinases.

It is also established, that under the influence of cyanophage infection,the rising of activity of glytaminsynthetase, alaai-riedehydrogenase and aspartate-kinase (ASK) of cyanobacteria take place.

ASK complex in native cells of A.variabilis is represented by

3 enzymes, and at the period of cyanophage development - by 5. Given isoenzymes detected differences on pH-optimum effect, by mean of pi, and also as regards aninoacids of aspartate family. So, isoenzymes of native /».variabilis were regylated by ASK-1 - Hey, AfK-r - M';t, A3K-3- propably.by not more than intermidiate metabolite. In the process of development of cyanophage A-l, expressed inhibitory effect on the ASK-1 side of aminoacid aspartate family was observed only for ASK-1, the other isoenzymes were not .«»r^ ro;rrr. tv ne^hier separate aminoasids, no bv <n\:z,

" ¡iiying of the system of ^/c^«*»«^ A-« - cv^iomcteria A.variabilis, if -oi-^'isl.cu. t^l one from possible enzymes of i«-*~tr.;l.-sicn of retroinhibition effect, that allows to .-..-crve nigh rate of aminoacid biosynthesis de novo on the back-:rcur,d cf aminoacid pool increasing.