Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ ИЗ ЦИАНОБАКТЕРИИ В НОРМЕ И ПРИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ ИЗ ЦИАНОБАКТЕРИИ В НОРМЕ И ПРИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ"

А~2>от

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУИБЫ НАРОДОВ ' АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ОСР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЮЩ ИНСТИТУТ ШКРОБИОЛОПИ И ВИР/СОЛОГИИ им, Д.К. забожгйюго

На правах рукописи

МЕЯЬНЖ Анатолий Иванович

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА САЙТ-СПЩШГШЖИХ ЭНДОНУКЛЕАЭ РИСТРЙЩИИ КЗ ЦИАНОБАКТЕРИИ В Н0Р1К И ПРИ ВИРУСНОЙ И№ЭСЦ№

03. Об. 06 - вирусология

•Автореферат

диссертации на соискание ученой отапени кандидата биологических наук

Киев - 1991,

Работа выполнена в отделе вирусов водорослей ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии ивиру оологии им. Д. К. Заболодного

АН УХР . ' '

* ' - . -

Научные руководители: доктор биологических наук

Н.И. ШДКУЛ

\ ' ' " ' кандидат биологических наук

Б. А. РЕБЕНГИВ

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор Я.Г. КШКО .

, ' " доктор дологических наук, ' . профессор Ю.К.1 ФОМИЧЕВ

Ведущая организация: - Институт эпидемиология и

^ ■ микробиологии им.нГФ-Памалеи

' ■ • АМН СССР

Защита состоится "/ft" t3 tcf I99I г. в ->_ZO_- часов

на заседании специализированного совета Д 016.06.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии им. Д,К. Забо-лотного АН УССР по'адресу: 2 52627,Киев-143,ул.Забол отноги154.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Института ми!фобиологии и вирусологии им. Д-К.Заболотного АН УССР

Автореферат разослан " ^ " ¿в^с/Х^С 1991 г.

Ученый секретарь

•специализированного совета

... - /

кандидат биологических наук ч, "" Э.А. Коваленко

ОЩАЯ ХАРАКТЕРЙСГЖА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из центральных проблем современной вирусологии является познание молекулярных механизмов взаимодействия вируса с клеткой. Несмотря на то, что фаги Т-серии стали ключевыми моделями, сыгравшими исключительно важную роль в решении таких вопросов; как репликация, транскрипция и трансляция вирусных нуклеиновых кислот, тем не менее молекулярные механизмы фагоспецифкческой деградации клеточного генома и вирусепецкфичес-кме механизм« защиты вирусной ДНК до с их шр остаются невыясненным

Цнанофогн, как модельные систен*, уникальны в своем роде» К изучению этой специфической группы фагов исследователей привлекают следующие два наиболее значимых аспекта.

1. Выявленные в настоящее время цианофаги поражают одноклеточные, нитчатые и гетероцистные формы цианобактерий, принадлежащие к различным таксонам. В этом отношении экспериментальные системы цианобактерия-цианофаг являются чрезвычайно удобной моделью для исследования вопросов вирусного паразитизма в различны* таксонах ериной группы фотосинтезирующих микроорганизмов. Прокариот-ное строение клеток цианобактерий и аволюционно сложившаяся способность к фототрофному росту делает их практически идеальной моделью для молекулярко-бнологических исследований.

Продолжительность литического цикла развития цианофагов в клетках цианобактерий в несколько раз превышает таковой у бактериофагов, являющихся традиционными объектами в молекулярной биологии, Этот феномен во итогом облегчает исследование молекулярных механизмов взаимодействия вирусного и клеточного геномов. Раскрытие механизмов, лежащих в основе регуляции временной реализации генетической информации цианофагов по сравнению с другими фагами, по-видимо»^, может привести к новым концепциям в бактериофагии, в частности, и вирусологии вообще,

2. Цианобактерии являются богатыми источниками рестрйктаз. Однако проблема поиска новых ферментов не потеряла своей актуальности. Это объясняется, во-первых, необходимостью расширения арсенала ферментов с уникальной специфичностью и, во-вторых, поиском новых продуцентов рестрйктаз о уже известной сайтовой специфичностью. Кроме того, одним из важных звеньев взаимодействия между

геномами фага и клетки хозяина при литической инфекции является вирусспецифическая деградация бактериального генетического аппарата хозяина. Несмотря на очевидную актуальность, вопрос о селективной деградации клеточного генома специфическими фаговыми нуклеаэами остается малоисследованным, а имеющееся на сегодняшний день понимание энэиматичееких механизмов этого процесса ограничивается результатами экспериментов в системе фаг Т4-клетки В. coli (Kutter, Wlberg. I960).

Отсутствие фундаментальных сравнительных исследований процессов репродукции цианофагов в клетках различного эволюционного усложнения) а также крайне ограниченная информация о молекулярных механизмах воздействия вирусной инфекции на геном клетки вызвали настоятельную необходимость проведения настоящих исследований.

Цель и задачи работц. Целью напей работы было изучение некоторых аспектов вэаимодействия вирулентного цианофага ц-г о клетками гетероцнстной нитчатой цианобактерви Nontoc linckia, шт. Bleak За7/7. При этом основное внимание было уделено изучение клеточных И вирусиндуцированных ферментов рестрикции и внзнмати-чее кого гидролиза ДНК хозяина в процессе инфекции.

Исходя ю вьшеиэложекного в задачу наших исследований входию,

1. Провести скрининг рестриктазной активности в клетках циа-нобактерий ¿.variabilis, H.linckla, Р.Ьо^апшп, £.c«4roium.

2. Разработать схецу очистки и изучить каталитические й некоторые физико-химические свойства эндсмуклеаэ рестрикции цианобактерии Hoetoc Unckla,

3. Определить сайты узнавания и точку разрезания очищенных ферментов рестрикции.

4. Изучить динамику ферментативной деградации цианоба«термального генома в процессе инфекции в четырех вирус-клеточных' система*.

5. Осуществить поиск эндонуклеаэ рестрикции в инфицированных клетках цианобактерий.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение влияния вирусной инфекции на геном цианобактерий:

- изучена вирусиндуцированная активация нуклеазной активности в четырех вирус-клеточных системах;

- впервые разработана высокоэффективная схема очистки

_ з -

энвонуклеаз рестрикции nil -387/7 I« НИ 307/7 И» позволившая очистить их в 400 раз и получить чистые ферментные препараты. Установлены сайты узнавания, а для фермента Uli ¿67/7 I - точка разрезания. Показано, что Uli 5W/7 i является «оиныы изошиэомаром рестриктаэы Ava I;.

- впервые показано участие в реградации клеточного генома цианобактерии во et о о ltacfcla неспецифическюс нуклеаэ вирусного происхождения.

Практическая ценность работы. Разработанный метод получения высокоочищеннык рестриктаз рекомендуется для выделения ферментов кз цианобактерии Host о с Илек i а. Реетриктаэы N11 337/7 I к Uli 3S7/7 И успешно используются в исследовательских работах в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР, Институте биоорганической химии и нефтехимии Ali УССР и Институте микробиологи« и вирусологии АН УССР.

Полученные в диссертационной работе данные о взаимодействии цианофагов с клетками цианобактерий, а также информация об участии неспецифической вирусной активности в деградации клеточного цианобактериального генома расширяют современные представления об особенностях репродукции бактериальных вирусов.

Апробации работу- Материалы диссертации докладывались на I Всесоюзной конференции "Актуальные пройде»« современной альгологии" (Черкассы, 1387), [0 Международном микробиологическом конгрессе ( azeged, 1987), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990),

Публикация результатов исследований. Основные положения дио-. оертации отражены в б опубликованных работах.

Структура и объем рабоуыт Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы 2,3 и 4), обсуждения, выводов и списка использованной литературы (128 источников из них 28 отечественны* и 100 зарубежных). Работа изложена на 140 страницах машинописного текста иллюстрирована 3 таблицами и 16 рисунками.

■ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекту исследования. В качестве объектов исследований были использованы цианобактерии: Syne choco с cus cedro rum итТРС бдоа (Франция, Пастеровский институт), полученный из коллекции МГУ; АпаЪаепа variabilis шт. Myers С ALU 45а (США, Техасский уни-

вере ит ет), Pie ct one am Ъогуашип ШТ. С ALU 465 (США, Инрианс-кий университет), Moatoo llnckia шт. Elenk 3Ö7/7, полученную иэ коллекции Института микробиологии и вирусологии АН УССР,

В работе использовали цианофаги: S-ük, лизирующий цианобак-тери» Б. cedrorumi A-I и А-2, .визирующие цианобактерию A.variabilis t H-г, лизирующий н.llnckia и LPP-5, лизирующий p.boryanum, полученные из отдела вирусов водорослей Института микробиологии и вирусологии АН УССР.

Методы исследований. Условия выращивания культур цианобакте-рий, инфицирования и инкубации инфицированных клеток проводили по ранее описанным метопам ( Btanier, 1975; Ыендлул, 1989). Разрушение цианобактериальных клеток осуществляли с помощь» ультразвукового дезинтегратора УЗДО-ЙТ при мощности 44 кГц дробно по 30 сек в течение 10 мин с I-минутным интервалом. Образцы охлаждали на ледяной бане.

Испытание бесклеточных экстрактов на наличие ендонуклеазкой активности проводили по методу { Schleif, 1900.).

Суммарную ДЖ-азную активность в бесклеточных экстрактах циа-кобактерий определяли при помощи радиометрического метода (Панкина, 1975t Geidusctieic, 1965).

Оценку качества выделенных ферментов проводили по эффективности актирования ДЦС фрагментов и последующего специфического фрар-ментировання актированных молекул.

Дяя выделения ДНК использовали метод слабощелочной фекольной дегтротеинизации С Olereг, 1965).

Для определения молекулярной массы рестриктаз бил использован денатурирующий электрофорез ь полиакриламидном геле в присутствии sus ( Laenli, 1970).

С цель» определения сайтов узнавания проводили сравнительный анализ электрофоретическоИ подвижности фрагментов ДНК фага Л , полученных после обработки рестриктазами Hlí За?/? I и МП 3Ö7/71I, а также коммерческими ферментами Ava I И Ava II.

Установление точки разрезания в сайте уэнвания ДШ проводили согласно метода полимеразного копирования по Сенгеру ( Senge г, 1980),

Выделение и очистку рестриктаз проводили при помощи различных сорбентов: фосфоцеллвлозы P-II, на колонке "Mono Q" хромато-графической системы »Le, а также гепарин-сефароэы 4И, Для

выделения неспецифической вирусной активности бесклеточные экстракты цианобактерии H.llnckia, зараженные цианофагом N-2, очищали при помощи хроматографии на колонке с голубой сефарозой СЬ-бВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика эндонукдеаз рестрикции из цианобактерии Hostос llnckla. Для обнаружения наличия рестриктаэной активности в клетках цианобактерии H.llnckia, A.vaxiabilie, F. boiyanutm, 6. cedro гид был проверен скрининг экронуклеаэ-ной активности в бееклеточных экстрактах изучаемых штаммов. При обработке ДНК фага А происходила ее специфическая фрагментация. Однако полученные фрагменты выявлялись недостаточно четко на фоне сопутствующих (»специфических нуклеазных активностей.

Этим методом было установлено, что штаммы A. variabilis, If, llnckla, S* cedro rum облагали рестриктаэной активностью. Однако в штамме Р» Ъохуапиш не было обнаружено сайт-специфической активности.

С целью получения очищенных высокоактивных ферментов вш разработан простой и эффективный способ их выделения (рис.I). Аанализ профиля элюции при разделении бесклеточного экстракта на фосфоцеллюлозе P-II в градиенте NaCl показал, что эндонуклеаз-ная активность проявляется во фракциях, элпирущихся при 0,3В-0,65 M IfaCl шгя первого фермента и 0,7-0,62 M MaCl для другого фермента. Фракции, содержащие болыцую часть элюированных с колонки ферментов, объединяли, диалнзовалн против буфера Б {без ttaCl) и для дальнейшей очистки наносили их на колонку "Mono q" хроматаграфической системы PTLC. Эндонуклеазну» активность ферментов обнаруживали в элюате с концентрацией HaCl, равной О, II-0,2 M для первой активности и 0,08-0,23 M для другой активности. Для выявления примесей нуклеазных активностей фракции очищенных рестриктаз инкубировали с ДНК фага \ с 1857 в течение 24 ч при 437 °С. Результаты показали, что фракции содержали неспецифическую активность, которая в значительной мере затрудняла определение субстратной специфичности исследуемых рестриктаз. Поэтому в дальнейшем ферменты подвергали дополнительной очистке на колонке о геаркн-сефарозой АВ, Вымывание активных фракций с колонки наблюдали при концентрации HaCl0,25-0,38 M для первого фермента и

Клетки + лиэоцим Ультразвук 105 ООО б ÍI «) 4осфо целлюлоз a P-II

Солевой градиент элюции 0,1-1 И Bad в буфере

Хроматографическая система FPLC, колонка "Mono q"

Солевой градиент элюции 0-0,5 М líaCl е буфере

Гепарин - сефарода 4В

Солевой градиент элоции 0,1-0,8 М НаС1 в буфере

Концентрирующий диализ

Рис. I. Схема выделения рестриктаа из цианобактерии Ио^оо 11пск1а шт. ШеШс 587/7

0,38-0,6 М ИаС1 зля другого. Использование вышеописанной схемы очистки ферментов из экстрактов клеток Ноб1;ос 11пск1в, включающая три хроматографические стадии, позволило получить препарат Н11 3&7/7 X. очищенный в 400 раз.

Оценку чистоты выделенных препаратов проводили по эффективности лигирования ДШ фрагментов и последующего специфического фрагментирования продуктов лигирования. В результате фрагменты.

полученные после повторной рестрикции, полностью совпадали с фрагментами при первичной рестрикции. Выделенные две рестриктаэы узнавали различные сайты на ДШ фага А. Поэтому в соответствии с современной классификацией эндонуклеаз рестрикции они были названы как N11 387/7 I и Hli 367/7 II.

Изучение потребности реетриктаз в кофакторах для проявления специфической активности показало, что они зависят от ионов и не требуют присутствия в инкубационном буфере s-аденоэнл-ме-тионина и АТФ. Молекулярная масса реетриктаз составляла для N11 387/7 X 67500+1500 Д, а для рестриктаэы Н11 У>7/7 II 65500+1500 Д.

При определении сайтов узнавания исследуемых реетриктаз был проведен сравнительный анализ электрофоретической подвижности фрагментов ДНК фага \ , полученных после их обработки рестрикта-зами МП 387/7 I и NU 307/7 и» а также коммерческими ферментами ¿va i и Ava Ii. В результате была установлена полная идентичность между фрагментами ДНК фага К , обработанной N111 и Ava I , а также N11 II и Avaп.Полученные данные указывают на то, что эти пары реетриктаз имеют сходные сайты узнавания и, следовательно, мы предположили, что они являются изошизомерами реетриктаз ¿va i и Ava Ii.Однако,определяя точку разрезания для рестриктаэы НИ 387/7 I, было показано, что точка расщепления этим ферментом находится между 5 и б нуклаотидными остатками оестичленного полиндрома (схемы I и 2), тогда как точка расщепления для рестриктаэы Ava I находится между I И 2 нуклеотидныш остаткам того же полиндрома ( Roberts. 1985).

Окема I

Схема г

5* -C-ÍC/T>-C-G-(O/A)ÍG-3'

5 -C-CT/C)-G-G-(G/A>-C-J з' _G_(G/А ) -G-C—С С /Г 5'

J

точка разрезания в сайте N11 367/7 I

точка разрезания в сайте

Ava I

Таким образом, рестриктаза N11 387/7 I является ложным morn из омаром рестриктаэы Ava I.

Изменение суммарной нуЕлеазноИ активности в системе циансфаг - цианобактерий в процессе вирусной инфекции. Приведенные выше данные показывает, что штаммы Boston linckia обладают выраженной .системой рестрикции, которая должна защитить циано-бактериальнуи клетку от проникновения чужеродного генетического материала. Однако способность цианофагов вызывать литическую инфекцию свидетельствует о наличии у них механизма преодоления клеточной рестрикции, а также собственных механизмов защиты своей ДШ. Поскольку в первой половине литического цикла цианофагов, т.е. в предрепликативной стадии их развития, происходит медленная экспрессия вирионной ДЕК (Менджул с соавт., 1985), важно было выяснить, какие вирусиндуцированные процессы предшествуют репликации вирусной ДНК.

Для выявления причин деградации клеточного генома, были проведена эксперименты по изучению изменения суммарной нуклеаэной активности в динамике вирусной инфекции в различных системах цианофаг - циаяобактеркя.

В результате проведенных исследований было показано, что в процессе репродукции цианофагов в индуцированных клетках цианобактерий резкое повышение нуклеазной активности, как правило, предшествует началу синтеза вирионных ДЖ (рис. 2). Так на втором часе инфекции во всех испытанных вирус-клеточнщ системах реЗко увеличивается суммарная нуклеаэная активность. В дальнейшем, в зависимости от репродуктивного цикла цианофагов, она либо остается на том же уровне ( H.liackia - Я-2 ), либо понижается. При этом, как показали опыты, нуклеаэная активность бесклеточных экстрактов каждой из испытанных систем была строго специфична. Саьый высокий прирост гидролиза ДНК, выделенных из исследуемых цианобактерий, наблюдался при-добавлении бесклеточного экстракта, полученного из аналогичной цианобактерия, инфицированной гомологичным цианофагом. В противном случае, инфицированные вирусной инфекцией эндонуклеаэы должны были бы гидролиз о вать не только собственную ДНК, но И ДНК, выделенные из других штаммов цианобактерий (рис. 3).

Для выяснения вопроса какие ферменты и каким образом они осуществляют деградации цианобактерийльного генома бесклеточные экстракты инфицированных клеток К. llnckia. подвергали очистке на колонке с голубой сефарозой CL-6B. Так как литический цикл циано-фага Н—2 длится V ч, на самых ранних этапах инфекции пробы

•Г" Рис. 2. Изменение суммарной нуклеаэной активности

в динамике инфекции в система* вирус-клетка; А.уаг1аЬ1-11э - д-1( з.сеапэпип - В-Ше( Н.11аЫс1а - М-2( Р.Ъогуа-пил - ЬРР-3

1.

Рис. 3. Гистограмм! специфичности нукяеазной активности бееклеточных экстрактов инфицированных культур цванобактерий: А.уаг1аЫ11в - А-1» N. ПпсМа - М-2) Р.Ьогуадша - ЫТ-3, I - ДНК Из цнвнобахтерии А.уаг1аЪ111в| 2 - ДНК из цианобакте-рии н.11лек1а( 3 - ДНК из цианобактерии Р.Ъогуапшп

отбирали с интервалом 15 мин, а после часовой инфекции с интервалом I ч. Поиск фагоспецифическоЯ нуклеаэной активности осуществляли по следующей схеме: клетки штамма Hostoo lLnctcla Elenk S87/7 инфицировали цианофагом Ы-2 с множественностью 10-15; для выделения вирусной нуклеаэной активности клетки цианобакте-рии fí. linckla разрушали при помощи УЗДИ-2Т, центрифугировали при 105 ООО е.Пробы бесклеточных экстрактов N.liackta, инфицированные цианофагом К-2 на разных временных интервалах после заражения, наносили на колонку с голубой сефарозой CL-6B и элюироеа-ли линейным градиентом 0-0,5 M HttCi в буфере А. Наличие фагоспе-цифической нуклеаэной активности проверяли по гидролизу ДШ фага А с 1857.

Как видно из приведенной электрофореграммы (рис. 4), сайт-специфическая активность проявляется в первой пробе (через 15 мин после заражения). Неспецифическая активность появляется через 2 ч инфекции, через Э ч - она уменьшается, а начиная с четырех часов инфекции неспецифическая активность вновь увеличивается и продолжает проявляться до конца латентного периода развития цианофага N-2, Эти результаты опытов подтверждают данные, полученные ранее по динамике суммарной нуклеаэной активности (рис. 2),

Особый интерес представляет проверка нуклеаэной активности очищенных бесклеточных экстрактов (голубая сефароэа CL-6B ) в гомологичной системе - на Д№{, выделенной из цианобактерии N. lineóla, так как ранее нами бшо установлена строгая специфичность неочищенных бесклеточных экстрактов (рис. 3). С этой целью был исследован характер воздействия частично очищенных бесклеточных экстрактов H.llnckla« инфицированных цианофагом Н~2 , полученных на разных временных интервалах после заражения! на ДНК цианобактерии H.linctia, В результате установлено, что Вирусспецифическая нуклеазная активность, как и в предыдущем эксперименте резко увеличивается с 2 часов инфекции, через 3 ч наблюдается ее уменьшение, а с 4 часов активность вновь увеличивается.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ДНК цианобактерии N.llnckia гидролизуется ферментами, полученными в динамике вирусной инфекции начиная с двух часов репродукции цианофага Н-2. При деградации клеточной ДНК не обнаружены дискретные фрагменты, что свидетельствует о неспецифической активности этих

123456769 10 К

Рис. 4. Электрофореграмиа анализа специфической

и неспецифической эндонуклеазной активности бесклеточных экстрактов клеток Н*11пс1с1а, зараженных цианофагом Н-2 (фракции с колонки голубой сефарозы). Инкубация с ДШ фага \ на различных Промежутках времени после заражения. Время инкубации 45 мин: 1-15 мин (инфекции), 2-30 мин, 3-45 мин, 4 -60 мин, 5-2 часа, 6-3 часа, 7-4 часа, 8-5 часов, 9-6 часов, 10-7 часов, К - контроль

ферментов. Необходимо отметить, что процесс гидролиза происходит скачкообразно, что в принципе согласуется с данными по динамике проявления суммарной ДИ(-азной активности в инфицированных клетках цианобактерия N. 11пск1а. Максимум* активности наблюдаются на 2, 4, 5 часах вирусной инфекции, на 3,6,7 часах активность ферментов снижается. Причина такого характера активностей эндонуклеаэ пока не ясна. В результате проведенных нами экспериментов было обнаружено появление неспецифической эндонуклеаэной активности, связанной с вирусной юфекцией, которая участвует в деградации клеточного генома. Однако этот факт не является окончательным докаэа-

твльством отсутствия в инфицированных клетках вирусспецифической эндонуклеаэы рестрикции, которая может рестрицировать геном клетки в крайне ограниченном количестве сайтов.

Таким образом, в результате проведенных исследований выделены и очищены из штамма Host о о linckla Elenlc 387/7 две рестрик-тазы НИ ЗВ7/7ХИ ИИ 3»7/711, изучены их потребности в кофакторах. определены сайты узнавания, а также точка расцепления для рестриктазы Rli 367/7 I. Показано, что рестриктаэа НИ 3S7/7 I является ложным изошиэомером Ava I.Установлено, что в деградации клеточного генома участвует неспецифическая вирусная нуклеазная активность.

вывода

1. В результате скрининга на наличие рестриктаэной активности у цианобактерий в норме и при вирусной инфекции обнаружены штамьы, обладающие рестриктаэной активностью. -

2. Разработана схема выведения рестриктаз МИ 337/7 I и НИ 387/7 и, обеспечивающая высокий выход очищенных ферментов, что позволяет использовать цианобактерию Hoetoo Undid«. тт.

El«пк 387/7 в качестве удобного продуцента для внедрения в производство и лабораторную практику.

3. Выделены и очищены две рестриктазы ЛИ 367/7 I и N11 387/7 II. Определен ряд их характеристик: молекулярная масса, потребности в кофакторах, узнаваемая последовательность нуклеоти-дов, а также точка разрезания. Полученные данные позволяют утверждать, что ИИ 337/7 I является ложным юошизомером рестриктазы Ava Х.аИИ 367/7 II - иэоиизомером Ата II.

4. Установлено, что в процессе вирусной инфекции в 4 испытанных вирус-клеточных системах суммарная нуклеазная активность увеличивается в 40-500 раз. Активация нуялеазной активности предшествует началу репликации вирионных ДНК,

5. Показано, что нуклеазная активность строго специфична

к гидролитическое расщепиенио генома клеток цианобактерий, зараженных гомологичными циансфагами.

. . ' ■ ■ - 13-

ч • • •

6. Установлено, что в клетках Но atoo linckia зараженных цианофагом Н-2, присутствует неспецифическая активность,'которая связана с вирусной инфекцией и участвует в деградации'клеточного генома.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ 'ДИССЕРТАЦИИ

1

1. Мельник А,И., Менджул М.И. Влияние вирусной инфекции на актив, .,ность ДНК-аз в клетках цианобактерий// Тез. докл. I Всесоюз.

конф. " Актуальные проблемы современной альгологии", -Черкассы, 1987, - С. 49. - ■ ' ■

2. Менржул М.И,, Нестерова Н.В., Лысенко Т.Г., Мельник А. И, 1 , Стратегия функционирования генома цианофагов в клетках циано-бактеркй // Тез. докл. I Всесоюз. конф. "Актуальные проблемы альгологии",- Черкассы, 1987. - С. 50.

3. Henilzui Ы.1., Weaterova H.V., Lyaenko Т.О., Kalirtichenko T,S,, Melailc A.I., Gerachejjko I.V. The pecularitiea ot functioning cyanophaga genome In cyaaobacterla cells // 20t)i flongr. of the Hungarien Society of Ulcrobiology, Saeged, - 1997. -

P. 112.

4.' Мельник А.И., Менгогул М.И. Цианобактерии - продуценты сайт-специфических эндонуклеаэ рестрикции )} Тез, докл. Всесоюз. конф. "Метода получения, анализа и применения ' ферментов".-Юрмала, 1990, - С, 42.

5. Мельник А.И/, Менджул М.И,, Ребентищ Б.А., Болотин А. В. Две сайт-специфические эндонуклеаэы рестрикции цианобактерии Hostoo llnckia / Микробиол. журн..-. 1991. - Т.53, V 2. -С, 23—29,. ' у

6. Нестерова Н.В. Калиниченко Т.С., Сырчин С.А., Мельник А.И. Процесс деградации генома'цианобактерий при репродукции цианофагов A-II, В -вк, РР-3 и A-I // Микробиол. журн. - 1991. - ' Т. 53, » 3. - С. ЭО-33.

■ ' ' í Л ' ' ■

Пилписано в печвть 6.09.91 г. формат 6QÍ84 / 16 Бумага писчая . Тел.пвч.л. 1.0, Тирах 100 акз. Э»к

Отпечатано Ц70П К® "Плохиацпровкт" г.Ки ксаг< ,1

t

'Ч

/