Влияние раздельного и сочетанного воздействия ионизирующей радиации и ионов свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных

Григорьев, Михаил Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние раздельного и сочетанного воздействия ионизирующей радиации и ионов свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние раздельного и сочетанного воздействия ионизирующей радиации и ионов свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных"

На права* рукописи

ГРИГОРЬЕВ Михаил Валерьевич

ВЛИЯНИЕ РАЗДОЛЬНОГО И СОЧЕТАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ИОНОВ СВИНЦА НА УРОВЕНЬ ДНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК В КЛЕТКАХ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ

03.00.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре радиобиологии, рентгенологии и ГО ФГОУ ВПО' «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» и лаборатории биоиндикации экологических техногенных аномалий МосНПО «Радон».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Пак В.В.

Научный консультант:

доктор биологических наук Сыпин В.Д.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,профессор Котов Н.Н.,

доктор биологических наук, профессор СургучеваЛ.М.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская

академия ветеринарной медицины»

Защита состоится 10* марта 2004 г. в 14 30 часов на заседании Диссертационного совета Д220.042.04 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «_» февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.Д. Фомина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Стремительные темпы научно-технического прогресса сопряжены с активным загрязнением среды обитания, как человека, так и животных, в частности, радионуклидами и тяжелыми металлами. Это определяет необходимость всестороннего мониторинга и оценки воздействия техногенных факторов радиационной и химической природы.

Важнейшим объектом при лучевых воздействиях на живую клетку является молекула ДНК и геном в целом. Именно изменения в геноме ответственны за отдаленные последствия воздействия как для непосредственно облученного организма, так и для потомства. Поэтому эффективная регистрация изменений на уровне ДНК могла бы дать своевременную информацию о возможных последствиях и принятии необходимых профилактических мер.

При воздействии на клетку ряда внешних физических и химических агентов может происходить преобразование лабильных связей ДНК-белок нормально функционирующего хроматина в крайне прочные связи, получившие название "ДНК-белковых сшивок" (ДБС) (Fornance A.J. et al., 1977, Oleinick N.L. et al., 1987). Одним из наиболее значимых свойств ДНК-белковых сшивок для оценки их биологического значения является низкая скорость репарации этого типа повреждений. Наиболее медленно репарация ДБС происходит в неактивных областях хроматина; в метафазных клетках ДБС практически не репарируются (Chiu S.M. et al., 1986). Эти сведения дают основания предполагать накопление таких повреждений ДНК в клетках. Способность ДБС препятствовать нормальной транскрипции, репликации ДНК может определять участие ДБС в дестабилизации генома и являться причиной отдаленных последствий лучевого (или химического) воздействия (мутагенез, канцерогенез, гибель клеток по некротическому или апоптическому механизмам) (К.П. Хансон, В.Е.Комар, 1985, Ауербах Ш., 1978; Hart R.W. et al., 1978).

Таким образом, изучение влияния ионизирующей радиации и тяжелых металлов на образование медленно репарируемых повреждений ДНК - ДНК-белковых сшивок — в клетках животных позволит найти новые подходы к оценке тяжести радиационно-химического поражения, а также прогнозу отдаленных последствий таких воздействий (снижение иммунного статуса, канцерогенеза, преждевременной смертности и др.)

Цель и задачи исследований: Целью данной работы являлось изучение закономерностей образования ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных при раздельном и сочетанном воздействии на организм ионизирующего излучения и ионов свинца.

Исходя из этого, были определены конкретные задачи:

1. Провести сравнительное изучение ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различных органов после острого общего облучения животных в разных дозах.

2. Изучить уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов и лейкоцитах крови после фракционированного облучения животных с разной интенсивностью.

3. Изучить влияние хронического воздействия ионов свинца в разных концентрациях на образования ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов и лейкоцитах крови животных.

4. Изучить влияние комбинированного воздействия ионов свинца и хронического гамма-облучения в малых дозах на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов животных.

Научная новизна работы

Впервые проведены сравнительные исследования уровней ДНК-бедковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различных органов крыс при однократном облучении в разных дозах, установлены закономерности их образования в зависимости от вида клеток.

Изучен характер и количественные изменения ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов животных при раздельном и сочетанном воздействии у-облучения в малых дозах и ионов свинца. Установлено, что комбинированное воздействие облучения в малых дозах и ионов свинца снижает уровень ДНК-белковых сшивок, по сравнению с раздельным воздействием любого из двух факторов.

Впервые получены данные о динамике изменения клеточности тимуса и селезенки при хроническом облучении животных в малых дозах, хроническом воздействии ионов свинца и их комбинированном воздействии.

Научно-практическое значение полученных результатов.

1. В широком диапазоне доз (от малых до абсолютно летальных) показано, что повышение уровня ДНК-белковых сшивок является универсальной реакцией клеток различного типа на воздействие ионизирующего излучения и ионов свинца.

2. Полученные данные свидетельствуют, что на фоне отсутствия ярких изменений со стороны картины крови при лучевых воздействиях малых и средних интенсивностей в клетках разных органов (тканей) происходит запуск процессов, приводящих к изменениям на молекулярном уровне (образование ДНК-белковых сшивок), способных, по-видимому, приводить к реализации отдаленных последствий радиационного (химического) воздействия.

3. Результаты сочетанного воздействия ионизирующего излучения и свинца позволяют предположить реализацию запуска дополнительных защитных механизмов в клетках животных, приводящих к снижению регистрируемого уровня ДНК-белковых сшивок, по сравнению с результатами отдельного воздействия радиации или свинца.

4. Результаты определения уровня ДНК-белковых сшивок тимуса и селезенки при хроническом облучении животных малыми дозами позволяют заключить, что ответ клеток на лучевое воздействие в малых дозах не является специфической для лучевого поражения и происходит по типу общего адаптационного синдрома.

5. Определение уровня ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови животных методом детергентного осаждения может быть рекомендовано для определения степени тяжести поражения генетического аппарата животных и вероятностного прогноза отдаленных последствий при радиационном воздействии и действии ионов свинца.

На защиту выносятся следующие основные положения работы:

1. Результаты сравнительных исследований ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различных органов животных после острого облучения животных в разных дозах.

2. Особенности образования ДНК-белковых сшивок в зависимости от тканевой специфики клеток при фракционированном облучении с разной интенсивностью и хроническом поступлении ионов свинца в разных концентрациях.

3. Результаты и выводы, полученные при изучении динамики изменения уровня ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов животных при раздельном и сочетанном воздействии хронического облучении в малых дозах и хронического воздействия ионов свинца.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Третьем съезде по радиационным исследованиям "Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность" (Москва, 14-17 октября 1997г.) и на Втором съезде биофизиков России (Москва, 23-27 августа 1999 г.)

Публикации по теме работы:

По данным диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. В работе имеются 12 таблиц, 1 фотография, 10 рисунков. Список литературы включает 165 источников, в том числе 66 отечественных и 99 иностранных.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 55 крысах-самцах линии «Вистар» и 60 мышах линии СВАЛас, полученных из питомника РАМН «Столбовая». В период проведения опытов животных содержали в виварии на стандартном рационе.

Острое и фракционированное облучение экспериментальных животных проводили на гамма-установке «Панорама-Зс» при мощности дозы 0,63 сГр/с. Для хронического облучения животных использовали гамма-установку УОГ-1 (разработчик ВНИИФТРИ) с мощностью дозы 30 мкГр/ч. Источник излучения в использованных установках — 137Сз.

Экспериментальная часть работы состояла из четырех серий опытов.

В первой серии опытов изучали влияние острого облучения крыс в разных дозах на образование ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК

Для опытов использовано 20 крыс массой 140-160 г., которые были разделены на 5 групп (по 4 крысы в группе). Четыре группы были облучены на

гамма-установке в дозах соответственно 2, 6, 12 и 18 Гр. Одна группа служила контролем.

Через 3 ч после облучения проводили декапитацию крыс, вскрывали животных, отбирали тимус, селезенку, головной мозг, печень с немедленным помещением органов в жидкий азот. Замороженные органы растирали в ступке до порошкообразного состояния, отбирали навески для последующего определения -ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК и переносили в соответствующие лизирующие буферы.

Для определения однонитевых разрывов высокомолекулярную ДНК из клеток выделяли по методу Дэвиса с соавт. (Davis L.G., et al., 1986). Однонитевые разрывы ДНК определяли методом ROPS-анализа по Basnakian A. G., James S. J.(1994). Метод основан на измерении радиоактивности меченных предшественников ДНК, встраивающихся- по месту разрыва. Измерение радиоактивности проводили методом Черенкова- на. жидкостном

сцинтилляционном счетчике Дельта-300 фирмы «Tracor Analytic» (США).

Во второй серии опытов изучали образование ДНК-белковых сшивок в клетках печени, тимуса, селезенки и лейкоцитах крови крыс после фракционированного облучения с разной интенсивностью.

Две группы крыс подвергались у-облучению дозами 0,3 и 0,5 Гр в сутки соответственно в течение 30 дней до суммарных доз 6,6 и 11 Гр. Через 30 суток от начала эксперимента производили убой и вскрытие крыс. Для гематологических исследований кровь получали из хвостовой вены. ДБС определяли в клетках тимуса, печени, селезенки и лейкоцитах крови. Выделение лейкоцитов проводили путем селективного лизиса эритроцитов ионами аммония (Хант С, 1990). Осадок лейкоцитов ресуспендировали' в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 1+2x106 клеток/мл.

Для определения* свободных сульфгидрильных групп кровь отбирали в гепаринизированные пробирки. SH-группы определяли методом амперометрического титрования по В. Соколовскому (1962).

В третьей серии опытов изучали влияние длительного поступления ацетата свинца в разных концентрациях на образование ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови и клетках лимфоидных органов крыс, а также эффект острого у-облучения в полулетальной дозе на фоне свинцовой интоксикации.

Крысы линии Вистар были разделены на 5 групп. Четырем группам животных в течение 30 дней ежедневно выпаивали растворы ацетата свинца (СН3СООНХЗН2О) в дистиллированной воде, в концентрациях, соответствующих 5, 10 и 20 (ПДК) по воде культурно-бытового и хозяйственно-питьевого водопользования (СП 2.1.5.761-99). Крыс четвертой экспериментальной группы, (получавших ежедневно с водой 10 ПДК по ионам свинца) на 14 сутки эксперимента облучили дозой 6 Гр Через 30 суток от начала

эксперимента проводили убой и вскрытие животных. Для определения гематологических показателей кровь получали из хвостовой вены. ДБС определяли в клетках тимуса, селезенки и лейкоцитах крови.

В четвертой серии опытов изучали влияние раздельного и сочетанного действия хронического внешнего облучения мышей в малой дозе и хронического действия ацетата свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках селезенки и тимуса.

Исследования проведены на 60 мышах-самцах линии СВАЛас исходной массой 14-16 г. Животные были разделены на четыре группы (по 15 животных в группе). Одна группа мышей подвергалась хроническому облучению с мощностью дозы 30 мкГр/ч на гамма-установке УОГ-1. Животные второй группы подвергались хроническому воздействию ацетата свинца в виде питьевой воды концентрации 0,3 мг/л (ЗхЮ"4 кг/м3) по ионам свинца (10 ПДК по ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая»). Животных третьей группы подвергали комбинированному радиационно-химическому воздействию (ацетат свинца и облучение) в режимах, описанных выше. Четвертую группу животных содержали в стандартных условиях вивария и использовали в качестве контроля.

Через 20, 40 и 80 суток от начала эксперимента (суммарные поглощенные дозы 1,44, 2,88 и 5,76 сГр соответственно) отбирали по 5 животных от каждой группы, проводили убой животных. Животных вскрывали, отбирали тимус и селезенку, органы взвешивали и готовили суспензии клеток в охлажденном фосфатно-солевом буфере. Полученные суспензии использовали для исследований ДБС методом детергентного осаждения, а также для определения клеточности тимуса и селезенки.

Для определения ДНК-белковых сшивок в работе использовали метод детергентного осаждения, предложенный Zhitkovich A. and Costa M. (1992), в модификации Осипова А.Н. и Коломийцевой ГЛ. (1996). Суть метода состоит в диссоциации нековалентных ДНК-белковых комплексов посредством жесткой обработки додецилсульфатом натрия (Ds-Na+, SDS) и селективного осаждения сшитого ДНК-белкового комплекса путем добавления

Для определения уровня ДБС проводили следующие процедуры. Отбирали по 100 мкл суспензии клеток или по 100 мг замороженных в жидком азоте и измельченных до порошкообразного состояния органов и добавляли по 1 мл лизирующего буфера (20 тМ Tris-HCI, рН 7,5, содержащий 2% Ds-Na, 10 тМ ЭДТА и 1мМ фенилметилсульфонилфторида). Для достижения воспроизводимости получаемых результатов перед осаждением ДНК-белкового комплекса проводили механическую фрагментацию ДНК. Размер фрагментов ДНК контролировали, используя метод горизонтального электрофореза в геле агарозы (Sharp P., Sugden В., Sambrook J., 1973). Концентрацию ДНК определяли на ДНК-флуориметре ТК0-100 фирмы «Hoefer Scientific Instruments» (США) с использованием реактива Hoechst 33258.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнительный анализ ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК после острого облучения крыс в разных дозах С целью изучения ранних радиационных структурно-функциональных изменений в комплексе ДНК-белок крыс облучали дозами 2,6,12 и 18 Гр. Через 3 часа после облучения проводили убой животных, производили вскрытие, отбирали тимус, селезенку, печень и головной мозг. Определяли уровень ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках отобранных органов.

Для количественной оценки числа нормальных и индуцированных воздействием (облучением) ДНК-белковых сшивок был введен относительный коэффициент сшивания кдБс, представляющий собой отношение количества ДБС

в клетках опытной группы животных к соответствующему значению для контрольной группы.

Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют что через 3 часа после облучения во всех изученных органах регистрируется повышенный уровень ДНК-белковых сшивок, степень увеличения сшивок зависела от дозы облучения (таб.1).

Наибольшее количество ДБС регистрируется в клетках тимуса. Отмечается крайне сильная зависимость количества ДБС от дозы излучения. Уже после облучения дозой 2 Гр был зарегистрирован уровень ДБС, достоверно превышающий контрольный в 1,8 раза. С увеличением дозы излучения отмечался соответствующий рост количества сшивок (значения кдас), достигая при дозе 18 Гр более чем 3,5-кратного превышения уровня контроля.

В клетках селезенки также зарегистрирован дозозависимый рост количества ДБС. Однако реакция спленоцитов на увеличение дозы излучения выражена не так ярко, как для клеток тимуса. После облучения дозой 2 Гр значение относительного коэффициента сшивания кдас превышало контрольное значение лишь на 20 % (отличие недостоверно). Максимальное значение кдас для селезенки было достигнуто после облучения крыс дозой 18 Гр и составило 2,31±0,18. Отличия в реактивности клеток тимуса и селезенки при общем облучении животных могут быть обусловлены как различиями в функционировании клеточных и тканевых систем репарации повреждений ДНК, так и особенностями метаболизма клеток в этих органах.

Таблица 1

Значения кдас в различных органах крыс через 3 часа после облучения (М±т)

Доза, Гр Тимус Селезенка Головной мозг Печень

0 (Контроль) 1,0010,16 1,0010,11 1,0010,12 1,0010,16

2 1,80+0,22* 1,2310,16 1,1210,09 1,61+0,16*

6 2,3710,22* 1,7210,16* 1,58Ю,12* 2,0410,22*

12 3,1610,18* 1,97+0,22* 1,7510,18* 2,1610,15*

1S 3,7010,26* 2.31Ю,18* 1,9710,15* 2.22Ю.24*

* - отличия достоверны, р<0,05

В клетках головного мозга после облучения крыс дозой 2 Гр достоверных изменений со стороны количественного выхода ДБС не отмечено. При повышении дозы значение кдас повышалось, достигая при дозе 6 Гр достоверного превышения уровня контроля в 1,5 раза. При больших дозах облучения количественный выход ДБС увеличивается не так показательно, как в клетках лимфоидных органов: при максимальной дозе (18 Гр) значение кдас не достигает 2.

В печени через 3 часа после облучения дозой 2 Гр отмечалось резкое повышение числа ДБС, сравнимое с высоко чувствительными лимфоидными клетками. После облучении дозой 6 Гр значение достигает двукратного превышения уровня контроля. Однако, при более высоких дозах роста числа сшивок не наблюдалось, как бы создавая эффект насыщения. Количественный выход ДБС практически оставался на постоянном уровне вплоть до дозы 18 Гр.

Количественный характер образования ДБС в различных органах после острого облучения согласуются с общепринятыми понятиями о тканевой радиочувствительности.

Таблица 2

Значения кордля тимуса, селезенки, головного мозга и печени после острого облучения крыс разными дозами

Доза, Гр Тимус Селезенка Головной мозг Печень

0 (Контроль) 1,00±0,0б 1,00±0,05 1,00±0,06 1,00±0,08

2 1,15±0,08 1,13±0,08 1,07±0,11 0,91±0,12

6 1,10+0,12 1,17±0,13 1,06±0,16 1,17+0,09

12 1,46+0,09* 1,22±0,12 1,07±0,09 1,15+0,11

18 1,49+0,11* 1,42±0,16* 0,96±0,12 1,16±0,13

Для анализа ОР ДНК был введен коэффициент представляющий отношение количества ОР (средней радиоактивности меченных проб) в каждой опытной группе к соответствующему значению контрольной группы. Результаты определения ОР ДНК представлены в таб. 2.

Через 3 часа после облучения ОР ДНК достоверно зарегистрированы лишь в тимусе при дозах 12 и 18 Гр ив селезенке при дозе 18 Гр. Для остальных органов и доз облучения количественный выход ОР ДНК достоверно не отличается от соответствующих значений контрольной группы. Наибольшие значения получены для тимуса и селезенки. Полученные результаты

подтверждают данные Иванника Б.П. и соавт. (1976) о высоких темпах репарации ОР ДНК.

Таким образом, через 3 часа после острого облучения уровень ДБС в клетках изученных органов проявляет себя как более информативный критерий поражения генетического аппарата, по сравнению с ОР ДНК.

Влияние фракционированного облучения крыс с разной интенсивностью на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках печени, тимуса, селезенки и лейкоцитах крови.

С целью изучения характера пострадиационных изменений в характере ДНК-белковых взаимодействий в клетках различного типа после серии многократных облучений крыс облучали дозами 0,3 и 0,5 Гр в сутки в течение 30 дней до суммарных доз 6,6 и 11 Гр соответственно. Через 30 дней от начала серии облучений производили убой животных, отбирали образцы органов и крови. Определяли уровень ДБС в клетках тимуса, селезенки, печени и лейкоцитах крови животных. Для оценки интенсивности свободно-радикального окисления определяли количество свободных сульфгидрильных групп крови. Физиологический статус животных на момент исследований оценивали по уровню гемоглобина, общего количества эритроцитов и лейкоцитов и лейкоформуле.

Установлено, что показатели количества эритроцитов и гемоглобина в крови крыс каждой из экспериментальных групп не отличались достоверно от соответствующих значений для контрольной группы. Концентрация лейкоцитов в крови крыс, подвергавшихся фракционированному облучению, достоверно

снижалась. Степень снижения не зависела от суточной дозы излучения; число лейкоцитов в крови крыс каждой из опытных групп составляет около 60 % от соответствующего значения для контрольной группы. Соотношение различных форм лейкоцитов достоверно не изменялось, оставаясь на уровне контрольных значений. Данные по изменению клеточного состава крови согласуются результатами работы Бергграума Д.И., Гавришина Х.В. и др. (1990)

Таблица 3.

Содержание свободных сульфгидрильных групп в крови крыс после фракционированного облучения

Группа животных Кол-во 5Н-групп, моль/м3 крови Отношение количества ЭН-групп к содержанию гемоглобина

Контроль X 22,44 2,86

+т 0,92 0,38

0,3 Гр в сутки X 15,77* 1,93*

±т 1.12 0,09

0,5 Гр в сутки X 15,33* 1,83*

±т 1,49 0.12

Примечание. * - достоверно, р<0,05

Для характеристики интенсивности протекания окислительных процессов в организме крыс после облучения было проведено исследование числа свободных сульфгидрильных групп в крови животных. Результаты исследования представлены в таб. 3.

Учитывая тот факт, что наибольшее число SH-гpyгm крови приходится на SH-группы гемоглобина (4 сульфгидрильные группы на одну молекулу гемоглобина), значения концентраций SH-групп были отнесены к его концентрации в крови крыс. Как следует из таб. 3, после фракционированного облучения в течение 30 дней до суммарных доз 6,6 (0,3 Гр/сут) и 11 Гр (0,5 Гр/сут) происходит достоверное, независимое от содержания гемоглобина, снижение уровня свободных сульфгидрильных групп. Уровень свободных SH-групп для двух дозовых режимов облучения (0,3 и 0,5 Гр в сутки) снижалось по отношению к контролю на 33 и 36% соответственно.

При исследовании ДНК-белковых сшивок для всех органов (тканей) зарегистрировано увеличение количества ДБС. При этом итоговые значения уровня ДБС зависели как от суточной дозы облучения, так и от вида ткани, взятой для изучения (таб.4). В наименьшей степени тенденция к повышению уровня ДБС выражена для клеток печени, эффект воздействия в которых заметен лишь при облучении дозами 0,5 Гр/сут, а численно среднее значение кдас превышает контрольное на 34%. В клетках крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки) эффект облучения более заметен. Так, в лейкоцитах крови зарегистрировано достоверное увеличение числа ДБС в обеих экспериментальных группах и численно для суточных доз 0,3 и 0,5 Гр соответственно составили 1,64 и 1,89. 10

Таблица 4

Значение кдас для клеток печени, селезенки, тимуса и лейкоцитов крови крыс после фракционированного облучения

Примечание. * - р<0,05

В клетках тимуса зарегистрировано увеличение уровня ДБС на 60 % (таб. 4). Увеличение суточной дозы до 0,5 Гр, не вызывало ответного увеличения значения кдас- Зарегистрированный уровень ДБС остался на неизменном уровне, создавая как бы картину «насыщения» значения показателя.

В клетках же селезенки после облучения дозами 0,3 Гр/сут значение кдас не превышало контрольных значений. Одпако для доз 0,5 Гр/сут в клетках селезенки отмечено достоверное увеличение числа ДБС; при этом значение кдвс превышает соответствующую величину для тимуса.

Полученные результаты согласуются с данными А.Н. Осипова (1998), полученных на мышах для многократного облучения до суммарной дозы 1,5 Гр. По реакции клеток на облучение в отношении образования ДБС органы также располагаются в ряд (по убыванию проявления эффекта) тимус - селезенка -печень.

Рассматривая уровень ДБС в лейкоцитах крови, клетках лимфоидных органов и одновременно сопоставляя эти данные с результатами подсчета лейкоцитов и определения лейкоцитарной формулы можно предположить, что наблюдаемая лейкопения, происходит за счет накопления повреждений ДНК в лимфоцитах крови и лимфоидных органов, приводящим к усилению их гибели. Такой эффект способен не только снижать иммунный статус организма, но и может становиться причиной отдаленных нарушений реактивности иммунной системы.

Таким образом, как показано результатами эксперимента, на фоне отсутствия ярко выраженного ответа со стороны показателей периферической крови, фракционированное облучение крыс способствовало запуску механизмов повреждения на молекулярном уровне. Повышение интенсивности свободно-радикального окисления, наглядно показанное снижением числа свободных сульфгидрильных групп, приводит к увеличению в клетках числа ДНК-белковых сшивок (рис. 1).

контроль 0,3 Гр/еут 0,5 Гр/сут

ВДБС ЩБН-группы

Рис.1. Уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и количество свободных сульфгидрильных групп крови животных после фракционированного облучения.

Влияние длительного воздействия ионов свинца в разных концентрациях на уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови и клетках лимфоидных органов крыс Эффект острого облучения на фоне свинцовой интоксикации

С целью изучения закономерностей образования сшивок ДНК-белок при токсическом действии ионов свинца, а также эффекта острого облучения на фоне свинцовой интоксикации в данной серии экспериментов исследовали уровень ДНК-белковых сшивок в клетках тимуса, селезенки и лейкоцитах крови после 30-дневного хронического поступления ацетата свинца в разных концентрациях. Концентрации ацетата свинца для экспериментальных групп животных соответствовали 5, 10 и 20 ПДК по ионам свинца. Одну группу, получавшую с водой 10 ПДК по ионам свинца, подвергли острому облучению на гамма-установке полулетальной дозой на 14 сутки эксперимента. Через 30 дней от начала поступления ацетата свинца животных подвергали убою. Физиологическое состояние крыс на момент исследований оценивали по показателям периферической крови.

Результатами исследований показано, что через 30 суток от начала поступления в организм ацетата свинца, в результате свинцовой интоксикации происходит заметное снижение концентрации клеток как красной, так и белой крови. При анализе лейкоцитарной формулы крови наблюдалось снижение доли палочкоядерных нейтрофилов со смещением ядерного индекса вправо после хронического воздействия ионов свинца, что полностью согласуется с данными Фоминой Л. И. (1970). Изменение картины крови при сочетанном радиационно-химическом воздействии оказалось сходным с результатами для отдельного воздействия свинца в той же концентрации.

Результаты определения ДНК-белковых сшивок, приведенные в таб. 5, свидетельствуют об общей тенденция к увеличению в клетках количества ДБС. При этом в спленоцитах к моменту убоя животных превышение уровня ДБС над контролем регистрируется уже при минимальной (5 ПДК) концентрации ионов металла. С увеличением концентрации ацетата свинца в воде количество ДБС в спленоцитах увеличивается и при концентрации 10 и 20 ПДК достоверно превышает контрольный уровень в 1,5 и 1,7 раза соответственно. При определении ДБС после облучения полулетальной дозой на фоне хронического поступления ацетата свинца зарегистрирован уровень ДБС, превышающий контрольные значения в 1,26 раза. Характерно, что это значешге ниже, чем после отдельного действия свинца в той же концентрации.

Таблица 5

Значение кдас для клеток тимуса, селезенки и лейкоцитов крови крыс после длительного токсического воздействия ацетата свинца и его сочетания с облучением

Группа животных Тимус Селезенка Лейкоциты

Контроль X 1,00 1,00 1,00

±ш 0,05 0,05 0,05

РЬ 5 11ДК X 0,99 131 1,05

±ш 0,10 0,16 0,11

РЬ 10 ПДК X 1,68* 1,48* 1,24*

+т 0,14 0,15 0,06

РЬ + 6 Гр X 1,44* 1,26 1,10

±т 0,08 0,09 0.13

РЬ20ПДК X 1,56* 1,66* 1,04

±т 0,17 0,19 0,10

Примечание. * - достоверно, р<0,05

Для клеток тимуса отмечено наличие пороговой концентрации ионов свинца для образования ДБС. Лишь при достижении концентрации 10 ПДК количество ДБС в тимоцитах достоверно превышало уровень контрольной группы в 1,68 раза. При увеличении концентрации тяжелого металла до 20 ПДК значение кдвс оставалось на том же уровне. Количество ДБС в тимоцитах крыс, подвергнутых сочетанному воздействию свинца и облучению, было достоверно выше, чем в контроле, однако ниже значений, полученных для отдельного токсического воздействия в той же концентрации.

Изменения уровня ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови, в изученном диапазоне доз и концентраций проявляется слабо. Так заметное увеличение количества ДБС зарегистрировано лишь при концентрации ацетата свинца 10 ПДК Комплексно рассматривая полученные результаты для

уровня ДБС и клеточных показателей крови, можно предположить высокие темпы гибели лейкоцитов в русте крови при изученном химическом и радиационно-химическом воздействии. Преимущественная гибель клеток с повышенным уровнем повреждений ДНК может объяснить регистрируемое отсутствие изменений со стороны ДБС.

Таким образом, наибольшие изменения со стороны генетических структур отмечены для клеток лимфоидных органов (тимуса и селезенки). Различия в характере кривых концентрационной зависимости для этих органов могут быть связаны с разной интенсивностью пролиферации их клеток.

Результаты определения ДБС после сочетанного воздействия острого облучения на фоне хронического поступления ацетата свинца для клеток всех органов и тканей свидетельствуют о тенденции к взаимному снижению эффекта; регистрируемый уровень ДБС ниже, чем для отдельного воздействия ацетата свинца в той же концентрации.

Влияние раздельного и сочетанного воздействия хронического внешнего облучения мышей в малых дозах и хронического воздействия ацетата свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов

В настоящем эксперименте проводили изучение ДБС в клетках тимуса и селезенки при хроническом раздельном и сочетанном воздействии ионов тяжелого металла (свинца) и гамма-облучения в малых дозах. ДНК-белковые сшивки определяли через 20,40 и 80 суток от начала эксперимента.

Результаты определения сшивок ДНК-белок в клетках тимуса и селезенки представлены в относительных единицах от соответствующих значений контрольной группы и приведены на рис. 2.

Как видно из графиков, зависимость количества сшивок ДНК-белок для длительного радиационного, химического, а равно и для комбинированного воздействия от суммарной дозы (времени воздействия) характеризуется ярко выраженной нелинейностью с максимальным- значением на 40-е сутки воздействия.

Уже через 20 суток от начала облучения животных для клеток тимуса и селезенки мышей облученной группы значения соответственно составили 1,41±0,62 и 1,56±0,14. Хроническое поступление ацетата свинца (0,3 мг/л) также индуцирует достоверное увеличение количества ДБС в спленоцитах мышей (рис. 2, А). До 40-х суток эксперимента количество ДБС продолжало расти для каждого из лимфоидных органов как при радиационном, так и при химическом воздействии; при этом для облучавшейся группы и группы, подвергавшейся воздействию ацетата свинца регистрируется достоверное изменение их

значения практически совпадают (рис. 2). Дальнейшая динамика количества сшивок ДНК-белок, по-видимому, обусловлена возвратом к контрольным значениям. Это подтверждается результатами определения ДБС через 80 суток от начала эксперимента. К этому времени значение относительного коэффициента сшивания для каждого органа, для всех экспериментальных групп

достоверно не отличается от значения контроля.

Рассматривая в отдельности результаты, полученные для сочетанного радиационного воздействия и хронического действия ацетата свинца, следует отметить, что регистрируемое количество ДБС при комбинированном воздействии для любой экспериментальной точки оказалось ниже, чем для каждого из факторов, действующих отдельно. Это справедливо как для тимоцитов, так и для спленоцитов. Так для тимоцитов мышей, подвергавшихся комбинированному воздействию облучения и ионов свинца, регистрируемое

количество ДБС повторяло значения для контрольной группы на протяжении всего эксперимента.

Рис. 2. Значение кдвс в спленоцитах (А) и тимоцитах (Б) мышей при длительном воздействии ионизирующего ихтучения и ацетата свинца на разные сроки эксперимента

В литературе имеются данные о снижении радиационных эффектов при одновременном действии соединений свинца. Так А. Н. Осипов (1999) приводит результаты по взаимному снижению количества ДБС в клетках головного мозга мышей при хроническом воздействии ионов свинца и фракционированном облучении. В настоящее время нет однозначного мнения для объяснения такого антагонистического действия ионизирующего излучения и ионов тяжелого металла. Мы предполагаем, что в ситуации комбинированного радиационно-химического воздействия происходит запуск одновременно нескольких молекулярных и клеточных механизмов, направленных на сохранение гомеостаза. В этом случае действительно можно ожидать более быстрое восстановление

повреждений (неблагоприятных модификаций) на разных уровнях биологической организации. Более детально рассматривая механизмы, приводящие к восстановлению повреждений, к таковым можно отнести, например, запуск синтеза de novo белков металлотионеинов (МТ) (Котеров А.Н., Филипович И.В.,1995) и других низкомолекулярных стрессорных белков (белки теплового шока и др.) богатых сульфгидрильными группами и способных перехватывать. свободные радикалы, образующиеся при действии излучения. Кроме того, свинец способен связываться непосредственно с молекулой ДНК (Ariza M.E., Marshall V. Williams, 1996). Вследствие этого возможна реализация конформационных изменений, ограничивающих подход индуцированных радиацией свободных радикалов к ДНК, необходимый для образования ДНК-белковой сшивки.

Таким образом, серия исследований, проведенных на животных, с применением различных вариантов лучевого воздействия, а также токсического воздействия ионов свинца, свидетельствует об универсальном ответе клеток различного типа на внешнее воздействие. В условиях нашего исследования эта универсальность сводится к запуску каскада процессов, в конечном итоге приводящих к изменениям в организации комплекса ДНК-белок и образованию ДНК-белковых сшивок. Как свидетельствуют полученные в работе экспериментальные данные, увеличение числа сшивок ДНК-белок в клетках происходит, как при высоких дозах радиационного воздействия, полученных животными за короткое время, так и при облучении сравнительно низкими дозами в течение длительного периода времени, при хроническом облучении малыми дозами излучения, а также при отдельном и сочетанном воздействии радиации и свинца.

Вместе с этим следует отметить, что ДНК-белковые сшивки показали себя как чувствительный критерий поражения генетического аппарата. Поэтому сшивки ДНК-белок могут быть рекомендованы для использования в качестве одного из показателей при комплексной оценке биологического действия неблагоприятных факторов внешней среды, в частности, ионизирующей радиации и соединений свинца.

3. ВЫВОДЫ

1. Острое облучение крыс дозами 2,6,12 и 18 Гр через 3 часа после воздействия приводит к дозозависимому увеличению количества сшивок ДНК-белок в клетках тимуса, селезенки, печени и головного мозга. Наибольший количественный выход сшивок отмечен для лимфоидных органов - тимуса и селезенки. Это указывает на зависимость повреждения генетического аппарата от специфики метаболизма данного типа клеток и уровня их пролиферативной активности.

2. Фракционированное облучение крыс в течение 30 дней дозами 03 или 0,5 Гр в сутки (суммарные дозы 6,6 и 11 Гр соответственно) вызывает дозозависимое увеличение уровня ДНК-белковых сшивок в клетках селезенки, тимуса и лейкоцитах крови. Одновременно обмечается зависимое от дозы, достоверное снижение уровня сульфгидрильных групп крови.

3. Хроническое поступление ацетата свинца в организм крыс с питьевой водой в течение 30 суток в концентрациях, соответствующих 10 и 20 ПДК приводит к достоверному увеличению сшивок ДНК-белок в клетках тимуса, селезенки и лейкоцитах крови. Концентрация ацетата свинца, соответствующая 5 ПДК, не оказывает влияния на уровень ДНК-белковых сшивок в изученных тканях.

4. Хроническое облучение мышей с мощностью дозы 30 мкГр/ч вызывает увеличение количества ДНК-белковых сшивок в тимоцитах и спленоцитах мышей через 40 суток от начала облучения (суммарная доза 2,88 сГр). Дальнейшее облучение мышей до 80 суток (суммарная доза 5,76 сГр) приводит к снижению количества сшивок ДНК-белок до контрольных значений.

5. Хроническое поступление ацетата свинца с питьевой водой в концентрации 10 ПДК приводит к увеличению количества ДНК-белковых сшивок в тимоцитах и спленоцитах мышей на 40-е сутки с последующим снижением до значений контроля на 80 сутки.

6. При сочетанном воздействии гамма-облучения и ионов свинца регистрируемый уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов значительно меньше, чем при раздельном воздействии каждого из изученных факторов, что может свидетельствовать об активации синтеза в клетках соединений(металлотионеинов, белков теплового шока, других стрессорных белков), обладающих радиопротекторными свойствами.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий по радиобиологии, а также при выполнении научно-исследовательских и дипломных работ, написании учебников и учебных пособий.

2. Данные, полученные при изучении влияния многократного облучения животных с низкой интенсивностью на образование сшивок ДНК-белок в лейкоцитах крови, дают основания рекомендовать ДНК-белковые сшивки в качестве критерия радиационного поражения генетических структур животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Григорьев М.В., Коломийцева ГЛ., Косенко А.С. Сравнительное изучение образования ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в различных органах крыс после общего гамма-облучения // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. - Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997. -Т.2.-С.9-10.

2. Григорьев М.В., Коломийцева Г.Я., Пучков П.В. ДНК-белковые сшивки и сульфгидрильные группы крови при фракционированном облучении крыс различной дозовой нагрузкой // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб. науч. тр. — М.: Моск. гос. акад. вет. мед. и биотехн. им. К.И. Скрябина М., 1998. - С.38 - 40.

3. Григорьев М.В., Коломийцева ГЛ., Пучков. ДНК-белковые сшивки в клетках внутренних органов крыс при фракционированном облучении с различной дозовой нагрузкой//Биохимия. - 1999. - Т.64. - № 2. - С. 251-254

4. Осипов А.Н., Григорьев М.В., Польский О.Г., Сыпин В.Д. ДНК-белковые сшивки в спленоцитах мышей при хроническом воздействии малых доз ионизирующего излучения и ионов свинца/Л1 Съезд биофизиков России: тез докл. -М.: МГУ, 1999. - Т.З. - С. 826-827.

5. Григорьев М.В., Коломийцева Г.Я., Пучков П.В. Влияние хронического действия свинца и его комбинации с облучением на показатели состояния генетического аппарата лимфоидных органов крыс.// Роль зооветобразования в профилактике болезней и лечении животных: Тез. докл. - М.: МВА им. К. И. Скрябина, 1999.- С.209-210.

6. Осипов А.Н., Григорьев М.В. Сшивки ДНК-белок в тимоцитах мышей при воздействии малых доз ионизирующей радиации и свинца.// Роль зооветобразования в профилактике болезней и лечении животных: Тез. докл. -М.: МВА им. К. И. Скрябина, 1999. - С.206.

7. Григорьев М.В., Осипов А.Н. Образование и репарация ДНК-белковых сшивок в клетках печени и головного мозга облученных крысУ/ Роль зооветобразования в профилактике болезней и лечении животных. Тез. докл. -М.: МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, 1999. - С.207.

8. Осипов А.Н., Григорьев М.В., Сыпин В.Д. Влияние сочетанного воздействия свинца и низкоинтенсивного гамма-излучения в малых дозах на генетические структуры тимоцитов мышей//Урал атомный, Урал промышленный: Тез. докл. VII международный экологический симпозиум. - Екатеринбург: УрО РАН, 1999.-С.151-152.

9. Григорьев М.В., Коломийцева ГЛ., Пучков П.В., Спиридонов М.Б. Использование сшивок ДНК-белок в качестве критерия радиационного поражения генетического аппарата клеток крови при многократном облучении с низкой интенсивностью./Информационный листок № 128-99. - М.: МособлЦНТИ, 1999. - 3 с.

Ю.Осипов А.Н., Григорьев М.В., Сыпин В.Д. Влияние длительного воздействия низкоинтенсивного гамма-излучения и тяжелых металлов на генетические структуры клеток лимфоидных органов мышей. II съезд Вавиловского

общества генетиков и селекционеров.: Тез. докл. - С-Пб., 2000. - Т. 2.- С. 165166.

П.Осипов А.Н., Григорьев М. В., Померанцева М.Д., Рамайя Л. К., Сыпин В.Д. Влияние хронического радиационного воздействия в малых дозах на генетические структуры мышей. // Хроническое радиационное воздействие: возможности биологической индикации: Тез. докл. Международный симпозиум. - Челябинск, 2000. - С. 60-61.

12.Osipov A. N.. Grigoryev M. VM Pomerantseva M. D., Ramaiya L. К., Sypin.V.'D. Study of combined chronic action of low-intensity gamma-radiation and lead at low doses on genetic structures of mice. // 8-th International Symposium on Radiation Physics. 5-9 June 2000. Prague.: Abstracts. - Prague. - 2000. - P. 248.

В.Осипов А.Н., Григорьев М.В., Сыпин В.Д., Померанцева М.Д., Рамайя Л. К., Шевченко В.А. Влияние хронического воздействия кадмия и у-излучения в малых дозах на генетические структуры мышей/ЛРадиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - Т. 40. - № 4. - С. 373-377.

14. Осипов А.Н., Рязанов ИА., Сыпин В.Д., Григорьев М.В., Пучков П.В. Изменения структурно-функциональных показателей клеток системы крови мышей при длительном воздействии свинца и кадмия. // Токсикологический вестник. -2001.-№.5.-С.2-5.

Лицензия ЛР № 021238 от 22.08.97.

Подписано в печать 06.02.2004 г.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Бумага 60x84 1/16

Усл.печл. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ № 18-1

111621, г. Москва, ул. Оренбургская, 15 Отдел оперативной полиграфии ФГУП «ВО Минсельхоза России»

3425

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорьев, Михаил Валерьевич

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общая характеристика ДНК-белковых сшивок.

2.2. ДНК-белковые сшивки при действии химических агентов.

2.3. Биологическое значение ДНК-белковых сшивок.

2.4. Свинец. Токсическая и генотоксическая характеристика.

2.5. Комбинированное действие радиации и тяжелых металлов.

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы и методы исследования.

3.1.1. Материалы исследования.

3.1.2. Методы исследования.

3.1.2.1. Количественное определение ДНК-белковых сшивок.

3.1.2.2. Определение однонитевых разрывов ДНК ROPS-методом.

3.1.2.3. Определение содержания свободных сулъфгидрильных групп крови амперометрическим титрованием.

3.1.2.4. Гематологические методы.

3.1.2.5. Определение клеточности тимуса и селезенки.

3.2. Результаты собственных исследований.

3.2.1. Сравнительный анализ ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК после острого облучения крыс в разных дозах.

3.2.2. Влияние фракционированного облучения крыс с разной интенсивностью на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках печени, тимуса, селезенки и лейкоцитах крови.

3.2.3. Влияние длительного воздействия ионов свинца в разных концентрациях на уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови и клетках лимфоидных органов крыс. Эффект острого облучения на фоне свинцовой интоксикации.

3.2.4. Влияние раздельного и сочетанного воздействия хронического внешнего облучения мышей в малых дозах и хронического воздействия ацетата свинца.

3.3. Обсуждение результатов исследований.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние раздельного и сочетанного воздействия ионизирующей радиации и ионов свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных"

Актуальность темы

При анализе экологической обстановки в районах аварийного радиационного загрязнения зачастую одновременно регистрировали высокий уровень загрязнения тяжелыми металлами, в частности свинцом (Фомичева Н.А., 1997; Белов А.Д., Журавлев А.И. и др., 1998). При одновременном воздействии ионизирующего излучения и химических агентов наблюдается модификация летального, мутагенного и/или канцерогенного действия излучения (Жербин Е.А. и др., 1982; Streffer С., Muller W.U., 1984). Это положение отражено также в докладе научного комитета ООН Генеральной Ассамблее 1982 г. "Ионизирующее излучение: Источники и биологические эффекты". Авторами доклада отдельно акцентируется внимание на необходимости изучения закономерностей сочетанного действия ионизирующих излучений и тяжелых металлов.

Геном эукариотических клеток организован как система тонких структурно и функционально обусловленных взаимодействий носителя генетической информации - молекулы ДНК с гистонами и негистоновыми белками хроматина - сложной надмолекулярной структуры, способной к кооперативным перестройкам. Поддержание многоуровневого порядка организации молекулы ДНК в клетке, эффективная реализация генетических программ напрямую связаны с динамикой ДНК-белковых взаимодействий. При воздействии на клетку ряда внешних физических и химических агентов может происходить преобразование лабильных связей ДНК-белок нормально функционирующего хроматина в крайне прочные связи, получившие название "ДНК-белковых сшивок" (ДБС) (Fornance A.J. et al., 1977, Oleinick N.L. et al., 1987). Формирование ДБС характеризуется "пришиванием" белка к ДНК, по-видимому, посредством ковалентной связи. Строгие доказательства ковалентной природы ДБС малочисленны, проведены лишь для некоторых модельных систем (Shetlar M.D. 1980). Зачастую наличие ковалентной связи констатируют на основании устойчивости комплекса к воздействию диссоциирующих и денатурирующих химических агентов, неэффективности разделения белка и ДНК известными физико-химическими методами (Murthy К.К. et al., 1993). Одним из наиболее значимых свойств ДНК-белковых сшивок для оценки их биологического значения является низкая скорость репарации этого типа повреждений. Наиболее медленно репарация ДБС происходит в неактивных областях хроматина; в метафазных клетках ДБС практически не репарируются (Chiu S.M. et al., 1984, 1986). Эти сведения дают основания предполагать накопление таких повреждений ДНК в клетках. Считается, что способность ДБС препятствовать нормальной транскрипции, репликации ДНК может определять участие ДБС в дестабилизации генома и являться причиной отдаленных последствий лучевого (или химического) воздействия (мутагенез, канцерогенез, гибель клеток по некротическому или апоптическому механизмам) (К.П. Хансон, В.Е.Комар, 1985, АуербахШ., 1978; HartR.W. et al., 1978).

Таким образом, изучение влияния ионизирующей радиации и тяжелых металлов на образование медленно репарируемых повреждений ДНК - ДНК-белковых сшивок - в клетках животных позволит найти новые подходы к оценке тяжести радиационно-химического поражения, а также прогнозу отдаленных последствий таких воздействий (снижение иммунного статуса, канцерогенеза, преждевременной смертности и др.)

Целью данной работы являлось изучение закономерностей образования ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных при раздельном и сочетанном воздействии на организм ионизирующего излучения и ионов свинца.

Исходя из этого, были определены конкретные задачи:

3. Изучить влияние хронического воздействия ионов свинца в разных концентрациях на образование ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов и лейкоцитах крови животных.

Научная новизна:

Впервые проведены сравнительные исследования уровней ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различных органов крыс при однократном у-облучении в разных дозах, установлены закономерности их образования в зависимости от вида клеток.

Изучен характер и количественные изменения ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов животных при раздельном и сочетанном воздействии у-облучения в малых дозах и ионов свинца. Установлено, что комбинированное воздействие у-облучения в малых дозах и ионов свинца снижает уровень ДНК-белковых сшивок, по сравнению с раздельным воздействием любого из двух факторов.

Научно-практическое значение работы;

Реализация результатов работы:

Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре радиобиологии, рентгенологии и ГО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий. Они используются при выполнении научно-исследовательской работы в лаборатории радиобиологии, при выполнении дипломных и курсовых работ. Методические подходы и выводы диссертационной работы используются для проведения радиоэкологического мониторинга в работе лаборатории биоиндикации экологических техногенных аномалий МосНПО «Радон». По результатам диссертациионной работы выпущен информационный листок «Использование сшивок ДНК-белок в качестве критерия радиационного поражения генетического аппарата клеток крови при многократном облучении с низкой интенсивностью» (Информационный листок № 128-99. - М.: МособлЦНТИ, 1999. - 3 с.)

Апробация работы:

Публикации по теме работы:

По данным диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 116 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложения. В работе имеются 12 таблиц, 1 фотография, 10 рисунков. Список литературы включает 165 источников, в том числе 66 отечественных и 99 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Григорьев, Михаил Валерьевич

ВЫВОДЫ

2. Фракционированное облучение крыс в течение 30 дней дозами 0,3 или 0,5 Гр в сутки (суммарные дозы 6,6 и 11 Гр соответственно) вызывает дозозависимое увеличение уровня ДНК-белковых сшивок в клетках селезенки, тимуса и лейкоцитах крови. Одновременно отмечается зависимое от дозы, достоверное снижение уровня сульфгидрильных групп крови.

6. При сочетанном воздействии гамма-облучения и ионов свинца регистрируемый уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов значительно меньше, чем при раздельном воздействии каждого из изученных факторов, что может свидетельствовать об активации синтеза в клетках соединений (металлотионеинов, белков теплового шока, других стрессорных белков), обладающих радиопротекторными свойствами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьев, Михаил Валерьевич, Москва

1. Авцын А.П. Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека. М.: Медицина, 1991. - 312 с.

2. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. - 463 с.

3. Баскаева И.О. Образование ДНК-белковых сшивок под действием у-радиации, УФ-облучения и некоторых химических агентов // Радиобиология. 1992. - Т.32. - Вып. 5. - С. 673-683.

4. Белов А.Д., Киршин В.А., Лысенко Н.П., Пак В.В., Рогожина Л.В. Радиобиология. М.: Колос, 1999. - 384 с.

5. Бергхоф П.К. Мелкие домашние животные. Болезни и лечение. / Пер. с нем. И. Кравец. М.: Аквариум, 1999. - 224 с.

6. Блэкет Н.М. Гематологические эффекты при длительном лучевом воздействии. В кн.: Руководство по радиационной гематологии (под ред. Ярмоненко С. П.) М.: Медицина, 1974. С. 106-111.

7. Бурлакова Е.Б. Современные достижения и нерешенные проблемы в радиобиологии//Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997. - Т. 1. - С. 9-10.

8. Виленчик М.М. Исследование возрастных изменений ДНК новый подход для выяснения, ответственных за спонтанную нестабильность ДНК // Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов. - Киев: Наук, думка. - 1986. - С. 133-140.

9. Виленчик М.М. Спонтанная нестабильность и пластичность ДНК in vivo: Рекомбинация между ядерной и митохондриальной ДНК и ее биологическое значение // Успехи современной биологии. Т. 99. -вып. 2.-С. 194-211.

10. Витвицкий В.Н., Соболева JI.C., Шевченко В. А. Модификации мутагенных эффектов гамма-излучений солями хрома (VI) и свинца (II). // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. -Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997. -Т. 2. С. 222-223.

11. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989.-255 с.

12. Гераськин С.А. Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения. // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997.-С. 20-21.

13. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений. М.: Медицина, 1989. 153 с.

14. Жербин Е.А., Новоселова Г.С., Комар В.Е. Комбинированное действие излучения и химических факторов. М., 1982.-21 с.

15. Жижина Г.П. Связь структурных характеристик ДНК эукариот и ее чувствительность к действию малых доз ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39. - Вып. 1. - С. 41-48.

16. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А.,Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев: Вища школа, 1983. 264 с.

17. Иванник Б.П., Проскуряков С.Я.,Рябченко Н.И. Исследование репарации и регенерации ДНК в радиочувствительных тканях облученных крыс//Радиобиология. 1976. - Т. 16. - Вып.6. - С.803-810

18. Иванник Б.П., Рябченко Н.И. О некоторых физико-химических изменениях в ДНК, выделенной из органов облученных крыс.//Радиобиология. 1969. - Т.9. - Вып.1. - С. 7-11.

19. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Попович И.Г., Забежинский М.А. Оценка генотоксичности и отдаленных эффектов радиационно-химических воздействий // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. - Т. 39.-Вып. 4.-С. 418-424.

20. Илюхин А. В., Шашков B.C. Бурковская Т.Е., Зубенкова Э.С. Цитокинетика и морфология кроветворения при хроническом облучении. М.: Энергоатомиздат, 1982. 136 с.

21. Ионизирующее излучение: источники и биологические эффекты. НКДАР ООН: Пер. с англ. Нью-Йорк: Организация Объединенных Наций, 1982.-780 с.

22. Комар В.Е., Хансон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток. М.: Атомиздат, 1980, 176 с.

23. Комар В.Е., Хансон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток. М.: Атомиздат, 1972, 160 с.

24. Котеров А.Н., Филиппович И.В. Радиобиология металлотионеинов // Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. -Т. 35. - Вып. 2. - С. 162-180.

25. Михельсон В.М. Роль нарушений репарации ДНК в канцерогенезе и старении в связи с проблемой надежности клетки // Надежность и элементарные процессов старения биологических объектов. Киев, 1986.-С. 127-131

26. Михельсон В.М. Старение клеток в культурах. Связь с естественным старением и репарацией ДНК // Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов, Киев, 1986а,- С. 116-123

27. Москалева Е.Ю., Илюшина Н.А. Повреждения ДНК при действии ионизирующих излучений и их репарация // Итоги науки и техники. Серия «Радиационная биология». Т. 9. - ВИНИТИ - 1990, С. 3-113.

28. Осипов А. Н., Сыпин В.Д. Влияние ионов тяжелых металлов на ДНК-белковые сшивки в клетках головного мозга облученных мышей //II Съезд биофизиков России: Тез. докл. Москва, 1999.- Т. 3. - С. 827

29. Осипов А.Н., Коломийцева Т.Я. Пострадиационные изменения ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различныхорганов у-облученных крыс. // Биохимия. 1996. - Т. 61. - Вып. 5. - С. 927-931.

30. Осняч B.C., Сергеев П.В., Ярмоненко С.П. Молекулярная радиобиология. М.: 2й МГМИ, 1978. 138 с.

31. Петров И.Р., Коропов В.М. Практикум по патологической физиологии./ М.: Колос, 1964. 204 с.

32. Радиобиологические подходы к диагностике лучевых поражений / Сб. науч. трудов ин-та усовер. врачей. Л., 1987. - 111 с.

33. Рождественский Л.М., Кондрадов А.А. Концепция действия пролонгированной ионизирующей радиации как раздражающего, а не повреждающего фактора. // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. Пущино, 1997. - Т. 1. - С. 39-40.

34. Рябченко Н.И. Радиация и организм. Обнинск, 1967. - С. 94

35. Рябченко Н.И. Основные закономерности повреждения макромолекулярной структуры ДНК при облучении in vivo и in vitro // Механизмы радиационного поражения и восстановления ДНП. -Пущино, 1972.-С. 15-32.

36. Семов А.Б., Птицына С.М., Семова Н.Ю. Особенности репарации ДНК при хроническом воздействии мутагенных факторов//Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. - Т.37. -Вып.4. - С.565-568.

37. Склобовская М.В., Рябченко Н.И. Снижение выхода ДНК при депротеинизации УФ- или у-облученных растворов дезоксирибонуклеопротеида // Радиобиология. 1970. - Т. 10. -Вып. 1. - С. 14-18.

38. Сложеникина Л.В., Фиалковская JI.A., Коломийцева И.К. Орнитиндекарбокси-лаза в органах крыс в условиях хронического воздействия у-излучения малой мощности доз // Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. - Т. 37. - Вып. 2. - С. 137-142.

39. Соколовский В.В. Определение содержания сульфгидрильных групп в крови амперометрическим титрованием// Лаб. дело. 1962. - № 8. -С. 3-7.

40. Стражевская Н.Б., Трояновская М.Л. Метод исследования радиационного эффекта на дезоксирибонуклеопротеид хроматина // Радиобиология. 1970. - Т. 10. - Вып.6. - С. 808-814.

41. Стражевская Н.Б., Трояновская М.Л., Кривцов Г.Г. Механизм радиационного повреждения дезоксирибонуклеопротеида хроматина в животной клетке // Радиобиология. 1971. - Т.П. - Вып. 3. - С. 329-334.

42. Стражевская Н.Б., Трояновская М.Л., Стручков В.А., Красичкова З.И. Нарушение состояния комплекса ДНК-белок хроматина ядра клетки под влиянием ионизирующей радиации // Радиобиология. 1969. -Т.9. - Вып.5. - С. 903-905.

43. Сьяксте Т.Г., Сьяксте Н.И. Химические соединения, повреждающие ДНК. Рига: Зинатне, 1991. - С. 22-24.

44. Токин И.Б. Проблемы медицинской цитологии. Л.: Медицина, 1974. - 122 с.

45. Уманский С.Р. Радиационное нарушение структуры и функции хроматина./ Автореф. дис. докт. биол. наук. Л., 1975. - 52 с.

46. Филиппович И.В. Репарация и репликация ДНК в облученных клетках/ Итоги науки и техники: Серия «Радиационная биология». -М.: ВИНИТИ, 1990. Т. 9, 94 с.

47. Фомина Л.И. Картина белой крови при свинцовой интоксикации//Социальная гигиена и организация здравоохранения, гигиена труда, профессиональная патология. Алма-Ата, 1970. - Т. 1. -С. 178-181.

48. Фомичева Н.А. Интенсивность свободнорадикального окисления и возможность ее коррекции биоантиоксидантами у крупного рогатого скота, находящегося на загрязненной радионуклидами территории. Автореф. канд. биол. Наук. М., 1997. -21 с.

49. Хансон К.П., Комар В.Е. Молекулярные механизмы гибели клеток. -М.: Энергоатомиздат, 1985. 152 с.

50. Хант С. В кн. Лимфоциты. Методы (под ред. Клауса Дж.). М.: Мир. 1990. С. 52-53.

51. Химия окружающей среды /под ред. О.М. Бокриса. М., Химия. -1982.- 180 с.

52. Цейтлин П.И., Рябченко Н.И., Горин А.И., Тронов В.А., Склобовская М.В., Иванник Б.П. // Радиобиология. 1967. - Т.7. - Вып. 5. - С. 658-664.

53. Цыб А.Ф. Медицинские последствия на Чернобыльской АЭС. // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. Пущин о, 1997.-Т. 1.-С. 15-16.

54. Шахова И.К., Ломова Т.Ю. Кинетика поведения сшивок ДНК-белок, индуцированных бифукциональными алкилирующими агентами, обладающими противоопухолевым действием // Экспериментальная онкология. 1983. - Т. 5., № 1. - С.67-71.

55. Эйдус JI.X. О едином механизме инициации различных эффектов малых доз ионизирующих излучений // Третий съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. Пущино, 1997. - Т. 1. - С. 52.

56. Ярилин А.А. Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье человека/Под ред. Е.Б. Бурлаковой. М., 1996а. - С.68-95

57. Ярилин А.А. Радиация и иммунитет. Современный взгляд на старые проблемы.// Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. - Т. 37. -Вып. 4. - С. 597-603.

58. Alexander P., Moroson Н. Cross-linking of deoxyrobonucleic acid following ultra-violet irradiation of different cells // Nature.-1962.-V.194.- №4831.-P.882-883.

59. Ariza M.E., Marshall V. Williams. Mutagenesis of AS52 cells by low concentrations of lead (II) and mercury (II) // Environmental and Molecular Mutagenesis. 1996. - V. 27. - P.30-39

60. Banjar Z. M., Hnilica L., Briggs R., Stein J., Stein G. Cis- and trans-diaminedichloro-platinum(II)-mediated crosslinking of chromosomal nonhistone proteins to DNA in Hella cells. // Biohemistry. -1984. V. 23. - P. 1921-1926.

61. Basnakian A. G., James S. J. A rapid and sensitive assay for the detection of DNA fragmentation during early phases of apoptosis // Nucleic. Acids Res.-1994.- V.22.-№13. P.2714-2715

62. Biaglow J.E., Varnes M.E., Tuttle S.W. et al. The effect of L-buthionine sulfoximine on the aerobic radiation respose of A549 human lung carcinoma cells. // Int. J. Radiat. One. Biol. Phys. 1986. - V. 12. - P. 1139-1143.

63. Bide R.W. Effect of X-irradiation on sulfhydryl levels in rat cells // Radiat.Res. 1965. - V.25. - P.221-226

64. Black M.C., Ferrel J.R., Horning R.C., Martin L. K. Jr. DNA strand breakage in fresh water mussels (Anodonta grandis) exposed to lead in the laboratory and field // Environ. Toxicol. Chem. 1996. - V. 15. - №5. - P. 802-808

65. Bohue L., Coquereller Т., Hagen H. Radiation sensitivity of bacteriophage DNA. II. Breaks and cross-links after irradiation in vivo II Int. J. Radiat. Biol. 1970. - V. 17. - № 3. - P. 205-215.

66. Cesarone C.F., Bolognesi C., Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. // Anal. Biochem.-1979. -V. 100.-P. 188-197

67. Chen Y., Cohen M.D., Snow E.T., Costa M. Alteration in restriction enzyme digestion patterns detects DNA-protein complexes induced by chromate. // Carcinogenesis. -1991. V. 12. - P. 1575-1580

68. Chiu S.-M., Socany N.M., Friedman L. R., Oleinick N.L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-proteincrosslinks in Chinese hamster cells. // Int. J. Radiat. Biol. 1984. - V. 46. -P. 681-690.

69. Chiu S.M., Friedman L.R., Sokany N.M., Xue L.Y. Nuclear matrix proteins are crosslinked to transcriptionally active gene sequences by ionizing radiation. // Radiat. Res. 1986a. - V.107. - P. 24-28.

70. Chiu S.M., Friedman L.R., Xue L.Y., Oleinick N.L. Modification of DNA damage in transcriptionally active vs. bulk chromatin. // Int. Radiat. Oncol. Biol. Phys. -1986b. V.12. - №8. - P. 1529-1532

71. Cicarelli R.B., Wetterhahn K.E. Nickel distribution and DNA lesions induced in rat tissues by the carcinogen nickel carbonate. // Cancer Res. -1982.-V. 42.-P. 3544-3549.

72. Costa M. Analysis of DNA-protein complexes induced by chemical carcinogenes. // J. Cell. Biohem. 1990. - V. 44. - P. 127-135.

73. Costa M. Molecular mechanisms of nickel carcinogenesis. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1991. -V. 31. - P. 321-337.

74. Costa M., Zhitcovich A., Toniolo P. DNA-Protein Cross-Links in Welders: Molecular Implications // Cancer Res. 1993. -V. 53. - №1. - P.460-463.

75. Costa, M., Lukanova, A., Popov, T. Taioli E., Toniolo P., Zhitcovitch A. Monitoring human lymphocytic DNA-protein cross-links as biomarker of biologically active doses of chromate // Environmental Health Perspectives. 1996.-V. 104, №5, P. 917-919.

76. Cress A. Nuclear matrix proteins are covalently linked to DNA after ionizing radiation. // Radiat. Res. -1985. Abstracts. - P. 94.

77. Cress A.E., Bowden G.T. Covalent DNA-protein cross-linking occurs after hyperthermia and radiation. // Radiat. Res. -1983. -V. 95. №3. - P.610-619.

78. Datta A.K., Mistra M., North S.I., Kasprzak K. Enhancement by nicel (II) and 1-histidine of 2'-deoxiguanosine oxidation with hydrogen peroxide. // Carcinogenesis. -1992. V. 13. - P. 283- 287.

79. Davis L.G., Dibner M.D., Battey J.F. Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier Science Publishing Co., Inc., NewYork. 1986. - 388 p.

80. Farahani M.//18th Annual Sesion of the American Association for Dental Research. San-Francisco, California, USA, March 15-19,1989. I. Dent. Res. 68 (Spec.issue). -1989. P. 291.

81. Fennell, T.R. Development of methods for measuring biological markers of formaldehyde exposure // Res. Rep. Health Eff. Inst. -1994. V.67. - P. 1-26

82. Flora S., Wetterhahn K.E. Mechanisms of chromium, methabolism and genotoxicity. // Life Chem. Rep. -1989. -V. 7. P. 169 -244.

83. Fornace A.J., Kohn K.W. DNA-protein cross-linking by ultraviolet-radiation in normal human and xeroderma pigmentosum fibroblasts//Biochem. Biophys. Acta.-1976.- V.435.- №1. P.95-103.

84. Fornace A.J., Litlle J.B. DNA-crosslinking induced by X-ray and chemical agents. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V. 477. - № 4. -P.343-355.

85. Fornace A.J., Litlle J.B. DNA-protein cross-linking by chemical carcinogens in mammalian cells. // Cancer Rec. 1979. - V. 39. - № 3.-P.704-710.

86. Fornace A.J.Jr., Seres D.S., Lechner J.F., Harris C.C. DNA-protein crosslinking by chromium salts. // Chem. Biol. Interact. 1981. -V. 36. -№ 3. -P.345-354.

87. Fornance A.J. Detection of DNA single-strand breaks produced during the repair of damage by DNA-protein crosslinking agents. // Cancer Res. -1982.-V.42.-P. 145-151.

88. Giocanti N., Ekert B. Radiochemical cross-linking between proteins and RNA within 70S ribosomal particles from E. coli. // Int. J. Radiat. Biol. -1981. V. 40. - № 5. - P.507-524.

89. Grafstrom R.C., Fornance A.J., Harris C.C. Repair of DNA damage caused by formaldehyde in human cells. // Cancer Res. -1984. -V. 44. -№ 10. P. 4323-4327.

90. Greer W.L., Kaplan J.G. DNA strand breaks in murine lymphocytes induction by purine and pyrimidine analogues//Biochem. Biophys. Res. Com. 1983.-V. 115. -№3.-P. 834-840

91. Hart R.W, Hall K.Y., Daniel F.B. DNA repair and mutagenesis in mammalian cells // Photochemistry and Photobiology -1978.- Vol. 28,- P. 131-155

92. Hawkins R.B. Quantitative determination of cross-linkage of bacteriophage DNA and protein by ionizing radiation // Int. J. Radiat. Biol. 1978. - V.33. - № 5. - P. 425-441.

93. He F., Xia S.X. DNA cross-links and their biological significance in SI 80-V mouse tumour cells treated with cis- platinum.// Acta Farmacol Siu. -1987. V. 8. - № 5. - P. 468-470.

94. Jiaan D.B., Monnier V.M., Zuik M., Pomerantz J., Cruz W., Hampel N., Fogarty J., Seftel A.D. Age-related increase in an advanced glycation end product in penile tissue // Word Jornal of Urology. -1995. V.13. - №6. -P.365-375

95. Johnson K., Chan A., Hanlon S. Mixed conformations of deoxyribonucleic acid in intact chromatin isolated by various preparative methods. // Biochemistry. 1972. - V. 11. - P. 4347-4349.

96. Juhaasz P.P., Sirota N.P., Gaziev A.I. Radiation-induced dissociation of stable DNA-protein complexes in Ehrlich ascites carcinoma cells. // Int. J. Radiat. Biol. 1982. - V. 42. - № 1. - P. 13-21.

97. Kagi J.H., Schaffer A. Biochemistry of metallothionein. // Biochemistry. -1988. -V. 27.-№23.-P. 8509-8515.

98. Katsifis S.P., Kinney P.L., Hosselet S., Burns F.G., Christie N.T. Interaction of nickel with mutagens in the induction of sister chromatid in human lymphocytes // Mutat. Res. 1996. - Vol. 359. - № 1. - P. 7-15.

99. Klein C.B., Frencel K., Costa M. The role of oxidative processes in metal carcinogenesis. // Chem. Res. Toxicol. -1991. V.4. - P. 592-604.

100. Kohn K.W., Friedman C.A., Ewing R.A., Igbal I.M. DNA-chain growth during replication of asynchronous L1210 cells. Alkaline elution of large DNA segments from cells lysed on filters. // Biochemistry. 1974. - V. 13. - №22. - P.4629-4637.

101. Kohn K.W., Grimek G., Ewing R.A. Alkaline elution analysis, a new apporach to the study of DNA single-strand interuptions in cells. // Cancer. Res. 1973. - V. 33. - № 8. - P. 1849-1853.

102. Kropacova K., Misurova E., Hakova H. Protective and therapeutic effect of silymarin on the development of latent liver damage. //Радиобиология. Радиоэкология. -1998. V.38. - № 3. - P. 44-48.

103. Labarca C., Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. //Anal. Biochem. 1980. -V. 102. - P. 344-352.

104. Lai L.W., Rosenstein B.S. Induction of DNA strand breaks and DNA-protein cross-links in normal human skin fibroblasts following exposure to254 nm UV radiation.// J. Photochem. Photobiol. B. 1990. - V. 6. - № 4. -P. 395-404.

105. Lippard S.I. New chemistry of an old molecule: cis-Pt(NH3)2Cl2. // Science. 1982. - V. 218. - № 4577. -P. 1075-1082.

106. Lippard S.I., Hoeschele I.D. Binding of cis- and trans-dichlorodiamineplatinum (II) to the nucleosome core. // Proc. Nat. Acad.Sci. (USA). 1979. -V. 76. - P. 6091-6095.

107. Liu, L.F., Rowe, T.C., Yang, L., Tewey, K.M. and Chen, G.L. Cleavage of DNA by mammalian DNA topoisomerase II. // J. Biol. Chem. -1983. -V. 258.-P. 15365-15370.

108. McClellan R.O. Risk assessment and biological mechanisms: lessons learned, future opportunities // Toxicology.-1995.- V.102. №1-2. - P. 239-258

109. Mee L.K., Adelstein S.L. Radiolysis of chromatin extracted from cultured mammalian cells: Formation of DNA-protein crosslinks. // Int. J. Radiat. Biol. 1979.-V. 36. -P. 359-363.

110. Mee L.K., Adelstein S.L. DNA-protein crosslinks in gamma-irradiated chromatin. Proc. of Int. Conference on Mechanisms of DNA Damage and Repair, Gaithersberg, MD. 1985. - P. 242-244

111. Meyn R.E., Van Ankeren S.C., Jenkins W.T. The indication of DNA-protein crosslinks in hypoxic cells and their possible contribution to cell lethality // Radiation Research. 1987. - V.109. - №3. - P.419-429

112. Michel C. and Balla I. Interaction between radiation and cadmium or mercury in mouse embryos during organogenesis // Int. J. Radiat. Biol., 1987, Vol. 51, № 6, P. 1007-1019.

113. Moule I., Murean S., Autard R. Induction of cross-links between DNA and protein by PR toxin, a mycotoxin from Penicillium roquerfarti. // Mutat. Res. 1980. -V. 77. - №1. - P.79-90.

114. Moule I., Renauled N., Darraeq C., Doyce C. DNA-protein cross-linking by the mycotoxin, botryodiplodin, in mammalian cells.// Cancinogenesis.1982. V. 3.-№2. - P. 211-214.

115. Mullenders L.H.F., van Zeeland A.A., Natarajan A.T. Comparison of DNA loop size and super-coiled domain size in human cells. // Mutat. Res.1983. -V. 112. -P. 245-251.

116. Muller, M.T. Nucleosomes contain DNA binding proteins that resist dissociation by sodium dodecyl sulphate. // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1983. - V. 114. - P. 99-106.

117. Murthy K.K., Friedman L.R., Oleinick N.L., Salomon R.G. Formation of DNA-protein cross-links in mammalian cells by levuglandin E 2. // Biochemistry. -1993. -V. 32. P. 4090-4097.

118. Murray D., Meyn R. Enhancement DNA cross-linking of melpalan by misonidozole in vivo. // Brit. J. Cane. -1983. V.47. - №2. - P. 195-203

119. Niggly H.J., Cerrutti P.A. Nucleosomal distribution of thymine photodimers following far- and near- ultraviolet irradiation. // Biohem. Biophys. Res. Commun. -1982. V. 105. - P. 1215-1218.

120. Oleinick N.L., Xue L.Y., Friedman L.R., Donahue L.L., Biaglow J.E. Inhibition of radiation-induced DNA-protein cross-links repair by glutatione depletion with L-buthionine sulfoximine. // NCI Natl. Cancer Inst. Monogr. -1988. №6. - P.225-230.

121. Oleinick N.L., Chiu S.M., Friedman L.R., Ramakrishnan N., Xue L.Y. Mechanism of DNA Damage and Repair Implications for Carcinogenesis Risk Assessment (Simic M., Grossman L., Upton. A., ed.) Plenum, New York. -1986. -P. 181-192.

122. Oleinick N.L., Chiu S.M., Friedman L.R. Gamma radiation as a probe of chromatin structure: Damage to and repair of active chroromatin in the metaphase chromosome. // Radiat. Res. 1984. - V. 98. - P. 629-634.

123. Oleinick N.L., Chiu S.-M., Ramakrishnan N., Xue L.-Y. The formation, identification, and significance of DNA-protein crosslinks in mammalian cells. // Br. J. Cancer. -1987. V. 55. - P. 135-140

124. Olinski R., Briggs R.C., Stein J., Stein G. Cross-linking of chromosomal proteins to DNA in HeLa cells by UV, gamma radiation and some antitumor drugs. // Radiat. Res. -1983. -V. 86. P. 102-109.

125. Olinski R., Briggs R.S., Hnilica L.S., Stein J., Stein G. Cross-linking of chromosomal non-histone proteins to DNA by UV radiation and some antitumor drugs. // Chem. Biol. Interact. -1981. -V.34. № 2. - P. 113-183.

126. Olive P. L. DNA organization affects cellular radiosensitivity and detection of initial DNA strand breaks //Int. J. Radiat. Biol. 1992. V.62. №4, P. 389-396

127. Peak J.G., Peak M.J., Sikorzki R.S., Jones C.A. Induction of DNA-protein crosslinks in human cells by ultraviolet and visible radiations: Action spectrum. //Photochem. Photobiol. -1985. -V. 41. C. 295-301.

128. Ramakrishnan N., Chiu S.-M., Oleinick N.L. Yield of DNA-protein crosslinks in y-irradiated Chinese hamster cells. // Cancer Res. 1987. - V. 47. -P. 2032-2037.

129. Rayshell M., Ross J., Werbin H. Evidence that N-acetoxy-N-acetyl-2-aminofluorene crosslinks DNA to protein by a free radical mechanism. // Carcinogenesis. 1983. -V. 47. - P. 501-508.

130. Roberts J.J. The repair of DNA modified by cytotoxic, mugenic and carcinogenic chemicals//Advances of Radiation Biology 1978 Vol. 7.- P. 211-434

131. Roberts J.J., Thomson A.J. The mechanism of antitumor platinum compound. // Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. -1979. V. 22. - P. 71133.

132. Rojas A. and Denekamp J. Modifiers of radiosensitivity // Experimentia. -1989,- Vol. 45.-P. 41-51.

133. Ross W.E., Memillian D.R., Ross C.F. Comparison of DNA damage by mthylmelamines and formaldehyde. // J. Natl. Cane. Inst. 1981. -V. 67. -№ 1. - P. 217-222.

134. Roy M.B., Mandal P.C., Bhattacharayya S.N. Radiosensitisation of thimine by copper (II) and nickel (II) complexes of metronidasole // Int. J. Radiat. Biol. 1996. - V. 69, № 4. - P. 471-480.

135. Salnikow K., Zhitkovich A., Costa M. Analysis of the binding sites of chromium to DNA and protein in vitro and in intact cells. // Carcinogenesis. -1992. -V. 14. -P.1678-1802.

136. Shetlar M.D. Photochemical and free radical initiated reactions of 1,3-dimetylthymine with isopropanol. // Photochem. Photobiol. Rev. 1980. -V. 5. - P. 105-197.

137. Schuessler H. // Proc. 8th Intern. Congress of Radiation Reseach: Edinburg, 1987. V. 2. - P. 152-157.

138. Sharp P., Sugden В., Sambrook J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophillus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.//Biochemistry. -1973. -V. 12. -P. 3055-3058.

139. Shooter K.V., House R., Merryfield R.K. Dobins A.B. The interaction of platinum II compounds with bacteriophages T7 and R17.// Chem. Biol. Interact. -1972. -V.5. -№ 5. P. 289-307.

140. Smith K.C. A mixed photoproduct of thymine and cysteine: 5-S-cysteine, 6-hydrothymine. // Biochem. Biophis. Res. Commus. -1961. V. 8. -P.157-163

141. Smith K.C. The radiation-induced addition of protein and other molecules to nucleic acids.// Photochemistry and Photobiology of nucleic acids.- NY. 1987. - P. 187-218

142. SmithK.C. A mixed photoproduct of thymine and cysteine: 5-S-cysteine, 6-hydrothymine. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. -V. 39. - P. 1011- 1016.

143. Snyder R.D. Effects of metal treatment on DNA repair in polyamine-depleted HeLa cells with special reference to nickel // Environ. Health Perspect. 1994. - V. 102, Suppl. 3. - P. 51-55.

144. Streffer C., Muller W.U. Radiation risk from combined exposures to ionizing radiation and chemicals // Advances in Radiat. Biol. 1984. - V. 11.-P. 173-210.

145. StrnisteG.F., RallS.C. Induction of stable protein-deoxyribonucleic acid adducts in Chinese hamster cell chromatin by ultraviolet light. // Biohemistry. 1976. - V. 15. - P. 1712-1720.

146. Tsapakos M.J., Hampton Т.Н., Wetterhahn K.E. Cromium(VI)-induced DNA lessions and chromium distribution in rat kidney, liver and lung. // Cancer Res. -1983. V. 43. - P. 5662-5667.

147. Wedrichowski A., Smidt W.N., Hnilica L.S. The in vivo cross-linking of protein and DNA by heavy metals // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261, №7. -P. 3370-3376.

148. Wilkins B.J., MacLeod H.D. Formaldehyde induced DNA-protein crosslinks in E.coli//Mutat. Res. 1976. - V.36. - №1. - P. 11-16.

149. Williams J.I., Friedberg E.C. DNA excision repair in chromatin after ultraviolet irradiation of human fibroblasts in culture. // Biohemistry. -1979. -V. 18. P. 3965-3971.

150. Zhitkovitch A., Costa M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein cross-links in intact cells and in vivo // Carcinogenesis (1992), V. 13. -№8. P.1485-1489

151. Zwelling L.A., Bradley M.O., Sharkey N.A., Anderson Т., Kohn, K.W. Mutagenicity, cytotoxicity and DNA crosslinking in V-79 Chinese hamster cells treated with cis- and trans-Pt(II) diammine dichloride. // Mutat. Res. -1979. -V. 67. P. 271-280

Информация о работе

Григорьев, Михаил Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.01

Диссертация

Влияние раздельного и сочетанного воздействия ионизирующей радиации и ионов свинца на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы