Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние природных цеолитов на Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние природных цеолитов на Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

Шурубикова Анжелика Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ ЦЕОЛИТОВ НА ЗЛССИЛЯОМУСЕЗ СЕЯЕУШЛЕ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ 2004

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Восточно-Сибирского государственного технологического университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Цыренов В.Ж.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Жамсаранова С.Д. кандидат биологических наук, Никонова Т.С.

Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной биологии Бурятского научного центра СО РАН.

Защита диссертации состоится 23 сентября 2004 г. в 10м часов на заседании Региональною диссертационного совета ДМ 212.039.02 при Восточно-Сибирском государственном технологическом университете по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская 40 «В».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Восточно-Сибирского государственного технологического университета, г. Улан-Удэ.

Автореферат разослан

<¿3 лбЬйЛЬ 2004 г.

Ученый секретарь

специализированного совта

доктор технических наук

Хамнаева Н.И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В биосферном аспекте В.И. Вернадский выделял две формы материи: биологические организмы и минералы. Между двумя этими формами материи существует тесная и неразрывная связь, проявляющаяся в преобразовании одной формы в другую. Большая часть минералов поверхности Земли образована за счет минерализации живого вещества, которое в свою очередь произросло из минеральной среды. Подобная трансформация материи и энергии не может не оказывать влияние друг на друга без участия третьего компонента - воды.

Из всех известных природных минералов наибольшее влияние на организмы разных уровней организации оказывают цеолиты. В структуру природных цеолитов в основном входят соединения двуокиси кремния и алюминия, остальную часть представляют разные концентрации макро- и микроэлементов. Мозаичность вариаций элементов обусловливает неповторимость природных цеолитов и уникальность их свойств, таких как ионообменные, адсорбционные, каталитические, кристалло-морфологические и многие другие.

Проведено большое количество работ по установлению влияния природных цеолитов на макроорганизмы — растения, птиц, животных, человека. Цеолиты неоднозначно проявляют себя в отношении биологических систем. Их свойства существенно зависят от дозы внесения, степени измельчения, месторождения, физико-химических характеристик среды и многих других факторов, которые тесно переплетены друг с другом и затрудняют установление роли каждого из них. Природные цеолиты могут проявлять как стимулирующее, так и цитотоксическое действие. Механизм такой избирательности недостаточно ясен и остается предметом оживленных дискуссий, вследствие чего видится целесообразным изучение действия природных цеолитов на микроорганизмы.

Из литературных источников известно, что природные цеолиты оказывают выраженное бактерицидное или бактериостатическое действие на определенные прокариотные микроорганизмы, но их влияние на эукариотные, в частности на дрожжевые клетки, все еще остается мало изученным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являются исследования влияния природного цеолита Холинского месторождения на клетки Sac-

скаготусез cerevisiae (3. еегеу181ае) и возможности использования полученных результатов в биотехнологической промышленности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

4) исследовать влияние природных цеолитов на морфологические и физиологические характеристики 3. сегеУ151ае;

5) разработать метод получения иммобилизованных клеток 3. сегеУ151ае на цеолите;

6) оценить эффективность применения природного цеолита в бродильных процессах (на примере производства пива, хлеба).

Научная новизна. В работе впервые проведено исследование влияния ПЦ Холинского месторождения на морфо-физиологические характеристики дрожжевых клеток 3. сегеутае. Установлено стимулирующее действие ПЦ и водной вытяжки из него (ВВ) на рост дрожжевых клеток, эффективность спиртового брожения.

Показано в присутствии ПЦ и ВВ из него у 3. сегеУ151ае образование внеклеточных структур, предположительно кремниевой природы.

Разработан метод получения иммобилизованных клеток 3. сегеутае на ПЦ. Доказана принципиальная возможность и эффективность использования ПЦ в бродильных процессах (на примере производства пива, хлеба).

Практическое значение. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре «Биотехнология» по курсам: микробиология, биотехнология, иммобилизация микроорганизмов.

Результаты работы прошли практическое испытание в производстве пива на ИП Дылгырова И.С. (г. Улан-Удэ) и в производстве хлеба на ОАО «Бурятхлеб-пром» (г. Улан-Удэ).

Выполненная работа поддержана грантами «Молодые ученые республики Бурятия», 2003, 2004 гг, «Молодые ученые Восточно-Сибирского государственного -технологического университета», 2003 г.

Публикации и апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: ежегодных научных конференциях ВосточноСибирского государственного технологического университета по секции «Технология, биотехнология и оборудование пищевых и кормовых производств» (Улан-Удэ, 1998-2004); IV Региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и

рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2000); I Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы» (Москва, 2002); Общероссийской научно-практической конференции «Современные методы переработки минерального сырья» (Иркутск, 2003); Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Удэ, 2003). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и его обсуждения, выводов и библиографии, включающей 172 наименования. Работа изложена на 115 страницах компьютерного текста, содержит 13 таблиц и 17 рисунков.

Объекты и методы исследования

В работе использовали хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae (штамм ВКМ Y-542) и природные цеолиты (ПЦ) Холинского месторождения.

ПЦ относятся к каркасным алюмосиликатам с содержанием цеолита — кли-ноптилолита 60-70 % (ТУ 2163-001-1276 3074-97 «Цеолит природный - цеохол для сельскохозяйственных животных и птиц»). Цеолиты предварительно измельчали, мешировали; перед внесением в питательную среду подвергали термической обработке при 160° С в течение 30 мин.

Для культивирования S. cerevisiae использовали среду Гловера: сахароза (40 г/л), пептон (10 г/л), К2НРО4 (3 г/л), MgSO4 (5 г/л), рН - 4,6. Для приготовления твердых сред в среду Гловера добавляли агар (15 г/л). Культивирование дрожжевых организмов осуществляли на качалках (160 об/мин), а также в стационарных условиях в термостате, при температуре 28 °С.

Размеры клеток определяли с помощью окулярного микрометра МОВ-1-15, используя микроскоп PZO SK19 Биолам Р-16 (коэффициент пересчета - 0,067). Бродильную активность дрожжевых клеток определяли по интенсивности выделения углекислого газа весовым и манометрическим методами. Мальтазную активность определяли по методу, основанному на гидролизе мальтозы. Количество спирта определяли по методу Мартена.

Элементный анализ водной вытяжки из ПЦ получали при помощи квадру-польного масс-спектрометра VG PlasmaQuad 2 PQs (Британия) с индуктивно связанной плазмой, предел обнаружения 0,01 мкг/л.

Фотографии препаратов дрожжевых клеток получали при помощи микроскопа Nikon E-400 (Япония). Препараты клеток фиксировали жаром, с последующим окрашиванием простым методом, метиленовой синью в течение 3 мин.

Адсорбированные клетки на минерале изучали с помощью электронно-сканирующей микроскопии (СЕМ) на микроскопе Philips SEM 525M (Голландия). Для проведения адсорбции дрожжевые клетки трехкратно отмывали от питательной среды в физиологическом растворе, клетки вносили в колбу с содержанием цеолита (10 мл клеточной суспензии с содержанием клеток 107-108 кл/мл на 2 г цеолита), инкубировали стационарно при температуре 28° С в течение 2 ч, для усиления процесса сорбции пробы выдерживали при температуре +5° С в течение 3 ч. Объекты обезвоживали в спиртах восходящей концентрации с последующим напылением золотом.

Водную вытяжку (ВВ) из ПЦ получали настаиванием ПЦ в бистиллирован-ной воде (50 г ПЦ на 100 мл воды) при комнатной температуре (22±2°С) в течение 3 сут. Для удаления микропримеси в вытяжке, её пропускали через фильтр диаметром пор 0,2 мкм (Carning, Германия).

При разработке метода получения иммобилизованных дрожжевых клеток определяли активность сорбции по показателю адгезии «А» (разница количеств дрожжевых клеток до и после контакта с ПЦ, определенная путем количественного посева надосадочной жидкости опытного и контрольного (без сорбента) образцов на твердые питательные среды). Процесс сорбции вели по вышеописанному для электронной сканирующей микроскопии методу. После проведения адсорбции определяли прочность закрепления клеток на ПЦ по результатам количественного посева элюата, в котором отмывали клетки, на плотные питательные среды. Элю-цию проводили встряхиванием 1 г сорбента в 50 мл физиологического раствора (рН 7,2) в течение 1 часа при температуре 28°С.

ВВ из ПЦ использовали в производстве пива на стадии водоподготовки для сменных пивных дрожжей. При проведении производственных испытаний в

технологии производства пива учитывали следующие показатели: количество дрожжевых клеток, их бродильную активность, способность к флокуляции, определяли степень сбраживания пива, кислотность, содержание спирта стандартными методами, применяемыми в данном производстве.

ВВ из ПЦ использовали для водоподготовки при производстве хлеба. Исследование вели методом пробной лабораторной выпечки по ГОСТ 27669-88. При выпечке хлеба контролировали качественные показатели дрожжей, полуфабрикатов и готовой продукции стандартными методами.

Результаты исследований статистически обработаны общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М) и ошибки (т); достоверность результатов (Р) рассчитывали с помощью параметрического ^ критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

3. Влияние ПЦ на морфологические характеристики клеток S. cerevisiae

Изучение эффективности влияния ПЦ на некоторые морфологические характеристики клеток & сегеутае проводили в двух направлениях: как при непосредственном внесении ПЦ в питательную среду, так и опосредованно путем использования водной вытяжки (ВВ).

Клетки исходных & cerevisiae имеют яйцевидную форму, размером 3-8 мкм, почкуясь, располагаются по две-три клетки вместе, в то время как при внесении ПЦ в среду для клеток характерно образование фигур из четырех-шести и более клеток. При внесении крупной фракции ПЦ в питательную среду клетки приобретают-овальную или удлиненную форму. При внесении мелкодисперсных частиц ПЦ наряду с удлиненными формами клеток наблюдаются и мелкие клетки, не достигшие материнских размеров. После инкубации дрожжевых клеток с ПЦ в течение 24 час клетки, размножаясь на поверхности плотной среды, почкуются быстрее, образуя крупные колонии. На плотной среде Гловера размер колоний Х cerevisiae составил:

8,0±0,96 мм (при внесении частиц ПЦ размером 0,5-1 мм); 8,7±1,04 мм ( 2-3 мм), 6,5±0,78 мм — в контрольных образцах (без внесения ПЦ).

Установлено, что при инкубации дрожжевых клеток в ВВ без питательной среды у клеток наблюдается образование внеклеточных структур. Инкубацию дрожжевых клеток в ВВ без питательной среды проводили стационарно в термостате при температуре 28°С. Препараты готовили фиксацией клеток жаром, с последующим окрашиванием метиленовой синью в течение 3 мин. Снимки микрофотографий дрожжевых клеток представлены на рисунке 1.

Выявленные структуры не проявляются в препарате «раздавленная капля», при негативной окраске с жидкой черной тушью. Установленные образования образуются в первые же часы инкубации и сохраняются до лизиса клеток. Хорошо окрашиваются спиртовым раствором метиленовой сини. Метиленовый синий относится к окислительно-восстановительным индикаторам, при окисленной форме краситель дает синюю окраску, а при восстановленной — бесцветную. Следовательно, выявленные структуры имеют щелочные свойства. Это подтверждается качественным окрашиванием индивидуальными кислотно-основными индикаторами: бриллиантовой зеленью, фуксином основным, хлорфеноловым красным, фенолфталеином, малахитовой зеленью. Обобщая полученные результаты можно предположить, что рН образуемых структур лежит в пределах 8,5-11.

Исследуемые структуры не разрушаются при кратковременном температурном воздействии (замораживание до -1°С, нагревание до 100°С), энзиматически не разрушаются под действием комплекса ферментов панкреатина амилазы, пептида-зы, липазы, устойчивы к действию спиртов, деформируются при внесении кислот. Данные структуры не проявляются при щелочном рН среды 10-11 и при внесении плавиковой кислоты Анализируя полученные данные, можно предположить, что составной частью образуемых структур являются соединения кремния Соединения кремния с водой образуют химическую связь, которую очень трудно разорвать, это возможно в щелочной зоне рН, при этом ортокремневая кислота переходит в активный ион кремния Возможно, одной из причин неоднозначности действия ПЦ на биологические организмы является различное содержание ионов щелочных металлов в структуре ПЦ, что оказывает влияние на варьирование активных ионов кремния Возможно, этим обусловлено положительное действие модифицированных ПЦ ионами щелочных земель Исходя из полученных результатов, можно предположить о существовании биохимии кремниевых соединений в гетеротрофных организмах.

Исследование взаимодействия £ сегвугягав с ПЦ при помощи электронно-сканирующей микроскопии подтвердило образование внеклеточных структур (рис. 2)

На представленной фотографии видно, что ПЦ индуцирует у дрожжевых клеток образование структур, с помощью которых они прикрепляются к поверхности ПЦ. По аналогии с силикатными бактериями, можно предположить, что подобные структуры выделяются клетками для образования комплекса с минералом, в котором он энзиматически разрушается, что указывает на возможность клеток & cerevisiae участвовать в деструкции ПЦ.

Исходя из предположения, что на дрожжевые клетки оказывают влияние химические соединения, переходящие в ВВ из цеолита, исследовали содержание элементов в ВВ до и после контакта с дрожжевыми клетками. При исследовании содержания элементов в ВВ учитывали фоновую концентрацию элементов в биди-стиллированной воде, на которой была приготовлена вытяжка. Исследования проводили с использованием полипропиленовой посуды.

При внесении ПЦ в воду наблюдается пенообразование за счет интенсивного выделения пузырьков газа, при этом повышается температура воды на 1,5-2°С. Общая минерализация ВВ составила около 0,2 г/л, рН 7,6±0,8. Наибольшее количество элементов, перешедших в ВВ, составили ионы № - более 100 и Si - 38 мг/л. Элементы В, К, Са, I, S - перешли в меньшем количестве от 5,5 до 1,5 мг/л; концентрации Zn, P, Вг - минимальны. Благодаря широкому набору элементов в ВВ, её можно рекомендовать как источник микро- и макроэлементов для регуляции гомеостаза в живых системах.

Для определения концентрации элементов в ВВ до и после контакта с дрожжевыми клетками в ВВ вносили трехкратно отмытые от питательной среды клетки S. сегеугягав. Инкубировали при температуре 28±ГС в течение 5 ч. При определении концентрации микроэлементов в водной вытяжке после контакта с дрожжевыми клетками, её пропускали через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Для учета сухой массы дрожжей клетки высушивали при 150°С до постоянного веса (сухая масса дрожжевых клеток составила - 0,0337 г, масса водной вытяжки из ПЦ — 5,3772 г). Отмечено в ВВ после контакта с дрожжевыми клетками значительное увеличение концентраций элементов. Наибольшее количество элементов составили К, Р, Mg, Са, Zn, S — их концентрации составили от 3,300 до 0,860 мг/л. Концентрации Вг, Л1, Fe, В, Ва минимальны, 0,250-0,130 мг/л. Содержание Rb, Mn, ТС, Sг, Sc,

N1, Сг — следы. Наряду с увеличением концентраций элементов в ВВ после культивирования с дрожжевыми клетками регистрируется уменьшение в ВВ 81; I на 0,950; 0,650 мг/л соответственно.

4. Влияние ПЦ на физиологические характеристики S. сегеугягав

Влияние ПЦ на физиологические характеристики дрожжевых клеток контролировали по активности генерации и интенсивности брожения клеток (потребление мальтозы, выделение СО2, накопление спирта).

На первом этапе исследовали интенсивность роста дрожжевых клеток в зависимости от количества вносимого ПЦ в питательную среду и степени его измельчения. В работе использовали ПЦ с разными разямерами - 0,01-0,5 мм; 0,5-1 мм; 1-2 мм; 2-3 мм. Внесение ПЦ в питательную среду осуществляли непосредственно перед культивированием клеток. Исследовали влияние разных доз ПЦ, внесенного в питательную среду (1,5, 10, 15 г ПЦ на 100 мл питательной среды). Культивирование & cerevisiae осуществляли при температуре 28±1°С в течение 72 час.

Установлено неоднозначное влияние дисперсности и доз ПЦ, внесенных в среду. Положительный эффект оказывает 1 и 10 %-ная доза ПЦ в среде. Положительное влияние на рост дрожжевых клеток 1%-ной дозы ПЦ в среде, возможно, связано с эффектом малых доз. Однако для решения поставленных задач целесообразнее проводить исследования с 10%-ной дозой, поэтому дальнейшие исследования проводили с указанной дозой размерами фракций 0,01-0,5 и 2-3 мм, названные Проба «А» и Проба «Б» соответственно.

После выбора фракции и концентраций ПЦ в питательной среде, исследовали динамику роста дрожжевых клеток в стационарных условиях в термостате и в условиях аэрации на качалках (160 об/мин) при температуре 28 °С. Кривые роста Х cerevisiae показаны на рисунках 3,4.

При внесении ПЦ в питательную среду наблюдается значительное увеличение роста клеток в сравнении с контролем. В стационарных условиях после 70 час культивирования клетки, которые быши в контакте с мелкодисперсной фракцией (Проба «А»), начинали подвергаться лизису раньше контроля, а более крупная фракция (Проба «Б»), наоборот, способствовала удлинению роста. В аэробный условиях при достижении 18-го час культивирования в пробах с содержанием ПЦ в среде численность клеток начинала резко снижаться, что, возможно, обусловлено механическим повреждением клеток частицами ПЦ. Во всех случаях продолжи-

тельность лаг-фазы при внесении ПЦ в питательную среду сокращается. Возможно, ПЦ способствует улучшению газового режима, препятствует пресыщению среды углекислотой, улучшая кислородное снабжение дрожжей.

При исследовании влияния ВВ на интенсивность роста дрожжевых клеток питательную среду в опытных пробах готовили на ВВ, а контрольную - на дистиллированной воде. Культивирование дрожжевых организмов осуществляли как в условиях аэрации, так и в стационарных при температуре 28±1 °С. Полученные данные представлены на рисунках 5,6.

При использовании питательной среды, приготовленной на ВВ, рост дрожжевых клеток выше, чем на дистиллированной воде. Однако результаты ниже данных, полученных при внесении частиц цеолита в среду. Это указывает на то, что при непосредственном контакте клеток с минералом стимулирующее действие оказывают не только соединения, переходящие в водную вытяжку, но и сама поверхность природного цеолита.

Одновременно с изучением динамики роста дрожжевых клеток контролировали мальтазную активность, выделение СО2 и накопление спирта. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели спиртового брожения 5. сегеушае в среде с использованием водной

вытяжки и с внесением частиц цеолита (М±т, п=10)

С02 в г на 100 мл в г на 100 мл среды

№ Среда продолжительность брожения, сут. н о. 1 О Й « 5 "

1 2 3 4 7 О

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 Контроль 1,2± 0,14 4,6± 0,55 5,56± 0,67 5,8± 0,70 5,83± 0,71 6,25± 0,75 4,12± 0,5

2 Питательная среда, приготовленная на ВВ 1,7± 0,20 4,8± 0,58 5,85± 0,70 5,87± 0,70 5,9± 0,71 6,3 2± 0,76 4,31± 0,51

3 Проба «А» 2,8± 0,34 6,4± 0,77 6,9± 0,83 7,15± 0,86* 7,15± 0,86* 7,57± 0,91* 2,57± 0,31*

4 Проба «Б» 3,0± 0,36 6,1± 0,73 6,8± 0,82* 6,9± 0,83* 6,95± 0,83* 7,48± 0,89* 2,54± 0,30*

Примечание: * - здесь и далее различия между опытом и контролем достоверны по сравнению с контролем при Р 5 0,05.

Внесение в питательную среду ПЦ интенсифицирует активность выделения СО2. Причем этот показатель изменяется в зависимости от степени дисперсности частиц минерала: при внесении измельченных частиц пробы «А» интенсивность брожения выше, чем при внесении крупных частиц пробы «Б». При использовании ВВ для приготовления питательной среды бродильная активность дрожжевых клеток выше в сравнении с питательной средой, приготовленной на дистиллированной

14

воде. Внесение ПЦ в культуральную среду приводит к повышению выхода спирта, более полному потреблению углеводов из питательной среды, что также зависит от степени его дисперсности. Более интенсивное влияние оказывает непосредственный контакт дрожжевых клеток с ПЦ, чем при использовании ВВ. Полученные данные свидетельствуют, что ПЦ и ВВ из него оказывают стимулирующее действие на метаболические процессы, протекающие в дрожжевых клетках.

ПЦ обладают ионообменными свойствами, поэтому при контакте со средой культивирования, они могут изменять окислительно-восстановительный потенциал среды (ОВП). Изменение ОВП исследовали в стационарной фазе роста дрожжевых клеток, через 24 часа. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Зависимость ОВП среды от условий культивирования и степени дисперсности ПЦ (М±ш, п=8)

Пробы Культивирование в стационарных условиях Культивирование в условиях аэрации

рн Eh, мВ гН2 рн Eh, мВ гН2

I 2 3 4 5 6 7

Контроль 7,6± 0,8 288 ± 29 24,53 ± 3 5,4 ± 0,5 128 ± 15 15,21 ±1,8

Проба«А» 8,2 ± 0,8* 240 ±24* 24,68 ± 3 6,3 ± 0,6* 166 ± 19* 18,32 ± 2,2

Проба «Б» 8 ± 0,8* 260 ±26* 21,52 ±2,6 6,2 ± 0,6* 156±19* 17,78 ± 2,1

Внесение в питательную среду частиц цеолита сдвигает рН среды в щелочную сторону. Внесение мелкодисперсных частиц минерала - Проба «А», понижает редокс-потенциал среды, что приводит к увеличению в среде количества восстановленных веществ. При внесении крупных фракций - Проба «Б», повышается редокс-потенциал, что приводит к увеличению в среде окисленных веществ. Таким образом, вероятно, увеличение поверхности ПЦ способствует анаэробным процессам, протекающим в дрожжевых клетках, а уменьшение, наоборот — аэробным.

При микрокопировании окрашенных качественными реакциями препаратов в дрожжевых клетках отмечается более интенсивное накопление гранулярных ком-

понентов протоплазмы - гликогена и волютина, как при внесении ПЦ в среду куль тивирования, так и при использовании ВВ из него, в сравнении с контролем.

3. Разработка метода получения иммобилизованных дрожжевых клеток на природном цеолите

Адсорбцию дрожжевых клеток на поверхности ПЦ рассматривали при помощи электронно-сканирующей микроскопии (рис. 7)

Рис 7. Фотография адсорбции на поверхности природного цеолита (СЕМ)

Адсорбция клеток на единицу поверхности ПЦ высока. Дрожжевые клетки неравномерно закрепляются на поверхности, в микротрещинах, в микропорах ПЦ. Адсорбируются не только материнские клетки, но и дочерние — почки. Некоторые дрожжевые клетки прикрепляются за счет установленных ранее внеклеточных структур. Следует отметить, что взаимодействие ПЦ с 3 сегвугягав проводили без применения приемов, основанных на снижении электростатического барьера путем обработки клеток или сорбентов реагентами, например, растворами солей алюминия, железа, кальция, которые используются для повышения эффективности закрепления клеток при иммобилизации.

Условия адсорбции дрожжевых клеток на ПЦ использовали в разработке метода получения иммобилизованных клеток. Учет концентрации дрожжевых клеток до и после контакта с ПЦ осуществляли путем количественного посева надосадоч-ной жидкости опытных и контрольных (без сорбента) образцов на твердые среды. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Сорбция БассИаготусез сегЫя1ае природными цеолитами (М±ш, п=10)

Наименование ОМЧ микроорга- Показатель ОМЧ

образца низмов адгезии, А (%) элюата

1 2 3 4

Проба «А» (0,673 ± 0,08) • 105 99,1 ± 7,9* (0,053 ± 0,01) • 105

Проба «Б» (5,4 ± 0,65) • 105 92,84 ±7,43* . (0,098 ± 0,01) -10'

Контроль (37,8 ±4,5) • 105 ... (75,6 ±9,1)-105

При анализе степени иммобилизации дрожжевых клеток на ПЦ установлено, что показатель адгезии достигает 92,84% для крупной фракции 2-3 мм (Проба «Б») и 99,1% - для мелкодисперсной 0,1-0,5 мм (Проба «А»).

Исследовали прочность закрепления дрожжевых клеток в зависимости от степени дисперсности ПЦ. Показатель десорбции для Пробы «А» составил 21,6%, а для Пробы «Б» - 28,4%. Из полученных данных можно сделать вывод, что на степень адсорбции дрожжевых клеток оказывает влияние величина поверхности сорбента. Количество закрепленных дрожжевых клеток прямо пропорционально суммарной величине поверхности ПЦ и увеличивается с уменьшением его размеров.

В дальнейших исследованиях определили степень адсорбции дрожжевых клеток в зависимости от фазы роста. Для испытаний были взяты дрожжевые клетки. на разных фазах роста: в логарифмической фазе роста (2 часа); в экспоненциальной фазе роста (24 часа); в стационарной фазе роста (48 часов). Показатель адгезии клеток в лаг-фазе ниже в сравнении с другими фазами. Наибольшая адсорбция наблюдается при использовании клеток в экспоненциальной фазе роста. Степень адсорб-

ции находится в прямой зависимости от площади поверхности ПЦ с увеличением поверхности минерала: увеличивается показатель адгезии клеток.

При исследовании длительности хранения иммобилизованных дрожжевых клеток образцы оставляли на хранение в течение 30 суток при температуре 20° С. Изначально вносимое количество дрожжевых клеток принимали за 100%. Результаты изучения динамики жизнеспособности иммобилизованных дрожжевых клеток представлены на рисунке 8.

Активность дрожжевых клеток на поверхности ПЦ сохраняется в течение 9 суток, после этого периода показатель жизнеспособности резко снижается. Из результатов по показателю жизнеспособности можно сделать вывод, что внесение ПЦ не вызывает токсического действия на клетки.

Одновременно с показателем жизнеспособности определяли активность образования спирта. Наибольшее количество спирта дрожжевыми клетками образуется в первые 9 суток. Клетки остаются жизнеспособными, но выход спирта резко снижен. Поэтому рекомендуемый срок хранения иммобилизованных препаратов дрожжевых клеток на природном цеолите до 9 суток.

5. Применение природных цеолитов в бродильных производствах

Изучена возможность использования ПЦ на стадии водоподготовки при производстве пива, в процессе обработки сменных пивных дрожжей. Сменные дрожжи заливали ВВ из цеолита в соотношении 1 : 1 (10 см3 жидких сменных дрожжей и 10 мл ВВ) - опытный образец. Контролем служила дистиллированная вода, используемая на данной стадии в технологии производства пива.

Полученные данные показали положительное влияние ВВ из ПЦ на технологические характеристики пива. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Технологические характеристики дрожжей и целевого продукта (М±ш, п=10)

Показатели Контроль Опыт

1 2 3

Бродильная активность дрожжей: манометрическим методом, мл. 24,0 ±2,5 25,8 ±2,6*

весовым, г 7,2 ±0,8 10,4 ± 1,0*

Количество дрожжевых клеток, через 3 сут (320±38)*106 (400 ±42) МО6

Способность к флокуляции

Высота осадка: до / после брожения 30,0/30,0 30,0*/30,0*

Объем осадка: до / после брожения 235,5/235,5 235,5*/23,5*

Степень сбраживания пива 36, 7 ±4,0 45,8 ± 5,0*

Кислотность пива 1,7 ±2,0 1,7 ± 2,0*

Содержание спирта в пиве, % 2,5 ± 0,8 3,3 ± 1,2

Содержание мертвых клеток 30,2 ±3,0 30,2 ± 3,0

до / после брожения, % /36,5 ±3,6 /31,6 ±3,2

Установлено положительное влияние ВВ из ПЦ на кислотность, степень сбраживания, содержание спирта и качество пива, которое длительный период остается стабильным. Использование данного способа активации пивных дрожжей, позволяет получить дрожжи с повышенной бродильной активностью, что приводит

к сокращению длительности процесса главного брожения пивного сусла без существенных капитальных вложений.

При исследовании влияния ВВ из ПЦ на некоторые свойства хлебопекарных дрожжей Засскаготусв! сегеу181ае. В контрольном образце для выпечки хлеба использовали дистиллированную воду, а в опытном образце ВВ из ПЦ (табл. 6).

Таблица 6

Технологические характеристики сырья и готовой продукции (М±ш, п=9)

Показатели Опыт Контроль

Характеристика дрожжей

Массовая доля влаги дрожжей, % 75,0 ±6,8 75,0± 6,8

Подъемная сила, мин 24,1 ±2,3 27,9 ±2,6*

Мальтазная активность, мин 78,0 ±7,9 84,0 ±8,1*

Характеристика теста (мука 1 сорт)

Продолжительность брожения, час 2,3 ± 0,3 2,4 ± 0,3*

Кислотность, °Н 4,1 ±0,4 4,2 ± 0,4*

Характеристика хлеба

Удельный объем, см3/100 385,0 ± 21,0 365,0 ±22,0*

Пористость, % 73,0 ±7,0 70,0 ±7,0

Массовая доля влаги мякиша, % 42,0 ±4,1 42,0 ±4,1

Кислотность мякиша, °Н 3,8 ±0,4 3,9 ±0,4*

Опытный хлеб отличается ярко выраженный окраской корки, имеет равномерную тонкостенную пористость и более эластичный мякиш по сравнению с контрольными показателями, больший объем готовых изделий, лучший вкус и аромат.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности и эффективности использования ПЦ Холинского месторождения и ВВ из него в бродильной промышленности для активации дрожжевых клеток и улучшению технологических показателей готовой продукции.

выводы

1. Природные цеолиты и водная вытяжка из него оказывают стимулирующее действие на рост S. сегеугягав, способствуют: повышению их бродильной активности; накоплению углекислого газа, спирта в среде; более полному потреблению клетками углеводов.

2. Установлено влияние природного цеолита на физиологические характеристики & cerevisiae в зависимости от дозы и дисперсности.

3. В присутствии природного цеолита и водной вытяжки из него у & cerevisiae наблюдается образование внеклеточных структур, предположительно кремниевой природы.

4. Установлено при инкубации дрожжевых клеток в водной вытяжке из природного цеолита в течение 5 часов, в вытяжке увеличение количества химических элементов наряду с уменьшением кремния, йода.

5. Разработан метод получения иммобилизованных дрожжевых клеток на природном цеолите.

6. Показана эффективность использования водной вытяжки из цеолита в процессе производства пива, хлеба. При этом отмечается уменьшение длительности брожения, улучшение органолептических и физико-химических характеристик готового продукта.

Основные публикации по теме диссертации

1. Дэбэева (Шурубикова) А.А., Инешина Е.Г., Матуев А.С., Цыренов В.Ж., Зон-хоева Э.Л. Влияние природных цеолитов на рост хлебопекарных дрожжей // Сб. науч. трудов. Сер. «Технология и биотехнология и оборудование пищевых производств». - Улан-Удэ: ВСГТУ, 2000. - С. 283-287.

2. Дэбэева (Шурубикова) А.А., Инешина Е.Г., Зонхоева Э.Л. Использование природных цеолитов для водоподготовки при производстве хлеба // Мат. IV региональной конференции молодых ученых. Проблемы экологии и регионального природопользования Дальнего Востока. - Владивосток: Изд-во: ВГУЭС, 2000. -С. 160-161.

3. Дэбэева (Шурубикова) А.А., Парахина Д.В., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. Использование природных цеолитов для водоподготовки при активации пивных дрожжей // Мат. научно-практич. конференции. Будущее Бурятии глазами молодежи. - Улан-Удэ, 2001. - С. 79-80.

4. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. Влияние природных цеолитов на дрожжевую клетку // Мат. I Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы». - М.: Максима, 2002. - С. 255.

5. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. О биологическом действии природных цеолитов на дрожжевые клетки // Сб. науч. трудов. Сер. «Технология и биотехнология и оборудование пищевых производств». - Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. - С. 133-135.

6. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. Влияние природных цеолитов на рост дрожжевых клеток ЗассНаготусея сегеутае II Мат. II Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы». - М.: Максима, 2003. - С. 245.

7. Шурубикова А.А., Фалилеева О.Ю., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. Исследование возможности. использования природных цеолитов для иммобилизации микроорганизмов // Мат. Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири». - Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. — С. 1820.

8. Шурубикова А.А Влияние микроэлементов входящих в состав природных цеолитов на дрожжевые клетки // Вестник ВСГТУ. - Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. - С. 71-75.

9. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Матуев А.С., Цыренов В.Ж. Изучение активации хлебопекарных дрожжей природными цеолитами // Мат. Общероссийской научно-практической конференции «Современные методы переработки минерального сырья». - Иркутск: ИГУ, 2003. - С. 32-35.

10. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж. О перспективе использования водного экстракта из природного цеолита для лечебно-профилактических целей // Актуальные вопросы хирургии. - Улан-Удэ: БГУ, 2003. - С. 47-55.

11. Шурубикова А.А., Инешина Е.Г., Цыренов ВЖ. Применение природных цеолитов для адсорбции дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae // Вестник БГУ. - Улан-Удэ: БГУ, 2003. - С.141-148.

Выражаю искреннюю признательность кандидату биологических наук, доценту Инешиной Е.Г. за оказанную многогранную помощь в проведении всех этапов работы над представленной диссертацией.

1155 0«

Подписано в печать 21.08.2004 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ № 79.

Отпечатано в изд-ве «Феникс» 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой,3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шурубикова, Анжелика Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Биологическая активность природных минералов.

1.2. Взаимодействие минералов с микроорганизмами.

1.3. Минералы и микроэлементы в спиртовом производстве

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние природных цеолитов на Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность темы. Жизнь на Земле - это непрерывные динамичные процессы, протекающие при участии двух форм материи: биологических организмов и минералов /25,26/. При этом организмы умирают, а их мертвая (косная) материя в большей своей части минерализуется, образуя биогенные минералы. В биосфере есть и небиогенные минералы, которые образовались без участия живого вещества, они находятся на глубине 3-5 км.

Основными составляющими биосферы являются две формы материи -живые организмы и биогенные минералы, образованные из косной материи этих организмов. Подобная трансформация материи и энергии не может не оказывать влияние друг на друга.

Из всех известных природных минералов наибольшее влияние на организмы разных уровней организации оказывают цеолиты. В структуру природных цеолитов, в основном, входят соединения двуокиси кремния и алюминия, остальную часть представляют разные концентрации макро- и микроэлементов. Мозаичность вариаций элементов обусловливает неповторимость природных цеолитов и уникальность их свойств, таких, как ионообменные, адсорбционные, каталитические, кристалломорфологические и многие другие.

Проведено большое количество работ по установлению влияния природных цеолитов на макроорганизмы - растения, птиц, животных, человека. Цеолиты неоднозначно проявляют себя в отношении биологических систем. Их свойства существенно зависят от дозы внесения, степени измельчения, месторождения, физико-химических характеристик среды и многих других факторов, которые тесно переплетены друг с другом и затрудняют установление роли каждого из них. Природные цеолиты могут проявлять как стимулирующее, так и цитотоксическое действие. Механизм такой избирательности недостаточно ясен и остается предметом оживленных дискуссий.

Из литературных источников известно, что природные цеолиты оказывают выраженное бактерицидное или бактериостатическое действие на определенные прокариотные микроорганизмы, но их влияние на эукариотные, в частности на дрожжевые клетки, все еще остается мало изученным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являются исследования влияния природного цеолита Холинского месторождения на клетки Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) и оценке возможностей использования результатов в биотехнологической промышленности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) исследовать влияние природных цеолитов на морфологические и физиологические характеристики S. cerevisiae;

2) разработать метод получения иммобилизованных клеток S. cerevisiae на природном цеолите;

3) оценить эффективность применения природного цеолита в бродильных процессах (на примере производства пива, хлеба).

Научная новизна. В работе впервые проведено исследование влияния природного цеолита Холинского месторождения на морфо-физиологические характеристики дрожжевых клеток S. cerevisiae. Установлено стимулирующее действие природного цеолита и водной вытяжки из него на рост дрожжевых клеток и эффективность спиртового брожения.

Показано образование внеклеточных структур у S. cerevisiae в присутствии природного цеолита и водной вытяжки из него, предположительно кремниевой природы.

Разработан метод получения иммобилизованных клеток S. cerevisiae на природном цеолите. Показана принципиальная возможность и эффективность использования природного цеолита в бродильных процессах (на примере производства пива, хлеба).

Практическое значение. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре «Биотехнология» по курсам: микробиология, биотехнология, иммобилизация микроорганизмов.

Результаты работы прошли практическое испытание в производстве пива, акт испытания от 20.02.2004 г. (приложение 1), и в производстве хлеба, акт испытания от 26.03.2004 г. (приложение 2).

Выполненная работа поддержана грантами «Молодые ученые Республики Бурятия», 2003, 2004 гг.; «Молодые ученые Восточно-Сибирского государственного технологического университета», 2003 г.

Публикации и апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Восточно-Сибирского государственного технологического университета по секции «Технология, биотехнология и оборудование пищевых и кормовых производств» (Улан-Удэ, 1998-2004); IV региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2000); I Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы» (Москва, 2002, 2003); Общероссийской научно-практической конференции «Современные методы переработки минерального сырья» (Иркутск, 2003); Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Удэ, 2003). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Выражаю искреннюю признательность кандидату биологических наук, доценту Инешиной Елене Григорьевне за многогранную помощь в проведении всех этапов работы над данной диссертацией.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шурубикова, Анжелика Анатольевна

выводы

1. Природный цеолит и водная вытяжка из него оказывают стимулирующее действие на рост S. cerevisiae, способствуют повышению их бродильной активности; накоплению углекислого газа, спирта в среде; более полному потреблению клетками углеводов.

2. Исследовано влияние природного цеолита на физиологические характеристики S. cerevisiae в зависимости от дозы и дисперсности.

3. В присутствии природного цеолита и водной вытяжки из него у S. cerevisiae наблюдается образование внеклеточных структур.

4. Определен химический состав элементов в водной вытяжке из природного цеолита, после инкубации в ней дрожжевых клеток. Установлено в вытяжке увеличение концентраций элементов, наряду с уменьшением кремния, йода.

5. Разработан метод получения иммобилизованных дрожжевых клеток на природном цеолите.

6. Показана эффективность использования водной вытяжки из цеолита в процессе производства пива, хлеба. При этом отмечаются уменьшение длительности брожения, улучшение органолептических и физико-химических характеристик готового продукта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шурубикова, Анжелика Анатольевна, Улан-Удэ

1. Адгезия патогенной микрофлоры на угольных сорбентах / Григорьев А.В., Картель Н.Т., Бондаренко В.М. и др. // Микробиология. 1988. -№ 7.-С. 11-13.

2. Айлер А. Химия кремнезема. М.: Наука, 1964. - Т. 1, Т. 2. - 1004 с.

3. Александров В.Г, Зак Г.А. Бактерии, разрушающие алюмосиликаты // Микробиология. 1950. - 19, вып. 2. - С. 10-17.

4. Александров В.Г. Силикатные бактерии. — М.: Изд-во сельскохозяйственной литературы, 1953. 116 с.

5. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования. — Л.: Наука, 1980.-186 с.

6. Аристовская Т.В., Дараган А.Ю., Зыкина Л.В., Кутузова Р.С. Микробиологические факторы миграции некоторых минеральных элементов в почвах // Почвоведение. 1969. - № 9 - С. 95-104.

7. Аристовская Т.В., Кутузова Р.С. О микробиологических факторах мобилизации кремния из труднорастворимых природных соединений // Почвоведение. 1968. - № 12. - С. 59-66.

8. Афанасьева О.В. Микробиологический контроль хлебопекарного производства. — М.: Пищевая промышленность, 1973. — 143 с.

9. Балакирева Л.М., Кантере В.М., Работнова И.Л. Определение окислительного потенциала в культуре Candida utilis II Микробиология. 1971. -40, вып. 4.-С. 740-745.

10. Баранников В.Д. Дезорация навозных стоков и продуктов их очистки // Ветеринария. 1994. - № 6. - С. 47-49.

11. И. Бгатов А.В., Бгатов В.И., Новоселова Т.И. Феномен литофагии // Природные минералы на службе здоровья человека: Мат. науч.-практ. конф. Новосибирск: Экор, 1999. - С. 40-50.

12. Белицкий И.А., Панин Jl. Е. Минералого- физико- химические свойства и биологическая активность // Физико-химические и медико-биологические свойства природных цеолитов: Сб. науч. тр. АН СССР. — Новосибирск, 1990. С. 5-13.

13. Белов Н.В. Очерки по структурной минералогии. М.: Недра, 1976. — 344 с.

14. Березина А.И., Абгафорова Г.Е. Очистка воды природными цеолитами // Железнодорожный транспорт. 1991. - № 2. - С. 55.

15. Беренштейн Б.Т. Опыт использования природных цеолитов // Методы получения и использования модифицированных природных сорбентов: Сб. ст.-М., 1988.-С. 114-120.

16. Бернал Дж. Происхождение предбиологических систем. — М.: Наука, 1966.-76 с.

17. Бернал Дж. Возникновение жизни. — М.: Мир, 1969. 391 с.

18. Берри Д. Биология дрожжей. М.: Мир, 1985. - 96 с.

19. Бершова О.И. Микроэлементы и почвенные микроорганизмы. — Киев: Наукова думка, 1967. 204 с.

20. Брек Д. Цеолитовые молекулярные сита. М.: Мир, 1976. - 365 с.

21. Булакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз // Вестник Российской академии наук. 1994. - 64, № 5. - С. 425-431.

22. Буров Г.А., Буров А.И. Применение клиноптилолита Сокирницкого месторождения в качестве подкормки поросят отъемышей // Применение природных цеолитов в птицеводстве и растениеводстве: Тр. науч.-практ. конф. — Тбилиси: Мецниереба, 1984. - С. 60-61.

23. Бурьян Н.И., Баев В.И., Кишковская С.А. Влияние избыточного давления СОг на уровень АТФ, активность гексокиназы и фосфофруктокиназы у дрожжей вида Saccharomyces vini II Прикладная биохимия и микробиология. 1976. - 12, вып. 6. - С. 863-865.

24. Великанов Л.Л. Адсорбция почвами и глинистыми минералами микроорганизмов и их метаболитов: Автореф. дис. канд. биол. наук. М, 1969. -21 с.

25. Вернадский В.И. Биогеохимические очерки. — М.: Изд-во АН СССР, 1940.-56 с.

26. Вернадский В.И. О значении почвенной атмосферы и ее биогенной структуры //Почвоведение. 1944. - № 4-5. - С. 137-141.

27. Виноградов В.В., Николаев В.Н. Влияние включения цеолитовых туфов в пищевой рацион животных на тканевое дыхание животных // Деп. рук.- Новосибирск: СО АМН СССР, 1988. 5 с.

28. Влияние природного цеолита Кохловского месторождения на некоторые стороны рубцового пищеварения у овец / Караджян A.M., Чиркинян А.Г., Геворкян Г.А. и др. // Там же. С. 28-30.

29. Волкова Л.П., Булах Г.А., Данилова Л.А., Литовченко Г.Н. Воздействие микроорганизмов на нефелин // Изв. АН СССР. Сер биол. 1975. - № 6. -С. 913-917.

30. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1981. - 570 с.

31. Воронков М.Г., Зелчан Г.И., Лукевиц Э.Я. Кремний и жизнь. Рига: «Зинатне», 1978. - 588 с.

32. Воронков М.Г., Скоробогатова В.И., Вугмейстер Е.К., Макарский В.В. Кремний в нуклеиновых кислотах // ДАН СССР. — 1975. 220, № 3. — С. 723-725.

33. Врзгула JI. Изучение и использование природных цеолитов в животноводстве Чехословакии // Природные цеолиты: Тр. IV Болгар.-Совет. симп. (Бургас, 3-7 июня 1985 г.). Бургас: София, 1986. - С. 446-452.

34. Высоцкий А.В., Каменев В.П. Природные цеолиты Восточной Сибири в сельском хозяйстве Братского региона // Природные цеолиты в народном хозяйстве России: Тез. док. междунар. науч.-практ. конф. (Иркутск, 30 сен. 4 окт. 1996). - Иркутск, 1996. - С. 40-41.

35. Высоцкий 3.3., Дивнич Л.Ф., Поляков М.В. Влияние растворенных фор-мователей на образование специфически адсорбированного силикагеля // Докл. АН СССР. 1962. - 146, № 3. - С. 707-709.

36. Высоцкий 3.3., Дивнич Л.Ф., Поляков М.В. Влияние растворенных фор-мователей на образование специфических адсорбционных свойств поверхности силикагелей // ДАН СССР. 1961. - 139, № 6. - С. 1400-1402.

37. Гамидов М.Г. Эффект использования цеолитов Приамурья при желудочно-кишечных болезнях животных и птиц: Дис. д-ра. вет. наук — Улан-Удэ: БГСХА, 2004. 543 с.

38. Гинзбург И.И. Вопросы энергетики реакций процессов выветривания некоторых алюмосиликатов // Кора выветривания. — М.: Изд-во АН СССР, 1963.-вып. 5.-С. 87-119.

39. Голубович В.Н., Ховрычев М.П., Работнова И.Л. Связывание ионов серебра клетками Candida utilis II Микробиология. 1976. - 45, вып. 1. - С. 119-121.

40. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии. -М.: Высш. Шк., 1974. 288 с.

41. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высш. Шк, 1984. — 256 с.

42. Блинов Н.П., Юрлова Н.А. Изучение химического состава клеток Aureobasidium (Pullularia) pullulans II Микробиология. — 1976. — 45, вып. 1.-С. 111-115.

43. Ермолова А.А. Применение цеолитов в сельском хозяйстве (обзор) // Химия в сельском хозяйстве. — 1987. 25, № 5. — С. 39-43.

44. Ершова А.Т., Кигличенко Е.Н., Михайлов В.И. Использование клиноп-тилолита Холинского месторождения для удаления ионов аммония из техногенных вод // Химия и технология воды. 1991. — 13, № 1. - С. 6568.

45. Жвирблянская А.Ю. Микробиологический контроль производства пива и безалкогольных напитков. М.: Пищевая промышленность, 1970. — 270 с.

46. Забродский А.Г., Мовчан А.А. О влиянии адсорбентов на спиртовое брожение // Биохимия. 1952. - 17, вып. 5. — С. 513-520.

47. Закрепление пивоваренных дрожжей на полимерных материалах / Кол-пакчи А.П., Исаева B.C., Жвирблянская А.Ю. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1976. - 12, № 6. - С. 866-870.

48. Зверева Л.Ф., Немцова З.С., Волкова Н.П. Технология и технохимиче-ский контроль хлебопекарного производства. М.: Пищевая промышленность, 1983. - 417 с.

49. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: МГУ, 1973. - 423 с.

50. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Московского университета, 1978. - 256 с.

51. Звягинцев Д.Г., Перцовская А.Ф., Яхнин Е.Д., Авербах Э.И. Определение величины адгезии клеток микроорганизмов к твердым поверхностям //Микробиология.-1971.-2, вып. 6. С. 1024-1028.

52. Зыкина JI.B. Разложение минералов под влиянием Aspergillus niger II Почвоведение.-1982.-№ 1.-С. 131-138.

53. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмосиликатных стекловолокнах / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, А.Б. Ефремов и др. // Биотехнология. 1986. - № 3 . - С. 66-69.

54. Иммобилизованные клетки в биотехнологии / Синицин А.П., Райнина Е.И., Бачурина Г.П. и др. Пущино: Изд-во науч. центра биоисследований АН СССР, 1987. - С. 86-95.

55. Информационный отчет о результатах изучения возможностей использования цеолитовых туфов Сибири в птицеводстве / Шадрин A.M., Бе-лицкий И.А., Николаев В.Н. и др. Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1986. -26 с.

56. Использование природных цеолитов в кормлении крупного рогатого скота / Гарсиа Г., Элиас А., Вале М. и др. // Применение природных цеолитов в животноводстве и растениеводстве: Тр. науч.-практ. конф. — Тбилиси: Мецниереба, 1984. С. 31-33.

57. Исследование возможности замены фосфатов цеолитами в синтетических моющих средствах / Гладкий Ф.Ф., Ющенко В.А., Киркач Л.И. и др. // Сообщение III. деп. сб. (рук.) УКРНИИНТИ 1694УК-85,19850806, 1985.- 10 с.

58. Калюжнов В.Т., Злобин И.Е., Никулина Л.Г. Физиологическое обоснование включения цеолитов в рацион птицы // Использование цеолитов Сибири и Дальнего Востока в сельском хозяйстве. Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1988. - С. 54-59.

59. Калюжный М.Я. Влияние адсорбции на размножение и брожение, вызываемое дрожжами // Микробиология. 1957. - 26, вып. 3. - С. 346-351.

60. Камай Г.Х., Клабуновский Е.И., Гатилов Ю.Ф., Ходаков Г.С. Разделение четвертичных арсониевых соединений на оптические антиподы путем асимметрической адсорбции на природных дисимметрических адсорбентах // ДАН СССР. 1961. - 139, № 5. - С. 1112-1113.

61. Картель, Н.Т., Стрелко В.В., Кабакчи A.M. Исследование особенностей радиационно-химического синтеза аминокислот из смеси простейших газов в поверхностном слое адсорбентов // Теоретическая и экспериментальная химия. 1976. - 12, № 1. — С. 33-40.

62. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев: Наукова думка, 1991. — 328 с.

63. Кирова К.А., Слюсаренко Т.П. Руководство к практическим занятиям по микробиологии пищевых производств. — М.: Пищепромиздат, 1961 — 322 с.

64. Ковальский В.В., Боровик-Романова Т.Ф., Летунова С.В., Гинзбург Е.О. Некоторые данные о содержании микроэлементов в микроорганизмах // Микробиология. 1965. - 34, вып. 3. - С. 403-406.

65. Ковальский В.В., Летунова С.В. Значение иловой микрофлоры в миграции кобальта и приспособление микроорганизмов к среде в биогеохимических провинциях с различным содержанием кобальта // Докл. АН СССР. 1959. - 126, № 1. - С. 167-170.

66. Колодкин A.M. Микроэлементы молока и их влияние на качество молочной продукции. Иркутск: Изд-во Иркутского университета, 1985. — 283 с.

67. Колпакчи А.П., Исаева B.C., Жвирблянская А.Ю., Казанцев Э.Н., Серова Е.Н., Раттэль Н.Н. Закрепление пивоваренных дрожжей на полимерных материалах // Прикладная биохимия и микробиология. — 1976. 12, вып. 6.-С. 866-870.

68. Комарова Л.И. Влияние твердых частиц, перемешивания и температуры на спиртовое брожение // Микробиология. 1951. - 20, вып. 2. - С. 140149.

69. Кориневский А.А., Авакян З.А. Каравайко Г.И. Микробиологическая деструкция сынныритов // Микробиология. 1992. — 61, вып. 6. - С. 1011-1017.

70. Красильников Н.А. Роль микроорганизмов в выветривании горных пород. I. Микрофлора поверхностного слоя скальных пород // Микробиология. 1949. - 18, вып. 4. - С. 318-323.

71. Красильников Н.А. Роль микроорганизмов в выветривании горных пород. И. Очаговое распространение микроорганизмов на поверхности скальных пород // Микробиология. 1949. — 18, вып. 6. — С. 492-497.

72. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов / Грачев И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. 240 с.

73. Лили В., Барнет Г. Физиология грибов. М.: Изд-во Иностранной литературы, 1953. — 532 с.

74. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. -447 с.

75. Любарская Г.А., Кирикилица С.И., Андреев П.И., Мочалов А .Я. К вопросу о микробиологическом разложении каолинита // Геол. журн. — 1981.-41, №5.-С. 90-97.

76. Матвеева JI.A. Экспериментальные исследования процессов выветривания // Кора выветривания. М.: Наука, 1974. — вып. 14. - С. 227-239.

77. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. Санкт-Петербург: Наука, 1994. -452 с.

78. Молин Ю.Н., Воеводский В.В. Исследование воздействия ионизирующего излучения на кварц методом ЭПР // Журн. техн. физики. 1958. -28, № 1.-С. 143-149.

79. Молчанова JI.B., Удалова С.В., Казначеев С.В. Информационно-энергетические особенности влияния «Литовит — М» на организм человека // Природные минералы в жизни высших животных и человека: Мат. науч.-практ. конф. Новосибирск: Экор, 1999. - С. 52-53.

80. Никовская Г.Н., Гордиенко А.С., Глоба Л.И. Сорбция микроорганизмов волокнистыми материалами в зависимости от заряда клеток и волокон // Микробиология. 1986. - 55, № 4. - С. 691-694.

81. Никовская Н.Г. Адгезионная иммобилизация в очистке воды // Химия и технология воды. 1989. - 11, № 2. - С. 158-169.

82. Новогрудский Д.М. Почвенная микробиология. Алма-Ата: Изд-во АН ССР, 1956.-402 с.

83. Обеззараживание питьевой воды модифицированным клиноптилолитом / Никашина В.А., Кац Э.М., Зотова В.И. и др. // Вода: экология и технология: Мат. междунар. конгр. М., 1994. - Т. 2. - С. 518-525.

84. Одегова М.А., Чевычелов А.П. Опыт использования цеолитов при выращивании цветочных культур // Природные цеолиты в народном хозяйстве России: Тез. док. междунар. науч.-практ. конф. (Иркутск, 30 сен. — 4 окт. 1996). Иркутск, 1996. - С. 48-50.

85. Опарин А.И. Жизнь, ее природа, происхождение и развитие. М.: Наука, 1968.-173 с.

86. Опарин А.И. Происхождение жизни. М.: Госполитиздат, 1945. - 102 с.

87. Офицеров Е.Н. Кремний в биосфере // Химия и жизнь. — 2002. № 7. — С. 32-36.

88. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. Общие закономерности. — М.:Наука, 1997.-273 с.

89. Паничев A.M., Гульков А.Н. Гипергенные и биогенные минералы как регуляторы и стабилизаторы биологических систем // Природные минералы на службе здоровья человека: Мат. науч.-практ. конф. Новосибирск: Экор, 1999. - С. 51-60.

90. Паничев A.M., Гульков А.Н. К авторегуляционным принципам медицины XXI века // Природные минералы в жизни высших животных и человека: Мат. науч.-практ. конф. — Новосибирск: Экор, 1999. — С. 64-67.

91. Панкратов А.Я., Григоров B.C., Кащенко P.JI. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. -М.: Пищевая промышленность, 1975. -216с.

92. Парина О.В., Патрикеев В.В., Лысенко С.В. Исследование выживаемости и физиологической активности некоторых штаммов дрожжей после длительного хранения в силикагеле // Микробиология. — 1972. 41, вып. 1.-С. 164-166.

93. Патрикеев В.В., Смирнова З.С., Максимова Г.И. Некоторые биологические свойства специфически сформированного силикагеля // ДАН СССР. 1962. - 146, № 3. - С. 707-709.

94. Перевертайло И.И. Применение цеолитов при пеговыращивании // Природные цеолиты в народном хозяйстве России: Тез. док. междунар. на-уч.-практ. конф. (Иркутск, 30 сен. — 4 окт. 1996). — Иркутск, 1996. — С. 50-52.

95. Питрюк А.П., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Влияние активности воды на развитие микроорганизмов в мелкопористых системах (каолинит) // Микробиология. 1973. - 42, вып. 2. - С. 340-346.

96. ЮЗ.Плевако Е.А. Влияние активных углей на сбраживание нормальных па-ток // Бродильная промышленность. 1934. - № 5. — С. 23-27.

97. Полынцева JI.B. Влияние модифицированного цеолита на течение патологических процессов в желудке и коже: Автореф. канд. биол наук — Улан-Удэ: БНЦ СО РАН, 2004. 25 с.

98. Постников А.В., Илларионова Э.С. Использование цеолитов в растениеводстве // Агрохимия. 1990. - № 7. - С. 113-125.

99. Пылев JI.H., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений РФ // Природные минералы в жизни высших животных и человека: Мат. науч.-практ. конф. -Новосибирск: Экор, 1999. С. 68-70.

100. Пылев JI.H., Кривошеева JI.B. Канцерогенная активность некоторых отечественных природных цеолитов и ее возможные причины // Физ.-хим. и мед.-биол. свойства природных цеолитов. Новосибирск: СО ВАСХ-НИЛ, 1990.-С. 114-136.

101. Роль микроорганизмов в разрушении сподумена / Каравайко Г.И., Круц-ко B.C., Мельникова Е.О. и др. // Микробиология. 1980. - 49, вып. 3. -С. 547-551.

102. Русских А.П., Горохов В.К., Им Мен Ок, Павлов А.Г. Использование Сахалинских природных цеолитов в кормлении цыплят-бройлеров // Применение цеолитов туфов в сельском хозяйстве. Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1986. - С. 42-46.

103. Селективность действия адсорбента, сформированного в присутствии бактерий, в отношении оптических изомеров / Патрикеев В.В., Баландин А.А., Клабуновский Е.И. и др. // ДАН СССР. 1960. - 132, № 4. - С. 850852.

104. Сендеров Э.Э., Юневич Г.В., Габуда С.П. Радиоспектроскопия твердого тела.-М.: Агропромиздат, 1967.-С. 149-151.

105. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: МГУ им. Св. Климена Охрид-ского, 1994.-288 с.

106. Слюсаренко Т.П. Лабораторные практикум по микробиологии пищевых производств. -М.: Легкая и пищевая помышленность, 1984. 208 с.

107. Соколов А.В., Замана С.П. Картофель и овощи хорошо хранить с цеолитом // Картофель и овощи. 1994. - №4. - С. 25.

108. Токсикологическая оценка цеолитовых туфов Шивыртуйского месторождениях на курах / Минина Л.А., Павленко Ю.В., Болтян В.А. и др. // Природные минералы в животноводстве и растениеводстве: Мат. науч.-практ. конф. Новосибирск: Экор, 1999. - С. 28-35.

109. Фалилеева О.Ю. Об использовании молочнокислых бактерий и природных сорбентов для получения препарата профилактического назначения: Автореф. канд. техн. наук Улан-Удэ: ВСГТУ, 1999. - 21 с.

110. Хантургаев Г.А. Использование цеолитов Бурятии для очистки сточных вод от нефтепродуктов // Комплексное использование минерального сырья. 1990. - № 2. - С. 65-68.

111. Хорунжина С.И. Биохимические и физико-химические основы солода и пива. М.: Колос, 1999. - 312 с.

112. Хорунжина С.И. Способы применения природных цеолитов в производстве пива. М.: Кемерово, 1992. - 320 с.

113. Хорунжина С.И., Егорченкова А.А., Поздняковский В.М. Применение цеолитов в производстве напитков. М.: АгроНИИТЭИПП, 1992. - 40 с.

114. Шадрин A.M., Белицкий И.Г., Болтухин В.П. Опыт применения цеолитового туфа в профилактике диареи поросят // Природные цеолиты Тр. IV болгар.-совет, симп. (Бургас, 3-7 июня 1985 г.). Бургас - София, 1986.-С. 505-508.

115. Шадрин A.M., Моловилов К.Я., Михайлов Е.Г. Влияние пегасина на пе-ревариваемость и усвояемость питательных веществ яичных кур // Применение цеолитов в сельском хозяйстве. — Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1986.-С. 36-39.

116. Шадрин A.M., Подъяблонский A.M. Использование природных цеолитов в кормлении кур-несушек // Применение природных цеолитов в птицеводстве и растениеводстве: Тр. науч.-практ. конф. Тбилиси: Мецниереба, 1984.-С. 175-178.

117. Шадрин A.M., Селятицкий Г.А., Болтухин В.П. Использование цеолито-вого туфа Пегасского месторождения в свиноводстве // Применение природных цеолитов в животноводстве и растениеводстве: Тр. науч.-практ. конф. Тбилиси: Мецниереба, 1984. — С. 45-49.

118. Шайкин В.И., Давыдова Т.И., Рягина Г.А. Оценка токсических свойств цеолита Холинского месторождения // Методология мероприятий по профилактике и ликвидации болезней сельскохозяйственных животных.- Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1995. С. 257-259.

119. Эффект последствия органо-цеолитовых удобрений / Кардава М.А., Михайлова Н.И., Цицишвили Г.В. и др. // Изв. АН ГССР. Сер. Хим. 1990.- 16, № 1.-С. 53-56.

120. Яковлев С.В., Воронов Ю.В. Биологические фильтры. -М.: Стройиздат, 1975.- 135 с.

121. Яхонтова Л.К., Зверева В.П. Основы минералогии гипергенеза: Учеб. пособие. Владивосток: Дальнаука, 2000. - 331 с.

122. Яхонтова Л.К., Нестерович Л.Г. Зона гипергенеза рудных месторождений как биокосная система. М.: МГУ, 1983. — 57 с.135.19850619 SU В 01 Д 53/26. Способ глубокой осушки газов / Моисеева В.Ф., Чернухина В.Г., Зеленцова Н.И. и др. // Патент. 1987.

123. А 1 1594216 SU С 12 N 11/00. Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих бродильной активностью / Кудряшов Н.А., Агеева Н.М., Соболев Э.М., Толмачев В.А. // Патент. 1990.

124. С 1 2084519 RU 6 С 12 N 1/18. Способ получения питательной среды для выращивания хлебопекарных дрожжей / Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Далгатова Б.И., Эфендиева Д.А., Хахилова Э.А. // Патент . 1997.

125. С 1 2188232 RU 7 С 12 N 1/18 // (С 12 N 1/18, С 12 R 1:85). Штамм дрожжей Saccharomyces oviformis Y-2635 для производства прессованных хлебопекарных дрожжей / Абрамов Ш.А., Коненко С.Ц., Исламова Ф.И., Халилова Э.А. // Патент 2002.

126. Barrer R.M. Zeolite and Clay Minerals as Sorbents and Molecular Sieves // Academic Press. 1978. - 20. - P.497.

127. Bringi V., Gale B.E. Enhanced Yeast Immobilization by Nutrient Starvation // Biotechnol. Lett. 1985. - 7, N 12. - P. 905-908.

128. Cho S.-W., Joshi J.G. Inactivation of Bakers' Yeast Glucose-6-phosphate Dehydrogenase by Aluminum // Biochem. 1989. - V. 28. - P. 3613-3618.

129. Coffey R., Gubowics T. Trends in Siliceous Builders // Chem. and Ind. . — 1990.-N6.-P. 169-172.

130. Corrien G., Blanchere H., Ramirez A. An Immobilized Yeast Fermentationth

131. Pilot Plan Used for Production of Beer // 5 Int. Ferment. Symp. Berlin, 1976. - P. 845-851.

132. D'Souza S. F., Melo J.S. Immobilization of Yeast Cells by Adhesion to Glass Surface Using Polyethylenimine // Biotechnol. Lett. 1986. - 8, N 9. - P. 643-648.

133. Duff R. В., Webley D.M., Scott R.O. Solubilization of Mineral and Related Materials by 2-ketogluconic Acid-producing Bacteria // Soil Science. 1963. -V. 95. №2.-P. 105-115.

134. Greenland D.J. The Adsorption of Sugars by Montmorillonite // J. Soil. Sci. -1956.-V. 7.-P. 329-334.

135. Haldane J.B.S. The Origin of Life. Rationalist Annual. M.: Наука, 1929. -29 с.

136. Harvey G.R., Degens E.T., Mopper K. Synthesis of Nitrogen Heterocycles on Kaolinite from C02 and NH3 // Naturwissensshaften. 1971. - 58, № 12. - P. 624-625.

137. Heacht J. Van, Bolimbo M., Rouxhet P.G. Immobilization of Saccharomyces cerevisiae by Adhesion: Treatment of the Cells by Al-ions // Biotechnology & Bioeng. — 1985. — 27, N 3. P. 217-224.

138. Heacht J.L. Van, De Bremaker M., Rouxher P. A. Immobilization of Yeast by Adhesion to a Support without use of Chemical Agents // Enzyme & Microbial Technology. 1984. - 6, N 5. - P. 221-227.

139. Hoffman H.J. Precambrian Fossils (?) near Elliot Lake, Ontario // Science. -1967.- 156.-P. 500-504.

140. Kersten W., Staudinger Hj. Zum Silikoseproblem: Schadigung der Zellatmung durch Monokieselsaure // Naturwissenschaften. — 1956. № 43. - P. 68.

141. Kiruth W., Schliproter H.V. Zum Silikoseproblem: Uber die Wirkung von Kieselsauresol und Ribonucleinsaure im Tierversuch // Naturwissenschaften. -1956.-№43.-P. 68.

142. Kunkee R.E., Ough C.S. Multiplication and Fermentation of Saccharomyces cerevisiae Under Carbon Dioxide Pressure in Wine // Appl. Microbiol. — 1966.-V. 14,N4.-P. 511-514.

143. Lahav N., Keynan A. The Influence of Bentonite and Attapulgite on the Respiration of Bacillus subtilis I I Canad. J. Mikrobiol. 1962. - V. 8. № 4. -P. 567-582.

144. Marshall K.C. Bacterial Adhesion in Natural Enviroments // Microbial Adhesion to Surfaces. London: Society of Chem. Industry, 1980. - P. 187196.

145. Marshall K.C. Interaction Between Colloidal Montmorillonite and Cells or Rhizobium Species with Different Ionogenic Surfaces // Biochem., Biophys. Acta. 1968.-V. 156.-P. 179-186.

146. Marshall K.C. Orientation of Clay Particles Sorbed on Bacteria Possessing Different Ionogenic Surfaces // Biochem., Biophys. Acta. — 1969. V. 193. — P. 472-474.

147. Marshall K.C. The Nature of Bacterium-clay Interaction and its Significance in Survival of Rhizobium Under arid Conditions // 9-th Int. Congr. Soil. Sci. Trans. (Adelaide, Australia). Adelaide, 1968. - V. 3. - P. 275-280.

148. Mozes N., Rouxhet P.G. Metabolic Activity of Yeast Immobilized as Support Monolayer // Appl. Microbiol. & Biotechnol. 1985. - 22, N 2. - P. 92-97.

149. Neuberg R.E., Sandberg M. Neue Klassen von Stimulatoren der Alkoholischen Zuckerspaltung // Biochem. Ztschr. 1921. - B. 121. - P. 645.

150. Santoro Т., Stotzky G. Sorption and Flocculation of Clay Minerals by Microorganisms and their Metabolites // Bacteriol. Proc. — 1966. N 26. — P. 124.

151. Schopf J.W., Barghoorn E.C. Microorganisms Three Billion Yeast Old from the Precambrian of South Africa // Science. 1966. - 152. - P. 758-763.

152. Schopf J.W.,Kvenvolden K.A., Barghoorn E.C. Amino Acids in Precambrian Sediments: an Assay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. - 59, (2). - P. 639-646.

153. Schwarz R. Wiss. Forschungsber. Naturwiss. Reihe. — 1958. — 66. P. 113.

154. Schwarz R., Baronetsky E. Ein chemischer Beitrag zum Silicose-Problem // Angewandte Chemie 1956. - 68. - P. 573-577.

155. Schwarz R., Baronetsky E. Zum Silikoseproblem: Uber die Einwirkung von Monokieselsaure auf Ribonucleunsaure //Naturwissenschaflen. — 1956. — № 43.-P. 68.

156. Silverman M.P. Biological and Organic Chemical Decomposition of Silicates // Biogeochem. Cycling of Mineral Forming Elements. 1979. - P. 443-445.

157. Wagner M., Schwartz W. Geomikrobiologische Untersuchungen. VIII Uber das Verhalten von Bakterien auf der Oberflache von Gesteinen und Mineralien und Inre Rolle bei der Verwitterung // Z. Allg. Mikrobiol. 1967. -V. 7. N. 1.-P.33.

158. Womack F.C., Colowick S.P. Proton-dependent Inhibition of Yeast and Brain Hexokinases by Aluminum in ATP Preparations // Biochem. 1979. — V. 76. N 10.-P. 5080-5084.

159. Wood D.A., Gibson I.L., Thompson R.N. Elemental Mobility During Zeolite Facies Metamorphism of the Tertiary Basalts of Eastern Iceland // Contribs. Mineral, and Petrol. 1976. - V. 55. - P. 241-254.

160. Zeolite as Catalysts for the Synthesis of Amino Acids and Purines / Fripiat J.J., Poncelet G., Van Asshe A.T. et al. // Clays Clay Miner. 1972. - N 20. -P. 331-340.