Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ноотропов на потенциалоуправляемые ионные каналы нейрональной мембраны

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буканова, Юлия Викторовна, Москва

российская академия медицинских наук научно-исследовательский институт мозга

Буканова Юлия Викторовна

ВЛИЯНИЕ НООТРОПОВ НА ПОТЕНЦИАЛОУПРАВЛЯЕМЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ НЕЙРОНАПЬНОЙ МЕМБРАНЫ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель д.б.н. Солнцева Е.И.

Москва 1998г.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 1

Глава 1. Обзор литературы 6

1.1. Определение понятия "ноотропы" 6

1.2. Механизмы действия ноотропов 7

1.3. Характеристика отдельных ноотропных препаратов 9

1.3.1. Пирацетам 9

1.3.2. ГВС-111 11

1.3.3. Циннаризин 12

1.3.4. Винпоцетин 12

1.4. Воздействие ноотропов на ионные каналы 14

Глава 2. Материалы и методы 23

Глава 3. Результаты исследований 27

3.1. Влияние ноотропов на высокопороговый кальциевый ток 27

3.1.1. Влияние пирацетама и ГВС-111 на lCa 27

3.1.2. Влияние винпоцетина на lCa 29

3.1.3. Влияние циннаризина на lCa 33

3.2. Влияние ноотропов на различные типы высокопороговых калиевых каналов мембраны нейрона 33

3.2.1. Различные типы калиевых каналов нейронов виноградной улитки 33

3.2.2. Влияние ноотропов на lK(Ca) 37

3.2.3. Влияние ноотропов на lK(Ca) 43

3.2.4. Влияние ноотропов на быстрый калиевый ток 47

3.2.5. Влияние винпоцетина на смешанный калиевый ток 49

3.2.6. Сходный профиль в действии разных ноотропов на ионные каналы нейронапьной мембраны 52

3.2.7. Влияние 4-АР и ТЭА на lK 53

3.2.8. Влияние дилтиазема на lK 53

3.3. Сравнительное изучение влияния винпоцетина и циклических нуклеотидов

на калиевый ток 54

3.3.1. Влияние дцГМФ на 1К 56

3.3.2. Вычисление коэффициента корреляции между эффектами винпоцетина и дцГМФ 58

3.3.3. Отсутствие аддитивности эффектов винпоцетина и дцГМФ 58

3.3.4. Влияние дцАМФ на 1К 61

3.4. Сравнительное изучение влияния

пирацетама и дцАМФ на калиевый ток 61

3.5. Исследование взаимодействия ноотропов и других антагонистов ионных каналов с

этанолом 64

3.5.1. Влияние этанола на 1к 64

3.5.2. Отсутствие взаимодействия эффектов этанола и ноотропов 65

3.5.3. Ослабление этанолом блокады калиевых

токов, вызванной дилтиаземом и ТЭА 65

Глава 3. Обсуждение результатов 73

Глава 4. Выводы 87

Список публикаций по материалам диссертации 88

Список литературы

90

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Увеличение продолжительности жизни людей в развитых странах ведет к росту доли пожилых и старых людей в обществе. К сожалению, это связано с увеличением количества пациентов, страдающих сенильной деменцей. По данным 1пеюИеп В. (1987), во второй половине 80-х 10% людей в возрасте старше 65 лет страдали деменцией средней тяжести. Продолжающийся рост числа случаев заболевания деменцией является не только медицинской, но и социальной и экономической проблемой, и, как и любое заболевание, снижает качество жизни человека. Разработка эффективных препаратов для лечения деменции является важной фармакологической и терапевтичекской целью. Хотя точная этиология сенильной деменции, включая ее наиболее тяжелую форму, болезнь Альцгеймера, остается неизвестной, прогресс в нейробиологии и молекулярной нейрохимии существенно улучшил понимание механизмов патофизиологических и нейродегенеративных процессов, лежащих в основе патологических возрастных изменений. Изучение механизмов нейродегенеративных процессов делает возможным развитие более целенаправленной терапевтической стратегии, включая разработку ноотропных препаратов.

В настоящее время известно большое количество веществ с разной химической структурой и с различными свойствами, которые обладают способностью улучшать когнитивные функции. Несмотря на то, что физиологические механизмы их влияния на обучение и память активно изучаются во всем мире и постоянно возникают все новые гипотезы, этот вопрос до сих пор остается открытым.

Одним из возможных механизмов действия ноотропов является модуляция работы ионных каналов нейрональной мембраны ДЗоиПаеу е1 а1, 1994/. Специфически влияя на определенные типы ионных каналов, ноотропы могли бы регулировать вход кальция в клетку и т.о. повышать эффективность межнейронной передачи или оказывать цитопротекторное действие, защищая клетки от кальциевой

перегрузки. В пользу этого предположения свидетельствуют данные, подтверждающие способность ноотропов модулировать работу различных типов ионных каналов /Molnar et al, 1995; Капе ko et ai, 1990; Kojima et al, 1991/, a также сообщения о том, что некоторые блокаторы ионных каналов могут влиять на память и обучение /Moller, 1993; Pucilowski, 1992; Lavretsky et al, 1992/. Данные литературы относительно влияния ноотропов на потенциалозависимые ионные каналы в основном касаются кальциевых каналов и являются весьма противоречивыми. Противоречия могут быть обусловленны выбором объекта, а также различиями в концентрациях исследуемых веществ; есть сообщения и о прямо противоположном эффекте разных концентраций ноотропов на кальциевый ток /Yoshii et al, 1994/.

Влияние ноотропов на калиевые каналы остается малоизученным. В то же время потенциалозависимые калиевые каналы крайне важны для нормального функционирования нервной клетки и могут являться важной терапевтической мишенью для различных препаратов, включая ноотропы. Нужно отметить, что и регулирование входа ионов кальция в клетку может осуществляться не только через изменение работы Са2+-каналов, но и путем модуляции работы К+~канагюв.

Кальций является важным ионом, регулирующим многочисленные внутриклеточные процессы. Необходимость строгого контроля за уровнем внутриклеточного кальция возрастает с возрастом, т.к. в результате возрастных изменений повышается чувствительность к кальцию зависимых от него процессов /Hartmann et al, 1993(a,b); Muller et al, 1996/.

Механизм влияния ноотропов на ионные каналы остается практически неизученным. Результаты немногочисленных исследований позволяют предположить сложный характер взаимодействия с вовлечением системы циклических нукпеотидов и G-белков /Yoshii et al, 1991; 1994/.

Литературные данные, касающиеся эффектов ноотропных препаратов, получены на самых разнообразных объектах. Наши эксперименты проводились на нейронах виноградной улитки. Эту модель использовали и другие авторы, изучающие

ноотропные препараты /Пивоваров и др., 1987; ОшкагсИ а!,

1987/.

Всестороннее изучение ноотропных препаратов является актуальным вопросом, которому посвящено большое количество литературы. Это и понятно, т.к. понимание механизмов действия веществ, улучшающих когнитивные функции могло бы стать ступенью к пониманию физиологических механизмов, лежащих в основе таких функций.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение влияния препаратов, обладающих ноотропными свойствами, на потенциалоуправляемые кальциевые и калиевые каналы нейрональной мембраны на модели нейронов моллюска.

В группу изучаемых препаратов входили классические ноотропы, широко используемые сегодня для терапии деменций: пирацетам, винпоцетин и циннаризин. Кроме того в работе использовали также новый препарат ГВС-111, который является пептидным аналогом пирацетама и проходит сегодня преклинические испытания / ЭегесЗетп е! а!, 1995/. Конкретные задачи исследования были следующие: -изучение влияния указанных препаратов на высокопороговый кальциевый ток (1са);

-исследование эффектов этих же препаратов при регистрации различных типов высокопорогового калиевого тока, а именно: Са ^-зависимого К+-тока (1К(Са)), К+-тока задержанного выпрямления (1К0) и быстроинактивирующегося К+-тока (1А):

-изучение эффектов ноотропов, а также некоторых классических антагонистов ионных каналов (тетраэтиламмоний, дилтиазем) на калиевые токи на фоне действия этанола;

-оценка возможного участия циклических нуклеотидов в опосредовании эффектов пирацетама и винпоцетина на калиевые токи.

Новизна полученных результатов.

На сегодняшний день в мировой литературе отсутствуют данные о влиянии пирацетама, винпоцетина, циннаризина и ГВС-111 на калиевые каналы нейрональной мембраны. В связи с этим, все наши результаты, касающиеся этого вопроса, являются новыми. Сюда относятся:

1) эффекты ноотропов на различные типы калиевых каналов;

2) сравнительное изучение влияния ноотропов и циклических нуклеотидов на калиевые токи;

3) изучение взаимодействия ноотропов и этанола, а также классических антагонистов ионных каналов и этанола при регистрации калиевых токов.

Новыми также являются результаты о влиянии ГВС-111 на кальциевый ток.

Научно-практическая значимость работы.

Представленные материалы способствуют пониманию механизмов действия ноотропных препаратов. Это может быть важно для разработки новых препаратов, а также для понимания механизмов и сущности корректируемых ими патологий.

Положения, выносимые на защиту.

Потенциалозависимые ионные каналы нейрональной мембраны являются чувствительной мишенью для ноотропных препаратов. Калиевые каналы более чувствительны к действию ноотропов, чем кальциевые каналы.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: Региональная конференция ISIN "Простые нервные системы", Пущино, 1994 г.; Международная конференция "Neurochemistry and pharmacology of drug addiction and alcoholism", С.-Петербург, 1996 г.; 5-я Восточноевропейская конференция ISIN, Москва, 1997 г.; XVII съезд Всероссийского

физиологического общества им. И.П. Павлова, Ростов-на-Дону,

1998г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ: 8 статей, 1 из которых опубликована в международном журнале, 5 тезисов

Структура и объем диссертации.

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание методики, изложение экспериментальных результатов, обсуждение результатов и выводы. Работа занимает 108 страниц, содержит 28 рисунков. Список цитированной литературы включает 219 источников.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Определение понятия "ноотропы".

Ноотролы представляют собой новый класс психотропных веществ, которые характеризуются тем, что улучшают такие интегративные функции мозга, как память, обучение и внимание при острых и хронических деменциях. Последние могут явиться следствием нарушений мозгового кровообращения, травм, интоксикаций и других органических поражений мозга/Benesova, 1994; Gabryeletal, 1994; Gouliaev et al, 1994; Mondadori, 1993/. При этом в нормальных условиях большинство ноотропов инертны и лишены токсических эффектов /Gabryel et al, 1994; Mondadori, 1993/. В поведенческих экспериментах ноотропы улучшают память и обучение у животных в тестах пассивного избегания, в лабиринтах и др., проявляя колоколообразную дозозависимость /Gouliaev et al, 1994; Mondadori, 1993/. В электрофизиологических экспериментах показано, что различные ноотропы способны усиливать LTP (длительную посттетаническую потенциацию) и восстанавливать ее после повреждений /Ishihara et al, 1989; Molnaretal, 1992, 1994/. LTP является широко распространенной экспериментальной моделью синаптической пластичности; как полагают, она имеет отношение к процессам, лежащим в основе обучения и памяти /Izquierdo, 1994; Teyler et al, 1987/.

В настоящее время известно уже большое количество веществ, имеющих разную химическую структуру и, вероятно, различный механизм действия, которые способны улучшать когнитивные функции. Разные авторы предлагают различную классификацию ноотропных препаратов. Так, Gabryel В. (1994) выделяет два основных класса ноотропов в зависимости от локализации мишеней их действия. К первому классу он относит препараты непосредственно взаимодействующие с нервными клетками. В этот класс входят пирацетам и его аналоги, 2-пирролидинон-дериваты и ноотропы с разной структурой (циннаризин, пиритинол и др.). Ко второму классу ноотропов автор относит те препараты, которые улучшают мозговые функции посредством улучшения кровоснабжения

мозга (винпоцетин, теофиллин, дигидропиридины и др.). Более подробная классификация ноотропов приведена в работе Forstl & Maitre (1989). Авторы подразделяют ноотропные препараты на следующие классы:

1. ноотропы группы пирацетама

2. препараты ко-дергокрин-типа

3. препараты типа винкамина

4. холиномиметики

5. ингибиторы холинэстеразы

6. предшественники холи на

7. психостимуляторы

8. вещества, повышающие энергетический обмен мозга

9. вазодилататоры

10. антианоксические агенты

11. витамины и родственные соединения

12. антидепрессанты, антипсихотики и а гон исты бензодиазепина

13. пептиды и ингибиторы ферментов

A. анологи АКТГ и вазопрессина

Б. тиротропин-рилизинг гормон, его аналоги

B. соматостатин, холецистокинин, нейропептид Y

Г. ангиотензин II, ингибиторы ангиотензин-

конвертирующего фермента

14. фактор роста нервов и ганглиозиды.

1.2.. Механизмы действия ноотропов.

Одним из первых объяснений механизма действия ноотропов была гипотеза, предполагающая их влияние на холинергическую систему /Benesova, 1994; Mondadori, 1993; Sarter, 1991/. Эта гипотеза зародилась после того, как были получены свидетельства участия холинергической системы в процессах обучения и памяти: был обнаружен дефицит ацетилхолинтрансферазы у больных деменцией и тот факт, что ноотропы вызывают улучшение памяти при скополамин-индуцированной амнезии, а скополамин, как известно, взаимодействует с холинергической системой /D räch man, 1977; Schindler, 1989; Hock F.J.,1995/. В пользу холинергической гипотезы говорит и усиление ноотропами

высокоаффинного поглощения холи на, описанное некоторыми авторами /Pugsley et al, 1983/, а также способность некоторых соединений этой группы ингибировать ацетилхолинэстеразу /Drukarch et al, 1987/. В то же время другие авторы считают маловероятным специфичекское участие ацетилхол и на в процессах обучения и памяти и считают его скорее вовлеченным в процессы, лежащие в основе внимания /Blokland, 1995/.

В дальнейшем, нейрохимическое изучение ткани мозга умерших от сенильной деменции показало, что при деменциях страдают и другие нейротрансмиттерные системы. Так, было обнаружено снижение уровня катехоламинов и 5-НТ вследствие патологически увеличенной активности моноаминооксидазы В- ключевого фермента в деградации этих медиаторов /Oreland et al, 1986/. Классическими представителями веществ, улучшающих моноаминергическую передачу в мозге являются э р гот - ал кал о и д-д е р и ват ы, которые вза и м оде й ст ву ют с рецепторами норадреналина, дофамина и 5-НТ, а также улучшают метаболизм, повышая утилизацию глюкозы /Markstein, 1989; Meier-Ruge, 1986/.

Данные, касающиеся вовлечения системы возбуждающих аминокислот (глутамат, аспартат) в когнитивные процессы довольно противоречивы. С одной стороны, установлено, что при деменции Альцгеймеровского типа повышается уровень глутамата в спиномозговой жидкости, что положительно коррелирует с ухудшением когнитивных функций /Pomara et al, 1992; Smith et al, 1985/. Повышенный уровень глутамата, возможно, отражает повышенную глутаматергическую активность мозга больных, что может привести к повышению входа ионов кальция через каналы NMDA-рецептора и к разрушению клеток от кальциевой перегрузки. В литературе есть данные, что некоторые ноотропы (идебенон, винпоцетин) способны защищать нейроны от глутамат-индуцированной цитотоксичности /Miyamoto et al, 1989/. С другой стороны обнаружено, что индукция LTP сопровождается усилением тока через АМРА-рецептор и сходное усиление тока вызывают ноотропы группы пирацетама; показано также, что они повышают освобождение глутамата в срезах гиппокампа /Marchi et al, 1990/.

Свой вклад в процесс старения и развития деменций вносят оксигенные свободные радикалы, которые атакуют мембраны и другие клеточные структуры, вызывая их разрушение. Обнаружено, что некоторые ноотропы обладают способностью связывать свободные радикалы и т.о. защищать клетки от их воздействия /Benesova, 1994/.

Интересно, что ноотропы группы пирацетама эффективны только при определенной концентрации стероидов в крови /Mondadori, 1993/, что вместе с известной способностью адренокортикотропного гормона и кортикотропин-рилизинг-фактора улучшать память и обучение /Chou et al, 1995; De Wied, 1974/ показывает важную роль стероидов в коррекции когнитивных расстройств.

1.3. Характеристика отдельных ноотропных препаратов.

Ниже мы приводим более подробную характеристику тех ноотропных препаратов, фармакологическая активность которых изучалась в нашей работе. Три из них (пирацетам, винпоцетин и циннаризин) широко используются в клинике; ГВС 111 в настоящее время проходит преклинические испытания.

1.3.1. Пирацетам.

2-оксо-1 -пиррол идинилацетамид

Молекулярная формула C6H10N2

Молекулярный вес 142,15

Пирацетам является основным ноотропных препаратов. Был синтезирован в 1972г. Giurgea С., который и ввел термин "ноотропы". По химической структуре пирацетам сходен с ГАМ К, однако, в организме он в ГАМ К не превращается, не изменяет ее содержания и с ГАМК-рецепторами не взаимодействует /Bering et al, 1985; Giurgea, 1976; Gamzu et al, 1989/. Пирацетам малотоксичен: в острых опытах на животных летальная доза превышает 10 г/кг при внутривенном введении, в то время как его терапевтические дозы составляют 200-500 мг/кг /Машковский, 1994/. Пирацетам широко используется в клинике при

Н С—СИ

H с с = о

2 У

¿н —С—NH