Потенциалоуправляемые кальциевые каналы: взаимозависимость ингибирования и инактивации

Бирюков, Станислав Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Потенциалоуправляемые кальциевые каналы: взаимозависимость ингибирования и инактивации
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Потенциалоуправляемые кальциевые каналы: взаимозависимость ингибирования и инактивации"

На правах рукописи

БИРЮКОВ Станислав Анатольевич

ПОТЕНЦИАЛОУПРАВЛЯЕМЫЕ КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ: ВЗАИМОЗАВИСИМОСТЬ ИНГИБИРОВАНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ.

03.00.02 «биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

ПУЩИНО 2006

Работа выполнена в Институте Фармакологии и Токсикологии Университета г. Вены, Австрия.

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук

Смолянинов Владимир Владимирович

Доктор биологических наук Асланиди Константин Борисович

Доктор физико-математических наук Колесников Станислав Сергеевич

Ведущая организация: Российский Кардиологический Научно-

Производственный Комплекс

Защита диссертации состоится " 20 " сентября 2006 г. в " 15-30 " часов на заседании диссертационного совета Д 002.093.01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан " /2. " 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета //У//"г*/

кандидат физ.-мат. наук ^' Ч Панина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение

Ионные каналы

Ионный канал представляет собой белковую структуру, которая встроена в клеточную мембрану. Эта структура выборочно пропускает определенные ионы в ответ на определенное воздействие — например, на изменение мембранного потенциала. В представленном исследовании мы подробно рассмотрим роботу каналов, которые открываются в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны и избирательно проводят ионы кальция - т.е., потенциалоуправляемые кальциевые каналы.

Потенциалоуправляемые Са2+ каналы состоят из нескольких субъединиц (Рис. 1). Каждая субъединица кодируется отдельным геном. Ионопроводящая структура (пора) канала формируется си субъединицей (молекулярный вес около 195 кД), на которой расположены рецепторы Са2+ антагонистов и токсинов. си субъединица нековалентно связана с гидрофобной негликолизируемой ß-субъединицей (55 кД) и слабо гликолизируемыми a2-S-(180 кД) и у- (33 кД) субъединицами. Принято считать, что "минимальная функционирующая" структура Са2+ канала состоит из он, ß и а2-5 субъединиц (Catterall, 1995).

Потенциалоуправляемые ионные каналы, в том числе и кальциевые, играют важную роль в регуляции электрической активности возбудимых клеток. Изменения в кинетике и плотности экспрессии ионных каналов, вызванные, в том числе мутациями в соответствующих генах, приводят к разнообразным патологическим состояниям на уровне организма (Benatar, 1999; Felix, 2000). В качестве примеров таких патологических состояний можно привести обыкновенную полушарную мигрень, эпизодическую атаксию типа 2, церебральную атаксию типа 6, врожденную стационарную никталопию, предрасположенность к злокачественной гипертермии и периодические гиперкалемические параличи.

уровне субъединиц.

Классификация потенциалоуправляемых Са2* каналов

Потенциалоуправляемые Са2* каналы вместе с К1 и Na* каналами относятся к семейству «трансмембранных белков ионных каналов» (Catterall, 1995).

ои-субъединицы потенциалоуправляемых Са2+ каналов млекопитающих кодируются по меньшей мере десятью генами. Первоначально каждому вновь открытому гену давалось произвольное имя, что в итоге существенно затруднило классификацию. В 1994 году была введена новая классификация: ои-субъединица Са2* канала скелетной мышцы была обозначена как ais, а все остальные известные на тот момент ои-субъединицы были обозначены латинскими буквами от А до Е (Birnbaumeret al., 1994).

Клонирование новых Са2+ каналов снова существенно усложнило ситуацию, и в 2000 году (Ertel et al.) была введена «рациональная» классификация, аналогичная той, что используется для калиевых (Chandy & Gutman, 1993) и натриевых (Goldin et al., 2000) каналов. Для обозначения' канала используется химическое название проникающего иона, после которого следует индекс, характеризующий физиологический модулятор: в данном случае Cav («v» означает «voltage» - потенциал). Дальше приводится номер подкласса генов (в настоящий момент 1, 2 или 3) и индекс канала, принадлежащего данному подклассу, в порядке открытия. Таким образом, подкласс Cav1 (Cav1.1-Ca„1.4) включает в себя каналы, состоящие из ais, ctic, a-ю, a1F и проводящих Са2* токи L-типа. Подкласс Сау2 (Са»2.1- Cav2.3)

включает в себя каналы сил, а1В, «те. проводящие токи P/Q-, N- и R-типов. К подклассу Cav3 (Cav3.1- Са»3.3) относятся каналы, состоящие из chg, оин, а-п, и проводящие токи Т-типа.

Полные аминокислотные последовательности сч-субъединиц более чем на 70% идентичны внутри подкласса, и менее чем на 40% между подклассами.

Саг* антагонисты

В 60х годах Fleckenstein обнаружил, что различные вещества способны избирательно блокировать «входящие» Са2* токи, вызванные деполяризацией клеточной мембраны. Исследования, выполненные на клетках сердечных и гладких мышц, показали, что это ведет к уменьшению сократительной силы и делает невозможным проведение потенциала действия (Fleckenstein et al., 1983). Увеличение концентрации Са2+ вновь увеличивало силу мышечных сокращений и восстанавливало проводимость Са2* .потенциала действия. Это дало повод ввести термин Са2* антагонисты (Рис. 2).

Особый интерес представляет взаимодействие потенциалоуправляемых Са2+ каналов с широко используемыми в клинической практике 1.4-дигидропиридинами (ДГП, например нифедипин и нитрендипин), фенилалкиламинами (ФАА, галлопамил и верапамил) и бензотиазепинами (БТЗ, д-цис дилтиазем).

Фармакологическая активность Са2+ антагонистов, например их антиаритмическое и сосудо-расслабляющее действие, объясняется потенциало- и частото-зависимым (для ФАА и БТЗ) блокированием проникновения ионов Ca2t через каналы L-типа в гладких и сердечных мышцах. Блокирование потока двухвалентных ионов через Ca2t каналы определяется высокоспецифичным взаимодействием Са2+ антагонистов с соответствующими рецепторами (Caterall et al., 1992, Striessnig et al., 1993).

Молекулярные механизмы, лежащие в основе взаимодействия Са2* антагонистов с соответствующими рецепторами, а также эффект такого действия на ионный канал в целом, на данный момент исследованы недостаточно.

Рис. 2. Структурные формулы представителей Са2* антагонистов различных классов.

Израдипин (РЫ 200-110) и нимодипин относятся к химическому семейству .1,4-дигидропиридинов. Верапамил (й575) и девапамил (0388) принадлежат к классу фенилалкиламинов. Д-цис дилтиазем й ЭО 32,910 являются типичными представителями класса бензотиазепинов.

Верапамил, девапамил и д-цис дилтиазем обладают ярко выраженным частото-зависимым действием на потенциалоуправляемые Са2* токи 1_-типа.

Формальное описание работы потенииалоуправляемых Са2* каналов Потенциалоуправляемые Са2+ каналы открываются - или, другими словами, активируются - в ответ на деполяризацию мембраны клетки. Продолжающаяся деполяризация в свою очередь ведет к закрытию каналов -такой процесс называется инактивацией.

Для описания работы потенциалоуправляемых Са2+ каналов была предложена гипотеза, согласно которой каналы осуществляют переходы между различными конформационными состояниями. При потенциале покоя канал находится в закрытом состоянии, или состоянии покоя. При деполяризации канал активируется - переходит в открытое состояние. При продолжительной деполяризации канал снова переходит в непроводящее инактивированное состояние, или инактивируется. Отличие инактивированного и закрытого состояний канала (или состояния покоя) состоит в том, что под действием потенциала инактивированный канал не может немедленно активироваться, в то время как «просто» закрытый - может.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе переходов между различными состояниями потенциалоуправляемых Са2+ каналов, на данный момент исследованы недостаточно.

Кинетика инактивации — отличительная черта подгрупп Са2* каналов.

Для точного контроля притока ионов Са2+ во внутриклеточное пространство в процессе эволюции возникло семейство потенциалоуправляемых Са2+ каналов с различными биофизическими и фармакологическими свойствами. Одним из основных отличительных признаков подклассов Са2* каналов является их кинетика инактивации. Кинетика инактивации Са2* канала зависит, в свою очередь, не только от свойств сч-субъединицы, но и от состава дополнительных субъединиц, образующих канал. Интересно отметить, что в процессе эволюции «дополнительно» к различным каналам появилось несколько инактивационных механизмов.

Клонирование Са2+ каналов позволило сравнить инактивационную кинетику различных типов каналов при экспрессии с одними и теми же дополнительными субъединицами и в одинаковых системах экспрессии. Каналы семейства Cav3 (Cav3.1-Cav3.3, или же каналы Т-типа, Perez-Reyes et al., 1999) обладают самой быстрой кинетикой инактивации среди потенциалоуправляемых Са2+ каналов, если использовать Ва2* в качестве носителя заряда. Несколько медленнее инактивируются Cav2.3 (R-тип, Zhang et al., 1994, Spaetgens & Zamponi, 1999), еще медленнее Cav2.2 (N-тип, Hans et al., 1999b) и Са„2.1 (P/Q-тип, Sather et al., 1993). Медленнее всего инактивируются Ва2+ токи через каналы семейства Cav1, в частности Са»1.1 (каналы L-типа, Williams et al., 1992, Hofmann et al., 1999).

Конформаиионно-зависимое действие веществ

Предположение о том, что эффективность связывания вещества с ионным каналом зависит от того, в каком состоянии - покоя (R, от „Rest"), открытом (О, .Open") или инактивированном (1, „Inactivated") - находится канал, впервые высказали Armstrong (1966, 1969) и Strichartz (1973). Эта идея легла в основу гипотезы «модулированного рецептора» («modulated drug receptor»; Hille, 1977; Hondghem et al, 1977).

Данная концепция была успешно применена для объяснения механизмов подавления ноцецептивных сигналов локальными анестетиками, антиаритмического действия локальных анестетиков, действия антиэпилептиков (Hille, 1992), антигипертензивного эффекта 1,4-дигидропиридинов (ДГП, Bean, 1984, Sanguinetti et al, 1984), а также подавления суправентрикулярных аритмий фенилалкиламинанами (ФАА) и д-цис дилтиаземом (Lee et al, 1989; McDonald et al, 1984).

Несмотря на различные физиологические эффекты и химическую структуру эти вещества похожи в одном: они избирательно подавляют аномально высокую активность и не влияют на генерацию и распространение потенциала действия с «нормальной» частотой. Суть явления заключается в том, что некоторые вещества блокируют ионный канал эффективнее, если канал «используется», т.е. находится в открытом или инактивированном состояниях (во время, например, потенциала действия). В английском языке этот эффект получил логичное название' «use-dependent inhibition» -ингибирование, зависимое от использования (Courtney, 1975). Используемый в русском языке термин «частотозависимое подавление (ингибирование)» быть может не так элегантен, но суть явления отражает не менее точно.

Частото-зависимое ингибирование ионных каналов можно объяснить либо в рамках концепции «модулированного рецептора» (включая гипотезу «охраняемого рецептора»: Hille, 1977; Starmer et al, 1985), либо с помощью теории «медленной инактивации» (Khodorov, 1979, 1981). Обе теории основаны на экспериментальном наблюдении - некоторые вещества существенно замедляют переход ионных каналов в состояние покоя при реполяризации.

Концепция «модулированного рецептора» предполагает, что в ионном канале, который находится в состоянии покоя, места связывания лигандов (рецепторы) находятся «глубоко» внутри молекулы канала. Эти рецепторы становятся доступными для связывания только в результате конформационных изменений, лежащих в основе процессов активации и/или инактивации ионных каналов. Блокирование открытого состояния канала является частным случаем гипотезы «модулированного рецептора» (Starmer et al, 1985). В этом случае рецепторы в ионопроводящей структуре канала связываются с веществом только тогда, когда канал находится в открытом состоянии. Медленный переход ионного канала в активируемое состояние принято объяснять медленной

диссоциацией вещества от «открытого-и-блокированного» состояния канала (такое состояние принято считать непроводящим).

Концепция «медленной инактивации» подразумевает, что вещество ускоряет переход в состояние «медленной» инактивации. При этом связывание вещества может происходить либо с открытым состоянием ионного канала, либо вообще независимо оттого, в каком состоянии находится канал (КЬойогоу, 1979, 1981). В этом случае частото-зависимое ингибирование можно объяснить медленным выходом каналов из «медленного» инактивированного состояния.

Исследования взаимосвязи структуры и функций белков при помощи рекомбинантных каналов и анализ данных.

На данный момент можно выделить 2 основных метода исследований взаимосвязи структуры и функций белков.

1. Создание молекул-«химер», состоящих из двух различных по своим свойствам белков. Последующее сравнение свойств полученных химерных белков со свойствами исходной молекулы позволяет идентифицировать те Структурные элементы, которые «отвечают» за воспроизведение функций, уникальных для одной из исходных молекул. Обычно такой подход используется в качестве «первой итерации».

2. Замена отдельных аминокислот и сравнение свойств полученных рекомбинантных каналов со свойствами исходной молекулы.

Описанные методы можно разделить еще на два подхода - а) «деструктивный», когда целью является сделать белок нефункциональным, и б) «конструктивный» - когда делается попытка заставить белок выполнять ранее несвойственные ему функции.

Во многих случаях для оценки результатов изменения структуры белка (например, фермента) достаточно самого простого критерия - «работает/не работает». В некоторых случаях для описания действия лиганда на рекомбинантный белок так же достаточно «действует/не действует».

Однако в случае ионных каналов подобные критерии применимы редко.' В частности, для оценки эффективности лигандов, для которых характерно частотозависимое (БТЗ и ФАА) или потенциалозависимое (ДГП) действие, простейших критериев оказывается явно недостаточно: возникает необходимость подробного анализа кинетики ингибирования и/или изменения

кинетики самого канала под действием лиганда. «Готового к работе» метода анализа, способного учесть модификацию кинетики канала лигандом, на момент начала работы не существовало.

Отдельного разговора заслуживают исследования последствий замен отдельных аминокислот или участков аминокислотной последовательности на потенциалозависимость активации и инактивации, а также на кинетику активации и инактивации. Попыток описать изменения кинетики инактивации Са2* каналов в рамках даже простейшей кинетической схемы отмечено не было.

Вопрос о том, можно ли в рамках концепций «модулированного рецептора» и/или «лиганд-индуцированной медленной инактивации» непротиворечиво объяснить все вышеописанные явления, в частности в рекомбинантных каналах, на момент начала работы так же оставался открытым.

Вопрос о (взаимо-) связи кинетики инактивации канала и его чувствительности к определенным лигандам на первый взгляд может показаться лишенным смысла. Тем не менее, аргументом в пользу существования такой взаимосвязи является тот факт, что некоторые мутации отдельных аминокислот приводят к одновременному изменению кинетики инактивации и чувствительности канала к определенным лигандам.

Цели исследования

1. Исследовать возможную структурную и функциональную взаимосвязь процессов инактивации и ингибирования потенциалоуправляемых Са2+ каналов Са2+ антагонистами.

2. Разработать концепцию для описания изменений работы потенциалоуправляемых Са2* каналов под действием лигандов, ионов, замены участков последовательности, мутаций и экспрессии различных регуляторных белков (например, дополнительных субъединиц). В частности, разработать методику определения механизма действия лигандов и их «фармакологической» активности по отношению к потенциалоуправляемым Са2+ каналам.

Положение, выносимое на защиту

Способность ДГП, ФАА и БТЗ ингибировать и модифицировать потенциалоуправляемые Са2* каналы зависит непосредственно от кинетики инактивации таких каналов. Ингибирующее и модифицирующее действия ДГП и ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы объясняются тем, что эти лиганды меняют кинетику переходов каналов между состояниями, и, в том числе, ускоряют переход в инактивированные состояния.

Научная новизна

Обнаружен кластер из четырех аминокислот, замена которых приводит к значительным изменениям в кинетике инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов. Расположение аминокислот в нижней трети сегмента 1Ч/Э6 подтверждает предположение о том, что кинетика канала зависит от взаимодействий между сегментами Э5 и Б6, образующими ионопроводящую структуру канала. Представленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие сегментов и Б6 зависит главным образом от заряда и полярности аминокислот.

Показана взаимозависимость процессов инактивации и ингибирования потенциалоуправляемых Са2* каналов. В частности, одни и те же молекулярные структурные элементы могут входить как в состав «рецептора» определенного лиганда, так и в состав структуры, определяющую кинетику инактивации. Кроме того, показана корреляция между ингибирующей активностью лиганда по отношению к Са2+ каналу и кинетикой инактивации Са2* каналов.

Кинетическая модель, учитывающая переходы между единственным закрытым, единственным открытым и несколькими («быстро-», «медленно-» и «Са2+-») инактивированными состояниями, впервые применена для оценки эффектов экспрессии различных р-субъединиц, замен участков последовательности и отдельных аминокислот, а также изменения кинетики каналов в присутствии различных лигандов.

Са2+ каналы. Предложена альтернативная гипотеза, позволяющая непротиворечиво описать взаимовлияние кинетики инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов и способности лигандов изменять работу таких каналов.

Предложена методика оценки активности лигандов, обладающих частотозависимым действием на потенциалоуправляемые Са2+ каналы, а также способности Са2* антагонистов модифицировать работу ,Са2+ каналов. Методика основана на анализе измеряемых экспериментально зависимостей а) кинетики ионных токов и/или Ь) ингибирования ионных токов от ¡) частоты стимулирования Щ длины импульсов и Ш) концентрации лиганда в рамках простейшей кинетической модели.

Теоретическое и практическое значение.

. Информация о механизмах взаимодействия Са2+ антагонистов классов ДГП, ФАА и БТЗ с потенциалоуправляемыми Са2* каналами на молекулярном уровне (лиганд-рецептор) должна оказать существенную помощь в разработке новых лекарственных препаратов.

Описанная методика позволяет определить механизмы действия лиганда на ионный канал («модулятор кинетики», «ингибитор открытого состояния канала» и т.д.) и сравнительно точно предсказать поведение каналов в сложных системах, например при повторяющемся стимулировании в присутствии нескольких модуляторов (различных ионов, лигандов, дополнительных субъединиц). Всесторонняя оценка действия лиганда на ионный канал имеет первостепенную важность при оценке его эффективности как «потенциального» лекарственного препарата

Полученные результаты и наработанные методики должны оказать существенную помощь в последующих исследованиях молекулярных механизмов, обеспечивающих работу потенциалоуправляемых Са2* каналов.

Описанные методики и данные о молекулярных механизмах инактивации могут быть применены для исследований не только на потенциалоуправляемых Са2+ но так же и на других типах ионных каналов, в частности натриевых и калиевых.

Способность потенциалоуправляемых Са2+ каналов изменять свои свойства под действием различных лигандов и белков позволяет исследовать многие физиологические - в особенности регуляторные - процессы с новой точки зрения.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Экзогенная экспрессия субъединиц Ca2* каналов в ооцитах Xenopus laevis.

Самки лягушек Xenopus laevis были анестезированы в течение 15 минут в растворе MS-222 (Sandoz) непосредственно перед хирургическим извлечением частей овариев. Изолированные ооциты были очищены от фолликулярной оболочки обработкой в растворе коллагеназы (2 мг/мл).

сРНК, кодирующая потенциалоуправляемые Ca2t каналы, была инъецирована в ооциты (объем инъекции «50 нл) при помощи пневматического микроинъектора. Состав субъединиц: природная или рекомбинантная си; одна из ßia, рга или ß3; и а2-51 (соотношение концентраций приблизительно 1:1:1).

2. Эксперименты методом двухэлектродной фиксации, потенциала.

Регистрация ионных токов в ооцитах осуществлена методом двухэлектродной фиксации потенциала при температуре 22-25°С через 36-48 часов после инъекции сРНК. Раствор для измерений содержал 40 мМ Ва2* или Са2+ в качестве носителя заряда (pH 7,4). Сопротивление микроэлектродов было 0.3 - 2 МОм. Эндогенные Са2+-активируемые хлорные токи были подавлены инъекцией 50-100 нл 0.1 мМ раствора ВАРТА (свободная кислота) приблизительно за 1 час до начала эксперимента. Регистрационная камера

промывалась постоянным потоком («1 мл/мин.) контрольного раствора, или раствора, содержащего исследуемое вещество.

3. Анализ ингибирования Ca2* и Ва2* токов.

Известно, что блокирование Са2+ каналов Ca2* антагонистами может увеличиваться при повторяющейся деполяризации (Hille, 1992). Поэтому в представленной работе были изучены две различные компоненты ингибирования:

1. Ингибирование тока в течении 3-5 минут после подачи вещества, отражающее взаимодействие преимущественно с закрытым непроводящим состоянием канала («начальное» или «тоническое» ингибирование).

2. Дополнительное частото-зависимое ингибирование измерялось в течении последовательности деполяризующих импульсов одинаковой длины (100-1000 мс) в частотном диапазоне 0.03-1 Гц.

4. Конструирование ионных каналов-мутантов.

Рекомбинантные ионные каналы были получены мутацией отдельных

аминокислот в си субъединице сДНК методом "gen SOEing" (Horton et al., 1989). Соответствующий шифр исходного белка в международной базе данных приведен в тексте.

Цепная полимеразная реакция была проведена с использованием Pfu-полимеразы (Stratagene).

Аминокислотная последовательность полученных химер была проверена методом, описанным в работе Sanger et al., 1977.

5. Частота снятия показаний.

Частота, снятия показаний при регистрации ионных токов была 5 КГц. Данные были фильтрованы (фильтр нижних частот) численно с частотой «отсекания» 2 КГц.

6. Программное обеспечение.

Данные экспериментов методом фиксации потенциала были получены и обработаны с использованием пакета программ pClamp версий 6.0 и 8.0 (Axon

Instruments, США). Иллюстрации подготовлены с помощью пакетов программ Microcall Origin версий 5.0 и 7.0, а также Corel Draw! версий 6.0 и 9.0

7. Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистическая достоверность отличия двух средних величин оценена при помощи парного или группового t-критерия Стьюдента (р < 0.05).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были доложены на 43, 45, 46, 47, 48 и 49 Ежегодных Конференциях Биофизического Общества США. По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в международных научных журналах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние мутаций аминокислот сегмента IVS6 на кинетику инактивации Cav2.1

Замена сегмента IVS6 в <х12.1-субъединице на соответствующий сегмент из <xi1-1 приводит к значительному увеличению чувствительности к (-)-галлопамилу и д-цис дилтиазему (химера AL23, Doering et al., 1996). Интересно отметить, что кинетика инактивации рекомбинантного канала (химеры AL23) оказалась быстрее, чем обоих «исходных» каналов. Этот факт был использован в качестве исходного пункта для изучения механизмов инактивации в потенциалоуправляемых Са2* каналах.

Сегменты IVS6 ои-субъединиц различных подгрупп потенциалоуправляемых Са2+ каналов состоят из 25 аминокислот, при этом последовательности IVS6 ои2.1- и ai1.2 субъединиц отличаются на 8 аминокислот (Таблица 1 - белые буквы на черном фоне). Таким образом, результат можно переформулировать так: одновременная замена восьми оц2.1-на «соответствующие» ai1.2 аминокислоты приводит к значительному ускорению кинетики инактивации.

Таблица 1. Сравнение аминокислотных последовательностей сегментов IVS6 ai2.1-и oi1.2 субъединиц.

Канал Аминокислотная последовательность

ос-|2.1 (i7,e,4MBM»cBM»Fvfflig(i8ao,

a, 1.2

Исследование эффекта одновременной замены 8 аминокислот вполне логично начать с исследования последствий замен отдельных аминокислот.

Для этого каждая из восьми «ai2.1 »-аминокислот была заменена на соответствующую «оч1.1 »-аминокислоту (Рис. ЗА, Таблица 1). Кинетика инактивации каналов с заменами Y1797V, V1801L, I1804Y, F1805M, S1808A, M1811I, L1812I, V1818L была исследована методом двухэлектродной фиксации потенциала после экспрессии в ооцитах Xenopus. В состав исследуемых

каналов входили мутантная или природная at- вместе с a2-S- and р1а- или р3 субъединицами.

Для сравнения кинетики различных мутаций введем параметр «максимальная скорость инактивации» ки=1/тИкает™ачк1и, где характерное время инактивации определяется приближением Ва2+ тока моно- или биэкспоненциальной функцией. Соответственно, ки измеряется в обратных секундах (с1).

Рис. 3. Эффект мутаций аминокислот в сегменте 1\/86 си субъединицы Са2* канала на кинетику инактивации.

(A) Вторичная белковая структура сегмента 1\/в6 ои2.1 (а-спираль). Серым цветом выделены те аминокислоты, замена которых приводит к наибольшему ускорению кинетики инактиваци.

(B) и (С) Максимальная скорость инактивации в природных и мутантных Сау2.1 каналах. Мутация М1_1811/181211 обозначена «М1_/11». Состав субъединиц: (В): си, а2-б и р1а, (С): «12.1, а2-о и р3. Вставки: шкалированные Ва2* токи в отдельных мутантных каналах и химере А1.23 (поддерживаемый потенциал: -80 мВ, ток измерен при потенциале, приблизительно соответствующем максимуму вольтамперной характеристики).

Статистически достоверное отличие (р<0.05) показано звездочками (*), п=3-5.

Максимальная скорость инактивации в природных сч2.1/а2-5/р1а каналах составляет 1.3510.25 с"1. Только две мутации из восьми - М18111 и 1.18121 -существенно (в 8 и 4 раза соответственно) ускоряли инактивацию природных каналов (Рис. ЗВ). При этом замена только одной аминокислоты - М18111 -приводила практически к такому же эффекту на кинетику инактивации, как замена всего сегмента МЭб (=8 аминокислот, химера А1.23, ки= 11±0.8 з"1, вставка на Рис. ЗВ). Интересно отметить, что второе по величине ускорение инактивации - примерно в 4 раза - было обнаружено при замене аминокислоты 1.18121, соседней с«самой быстрой» М18111 (ки=5.26±0.39 с"1).

Дополнительно были исследованы мутации восьми аминокислот сегмента 1\/36, которые присутствуют в последовательности всех подклассов потенциалоуправляемых Са2* каналов (Таблица 1, выделено серым). Самое значительное ускорение кинетики инактивации по сравнению с природными си2.1/а2-8/рз каналами вызывали мутации А1817М - в 3.6 раза, и Ж813А - в 2.7 раза (Рис. ЗС). Та же закономерность была обнаружена при экспрессии мутантов Ы1813А и А1817М вместе с р-и-субъединицей (данные не показаны).

Эффект мутаций на потенциалозависимость активации оказался сравнительно слабым.

Таким образом, ускорение инактивации более чем в 3 раза отмечается только при заменах двух соседних аминокислот - М1811 (8х) и 1.1812 (4х), и одной сравнительно близко к ним расположенной А1817 (3,5х). Логично предположить, что именно в этой части ионного канала имеют место взаимодействия, играющие важную роль в определении кинетики инактивации Сау2.1 канала.

Для того, что бы понять, какие именно взаимодействия могут определять кинетику инактивации потенциалуправляемых Са2* каналов, мы заменили аминокислоту М1811 на основания, обладающие различными зарядами, полярностью и размером.

Замены М1811 на заряженные и/или полярные аминокислоты -глютаминовое основание (О), глютаминовую кислоту (Е), аспарагин ((\|) и лизин (К) - вызывали самое значительное ускорении максимальной скорости инактивации: например, 12-кратное в М1811К и 75-кратное (!!!) в М181Ю (ки=102±3 с*1). Интересно отметить, что максимальная скорость инактивации в мутанте М181Ю- не отличалась от СЭу3.1 (канал Т-типа; ки= 104±3. с1),

обладающего самой быстрой кинетикой среди потенциалоуправляемых Ca2* каналов (подробно описано в диссертации).

Замена М1811 на гидрофобные основания различных размеров так же вызывает ускорение инактивации, однако не столь ярко выраженное («всего» в 2-8 раз), как в случае с заряженными и полярными аминокислотами.

Таким образом, замена трех аминокислот, расположенных в нижней трети сегмента IVS6, вызывает самые значительные изменения кинетики инактивации. Важно отметить, что две из этих трех аминокислот входят в состав рецепторов Са2+ антагонистов: М1811 входит в состав рецепторов ФАА, ДГП и дилтиазема, a L1812 - ДГП.

Наибольшее ускорение инактивации наблюдается при замене «исходных» аминокислот заряженными и полярными аминокислотами

Мутации аминокислот, расположенных вблизи рецепторов Ca2* антагонистов, изменяют кинетику инактивации и чувствительность канала клигандам.

Взаимосвязь инактивации и подавления канала лигандами исследована на примере химерных и мутантных Cav, обладающих различной кинетикой инактивации.

Природный Cav2.1 обладает низкой чувствительностью к д-цис дилтиазему и (-)-галлопамилу (Рис. 4В, слева в верху). Перенос трех «уникальных Са„1.2» аминокислот в Cav2.1 (сегмент IVS6: Y1804, А1808 и 11811 согласно нумерации очд, мутант AL25, Hering et al., 1996), значительно усиливает частото-зависимое блокирование Са„2.1 канала д-цис дилтиаземом и (-)-галлопамилом (Рис. 4А, В - справа в верху), и, в то же время, ускоряет кинетику инактивации.

Дополнительная мутация F1805M ускоряет инактивацию и увеличивает чувствительность (Y,M,A,I; Рис. 4В слева внизу). «Обратная» мутация А1808 на S (двойной мутант Y, I; слева в середине) или 11811 на М (двойной мутант Y, А; справа в середине) существенно замедляет инактивацию и снижает чувствительность к ФАА и БТЗ. Мутация Y1804 на I в двойном мутанте А, I (справа внизу) уменьшает частотозависимое ингибирование и при этом практически не меняет кинетику инактивации по сравнению с AL25 (справа вверху).

«Обратные» замены A1S08 на серин или 11811 на метионин в мутанте AL25 не только существенно уменьшают чувствительность к ФАА и БТЗ, но также существенно замедляют кинетику инактивации.

Эти данные свидетельствуют о взаимозависимости инактивации и кажущейся чувствительности Са2* канала к Са2+ антагонистам.

Ca,2.1/IVS6

¿Г*1

Дилтаазем

Дилтиазем

Рис. 4. Аминокислоты в сегменте №86 чувствительного к д-цис диптиазему Сау2.1 -мутанта определяют сродство к лигандам и, в тоже время, кинетику инактивации канала.

(A) Сегмент 1Ув6 Са»2.1 представлен в виде а-спирали. Перенос четырех аминокислот (У, А, I, М, черные круги, нумерация согласно а1А, шифр: Р27884) увеличивает чувствительность к д-цис диптиазему и ФАА.

(B) Частотозависимое ингибирование Ва2* токов (100 рМ д-цис-дилтиазема, 15 импульсов, 0.1 Гц).

Мутации аминокислот, не входящих в состав рецепторов Са1* антагонистов, но определяющих кинетику инактивации, влияют на ингибирование канала лигандами.

Зависимость между кинетикой инактивации и чувствительностью канала к Са2+ антагонистам была обнаружена при исследовании мутаций аминокислот, расположенных вне мест связывания канала и антагонистов.

Замена расположенного в нижней части сегмента 1Х/Э6 VI477 на аланин (Рис. 5А), существенно замедляет кинетику инактивации Сау1.2 и одновременно существенно снижает чувствительность к д-цис дилтиазему (Рис. 5С).

Подробный анализ мутаций аминокислот сегмента IIIS6 канала-химеры, составленного из фрагментов Са„1.1 и Са„2.1, также выявил корреляцию между кинетикой инактивации и активностью блокаторов (Рис. 6С, так же Hering et al., 1997). Замена двух аминокислот сегмента IIIS6 на аланин (I1163A и F1164A, Рис. 6), и двойная мутация IF1163.1164AA уменьшали скорость инактивации, и, одновременно, существенно снижали часготозависимое подавление каналов (-)-галлопамилом (Рис. 6В).

Ca,1.2(ß1a)

Рис. 5. Структуры в сегменте МБ6 Са„1.2, определяющие кинетику инактивации, влияют на чувствительность каналов клигандам.

(A) Сегмент 1\/36 Сау1.2 канала представлен в виде а-спирапи. Аминокислоты, входящие в состав рецепторов ФАА или БТЗ (ЗМезэтд е1 а1., 199В; Носкегшапп е1 а1., 2000) выделены черным. Аминокислоты, определяющие инактивационную кинетику -11471 и У1477 (Вег]ико\ч е1 а1., 1999), а так же 11478 (БЫ & БоИаЪу, 2002), представлены белыми кругами.

(B) Мутации аминокислот, входящих в гипотетические рецепторы ФАА (11470А) и ДГП (11471 А), замедляют кинетику инактивации.

(C) Нормализованные Ва2* токи через природные Сау1.2 и мутированные (\/1477А) каналы. Мутация VI477А существенно замедляет потенциалозависимую инактивацию и ослабляет частото-зависимое подавление д-цис-дилтиаземом (15 100 мс импульсов от-80 мВ до +10 мВ, 1 Гц, Вепикоку е1 а!., 1999, 2000).

При исследовании мутаций в петле, связывающей домены I и II (R387E в Cav2.1), была обнаружена та же зависимость - чем медленнее инактивируется канал, тем слабее этот канал подавляется (-)-галлопамилом (Sokolov et al., 1999).

Добавление одного аланина в петлю I-II си1-2 существенно замедляет кинетику инактивации и значительно снижает часгото-зависимое подавление мибефрадилом (Jimenez et al., 2000). Таким образом, подавление Са2+ каналов определяется не только структурами, перекрывающимися с рецепторами, но так же и структурами, которые расположены вне рецепторов.

F1164A IF1163.1164AA

V1165/J

Инактивация la. за 100 мс (%)

Рис. 6. Корреляция между кинетикой инактивациии и частото-зависимым подавление каналов (-)-галлопамилом (D600).

(A) Сегмент IIIS6 ФАА-чувствительной Cav1.1/Cav2.1 химеры AL1 (Grabner et al., 1994) представлен в виде а-спирали. Аминокислоты сегмента IIIS6, входящие в состав рецепторов ФАА или БТЗ (Striessnig et al., 1998; Hockermann et al., 2000) выделены черным. Аминокислоты фрагмента «IFV» (11163, F1164 и V1165, Hering et al., 1998) представлены белыми кругами.

(B) Частотозависимое ингибировании химеры AL1, а также мутантов F1164A, IF1163 и 1164АА 100 рМ (-)-галлопамила (10 100 мс импульсов от -80 мВ до +10 мВ, 0.1 Гц). Химера AL1, обладающая самой быстрой кинетикой инактивации, сильнее всего подавляется (-)-галлопамилом. Канал с самой медленной кинетикой инактивации (двойной мутант IF1163,1164АА) слабее всего блокируется ФАА. (см. так же Kraus et al, 1998: влияние V1165 на действие д-цис дилтиазема).

(C) Корреляция (R=0.92) межЧУ инактивацией в течении 100 мс импульса и частото-зависимым подавлением каналов различных мутантов AL1 (Hering et al., 1997).

Взаимосвязь кинетики инактивации и блокирующего действия 1,4-Дигидропиридинов.

Взаимодействие Са2+ каналов с ДГП непосредственно зависит от кинетики инактивации каналов. Быстро инактивирующийся мутант сиа-онр обладает большей чувствительностью к ДГП, чем медленно инактивирующийся природный Са„1.2 канал. Это соотношение верно в случае экспрессии как с «быстрой» р1а, так и с «медленной» р2а субъединицами (Рис. 7А). Таким образом, предположение о том, что ускорение инактивации приводит к возрастанию ДГП-чувствительности, выглядит по меньшей мере не лишенным смысла (Рис. 7 В и С).

Рис. 7. Быстро инактивирующийся Cav2.1 мутант а1А_онр более чувствителен к ДГП, чем сравнительно медленно инактивирующийся природный Cav1.2 канал.

(A) Зависимость подавления каналов а^-онрфи) (белые квадраты) и aiA,.DHp(P2a) (черные квадраты), Cav1.2(p1a) (белые круги) и Са„1.2(р2а), (черные круги) от концентрации (+)-израдипина. IC5o(a1A.DHp/Pia) = 61 нМ, ЮгоСоил-онр/рга) = 52 нМ, IC50(Cav1.2(pia)) = 327 нМ и IC50(Cav1.2(p2a)) = 198 нМ).

(B), (С) Типичные нормализованные токи через Cav1.2 (В) и а1А.№Р (С) каналы, содержащие р,„- или р2а-субъединицы. Токи вызваны деполяризациями от -80 мВ до +20 мВ. Данные из Berjukow et al., 2000.

Еще один пример взаимосвязи инактивации и взаимодействия канала с ДГП приведен в исследовании Вец'икоуу е1 а1., 2000. Мутация 11471А в сегменте 1\/в6 (Рис. 5А) приводит к существенному замедлению инактивации канала, и

одновременно ускоряет восстановления каналов из инактивации в присутствии ДГП (Рис. 8 А,В). Таким образом, аминокислота 11471, являющаяся частью рецептора ДГП, дестабилизирует не только «исходное» инактивированное, но так же и ДГП-инактивированное состояние.

1 с Время, с Мембранный потенциал. мВ

Рис. 8. Медленное восстановление ДГП-модифицированных каналов от инактивации и зависимость действия ДГП от потенциала.

(A) (+)-израдипин (1 рМ) ускоряет инактивацию Ва2* тока через природные Cav1.2(p1a) каналы (слева) и замедляет восстановление от инактивации/подавления (справа) примерно в 4,5 раза (характерные времена восстановления: тгантроль = 0.63 е., х юрадипя„ = 2.85 е.).

(B) Принято считать, что аминокислота 11471 входит в состав рецептора ДГП. Мутация I1471A существенно замедляет инактивацию (Рис. 5В). Слева показаны токи через 11471А в контроле и 1 рМ (+)-израдипина. Справа: восстановление 11471А от инактивации в контроле ускорено по сравнению с природным Cav1.2(р1а) каналом (см. панель (А)): Восстановление I1471A от инактивации в присутствии израдипина происходило быстрее, чем для Са„1.2, однако достоверно не отличалось от контрольных значений (т,онтроль = 0.50 с, т тятропь = 0.46 с, сравните с (А)). Данные из Berjukow et al., 2000.

(C) Потенциалозависимое ускорение инактивации Ва2* тока в медленно инактивирующимся мутанте V1477A, вызванное 1 рМ (+)-израдипина (вставка). Значения констант времени инактивации мутанта V1477A в отсутствии израдипина (незаполненные круги) были в диапазоне между 10 и 20 секундами. Данные из Berjukow et al., 2001.

Подробное исследование взаимодействия ДГП с СаУ1.2 и Са„2.1 мутантами, обладающими различной кинетикой инактивации, приводит к следующему выводу: определенные лиганды усиливают «быструю»

потенциалозависимую инактивацию, а не связываются с этим состоянием. Гипотеза «инактивации, вызванной лигандом», частично подтверждается экспериментами с мутантом \/1477А, в котором полностью отсутствует «быстрая» потенциалозависимая инактивация. (+)-Израдипин ускоряет инактивацию \/1477А канала в зависимости от мембранного потенциала, при этом кинетика инактивации в У1477А канала присутствии ДГП напоминает кинетику природного Сау1.2 (Рис. 8С). Таким образом, действие израдипина на этот канал может быть описано как создание, или восстановление, «быстрой» потенциалозависимой инактивации (Велико!« е1 а1., 2001).

Лиганд-зависимая инактивация

Согласно гипотезе «модулированного рецептора» ионный канал в инактивированном состоянии обладает повышенным сродством к ДГП. Было бы логично проверить, действительно ли мутантные каналы в инактивированном состоянии являются «рецепторами» (+)-израдипина. Для этого были изучены изменения фракции инактивированных мутантных каналов под действием (+)-израдипина при -30 мВ (схема эксперимента показана на Рис. 9А).

Необходимо отметить, что мутации 11497А, 11498А и \/1504А сами по себе влияют на равновесную инактивацию: фракции инактивированных каналов при -30 мВ оказались в диапазоне между 9±1% [ацУРи, п=5] и 21±3 % [11498А, п=4]) (Рис. 9 С,0).

Ожидаемой - прямо пропорциональной - зависимости блокирования Са2* каналов (+)-израдипином от количества инактивированных каналов обнаружено не было. Напротив, увеличение фракции инактивированных ац_с/р2а (по сравнению с а^с/Рта) каналов не привело к более эффективному ингибированию (+)-израдипином (Рис. 9 А,В). По сравнению с счи/Ри (56±3% добавочного подавления, п=4), (+)-израдипин проявил существенно меньшее сродство к ако/рга, (40±4%), 11498А (25±2%) и У1504А каналам (34±5%, п>7. Рис. 9С). Таким образом, добавочное блокирование (+)-израдипином оказалось обратно пропорциональным фракции инактивированных при -30 мВ каналов (коэффициент корреляции -0.94, Рис. ЭЭ).

Парадоксальное действие (+)-израдипина на Са2* каналы при поддерживаемом потенциале -30 мВ вполне могло оказаться частным случаем. Таким образом, потенциало- и концентрационная зависимость действия (+)-

израдипина на ац_с/Р1а, «ис/Рга, 11498А и \/1504А каналы были исследованы дополнительно. Однако, инактивационные кривые для ац_с/Р1а, ац_с/р2а, 11498А и VI504А каналов оказались смещены в сторону отрицательных потенциалов на соизмеримые величины (более подробно вопрос рассмотрен в диссертации). Гипотеза «модулированного рецептора» предсказывает, что потенциалоуправляемое блокирование должно быть пропорционально инактивации, вызываемой 30-секундным инактивирующим импульсом. Тем не менее, предсказываемой корреляции обнаружено не было.

°1Ьс/Р2а

М1зг.

Бремя, с Равновесная инактивация >-МР1тТм4Э7А

ШР2 х -

10 20 30

Контроль

Рис. 9. Израдипин-инактивация Са каналов в состоянии покоя.

(А, В) Кинетика инактивации каналов <хц_с/Р1а (п=4, А) и оииЛЬа (п=4, В) при -30 мВ в контроле (белые круги) и 1 рМ (+)-израдипина (черные круги). Схема эксперимента показана на вставке панели А. Непрерывные линии показывают приближение экспериментальных данных биэкспоненциальной функцией. Штриховая линия показывает равновесную инактивацию в контроле и в присутствии 1 рМ (+)-израдипина. Вертикальные «обоюдоострые стрелки» на панелях А и В показывают изменение равновесной инактивации под действием (+)-израдипина. (С) Дополнительная инактивациия, вызванная 1 рМ (+)-израдипина. Увеличение амплитудного коэффициента быстрой компоненты инактивации (А,а„, ,израдипнн Айм.контрсь) представлено черными колонками.

(О) Корреляция равновесной инактивации при потенциале -30 мВ в контроле и присутствии (+)-израдипина.

При -30 мВ Са2+ каналы инактивируются по биэкспоненциальной зависимости (Рис. 9). Быстрая компонента (^О изменяется в диапазоне между 0.42Ю.06 с (11497А) и 0.92±0.07 с (ац.с/р2а), в то время как медленная компонента (твю«,) - между 10.1±2.1 с (11497А) и 14.0±2.1 с (ац_о/р1а). 1 ММ (+)-израдипина вызывает существенное увеличение амплитуды быстрой компоненты без существенного ускорения константы времени: т(аВ1 в диапазоне между 0.51 ±0.06 с. (И498А) и 0.89±0.08 с. (11497А). Медленная компонента инактивации (т8|0Ж) в присутствии (+)-израдипина по сравнению с контролем изменялась несущественно (Рис. 9 А,В).

Эти данные можно интерпретировать следующим образом: в присутствии (+)-израдипина Са2+ канал может находиться в состоянии, по своим свойствам похожем на исходное «быстро-инактивированное» состояние. Этот вывод косвенно подтверждается тем, что фракция «израдипин-инактивированных» Са2+ каналов соответствует разнице между равновесной инактивацией в контроле и в присутствии (+)-израдипина (Рис. 9С).

Анализ влияния /}-субъединиц на кинетику Са2* каналов в рамках простейшей кинетической модели.

Модель предполагает переходы между открытым (О), быстро (РавИ) и медленно (БкэиМ) инактивированными состояниями (Рис. 10, см. также Эококэу е1 а!., 2000). Каждая мутация вызывает определенные изменения кинетики переходов между открытым, быстрым и медленным инактивированными состояниями.

Рис. 10. Схема переходов между различными состояниями

Простейшие расчеты показывают, что эффект субъединицы р2а на кинетику Са2+ каналов заключается в дестабилизации быстрого инактивированного состояния (Рис. 11). Эффект р2а-субъединицы на кинетику

о БавМ

потенциалоуправляемых Са2> каналов.

инактивации воспроизводится приблизительно 1000-кратным увеличением скорости перехода из быстро-инактивированного в открытое состояние канала (константа скорости р). Ускорение перехода из быстрого инактивированного в открытое состояние в присутствии р2а субъединицы не зависит от вариаций кинетики си2.1, вызванных мутациями в сегменте 14/36.

СЭу2.1

а ß у

1.3 0.12 0.12 0.05 1.3 1 00 0.12 0.09

6 0.12 0.22 0.05 ß2a в 100 0.22 0.05

M1811N

а [} у Ö

21 0.03 1.5 0.5 23 30 1.5 0.5

m1811q

f!1a

90 0.03 0.7 1 90 33 0.7 1

Рис. 11. Математическое моделирование изменений кинетики инактивации Сау2.1 каналов под действием р2а субъединицы

Схема переходов между различными состояниями Са2* каналов показана на Рис. 7 Инакт4с6. Результаты моделирования показаны штриховыми линиями. Значения констант скоростей а, р, у и 5, использованные в моделировании экспериментальных данных, показаны справа от токов. Эффект р2а-субъединицы на кинетику инактивации воспроизводится приблизительно 1000-кратным увеличением скорости перехода из быстро-инактивированного в открытое состояние канала (константа скорости р).

Взаимозависимость ингибирования и инактивации.

Эксперименты, выполненные на рекомбинантных Са2+ каналах свидетельствуют о том, что Са2+ антагонисты способны воздействовать на молекулярный механизм инактивации (Berjukow et al, 2000, Hering et al, 2000; Sokolov et al, 2001). ФАА, мибефрадил и д-цис дилтиазем ускоряют макроскопическую инактивацию Са2+ канала. Похожим образом на инактивацию влияют определенные точечные мутации и «быстрые» р-субъединицы. Для того, что бы объяснить экспериментальные данные, была предложена концепция, условно названная «взаимозависимость инактивации и

подавления» (Рис. 12, см. также Hering, 2002). В рамках данной гипотезы связывание лиганда совершенно необязательно зависит от состояния ионного канала.

Гипотеза предполагает наличие двух фракций ионных каналов:

1) не связанных с лигандом, и, соответственно, с неизменной

кинетикой переходов между состояниями,

2) связанных с лигандом - «модифицированных», с определенным

образом измененной кинетикой переходов между состояниями (Рис. 12).

Таким образом, согласно предложенной гипотезе «видимая» кинетика ионного тока является усреднением кинетики двух разновидностей каналов модифицированных и немодифицированных.

Одним из очевидных предсказаний является следующее - если связывание лиганда замедляет переход каналов в состояние покоя «достаточно сильно», то имеет место частото-зависимое ингибирование ионного канала данным лигандом (Рис. 12).

Сдвиг инактивационной кривой, предсказанный в рамках данной модели, идентичен сдвигу, предсказанному в рамках гипотезы «модулированного рецептора». Однако, в первом случае изменения способности каналов активироваться вызвано изменениями зависимости кинетики переходов между состояниями ионного канала от потенциала, а не связыванием с его инактивированным (I) состоянием (Рис. 14).

Взаимозависимость ингибирования и инактивации

Модулированный рептор

канал не связан с лигандом

канал связан с лигандом

Рис. 12. Различные модели рецепторов.

(A) Концепция вмодулированного рецептора»

Концепция «модулированного рецептора» предполагает, что лиганд с различной активностью реагирует с закрытым (R), открытым (О) и инактивированным (I) состояниями ионного канала. Считается, что ДГП имеют высокое сродство к инактивированному состоянию канала (Bean, 1984; Sanguinetti et al, 1984), в то время как ФАА и мибефрадил могут связываться как с открытым (Timin и Hering, 1992; Aczel et al, 1998), так и с инактивированным (Hockerman et al, 2000; Jimen6z et al, 2000; Nawrath et al, 1997; Bezprozvanny et al, 1995) состоянием Ca2* канала. Концепция «модулированного рецептора» объясняет более эффективное частото-зависимое ингибирование канала с ускоренной макроскопической инактивацией (например, при экспрессии . «быстрой» ' р^а-субъединицы) предпочтительным связыванием лиганда с инактивированным состоянием канала. Медленная ß2a-субъединица, в свою очередь, уменьшает популяцию инактивированных каналов, и, таким образом, ведет к менее эффективному частото-зависимому ингибированию инного канала (Hering, 2002).

(B) Концепция взаимозависимости ингибирования и инактивации

Лиганд взаимодействует с каналом независимо от его состояния (вертикальные красные стрелки). Связывание лиганда стимулирует переход в инактивированное состояние и замедляет выход из него. В таком случае частото-зависимое ингибирование оказывается суммарным эффектом «эндогенной» и «индуцированной лигандом» инактиваций. Например, рга-субъединица замедляет переходы в инактивированное состояние, и, таким образом, уменьшает эффект «лиганд-зависимой» инактивации, что, в свою очередь, ведет к уменьшению частото-зависимого блокирования. Моделирование поведения каналов, экспрессированных с разными р-субъединицами, показано на Рис. 11.

Механизм действия ФАА, д-цис дилтиазема и мибефрадила.

Молекулярные структуры потенциальных рецепторов ФАА, ДГП и д-цис дилтиазема расположены в сегментах IIIS5, IIIS6 и IVS6, образующих ионопроводящую структуру канала (Kraus et al, 1998; Hering et al, 1996; Motoike et al, 1999; Degtiar et al, 1997; Hockerman et al, 2000; Striessnig et al, 1998). Многие мутации вблизи рецепторов различных лигандов приводят к изменению кинетики инактивации канала (например, Hering et al, 1997, 2002). Более того, большинство мутаций, влияющих на кинетику инактивации, так же оказывают влияние на чувствительность канала к ФАА, д-цис дилтиазему и мибефрадилу, даже если эти мутации произведены «далеко» от соответствующего рецептора. Эти исследования позволили сделать вывод, что частото-зависимое ингибирование непосредственно зависит от инактивационных свойств Ca2* канала (Hering et al, 1997, 2002).

Тем не менее, некоторые экспериментальные данные трудно объяснить в рамках «конформационно-зависимой фармакологии». Мибефрадил, например, демонстрирует все признаки блокирования канала в открытом состоянии: ускорение инактивации ионного тока, вызванное лигандом, сопровождается незначительными изменениями инакгивационной кривой. Экспрессия ai с Рга-субъединицей существенно замедляет инактивацию канала, и, таким образом, существенно увеличивает время, которое канал проводит в открытом состоянии. Таким образом, согласно гипотезе «блокирования открытого состояния», частото-зависимое ингибирование данного канала мибефрадилом должно быть более эффективным, чем канала, в составе которого есть ßia-субъединица. Тем не менее, Jimenez et al. (2000) показал, что Ca2* каналы, экспрессированные с «медленной» р2а-субъединицей менее чувствительны к мибефрадилу, чем каналы с «быстрой» pia-субъединицей. Похожие данные были получены для ФАА и д-цис дилтиазема (Рис. 13; см. также Sokolov et al, 1999, 2001).

Эти факты прямо противоречат гипотезе «ингибирования открытого состояния».

(-)-галлопамнпом

(A) Модель включает 3 типа инактивации: Са2*-зависимая (Са-1), быстрая потенциапозависимая (РаэИ) и медленная инактивация (Slow-l).

(B) Моделирование частото-зависимого ингибирования Сау1.2(р3) и Сау1.2(рга) в 10 рМ (-)-галлопамила с Ва2+ или Са2* в качестве носителя заряда. Ионные токи, полученные экспериментально, показаны слева. Предположительно, галлопамил модифицирует только переходы между открытым и быстрым инактивированным состояниями (а и р). Эффект р2а-субъединицы воспроизводится увеличением а и р в 2 раза. Эффект галлопамила воспроизводится увеличением а в 6 раз и уменьшением р в 2 раза, при этом предполагается, что галлопамил модифицирует 50% каналов (полный набор параметров приведен в http://circres.ahaiournals.orq/cqi/content/full/hh2001.098983/DCH. Разница в чувствительности Са„1.2(р3) и Сау1.2(р2>) к галлопамилу может быть объяснена исключительно изменениями а и р и не требует допущения того, что р-субъединица влияет на взаимодействие канала и лиганда. Данные из воко1оу е( а1, 2001.

Молекулярный механизм действия ДГП.

Экспрессия сис вместе с «быстрой» Рча или «медленной» Рга-субъединицами приводит к значительным изменениям распределения каналов между состояниями в большом диапазоне потенциалов. При потенциале -80 мВ в инактивированном состоянии находится значительно больше очс/Ри. чем оис/Рг», каналов. Тем не менее, чувствительность сис/Р1а каналов к ДГП не отличается от чувствительности а1С/рга каналов. Аналогичное наблюдение было сделано для ДГП-чувствительного мутанта сца-онр- Эти данные прямо противоречат предположению о том, что ДГП реагирует предпочтительно с инактивированным состоянием ионного канала (Beгjukow е1 а1, 2000).

Хорошо известно, что ДГП вызывают значительное «тоническое» ингибирование и дополнительно сдвигают инактивационную кривую в сторону отрицательных потенциалов. Тоническое ингибирование не может быть изменено ни последовательностью деполяризующих импульсов ни значительной гиперполяризацией клеточной мембраны. Таким образом, тоническое ингибирование должно не зависеть от распределения Са2+ каналов между различными состояниями.

Сдвиг инактивационной кривой принято объяснять избирательным взаимодействием ДГП с инактивированным состоянием канала (Bean, 1984). В то же время, ускорение макроскопической инактивации тока (наиболее заметное, если в качестве носителя заряда используется Ва2+, Рис. 14) является признаком взаимодействия лиганда с открытым состоянием (подробно описано в диссертации). Для того, что бы объяснить экспериментальные данные в рамках концепции «конформационно-зависимой фармакологии», необходимо учитывать 3 разных эффекта - а) тоническое ингибирование б) взаимодействие ДГП с открытым состоянием канала с) взаимодействие ДГП с инактивированным состоянием канала.

Предложенная гипотеза «взаимозависимости подавления и инактивации» элегантно описывает особенности действия ДГП. Ускорение падения амплитуды тока во время деполяризации можно объяснить вызванным ДГП ускорением инактивации Са2* канала (Berjukow et al, 2000, 2001). Замедление перехода канала в состояние покоя (при потенциале покоя) находится в прямом соответствии с замедлением обратного перехода из инактивированного в открытое состояние во время деполяризации (Berjukow et al, 2000, 2001). Из-за того, что переход Са2+ канала в состояние покоя под действием вещества происходит сравнительно быстро, частото-зависимое ингибирование канала не так ярко выражено, как в случае ФАА, д-цис дилтиазема или мибефрадила.

Самым интересным результатом является то, что всего лишь одновременного ускорения переходов в инактивированное состояние и замедление обратных переходов достаточно для объяснения сдвига инактивационной кривой (Рис. 14 В,С).

Са„1.2/р„

1.50 3.08 0.45 >30

-100 -80 -во -«О -20 О 20 40 60 иоо -60 -10 -20 0 20 40

Мембранный потенциал, мВ Мембранный потенциал, мВ

Рис. 14. Моделирование эффекта (+)-израдипина на зависимость кинетики Сау1.2 от потенциала.

(А) Нормализованные 1аа через Са„(р1а) (слева) и Сау(р2а) (справа) в контроле и 1 цМ (+)-израдипина. Ионные токи были вызваны 3 сек. деполяризующими импульсами с -80 мВ до +20 мВ. Теоретические кривые построены с помощью модели, описанной Эоко1оу е1 а1., 2000. При деполяризации С а2* каналы осуществляют переходы между открытым (О) и двумя инактивированными - быстрым (I) и медленным (Э) -состояниями:

* . . У

Эффект израдипина воспроизводится ускорением перехода в быстрое инактивированное состояние (а) в 3 раза, и замедлением обратного перехода (р) также в 3 раза.

а Р Г . 6

Сау(р1а) (слева) ■

Контроль 0.45 0.32 0.03 0.03

Израдипин 1.53 0.1 0.03 0.03

Сау(р2а) (справа)

Контроль 0.45 10 0.03 0.03

Израдипин 1.5 3.1 0.03 0.03

(B) Зависимость кинетики инактивации Са»(Ри) (слева) и Сау(р2а) (справа) от потенциала (Зх-секундные деполяризующие импульсы. Экспериментальные данные были приближены функцией Больцмана:

Н_ = И,. +--

" м V - V

1 + ехр(—— к

«концепции взаимозависимости подавления и инактивации». Предполагается, что

израдипин ускоряет переход 0-»1 (константа а на Рис. 10) и замедляет переход 1-»0

(константа р на Рис. 10). Предполагается, что израдипин увеличивает отношение а/р в

9 раз при деполяризующих потенциалах. Таким образом, уравнение Больцман было

рассчитано с учетом действия ДГП:

V - V 1 + Ниехр(—

тт _ К_

«оДЖР - У-У

1 + (Н53 + х - X • Н„) - ехр(— к

где х = 9 - коэффициент, отражающий изменение отношения а/р. Параметры уравнения Больцмана:

НаБ Ун> мВ к, мВ

Сау(р„) 0.31 -10 7

Сау(р2а) 0.85 -30 7

«Взаимозависимость подавления и инактивации» против «Теории модулированного рецептора»: дискуссия и выводы

Принцип «модулированного рецептора» подразумевает, что каналы, связанные с лигандом, также могут осуществлять переходы между состояниями (К, О, I). Ассоциация и диссоциация лиганда и канала добавляют в систему еще одну «степень свободы». Вытекающие из описания схемы кинетические циклы

должны подчиняться принципу термодинамической обратимости. Таким образом, изменение скоростей переходов между состояниями каналов неизбежно приводит к изменению сродства лиганда к состояниям R, О, I.

Тем не менее, математическое описание этой привлекательной идеи оказывается слишком сложным: даже для описания упрощенной кинетической схемы, показанной на Рис. 12А, необходимо 5 дифференциальных уравнений. Выделить такое количество экспоненциальных компонент экспериментально не представляется возможным. Модели, описывающие блокирование инактивированного и открытого состояния каналов, а также идея «взаимозависимости подавления и инактивации», оказались боле удобны для количественного описания взаимодействия лиганда и ионного канала (Рис. 12В, 13, 14 и 15).

Представленные нами данные исследований на рекомбинантных потенциалоуправляемых Ca2* каналах с высоким порогом активации свидетельствуют о том, что лиганд может связываться с каналом независимо от состояния, в котором находится канал (Berjukow et al, 2000, 2001; Hering 2000, 2002; Sokolov et al, 2001).

Получены данные о том, что взаимодействие ß-субъединицы с внутриклеточным линкером между доменами I и II Са2+ канала способно влиять на активность некоторых ингибиторов (Jimeriöz et al, 2000; Sokolov et al, 1999). Это означает, что возможно «аллостерическое» взаимовлияние двух частей молекулы канала, прямое взаимодействие между которыми исключено. Попытки непротиворечиво объяснить эти данные в рамках гипотез блокирования инактивированного или открытого состояния канала, или, например, связыванием лиганда непосредственно с ß-субъединицей, результатов не принесли (Hering et al, 2000, 2002).

А Са!+ Саг+

э, —►

р2 Рз М1811СЗ VI504А ДГП ФАА Дил. Миб.

й "

И V/

Рис. 15. Схема изменений распределения каналов между активируемым и неактивируемыми состояниями под действием р-субъединиц, лигандов и мутаций

Концепция «взаимозависимости подавления и инактивации» основана на следующем экспериментально обнаруженном явлении: мутации в оц-субъединице и «быстрые» р-субъединицы ускоряют инактивацию ионных каналов таким же образом, как ФАА, ДГП, д-цис дилтиазем и мибефрадил (см. так же Асге! е1 а1, 1998; Великом е! а1, 1999, 2000; ЭокоЬу е1 а1, 1999, 2001; Лтепёг е1 а1, 2000). В свою очередь, структурные изменения, вызывающие падение кажущейся чувствительности каналов к лигандам, часто связаны с замедлением макроскопической инактивации. Стрелки на нижней части схемы показывают эффект р- субъединиц (Зоко1оу е1 а1, 2001), мутации М18110 (Вег}ико\л/ е1, 2001) в Сау2.1, \/1504А (Beгjukow е(, 1999) в Сау1.2 и Са2+ антагонистов на константы переходов между открытым и инактивированным состоянием канала.

Гипотеза «взаимозависимости ингибирования и инактивации» объясняет эти данные тем, что лиганд «провоцирует» инактивацию ионного канала. Модель непротиворечиво объясняет изменения кинетики, характерной для блокирования как открытого так и инактивированного состояний каналов, а также сопутствующие изменения инактивационной кривой Саг* канала (Рис. 13, 14 и 15).

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен кластер из четырех аминокислот, замена которых приводит к значительным изменениям в кинетике инактивации потенциалозависимых Са2* каналов. Расположение аминокислот в нижней трети сегмента 1\/Э6 подтверждает предположение о том, что кинетика канала может определяться взаимодействием между сегментами Б5 и Э6, образующими ионопроводящую структуру канала. Представленные данные свидетельствуют о том, что такое взаимодействие сегментов Э5 и Э6 должно зависеть главным образом от заряда и полярности аминокислот.

2. Замены аминокислот, входящих в состав рецепторов Са2+ антагонистов классов ДГП, ФАА и БТЗ, приводят к значительным изменениям кинетики инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов. В свою очередь, мутации аминокислот, приводящие к изменениям кинетики инактивации, также модифицируют чувствительность потенциало-управляемых Са2* каналов к ДГП, ФАА и БТЗ. Способность ДГП, ФАА и БТЗ ингибировать и модифицировать потенциалоуправляемые Са2+ каналы зависит непосредственно от кинетики инактивации таких каналов.

3. Простейшая кинетическая схема, учитывающая переходы между единственным закрытым, единственным открытым и несколькими («быстро-», «медленно-» и «Са2+-») инактивированными состояниями, достаточна для корректного описания эффектов мутаций и р-субъединиц на кинетику потенциалоуправляемых Са2+ каналов.

присутствии лиганда предполагается наличие двух фракций каналов: а) не связанных с лигандом, и, соответственно, с неизменной кинетикой переходов мехеду конформационными состояниями, и Ь) связанных с лигандом - «модифицированных» - каналов с измененной кинетикой переходов между конформационными состояниями. В таком случае в рамках простейшей кинетической схемы (см. Вывод № 3), блокирующее и модифицирующее действия ДГП и ФАА и БТЗ объясняются тем, что эти лиганды меняют кинетику переходов каналов между состояниями, и, в том числе, ускоряют переход в инактивированные состояния.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Hohaus A., Beyl S., Kudrnac М., Berjukow S., Timin E.N., Marksteiner R., Maw M.A., Hering S. (2005) Structural determinants of L-type Channel activation in segment IIS6 revealed by a retinal disorder. J. Biol. Chem. 69(2): 640-649.

2. Hemara-Wahanui A., Berjukow S., Hope CI., Dearden P.K., Wu S.B., Wilson-Wheeler J., Sharp D.M., Lundon-Treweek P., Clover G.M., Hoda J.C.,

• Striessnig J., Marksteiner R., Hering S., Maw M.A. (2005) A CACNA1F mutation identified in an X-linked retinal disorder shifts the voltage dependence of Cav1.4 channel activation. Proc. Natl.. Acad. Sei. USA. 102(21): 7553-7558.

3. Strasser H., Berjukow S., Marksteiner R., Margreiter E., Hering S., Bartsch G., Hering S. (2004) Stem cell therapy for urinary stress incontinence. Exp. Gerontol. 39(9): 1259-1265.

4. Ott H.C., Berjukow S., Marksteiner R., Margreiter E., Bock G., Laufer G., Hering S. (2004) On the fate of skeletal myoblasts in a cardiac environment: down-regulation of voltage-gated ion channels. J. Physiol. 558(Pt 3): 793-805.

5. Sinnegger-Brauns M.J., Hetzenauer A., Huber I.G., Renstrom E., Wietzorrek . G., Berjukow S., Cavalli M., Walter D„ Koschak A., Waldschutz R., Hering S., Bova S., Rorsman P., Pongs O., Singewald N.. Striessnig J. (2004) Isoform-specific regulation of mood behavior and pancreatic beta cell and cardiovascular function by L-type Ca2+ channels. J. Clin. Invest. 113 (10): 1430-1439.

6. Berjukow S., Margreiter E., Marksteiner R., Strasser H., Bartsch G., Hering S. (2004) Membrane properties of single muscle cells of the rhabdosphincter of the male urethra. Prostate 58(3): 238-247.

7. Timin E.N., Berjukow S., S. Hering S (2004) "Concepts of calcium channel state-dependent pharmacology" in "The pharmacology of voltage gated calcium channels" ed. by Stefan I McDonough, Kluwer Academic/Plenum Publisher, New York.

8. Hering S., Sokolov S., Berjukow S., Marksteiner R., Margreiter E. and Evgeni N. Timin (2004) Calcium channel block and inactivation: Insights from structure-activity studies. In "Voltage gated calcium channels" ed. G. Zamponi, Landes Bioscience.

9. Marksteiner R., Schurr P., Berjukow S., Margreiter E., Perez-Reyes E., Hering S. (2001) Inactivation determinants in segment IIIS6 of Cav3.1. J. Physiol. 537(Pt 1): 27-34.

10. Berjukow S., Hering S. (2001) Voltage-dependent acceleration of Cav1.2 channel current decay by (+)- and (-)-isradipine. Br. J. Pharmacol. 133(7): 959-966.

11. Berjukow S., Marksteiner R., Sokolov S., Weiss R.G., Margreiter E., Hering S. (2001) Amino acids in segment IVS6 and beta-subunit interaction support distinct conformational changes during Ca„2.1 inactivation. J. Biol. Chem, 276(20): 17076-17082.

12.Hering S., Berjukow S., Sokolov S., Marksteiner R., Weiss R.G., Kraus R., Timin E.N. (2000) Molecular determinants of inactivation in voltage-gated Ca2* channels. J. Physiol. 528 Pt 2: 237-249.

13.Berjukow S„ Marksteiner R., Gapp F., Sinnegger M.J., Hering S. (2000) Molecular mechanism of calcium channel block by isradipine. Role of a drug-induced inactivated channel conformation. J. Biol. Chem. 275(29): 2211422120.

14. Eller P., Berjukow S., Wanner S., Huber l., Hering S., Knaus H.-G., Toth G., Kimball S.D., Striessnig J. (2000) High affinity interaction of mibefradil with voltage-gated calcium and sodium channels. Br. J. Pharmacol. 130(3): 669677.

15. Berjukow S., Gapp F., Aczel S., Sinnegger M.J., Mitterdorfer J., Glossmann H., Hering S. (1999) Sequence differences between a1C and a1S Ca2* channel subunits reveal structural determinants of a guarded and modulated benzodiazepine receptor. J. Biol. Chem. 274(10): 6154-6160.

16. Hering S., Berjukow S., Aczel S., Timin E.N. (1998) Ca2+ channel block and inactivation: common molecular determinants. Trends Pharmacol. Sei. 19(11): 439-443.

17.Mitterdorfer J. Hering S., Aczöl S., Berjukow S., Degtiar E.D., Döring F., Grabner M., Kraus R., Sinnegger M.J., Striessnig J., Wang Z., Glossmann H. (1998) Molecular basis of drug interactions with calcium channels: a constructive approach. „Low voltage activated T-type calcium channels", Editors: R.W. Tsien, J.-P. Clozel, J. Nargeot, Adis international Ltd, Chowley Oak Lane, Tattehall, Chester, England.

18. Hering S., Aczel S., Kraus R.L., Berjukow S., Striessnig J., Timin E.N. (1997) Molecular mechanism of use-dependent calcium channel block by phenylalkylamines: role of inactivation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94(24): 13323-13328.

19. Degtiar V.E., Aczel S., Döring F., Timin E.N., Berjukow S., Kimball D., Mitterdorfer J., Hering S. (1997) Calcium channel block by (-)devapamil is affected by the sequence environment and composition of the phenylalkylamine receptor site. Biophys. J. 73(1): 157-167.

20. Berjukow S., Aczel S., Beyer B., Kimball S.D., Dichtl M., Hering S., Striessnig J. (1996) Extra- and intracellular action of quaternary devapamil on muscle L-type Ca -channels. Br. J. Pharmacol. 119(6): 1197-1202.

21. Hering S., Aczel S., Grabner M., Döring F., Berjukow S., Mitterdorfer J., Sinnegger M.J., Striessnig J., Degtiar V.E., Wang Z., Glossmann H. (1996)

Transfer of high sensitivity for benzodiazepines from L-type to class A (Bl) calcium channels. J. Biol. Chew. 271(40): 24471-14475.

22.Berjukow S, Doring F., Froschmayr M., Grabner M., Glossmann H., Hering S. (1996) Endogenous calcium channels in human embryonic kidney (HEK293) cells. Br. J. Pharmacol. 118(3): 748-754.

23.Wang Z., Grabner M., Berjukow S., Savchenko A., Glossmann H., Hering S. (1995) Chimeric L-type Ca2t channels expressed in Xenopus laevis oocytes reveal role of repeats III and IV in activation gating. J. Physiol. 486 (Pt 1): 131137.

24.Brauns T., Cai Z.W., Kimball S.D., Kang K.C., Haugland R.P., Berger W., Berjukow S., Hering S., Glossmann H., Striessnig J. (1995) Benzodiazepine binding domain of purified L-type calcium channels: direct labeling using a novel fluorescent diltiazem analogue. Biochemistry 34(10): 3461-3469.

2. ST Бирюков С.А., Тимин E.H., Геринг Ш. (2006) Общие свойства ингибирования и инактивации Са2+ каналов: совпадение или закономерность? Биофизика, т.51, выпуск 6. стр. 000-000.

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Бирюков, Станислав Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ. роль кальция в живых системах потенциалоуправляемые ел2* каналы

Са2+ антагонисты

Формальное описание работы потенциалоуправляемых Са2+ каналов 7 Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп потенциалоуправляемых Са2+ каналов конформационно-зависимое действие веществ

Исследования взаимосвязи структуры и функции белков при помощи рекомбинантных каналов и анализ данных

Цели исследования

Положение, выносимое на защиту

Научная новизна

Теоретическое и практическое значение

Структура диссертации

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Кальции и кальциевые токи через клеточную мембрану

Классификация потенциалоуправляемых Са2+ токов

Как ионы проникают через клеточную мембрану

Субъединицы Са2+ каналов ai-субъединица

3-субъединица ссг-З-субъединица у-субъединица

Классификация потенциалозависимых С а2 4 каналов

Фармакология потенциалоуправляемых Са2+ каналов

Молекулярные основы взаимодействия «канал-лиганд» 28 Структуры рецепторов кальциевых антагонистов на уровне отдельных аминокислот

Структура рецептора Дигидропиридинов

Структуры рецепторов Фенилалкиламинов и Бензотиазепинов 31 Исследования функции потенциалозависимых Са2+ каналов на примере трансгенных организмов

Выключение» экспрессии Cav1 2 (a1C)

Переэкспрессия Cav1 2 (a1C)

Выключение» экспрессии Cav1 3 (a1D)

Выключение» экспрессии Cav2 1 (a1A)

Выключение» экспрессии Cav2 2 (a1B)

Выключение» экспрессии Cav2 3 (a1E)

Выключение» экспрессии /31-субъединицы

Выключение» экспрессии рЗ-субъединицы

Выключение» экспрессии /I-субъединицы 37 Патологические состояния, вызванные мутациями в генах, кодирующих потенциалозависимые СА2+ каналы

Полушарная мигрень

Эпизодическая атаксия, тип 2 (ЕА2)

Мозжечковая (церебеллярная) атаксия, тип 6 (CSA6)

Врожденная стационарная никталопия (xICSNB)

Предрасположенность к злокачественной гипертермии

Периодические гиперкалемические параличи

Ионоселективный фильтр потенциалозависимых Са2+ каналов

Пространственная структура потенциалоуправляемых ионных каналов

Внешний вид» комплекса потенциалозависимого Са2* канала

Пространственная структура потенциалозависимого К* канала 45 конформационные изменения потенциалозависимых СА2+ каналов во время прохождения потенциала действия

Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп Са2+ каналов 53 Мутации, вызывающие полушарную мигрень у человека, изменяют кинетику инактивации са2+ каналов

Исследования механизмов инактиваци с использованием рекомбинантных Са2+ каналов 58 В ионопроводящеи структуре Са2+ канала расположены детерминанты кинетики инактивации

Внутриклеточные петли взаимодействие с р-субъединицами, G-белками и синтаксином

Карбоксильное окончание сплайс-варианты Cav1 2 и Са2+ зависимая инактивация

Структурные определяющие медленной инактивации в Са2+ каналах 66 Структуры, определяющие инактивацию, влияют на связывание лигандов в ионопроводящеи структуре са2+ канала

Выводы и обсуждение

ГЛАВА II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Ооциты xenopus laevis как система для экзогенной экспрессии ионных каналов

Экспрессия химерных а! субъединиц в ооцитах Xenopus laevis

Эксперименты методом двухэлектродной фиксации потенциала

Анализ ингибирования Са2+ и Ва2+ токов Са2+ антагонистами

Конструирование ионных каналов-мутантов

Частота снятия показаний

Программное обеспечение

Статистика 77 Приложение анализ кинетики ингибирования открытого и инактивированного состоянии ионного канала

ГЛАВА III МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ CAV2.1 И РОЛЬ р-СУБЪЕДИНИЦ.

Влияние аминокислот сегмента IVS6 на кинетику инактивации 80 Замена М1811 на полярные и заряженные аминокислоты вызывает значительное ускорение кинетики инактивации

Влияние «консервативных» аминокислот на кинетику инактивации 86 Изменение кинетики инактивации различных мутантов при экспрессии ргд-субъединицы

Обсуждение

Структуры сегмента IVS6, определяющие кинетику инактивации 90 Влияние мутаций в сегменте IVS6 на регулирование кинетики Cav р-субъединицами

Краткое резюме к Главе III

ГЛАВА IV МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ИЗРАДИПИНА: РОЛЬ ИНАКТИВИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ СА2+ КАНАЛА.

Действие р-субъединиц на инактивацию Са2* каналов и ингибирование (+)-израдипином 96 Молекулярные структуры в сегменте IVS6, определяющие инактивацию, влияют на ингибирование Са2* каналов (+)-израдипином 98 Равновесная инактивация и потенциалозависимое ингибирование Са2+ каналов

L-типа

Кинетика израдипин-инактивации при -30 мВ

Действие (+)-израдипина на кинетику 1ВА при+20 мВ . 103 «Восстановление» Ва2+ тока из потенциалозависимого ингибирования (+)-израдипином

Обсуждение

Мутации в сегменте IVS6 влияют на ингибирование (+)-израдипином Са2* канала в состоянии покоя

Роль инактивации в подавлении а1а dhp каналов (+)-израдипином

Роль инактивации при ингибировании Са2* каналов L-muna (+)-израдипином 106 Молекулярные структуры в сегменте IVS6, «ответственные» за инактивацию, определяют кинетику восстановления каналов от инактивации в присутствии (+)израдипина

Молекулярный механизм действия ДГП

Краткое резюме к Главе IV

ГЛАВА V ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОЕ УСКОРЕНИЕ БАРИЕВОГО ТОКА ЧЕРЕЗ CAV1.2 КАНАЛЫ (+)- И (-)-ИЗРАДИПИНОМ.

Подавление (+)- и (-)-израдипином бариевых токов через Са* потенциалозависимое ускорение инактивации lba (+)- и (-)-израдипином

Отличие стабильности (+)- и (-)- израдипин-инактивированных состоянии

Обсуждение

Эффективность ингибирования Са2* каналов в состоянии покоя (-80 мВ) соответствует способности израдипина ускорять переход из состояния покоя в инактивированное состояние (-30 мВ)

Ингибирование открытого состояния или «усиление» инактивации?

Молекулярные структуры СаЛ 2, определяющие «исходную» и лиганд-зависимую инактивацию

Краткое резюме к Главе V

ГЛАВА VI ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНГИБИРОВАНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ СА2+ КАНАЛОВ: СОВПАДЕНИЕ ИЛИ ЗАКОНОМЕРНОСТЬ?.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Потенциалоуправляемые кальциевые каналы: взаимозависимость ингибирования и инактивации"

Потенциалозависимая инактивация и чувствительность химер Cav каналов к лигандам 124

Аминокислоты, расположенные вблизи рецепторов Са2+антагонистов, определяют кинетику инактивации и чувствительность канала к лигандам 126 аминокислоты, не входящие в состав рецепторов СА2+ антагонистов, но определяющие кинетику инактивации, влияют на ингибирование канала лигандами 128 р-субъединица оказывает влияние на кинетику инактивации и подавление канала лигандами 130

Структуры, определяющие кинетику инактивации, и чувствительность каналов к ДГП 132

Роль Са2+-зависимои инактивации в ингибировании канала лигандами 136

Моделирование взаимодеиствия канал-лиганд 137

Обсуждение . 139

ГЛАВА VII КОНФОРМАЦИОННО-ЗАВИСИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ.141

Введение 141 Частотозависимое ингибирование ионного канала в течении последовательности импульсов 142

Количественный анализ частотозависимого ингибирования 145

Как учесть молекулярный механизм ингибирования ионного канала? 147

Зависимость связывания лиганда от состояния канала 149

Ингибирование состояния покоя ионного канала 149

Особенности ингибирования открытого и инактивированного состояний канала 150 Методы исследования конформационно-зависимого ингибирования кальциевых каналов 154

Взаимозависимость ингибирования и инактивации 154

Молекулярный механизм действия ФАА, дилтиазема и мибефрадила 157

Молекулярный механизм действия ДГП 158

Дискуссия и выводы 161

ВЫВОДЫ.164

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.166

ВВЕДЕНИЕ

Роль кальция в живых системах

Уже в конце прошлого столетия было известно, что кальций необходим для поддержания нормальной клеточной активности. Биолог Жак Леб писал: "Как только ткани становятся беднее ионами кальция, тотчас же ионы натрия утрачивают способность вызывать сокращение. После добавления' к раствору хлористого натрия избытка солей кальция ритмические сокращения совершенно прекращаются. Это указывает на то, что сокращения вызываются только при известной концентрации ионов натрия; но когда отношение ионов натрия к ионам кальция становится слишком большим, сокращения становятся невозможными; невозможны они и в том случае, когда это отношение делается слишком малым" (Леб, 1910, цитата воспроизводится согласно книге П. Г. Костюка "Кальций и клеточная возбудимость").

Открытие роли электрического тока, как универсального раздражителя возбудимых тканей, и развитие представлений о наличии в каждой клетке проницаемой - в ответ на определенные стимулы - поверхностной мембраны сделало возможным изучение механизмов, лежащих в основе функционирования возбудимых клеток. В свою очередь, эти исследования заложили основы для понимания механизмов возникновения и проведения потенциала действия - основной формы реакции возбудимой клетки

Особая роль двухвалентных катионов в живых системах была подчеркнута открытием способности белковых макромолекул избирательно связываться с двухвалентными ионами, в том числе с ионами кальция.

Потенциалоуправляемые Са2+ каналы

Для того, чтобы непротиворечиво объяснить механизм возникновения и проведения потенциала действия, оказалось необходимым предположить наличие особой структуры, встроенной в клеточную мембрану. Данная структура должна обеспечивать выборочное проведение определенных ионов через клеточную мембрану в ответ на определенный стимул например в ответ на изменение потенциала. Соответствующая - на тот момент гипотетическая - структура получила название «ионный канал».

Данная структура впоследствии была обнаружена экспериментально. Сначала удалось изолировать и исследовать свойства молекулы натриевого канала, а потом и измерить ионный ток через отдельный ионный канал.

На данный момент описано множество типов ионных каналов. Каналы способны избирательно проводить определенные ионы - как катионы, так и анионы - натрия, калия, кальция, хлора и некоторые другие. Ионные каналы, изменяют проводимость - «открываются» или «закрываются» - в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны (потенциалоуправляемые каналы) или в ответ на изменение концентрации некоторых ионов - например того же кальция (!). Активность канала может также зависеть от концентрации достаточно сложных лигандов, таких как у-аминомасляная кислота, ацетилхолин, аденозинтрифосфат, инозитолтрифосфат или циклические нуклеотиды (хемовозбудимые каналы).

В данной работе мы подробно рассмотрим работу каналов, которые открываются в ответ на изменение потенциала клеточной мембраны и избирательно проводят ионы кальция - т.е., потенциалоуправляемые кальциевые каналы.

Ca2* антагонисты

В 60х годах Fleckenstein обнаружил, что различные вещества способны избирательно подавлять «входящие» Са2+ токи, вызванные деполяризацией клеточной мембраны. Исследования, выполненные на клетках сердечных и гладких мышц, показали, что это ведет к уменьшению сократительной силы и делает невозможным проведение потенциала действия (Р1ескепз1ет е1 а1., 1983). Увеличение концентрации Са2+ вновь увеличивало силу мышечных сокращений и восстанавливало проводимость Са2+ потенциала действия. Это дало повод ввести термин Са2+ антагонисты.

Фармакологическая активность Са2+ антагонистов, например их антиаритмическое и сосудо-расслабляющее действие, объясняется потенциало- и частото-зависимым (для ФАА и БТЗ) ингибированием проникновения ионов Са2+ через каналы 1-типа в гладких и сердечных мышцах. Ингибирование потока двухвалентных ионов через Са2+ каналы определяется высокоспецифичным взаимодействием Са2+ антагонистов с соответствующими рецепторами (Са1ега11 е1 а1., 1992, БМезвтд е! а1., 1993)

Молекулярные механизмы, лежащие в основе взаимодействия Са2+ антагонистов с соответствующими рецепторами, а также эффект такого действия на ионный канал в целом, на данный момент исследованы недостаточно.

Формальное описание работы потенциалоуправляемых Са2+ каналов

При потенциалах покоя потенциалоуправляемые Са2+ каналы находятся в закрытом состоянии, или, другими словами, в состоянии покоя. В ответ на деполяризацию мембраны клетки каналы открывается (активируются), или, другими словами, переходят в открытое состояние. При продолжительной деполяризации каналы переходят в непроводящее инактивированное состояние, те., инактивируются. Отличие инактивированного и закрытого состояний канала (или состояния покоя) состоит в том, что под действием потенциала инактивированный канал не может немедленно активироваться, в то время как «просто» закрытый (в состоянии покоя) канал - может. При последующей реполяризации каналы переходят из инактивированного состояния в состояние покоя, или, другими словами, восстанавливаются от инактивации.

Кинетика инактивации - отличительная черта подгрупп потенциалоуправляемых Ca2* каналов.

Для точного контроля притока ионов Са2+ во внутриклеточное пространство в процессе эволюции возникло семейство потенциалоуправляемых Са2+ каналов с различными биофизическими и фармакологическими свойствами. Одним из основных отличительных признаков подклассов Са2+ каналов является кинетика инактивации. Интересно отметить, что в процессе эволюции «дополнительно» к различным типам каналов появилось несколько инактивационных механизмов.

Каналы семейства Cav3 (Cav3.1-Cav3.3, или же каналы Т-типа) обладают самой быстрой кинетикой инактивации среди потенциалоуправляемых Са2+ каналов, если использовать Ва2+ в качестве носителя заряда. Несколько медленнее инактивируются Cav2.3 (R-тип), еще медленнее Cav2 2 (N-тил) и Cav2.1 (P/Q-тип). Медленнее всего инактивируются Ва2+ токи через каналы семейства Cav1, в частности Cav1.1 (каналы L-типа, характерные для скелетно-мышеченых клеток).

Конформационно-зависимое действие веществ

Предположение о том, что эффективность связывания вещества с ионным каналом зависит от того, в каком состоянии - покоя (R, от „Rest"), открытом (О, „Open") или инактивированном (I, „Inactivated") - находится канал, впервые высказали Armstrong (1966,1969) и Strichartz (1973). Эта идея легла в основу гипотезы «модулированного рецептора» («modulated drug receptor»; Hille, 1977; Hondghem et al, 1977).

Суть явления заключается в том, что некоторые вещества ингибиируют ионный канал эффективнее, если канал «используется», т.е. находится в открытом или инактивированном состояниях (во время, например, потенциала действия). В английском языке этот эффект получил логичное название «use-dependent inhibition» - ингибирование, зависимое от использования (Courtney, 1975). Используемый в русском языке термин частотозависимое подавление (ингибирование)» быть может не так элегантен, но суть явления отражает не менее точно.

Исследования взаимосвязи структуры и функций белков при помощи рекомбинантных каналов и анализ данных.

На данный момент можно выделить 2 основных подхода в исследовании взаимосвязи структуры и функций белков.

1. Создание молекул-«химер», состоящих из фрагментов двух различных по своим свойствам белков. Последующее сравнение свойств полученных рекомбинантных («химерных») белков со свойствами исходной молекулы позволяет идентифицировать те структурные элементы, которые «отвечают» за воспроизведение функций, уникальных для одной из исходных молекул. Обычно такой подход используется в качестве «первой итерации».

2. Замена отдельных аминокислот («точечные мутации») и сравнение свойств полученных рекомбинантных каналов со свойствами исходной молекулы.

Однако в случае ионных каналов подобные критерии применимы редко. В частности, для оценки эффективности лигандов, для которых характерно частотозависимое (например, БТЗ и ФАА) или потенциалозависимое (например, ДГП) действие, простейших критериев оказывается недостаточно: возникает необходимость подробного анализа кинетики ингибирования и/или изменения кинетики самого канала под действием лиганда. «Готового к работе» метода анализа, способного учесть модификацию кинетики канала лигандом, на момент начала работы не существовало.

Отдельного разговора заслуживают исследования последствий замен отдельных аминокислот или участков аминокислотной последовательности на потенциалозависимость активации и инактивации, а также на кинетику активации и инактивации. Попыток описать изменения кинетики инактивации Са2+ каналов в рамках даже простейшей кинетической схемы отмечено не было.

Вопрос о том, можно ли в рамках существующих на данный момент концепций - «модулированного рецептора» и/или «лиганд-индуцированной медленной инактивации» - непротиворечиво объяснить все вышеописанные явления, в частности в рекомбинантных каналах, на момент начала работы так же оставался открытым.

Вопрос о (взаимо-) связи кинетики инактивации канала и его чувствительности к определенным лигандам на первый взгляд может показаться лишенным смысла. Тем не менее, аргументом в пользу существования такой взаимосвязи является тот факт, что некоторые мутации отдиночных аминокислот приводят к одновременному изменению кинетики инактивации и чувствительности канала к определенным лигандам.

Цели исследования

2. Разработать концепцию для описания изменений работы потенциалоуправляемых Са2+ каналов под действием лигандов, ионов, замен участков последовательности, мутаций и экспрессии различных регуляторных белков (например, дополнительных субъединиц). В частности, разработать методику определения механизма действия лигандов и их «фармакологической» активности по отношению к потенциалоуправляемым Са2+ каналам.

Положение, выносимое на защиту

Способность ДГП, ФАА и БТЗ ингибировать и модифицировать потенциалоуправляемые Са2+ каналы зависит непосредственно от кинетики инактивации таких каналов. Ингибирующее и модифицирующее действия ДГП и ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы объясняются тем, что эти лиганды меняют кинетику переходов каналов между состояниями, и, в том числе, ускоряют переход в инактивированные состояния.

Научная новизна

Обнаружен кластер из четырех аминокислот, замена которых приводит к значительным изменениям в кинетике инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов. Расположение аминокислот в нижней трети сегмента 1\/Б6 подтверждает предположение о том, что кинетика канала зависит от взаимодействий между сегментами Б5 и Б6, образующими ионопроводящую структуру канала. Представленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие сегментов Б5 и Б6 зависит главным образом от заряда и полярности аминокислот.

Показана взаимозависимость процессов инактивации и ингибирования потенциалоуправляемых Са2+ каналов. В частности, одни и те же молекулярные структурные элементы могут входить как в состав «рецептора» определенного лиганда, так и в состав структуры, определяющую кинетику инактивации. Кроме того, показана корреляция между ингибирующей активностью лиганда по отношению к Са2+ каналу и кинетикой инактивации Са2+ каналов.

Показано, что теории «модулированного (защищенного) рецептора» и «лиганд-зависимой медленной инактивации» недостаточны для корректного описания всех аспектов действия ДГП, ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы. Предложена альтернативная гипотеза, позволяющая непротиворечиво описать взаимовлияние кинетики инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов и способности лигандов изменять работу таких каналов.

Предложена методика оценки активности лигандов, обладающих частотозависимым действием на потенциалоулравляемые Са2+ каналы, а также способности Са2+ антагонистов модифицировать работу Са2+ каналов. Методика основана на анализе измеряемых экспериментально зависимостей а) кинетики ионных токов и/или Ь) ингибирования ионных токов от I) частоты стимулирования и) длины импульсов и ш) концентрации лиганда в рамках простейшей кинетической модели.

Теоретическое и практическое значение.

Информация о механизмах взаимодействия Са2+ антагонистов классов ДГП, ФАА и БТЗ с потенциалоуправляемыми Са2+ каналами на молекулярном уровне (лиганд-рецептор) должна оказать существенную помощь в разработке новых лекарственных препаратов.

Описанная методика позволяет определить механизмы действия лиганда на ионный канал («модулятор кинетики», «ингибитор открытого состояния канала» и тд.) и сравнительно точно предсказать поведение каналов в сложных системах, например при повторяющемся стимулировании в присутствии нескольких модуляторов (различных ионов, лигандов, дополнительных субъединиц и т д). Всесторонняя оценка действия лиганда на ионный канал имеет первостепенную важность при оценке его эффективности как «потенциального» лекарственного препарата

Способность потенциалоуправляемых Са2+ каналов изменять свои свойства под действием различных ионов, лигандов и белков позволяет исследовать многие физиологические - в особенности регуляторные -процессы с новой точки зрения.

Структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бирюков, Станислав Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен кластер из четырех аминокислот, замена которых приводит к значительным изменениям в кинетике инактивации потенциалозависимых Са2+ каналов. Расположение аминокислот в нижней трети сегмента 1\/Б6 подтверждает предположение о том, что кинетика канала может определяться взаимодействием между сегментами Б5 и Б6, образующими ионопроводящую структуру канала. Представленные данные свидетельствуют о том, что такое взаимодействие сегментов Б5 и Б6 должно зависеть главным образом от заряда и полярности аминокислот.

2. Замены аминокислот, входящих в состав рецепторов Са2+ антагонистов классов ДГП, ФАА и БТЗ, приводят к значительным изменениям кинетики инактивации потенциалоуправляемых Са2+ каналов. В свою очередь, мутации аминокислот, приводящие к изменениям кинетики инактивации, также модифицируют чувствительность потенциалоуправляемых Са2+ каналов к ДГП, ФАА и БТЗ. Способность ДГП, ФАА и БТЗ ингибировать и модифицировать потенциалоуправляемые Са2+ каналы зависит непосредственно от кинетики инактивации таких каналов.

4. Теории «модулированного (защищенного) рецептора» и «лиганд-зависимой медленной инактивации» недостаточны для корректного описания всех аспектов действия ДГП, ФАА и БТЗ на потенциалоуправляемые Са2+ каналы Ь-типа. Предложена альтернативная гипотеза, согласно которой лиганд и канал взаимодействуют независимо от конформационного состояния канала. В присутствии лиганда предполагается наличие двух фракций каналов' а) не связанных с лигандом, и, соответственно, с неизменной кинетикой переходов между конформационными состояниями, и Ь) связанных с лигандом - «модифицированных» - каналов с измененной кинетикой переходов между конформационными состояниями. В таком случае в рамках простейшей кинетической схемы (см. Вывод № 3), ингибирующее и модифицирующее действия ДГП и ФАА и БТЗ объясняются тем, что эти лиганды меняют кинетику переходов каналов между состояниями, и, в том числе, ускоряют переход в инактивированные состояния.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Бирюков, Станислав Анатольевич, Пущино

1. Ходжкин А (1965) «Нервный импульс», «Мир», Москва.

2. Ходоров Б. И. (1983) "Физиология возбудимых тканей" в Серии "Руководство по физиологии". Наука. Ленинград.

3. Acharya K.R., Lloyd M.D. (2005) The advantages and limitations of protein crystal structures. Trends Pharmacol Sci 26(1): 10-14.

4. Aczel S., Kurka В., Hering, S. (1998). Mechanism of voltage- and use-dependent block of class A Ca2+ channels by mibefradil. Br. J. Pharmacol 125: 447-454.

5. Adams В., Tanabe T. (1997). Structural regions of the cardiac Ca channel a-subunit involved in Са-dependent inactivation. J. Gen Physiol 110: 379-389.

6. Ankkath J., Campbell K.P. (2003) Auxiliary subumts: essential components of the voltage-gated calcium channel complex. Curr. Opm Neurobiol 13(3): 298-307.

7. Armstrong C.M. (1966) Time course of TEA(+)-induced anomalous rectification in squid giant axons. J Gen. Physiol 50(2): 491-503.

8. Armstrong C.M. (1969) Inactivation of the potassium conductance and related phenomena caused by quaternary ammonium ion injection in squid axons. J. Gen. Physiol 54(5): 553-575.

9. Auld V.J., Goldin A L., Krafte D.S., Marshall J., Dunn J.M., Catterall WA, Lester H A., Davidson N., Dunn R.J. (1988) A rat brain Na+ channel a-subumt with novel gating properties. Neuron 1(6): 449-461.

10. Barnard E.A., Miledi R., Sumikawa K. (1982) Translation of exogenous messenger RNA coding for nicotinic acetylcholine receptors produces functional receptors in Xenopus oocytes. Proc. R Soc Lond В Biol Sci 215:241-246.

11. Bean B.P. (1984) Nitrendipine block of cardiac calcium channels: high-affinity binding to the inactivated state. Proc Natl Acad Sci USA 81: 6388-6392.

12. BenatarM.G. (1999) Calcium channelopathies QJM 92(3): 133-141.

13. Berjukow S., Doring F., Froschmayr M., Grabner M., Glossmann H., Hering S. (1996) Endogenous calcium channels in human embryonic kidney (HEK293) cells. Br J Pharmacol 118:748-754.

14. Berjukow S , Hering S. (2001) Voltage-dependent acceleration of Ca(v)1 2 channel current decay by (+)- and (-)-isradipine. Br. J Pharmacol 133: 959-966.

15. Berjukow S., Marksteiner R., Gapp F., Sinnegger M.J., Hering S (2000). Molecular mechanism of calcium channel block by isradipine: Role of a drug-induced inactivated channel conformation. J Biol Chem 275:22114-22120.

16. Berjukow S., Marksteiner R., Sokolov S., Weiss R.G., Margreiter E., Hering S. (2001) Amino acids in segment IVS6 and p-subumt interaction support distinct conformational changes during Cav2.1 inactivation. J Biol Chem 276: 1707617082.

17. Bernatchez G., Talwar D., Parent, L. (1998). Mutations in the EF-hand motif impair the inactivation of barium currents of the cardiac a1C channel. Biophys J 75: 1727-1739.

18. Berridge M.J. (1997). Elementary and global aspects of calcium signaling. J Physiol (London) 499: 291-306.

19. Bezanilla F. (2003) Voltage sensor movements. J. Gen. Physiol 120(4)- 465-473.

20. Bezanilla F., Armstrong, C.M. (1977). Inactivation of sodium channel. II. Gating current experiments. J Gen Physiol 70: 567-590.

21. Bezprozvanny I., Scheller R.H., Tsien R.W. (1995). Functional impact of syntaxin on gating of N-type and Q-type calcium channel. Nature 378:623-626.

22. Bezprozvanny I., Tsien R.W. (1999 95?) Voltage-dependent blockade of diverse types of voltage-gated Ca2+ channels expressed in Xenopus oocytes by the Ca2+ channel antagonist mibefradil (Ro 40-5967). Mol Pharmacol 48(3): 540-549.

23. Billups S.J., Carter B.L. (1998) Mibefradil: a new class of calcium-channel antagonists. Ann Pharmacother. 32(6): 659-671.

24. Birnbaumer L., Campbell K P., Catterall W.A., Harpold M.M., Hofmann F., Home W.A., Mori Y., Schwartz A., Snutch T.P., Tanabe T., Tsien R.W. (1994). The naming of voltage-gated calcium channels. Neuron, 13: 505-506.

25. Black J.L. 3rd. (2003) The voltage-gated calcium channel gamma subunits: a review of the literature. J. Bioenerg Biomembr. 35(6): 649-660.

26. Bourinet E., Soong T.W., Sutton K., Slaymaker S., Mathews E., Monteil A., Zamponi G.W., Nargeot J., Snutch T.P. (1999). Splicing of a1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci 5:407-415.

27. Bouron A., Soldatov N. M., Reuter H. (1995). The Pi-subunit is essential for modulation by protein kinase C of an human and a non-human L-type Ca2+ channel. FEBS Lett 377:159-162.

28. Brehm P., Eckert R. (1978). Calcium entry leads to inactivation of calcium channel in Paramecium. Science 202:1203-1206.

29. Catterall W.A. (1995) Structure and function of voltage-gated ion channels. Annu. Rev.Biochem. 64:493-531.

30. Catterall WA. (1998) Structure and function of neuronal Ca2+ channels and their role in neurotransmitter release. Cell Calcium. 24: 307-323.

31. Catterall W.A. (1999). Interactions of presynaptic Ca2+ channel and snare proteins in neurotransmitter release. Ann NY Acad Sci 868:144-159.

32. Catterall W.A. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels Annu Rev Cell Dev Biol 16:521-555.

33. Catterall W.A., Striessnig J. (1992) Receptor sites for Ca2+ channel antagonists. Trends. Pharmacol Sci 3(6): 256-262.

34. Cens T., Restituito S., Galas S, Charnet P. (1999). Voltage and calcium use the same molecular determinants to inactivate calcium channels. J Biol Chem 274: 5483-5490.

35. Chandy KG., Gutman G.A. (1993) Nomenclature for mammalian potassium channel genes. Trends. Pharmacol Sci 14(12): 434.

36. Chien A J., Carr K.M., Shirokov R.E., Rios E., Hosey M.M. (1996). Identification of palmitoylation sites within the L-type calcium channel p2a subunit and effects on channel function. J Biol Chem 271:26465-26468.

37. Cole K.S. (1949) Dynamic electrical characteristics of the squid axon membrane. Arch Sci Physiol. 3: 253-258.

38. Courtney K R. (1975) Mechanism of frequency-dependent inhibition of sodium currents in frog myelinated nerve by the lidocaine derivative GEA. J. Pharmacol Exp Ther. 195: 225-236.

39. Curtis B.M., Catterall W.A. (1984) Purification of the calcium antagonist receptor of the voltage-sensitive calcium channel from skeletal muscle transverse tubules. Biochemistry 23(10): 2113-2118.

40. Dascal N. (1987). The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC. Crit Rev. Biochem 22: 317-387.

41. Degtiar V.E., Scheller R.H., Tsien, R.W. (2000). Syntaxln modulation of slow inactivation of N-type calcium channels. J. Neurosci 20:4355-4367.

42. De Leon M., Wang Y., Jones L., Perez-Reyes E., Wei X., Soong T.W., Snutch T.P., Yue D.T. (1995). Essential Ca2+-binding motif for Ca2+-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels. Science 270:1502-1506.

43. De Waard M., Liu H., Walker D., Scott V.E., Gurnett C.A., Campbell, K P. (1997). Direct binding of G-protein p-y complex to voltage-dependent calcium channels. Nature 385: 446-450.

44. De Waard M., Campbell, P.P. (1995). Subunit regulation of the neuronal aiA Ca2+ channel expressed in Xenopus oocytes. J. Physiol 485: 619-634.

45. Doering F., Degtiar V. E., Grabner M., Striessnig J., Hering S., Glossmann H. (1996). Transfer of L-type calcium channel IVS6 segment increases phenylalkylamine sensitivity of aiA (Bl). J Biol Chem 271:11745-11749.

46. Dolphin AC. (1998). Mechanisms of modulation of voltage-dependent calcium channels by G proteins. J. Physiol. 506: 3-11.

47. Dolphin A.C., Wyatt C.N., Richards J., Beattie R.E., Craig P., Lee J.H , Cribbs L.L., Volsen S.G., Perez-Reyes E. (1999). The effect of a2-5 and other accessory subunits on expression and properties of the calcium channel a1G. J Physiol. 519: 35-45.

48. Doyle D A., Morais Cabral J., Pfuetzner RA, Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. (1998). The structure of the potassium channel molecular basis of KC conduction and selectivity. Science 280. 69-77.

49. Eller P., Berjukov S., Wanner S., Huber I., Hering S., Knaus H.G., Toth G., Kimball S.D., Striessnig J. (2000) High affinity interaction of mibefradil with voltage-gated calcium and sodium channels. Br. J Pharmacol. 130(3): 669-677.

50. Ellinor P.T., Yang J., Sather W.A., Zhang J.F., Tsien R.W. (1995). Ca2+ channel selectivity at a single locus for high-affinity Ca2+ interactions. Neuron 15: 11211132.

51. Ernst M.E., Kelly M.W. (1998) Mibefradil, a pharmacologically distinct calcium antagonist. Pharmacotherapy 18(3):463-485.

52. Ertel E A, Campbell K.P., Harpold M.M., Hofmann F., Mori Y., Perez-Reyes E., Schwartz A., Snutch T.P., Tanabe T., Birnbaumer L., Tsien R.W., Catterall W.A. (2000) Nomenclature of voltage-gated calcium channels. Neuron 25(3): 533-535.

53. Fatt P., Ginsbourg B.L. (1958) The ionic requirements for the production of action potential in crustsean muscle fibres. J Physiol (Lond) 142: 516-543.

54. Felix R. (2000) Channelopathies: ion channel defects linked to heritable clinical disorders .J Med Genet 37(10):729-740.

55. Fleckenstein A. (1983a). History of calcium antagonists Circ Res 52:13-16.

56. Fleckenstein A. (1983b). Calcium antagonism in heart and smooth muscle. New York, John Wiley & Sons

57. Fletcher C.F., Lutz C.M., O'Sullivan T.N., Shaughnessy J D. Jr, Hawkes R., Frankel W.N., Copeland N.G., Jenkins N.A. (1996) Absence epilepsy in tottering mutant mice is associated with calcium channel defects. Cell 87: 607-617.

58. Forsythe I.D., Tsujimoto T., Barnes-Davies M., Cuttle M.F., Takahashi T. (1998) Inactivation of presynaptic calcium current contributes to synaptic depression at a fast central synapse. Neuron 20: 797-807.

59. Ganitkevich V.Ya., Shuba M.F., Smirnov S.V. (1987) Calcium-dependent inactivation of potential-dependent calcium inward current in an isolated guinea-pig smooth muscle cell. J Physiol 392:431-449.

60. Glossmann H., Ferry D.R. (1985) Assay for calcium channels. Methods Enzymol 109:513-550.

61. Glossmann H, Ferry D.R., Striessnig J., Göll A., Moosburger K. (1987) Trends Pharmacol Sei. 8:95-100.

62. Glossmann H., Striessnig J. (1990). Molecular properties of calcium channels. Rev Physiol Biochem. Pharmacol. 114:1-105.

63. Grabner M., Wang Z., Hering S., Striessnig J., Glossmann H. (1996). Transfer of 1,4-dihydropyridine sensitivity from L-type to class A (Bl) calcium channels. Neuron. 16: 207-218.

64. Gundersen C.B., Miledi R., Parker I. (1984) Messenger RNA from human brain induces drug- and voltage-operated channels in Xenopus oocytes. Nature 308: 421-424.

65. Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971) Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature 233. 177-182.

66. Hagiwara S., Saito N. (1959) Voltage-current relations in nerve cell membrane of Onchidium verruculatum. J. Physiol (Lond) 148:161-179.

67. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F.J. (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cellfree membrane patches. PflugersArch 391(2): 85-100.

68. Handrock R., Rao-Schymanski R., Klugbauer N., Hofmann F., Herzig S. (1999) Dihydropyridine enantiomers block recombinant L-type Ca2+ channels by two different mechanisms. J. Physiol 521(1): 31-42.

69. Hanlon M.R., Wallace B.A. (2002) Structure and function of voltage-dependent ion channel regulatory p-subunits. Biochemistry. 41(9): 2886-2894.

70. He M., Bodi I., Mikala G., Schwartz A. (1997) Motif III S5 of L-type calcium channels is involved in the dihydropyridine binding site. A combined radioligand binding and electrophysiological study. J Biol Chem 272(5): 2629-2633.

71. Heady T.N., Gomora J.C., Macdonald T.L., Perez-Reyes E. (2001) Molecular pharmacology of T-type Ca2+ channels. Jpn. J. Pharmacol. 85(4): 339-350.

72. Hering S. (2002) p-Subunits: fine tuning of Ca2+ channel block. Trends Pharmacol Sci 23(11): 509-513.

73. Hering S., Aczel S., Kraus R.L., Berjukow S., Striessnig J., Timin, E.N. (1997). Molecular mechanism of use-dependent calcium channel block by phenylalkylamines: role of inactivation. Proc Natl Acad Sci. USA 94: 1332313328.

74. Hering S., Berjukow S., Aczel S., Timin, E.N. (1998). Calcium channel block and inactivation: common molecular determinants. Trends Pharmacol Sci 19: 439443.

75. Hering S., Berjukow S., Sokolov S., Marksteiner R., Weiss R.G, Kraus R., Timin E.N. (2000) Molecular determinants of inactivation in voltage-gated Ca2+ channels. J Physiol 528: 237-249.

76. Hille B. (1977) Local anesthetics: hydrophilic and hydrophobic pathways for the drug-receptor reaction. J. Gen Physiol 69:497-515.

77. Hille, B. (1978) in Biophysical Aspects of cardiac Muscle (Academic Press), 55-73.

78. Hille B. (1992). Ion channels of excitable membranes. 2nd edition, Smauer assciates, Sunderland, Massachusets.

79. Hockerman G.H., Dilmac N., Scheuer T., Catterall W.A. (2000) Molecular determinants of diltiazem block in domains IIIS6 and IVS6 of L-type Ca2+ channels. Mol Pharmacol 58(6): 1264-1270.

80. Hockerman G.H., Johnson B.D., Scheuer T., Catterall WA. (1995) Molecular determinants of high affinity phenylalkylamine block of L-type calcium channels. J. Biol Chem 270(38): 22119-22122.

81. Hockerman G.H., Peterson B.Z, Johnson B.D., Catterall W.A. (1997b). Molecular determinants of drug binding and action on L-type calcium channels. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37:361-396.

82. Hodgkin A.L., Huxley A.F. (1952a) Currents curried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol (Lond) 116: 449472.

83. Hodgkin A.L , Huxley A F. (1952b) The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol (Lond) 116:473-496.

84. Hodgkin A.L., Huxley A.F. (1952c) The dual effect of membtrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo. J Physiol (Lond J 116:497-506.

85. Hodgkin A.L., Huxley A.F. (1952d) A quantitative decription of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond ) 117: 500-544.

86. Hodgkin A.L., Keyenes R.D. (1955a) Active transport of cations in giant axon from Sepia and Loligo. J Physiol (Lond.) 128: 28-60.

87. Hodgkin A.L., Keyenes R.D. (1955b) Potassium permeability of a giant nerve fibre. J. Physiol (Lond.) 128: 61-88.

88. Hofmann F., Lacinova L. Klugbauer N. (1999) Voltage-dependent calcium channels: from structure to function. Rev Physiol. Biochem Pharmacol 139: 3387.

89. Hondghem L.M., Katzung B.G. (1977) A unifying molecular model for the interaction of antiarrhythmic drugs with cardiac sodium channels: application to quinidine and lidocaine. Biochim. Biophys Acta 472: 373-377.

90. Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77(1): 61-68.

91. Hoshi T., Zagotta W.N., Aldrich R.W. (1990) Biophysical and molecular mechanisms of Shaker potassium channel inactivation. Science 250: 533-538.

92. Jen J. (1999) Calcium channelopathies in the central nervous system. Curr. Opm Neurobiol 9: 274-280.

93. Jentsch T. J., Steinmeyer K., Schwarz G. (1990). Primary structure of Torpedo marmorata chloride channel isolated by expression cloning in Xenopus oocytes. Nature 348: 510-514.

94. Jimenéz C., Bourinet E., Leuranguer V., Richard S., Snutch T.P., Nargeot J. (2000) Determinants of voltage-dependent inactivation affect Mibefradil block of calcium channels. Neuropharmacology. 39:1-10.

95. Julius D., MacDermott AB., Axel R„ Jessell T. M. (1988). Molecular characterization of a functional cDNA encoding the serotonin 1c receptor. Science 241:558-564.

96. Jiang Y., MacKinnon R. (2000) The barium site in a potassium channel by X-ray crystallography. J Gen Physiol. 115:269-272.

97. Katz B. (1962) The Croonian lecture. The transmission of impulses from nerve to muscle and subcellular unit of synaptic action. Proc R. Soc Lond B. 155: 455477.

98. Khodorov B.I. (1979) Some aspects of the pharmacology of sodium channels in nerve membrane. Process of inactivation. Biochem Pharmacol 28:1451-1459.

99. Khodorov B.I. (1981) Sodium inactivation and drug-induced immobilization in nerve membrane Prog Biophys Mol Biol 37: 49-89.

100. Kim M.S., Morii T., Sun L.X., Imoto K., Mori Y. (1993). Structural determinants of ion selectivity in brain calcium channel. FEBS Lett 318:145-148.

101. Klugbauer N., Dai S., Specht V., Lacinova L., Marais E., Bohn G , Hofmann F. (2000). A family of y-like calcium channel subunits. FEBS Lett 470:189-197.

102. Kobilka B.K., Kobilka T.S., Daniel K., Regan J.W., Caron M.G., Lefkowitz R.J. (1988) Chimeric a2-p2 adrenergic receptors: delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science. 240:1310-1316.

103. Kraus R.L., Hering S., Grabner M., Ostler D., Striessnig J. (1998) Molecular mechanism of diltiazem interaction with L-type Ca2+ channels. J. Biol Chem. 273: 27205-27215.

104. Kraus R.L., Sinnegger M.J., Glossmann H., Hering S., Striessnig, J. (1998). Familial hemiplegic migraine mutations change a1A Ca2+ channel kinetics. J. Biol Chem 273: 5586-55890.

105. MacKinnon R. (2003) Potassium channels. FEBS Lett. 555: 62-65.

106. Marmont G. (1949) Studies on the axon membrane. I. A new method. J. Cell Comp Physiol 34:351-382.

107. McDonald T.F., Pelzer D., Trautwein W. (1984) Cat ventricular muscle treated with D600: characteristics of calcium channel block and unblock. J Physiol 352: 217241.

108. Mikala G., Bahinski A., Yatani A., Tang S., Schwartz A. (1993). Differential contribution by conserved glutamate residues to an ion-selectivity site in the L-type Ca2+ channel pore. FEBS Lett 35: 265-269.

109. Miledi R., Parker I., Sumikawa K. (1982) Properties of acetylcholine receptors translated by cat muscle mRNA in Xenopus oocytes. EMBO J 1:1307-1312.

110. Miljanich G.P., Ramachandran J. (1995) Antagonists of neuronal calcium channels: structure, function, and therapeutic implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35: 707-734.

111. Moorman J. R., Kirsch G. E., VanDongen A. M., Joho R. H., Brown A. M. (1990). Fast and slow gating of sodium channels encoded by a single mRNA. Neuron 4: 243-252.

112. Motoike H.K., Bodi I., Nakayama H., Schwartz A., Varadi, G. (1999). A region in IVS5 of the human cardiac L-type calcium channel is required for the use-dependent block by phenylalkylamines and benzodiazepines. J Biol Chem 274: 9409-9420.

113. Muth J.N., Bodi I., Lewis W., Varadi G., Schwartz A. (2001a) A Ca2+-dependent transgenic model of cardiac hypertrophy: A role for protein kinase C-a. Circulation. 103(1): 140-147.

114. Muth J.N., Varadi G., Schwartz A. (2001b) Use of transgenic mice to study voltage-dependent Ca2+channels. Trends Pharmacol Sci 22(10): 526-532.

115. Nakamura Y., Nakajima S., Grunfest H. (1965) Analysis of spike electrogenesys and depolarizing K inactivation in electroplaques of Electrophorus electricus, L. J Gen Physiol 49: 321-349.

116. Narahashi T.J., Moore W., Scott W.R. (1964) Tetrodotoxin blocade of sodium conductance increase in lobster giant axon. J Gen Physiol 47:965-974.

117. Nawrath H., Wegener J.W. (1997) Kinetics and state-dependent effects of verapamil on cardiac L-type calcium channels. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 355: 79-86.

118. Neher E., Sakmann B. (1976) Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 260: 799-802.

119. Ophoff R A., Terwindt G.M., Vergouwe M.N., van Eijk R., Oefner P.J., Hoffman S M., Lamerdin J.E., Mohrenweiser H.W., Bulman D.E., Ferrari M., Haan J., Lindhout D., van Ommen G.J., Hofker M.H., Ferrari M.D., Frants R.R. (1996)

120. Familial hémiplégie migraine and episodic ataxia type-2 are caused by mutations in the Ca2+ channel gene CACNL1A4. Cell 87(3): 543-552.

121. Parent L., Gopalakrishnan M., Lacerda A.E., Wie X., Perez-Reyes E. (1995). Voltage-dependent inactivation in a cardiac-skeletal chimeric calcium channel. FEBSLett 360:144-150.

122. Patil P.G., Brody D.L., Yue, D.T. (1998). Preferential closed-state inactivation of neuronal calcium channels. Neuron 20:1027-1038.

123. Perez-Reyes E., Lee J.H., Cribbs L-L. (1999). Molecular characterization of two members of the T-type calcium channel family. Ann N Y. Acad Sci. 868:131-143.

124. Peterson B Z., DeMaria C.D., Yue D.T. (1999). Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+-dependet inactivation of L-type calcium channels. Neuron 22: 549-558.

125. Peterson B Z, Johnson B.D., Hockerman G.H., Acheson M , Scheuer T., Catterall WA (1997) Analysis of the dihydropyridine receptor site of L-type calcium channels by alanine-scanning mutagenesis. J. Biol Chem. 272(30): 18752-18758.

126. Peterson B.Z, Lee J.S., Mulle J.G., Wang Y., DeLeon M., Yue D.T. (2000) Critical determinants of Ca2+-dependent inactivation within an EF-hand motif of L-type Ca2+ channels. Biophys J. 78:1906-1920.

127. Peterson B.Z., Tanada T.N., Catterall W.A. (1996) Molecular determinants of high affinity dihydropyridine binding in L-type calcium channels J. Biol. Chem 271(10): 5293-5296.

128. Pichler M., Cassidy T.N., Reimer D., Haase H., Kraus R., Ostler D., Striessnig J. (1997) p-subunit heterogeneity in neuronal L-type Ca2+ channels. J. Biol Chem 272:13877-13882.

129. Pietrobon D, Striessnig J. (2003) Neurobiology of migraine. Nat Rev Neurosci 4(5): 386-98.

130. Platzer J., Engel J., Schrott-Fischer A, Stephan K., Bova S., Chen H., Zheng H., Striessnig J. (2000) Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca"2* channels. Cell. 102(1): 89-97.

131. Plomp J.J., Vergouwe M.N., Van den Maagdenberg AM., Ferrari M.D., Frants R.R., Molenaar P.C. (2000) Abnormal transmitter release at neuromuscular junctions of mice carrying the tottering <xia Ca2+ channel mutation. Brain 123: 463471.

132. Pragnell M., DeWaard M., Mori Y., Tanabe T., Snutch T P., Campbell, K.P. (1994) Calcium channel p-subunit binds to a conserved motif in the l-ll cytoplasmic linker of the a1-subunit. Nature 368: 67-70.

133. Qin N., Olcese R., Bransby M., Lin T., Birnbaumer L. (1999). Ca2+-induced inhibition of the cardiac Ca2+ channel depends on calmodulin. Proc Natl Acad Sci USA 96: 2435-2438.

134. Ritchie J.M., Rogart R.B., Strichartz G.R. (1976) A new method for labelling saxitoxin and its binding to non-myelinated fibres of the rabbit vagus, lobster walking leg, and garfish olfactory nerves. J. Physiol. 261(2): 477-494.

135. Rettig J., Sheng Z.H., Kim D.K., Hodson C.D., Snutch T.P., Catterall W.A. (1996). Isoform-specific interaction of the a1A subunits of brain Ca2+ channels with the presynaptic proteins syntaxin and SNAP-25. Proc. Natl Acad Sci USA 3: 73637368.

136. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad Sci U S A 74(12): 5463-5467.

137. Sanguinetti M.C., Kass R.S (1984) Voltage-dependent block of calcium channel current in the calf cardiac Purkinje fiber by dihydropyridine calcium channel antagonists Circ Res. 55:336-348.

138. Sather W.A., McCleskey E.W. (2003) Permition and selectivity in calcium channels. Annu Rev. Physiol. 65:133-159.

139. Sather W.A., Tanabe T., Zhang J F., Mori Y., Adams M.E, Tsien R.W. (1993) Distinctive biophysical and pharmacological properties of class A (Bl) calcium channel a1 subunits. Neuron 11: 291-303.

140. Schmid A., Romey G., Barhanin J., Lazdunski M. (1989) SR33557, an indolizinsulfone blocker of Ca2+ channels: identification of receptor sites and analysis of its mode of action. Mol Pharmacol 35(6): 766-773.

141. Schuster A., Lacinova L., Klugbauer N. Ito H., Birnbaumer L., Hofmann F. (1996) The IVS6 segment of the L-type calcium channel is critical for the action of dihydropyridines and phenylalkylamines. EMBOJ 15(10): 2365-2370.

142. Serysheva I.I., Ludtke S.J., Baker M.R., Chiu W., Hamilton S.L. (2002) Structure of the voltage-gated L-type Ca2+ channel by electron cryomicroscopy. Proc. Natl. Acad Sci USA 99(16): 10370-10375.

143. Sokolov S., Timin E., Hering S. (2001) On the role of Ca2+- and voltage-dependent inactivation in Cav1.2 sensitivity for the phenylalkylamine (-)gallopamil. Ore Res 89: 700-708.

144. Sokolov S., Weiss R.G., Kurka B., Gapp F., Hering, S. (1999) Inactivation determinant in the l-ll loop of the Ca2+ channel a1-subunit and p-subunit interaction affect sensitivity for the phenylalkylamine (-)-gallopamil J Physiol 519: 315-322.

145. Sokolov S., Weiss R.G., Timin E.N., Hering S. (2000). Modulation of slow inactivation in class A Ca2+ channels by p-subunits. J. Physiol. 527:445-454.

146. Starmer C.F., Grant A.O. (1985) Phasic ion channel blockade. A kinetic model and parameter estimation procedure. Mol Pharm 28:348-356.

147. Spaetgens R.L., Zamponi G.W. (1999) Multiple structural domains contribute to voltage-dependent inactivation of rat brain a1E calcium channels. J Biol Chem 274: 22428-22436.

148. Stotz S.C., Hamid J., Spaetgens R.L., Jarvis S.E., Zamponi, G.W. (2000) Fast inactivation of voltage-dependent calcium channels. A hinged-lid mechanism? J Biol. Chem 275: 24575-24582.

149. Straub R. E., Freeh G. C., Joho R. H., Gershengorn M. C. (1990). Expression cloning of a cDNA encoding the mouse pituitary thyrotropin-releasing hormone receptor. Proc Natl Acad Sci. U S A 87: 9514-9518.

150. Striessnig J., Grabner M., Mitterdorfer J., Hering S., Sinnegger M.J., Glossmann H. (1998) Structural basis of drug binding to L-type Ca2+ channels. Trends Pharmacol Sci. 19:108-115.

151. Strichartz G.R. (1973) The inhibition of sodium currents in myelinated nerve by quaternary derivatives of lidocaine. J. Gen Physiol. 62: 37-57.

152. Stuhmer W., Methfessel C., Sakmann B., Noda M., Numa S. (1987). Patch clamp characterization of sodium channels expressed from rat brain cDNA. Eur. Biophys J. 14:131-138.

153. Tanabe T., Takeshima H., Mikami A., Flockerzi V., Takahashi H., Kangawa K., Kojima M., Matsuo H., Hirose T., Numa S. (1987). Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle. Nature 328: 313-318.

154. Tanaka 0., Sakagami H., Kondo, H. (1995) Localization of mRNAs of voltage-dependent Ca2+-channels: four subtypes of a1- and p-subumts in developing and mature rat brain. Brain Res Mol Brain Res 30:10-16.

155. Tang S., Mikala G., Bahinski A, Yatani A., Varadi G., Schwartz A. (1993). Molecular localization of ion selectivity sites within the pore of a human L-type cardiac calcium channel. J Biol Chem 268:13026-13032.

156. Tang S., Yatani A, Bahinski A., Mori Y., Schwartz A. (1993) Molecular localization of regions in the L-type calcium channel critical for dihydropyridine action. Neuron 11:1013-1021.

157. Tareilus E., Schoch J., Breer H. (1994) Ca2+-dependent inactivation of P-type calcium channels in nerve terminals. J. Neurochem. 62: 2283-2291.

158. Timin E.N., Hering S. (1992) A method for estimation of drug affinity constants to the open conformational state of calcium channels. Biophys J 63: 808-814.

159. Walker D., Bichet D., Campbell K.P., De Waard M. (1998) A p4 isoform-specific interaction site in the carboxyl-terminal region of the voltage-dependent Ca2+ channel alAsubunit. J Biol Chem 273: 2361-2367.

160. Walker D., Bichet D., Geib S., Mori E., Cornet V., Snutch T P., Mori Y., De Waard M. (1999) A new p-subtype-specific interaction in a1A subunit controls P/Q-type Ca2+ channel activation. J. Biol Chem 274:12383-12390.

161. Walker D., De Waard M. (1998) Subunit interaction sites in voltage-dependent Ca2+ channels: role in channel function. Trends Neurosci 21(4): 148-154.

162. West J., Patton D., Scheuer T.f Wang Y., Goldin A., Catterall W. (1992) A cluster of hydrophobic amino acid residues is required for fast sodium channel inactivation. Proc Natl Acad Sci USA 89:10910-10914.

163. Williams M.E., Feldman D.H., McCue A F., Brenner R., Velicelebl G., Ellis S.B., Harpold M.M. (1992) Structure and functional expression of a1, a2, and p subunits of a novel human neuronal calcium channel subtype. Neuron 8: 71-84.

164. Wu L.G., Westenbroek R.E., Borst J.G.G., Catterall W.A., Sakmann B. (1999) Calcium channel types with distinct presynaptic localization couple differentially to transmitter release in single calyx-type synapses. J. Neurosci 19: 726-736.

165. Yang J., Ellinor P.T., Sather W.A., Zhang J.F., Tsien RW (1993) Molecular determinants of Ca2+ selectivity and ion permeation in L-type Ca channels. Nature 366:158-161.

166. Zamponi G.W., Soong T.W., Bourinet E., Snutch T.P. (1996) p-Subunit coexpression and the a1 subunit domain l-ll linker affect piperidine block of neuronal calcium channels. J Neurosci 6:2430-2443.

167. Zhang J.F., Ellinor P.T., Aldrich R.W., Tsien R.W. (1994) Molecular determinants of voltage-dependent inactivation in calcium channels Nature 372: 97-100.

168. Zhong H., Yokoyama C.T., Scheuer T., Catterall W. (1999) Reciprocal regulation of P/Q-type Ca2+ channels by SNAP-25, syntaxin and synaptotagmin. Nat. Neurosci 2:939-941.

169. Zuhlke R.D., Bouron A., Soldatov N.M., Reuter H. (1998) Ca2+ channel sensitivity towards the blocker isradipine is affected by alternative splicing of the human a1C subunit gene. FEBS Lett. 427: 220-224.

170. Zuhlke R.D., Pitt G.S., Deisseroth K., Tsien R.W., Reuter H. (1999) Calmodulin supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels. Nature 399: 159-162.

Информация о работе

Бирюков, Станислав Анатольевич
доктора физико-математических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Потенциалоуправляемые кальциевые каналы: взаимозависимость ингибирования и инактивации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы