Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация молекулярных структур рецепторов Са2+-антагонистов и кинетики Са2+ каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация молекулярных структур рецепторов Са2+-антагонистов и кинетики Са2+ каналов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР РЕЦЕПТОРОВ Са2+-АНТАГОНИСТОВ И КИНЕТИКИ Са2+ КАНАЛОВ

Специальность: 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математический наук

Р Г Б ОД 2 7 ЯНВ 1Д.97

На правах рукописи

Бирюков Станислав Айатолье

Долгопрудный, 1996 г.

Работа выполнена в Институте Биохимической Фармакологии (Иннсбрук,

Австрия).

Научные руководители:

dr. sei. med. Steffen Hering (Штеффен Херинг) кандидат физ.-мат. Наук Е. Н. Тимин

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук В. В. Смолянинов. Кандидат биологических наук С. В. Ревенко.

Ведущая организация: Институт патологии и патологической физиологии Российской АМН.

на заседании специализированного совета К 06.391.10 в Московском Физико- Техническом Институте по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, МФТИ.

Защита состоится " " _199?г., в час. ®С> мин.

Автореферат разослан:

1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В. Б. Киреев.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

В 60х годах Fleckenstein обнаружил, что различные вещества способны избирательно блокировать входящие Са2* токи, вызванные деполяризацией клеточной мембраны. Исследования, выполненные на клетках сердечных и гладких мышц, показали, что это ведет к уменьшению сократительной силы и делает невозможным проведение потенциала действия (Fleckenstein et al., 1983). Увеличение концентрации Са2* вновь увеличивало силу мышечных сокращений и восстанавливало проводимость Са2* потенциала действия. Это дало повод ввести термин Са2* антагонисты.

Особый интерес представляет взаимодействие потенциалоуправляемых Са2* каналов с широко используемыми в клинической практике 1.4-дигидропиридинами (ДГП, например нифедипин и нитрендипин), фенилалкиламинами (ФАА, галлопамил и верапамил) и бензотиаэепинами (БТЗ, д-цис дилтиаэем).

Фармакологическая активность Са2* антагонистов, например их антиаритмическое и вазодилятаторное действие, объясняется потенциало- и частотозависимым (для ФАА и БТЗ) блокированием проникновения ионов Са2* через каналы L-типа в гладких и сердечных мышцах.

Блокирование потока двухвалентных ионов через Са2* каналы определяется высокоспецифичным взаимодействием Са2* антагонистов с соответствующими рецепторами (Caterall et al., 1992, Striessnig et al., 1993).

Исследования подавления Са2* токов постоянно заряженными лигандами, такими как четвертичные производные ФАА галлопамила и БТЗ SQ 32,428, ДГП амлодипин (Hescheler et al., 1982, Kass et al., 1991, Hering et al., 1993), методом локальной фиксации потенциала ("Patch Clamp" ) на изолированных клетках позволили сделать вывод о том, с какой стороны мембраны расположен

соответствующий рецептор (предполагается, что из-за своего постоянного заряда подобные лиганды не могут проникать через клеточную мембрану).

Са2* каналы состоят из нескольких субъединиц. Каждая субъединица кодируется определенным геном. Ионопроводящая структура (пора) канала формируется ой субъединицей (молекулярный вес 195 кД, рис. 1), на которой расположены рецепторы С а2' антагонистов и токсинов, ai субъединица нековалентно связана с гидрофобной негпиколизируемой р-субъединицей (55 кД) и трудно гликолизируемыми a2S- (180 кД) и у- (33 кД) субъединицами. Принято считать, что "минимальная функционирующая" структура Саг* канала состоит из ai, Р и аг-5 субъединиц (Mikami et al„ 1989, Perez-Reyes et al„ 1989, Lacerda et al, 1991, Hullin et al., 1992, Jay et al., 1992, Birnbaumer et al., 1994).

Рис. 1. Олигомерная структура си-субъединицы Саг* канала.

Показана локализация структурных элементов, определяющих

воспроизведение некоторых важных функций.

Исследования с использованием антител и фотоактивных меток показали, что рецепторы Са2* антагонистов расположены рядом или в самом устье поры ai субъединицы (Caterall et al., 1992, Miller et al., 1992, Striessnig et al., 1993).

Анализ первичной структуры показал, что а, субъединица состоит из четырех гидрофобных доменов (1-1\/). Каждый домен состоит из шести трансмембранных спиралей - сегментов (51-56).

Используя методы молекулярной биологии Носкегтап е( а1., 1995, и Роелпд е1 а!., 1996, определили, что молекулярные структуры высоко аффинных рецепторов ФАА локализованы в сегменте 1\/86 си субъединицы Ьтипа.

На момент начала работы оставались неизвестными молекулярные структуры БТЗ и ФАА рецепторов.

Цель исследования.

Целью представленного исследования было: изучить молекулярные структуры рецепторов Са2" антагонистов классов БТЗ и ФАА в потенциалоуправляемых Са2* каналах Ьтипа.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности взаимодействия постоянно заряженного ФАА девапамила с Са2* каналами 1-тила.

2. Исследовать взаимосвязь между первичной структурой Са2* канала и его свойствами.

3. Выбрать оптимальную для решения данной задачи систему для экспрессии экзогенных Са2* каналов.

4. Охарактеризовать клеточную линию НЕК 293 как систему для экспрессии и исследования экзогенных Са2* каналов.

5. Исследовать структуру БТЗ и ФАА рецепторов Са2* каналов.

6. Исследовать взаимосвязь инактивации и блокирования канала БТЗ и ФАА.

Научная новизна.

Впервые исследован постоянно заряженный ФАА (четвертичный девапамил), который активен как с внешней, так и с внутренней стороны клеточной мембраны.

Таким образом, впервые показано, что ФАА рецептор доступен для связывания с обеих сторон клеточной мембраны.

Впервые показано принципиальное отличие основных характеристик блокирования канала постоянно заряженными ФАА с внешней и внутренней сторон клеточной мембраны - "тоническое" 1 и частотозависимое ингибирование соответственно.

Впервые показано, что структуры, определяющие активационную и инактивационную кинетику Са3* каналов сердечной и скелетной мышц, локализованы в доменах 111 и IV ctt-субъединицы С а2* канала.

Впервые показано, что клетки линии НЕК293 (клетки почки эмбриона человека) экспрессируют эндогенные потенциалоуправляемые Са2* каналы.

Обнаружены потенциалоуправляемые С а2* каналы, свойства которых не позволяют однозначно отнести их к какому-то определенному классу согласно принятой классификации.

Впервые определена структура и локализация БТЗ и ФАА рецепторов в Са2* каналах L-типа.

Впервые показано, что взаимодействие потенциалоуправляемых Са2* каналов L-типа с ФАА и БТЗ определяется сходными, но не идентичными структурами.

Впервые показана взаимосвязь между структурами, определяющими инактивационные свойства канала, и структурами, определяющими взаимодействие Са2* антагонистов классов ФАА и БТЗ с открытым состоянием Са2* канала L-типэ.

Теоретическое и практическое значение.

Полученные данные расширяют и углубляют понимание механизмов взаимодействия Са2* антагонистов классов ФАА и БТЗ с потенциалоуправляемыми Са5* каналами L-типа как на молекулярном (взаимодействие лиганд-рецептор), так

и на макроскопическом уровне. Широков использование Са2* антагонистов в клинической практике еще раз подчеркивает важность проделанной работы.

Подробное описание клеточной линии НЕК 293, как системы для экспрессии экзогенных лотенциалоуправляемых Са!* каналов, также должно способствовать последующим исследованиям.

Данные о взаимосвязи первичной структуры со свойствами канала позволили сделать существенный шаг в понимании того, как устроен потенциалоуправляемый С а2* канал.

Полученные результаты и наработанные методики должны оказать существенную помощь в дальнейших исследованиях свойств Са2* каналов.

Апробация работы.

Результаты диссертации доложены и обсуждены на 17 ежегодном симпозиуме по нейронаукам (Вена, 1994 г.), ежегодном симпозиуме Физиологического Общества Великобритании (Оксфорд, 1995 г.), Симпозиумах Немецкого Фармакологического Общества (1994, 1996 г.), на объединенном семинаре Кафедры физики живых систем Московского Физико-Технического Института и Лаборатории кибернетики Института хирургии им. А. В. Вишневского. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Клеточные культуры.

Клетки А7г5 были культивированы как описано в Hering et al., 1993. Клетки НЕК293 были выращены при 37°С в среде DMEM (GIBCO), в присутствии 10 % фактора роста (сыворотка FBS), в атмосфере, содержащей 8 % С02

2. Экспрессия экзогенных субъединиц Ca1* каналов в ооцитах Xenopus laevis.

Самки лягушек Xenopus laevis были анестезированы в течении 15 минут в растворе MS-222 (Sandoz) непосредственно перед хирургическим извлечением частей овариев. Изолированные ооциты были очищены от фолликулярной оболочки обработкой в растворе коллагеназы (2 мг/мл) и инъецированы (объем инъекции « 50 нл) при помощи пневматического микроинжектора.

3. Транзиентная (трансмембранная) трансфекция клеток НЕК 293.

сДНК субъединиц Ca2* каналов была введена в экспрессионный вектор млекопитающих pcDNA3 (Invitrogen) и, тем самым, экспрессирована под контролем CMV-промоутера. Клетки были трансфицированы "липофектаминным" методом. Стандартная трансфекция выполнялась в 35 мм чашке Петри при плотности клеток около 70%.

4. Эксперименты методом локальной фиксации потенциала.

4.1 Регистрация трансмембранных токов.

Входящие токи через потенциал-управляемые Ca2* каналы регистрировались в 10 мМ растворе Sr2* Na* токи через Ca2* каналы l-типа регистрировались во внеклеточном растворе, не содержащем двухвалентных ионов, в присутствии 130 мМ Na* в качестве токопереносчика. Регистрации осуществлены при температуре 22-

25°C a "whole-cell" конфигурации (Marty et al., 1981). Микроэлектроды с сопротивлением 1-4 МОм были вытянуты из боросипикатного ("тяжелого") стекла.

При необходимости ток утечки вычитался программно (алгоритм "шкалирования тока") или аналогово.

4.2 Смена внеклеточного раствора.

Смена внеклеточного раствора производилась с помощью микроперфузионной камеры МРС-50 (Savchenko at al., 1995).

4.3 Регистрация токов через одиночные каналы.

Для удаления вителиновой мембраны ооциты выдерживались 1 час в гипертоническом растворе, после чего мембрана удалялась механически острыми пинцетами. Токи регистрировались в конфигурации "с клеткой" ("cell attached", Hamil et al., 1981) в присутствии 90 мМ Ва2* (рН=7.4).

5. Эксперименты методом деухэлектродной фиксации потенциала.

Регистрации токов были осуществлены при температуре 22-25°С в растворе, содержащем 40 мМ Ва2*, при рН 7,4. Сопротивление микроэлектродов было 0.3 - 2 МОм. Эндогенные Са2*-активируемые хлорные токи были подавлены инъекцией 50100 нл 0.1 мМ раствора ВАРТА (свободная кислота). Регистрационная камера перфузировалась постоянным потоком (« 1 мл/мин.) контрольного раствора, или раствора, содержащего исследуемое вещество.

6. Дискретизация.

Ионные токи были дискретизированы с частотой 10 КГц при регистрации токов через одиночные Са2* каналы и 2 КГц в экспериментах на "whole cell", и затем фильтрованы численно с частотами 1 КГц и 0.5 КГц соответственно.

7. Программное обеспечение.

Данные были получены и обработаны с использованием пакета программ рС(_АМР версий 5.7 и 6.0.

3. Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистическая достоверность отличия двух средних величин оценена при помощи парного или группового {-критерия Стьюдента (р < 0.05).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Блокирующее действие постоянно заряженного ФАА девапамила.

с э n сн3 qDEV (qD888) был синтезирован

' " -С - (CH2),-N ~(СН2),-/()) „ , . „„„„

\w/ | 2 3 22 \v У/ квотернаризациеи (-) D888 и затем СН -

СНз° сн3 сн3 осн3 очищен от остатков третичного (-)

сн3о Чл^Д)—С - (CH2)3-N+-(CH2)2

¿н сн3 сн3о / \ осн.

D888 методом HPLS (Рис. 2). qDEV

C = N CH3

' ____ , I,, ,, показал незначительно большее

I

снз V сродство к месту связывания ФАА

сн3 сн3

(Ю = 1.1 ± 0.5 рМ и 2.7 ± 0.9 рМ для

Рис. 2. Структуры третичного (вверху) и [3H]verapamil и (-H3H]devapamil четвертичного (постоянно заряженного,

меченых доменов соответственно;

внизу) ФАА галлопамила.

п=3), чем четвертичная производ-ная галлопамила (0890; Ki = 4.7 ± 1.7 рМ и 13.2 ± 1 рМ, соответственно; п > 3; Hering et а(, 1993).

Предполагается, что из-за своего постоянного заряда подобные лиганды не могут проникать через клеточную мембрану.

Внеклеточное действие.

qDEV блокировал Sr** ток через Ca2* каналы (У в отсутствии повторяющегося стимулирования. Подавление I& в течение последовательности из 15 импульсов длиной 300 мс, деполяризующих клеточную мембрану с -70 до 20 мВ с частотой 0.2 Гц в 100 рМ qDEV (8 + 4 %, п = 4) практически не отличалось от ингибирсвания'в контроле (5.0 ± 0.5 %, п = 4). qDEV не сдвигал вольтампернуто характеристику Is,. qDEV эффективнее блокировал токи через Ca2* каналы (в данном случае Na") в отсутствии двухвалентных катионов. Так же как и qDEV блокировал преимущественно в состоянии покоя и не сдвигал пороговых значений активации Ic«^, пиковых значений тока вольтамперной характеристики и потенциала реверсии. qDEV блокировал 1с*>ц примерно в 3 раза эффективнее, чем Is, (Юм 27 и 90 рМ соответственно). Блокирование как так и Ic^ оказалось обратимым перфузией в контрольном растворе.

Внутриклеточное действие.

100 рМ qDEV были включены во "внутриклеточный" раствор. В отличие от внеклеточной аппликации, блок ls» оказался частотсзависимым и составлял 70 + 9.8 % (л = 5) после 20 минут внутриклеточной перфузии. Восстановление тока в течении 5 минут в отсутствии стимуляции составило около 65 % от начальной амплитуды при поддерживаемом потенциале -70 мВ.

Обсуждение.

qDEV (D888) блокирует Ca2* каналы при внеклеточной аппликации, в то время как сходные с ним по структуре ФАА D890 и D575 - нет. Следует отметить, что D890 отличается от qDEV одной, а D575 двумя дополнительными метильными группами на левом фенильном кольце (Рис. 2). Сходство свойств qDEV и SQ 32,428 (Adachi-Akahane et al., 1993, Hering et al., 1993, Seydl et al., 1993) позволяет предположить, что взаимодействие

каналов с ФМ и БТЗ определяется сходными структурами. Это подтверждается следующим:

1. Сходство свойств in vitra связывания (-) D888 и (+)-цис дилтазема (Striessnig et al, 1991).

2. Точно так же как для SQ 32,428,1С» блокирования Саг* каналов qDEV было ниже, когда ионы Na* использовались как токопереносчик (Hering et al., 1993).

3. Исследования методом SAR показывают, что девапамил может взаимодействовать с рецептором БТЗ (Kimball et al., 1992, Kimball et al., 1993).

Выбор системы для экспрессии экзогенных Са" каналов.

Современные методы генной инженерии позволяют менять первичную последовательность белка. Можно выделить два подхода: 1. In vitro мутагенез используется для изменения первичной структуры белка, 2. Создание "химерных" молекул из двух различных по своим свойствам белков каналов или рецепторов. Последующее сравнение свойств полученных химер со свойствами исходной молекулы позволяет идентифицировать те структурные элементы, которые определяют воспроизведение определенных функций.

Для изучения свойств "химерных" белковых молекул они экспрессируются в соответствующих "системах экспрессии". Из наиболее удобных систем можно выделить ооциты Xenopus (африканская когтистая жаба) и клеточную линию НЕК 293.

Согласно Lacerda et al., 1991, ооциты Xenopus экспрессируют эндогенные Са2* каналы. Поэтому, учитывая отсутствие сообщений о наличии эндогенных потенциалоуправляемых Са2* каналов и возможность использования метода локальной фиксации потенциала, первоначально для экспериментов была выбрана клеточная линия НЕК 293. Но, оказалось, что клетки линии НЕК 293 экспрессируют эндогенные Са2* каналы.

Характеристика эндогенных Са'* каналов клеточной линии НЕК 293.

Эндогенные ток и были обнаружены в 160 (76%) из 210 исследованных клеток. Деполяризация клеточной мембраны от поддерживаемого потенциала -70 мВ до порогового потенциала -40 мВ вызывала активацию эндогенного тока.

В

Мембранный потенциал, мВ -60 -40 -20 0 20 40 £г

100 мс

Рис. 3. Эндогенные токи в клетках клеточной линии НЕК 293.

A. Семейство входящих Б г2* токов. Показаны соответствующие потенциалы. Концентрация токоперносчика -10 мМ.

B. Вольтамперная характеристика эндогенных токов в НЕК 293 клетках.

Регистрации и, с использованием "Катр"-протокопа (линейное изменение потенциала от поддерживаемого потенциала -80 до 70 мВ за 300 мс) содержали один пик, что указывает на экспрессию одного типа Са5*' каналов. Ток достигал максимума при -6 ± 1.0 мВ, потенциал реверсии был 55 ± 6.1 мВ, потенциалы половинной активации и инактивации оказались равными -19.0 ± 1.5 и -39.7 ± 2.3 мВ соответственно (все данные для п=7, Рис. 3).

В клетках, выращенных в среде, не содержащей фактора роста, было обнаружено существенное (более, чем в 3 раза) увеличение плотности Эг2* тока без изменения потенциалозависимой кинетики активации и инактивации:

Взаимодействие эндогенных каналов с токсинами (га-Ада 1\/А, га-СТх С\/1А и и-СТх М\/ИС, Боопд е1 а1., 1993, ЕШпог е( а1., 1993) оказалось сходным с описанными ранее свойствами Са2* каналов Е-типа. Юм блокирования эндогенного тока ионами

Ni2* (48 pM) сравнимо с ICsa ~ 30 рМ, полученному для каналов Е-типа (Soong et al., 1993, Ellinor et at., 1993, Williams et al., 1994).

Быстрая инактивационная кинетика эндогенного тока также сходна с кинетикой токов Е-типа кальциевых каналов (Soong et al., 1993, Ellinor et al., 1993). Постоянные времени инактивации токов; для каналов Е-тила: 70 мс (в 15 мМ 8а2*), и » 60 мс (в 10 мМ Sr2*) для эндогенного тока в диапазоне тестпотенциалов от -10 до 30 мВ.

Тем не менее, были обнаружены свойства, отличающие эндогенные каналы от каналов Е-типа. Показано, что каналы Е-типа нечувствительны к 1,4-дигидропиридинам нифедипину (10 рМ, Soong et al., 1993) и нимодипину (10 рМ, Ellinor et al., 1993), в то время как эндогенные токи блокируются и израдипином и нимодипином.

Взаимодействие эндогенных каналов с 1,4-дигидропиридинами отличается от каналов L-типа. Подавление ls, не было стереоселекгивным и требовало более высоких концентраций, чем стереоселективный блок lS(. Кроме того, неактивная к каналам Са2* L-типа производная израдилина (VO 2605, Glossmanrt и Ferry, 1985) вызывала подавление эндогенного тока, сравнимое с высоко активным израдипином.

Таким образом, с одной стороны, эндогенные Са2* каналы обладают свойствами каналов типов Е и/или Т. С другой стороны, обнаруженные Са2* каналы не могут быть отнесены к какому либо ранее описанному типу потенциалоуправляемых Са2* каналов согласно классификации, предложенной Birnbaumeret al., 1994.

Экспрессия экзогенных Са1* каналов в клетках линии НЕК 293

Была изучена возможность использования данной клеточной линии для исследования потенциалоуправляемых Са2* каналов.

Клетки были трансфицированы сДНК химеры Са2* канала (СгаЬпег е( а1., 1991) липофектаминным методом. Успешная экспрессия экзогенных каналов была подтверждена регистрацией входящих Эг2* токов.

Сделан вывод о том, что клеточная линия НЕК 293 может быть использована как система для исследования потенциалоуправляемых каналов, т.к. токи через экспрессированные экзогенные кальциевые каналы 1_-типа можно отличить от эндогенных как по потенциалозависимости, так и по фармакологическим свойствам.

Решающим фактором в выборе системы явилась трудность получения достаточной плотности экспрессии а, субъединицы Са2* канала Е-типа в клетках линии НЕК 293.

Структурные элементы канала, определяющие его принадлежность к определенному классу.

Несмотря на сходные фармакологические свойства (главным образом чувствительность к 1,4-дигидропиридинам) Са2* каналы Ь-типа принято делить на подклассы, отражающие их функциональные особенности. Каналы Б-типа (а,3 субъединица, скелетная мышца) активируются существенно медленнее, чем другие каналы Ьтипа (например ак-,) (Мита в1 а1., 1992, СаАгеу, 1994).

ТапаЬе е1 а1., 1991, №ка1 е1 а1., 1994, гИапд е1 а1., 1994, идентифицировали структурные элементы в домене I си субъединицы, определяющие кинетику Са2* тока.

Чтобы исключить влияние экзогенных р, а2-8 и у субъединиц на кинетику токов, в данном исследовании использовалась экспрессия исключительно щ субъединиц.

Был сконструирован ряд "химерных" каналов (Э и Н - участки последовательности Б и Н типов соответственно, большая буква соответствует домену, маленькая - карбоксильному или аминному хвосту): эН (заменен только аминный хвост), эННЭЗз, зННЭЭЬ, эИНЭНЬ и эННИвИ.

Оказалось, что замена как аминного, так и карбоксильного хвоста канала сердечной мышцы на соответствующую последовательность скелетной мышцы не оказывала заметного влияния на кинетику тока.

Кинетика тока в sH и sHHSHh была сходной с кинетикой тока сердечно мышечного канала - сравнительно быстрая моноэкспоненциальная активация и заметная инактивация в течении 800 мс импульса.

Химеры sHHSSs, sHHSSh, sHHSHh демонстрировали кинетику, характерную для скелетно мышечного канала - медленную биэкслоненциапьную активацию. Заметная инактивация а течении 800 мс импульса отсутствовала. Кроме того, токи химеры sHHSHh активировались существенно медленнее, чем a sHHSSs и sHHSSh.

Пороговые значения активации, пиковые значения тока вольтамперных характеристик и потенциалы реверсии описанных химер достоверно не отличались.

Проводимость одиночных ионных каналов была оценена и оказалась равной 19.4 ± 1.1 (п=4) пС для sH ("быстрая") и 18.6 ± 1.2 (п=3) пС для sHHHSh ("медленная" химера) соответственно.

Таким образом, были получены доказательства существования структурных элементов в доменах III и IV С а2* канала L-типа, предопределяющих замедление и биэкспоненциальность активации тока через кальциевые каналы L-типа.

Локализация структурных элементов канала, определяющих связывание с ФАА и БТЗ.

Исследования структуры рецепторов лигандов велись следующими методами:

1. Перенос последовательности ai субъединицы L-типа в а,А субъединицу, которая тем самым становится чувствительной к кальциевым агонистам или антагонистам.

2. Мутация отдельных аминокислот си субъединицы.

at субъединицы исследуемых химер Са2* каналов экспрессировались в ооцитах Xenopus вместе с субъединицами (3tl (Ruth et al., 1989) и a2-3 (Ellis et al., 1988).

Фармакология "исходных" Са2* каналов.

Чувствительность химер к дилтиазему исследовалась при поддерживаемом потенциале -80 мВ, так как более положительные потенциалы вызывали существенное инггибироеание тока в контрольных условиях из-за накапливания каналов в инактивированном состоянии.

Рис. 4. Подавление тока в течении пакета из 15 100 мс импульсов (частота 0.2 Гц), чувствительный (Lh) и малочувствительный каналы (oía). Черные колонки: д-цис дилтиазем (контроль -10 цМ - 100 цМ), Серые: л-цис дилтиазем (100 цМ)

Д-цис дилтиазем вызывал существенное частотозависимое подавление lB., в течении пакета из 15 100 мс импульсов с интервалом 10 с, в то время как л-цис дилтиазем (стереоизомер) действовал слабо.

Каналы A-класса оказались слабо чувствительными и ингибирование не было стереоселективным. (Рис. А)

Введением последова-тельности L-типа в последо-вательность класса А было определено, что структурные элементы, определяющие чув-ствительность канала к ФАА и БТЗ, локализованы в сегменте IVS6 (шестой сегмент четвертого домена).

Носкегтап е1 а1. (1995) показали, что три аминокислоты в трансмембранном сегменте 1\/Б6 (У1463, А1467, 11470 в аю») определяют высокую чувствительность канала Ьтипа к ФАА. Этих аминокислот оказалось достаточно для "переноса''

чувствительности как к БТЗ дилтиаэему, так и к ФАА (-)-

IVS6

а,,. 1378 U02 галлопамилу, в класс А Са

I I II II III! I I II I I I а,4 1796 A^FYFVSFIFLCSFLMLNLFVAVIM 1820 каналов (тройной Мутант AL25,

AL25 AYFYFVSiflFLCgFIÍjLNLFVAVIM

AL25/-Y AYíYFVSFIFLCgFlflLNLFVAVIM

AL25/-A AYFYSVS líQSTiCS Fl{3 UíLfiVAVIM

AL25/-I AYFYFVSíCFLCgFLMLNLFVAVIM

AL2S/M AYFYFVStTOLCftFlflurLFVAVIM

AL25/-Y,M AYETfFVSFlJJbCglTflLNlFVAVIM

Рис. 5. Схема мутаций в в сегменте 1У56

рис. 5 и 6). Частотозависимое ингибирование 1в. дилтиаземом оказалось стереоселективным и было сравнимо с блоком химеры 1.11 (СгаЬпег е1 а1, 1994) при под-

держиваемом потенциале -60 мВ.

Вклад каждой из точечных мутаций (11804У, 81808А, М1811А) в формирование рецептора дилтиазема был исследован на соответствующих двойных мутантах. Мутанты А1-25/-У, А1.25/-А и А1.25/-1 блокировались дилтиаземом (100 рМ) с существенно меньшей (р < 0.01) эффективностью, чем А1.25. Это доказывает, что каждая из трех аминокислот является неотъемлемой частью БТЗ-рецелтора.

Для изучения возможной разницы в структурах рецепторов БТЗ и ФАА была сделана дополнительная мутация Р1805М в А1.25 (химера А1.25/М). (-) галлопамил

Рис. 6. Влияние точечных мутаций на чувствительность канала к ФАА и БТЗ.

Черные колонки - Д-цис дилтиаэем, контроль -10 цм -100 цм,

Темно-серые - девапамил, 10 цм -100 цм, Светло-серая - л-цис дил-тиазем (100 цм).

(100 цМ) эффективнее блокировал 10а в AL25/M (49 ± б % блока дополнительно к , ингибированию Ib. в контроле за счет накопления инактивации, п=4), чем в AL25 (35 ± 4 %, п=8). Напротив, блокирование 100 рМ дилтиазема lBa в AL25/M и в AL25 оказалось сходным (48 ± 4 % (п=8) в AL25/M и 50 ± 7 % (п=8) в AL25), что предполагает вклад Met-1387 (нумерация согласно ais скелетной мышцы карпа) во взаимодействие с ФАА, но не с БТЗ.

Следующей изученной химерой была AL25/-Y.M. Туг-1386 из последовательности L-типа был заменен на 11е-1804 класса А. 1в, в AL25/-Y.M существенно (р < 0.01) эффективнее блокировались (-) галлопамилом (10 рМ, 27 ± 3 %, п=8), чем дилтиаземом (10 рМ, 4 + 2 %, п=7). Эти данные подтверждают тот факт, что дополнительно к Туг-1386, А1а-1390, и lle-1396, Met-1387 участвует в формировании ФАА-рецептора, но не играет существенной роли в формировании рецептора БТЗ.

Обсуждение.

Полученные результаты показывают, что чувствительность к дилтиазему может быть перенесена из L-типа в класс А С а2* каналов с сохранением основных особенностей ингибирования - стереоселективности и частотозависимости. Для этого достаточно мутации трех аминокислот в IVS6 ocia (I1804Y, S1808A, М1811А, Рис. 7). Те же три аминокислоты образуют рецептор ФАА (Hockerman et al., 1995).

МеН31В оказался более важным для частотоэависимого ингибирования (-)-галлопамилом, чем дилтиаземом. Следовательно, ФАА и БТЗ рецепторы L-типа Са2* канала формируются сходными, но не идентичными структурами в трансмембранном сегменте IVS6.

Перекрытие структур, формирующих аысокоаффинные рецепторы ФАА (Hockerman et al., 1995), БТЗ и ДГП (Peterson et al., 1996) подтверждает описанную ранее модель взаимодействия между этими рецепторами (Glossmann и Striessnig, 1990).

Представленные данные не исключают, что дополнительные аминокислоты, гомологичные для cxia и ai субъединиц L-типа, участвуют в формировании высоко аффинных рецепторов ФАА и БТЗ.

В натриевых каналах рецептор локальных анестетиков (Ragsdale et al., 1994) и структуры, определяющие инактивационные свойства канала (McPhee et al., 1994), расположены в домене IVS6. Сходная ситуация обнаружена в домене IVS6 Са2* каналов. Аминокислоты, расположенные в поре канала, не только формируют БТЗ, ФАА и ДГП рецепторы (Grabner et al., 1996, Hockerman et al., Doering et al., 1996, Peterson et al., 1996), но и определяют инактивационную кинетику. Из этого, однако, не следует, что те аминокислоты, которые стабилизируют канал в закрытом инактивированном состоянии, также обеспечивают блокирование канала Са2* антагонистами.

Возникает вопрос о структуре, предотвращающей доступ веществ к их рецепторам в закрытом состоянии канала (Hille et al., 1977, Starmer et al., 1985). Аминокислоты, которые не влияют на аффинность, но регулируют доступ блокатора к рецептору, были идентифицированы в натриевых каналах (Ragsdale et al., 1994, Qu et al., 1995). Какие именно аминокислоты формируют "защитные" структуры и их гомологичность в L-типе и классе А Са2* каналов до настоящего времени не определено.

IVS6

Рис. 7. Расположение оснований на а-спирали трансмембранного сегмента 1VS6.

выводы.

1. Клетки линии НЕК 293 экспрессируют эндогенные потенциалоуправляемые С а2* каналы. Свойства этих каналов не позволяют отнести их к какому либо определенному классу согласно классификации Birnbaumer et al., 1994.

2. ФАА рецептор доступен для связывания с обеих сторон клеточной мембраны. При этом характер блокирования принципиально отличается: тоническое ингибирование при доступе с внешней стороны, и частотозависимое при доступе с внутренней стороны клеточной мембраны.

3. Структуры, определяющие кинетику Са2* каналов, расположены (помимо домена I) в доменах III и IV си-субъединицы Са1* канала.

4. Для переноса чувствительности к БТЗ и ФАА из L-типа в класс А Са2* каналов достаточно мутации трех аминокислот в последовательности класса A (oía) на соответствующие им аминокислоты из последовательности L-типа: I1804Y, S1808A, М1811А.

5. Чувствительность канала к БТЗ и ФАА определяется сходными, но не идентичными структурами (дополнительная мутация F1805M).

6. Аминокислоты, формирующие БТЗ и ФАА рецепторы, так же участвуют в управлении кинетикой инактивации канала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Wang Z., Grabner М., Berjukow S„ Savchenko A., Glossmann H., Hering S. Chimeric L-type calcium channels expressed in Xenopus laevis oocytes reveal role of repeats III and IV in activation gating. //J Physiol., (London) -1995-846, 131-137.

2. Berjukow S., Doering F., Froschmayr M., Grabner M., Glossmann H., Hering S. Endogenous calcium channels in human embrionic kidney (HEK 293) cells. II Brit. J. Pharmacol. -1995 - 118, 748-754.

3. Hering S., Aczel S„ Grabner M., Doering F., Berjukow S„ Mitterdorfer J., Sinnegger M.J., Striessnig J., Degtiar E.D., Wang 2., Glossmann H. Transfer of high sensitivity for benzotiazepines from L-Type to class A (Bl) calcium channels. II J. Biol. Chem. - 1996 - 271, №40, 24471-24475.

4. Berjukow S., Aczel S., Beyer В., Kimball D., Dichtl M., Hering S., Striessnig J. Extra- and intracellular action of quaternary devapamil on muscle L-type calcium channels. // Brit. J. Pharmacol. - 1996 - 119,1197-1202.

5. Brauns Т., Cai Zhen-Wei., Kimball D., Kang Hee-Chol., Haugland R. P., Berger W., Berjukow S., Hering S., Glossmann H., Striessnig J. The benzothiazepinone binding domain of purified L-type calcium channels: direct labeling using a novel fluorescent diltiazem analogue. // Biochemistry, -1995 - 34, 3461-3469.

6. Berjukow S., Kimball D., Striessnig J., Hering S. Quaternary devapamil blocks L-type calcium channels from the extracellular site. Naunyn Schmiedelberg's Arch. Pharmakol. -1994-349: R41.

7. Berjukow S., Doering F., Hering S. Endogenous calcium channels in Human Embrionic kidney (HEK 293) cells. II Proceedings of the Physiological Society, Oxford meeting, - 1995 - 238P.