Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых каротинсодержащих растительных масел на тканевые факторы свертывания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых каротинсодержащих растительных масел на тканевые факторы свертывания"

3Г6 од

- 5 ДПР 1953

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ УКРАИНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ И ТОКСИКОЛОГИИ

На правах рукописи

ЭДЬ-ЛАТИБ АМЕР МУХАМЕЩ

УДК 577.156.6:577.157.2:612.115

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ КАРОТИНСОДЕШЩИХ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ НА ТКАНЕВЫЕ ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой: степени кандидата биологических наук

Киев - 1993

Работа выполнена в Киевском государственном институте усовершенствования врачей МЗ Украины

Научные руководители: д.м.н., проф. Липкая Г.Н.

д.м.н. Мхитарян Л.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.А. Кита

доктор медицинских наук В.И.Коржов

Ведшая организация: Украинский государственный медицинский университет юл.акад. А.А.Богомольца

Защита состоится 14 апреля 1993 г, в _чао_мин. %

на заседании Специализированного Совета Д 088.19.01 при Украинском научно-исследовательском институте фармакологии и токсикологии МЗ Украины / 252057, Киев, ул. Эжена Потье, 14/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Украинского НИИ фармакологии и токоикологии МЗ Украины

Автореферат разослан " '/I . /.-¿¿¿Ь/^УС^ 1993 г*

И.о. ученого секретаря Специализированного Совета, доктор медицинских наук,

профессор В.С.Данилепко

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность работ». Растительные карогинсодержащие масла

обладают радиозащитннм, общеукрепляющим, противовоспалительным,

ранозаживляющим и другими видами лечебно-профилактического действия. В последние годы облепиховое масло фармакопейное /М.Д.

Машковский» 1988/, пищевые лечебно-профилактические масла, получаемые из облепихи, черноплодной рябины, бага-каротин микро-биального производства /ГУ 10-04-02-02-86/ и другие широко используются во всех областях медицины. Ведется разработка, изучение способов получения и биологическая оценка масел из различного растительного сырья, в частности, из бархатцев распростертых /A.c. № 913625, 16 ноября 1S81 г./. Есть немногочисленные работы, указывающие на то» что эти масла обладают выраженными фармакологическими эффектами. Однако, их специфическое действие и безвредность изучены еще далеко не полностью. Это касается и изучения их влияния на тканевые факторы свертывания. Известно, что последние во многом определяют нормальную микроциркуляцию и функцию, различных органов и тканей / мозга, сердца, печени и др,/ В.П.Скипетров, 1983/. При изменении, проницаемости клеточных мембран, стрессе тканевой тромбопластин в значительных количествах может попадать в кровоток и вызывать ряд нарушений, определяющих течение основного заболевания или патологического процесса» нарушая физиологические функции органов и тканей. В связи о этим является актуальным изучение влияния каротинсо-держащих растительных масел на тканевые факторы свертывания в условиях моделирования стресса, сопровождающегося нарушением распределения тканевых факторов свертывания между тканями и сосудистым руслом.

Цель исследования - Изучить характер нарушений в тканевом эвене гемостаза при экспериментальном иммобилизационном стрессе и возможности их коррекции каротинсодержащими маслами / облепи-ховым, арониевым, бархатцевым, раствором бета-каротина в растительном масле /.

Задачи исследования.

1. Дать оценку фармакологического действия масел, полученных по различной технологии экстракции сырья различными растятолышми маслами /оливковым, кукурузным, соевым, подсолнечным /.

2. Определить разницу в действии каротинсодержащих масел при однократном и курсовом применении.

3. Установить зависимость между дозировками масел, оказывающими витаминное действие и в меньших дозировках / до 10 % от ежедневной потребности в бета-каротине/.

4. Изучить изменения состояния тканевых факторов свертывания, с про— и антикоагулянтной активностью в условиях стресса и влияния на них каротинсодержащих масел.

Основные положения, вынесенные на защиту.

1. Бетакаротинсодержащив растительные масла в условиях иимо-билизационного стресса, повышающего активность тканевого тромбо-пластша в ткани головного мозга, сердца, печени, обладают статистически достоверной антитромбопластиновой активностью при лечебно-профилактическом применении в течение 20 дней, не влияя существенным образом на другие факторы свертывания крови тканей: антигромЗиновий, антигепариновый, фибринолитическую активность.

2. В дозе 0,002 мг/кг массы / в пересчете на бета-каротин/ < достоверной активностью и существенным влиянием на тканевой тром-бопластин обладает только' черноплоднорябиновое и бархатцевое масла. Так как эта доза на два порядка ниже количеств бета-каротина, "оказывающих провлтаминйое действие, его можно отнести за счет дру-

гих биологических и фармакологических эффектов. Это позволяет рекомендовать использование растительных бета-каротисодеркащих ыасал не только как источников провитамина А-бета-каротина, но и как препаратов, благоприятно действующих на тромболластиновую актив—, ностъ тканой в условиях иммобилизационного и возможно других стрео-сорных ситуаций, причем в этих случаях в составе растительных ыасал каротин эффективен в меньших дозах, чем суточная потребность в нем как проЕИгамиянам препарате.

3. Очевидно, в растительном сырье, из которого получают бета-каротансодержащие масла / облепихе,, черноплодной рябине, бархатцах/ есть группа веществ -синергистов бета-каротина, усиливающих его действие на тканевой тромбопластин, так как в дозе 0,002 мг/кг массы животных чистый бета-каротин не оказывает антитромбопласти-нового действия, а в составе бвта-каротинсодержащих масел в этой, же дозе он обладает статистически достоверным антатромбопластино-вым влиянием.

4. Полученные в эксперименте данные позволяют рекомендовать болев широкое использование бета-каротинсодеряащих растительных масел в клинической практике при заболеваниях, сопровождающихся активацией тромбопластиновых компонентов - ИБО, инфарктах миокарда, стрессах, неблагоприятных воздействиях внешней среды, как пищевых добавок к жирам, обладающим гиперкоагуляционной активность» в условиях целостного организма человека и животных.

5. Необходимы дальнейшие разработки по детальному изучений и клиническому использованию новых каротин-содержащих масал из черноплодной рябины и бархатцев распростертых, так как они обладают более значительной биологической активностью, чем хорошо изученное и широко применяющееся в клинической практике облепиховоа масло.

Научная новизна работы.

1; В доступной литературе нет данных по изучению влияния экспериментального стресса на тканевые факторы свертывания и возможности коррекции этих изменений каротинсодержапцмш маслами. Биохимическая оценка показателей тканевых факторов свертывания проведена впервве при вышеприведенных воздействиях.

2. Впервые проведена сравнительная оценка каротинсодержащих масел, полученных о использованием различных экстрагентов / оливкового, кукурузного, соевого, подсолнечного масла/. Показано,

что биологическое действие зависит только от химического состава экстрагируемого сырья / облэпихового, арониевого шрота, цветков бархатцев и др./ и не определяется эксграгентом,

3. Впервые получены данные, указывающие на то, что бета-каротинсодержащие масла обладают существенным действием на тканевые факторы свертывания в дозах на порядок меньших концентраций, оказывающих витаминный эффект / предотвращающих развитие гмпо-

и авитаминозов/.

4. В работе впервые проведен сравнительный анализ эффективности известных и новых бета-каротинсодержащих препаратов коррекции изменений активности тканевых факторов свертывания, вызванных экспериментальным иимобилизационным стрессом. При этом показано преимущество арониевого и бархатцевого масел в сравнении с облепиховым.

5. Теоретически обоснована и экспериментально доказана возможность создания эффективных корректоров тканевой системы ч свертывания крови на основе каротин-содержащях растительных масел, изучены их мембранотропные свойства.

Драктическое значение работы.

1. Проведен сравнительный анализ изменений тканевых факторов свертывания при действии различных бета-каротинсодержащих масея

в условиях иммобшшзационяого стреоса. Показана более значительная эффективность арониевого и бархатцевого масла по сравнению а об~ лепиховым, что определяет необходимость более широкого их внедрения в практику здравоохранения.

2. На модели иммобилизационного стресса отмечалась активация тромбопластшювых компонентов тканей и их коррекция под влиянием бата-каротинсодержащих масел. Полученные результаты экспериментально обосновывают целесообразность лечебно-профилактического применения последних о целью коррекции гиперкоагуляционных изменений в целостном организме» вызываемых стрессорными и другими воздействиями внешней среды.

3. Изучение биохимических показателей тканевой системы свертывания при стрессе показало, что наиболее существенные изменения претерпевает активность тканевого тромбопластина, Это нужно учитывать при переносе полученных экспериментальных данных в клинику. Активация тканевого тромбопластина может быть причиной гиперкоагуляционных изменений и тромбозов.

4. В механизмах благоприятного действия бета-каротинсодержа-щих масел на животный организм необходимо учитывать их мембрано-отабилизирующие эффекты, доказанные в условиях экспериментального иммобилизационного стресса.

Реализация результатов исследования. Данные, полученные в работе будут использованы при разработке технических условий на производство отдельных бета-каротинсодержащих масел - обле-пихствого, арониевого, бархатцевого, как витаминных добавок к пище, а также при подготовке материалов на фармакопейные статьи и в Фармакологический комитет.

Полученные в работе данные используются в учебном процессе кафедр клинической биохимии Харьковского института усовершенствования врачей, кафедр клинической лабораторной диагностики Киевского, Харьковского, Запорожского институтов усовершенствования врачей.

Апробация работы. Результаты исследований, докладывались и обсуждались на третьей украинской конференции по медицинской ботанике / 1992 г/, 17 съезде врачей-лаборантов Белоруссия.

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Обьем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах, содержат таблиц и рисунка^ Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, Ц/. глав экспериментальных исследований, заключена-;г выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 источника отечественных и 37 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 570 половозрелых белых крысах линии "Вистар"' массой 180- 240 г. Тканевые экстракты каждого органа готовила следующим образом: навеску ткани из: расчета 200 мг в 1,8 мл физиологического раствора гомогенизировали и центрифугировали при 1500 об/мин, используя в дальнейшем надосадочную, жидкость / 10% экстракт/. Из него путем последовательных разведений физиологическим раствором готовили 1%\ 0,5$; 0,1$;, 0,05Jfj: 0,01% экстракты. Для оценки состояния факторов свертывания тканей изучали тромбоппастиновую и антитромбиновув активность, антигепариновое действие / К.Т.Титова,Ю.П.Никитин, 1958; Ю.Н.Оборина, Ю.П.Никитвд,1968/. Тромбопластиновое и антигепариновое влияние тканевых экстрактов изучали во всех вышеуказанных концентрациях, антитромбиновоо - в 10 %, поскольку антитромбиновые субстанции неустойчивы к разведению / В.П.Сшшетров, 1978 /.

Тромбопластиновое действие тканей определяли по их влиянии на свертывание обедненной тромбоцитами субстратной плазмы. В качестве последней использовали бестромбоцигарную субстратную, плазму доноров, полученную сначала общепринятым методом, а затем повторно отцентрифугированную при 3000 об/мин в течение 1030 минут,, чтобы при добавлении к ней 0,1 м.ч 0,27755 раствора хлористого кальция овертывание происходило, в среднем, за 120-130 секунд.

Аналогичный оубстрат использовали и при определении антигепариновой активности тканей. В качестве стандартного раствора тромбина опытным путем подбирали такую его концентрацию, которая вызывала свертывание 0,2 мл субстратной пяазмыг о 0,3 мл физиологического раствора за 15 секунд. Контролем служила гапарияизиро-ванная субстратная плазма / с 0,1 мл гепарина в концентрации

0,45 ед/мл/г тромбиновоа время которой составляло, в среднем 50 секунд.

При определении антитромбиновой активности субстратом служила донорская цитратная плазма, полученная общепринятым способом. При этом использовали стандартный раствор тромбина, который вызывал свертывание субстратной плазмы, в среднем, за 30 секувд /контроль /.

Вышеуказанные показатели изучали в головном мозге, сердце и печени всех исследуемых групп животных / в тканевых экстрактах /, а также в отдельных субклеточных фракциях.

С целью изучения точки приложения действия бета-каротиясодер-

жащих масел на тканевое звено гемостаза, в тканях сердца и печени,

где изменения факторов свертывания были четко выражены, выделяли субклеточные фракции /сарколемма сердца/, микросомы /саркоплаэма-

тический ретикулум/, митохондрии и цитоплазму.

Выделение субклеточных фракций осуществляли гомогени-

эированеи тканей, отделе нем фракций путем дифференциального многократного центрифугирования и очистки /промывки / полученншс фракций в соответствующих средах при температуре 0-4°С с использованием препаративной ультрацентрифугя АС-602 /Германия/ и 1-6-60 /Бвятв-СШк/ / Э.Медци, 1979/. Качество и степень чистоты ввдолен-ных фракций определяли с помощью маркерных ферментов / А.А.Бодды-рев, 1586/. В частности, выделение плазматической мембраны гела-тоцитов /сарколеммы/ проводили по методу Г.М.Кравцова и соавт. Д979/. Очистку мембран проводили на 4-х сахарозных градиентах концентрациями 50-60 Необходимую фракцию выделяли между гради-ентаыи 52,5-65 % по методу Р..1.1оп1в, Р.У. »Лака /1976/.

Микросомальную фракцию /саркоплазматический ретикулум/ выделяли по методу З.Наг1£ауа вt а1. /1969/. Митохондрии получали

ПО Методу О.Н.Högeboom, С. Schneider J 1948 /.

Цитоплазматическую жидкость клеток выделяли по методу В.В.Куприянова и соавт. Д978/. О качестве и степени чистоты выделенных препаратов судили на основании определения активности маркерных ферментов. Активность этих ферментов измеряли по приросту уровня неорганического фосфора в инкубационной среде. Для плазматической мембраны гепатоцитов /сарколеммы/ маркером служила 5-нуклеотидаза /н.н.Агопаоп, O.Touster , 1974/, для макросом /саркоплазмати-ческого ретикулума/ - азидустойчивая Са2+ - АТФ-ааа / а .Hart сто» si, R.Feratos , 1S64/, для митохондрий - цитохромоксидаза / D.O.Warton, A.Fragoloff ,1967/.

С целью изучения липидного состава мембран из суспензий последних. получали якпидные экстракты хлороформ-мвтаноловой смесью / I.M, Foloh et el. ,1957/, которые использовали для количественного- определения холестерина/ М.Кейтс, 1965/, фосфолипидов /В.Г. Колб, В.С.Кашшников, 1962/. Содержание отдельных классов фосфолипидов изучали с использованием метода тонкослоной хроматографии в силикагеле на стандартных пластинах "Сидуфол- W- 254" Д.Е.Величко и соавт.,1980/. Содержание липидов мембран рассчитывали на белок , концентрацию которого определяли по о. lowry /1951/. Содержание жирных кислот в мембранах определяли спектро-фотометрически по w, Dunooraba /1964/, Изучение пассивного транспорта Са2+ через плазматическую мембрану гепатоцитов /сарколемму/изучали с использованием изотопа 45СаС12 и техники мпллипорового фильтрования / Э.Д.Воробец и соавт.,1983/.

Вышеперечисленные показатели изучали у интактных крыс и у животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу. При этом возникали стрессорные язвы, которые являлись показателем стрессорной ре-

акции. По данным D.A.Brodie, н.м.напвоп /1960/ частота изъязвлений у крыс, вызываемых 24-часовой иммобилизацией составляет 8688 Нас привлекла эта модель по той причине, что язвы желудка, образующиеся у животных в результате искусственно вызываемого невроза /стресса/ по мнению ряда авторов ближе всего стоят по своему происхождению к язвам желудка у человека при нейрогенных формах язвенной болезни / С.В.Аничков, И.О.Заводская, 1965j С.В. Аничков и соавт., 1S69/.

В условиях наших опытов у 86 $ животных возникали язвенные поражения о индексом Паулса свыше 7 /i.Paule et el,1947.А.А.Акимов, 1968 /. у них мы и изучали активность тканевых факторов свертывания и другие вышеперечисленные показатели.

Экспериментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента / А.К.Белоус,В,И« Кояодяжннй, 1971; И.Т.Шевченко, 1970 /.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучаемые бета-каротинсодержащие растительные масла вводили

белым крысам перорально из расчета 0,2 мг/кг массы и 0,002 мг/кг массы животных в объеме от 0,2 до 0,5 мл зондом. Изучали действие девяти бета^саротинсодержащих масв": облвпиховов масло, экстрагируемое кукурузным; облепиховое масло, экстрагируемое соевым,' облепиховое масло, экстрагируемое подсолнечным рафинированным маслом; облепиховое масло, экстрагируемое оливковым маслом Турецкого производства; арониевый бальзам производства "Центр Росток" на подсолнечном масле} бархатцевое масло, экстрагируемое кукурузным; бархатцевое масло, экстрагируемое соевым; масляный раствор бета- ,, каротина в кукурузном масле. Все перечисленные масла стандартизовались по концентрации в них бета-каротина, определяемого по фармакопейной статье / ФС 42-1730-81 /.

При изучении показателей тканевых факторов свертывания жиз-. нено важных органов интактных крыо было обнаружено, что з норме ткани головного мозга, сердца и печени обладают модными . коагулирующими свойствами на фоне слабой или практически не выявляемой антикоагулянтной активности. Тканевые экстракты исходной концентрации ДО %[ головного мозга и печени интактных животных укорачивают время свертывания контрольной бестромбоцитарной субстратной плазмы на 57 %, Сердце обладает более сильным тромбопла^-стиновым действием, чем головной мозг и печень. Его экстракты снижают время овертывания субстратной плазмы на 74 %, Тромбопла-стиновый потенциал экстрактов сохраняется во всех изучаемых концентрациях / от 10 % до 0,01 % /. В условиях нммобилизационного стресса громбопластиновая активность увеличивается,а время свертывания крови бестромбоцитарной субстратной плазмы сокращается в сравнении со временем свертывания тканевых экстрактов интактных животных. Снижэние времени свертывания бестромбоцитарной субстратной плазмы статистически достоверно как в группе крыс © иммобилизационнынстрессом, сопровождающимся язвенными поражениями /их отмечали визуально на слизистой желудка/, так и в группе животных с иммобилизационным стрессом без язвенных поражений. Так, например, при 0,5 % концентрации тканевых экстрактов головного мозга у крыс с язвами время свертывания бестромбоцитарной плазмы с 122 секунд сокращалось до 59,9 - 2,0, а без язвенных поражений - до 60,3 ¿2,6 секунд / у интактных животных -до 81,3 ¿1,8 секунд /; при добавлении тканевых экстрактов сердца 0,5 % концентрации время свертывания сокращалось соответственно до 56,6 £ 3,3 и 57,0 £ 4,0 / у интактных животных - 78,3 -3,6/; при добавлении тканевых экстрактов печени 0,5 % концентрации время свертывания плазмы сокращалось , соответственно1 до

75,4 ~ 3,8 и 78,9 - 1,9 / у интактных животных-91,3 * 3,1 /, Во всех опытах сокращение времени свертывания при добавлении тканевых экстрактов животных, подвергшихся иммобшшзационному стрессу было статистически достоверным по сравнению, с интактными животными.

При лечебно-профилактическом применении бета-каротинсодержащих масел в дозе 0,002 мг/кг массы животных перорально в течение 20 дней статистически достоверный эффект мы получили только при применении арониевого бальзама производства "Центр Росток" и масла бар-хатцевого. Масло облепиховое, экстрагированное оливковым маслом Ливанского и Турецкого производства не оказывало существенного действия на тромбопластиновне компоненты / Табл. 1 /. В этой дозе не эффективен также масляный раствор бета-каротина, приготовленный из кристаллического препарата производства Верхне-Днепровского крах-малопаточного комбината / Украина // Табл. 2 /. Как показали проведенные1 исследования, фармакологическая активность масляных растворов бета-каротина не зависела от качества и вида масла, которым проводили экстракцию / кукурузное, соевое, оливковое, подсолнечное/, а определялась химическим составом исходного бета-каротинсодеркаще-го сырья / облепиха, черноплодная рябина, бархатцы распростертые/. Причем бета-каротинсодержащие масла из нетрадиционного сырья -черноплодной рябины я бархатцев распростертых, полученные по технологии производства облепихового масла / Л.А.Иванова,1991 / по своей фармакологической активности в дозе 0,002 мг/кг превосходили последнее, как вадно из данных таблиц 1 и 2.

При той же постановке опыта в дозе 0,2 мг/кг массы все изученные каротинсодержащие масла обладали в условиях шиобклизациоиного стресса четкой нормализующей активностью на тромбопластяк тканей головного мозга, сердца и печени и антистрессорным действием. Если иммобилизация интактных животных приводила к активации тробомлпасги-

Таблица I

Тромбопластиновые свойства головного мозга, сердца и печени крыс, которым вводили перорально в течение 20 дней в дозе 0,002 мг/кг масло облепиховое, экстрагированное оливковым маслом Ливанского производства / I /, масло облепиховое, экстрагированное оливковым маслом Турецкого производства /2 /, арониевый бальзам производства "Центр Росток" / 3 /.

tpyni

па животных

Тканевые экстракты органов. %

га

1н m о

о 1н

о. Я 04 о

ч

о h

10 I

0,5 , 0,1 ' 0,05 0,01

43.3 + 3,0 50,5 + 3,0 57,0 + 3,0 67,9 + 3,3

74.4 + 2,9 90,0 + 4,2

44,1 + 2,8 49,8 + 2,8

57.1 + 3,0 66,3 + 4,0

74.2 + 4,0 86,1 + 3,3'

59,4 ± 3,7 67,7 + 2,9" 84,0 + 2,5"' 91,9 + 2,0" 105,0 + 4,5' 121,9 + 5,1"

10 28,9 + 0,6 30,8 + 0,6" 33,3 + 1,3"

I' 43,4 + 2,2 45,7 + 2,2 68,3 + 3,4"

га 0,5 59,4 + 3,3 56,8 + 3,3 81,8 + 3,4"

1 0,1 62,3 + 5,1 67,2 ± 5,1 90,6 + 2,0"

Ф (j 0,05 76,1 + 5,1 73,3 + 4,5 98,1 + 2,0"'

0,01 78,6 ± 4,6 82,4 + 4.3 114,1 + 3,5"

10 51,3 + 1,9- 45,2 + 1,0" 59,9 + 2,6

I 61,1 + 2,0 54,0 + 2,6 78,6 + 3,6'

й аз 0,5 69,7 + 2,6 ' 69,1 + 3,9 91,3 + 3,0'

а> !У 0,1 75,2 + 2,8" 78,5 + 2,7' 98,5 + 2,5"

И 0,05 83,4 + 2,9 86,5 + 2,7 107,4 + 3,4"

0,01 88,3 + 2,6 ' —i . 94,9 ± 3,1' 115,4 + 2,0'"

Примечания: I. Время свертывания бестромбоштарной субстратной плазмы 122,0 - 9,0 сек.

• р 0,05 по сравнению с интактнили крысами, ••р^0,01 - " -

•• -р<; 0,001

Таблица 2

Тромбопластиновые свойства головного мозга, сердца и печени крыс, которым вводили перорально в течение 20 дней в дозе 0,002 мг/кг масло бархатцевое, экстрагированное кукурузным / I /, масло бархатцевое, экстрагированное соевым / 2 /, масляный раствор бета-каротина / 3 /.

Тканевые

Группа животных

экстракты : органов, % : I | 2 : 3

В 10 59,4 + 3,7 57,1 ± 3,5 ■ 46,7 + 3,4

о г ' I 67,7 + 2,9" 71,2 ± 3,0" 48,2 + 2,4

о ^ 0,5 84,0 + 2,5"" 83,6 ± 2,0*" 54,0 + 2,0

о ГС 0,1 91,9 + 2,0" 96,1 ± 3,1" 60,9 ± 4,1

<ч о 0,05 105,0 1 4,5' 103,7 + 4,3' 73,9 t 3,7

ч о й ■ 0,01 121,9 5,1" 122,7 + 4,0" 85,4 + 2,3"

10 79,3 + 0,9'" 42,5 + 1,0'" 28,8 + 1,4

I 74,7 + 3,4" 67,1 + 3,1" 57,1 + 3,1

го п 0,5 ' 83,8 + 3,2" 78,3 + 3,7" 60,1 ± 2,8

а ф од 89,9 + 3,7" 91,0 + 2,8" 63,8 + 3,1

с 0,05 96,0 + 3,9" 99,7 ± 2,2"- 68,1 ± 3,5

0,01 113,0 + з,1- 112,5 + 3,7"' 74,8 + 4,2

10 55,7 +2,9 61,4 + 2,2 42,5 + 1,2'

I 83,2 ± 3,7" 79,1 + 3,1* 55,6 ± 1,1

0,5 96,7 ± 3,1" 94,5 + 3,4" 67,4 + 2,3

0,1 103,4 ± 2,6" 103,0 + 2,5" 78,6 + 2,3'

0,05 108,2 ± 1,8"' ^09,7 + 1,8*" 86,5 ± 2,0

0,01 118,2 ± 2,5".' 118,6 + 1,7'" 92,2 + 2,6

Примечания: I. Время свертывания бестромбоцитарной субстратной плазмы 122,0 - 9,0 сек.

• р<^0,05 по сравнению с интактными крысами, ••р<с0,01 •••р^0,001 - » _ •

новых компонентов, то иммобилизация животных, которым с лечебно-профилактической целью вводили бетакаротинсодержащие маола на протяжении 20-дневного курса, практически не приводила к активации тканевого тромбопластина, Механизм действия бета-каротинсодер-жащих масел реализуется через трмобопластиновую активность тканей^ так как другие факторы овергывания тканевой системы - антигепарв-новоа, антитромбияовое действие, фибринолиз в условиях наших экспериментов не претерпевали существенных статистически достоверных изменений.

С целью выявления субклеточной локализации свертывающего и антикоагуляционного потенциала клеток сердца и печени и динамики их изменений в условиях воздействи каротин-содержащих растительных масел» нами было проведено исследование тромбопластиновой, антигепариновой и антитромбиновой активности в митохондриях, микросомах /саркоплазматическом ретикулуме/ , цитозоле и наружных мембранах миокардиоцитов и гепатоцитов интактных крыс и животных, получавших бета-каротинсодераащив масла перорально в вышеприведенных дозах. По нашим данным наибольшей тромбопластиновой и антигепариновой активностью в клетках печени интактных животных обладают митохондрии и микросомы, а в клетках сердца - микросомы и митохондрии / определение по времени свертывания контрольной бестромбоцитарной и.гепардаизрсшанной. субстратной плазмы/. Так, под влиянием мито- • ховдряй печени и сердца время свертывания бестромбоцитарной субстратной плазмы сокращалось на 32 % и 52 а тромбиновое время ге-паринизированной. плазмы укорачивалось, соответственно, на 25% и 52 %. Микросомы сокращали время рэкальцификации субстратной плазмы на 27 %, а саркоплазматический ретикулум - на 56 %. Тромбиновое время гепаринизрованной субстратной плазмы под их влиянием укорачивалось соответственно, на 39$ и 42 %.

Плазматическая мембрана гепатоцитов проявляла невыраженную тромбопластиновую активность и не оказывала антигепаринового действия. Время свертывания бастромбоцитарной субстратной плазмы уненьшалось на И составляя 118 £ 4,3 секунд против 132 £ 15 секунд в контроле.

Трабомбопластинавое и антигепаринавое действие сарколеммы также проявляется незначительно, а в цитоплазматической фракции тромбопластиновое и антигепариновое влияние вообще нэ обнаружено. В то же время цитозоль и наружные мембраны клеток сердца и печени оказывали антикоагулянтное действие на субстратную плазму. Тромбиновоа время плазмы под их влиянием удлинялось на 100 % и 66 % при действии цитозольной фракции и на 53 и 27 % при действии наружных мембран миокардиоцигов и гепатоцитов.

Митохондрии и микросомк клеток печени, обладающие в норме высокой тромбопластиновой и антигепариновой активностью, не проявляют антикоагулянтные свойства. Цитозольная фракция, наоборот, оказывает антикоагулянтное действие, но не обладает свертывающим потенциалом, Наружнал мембрана гепатоцитов проявляла антикоагулянтное действие, слабое тромбопластиновое влияние и не обладала антигепариновыми свойствами,

Митоховдрии и саркоплазматический ретикулум клеток сердца в норме оказывали выраженное тромбопластиновое и антигепариновое действие, сарколемма - слабое коагулирующее действие. Антикоагу-дянтными свойствами обладали лишь цитозольная фракция и сарколемма, Курсовое применение каротиксодержащих растительных масел не вкаывало значительных достоверных изменений тканевых факторов свертывания, которые могли бы свидетельствовать с0 изменения их оодержаниа или о перер&ределвнаи их локализации в субклеточных, структурах.

Известна, что начальная стадия свертывания крови во многом зависит от липвдных компонентов тромбопластинов ~ фосфолипидов, липвд-липидным взаимоотношениям между их функционально различными группами / К.Г.Карагезян, и соавг, ,1974/, Учитывая существование метаболической, связи между холт—, этаноламино— и серин-со-держащими фосфатидами и определяющее значение характера их взаимоотношения на проявление прокоагулянтной активности / С.О.Оваки-мян, К.Г.Карагезян» 1978/, нами был исследован фосфолипидный состав наружных мембран клеток печени и сердца, так как именно эти мембраны имеют самое непосредственное отношение к тромбопластино-вой активности тканей. Изучали содержание фосфатадилхолина, фосфв-тидилэтаноламина, фосфатидилсерпна,, холестерина, а также продуктов распада фосфолзшлдов - лизоформ и свободных жирных кислот в наружных мембранах клеток этих органов. В плазматической мембране ге~ патоцитов оказалось 28,7 % фосфатадилхолина, 2,9 % фосфатвдил-эганоламива, 1,74 % фосфатвдилсерина, 39,4 % холестерина, 26,4$ свободных жирных кислот, 0,9 % лизофосфолипидов.' В сарколемме -оказалось 1,74 % фосфатидилсерина, 25,0 % фосфатидилхолина, 47,5 47,5 % холестерина, 25 % свободных жирных кислот и 25 % лизофосфолипидов. Введение каротинсодержащих масел на приводило к существенным изменениям соотношения изучаемых фракций липидов в мембранах. • Поэтому изменения юс проницаемости,изученные позднее при помощи меченого кальция, являются функциональными и не связаны с достоверным изменением жирнолипвдного состава мембран.

Нами была также изучена скорость пассивного транспорта ионов кальция из везикул мембран клеток сердца и печени, предварительно нагруженных радиоактивным кальцием. Необходимость таких эксперимен-

500 объяснялась тем, что изменения тканевых факторов свертывания под влиянием этилового алкоголя могут быть следствием нарушения выхода субстанций с про- и антикоагулянтной активностью, как результат изменения проницаемости клеточных мембран. Результаты этой серии исселдований приведены на рисунке в условиях контроль- . них опытов м концу первой минуты инкубации из везикул мембран миокардиоцитов и гепатоцитов выходит соответственно 30 и 26 % исходного содержания кальция, а остальное его количество выходит постепенно, плавно онижаясь По мера уменьшения градиента концентрации ионов кальция.

Сравнительное изучение проницаемости наружных мембран: клеток обоих органов показало, что если в условиях иммобилизационного стресса выявляется выраженный дестабилизирующий эффект на мембрану, при атом резко повышается проницаемость ее для ионов кальция, то у животных, которым вводили о лечебно-профилактической целью; бета-каротинсодержащие масла, усиление проницаемости менее значительно. Сдвиги проницаемости мембран в сторону их снижения можно расценивать как положительную защигну» реакцию организма, которая оптимизируется каротин-содаржащимж масл^ыи,

Риаутюк .« Пассивный транспорт 45Са2+ через везикулы наружных мембран миокардиоцитов и гепатоцитов и его изменения, под действием каротинсодержащих растительных масел А ~ сарколемма миокардиоцитов В ~ плазматическая мембрана гепатоцитов

1 - крысаи вводили бархатпевое^масло о содержанием

бетанкаротина 0,002 мг/кг, перорально в течение 20 дней

2 - вводили черноплоднорябиновое масло . 3 - вводили облепиховое масло

4 - вводили масляный раствор бега-каротияа микробиоло-

гического из расчета 0,002 мг/кг, перорально в

течение 20 дней

5 — интактяне животные

ВЫВОДЫ

1.. Экспериментальный иммобилизационный стресс вызывает нарушения в тканевом звене гемостаза, что проявляется в активации тром-бопластиновы^ компонентов тканей головного мозт, сердца,печени животных.

2. При изучении биологического действия каротинсодержащих масел /облепихового,арониевого,бархатцевого,бета-каротина/ в условиях стресса показано, что последние оказывают статистически достоверное антитромбопластинавое действие при лечебно-профилактическом применении в течение 20 дней, не влияя существенным образом на антитромбиновую,антигепариновую и фибринолити-чесхую активности.

2. Установлена зависимость коррегирущего действия каротинсодержащих масел на изменения тканевого гемостаза от их дозировки. Так, в дозе 0,2 мг/кг массы тела /в пересчете на £-каротин/все изученные растительные масла вызывали ангитромбопластический аффект,в то время как в дозе 0,002 мг/кг массы он проявлялся только при введении черноплоднорябинового и бархатцевого масел, что подчеркивает их большее биологическое действие. Антйтромбопластиновый эффект, как показали результаты исследований, ко зависел от вида масляного экстрагента /подсолнечное, соевое,кукурузное,оливковое масло/, а был обусловлен химическим составом исходного сырья /облепиха,черноплодная рябина,бархатцы распростертые/. Поэтому получение бета-каротинсодержащих масел о высокой биологической активностью можно осуществлять, используя различные вышеперечисленные растительные касяа.

5. Результаты изучения пассивного транспорта4Ва2+через везикулы наружных мембран мяокардиоцитов я гепатоцитов свидетельствуют о том,что бета-каротинсодержащне растительные масла обладают

стабилизирующим мембраны эффектом, и в этом отношения наиболее активными являются бархатцввов и черноплоднорябиновое масло. 6. Полученные результаты исследований экспериментально обосновывают целесообразность лечебно-профилактического применения бета-

вклинике

каротинсодерлащих масёЯ^гГцелью коррекции гиперкоагулящюнных изменений в организме.вызываемых стрвссорными ■ другими неблагоприятными воздействиями..

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка унифицированных показателей, свертывающей системы крови при курсовом применении облепихового масла // 1У научный

съезд специалистов по клинической лабораторной диагностике Республики Беларусь: Тезисы докладов.. - г. Гродно, 1992. - С. 173175..

2. К вопросу об унификации методов определения фибринолити-ческой активности крови // 17 научный сьезд специалистов по клинической лабораторной диагностике Республики Беларусь: Тезисы докладов. - Г.Гродно, 1332. - С. 152-154 / соавт. Лилкан Г.Н"., Гетте З.П., Каменецкая Т.Н. и др. /

3. Значение изучения, тромбопластиновой, активности тканей при оценке действия физиологически активных веществ на систему гемостаза // Тратя украшська конференцгя а медично! бстанпси: Тези доповгдей. - Ки1в. - 1992. - Ч. 1. - С. 91. /соавт. Лилкан Г.Н.Пахмутова Л.М.» Иваненко Т.В. /