Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние модифицированного аубазидана на некоторые клеточные и гуморальные компоненты макроорганизма

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние модифицированного аубазидана на некоторые клеточные и гуморальные компоненты макроорганизма"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО АУБАЗИДАНА НА НЕКОТОРЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ И ГУМОРАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МАКРООРГАНИЗМА

Специальность: 03.00.07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РГБ ОД

1 о янп

На правах рукописи

К А Н А Е В Павел Андреевич

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена на кафедре микробиолог™ Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института и в лаборатории иммунологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии иы.Пастера.

Научные руководители: доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РСФСР, академик СПбИА, профессор Блинов Н.П. и кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Кузнецов С.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф.Ви-товская Г.А.; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Морозов В.И.

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургская Медицинская академия последипломного образования.

Защита состоится " ¿¿¿¿/дД^ 1дд6 г> в На

заседании Специализированного совета К 084.63.01 Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по адресу: 197022, С.-Петербург, ул.проф.Попова, д.14.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института.

Автореферат разослан " оемги^^ 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние годы все большее внимание уделяется микробным полисахаридам и их продуцентам. В этом ряду особое место занимают дрожжевые организмы - сапрофи-ты, образующие экзогликаны различных строения и свойств. Как установлено ранее, большинство изученных дрожжевых внеклеточных полисахаридов не обладают антигенностыо, не проявляют токсических и сенсибилизирующих свойств при введении in vivo, в этой связи актуальной задачей является исследование дрожжевых экзо-гликанов как основы для создания специфических сорбентов (в том числе - для селективной гемосорбции), отвечающих определенным требованиям и соответствующих запросам практики. Среди углеводных биополимеров несомненный интерес представляет полисахарид -аубааидан, образуемый диморфным грибом Aureobasidium pullulans штамм N 8 (F-348).

Аубааидан имеет разветвленную структуру и достаточно большое число свободных ОН-групп, благодаря чему он может быть трансформирован в гранулированную форму. Вместе с тем, аубазидан проявляет иммуномодулируювде, антивирусные и детоксицирующие свойства, что придает ему особую ценность при создании гемосорбентов. Аубазидан может быть использован в двух направлениях: для обеспечения более качественного процесса гемосорбции и для сочетания улучшенного процесса экстракорпоральной гемосорбции с проявлением имму-номодулирующих и антивирусных (индукция интерферона) свойств. Настоящая работа является дальнейшим развитием исследований, проводимых в Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институ-

- г -

те по микробным полисахаридам.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования - изучить и определить возможности использования грибного экаогликана - аубазидана для гемосорбции; задачи исследования:

1. Создать гранулированные формы аубааидана, обладающие выраженными дренажными свойствами.

2. Изучить физико-химические показатели полусинтетических производных аубазидана на предмет выбора наиболее подходящих из них по целевому назначению.

3. Оценить влияние полусинтетических производных аубазидана на физиологические функции макроорганизма и контролируемые функции белых клеток крови до и после гемоперфузии.

4. Определить пути практического использования полусинтетических производных аубазидана, включенных в схему экстракорпоральной гемосорбции.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований были получены методом полусинтеза с зпихлоргидрином гранулированные формы аубааидана - гемосорбенты группы ГПА (ГПА - гранулированный поперечносшитый аубазидан), при этом было показано, что природа растворителя, из которых выделяют ГПА, заметно влияет на их емкость по воде, пористость и способность адсорбировать белки (БСА и гемоглобин). Доказана возможность использования данных гемосорбентов (после периодатного окисления) в качестве матри для присоединения аминосодержавдх лигандов.

Исследован эффект гемоперфузии через гемосорбент ГПА (и сорбенты сравнения - уголь СКН-2К и агарозы 4В) на некоторые клеточ-

ные и гуморальные компоненты макроорганизма. При этом установ-дено, что в процессе гемоперфузии через ГПА:

- изменяется соотношение полиморфноядерных и мононуклеарных лейкоцитов крови;

- перераспределяются фракции сердечного выброса;

- индуцируется синтез ot и г интерферонов;

- падает гемолитическая активность системы комплемента;

- стимулируются окислительные процессы в лейкоцитах крови;

- изменяется концентрация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови;

- не происходит поликлональной активации В-лимфоцитов.

В опытах in vitro показана незначительная гемолитическая активность ГПА.

Обнаружен эффект подавления хемилюминесценции лейкоцитов крови в присутствии активатора кислородного метаболизма - форболмиристат-ацетата (ФМА) и высокая сорбционная емкость для атерогенных липо-протеидов низкой плотности (ЛПНП). Практическая ценность работы.

1. ГПА, будучи индуктором синтеза а и т интерферонов и высвобождения биологически активных веществ при гемоперфузии, интересен при различных инфекционных и неинфекционных заболеваниях.

ГПА обладает высокой сорбционной емкостью по отношению к липопро-теидам низкой плотности, при отсутствии сорбции липопротеидов высокой плотности, поэтому он перспективен при лечении гиперхо-листеринемии, ишемической болезни сердца, хронической почечной недостаточности.

2. Доказана возможность получения сорбентов полисахаридной природы с различной пористостью, структурой и специфичностью к различным соединениям, что может иметь практическое приложение в экспериментальной и клинической медицине.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (С.-Петербург, 1994) и в ежегодных отчетах аспирантов на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Публикации. По материалам диссертации имеется 10 публикаций в форме тезисов и поданы 2 заявки на патенты.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на -i3Z страницах машинописного текста и состоит из введения, 2-х глав обзора литературы (1-я часть), 2 глав результатов собственных исследований (Q-часть), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего /¿* публикаций на русском и /3? на иностранных языках. Работа иллюстрирована ji таблицами и 33 рисунками.

Материалы и методы исследования.

В работе использовали Aureobasidium pullulans (De Вагу) Arnaud штамм 8 (F-348) и образуемый им экзогликан - аубазидан.

Аубазидан - разветвленный глюкан, основная цепь которого представляет собой 3-1,3-связанные остатки D-глюкопиранозы, каждый третий остаток в положении Се имеет боковую цепь, содержащую «-1,4-связанные глюкозидные остатки. Молекулярная масса

(0-9) х Ю6 Да; pH водных растворов - 7,0; удельное вращение в 0,1 Н NaOH -18°.

Емкость гелей аубазвдана (W) и степень набухания определяли гравиметрическим методом (Тугов И.И., 1989). Расчет производили по формуле: W (г/г) = шг - mi/mi , где mi - масса геля до набухания; mg - масса геля после набухания.

Сорбцию белка и гепарина проводили в статических условиях при температуре 20-23° С. Сорбенты в объеме 0,3 мл вносили в растворы белка или гепарина (3 мл) с различной концентрацией: от 1 до 80 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) ("Sigma", США, Ш 67000 Да) и от 1 до 32 мг/мл гепарина ("Спофа", Чехословакия, Ш 17000 Да). Равновесную концентрацию белка и гепарина в растворе измеряли по оптической плотности: для БСА при Х= 280 нм, для гепарина при \= 220 нм.

По разности между начальной и конечной концентрациями определяли количество белт или гепарина, сорбированного на сорбенте, и строили изотермы сорбции.

Образцы для электронной микроскопии готовили следующим образом: гранулы сорбентов помещали в 1% раствор 0s04. приготовленном на какодилатном буфере pH 7,2-7,4.

По истечении двух часов гранулы отмывали от OSO4 исходным буфером и проводили через возрастающие серии этанола (от 30 до 96%). Затем их заливали в эпоксидную смолу (Араудит), резали на микротоме "Reichert" (Австрия), срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. Морфологию сорбентов исследовали на электронном микроскопе "BS-613" (Чехословакия). Полученные изображения анали-

зировали при помощи счетной сетки с частотой Б х Б мм. Измеряли линейные размеры светлых областей и интерпретировали их как поры. На основании измерений рассчитывали средние размеры пор (Rs) и показатель U (неоднородность пор по размерам) (Черкасов А.Н., Пасечник В.А.,1991 ).

Инфракрасные спектры (ИК) сорбентов в вазелиновом масле снимали на спектрофотометре "Specord-75 IR". Стендовые испытания сорбентов проводили на колонке 0,5x60 мм с использованием перистальтического насоса фирмы "LKB" (Швеция) со скоростью подачи биологических жидкостей - 7 мл/час.

В экспериментах использовали 1000 белых беспородных мышей обоего пола с массой тела 20-22 г; 100 белых беспородных крыс-самцов массой тела 180-220 г., полученных из питомника РАМН "Рапполово".

Для проведения гемоперфузии мышей и крыс наркотизировали нем-буталом ~ 30 мг/кг. Свертывающую систему крови блокировали гепарином в дозе 500 ЕД/кг. Для мышей использовали колонки с гемоконтактными препаратами объемом 0,3 мл, которые подключали к системе кровообращения по схеме вена-вена. Кровь для перфузии подавали перистальтическим насосом со скоростью 3-5 мл/час. Продолжительность процедуры - 25-30 мин. Для крыс использовали колонки с сорбентом (2 см3). Скорость гемоперфузии составляла .15 мл/час, время перфузии 60 мин.

Гемолитическую активность сорбентов определяли в стендовых испытаниях по свободному гемоглобину на фотометре АЕФ-Ц-01С при Х= 405 нм. Степень гемолитической активности(«) выражали: оптическая плотность в опыте/оптическая плотность в контроле.

Изучение распределения фракций сердечного выброса проводили по методу (Ковалев O.A., 1981). Крысам через 10-15 мин после проведения гемоперфузии через артериальный катетер вводили макроагрегаты человеческого сывороточного альбумина (МАА), диаметром 10-30 мкм, меченные I131 (г.Обнинск), активностью 40 мил-либеккерель (МБК) в объеме 0,2 мл. Через 1 мин крыс убивали насыщенным раствором KCl. Извлекали органы и подсчитывали радиоактивность каждой пробы с помощью радиометрической установки и пересчетного прибора ПС0-2-2ЕМ.

Измерение пробы проводили в течение 100 сек. Относительные изменения фракции сердечного выброса в каждой пробе рассчитывали с помощью показателя % МАА в пробе нормированного по X массы органа.

Циркулирующие иммунные комплексы в сыворотке мышей до и после гемоперфузии определяли по методу Haskova.V (1978) в микромодификации С.-Петербургского института гриппа.

Интерфероны в сыворотках мышей определяли методом количественной гемадсорбции (Аксенов O.A., 1972).

Титр комплемента выявляли с помощью стандартной гемолитической системы, состоящей из 0,8% бараньих эритроцитов и 500 доз антибараньей гемолитической сыворотки. Эту смесь в равных обьемах вносили в исследуемый материал, предварительно разведенный 1:21:512 раз. Реакцию проводили при 37°С до появления полного гемолиза в разведениях. В гемолизированную смесь вносили субстрат -0.05% орто-фенилендиамин дигидрохлорид и 3% пероксид водорода. После развития цветной реакции ее останавливали 2М H2SO4 и учитывали на иммуноферментном анализаторе при длине волны 492 нм,

с расчетом величины оптической плотности для испытуемого и стандартного комплементов.

Метод иммуноферментных зон "Злиспот" выполняли согласно (Духин А.И., 1992).

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили как описано (Теория и практика иммуноферментного анализа /под ред.Егорова A.M., 1991).

Для изучения сорбции липопротеидов к 1 мл сорбента добавляли определенное количество плазмы крови (в мл) от больных наследственной гиперхолесгеринемией или ишемической болезнью сердца. Сорбент промывали 0,15 М NaCI, связанные липопротеиды злюировали 0,01 М раствором НагСОз и определяли нефелометрически в реакции с анти-апоВ (липопротеиды низкой плотности) и анти-апоА (липопротеиды высокой плотности) антителами /метод разработан и выполнен в лаборатории биохимии ИЭМ РАМН под рук.академика РАМН Климова А.Н./.

Хемилюминесцентную активность лейкоцитов крови определяли на приборе "Luminometer-1252" (LKB, Швеция). В гаовету биолюминометра помешали 0,1 мл сорбента или 0,1 мл раствора аубазидана, 0,6 мл раствора Хенкса без фенолового красного, 0,2 мл люминола ("Serva" Германия) в конечной концентрации 10~4 М/мл и 0,1 мл крови. В целях оценки индуцированной хемилюминесценции в кювету помещали то же количество сорбента или раствора аубазидана, люминола, крови; 0,5 мл раствора Хенкса и 0,1 мл форболмиристатацета-та (ФМА).

Статистическую обработку проводили в соответствии со стандартом СЭВ-876-78 "Прикладная статистика. Правила определения

оценок и доверительных границ для параметров нормального распределения".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первый этап заключался в получении гранулированной формы аубааидана, отвечающей требованиям, которые предъявляют к сорб-ционным препаратам. В экспериментах использовали классический метод получения гелей (сорбентов) на основе пожсахарщных гид-роксилсодержаддах полимеров, основанный на способности полифункциональных сшивающих соединений, таких как эпихлоргидрин (ЭХГ) ковалентно связывать полимерные цепи полисахарида с образованием поперечносшитых гелей (Flodin D., 1962). При исследовании зависимости гелеобразования аубазидана от его концентрации и концентрации ЭХГ было установлено, что минимальная концентрация аубазидана, при которой наблюдается полимеризация, составляет 4-5%, при соотношении сухой вес полисахарида /вес ЭХГ =1:1 (данное соотношение обозначали как "степень сшитости"). В дальнейших экспериментах использовали 5Z водно-щелочной раствор аубазидана. Обычно для проведения гемосорбции применяют гранулы правильной сферической формы, которые получают путем диспергирования раствора полисахарида и сшивающего агента в органических средах (Афин-ная хроматография /под ред.Дина П./., 1988). Все попытки получить гранулы аубазидана сферической формы не увенчались успехом. Поэтому решено было получать гранулы аубазидана несферической формы путем продавливания его гелей через сита с диаметром пор 0,50,7 мм. Однако, полученные гранулы обладали низкой механической прочностью в динамическом режиме. Гранулы сильно уплотнялись и

ограничивали скорость протекания жидкости в колонке. В связи с этим, для получения механически прочных гранул аубазидана, применили метод замены воды гидрогеля различными органическими жидкостями /Неймарк И. Е. , 1959/, например, ДМСО (диметилсульфоксид) и ДМФА (диметилформамид), а также обработку гелей дегидратирующими веществами - н-бутанол, этанол, 1,4-диоксан. Исходные гели, обработанные органическими жидкостями и дегидратирующими веществами, затем высушивали при Ы 63-65°С до постоянного веса с поел дующим набуханием в воде. Согласно литературным данным /Неймарк И.Е., 1959; Самсонов Г.В., 1986/ данная обработка может оказывать существенное влияние на формирование пористой структуры гелей (сорбентов), а, следовательно, на их свойства. Одним из показателей изменения структуры гелей (сорбентов) после вышеуказанной обработки является их емкость по воде (V/, г/г). Как видно из рисунка 1, емкость гелей по воде значительно понижается после обработки и высушивания из органических жидкостей (на рисунке указана "степень сшитости" 1:2). Наибольшую емкость имеют гели, полученные путем обработки 1,4-диоксаном и ДМСО. Наименьшая емкоста характерна для гелей, полученных при высушивании из воды и после обработки н-бутанолом (при дальнейшем изложении использована следующая форма: гели (сорбенты) получены из таких-то (вода, ДМСО, ДЩ>А, этанол, н-бутанол, 1,4-диоксан) растворителей). Затем определяли прочность гранул. Было установлено, что они обладают достаточной прочностью в колонках. Полученные гели (сорбенты) обозначали как ГПА (гранулированный поперечносшитый ау-бааидан) или сорбенты группы ГПА.

При изучении адсорбции белков, в частности, БСА, сорбен-

35 30 25 20 15 10 5 0

ил-

ш

Р 1

1

6

Рмс.1. Емкость гелей по воде (г воды/г геля) 0-исходный гель. Гели полученные и» воды-1; ДМСО-2; ДМФА-3; этанола-4; н-бутанола-5; 1,4-диоксана-б.

Рис.2.Изотермы сорбции БСА сорбентами группы ГПА;

А - сорбенты, полученные из воды-1; ДМСО-2; ДМФА-3; Б - сорбенты, полученные из зтанола-4; н-бутанола-5; 1,4-диоксана-6

тами группы ГПА (рис.2) было установлено,что наибольшей адсорбционной емкостью к белку обладали сорбенты,полученные из 1,4-ди-оксана и ДМСО, наименьшей - из воды и н-бутанола. При этом в области равновесных концентраций до 20 мг/мл (за исключением сорбента, полученного из 1,4-диоксана) изотермы сорбции для всех сорбентов очень близки. Полученные изотермы имеют выраженный S-отклик и они отличаются от классических изотерм Ленгмора. Согласно представлениям Чухрай Е.Е. и др.( 1973), Селезневой A.A. и Самсонова Г.В.(1975), Дмитренко Л.В. и Скворцо-ва A.M.(1990) подобные изотермы объясняются ассоциацией белков в адсорбированном слое, которая в нашем случае наблюдается в области больших концентраций БСА.

Нами также установлено отсутствие сорбции гепарина сорбентами ГПА, доказательством служили низкие (менее 1,0) коэффициенты распределения гепарина.

Пористость, гетерогенность полимерной сетки и радиусы пор сорбентов изучали с помощью электронной микроскопии. Как видно из рисунка 3 сорбенты группы ГПА имеют различную внутреннюю морфологию; средний радиус пор (Rs) и показатель U сорбентов приведены в таблице 1.

Из таблицы следует, что природа интермицеллярной жидкости оказывает существенное влияние на структуру сорбентов. Сжатие скелета геля было наибольшим в том случае, когда интермицеллярной жидкостью являлась вода и значительно меньшим, когда использовали органические жидкости - ДМСО и JW>A. При дегидратации геля н-бутанолом, этанолом, 1,4-диоксаном также изменяются пористость и структура гелей. При этом наиболее крупнопо-

X 44700

■л*«

Кб .ч 44700

рис.3 Электронно-микроскопическая морфология сорбентов. Обозначения сорбентов см.на рис.1

ристые гели (сорбенты) получены при использовании апротонных органических жидкостей - 1,4-диоксана, ДМСО и ДМВА.

Таблица 1

Характеристика сорбентов по данным электронной микроскопии

Сорбенты 1?з,нм и

N1, полученный из воды 14,0 1,097

N2, полученный из ДМСО 95,0 1,42

N3, полученный из ДМФА 28,0 1,24

N4, полученный из этанола 26,0 1,27

N5, полученный из н-бутанола 14,2 1,27

N6, полученный из 1,4-диоксана 42,0 2,57

Примечание:для однопористых сорбентов и = 1,0

Этими экспериментальными данными доказывается возножность получения сорбентов группы ГПА или гелей аубаэидана (не исключая также и других сорбентов) разной пористости.

По данным ИК-спектроскопии сорбенты ГПА не отличаются по спектральным характеристикам от исходного полисахарида, что указывает на отсутствие каких-либо функциональных групп, нехарактерных для аубаэидана, а также не наблюдается значительных конформационых изменений полимера (полисахарида) за счет влияния поперечных связей при его сшивании ЭХГ.

После создания и характеристики ГПА, исследовали влияние гемоперфузии через данный сорбент на некоторые клеточные и гуморальные компоненты макроорганизма.

Одним из важнейших показателей гемосовместимости сорбентов является их гемолитическая активность или способность повреждать эритроциты крови, что сопровождается гемолизом (Шерст-нев П.П.,1980). Гемолитическая активность ГПА (рис.4) меньше, чем для сорбентов сравнения - уголь СКН -2К и агарозы 4В, и составляет 5% от контрольного уровня (на 120 минуте эксперимента). Таким образом, на основании проведенных опытов можно заключить, что ГПА является более гемосовместимым с кровью(по степени гемолиза),чем сорбенты сравнения.

После гемоперфузии через ГПА в системном кровотоке мышей отмечено значительное повышение уровня полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) (рис.5) по сравнению с препаратами сравнения -углем СКН-2К и агарозой 4В. При этом наименее выраженный эффект имеет место после гемоперфузии через уголь СКН-2К. Как известно, повышение уровня ПЯЛ или нейтрофильный лейкоцитоз отражает ком-

время, мин

Рис.4.Степень гемолитической активности сорбентов

1 - ГПА, 2 - уголь СКН-2К, 3 - агароза 4В

%пяп

за 60 90 120

минуты

Рис.5. Изменение уровня ПЯЛ в системном кровотоке у мышей после гемоперфузии

к1 -контроль( до гемоперфузии)

к2 -контроль( после введения гепарина и нембутала)

1 - уголь СКН-2К 3 - ГПА

2 - агароза 4В

пенсаторные реакции организма на действие различных раздражителей (Павлов А.Д., 1987), таких как гемоперфуаия. Не исключено, что лейкоцитоз обусловлен повышением в кровотоке продуктов активации системы комплемента (см.ниже).

Повышение уровня ПЯЛ в кровотоке мышей сопровождается увеличением уровня хемидюминесценции (ХЛ) лейкоцитов крови (табл.2).

Таблица 2

Уровень хемилюминесценцин лейкоцитов крови после гемоперфузии через гемосорбент ГПА

Время мин Без активатора С активатором ША

пик.ш время пика,мин ПИК.ШУ время пика,мин

До 0,68±0,008* 0 1,23±0,27* 6,2 ±1,41

30 0,864+0,14 7,3 ±3,5 1,45+0,26 5,7б±1,11

60 1,250±0,38* 14,4 ±4,3 2,0 ±0,78* 8,0 ±0,32

120 1,290±0,42* 5,6 ±1,5 2,3 ±1,0' 7,12 ±1,0

Примечание: •* р<0,05

Уже через 60 минут происходит почти двухкратное увеличение уровня ХЛ (без активатора) и к 120 минуте выходит практически на посто-

янный уровень. ХЛ, индуцированная форболмиристагатацетагом (ОМА), почти в два раза выше ХЛ без активатора. Следовательно, в кровотоке мышей после гемоперфузии через ГПА присутствуют лейкоциты, генерирующие активные формы кислорода. При этом активируется только часть лейкоцитов, другая часть способна потенциально отвечать на различные стимулы (например, ЗШ).

В опытах in vitro было установлено, что ГПА не индуцирует ХЛ и достоверно понижает ХЛ,индуцированную <ША до контрольного уровня, т.е. выступает в качестве ингибитора ХЛ. В отличие от ГПА, растворимый аубааидан значительно индуцирует ХЛ лейкоцитов. Вероятнее всего, активные формы кислорода могут поглощаться ГПА, что и приводит к ингибиции ХЛ. Нами установлено, что после гемоперфузии через ГПА и сорбенты сравнения - уголь СКН-2К и агаро-зы 4В в плазме мышей увеличивается концентрация интерферонов (рис.б).Наиболее сильным индуктором оказался ГПА с пиком актив-

60

МЕ/мл

30

50

40

20

10

О

О

2

4

6

24

72

время,Ч

Рис.б.Индукция интерферонов у мышей после гемоперфузии

f - ГПА 2-агароза4В

з - уголь СКН-2К к - контроль

ности интерферона через 4 часа после проведения процедуры и последующим резким падением их тигра. Индуцибельные свойства угля приблизительно в 1,5 раза ниже, чем у ГПА. Агароза 4В незначительно стимулировала синтез интерферонов. Обнаруженные в плазме интерфероны в 100% относились к г-типу при контакте с углем и от 67 до 71% при взаимодействии с агарозой 4В и ГПА соответственно. В этой связи можно предположить,что стимуляция клетки, сопровождающаяся синтезом интерферонов, происходит через рецеп-торный аппарат, а изменяющееся функциональное состояние клетки можно рассматривать как процесс твердофазной контактной цитомоду-ляции.

После гемоперфузии через ГПА и препараты сравнения (см.вше) выявлена характерная динамика активности системы комплемента (рис.7).

о/

100 90 60 70 60 50 40 30 20 10 0

*

б

24

4

время, ч.

Рис 7 Изменение уровня комплемента у мышей после гемоперфузии

к1 - до гемоперфузии 3 - агароза 4В

к2 - контроль (после введения гепарина и нембутала)

1- ГПА 2 - уголь СКН-2К

Активность комплемента после гемоперфузии через ГПА понижалась в течение 24 часов и составляла 12Z от контрольного уровня. Наиболее значительное падение активности комплемента происходило при использовании угля СКН-2К. После перфузии через агарозу комплементарная активность понижалась в течение 4 часов, а затем медленно возрастала. Вероятнее всего, падение активности комплемента связано с расходом СЗ-компонента комплемента, который активируется при контакте с поверхностью сорбентов (Dennis Е.С.,1988; McLeod B.C., 1983). Снижение активности комплемента в контрольной группе животных (введение только гепарина и нембутала) связано с антикомплементарной активностью гепарина (Вавилова Л.М., 1990; Кузник Б.И., 1989).

Наш установлено изменение концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) после гемоперфузии (рис.8).

сутки

Рис.8 Изменение ЦИК в кровотоке у мышей после гемоперфузии

1-ГПА 3-агароза 4В

2-уголь СКН-2К к-контроль

При использовании угля СКН-2К и агароэы 4В на первые сутки после

гемоперфузии не обнаружено ЦИК в сыворотке крови мышей. После гемоперфузии с использованием ГПА уровень ЦИК возрастает в 5 раз

относительно контроля. На б сутки после процедуры имеет место повышение концентрации ЦИК как после гемоперфузии через ГПА, гак и через препараты сравнения. К 14 суткам уровень ЦИК в сыворотке крови мышей понижается, но наибольшее снижение характерно после использования ГПА. Изменение концентрации ЦИК после гемоперфузии, скорее всего, есть результат специфического сорб-ционного воздействия, что обусловлено смещением равновесия -образования и элиминации ЦИК (Петров В.И., 1983). Не исключено, что массовое поступление иммунных комплексов в кровоток (особенно после гемоперфузии через ГПА) является улучшением системы микроциркуляции крови (Остапенко В.А., 1993).

Гемоперфузия через ГПА и сорбенты сравнения не влияет на индукцию поликлональной дифференцировки и пролиферации В-лимфоцитов в антителообразующие клетки различной специфичности к белкам (бычий сывороточный альбумин, r-глобуллин человека) и убитым клеткам Candida albicans штамм 13.

При изучении перераспределения фракций сердечного выброса у крыс после гемоперфузии через ГПА выявлена его характерная особенность изменять органное и региональное кровообращение по сравнению с контролем и препаратами сравнения (уголь СКН-2К и агароза 4В). При этом фракции сердечного выброса достоверно (р< 0,05) понижались в мышцах живота, желудке и пищеводе, селезенке, надпочечниках, почках, коже задних конечностей; и незначительно повышались в каркасе живота и таза, мышцах и костях

задних конечностей. Как известно, изменение гемодинамики в данном случае носит транзиторный характер и отражает компенсаторные реакции сердечно-сосудистой системы на внезапно изменившиеся условия (Лопухин Ю.М., 1985).

Показана высокая сорбционная емкость сорбентов ГПА к атеро-генным липопротеидам. При этом наибольшее изменение концентрации атерогенных липопротеидов наблюдали на сорбенте, полученном пут обработки исходного геля 1,4-диоксаном. Специфическая емкость со{ бента для липопротеидов низкой плотности составляет 2,2 мг/мл. Следует подчеркнуть, что в процессе плазмосорбции фракция липопротеидов высокой плотности не связывается с сорбентом и не удаляется из плазмы (0,12 мг/мл геля). На основании этого мы предлагаем новый тип сорбента, который в перспективе можно успешно использовать при нарушении липидного обмена у больных, связанного с увеличением концентрации атерогенных липопротеидов.

На основе ранее известных фактов и полученных нами данных можно предположить, что гемоперфузия неоднозначно сказывается на макроорганизме.

С одной стороны, имеет место повышение активности определенных систем, с другой - понижение или отсутствие изменений в их активности. Поэтому, гемоперфузию можно рассматривать как раздражающий фактор, причем степень раздражения определяется природой сорбента. Гемоперфузия как раздражитель или стрессор способна нарушать внутреннее постоянство среды организма - гомеостаз (Панин Л.Е., 1992). Поскольку при различных патологических состояниях существует свой установившийся "патологический гомеостаз", то гемоперфузия как раздражитель может способствовать

переходу на новый гомеосгатический уровень, т.е. выступать как терапевтический прием. В данном случае гемоперфузии по определению Г.Селье можно отнести к зустрессу, от греческого "эу" - хороший (Селье Г., 1960).

ВЫВОДЫ

1. Отработаны условия получения сшитых эпихлоргидрином гелей аубазидана и их гранулированных форм - сорбентов группы ГПА.

2. Установлено, что природа растворителей, которые применяли для обработки гелей с целью получения сорбентов, влияет на:

а) их емкость по воде, которая выше при использовании апро-тонных растворителей - 1,4-диоксан, ДМСО, ДШ>А;

б) формирование их пористой структуры; наиболее крупнопористые сорбенты получены путем обработки исходного геля апротон-ными растворителями;

в) их способность адсорбировать белки (БСА, гемоглобин).

3. Сорбенты группы ГПА по спектральным характеристикам (ИК-спектроскопия) не отличается от исходного полисахарида.

4. Доказана возможность использования ГПА в качестве матрицы для присоединения различных аминосодержащих лигандов.

5. На основании гемоперфузии через ГПА установлено:

а) возрастание количества лейкоцитов в системном кровотоке (за счет повышения уровня полиморфноядерных лейкоцитов);

б) влияние на органное и региональное кровообращение;

в) усиление хемилюминесценции лейкоцитов крови в результате активации кислородного метаболизма;

г) значительное понижение активности комплемента;

д) повышение титров « и т интерферонов;

е) отсутствие влияния на поликлональную активацию и диффе-рендаровку В-лимфоцитов в антителообразующие клетки;

ж) изменение уровня иммунных комплексов в системном кровотоке, который повышается на 1 и 5 сутки, с последующим падением на 14 сутки.

6. В стендовых испытаниях с применением гемосорбенга ГПА установлено:

а) отсутствие выраженной гемолитической активности ;

б) способность подавлять хемилюминесценцию лейкоцитов крови человека в присутствии активатора респираторного взрыва - форбол-миристатацетата (ФМА);

в) высокая сорбционная емкость для липопротеидов низкой плотности (2,2 мг/мл геля) и отсутствие сорбции из плазмы липопротеидов высокой плотности (0,12 мг/мл геля).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заявка N 93026960 от 15.06.93 г. Способ регистрации клеток-антителопродуцентов в ИФА /соавт.: Кузнецов С.И., Павлико-ва М.И./.

2. Канаев П.А., Кузнецов С.И., Павликова М.И. Выявление клеток-антителопродуцентов методом ИФА //Актуальные проблемы инфекционной патологии: Материалы конференции, посвященной 70-летию Института им.Пастера. 25-27 мая 1993.-СПб.-1993.-с.31.

3. Кузнецов С.И., Павликова М.И., Канаев П.А. Экстракорпоральное кровообращение у мышей //Актуальные проблемы патофизиологии

экстремальных состояний:Тез.докл.Всеросс.конф.-СПб.-1993.-с.96.

4. Канаев П.А., Кузнецов С.И., Науменко Н.В., Тюкавин А.И. Реакция системы кровообращения на гемоперфузии через различные сорбенты //Эндогенные интоксикации: Тез.докл.Международ, симпозиума 14-16 июня 1994.-СПб.-с.33-34.

5. Кузнецов С.И., Павликова М.И., Канаев П.А. Влияние гемоперфузии на антителогенеа //Эндогенные янтоксикации.- Тез. докл. Международ.симпозиума 14-16 июня 1994.-СПб.-с.127.

6. Канаев П.А., Кузнецов С.И., Аксенов O.A., Елинов Н.П. Биологическая активность гемосорбента ГПА-83 //Эндогенные интоксикации: Тез.докл.Международ.симпозиума 14-16 июня 1994.-СПб.-с.223.

7. Канаев П.А., Кузнецов С.И., Елинов Н.П. Получение сорбентов группы ГПА на основе микробного полисахарида //Эндогенные интоксикации: Тез. докл.Международ.симпозиума 14-16 июня 1994. -СПб.- с.224.

8. Канаев П.А., Кузнецов СЛ., Аксенов O.A., Елинов Н.П. Интер-фероногенная активность сорбента (ГПА), полученного на основе микробного полисахарида // Химия и технология лекарственных веществ: Материалы Всероссийской научной конференции 28-30 июня 1994.-СПб.- с.16.

9. Канаев U.A., Кузнецов С.й., Елинов Н.П. Сорбенты на основе микробного полисахарида // Химия и технология лекарственных веществ: Материалы Всероссийской науч.конф.28-30 июня 1994.-СП6.-С.16.

10. Янковский О.Ю., Кузнецов С.И,, Рынцын О.В., Науменко Н.В., Канаев П.А., Эйсмонт Ю.А., Чурилова И.В., Тюкавин А.И.

Хемилюминесценция лейкоцитов-критерии биосовместимости носителей для эфферентной терапии // Актуальные вопросы военно-морской и клинической медицины : Материалы научно-практ. конференции посвящ. 280-летию 1 Военно-морского клин, госпиталя. -СПб. -1995.- с.300-301.

11. Заявка на выдачу патента на изобретение N 95111987 от 11.07.95. Способ индукции синтеза интерферона (его варианты) /соавт.: Кузнецов С.И., Аксенов О.А., Блинов Н.П./.

12. O.Yu.Yankovsky., S.I. Kuznetsov., I.V.Churilova., A.I.Tiuka-vin., N.V.Naumenko., P.A.Kanaev., 0.V.Rintsin., Yu.A.Aismont. Activation of leukocytes due to column-haemoperfusion and supression of R0S accumulation in the pass-blood by the intravascular injected antioxidants. //International Congress on Free Radicals In Health and Disease. September 6-10, 1995, Istanbul-Turkey.