Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фазовое состояние и возрастные характеристики Aureobasidium Pullalans (De Bary) Arnaud, 1910 в связи с продукцией аубазидана

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фазовое состояние и возрастные характеристики Aureobasidium Pullalans (De Bary) Arnaud, 1910 в связи с продукцией аубазидана"

ИЯИСГШЯВО 1ДО0|Ш0Я ПКШПДОХЯИ СССР

шшгрщтя шшо-^ашщвтйчесзшй институт

На правах рукописи Ш 599.61 66:547.917

РУССКИХ Татьяна Леонидовна

ФАЗОВОЕ СОСТОЯНИЕ И ВОЗРАСТНЫЕ ХАРАКГЕЙКХМКЙ АШШОМЗНШШ iULUJLAiiS CDS ЪШ) ASSAVD, 1910

В СВЯЗИ С ПРОДУЩЕЙ АУБАЗИДШ

03.00.07. - ЫЙКРОШОЛОШЯ •

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени* кандидата биологических наук

Ленинград 1990

Работа випожзна на кафедре микробиологии Ленинградского хи^жко-^аруацевткчеокого института.

НаучннП руководитель - заслуженный деятель'науки РСФСР, Д.&1 профессор Н.П.ЕШНОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е.П.ЯКОВЛЕВА кандидат биологических наук Н.А.СИЛУЯНОЗА

Ведущая организация - ШО "Биотехнология" Минмедпрома СССР

Защита состоится " * декабря 1990# года в & * часов на заседании специализированного совета К 098.02.02 по биологическим наукам Ленинградского химико-фармацевтического института по адресу: 197022, Ленинград, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЛХФИ.

Автореферат разослан " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук С1-1- /С_М.А.КШИНА

Актуальность тем». Ба&годаря ушк&гьнеста евайстз и отдася-дельной доступности шкробнне полисахариды иазод зироков пркмвкв-нкв а различных сферах человеческой деятельности: в буровой, неф-тадобнваязей, хюягческой, тзхсгняьной, пицезой, фармацевтической» парфгагрной арсккзданноста, ыедкщша. Дяалазон их использования с каядаш го дои расширяется. В этой свезя актуален вопрос об уве~ лвченкз объемов производства окзоподисахаркдов. Одни из путей решения этой проблемы - оптакнзацяя биосинтеза, основанная на познании бяохкшчесгих к физиологических закономерностей данного процесоа.

АагаоЬааА(11иа рц11и1апз штамм 8 - продуцент аубазидана, является диморфным грибом, т.е. существует в дрожжевой и мицели-альнай формах (фазовое состояние). Продукция полисахарида обычно связывается о дрожжевой фазой, хотя и эта пооледняя может развиваться, не образуя экзогликана. Изменение условий культивирования может привести к преимущественному росту культуры в той или иной фазе. Поэтому необходимо нахождение коррелятивных зависимостей между способность!) к синтезу полисахарида и морфологическими проявлениям культуры при различных условиях культивирования.

В научной литературе нет единого мнения об отнесении полисахаридов к первичным или вторичным метаболитам. Если полисахариды - вторичные метаболиты, вполне обоснованной является идея осуществления двухотадийного культивирования А.рц11и1апз в периоды грофофазы и идиофазы клеток, изначально обладающих способность» продуцировать экзогликан.

Настоящая работа выполнена в соответствии с Постановлением Государственного Комитета СССР по науке и технике Н> 371 от 12 ок-гября 1987 года "Программа работ по создании водонабухащих и водорастворимых полимерных материалов и их применение а различных отраслях народного хозяйства".

- к -

Цели и задачи исследования:

- доказать зависимость или, напротив, независимость продукции полисахарида от существования продуцента только в дрожжевой или только в мицелиальной фазе;

- установить в какой стадии размножения популяции продуцента начинается биосинтез полисахарида, затем достигает максимума, стабилизируется и затухает или прекращается;

- доказать справедливость отнесения аубазидана к разряду вторичных метаболитов, используя клетки продуцента в период идио-фазы для получения полисахарида.

Научная новизна. В результате исследований установлено, что аубазидан является вторичным метаболитом, т.е. накопление полисахарида в культуральной жидкости происходит в период идиофазы. Од- ' нако, синтез зкзогликана осуществляется только растущими клетками и при достижения ими "критических" размеров скорость биосинтеза падает. Поэтому, для увеличения выхода полисахарида необходимо создание условий, обеспечивающих высокую удельнув скорость роста продуцента.

Увеличение удельной скорости роста культуры А.ри12и1шгз 5 8 возможно при добавлении в среду аубазидана или органических кислот - участников цикла Кребса.

Показано, что морфологические изменения культура (форма и размеры клеток) могут служить контролем качества процесса биосинтеза екзогликака.

Установлено, что ионы ашония не являются ингибиторами синтеза полисахарида культурой А.ри11и1Ешя № 8. Подавление синтеза аубазидана, изменение морфологии и способа размножения клеток при высоких исходах концентрациях сульфата ашонкя в среде происходит з результате быстрого закисяания среда: культивирования.

Теоретическая и практическая значимость. Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные дополняют имеющиеся сведения о влиянии различных факторов на морфолого-физи-ологическое состояние культуры А.ри11и2епз К> 8 и биосинтетическую активность клеток продуцента аубазидана в различных фазах роста.

Установлено, что увеличение возраста посевного материала, выращенного на среде Чапека-Докса до 54-56 часов, приводит к увеличению выхода экэогликана на 15-3055.

Исходное значение рН 4.0 является оптимальным для биосинтеза полисахарида на среде Чапека-Докса.

Бри использовании аубазидана и органических кислот - участников цикла Кребса в качестве добавок к регламентной среде выход полисахарида значительно возрастает, при этом себестоимость готового продукта снижается на 25-45$.

Полученные результаты могут быть использованы для совершенствования процесса получения аубазидана в лабораторных и производственных условиях.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены на заседании Ленинградского научного общества микробиологов и эпидемиологов (1968), на конференции молодых ученых "Творчество молодых - научно-техническому прогрессу" (Ленинград, 1986), на конференции "Биоконверсия-88. Теоретические основы микробной конверсии" (Рига-Юрмала, 1988), на кояЛзеренщм "Проблемы и перспективы биотехнологии" (Братислава, ЧССР, 1969), на УП съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989).

Публикации. По материалам диссертации имеется 5 публикаций.

Структура, •работу. Диссертация состоит из введения, обзора литература, описания цатеркалов я методов исследования, изложения полученных результатов к их обсуждения, выводов, с иска циткруе-

шй гжзргхгуры. Работ® изждаиа. m ^ «агзидаяясиогс.

ts»c*&, содеряят расу®®», // табяяц, Вкй.ш>1рэфа.*; лгля« JS2. навнйШЕааий, из иаи ^ на ккосераяхш: языках.

ЖПЕРИдаШЬНАЯ ЧАСТЬ

»¿атзттат.и тто,г?| «саталог&гая. В каодстэо cfegr^a иссяедо-заг-отя ксяользоваа культуру A.paiiulan3 8 - продуггвш1 знвкде-■гочксго ауб&зедшгц • a такзо доэтпгегрлт я таза? кхэ-

ток в VBusrn six напзикзай бкоаяда-гтетеевоа активности.

Для получения лясАта гявтгш A.puliulans & 8 протопяасга-pocaat, пспользул слодусхне фэр&йнгныэ прзп&рати: пищвваротсл&юй! еок виноградной улитка Holix pomatia (ПСУ) и дрояазлитйи ~ продух? завода фермангннх препаратов, г. Вилыивс; продуцент - Act. . rutgerssßsis . Протопласты отделяли •'от интаэтигс: нлетов центрмфу-гирог-адаеи при 2000 сб/мин а т ens: nie 10 мин, отодэали от лйтнчвс-ксЯ сыесй осмотическим стабилизатором (0.6 М KCl) и разрупали ос-мотячесяоа сэяоц.

Для падения клеточного экстракта использовали дезинтегратор дискового типа (Кййошнн В.Г., Единое H.H., 1574), Разрушило клеток прозодаш -при скорости вращения внутрзкквго дяека 4500 -5000 otí/мин в течение 3 мин. Все операции проверяй при температуре 4°С. Гоиэгеняз&т центрифугировала при 5000 об/дон з точение 10 um, а результата получали клеточный cos, освобоядегапй от ие-paspyssHHHX кяатоа я клеточных стенок. Контроль sa стзпвньв разрушения клеток осуществляла путей оизмаивания препаратов гомигз-нязата по нвтоду В1«шеЫ.( .

Все эксперимента с лкз&том и двзкнтегратом клеток А.ри11и1ааз £ 8'проводили в колбах вместилостьв 100 мл при температур<з Ю°С к 25+1°С.

Ферментацни проводили в колбах Эрлен^ейера. змеетжосг-.о 750

ия g 2CQ m лнтггевгьгий среда щ® гжорарзшюа щрв&яятмш дошках ( Я »220 об/mm) в тежврв&урв куяьтяахровашя 25+ï°C, Процесс веля а ?ечешю 96 часов. Засев фсрквстбцкокшг кояб производила посвзтас матерааигсм, выраценнам а тех же условиях а колбах со 100 из пктаусльяой среда.

Дяй оц?1Ш* варгшэтроа роста я бкосдатаза полшсахаряда кс-пояьзоваля гадвуа еяктотггэскуа ср®ду Чаявка-Дожсл я среду Харада. Поскольку среда Чзпага-Докса с 5$ сахара-ргфгкада рекеыгидована о оттю-прошягшегшом репшеекто для получшгая аубазкдана сухого, в ишшх иссяедозакяязг ока быяа использовала s качестве контрольной.

Выход полисахграда а биокассз определяет весовш котодом. Кудьтуральну» авдаость цвитрЕ^углроэадя пра 35000 об/ьшн в течение 10 та. Полисахарид отдзглгя от биоыдссц и осаждали двуня объемами 96$ этанола. Осадок отфильуровнзаяи на бумааном фильтре. Биокассу проккзали дистиллированной водой, обезвоживали ацетоном. Полученные полисахарид и бноиассу вксудаваля до постоянного веса

пра ео°с.

Концентрации аясюкийкого азота в среде определяли с помощью ионселехткзного электрода типа ЭУГ-03, концентрации нитратного азота с поищы» пленочного электрода для определения активности ионов uoj .

Качественное определение органических кислот в культуральной жидкости проводили методой буназшой хроматографии (Соядатенхоэ C.B., 1971).

Образцы чистых полисахаридов получали из неразбавленной фэр-ыентационной массы с помощью ультрацентрифуги УОЫ 3170 В (35000 об/мин, 10 мин). Супернатаит очищали от остатков питательной среди и продуктов метаболизма двухкратным осаждением 96% этанолоц. Осадок растворяли в дистиллированной воде и затем вновь осавдалз

- б -

96$» этанолом. Полисахарид высушивали при 40°С в теченяа 6-8 часов. Полученные образцы анализировали по следугошм показателям: относительной вязкости 0.1% водного раствора - с помощь» вискозиметра Оствальда, гомогенности - методом гельфильтрации на колонке с Сефарозой-43, удельному вращения - на поляриметре Перкин-Элмер мод. 241, соотношений гликозидных связей - методом перйодатного окисления.

Оценку экономической эффективности питательных сред производили по приближенному экономическому критерию (Вирккоз В.З., Май-миндС.И., 1967).

Статистическую обработку значений количественных параметров проводили з соответствии со стандартом СЗВ 876-78 "Прикладная статистика. Правила определения оценок и доверительных границ для параметров нормального распределения".

Результаты исследования и их обсуждение. 3 ходе исследования установлено, что замена источников углеродного и азотного питания, изменение температуры вырацивання, добавление спиртов (1-2?), се-микарбазида, фекилгидразина, сульфата цинка (10-10~°моль/л) а :-идкуг> среду Чапека-Докса не приводит к индукций мицеяиалького развития культуры А.ри11и1апз д» 8, поэтому все посдедущие эксперименты проводили с дрожжевой фазой продуцента аубазидана.

I. Биосинтетическая активность клеток А.риНиХапз № 8 при периодическом культивировании.

Для получения аубазидана сухого э опытно-промышленном регламенте рекомендована среда Чапека-Докса. При выращивании в этой среде клетки А.ри11и1алз № 8 достигают стационарной фазы развития к 48 часам роста. К этому времени размножение культуры практически закончено. Количество почкующихся клеток составляет 2-3$. Происходит накопление клеточной массы за счет роста, или увеличе-

шя объема клеток. Именно этот период времени характеризуется ¡аксимальной биосинтетической активностьв продуцента. Когда боль-ад часть клеток достигает "критических размеров" (4.5-6.5 х 7.50.5 мкм) и прироста клеточной массы больше не происходит скорость;: ¡брззования полисахарида падает.

Возможно, синтез полисахарида связан с ростом и размножением клеток. Или же скорость образования экэогликана в стационарной зазе развития культуры снимется в результате качественных изме-[ений среда культивирования. Для выяснения этого вопроса мы азу-гали биоскнтетическу» активность клеток» находящихся в стационар-юй фазе разаятия.

При понесении отмытых дрожзсеподобяых клеток ¿.pullulcme » 8, выращенных в срэдв Челека-Докса в течение бв-72 часов в раст-юр; содержаний только сахарозу и 7^0 , накопления зхзсглк-

:аяа в среде не происходит. При переносе клеток в среду Чапека-[окса количество образующегося полисахарида пропорционально пря-юсту клеточной массы. Увелзгчение ze биоыассы происходит в резуль-•ате размножения клеток и зависит от концентрации источника азота. |днако, при выращивании в среде Чалеха-Докса клетки продуцента в гамент их каквнешей баосянтетачеакой активности практически не шннозкшгся и находятся в условиях лимита по источнику азота. При йрекосо 96 часовых клеток в культуральмую гидкость, освобаяденнуо i? клеток 48 часовой культура и, наоборот, 48 часовых клеток - а ультуралькув зеидаость, освобозэдекь-угз от клеток 96 часовой культу-и, и в том и в другом случаях набягщаан интенсивное раашохекае леток, накопление клеточной массы и полисахарида (Рис. I). Раэ-кчный характер нзиэие!ия показателей процесса биосинтеза в этих слозиях, вероятно, обусловлен возрастом плеток с учетом цикла их азвятая. Пенсе продадайтельвая Q уфаэа 48 часааык клеток приво-?5т к уаетченяю удельной скорости роста при переносе нх а вовув

среду. Большая продолжительность gj-фазы 96 часовых клеток способствует переходу части клеток а покоящуюся форму, а также образованию внутри популяции класса медленно размножающихся клеток. В результате скорости роста и размножения культуры ниже на менее обедненной среде. Таким образом, хотя уже к 48 часам а среде Чапека-До кс а происходит торможение роста численности популяции, среда остается пригодной для роста и размножения клеток. Можно предположить, что ауторегулятором развития A.pullulant В выступает полисахаридная капсула: при больших ее размерах происходит ограничение доступа экзогенных питательных веществ в клетку. При лишении источника энергии клетки останавливаются а своем развитии в Gj-фазе. Жизнеспособность клеток поддерживается за счет внутренних энергетических ресурсов. Поступление экзогенных источников питания при удалении полисахаридиий капсулы индуцирует пириход клетки из Gj в ¿¡-фазу. Действительно, при культивировании т/2 часовых клеток после центрифугирования при I6Q0Q об/мин происходит дальнейшее размножение клеток, их рост и синтоз полисахарида (Рис. I).

Таким образом, синтез полисахарида осуществляется клетками, находящимися а Gj-фазе клеточного цикла и создание условий, оптимальных для роста клеток продуцента и итоН фазе будет сиоооостио-иить накоплению екэогликана в среде.

При инкубировании дезинтиграта или лииата клоток A.^uXiuiuaj 8 в 0.1 M фосфатно-цитратном буфоро pli 5.0 с 2,1 глккоаы и Û.Cfou Uri^û^- 711^,0 синтеза полисахарида ни происходит. Циронтно, и о луча.; их приготовления происходит -'екеокиназ и синтоз полиса-

харида может бить осуществлен только при использовании и качоотло субстрата-донора фосфорилироаанних Сахаров (Гобаши, 1975).

Рис. I Зависимость биосинтеза глюкана от фазового состояния культуры А. рц11и1шш 8 и особенностей культуральной среда

1-48 часовые клетки в 96 расовой культуральной жидкости, освобожденной от клеток,

2 - 56 часовые клетки в 48 часовой культуральной жидкости, освобожденной от клеток,

3 - ?2 часовые клетки после центрифугирования при 18000 об/имн,

4 - контроль (72 часовые клетки).

2. Злиякке разжштшх условий культивирования на морфолого-|Е8нояогическое состояние культура A.puiiaians £ 8 и so биосштетическув активность.

А) Вяаянае ауб&зндака.

На процесс биосинтеза значительное влияние оказывает качество посевного материала. В соответствии с оштю-ггромотденшм регламентом дяя получения аубазидаиа используют 46-50 часовой посевной материал. При использовании 54-56 часового посевного материала вивсод чистого полисахарида позазается на 15-30$, по сравнения с контролем. В результата кссдедозэшй установлено, что улучшение показателей процесса биосинтеза полисахарида при использовании 55 часового кнокултв. обусловлено увеличением количества экзогли-кана, вносимого с клетками в питательную среду.

Добавление полисахарида э среду Чапека-Докса приводит к более интенсивному размножении клеток, накоплении клеточной массы. Изменяется профиль рН куяьтуральной жидкости. Закислекие среды происходит более медленно (рис. 2). Наибольшее влияние на биосинтез оказывает аубазидан а концентрации 0.4-0.5 г/я. Выход чистого полисахарида увеличивается ка 60-80$ при использования посевного материала, выращенного на среде Чапека-Докса, я на 40-50$ при использования посевного материала, выраженного ка среде Харада, где /

полисахарид не синтезируется. Добавление аубазвдана а среду влияет на скорости утилизации источников углеродного и азотного питания, что в своп очередь определяет характер изменения рН ферментационной массы.

Б) Влияние рН.

Значения рН питательной среда значительно влияет на рост, морфологко и процесс биосинтеза полисахарида культурой A.puliuians № 8. При культивирования в среде Чапека-Докса с фосфатно-ирктратнкм буфером максимальный выход полисахарида соответствует исходному рН среда 4.75. Снижение неходкого рН от 4.75 до 4.1 приводит к пере-

время культивирования,ч.

Рис. 2 Влияние добавления аубазидана в среду Чапека-Докса ка биосинтез экзогликана культурой Д.ри11и1апя 8

- среда Чапека-Докса

-----среда Чапека-Докса с 0.5 г/л аубазидана

распределение потоков метаболитов в сторону увеличения Быхода биомасса и снижения выхода полисахарида. При культивировании в среде Чапека-Докса оптимальным рН для синтеза экзоглмкака является 4.0 (выход полимера увеличивается почти в два раза). Увеличение выхода полисахарида при исходном рН среда 4.0 объясняется характером изменения концентрации водородных ионов в ферментационной массе в хода культивирования. В контроле рН снижается с 6.5 до 3-5-3.8 в течение.48-60 часов. При исходном рН 4.0 концентрация водородных ионов либо незначительно снижается (до рН 4.3-4.5), либо остается постоянной в течение 48 часов, что свидетельствует в пользу сбалансированного потребляя углеродного и азотного источников питания. В этих условиях происходят более интенсивное накопление биомассы клеток, а следовательно и увеличивается выход полисахарида.

Характер изменения кинетических характеристик процесса биосинтеза при высоких исходных концентрациях водородных яоноз определяется градиентом рН. При использовании в качества источника азота солеЛ аммония, потребление его сопровождается выделение?« з среду конов водорода - среда закисляется. Клетки А.?ц11о1ааэ б уавякчкаается а раааврах, размнекение осуществляется поперечным делением. Полисахарид в этих условиях не синтезируется. При использовании в качестве источника азота нитрата натрия, ого утилизация сопровождается удалением из среда исков водорода для вое-становления йо^" до , значение рН среды увеличивается. Клетки продуцента размножаются почкованием. Одна клетка образует до 2030 почек, которые практически одновременно отпочковываются и начинают синтезировать полисахарид, в результате изменяется-продолжительность фаз развития культуры (рис. 3). Однако, выращивание А.эаНиХалз 6 з среде Чапека-Докса с исходным рН 2.5 не всегда сопровождается значительным увелвнепием рН среда. Бели рй изме-

75 24 з£

48 60 72 64 96

время культивирования, ч.

Piic

ЕИ<

на

¡синтез полисахарида культурой л,pulíalas а среде Чапека-Докег с исходным значением pH 2.5

няется до значений 3.5-3.8 и не более, отделения почек не происходит, клетки остаются в а^н^азе. Полисахарид не синтезируется. При исходных значениях рН среда Чапека-Докса 2.0 снижения концентрации водородных ионов практически не происходит. В этом случае размножение осуществляется поперечный деление«, причем клетки не успевают отделиться друг от друга, образуются конгломераты. Отдельные клетки растут в виде сферулоподобных образований, в 7-10 раз презъйшщх по размерам обычные дрозжеподобшз клетки. Изменение рК ферментационной массы при культивировании продуцента ау-базидана в среде Чапека-Докса с рН 2.0-2.5 вероятно зависят от соотношения скоростей усвоения источников углеродного и азотного питания.

В) Влияние иоиоз аммония.

В результате высокой скорости утилизации ионоз аммония культурой "А.рцИоХааз I? 8 при выращивании продуцента аубазидана в среде Харзда происходит быстрое закисление среды культивирования. Изменяется форма, способ размножения клеток, лродолжателькость фаз развития: размножение осуществляется почкоааггиом, которое заканчивается к 24 часам роста, далээ клетки уве.тлъпвшгся в размерах и после 36 часов начинают размножаться поперечкьгл делением, образуются скопления клеток, подсчет их затруднен. Синтеза полисахарида не происходит. При уменьшении концентрации сульфата аммония з среде до 5-30 мг/л клетки продуцента размножаются только почкованием, рН культуральной жидкости сниэается до значений 3.5-3.8 з течение 48 часов. Накопление биомассы клеток сопровождается синтезом полисахарида (рис. 4).

Поддержание рН ферментационной массы а процессе аыршцивашя А.ри11и1апБ № 8 в среде Харада в пределах 4.0-5.5 приводит к образовании зкзогликана. Однако, количество биомассы клеток в этих условиях значительно превышает количество образующегося полисаха-

о »—»

X

о =: и

5

■ 7 * а «

б 1*4 а о

0' <4 о с О 3

4' ►•г» 'а. « о и о ч к

а л У О 9 о ■о

з-

2 1

г.

О—

-о---О- ---о

12 24 36- 45 60 72 84 96

время культивирования, ч,

Рис. 4 Влияние сульфата аммония на биосинтез полисахарида культурой Л.ри11и1апз 8

- ---среда Харада с 2 г/л (ЛН. КЗО.

т 6 ^

——— среда Харада с 20 мг/л СШ^зо*

«г<»

¿о -

рида (рис. 5). Можно предположить, что при метаболизме сахароз большая часть образующихся органических кислот идет на нейтрализации быстро утилизируемого клеткой аммиака. В результате выход полисахарида в среде Харада с контролируемым рН незначителен при высокой удельной скорости роста продуцента. Высокая скорость роста Л.рч11ц1ап8 3 8 в условиях лимитирования источником азота (72-96 часов), вероятно, обусловлена повышенным содержанием свободных аминокислот в клетках. Поэтому необходима условием синтеза полисахарида является определенное соотношение скоростей утилизации источников углеродного и азотного питания клетками, продуцента.

Г) Влияние органических кислот - участников цикла Кребса.

При добавлении кислот, участвующих в цикле Кребса, в среду Чалека-Докса в концентрациях 5-20 кмоль/л, увеличивается выход полисахарида и биокассы клеток А.риНоХасз $ 8. Максимальным стиму-дарудцим эффектом обладает яблочная кислота. При концентрации ее в среде 15-20 кмоль/л выход полисахарида увеличивается на 50-902». До(5авлениз органических кислот в культурздьнуо жидкость в момент возрастания биосинтетической активности клеток не приводит к значительному улучшению показателей процесса биосинтеза. Из этого можно сдзлать вывод, что органические кислоты оказывает влияние в основном на накопление клеточной массы. А поскольку к 48 часам, размножение культуры практически закончено и рост клеточной массы осуществляется за счет увеличения объема клеток, эффект органических кисло? незначителен. При культивировании А.,ри11и1адз № 8 а среде Ча-пека-Докса к 24 часам в ферментационной массе накапливаются органические кислоты: «¿-кетоглутаровая с 0.75, ¿^идентифицированная кислота с 0.52 и незначительные количества уроновых кислот. К 36 часам появляется также винная кислота ( Н,- 0.40). При зырацива-н'/.к А.ри11и1ш1з$ 8 в среде Харада в ферментационной массе обнаруживается только винная кислота. Вероятно, выделение в среду «¿-кето-

Ша. <Щ

Рис. 5 Влияние рН культурадьной жидкости на биосинтез полисахарида культурой А.раШйааз » 8 на среде Харада

----! - контроль

---------—— процесс биосинтеза с контролируемым рН

гзугаровой кисло*» при цузшяткрззада» з среде Чайсха-Дойоь ирг^с ход-:? з результате янгвбкроватя сукцкйатеиоишазы гадроксилгзйг-нем - промежуточна* соедакением при вссстаноаяокая штратнак ионов з аажкийже. Непрерывный синтез е^кетоглууаровсй кислоты в ее згсс-крсщня в среду ноже* пратеезм к аммеацня глноксклаттаго цкхт. Нтто нет иоэто объяснять каясйзалыай стязул1грущяа эффвж? яб~ лочшй касжсш.

В соответствии а тезсшЕО-окошУнчесюш обоснованием создания аубазидана сухого цена I кг экзоишхаиа составляет 995 руб (1933). По данным ЛХЗй проектная цена на аубазидап может быть установлена на уровне 83.5 руб/кг. Пояйая его себестоимость соответственно 833.52 и 69.90 руб/кг. Добавление аубазидана (0.5 г/л) или яблочной кислоты (20 ммоль/л) в среду Чапеха-Докса, изменение исходного значения рН до 4.0 приводит к значительному снижении себестоимости полисахарида. Таким образом, полученные результаты могут быть/»«^"^ лй/.^л? йлр&йцм в промышленном производстве аубазидана.

Таблица I

Оценка экономической эффективности питательных сред.

Вариант среды Выход Выход Снижение себестоимости

пояисаха- полисаха- .в % при оптовой цена на рида, г/л рида, % аубазидан

996 руб 83.5 руб

Среда Чапека-Докса 4.61+0.35 100 - -

Среда Чалека-Докса с исходным рй=>4.0 6.37+0.22 138.18 27.63 27.63

Среда Чапека-Дскса с 0.5г/л аубазидана 6.78+0.17 147.07 23.46 23.20

Среда Чалека-Докса с 20 ммоль/л яблоч- 8.39+0.14 182.00 44.46 37.97

ной кислоты

Среда Чапека-Докса 9.45+0.11 204.99 44.56 38.61

с У.о г/л ьцуии-лидапа,

20 ммоль/л яблочной кислоты и исхсдным рН-4.0

Таблица 2

Физико-химические характеристики полисахаридов, образуемых культурой ¿.ра11и1апа $ 8 при различных условиях культивирования

Условия получения Выход полиса- Зова суль- Содержание рН 0.1% вод- Относительная

полисахарида харида, г/я фатная, % влаги, % ного раствора вязкость 0.1%

водного раствора

Исходное рН среды Чапека-Докса 2.5 16+0.15 2.4, 2.5 6.3 2.7

Исходное рН среды """^'ч-Иокса 4.0 6.29+0.12 3.3 6.6 6.4 5.1

Возраст посевного материала 48 часов 4.53+0.24 3.6 4.1 6.4 4.5

Возраст посевного материала 56 часов 5.84+0.04 5.2 3.2 6.6 5.5

Соеда Чапека-Докса с 0.5 г/л аубазидана 5.36+0.41 4.8 2.8 6.7 3.5

Аубазидан (партия № 97) - 2.3 4.1 ' 6.5 3.2

Среда Харада с контролируемым рН 3.21+0,20 5.5 4.1 б .-8 5.1

Среда Чалека-Докса с 20 „ш.3ль/л яблочной кислоты 6.17+0.37 6.7 2.6 6.8 6.3

Среда Чапека-Докса с фоафатко-цитраткш буфером, рН 5.5 5.8Э+0.65 6.4 4.2 7.1 5.2

Таблица 3

Структурный анализ полисахаридов, образуемых культурой А.риНаХапз № 8 при различных условиях культивирования.

Условия получения полисахарида

ЪЛ% водного раствора

Среда Чалека-Докса с + 107

исходным рН 2.5

Среда Чалека-Докса с +39

исходным рН 4.0

и^ораст посевного • т 35

материала 48 часов

Возраст посевного 10

материала 56 часов

Среда Чалека-Докса с +44

0.5 г/л аубазидана

Аубазидан (партия № 97) +39

Среда Херада с контро- + 22

ГМ?\\ПЛЦ1М рН

Среда Чапека-Докса с 20 + 24

шоль/л яблочной кислоты

Среда Чапека-Докса о фосфат- + 28 но-цитратным буфером, рН 5,5

Типы и соотношение гяикоэидных связей

С1-С6 и/или С1-С4 и /или концевые нереду- С1-СЗ С1-СЗ

цируиоке группы

37.1

34.7 34.4 32.9

33.2

21.3

33.8

34.7 34.7

21.7 16.4 19.2 22.0

17.1

34.2 18.7

17.4

18.0

41.2 48.9

46.4 45.1 49.7

44.5 47.5

47.9

47.3

м о

- ?д -

3. Вжшшкв условий культивирования на фазяко-хкшгчесетв ха-рактерясткхи полисахаридов, образуем*® культурой А.»ра11ц-1ааз £ 8.

Bes полученные наыи полисахарида являются нейтральными гяв-канами с высокой относительной вязкость» (табл. 2} и пояидисаер-снсстьв: количество и соотношений фракций значительно варьирует в зависимости от условий культивирования.

На основакет результатов перйодатного окисления (табл. 3) можно предположить, что изменение условий хультквировакня влияет на длину боковых цепей и количество точек ветвления в молекуле полшера, однако, это влияние незначительно. Сникение вязкости, увеличение количества CI-CS связей и удельного угла вращения зк-зогликана, полученного на среде Чапека-Докса с исходным pH 2.5 мояет быть следствием снижения степени ветвления молекулы аубази-дана и увеличения фракции пуллулана в полисахаридаом препарате. Все глвканы (за исключением вышеназванного) по соотношении глико-зидных связей отвечают критерию стандартности для аубазидана, предложенному Хван A.B. Относительное постоянство содержания CI-C3 и CI-C6 связей в полисахаридаых образцах свидетельствует о том, что аубазидан является структурно-метаболическим полисахаридом, т.е. его синтез и строение генетически детерминированы. Изменение количества CI-C4 езязей обусловлено действием аубазидантад-ролаз с трансгликозилирущей активность» Шаронова Н.Б., 1988).

ВЫВОДЫ

-I. Наивысшая блосинтетическая активность клеток А.ри11и1аиз » 8 при период-¡ческом культивирования соответствует началу стационарной ф гы развития. В это время размножение клеток практически за' пчено и про исхода? накопление бко?-"1ссы клеток за счет их росте или увеличения oötewa.

2. Сщггез подксахаргц©. оау^сталлв?аг? только росятярос! дрохааяс дрбвгаая клетками (клетками, находгт^зегся в с- ■¡--фазя), поэтому реализация двухфазного процесса биосинтеза, полисахарида без использования полноценной питательной среди (а липь раствора глсзсозы иля сахарозы) для А.риХ1и1аиз $ 8 становится невоздах-ной. Для увеличения выхода полисахарида необходимо создание ус- . лазнй, сбеспечкзащря высокую удельную скорость раатьР/эсРу1^™-

3. По достияешш ялотка&и "критических* разборов (4.5-6-5 х 7.510.5 мки) происходи? снижение удельной скорости биосинтеза. При росте Д*ри11и1апз $ 8 з средах с рН кеблатоприяткшк для синтеза полисахарида изменяется морфология клеток продуцента: они укрупняется, появляются сферуяоподрбныз образования или конгломераты их с поперечными перегородками. Морфологические изменения культуры могут служить контролем качества процесса биосинтеза -экзем/к а на.

4. При использовании дезинтеграта и лизата клеток Д.ри11о1ап£№ 8 з качестве биокатализаторов и глюкозы в качестве субстрата не наблюдается синтеза экзополисахарида.

» •

5. Добавление аубазидана в среду Чапека-Докса оказывает стимулирующий эффект на развитие культуры А.риШйапа 9 8 и синтез еп полисахарида. При исходных концентрациях 0.4-0.5 г/л выход чистого зкзогликана увеличивается на 60-80&.

6. Показано стимулирующее действие органических кислот, образующихся в цикле Кребса, на биосинтез полисахарида культурой А.ри1-1и1апя $ 8. Максимальным стимулирующим эффектом обладает яблочная кислота - при концентрации ее в среде 15-20 ммоль/л выход полисахарида возрастает на 50-9056.

7. Установлено, что ионы аммония не являются ингибиторами синтеза полисахарида. При концентрации сульфата аммония в среде Харада 5-30 мг/л выхец полисахарида составил 1-1.5 г/л. При более вы-

coskx кояцедарйрш: сульфата симония в сред® происходи? быстрое скжение рН и, sea следствие, антябирувтся бкосангез экзо-гликака.

Работы, опубликованные по тсыз диссертации:

1. Русских Т.Л. Влияние рН среда на накопляйте бкоиесаг я синтез экзополисахарида некоторыми шташши ¿.иге сЪ asidlas pullu-isas .// Тез. дока. конр. шлодзк ученых "Творчество нададз&а -научно-техническому прогрессу". -Ленинград. -1988. -С ЛI.

2. Еликоз Н.П., Кравченко С.Б., Русских Т.Л. Возможности пролонгации глвкан-синтетазной активности Aureobasidiua pullulaaas

с учетам фазового состояния культуры.// Тез. докл. копр. "Био-конззрсия-68. Теоретические основы гликробной конверсии".-Рига-Юрмала .-1988.-С.45.

3. Кравченко С.Б., Русских Т.Д. Некоторые особенности биосинтеза /-1,3-глшсана культурой Aureobasidiua pallulaas .// Тез. докл. конф. "Проблемы и перспективы биотехнологии".-Братислава, ЧССР.-1989.-С.82.

4; Клипов Н.П., Артюхов В.Г., Русских Т.Л. Возможности использования микробных полисахаридов в качестве пищевых добавок.//Тез. докл. ксиф. "Химия пищевых добазок".-Черновцы.-1989.-С.71.

5. Блинов Н.П., Кравченко С.Б., Русских Т.Д. Дрожжевые организмы -продуценты гликанов,// У11 съезд Укр. микробиол. о-ва. Тез. докл.-Черновцы.-19®« - : ЛЮ.

Зяк.3200, тир.9> I2.II.90r п