Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микромицеты рода Aureobasidium Uiala Boyer

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Юрлова, Надежда Александровна, Санкт-Петербург

У / ... • . . л 1

г 7 - ' - ./ /¿У

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

на правах рукописи

ЮРЛОВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

удк 582.288.43: 579.22: 579.6

МИКРОМИЦЕТЫ РОДА AUREOBASIDIUM VIALA & BOYER: ТАКСОНОМИЯ, ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ

Специальность: 03.00.07 Микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1997

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение........................................................................................5

Обзор литературы..........................................................................15

1. История изучения рода АигеоЬа81с1шт. Таксономия рода.... 15

1.1. История рода АигеоЬа81сНит......................................................15

1.2. Экологические особенности, распространение..........................25

1.3. Таксономия рода..........................................................................27

2. Черные дрожжевые грибы — потенциальные патогенные микроорганизмы для людей и позвоночных животных............37

2.1. Характеристика черных дрожжевых грибов..............................37

2.2. Микозы, вызванные ЧДГ............................................................42

2.2.1. Микозы, вызванные АигеоЬа81с1шт риПикш............................50

3. Биотехнологические аспекты изучения грибов рода АигеоЬа81с1шт................................................................................52

3.1. А. риПЫаш — продуцент полисахаридов..................................52

3.1.1. Пуллулан........................................................................................52

3.1.2. Аубазидан......................................................................................55

3.1.3. Другие экзополисахариды, образуемые А. риПШаш................56

3.1.4. Влияние условий культивирования на синтез внеклеточного полисахарида................................................................................58

3.1.4.1. Источники углерода....................................................................59

3.1.4.2. Источники азотного питания......................................................63

3.1.4.3. Влияние рН среды........................................................................66

3.1.4.4. Влияние аэрации..........................................................................69

3.1.4.5. Влияние температуры..................................................................71

3.1.4.6. Влияние витаминов и минеральных солей................................72

3.1.5. Механизм биосинтеза полисахаридов........................................75

3.2. А. риПикпэ — продуцент ферментов................................................80

3.3. А. ри11и1аш — источник белка, витаминов и других биологически активных веществ........................................................................82

3.4. А. риПикш — в решении экологических проблем........................84

Экспериментальная часть....................................................................85

4. Объекты и методы исследования........................................................85

4.1. Объекты исследования........................................................................85

4.2. Культурально-морфологические особенности................................85

4.3. Физиологические особенности..........................................................85

4.4. Образование экзополисахаридов......................................................94

4.5. Получение клеточных стенок............................................................96

4.6. Анализ клеточных стенок..................................................................96

4.7. Получение препаратов геномной ДНК для полимеразной цепной реакции (ПЦР)............................................................................97

4.8. Амплификация фрагмента рДНК в ПЦР..........................................99

4.9. Гель-электрофорез ДНК....................................................................101

4.10. Рестрикционный анализ рДНК (полиморфизм длины рестрикт-ных фрагментов (ПДРФ))..................................................................101

4.11. Компьютерная обработка результатов ПЦР-риботипирования .. 102

4.12. Оптимизация состава питательных сред..........................................102

4.13. Химический состав и структура ЭПС..............................................105

4.14. Гомогенность ЭПС..........................................................................107

4.14.1. Фракционирование 96 % этанолом..................................................107

4.14.2. Фракционирование цетавлоном........................................................107

4.15. Определение молекулярной массы..................................................108

4.16. Удельное вращение............................................................................109

4.17. Вискозиметрические определения........... ..............................109

4.18. Статистическая обработка................................. 109

5. Культурально-морфологические и физиологические особенности микромицетов рода Aureobasidium.................... 110

5.1. Культурально-морфологические особенности................ 110

5.2. Физиологические особенности микромицетов рода Aureobasidium................................................ 138

5.2.1. Потребность в источниках питания и другие тесты............ 139

5.2.2. Биосинтез экзополисахаридов в средах с различными источниками азота.............................................. 153

6. Другие таксономические подходы для изучения Aureobasidium 164

6.1. Химический состав и строение клеточной стенки микромицетов рода Aureobasidium....................................... 164

6.2. Молекулярно-биологические аспекты в таксономии микромицетов рода Aureobasidium................................. 177

6.2.1. Молекулярно-биологические критерии для диагностики

Aureobasidium и родственных анаморф...................... 180

7. Биотехнологические аспекты изучения микромицетов рода Aureobasidium........................................... 198

7.1. Химический состав и аффинитет экзополисахаридов штаммов

A. pullulans, относящихся к разным генотипическим группам ... 199

7.2. Отбор штаммов — продуцентов экзополисахаридов. Оптимизация условий их культивирования........................... 218

7.3. Возможности использования экзополисахаридов, образуемых

штаммами F-370, F-371, 11 в медицинской практике.......... 237

Обсуждение результатов.............. .................... 242

Заключение............................................. 272

Выводы................................................ 277

Литература.............................................. 280

Приложение . .. „ t > « ....... . « . . «. » . * * - * - « ■» «• «■ .33]

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Черные дрожжевые грибы (ЧДГ) — таксономически сборная группа, объединяющая некоторые виды темнопигментированных (за счет накопления меланина в их клеточных стенках) микромицетов с одноклеточной стадией развития в виде дрожжеподобных клеток. Они играют существенную роль в биогеоценозах, биотехнологии, занимают все более видное положение среди патогенных агентов, встречающихся в клинической практике [173, 227, 353, 354, 355, 459а].

Первоначально термин "черные дрожжи" был ассоциирован с Aureobasidium (Pullularia) pullulans (de Вагу) Arnaud, 1910 [214, 215], позднее были идентифицированы другие роды и виды [281,286]. К настоящему времени насчитывается около 40 родов ЧДГ [287].

За рубежом ЧДГ активно исследуют ученые Германии, Голландии, США, Японии, однако проблема биологии и таксономии ЧДГ остается актуальной. В нашей стране этой группе грибов уделено весьма скромное внимание.

Известны базидиомицетные черные дрожжи, которые отнесены к фило-базидиомицетам [288] и аскомицетные, отнесенные к битуникатным ас-комицетам [289]. Одним из представителей ЧДГ аскомицетного типа является род Aureobasidium Viala & Boyer, 1891 (из-за наличия у некоторых би-туникатных аскомицетов порядка Dothideales, семейства Dothideaceae ана-морф, сходных с культуральными стадиями Aureobasidium [289,414,426]). Грибы этого рода — космополиты, широко распространены в природе и были обнаружены в самых разнообразных экологических нишах [234]. Род

АигеоЬаз1с1шт, также как и другие ЧДГ, отмечен как биодеструктор произведений живописи и архитектуры [173, 300, 395], широкого спектра полимерных материалов [83, 234]. В связи с этим весьма важно изыскание эффективных фунгицидных препаратов, что неразрывно связано с биологическими особенностями микроорганизмов-биодеструкторов, в том числе и микромице-тов рода АигеоЬа81с1шт.

А. ри11и1ащ является продуцентом множества разнообразных биологически активных веществ (БАВ), что указывает на ценность данного объекта для биотехнологии. Учеными многих стран было показано, что этот гриб является продуцентом ряда гидролитических ферментов: ксиланазы [232, 337, 338, 339, 340, 491], глюкоамилазы [239, 240, 241, 250], пектиназы [164], ДНК-азы [239], РНК-азы, уреазы [204, 226], фосфотазы [235,239], протеиназ [133, 226, 239], полигалактуроназы [356,366] и др.; а также ферментов из класса трансфераз: фруктозилтрансферазы [23,275,276], глюкозилтрансферазы [277]; из класса оксидоредуктаз: лакказы [404], Ь-фруктозодегидрогеназы [263] и Ь-рамнозодегидрогеназы [399, 400, 464]. Обладая огромным ферментным потенциалом, этот микромицет способен утилизировать нефть и продукты ее переработки, т.е. является перспективным для использования в целях устранения нефтяных загрязнений во внутренних водоемах и в морской воде [146, 227]. Толерантность А. риПикш к солям тяжелых металлов (свинцу, кадмию, ртути, меди, цинку) может быть использована при контроле загрязненности окружающей среды [227]. Из биомассы А. риПикш было выделено 18 новых антибиотиков, названных ауреобазидинами [449, 450]. Последние высоко эффективны в отношении патогенных грибов в том числе и дерматофитов [262]. Биомасса клеток А. риПикш перспективна в качестве источника белка и витаминов [119, 250, 268]. Этот гриб также интересен для пищевой промышленности из-за его способности синтезировать эритрит [305]; в косметике и фар-

миндустрии как продуцент полисахаридов пуллулана [63, 74, 157, 203, 422, 467, 498 и др.] и аубазидана [34, 36, 41, 108, 109].

Микромицеты рода Aureobasidium, как и другие ЧДГ, хорошо адаптируются к различным условиям окружающей среды. Адаптация к экстремальным условиям дает возможность ЧДГ преодолеть иммунную систему человека при попадании в подкожные травмы или при вдыхании, и тогда они способны стать причиной микозов [136а, 258, 354, 361]. Из-за нечеткой выраженности морфологических признаков ЧДГ диагностика заболеваний, этиологическим фактором которых являются эти микромицеты, затруднена. Имеются многочисленные случаи неправильного их определения [357]. Так как перед медицинской микологией стоит задача создания новых нетоксичных противогрибковых препаратов, эффективных в отношении определенных групп микромицетов, в том числе ЧДГ, важно правильно идентифицировать этиологический агент заболевания. В то же время при создании и дизайне новых противогрибковых лекарственных препаратов ученые должны опираться на биологические особенности грибов и механизмы их патогенеза [361]. В связи с этим особое внимание уделяется идентификации трудно-диагносцируемых ЧДГ [294], изучению их биологии [135, 297, 352, 361].

Несмотря на значительный интерес исследователей к представителям рода Aureobasidium, систематическое положение этого рода длительное время оставалось неясным из-за неполноты таксономических исследований на современном уровне. До последнего времени не было четких критериев таксономии рода Aureobasidium, отсутствовали данные о комплексных исследованиях биологических свойств этих микромицетов с использованием большого количества штаммов, в том числе и типовых, методами современной биологии. В этой связи решаемая в диссертации научная проблема изучения биологических, включая культурально-морфологические, физиологические, молекулярно-биологические, особенностей микромицетов рода Aureobasidium,

разработка критериев таксономии и диагностики данного рода и поиска новых продуцентов БАВ, в частности полисахаридов, является весьма актуальной.

Цель работы

Исследование биологических особенностей микромицетов рода АигеоЬаз1с1шт, разработка критериев таксономии и диагностики рода; изыскание новых штаммов - продуцентов экзополисахаридов (ЭПС); изучение условий биосинтеза ЭПС наиболее перспективными штаммами.

Задачи исследования

1. Изучить культурально-морфологические свойства грибов рода АигеоЬаз1с1шт, провести сравнительный анализ соответствующих свойств исследуемых и типовых штаммов и уточнить культурально-морфологические критерии для характеристики этого рода.

2. Изучить физиологические особенности АигеоЬаз1с1шт и родственных грибов, предложить критерии для идентификации этого и близких родов по физиологическим признакам.

3. Разработать молекулярно-биологические критерии для идентификации АигеоЬа81с1шт и близких к нему анаморфных родов.

4. Исследовать строение и химический состав клеточной стенки А. риНикш.

5. Изучить способность штаммов А. риНикш синтезировать экзополи-сахариды при различных условиях культивирования.

6. Изучить условия биосинтеза ЭПС, образуемых наиболее перспективными штаммами-продуцентами.

Научная новизна и теоретическая ценность работы

1. Впервые выполнено комплексное исследование биологических особенностей большой выборки штаммов (53), в том числе типовых штаммов синонимов (5) и неотипового штамма, А. риНикш, а также близкородственных анаморфных грибов Ногтопета 1^егЬещ & МеНп, 1927 (12 штаммов),

Kabatiella Bubak, 1907 (4) и Selenophoma Maire, 1907 (1); на основании этого разработаны критерии таксономии и диагностики Aureobasidium . Проведена ревизия рода Aureobasidium. Виды (13) Kabatiella, ранее переведенные в Aureobasidium [281], рекомендовано возвратить в прежний род. Уточнены морфологические критерии для характеристики рода Aureobasidium (тип ко-нидиогенеза синхронный с последующим развитием перкуррентного).

2. Впервые предложен ключ для идентификации Aureobasidium Viala & Boyer, 1891 и близкородственных анаморфных родов Hormonema Lagerber & Melin, 1927, Kabatiella Bubak, 1907, Selenophoma Maire, 1907 и телео-морфных родов Pringsheimia Schulzer, 1866 и Dothiora Fries, 1849 по физиологическим признакам.

3. Впервые предложены молекулярно-биологические критерии для идентификации и дифференциации анаморфных родов Aureobasidium, Hormonema, Kabatiella и Selenophoma на основании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с рДНК праймерами 5,8S-R и LR7 и последующей рестрикцией продуктов амплификации эндонуклеазами AluI, Hhal, Mspl, Ddel, Rsal.

4. На примере 12 штаммов A.pullulans изучен химический состав полисахаридов клеточных стенок, тип почкования, строение септы и ультраструктура стенок вегетативных клеток. Достоверно указано, что по этим признакам грибы анаморфного рода Aureobasidium относятся к аскомицетному типу.

5. Установлено, что штаммы A. pullulans продуцируют экзополисахари-ды (ЭПС) в жидких средах с различными источниками азота, тогда как штаммы родов Kabatiella и Hormonema либо образуют ЭПС в жидких средах с органическим азотом, либо вообще не образуют ЭПС (род Kabatiella).

6. Впервые показана внутривидовая вариабельность A.pullulans по способности продуцировать максимальное количество экзополисахаридов в жидких средах с разными неорганическими источниками азота (в окисленной или восстановленной формах). Установлено соответствие генотипических групп

штаммов A.pullulans (генотипические группы определены методом полимераз-ной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) в гибридизаци-онном варианте Мокроусовым И.В. [91]) группам штаммов, различающихся по способности продуцировать максимальное количество ЭПС в средах с неорганическими источниками азота в окисленной или восстановленной формах.

7. Показано, что ЭПС, синтезируемые штаммами разных генотипических групп в оптимальных условиях, являются глюканами, последние полидисперсны, в них преобладает одна из фракций либо аубазиданового, либо пуллулано-вого аффинитета. Пуллулановый аффинитет ЭПС соответствует генотипи-ческой группе, объединяющей штаммы, в том числе типовые штаммы синонимов A.pullulans и неотиповой штамм, с максимальной продуктивностью ЭПС в средах с восстановленной формой азота — (NH4)2S04, аубази-дановый — с окисленным азотом (NaN03).

8. Штаммы генотипической группы, в которую не входят типовые штаммы синонимов A.pullulans и неотиповой штамм A.pullulans, но отличающиеся от большинства представителей этого вида по структуре генома и рядом физиологических свойств (по отсутствию ассимиляции а-метил-D-глюкоз ида и лактозы, по оптимальному источнику азота для биосинтеза ЭПС, по аффинитету ЭПС), выделены в новую разновидность Aureobasidium pullulans (de Вагу) Arnaud var. aubasidani Yurlova var. nov.

9. Предложено использовать химический состав и строение ЭПС как один из таксономических подходов для характеристики таксона на уровне вида. Химический состав и строение мажорной цетавлоновой фракции ЭПС, образуемых штаммами A. pullulans в оптимальных условиях, возможно использовать для характеристики таксона рангом ниже вида — разновидности.

10. Выделены из природных экосистем, идентифицированы и изучены 3 новых штамма A. pullulans var. pullulans (F-370, F-371, 11) — продуцента эк-зополисахаридов пуллуланового аффинитета, по своей продуктивности пре-

вышающие известные продуценты; изучены условия биосинтеза экзоглюканов штаммами А. риПикпБ уаг. риПикпБ Р-370, Р-371, 11, предложены оптимальные питательные среды и условия выращивания с целью максимальной продукции ЭПС.

Практическая ценность

1. Результаты работы могут быть использованы в таксономии ЧДГ, для выявления филогенетических связей как внутри этой сборной группы мик-ромицетов, так и с телеоморфными родами, имеющими сходные конидиальные стадии.

2. Разработанные критерии таксономии рода АигеоЬаз1с1шт могут быть использованы в практической работе по клинической диагностике заболеваний, вызванных ЧДГ.

3. Стратегия и тактика, используемые в решении поставленных задач, могут быть применимы в современной таксономии грибов, в экологии для изучения биоразнообразия грибов, а также в диагностике микотических заболеваний.

4. Полученные результаты возможно использовать в биотехнологии для регулируемого процесса биосинтеза экзополисахаридов определенного химического состава и строения (пуллулановой или аубазидановой структуры).

5. Штаммы А. риПикш уаг. риПикш (Р-370, Р-371, 11) - пр