Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение протопластов дрожжеподобного гриба Aureobasidium Pullulans и изучение генетических последствий их слияния

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мироненко, Нина Васильевна

Введение

Глава I. Обзор литературы. Новые методы генетики несовершенных грибов

1*1. Введение

1.2. Несовершенные грибы как объекты генетических исследований

1.3. Биологические особенности и практическое значение несовершенного гриба Aureobasidium pullulans (de Вагу) Araaud

1.3.1. Жизненный цикл гриба A.pulluians.

1.3.2. Экологические ниши гриба и механизмы устойчивости к экстремальным факторам среды

1.3.2.1. A.pulluians - фитопатоген

1.3.2.2. A.pulluians - разрушитель полимеров.

1.3.2.3. Радиоустойчивосгть гриба.;.

1.3.2.4. Устойчивость гриба к ионам тяжелых металлов

1.3.3. A.pulluians , как модель для изучения дрожже-вого-мицелиального диморфизма у грибов.

1.3.4. A.pulluians - продуцент полисахаридов .■

1.3.5. Генетико-физиолошческие исследования гриба.

1.4. Протопласты грибов в генетических экспериментах

1.4.1. Условия получения и регенерации протопластов грибов

1.4.2. Слияние протопластов грибов

1.4.3. Внутривидовая гибридизация грибов методом слияния протопластов

1.4.4. Межвидовая гибридизация грибов путем слияния протопластов

1.4.5. Межродовые слияния протопластов грибов

1.4.6. Возможные механизмы стабилизации продуктов слияния протопластов путем генетической рекомбинации.

1.4.7. Протопласты в опытах по трансформации грибов. 54 1.5. Заключение

Глава П. Материалы и методы.

2.1. Штаммы гриба и мутанты, использованные в работе.

2.2. Условия культив1фования.

2.3. Выделение мутантов

2.3.1. УФ-мутагенез и отбор ауксотрофных мутантов.

2.3.2. Химический мутагенез

А. Обработка нитрозометилмочевиной (БММ).

Б. Обработка гидроксиламинопурином (ГАП).

2.4. Получение протопластов и условия их регенерации.

2.5. Метод слияния протопластов

2.6. Генетический анализ первичных и вторичных ПСП.

2.6.1. Анализ митотической стабильности ПСП.

2.6.2. Анализ индуцированной митотической сегрегации

2.6.2.1. Индуцирование УФ-излучением

2.6.2.2. Индуцирование хлорал-гидратом.

2.6.2.3. Индуцирование беномилсм

2.7. Метод окраски ядер в клетках гриба

2.8. Определение количества ДБК в клетках граба методом проточной цитофлуориметрии.

4 Стр.

2.9. Статистическая обработка результатов

Глава Ш. Характеристика исходных штаммов

3.1. Морфолого-культуральные признаки.

3.2. Устойчивость гриба к ионам Со2+ и Си2+

3.3. Устойчивость штаммов гриба к индукторам гашюиди-зации.

3.4. Устойчивость клеток гриба к УФ-излучению.

3.4.1. Летальное действие УФ-излучения

3.4.2. Мутагенное действие УФ-излучения.

Глава 1У. Протопласты A.puilulans и их слияние

4.1. Получение протопластов и их регенерация.

4.2. Внутри- и мешптаммовые слияния протопластов.

4.3. Слияние протопластов и тест на комплементацию

Глава У. Генетический анализ цродуктов слияния протопластов A.puilulans

5.1. Генетический анализ первичных ПСП.

5.2. Генетический анализ вторичных ПСП.

5.2.1. Генетический анализ нестабильных ПСП.

5.2.2. Генетический анализ стабильных ПСП.

5.2.2.1. Характеристика митотической стабильности ПСП.

5.2.2.2. Индуцированная УФ-лучами нестабильность ПСП.

5.3. Митотическая неста<Зальность,индуцированная хлоралгидратом .ПО

5.4. Митотическая нестабильность, индуцированная бено-милом .III

5.5. Сравнение количества ДНК на клетку в ПСП и родительских штаммах

Глава У1. Обсуждение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение протопластов дрожжеподобного гриба Aureobasidium Pullulans и изучение генетических последствий их слияния"

Актуальность проблемы. Первый этап развития генетики грибов характеризовался изучением объ-ектов, имеющих половой процесс, таких как нейроспора и дрокжи-сахаромицеты, причем единственным методом генетического анализа был анализ продуктов мей-оза. Однако после открытия парасексуального процесса положение изменилось. Было показано, что анализ вегетативного расщепления может быть дополнительным, а иногда и единственным методом генетического исследования ряда объектов, в частности из класса Несовершенных грибов.

Разработанные в последние годы новые методические подходы в генетике микроорганизмов - метод слияния протопластов и метод трансформации плазмцдной ДНК - открыли широкие перспективы в генетическом изучении грибов, как имеющих половой процесс, так и несовершенных. Особенно важным представляется использование этих методов для изучения практически полезных видов грибов и грибов-патогенов, которые не имеют ни полового, ни парасексуального про' цессов. Примеры успешного применения этих методов известны, глав' НЫМ образом,ДЛЯ грибов рода Candida.

В связи со сказанным, определенный теоретический и практический интерес представляет применение одного из вышеупомянутых методов - метода слияния протопластов - в исследовании новых объектов, ранее не изученных и бывших недоступными для генетического анализа. В качестве такого объекта нами был взят несовершенный гриб Aureobasidium pullulans - фИТОПЭТОГвН, биодеструктор, микроорганизм, перспективный для использования в микробиологической промышленности как продуцент полисахаридов, а также имеющий ряд интересных биологических особенностей.

Цель и задачи исследования. Целью работы было получение внутри- и межштаммовых гибридов гриба Aureobasidium puiiuians методом слияния протопластов и их генетический анализ.

Конкретные задачи включали 'в себя:

1) получение коллекции ауксотрофных мутантов гриба;

2) разработку метода протопластирования клеток гриба в дрожжевой фазе и условий регенерации протопластов;

3) разработку метода слияния протопластов;

4) определение частот внутри- и межштаммовых слияний протопластов;

5) доказательство шбрвдной природа полученных продуктов слияния протопластов (ПСП);

6) изучение стабильности ПСП.

Научная новизна и практическая ценность. С помощью ферментов пищеварительного сока улитки со 100% эффективностью получены протопласты гриба Aureobasidium puiiuians . Использование метода слияния протопластов позволило впервые получить гибриды этого гриба и изучить их спонтанную и индуцированную митотическую стабильность. Показано, что в качестве эффективных индукторов мито-тической рекомбинации можно использовать УФ-лучи и малоизвестный в генетике микроорганизмов индуктор гаплоидазации - хлорал-гидрат. Анализ митотического расщепления продуктов слияния протопластов позволил показать отсутствие сцепления по крайней мере для 6 из 7 изученных маркеров.

Обнаружен уникальный для этого гриба феномен митотической сегрегации, проявляющийся в образовании колоний, состоящих из двух типов ауксотрофных клеток, несущих в различных сочетаниях родительские маркеры.

В ходе исследования отмечена особенность парасексуального процесса A.puiiuians , воспроизведенного методом слияния протопластов - отсутствие заметной гаплоидизации. Однако, парасек-суальный процесс этого гриба, хотя и неполный, дает реальную возможность генетического изучения его практически важных признаков, также митотические рекомбинанты можно использовать в селекции продуцентов полисахаридов.

Изучена возможность образования межштаммовых гибридов и впервые выявлена генетическая дифференциация штаммов A.puiiuians различного происхождения. Таким образом, показано, что метод слияния протопластов может быть использован также для выявления групп генетической несовместимости, включеемых в вид A.puiiuians.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции «Мицелиальные грибы" (Путцино, 1983), семинарах Ленинградского института ядерной физики АН СССР (Лаборатория молекулярной и радиационной биофизики) и Ленинградского государственного университета (кафедра генетики и селекции).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; главы, в которой рассматриваются литературные данные по теме исследования; главы, посвященной описанию основных материалов и методов; трех глав, содержащих экспериментальные данные; главы, посвященной обсуждению экспериментальных результатов;выводов,

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мироненко, Нина Васильевна

- 134 -ВЫВОДЫ

1. Протопласты гриба Aureobasidium pullulans могут быть получены при действии пищеварительного сока улитки на клетки в дрожжевой фазе, вщэащенные в аэробных условиях. Эффективность протопластирования в подобранных условиях опыта достигает 100$. Протопласты способны регенерировать на поверхности среды с осмотическим стабилизатором.

2. Гибридные клетки у несовершенного гриба A.puiiuians могут быть получены методом слияния протопластов при использовании ПЭГа в качестве вызывающего слияние агента в растворе осмотического стабилизатора.

3. Продукты слияния протопластов имеют гибридную природу, что доказано генетическими и цитологическими методами.

• 4. УФ-лучи и хлорал-гидрат являются эффективными индукторами митотической рекомбинации у гибридов данного гриба. Так, до 43$ секторов, индуцированных хлорал-шдратом, содержат ауксотрофные клетки.

5. Маркеры ade2, lysXl, arg2, leul, hiszi не сцеплены; для маркеров ade2 и met3 на основании анализа мозаичных сег-регантов (МС) предполагается сцепление.

6. -Продукты слияния протопластов A.puiiuians проявляют феномен митотической сегрегации, неизвестный для других грибов, выражающийся в образовании колоний, состоящих из двух типов ауксотрофных клеток с комплементарными пищевыми потребностями в разнообразных сочетаниях родительских маркеров.

7. Штаммы, выделенные из больных растений льна и с полимерных материалов относятся к различным группам генетической совместимости, о чем свидетельствует невозможность слияния протопластов штаммов разного происхождения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мироненко, Нина Васильевна, Ленинград

1. Акименко В.К., Меденцев А.Г., Дмитриев В.В. Получение протопластов дрожжей Candida lipolytica Микробиология, 1975,т. 44, вып.1, с. 122-126.

2. Бабьева И.П. Систематика дрожжевых грибов.- В кн.: Эволюция и систематика грибов.- Л.:Наука, 1984, с.65-79.

3. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей Aureobasidium М., 1979, с.65-66.

4. Возняковская Ю.М. Эпифитные дрожжевые организмы.- Микробиология, 1962, т.31, вып.4, с.616-622.

5. Егорова В.Н., Инге-Вечтомов С.Г. Онтогенетическая и мутационная изменчивость Puliularia sp. .- Генетика, 1968, т. 4,1. J6 II, с. 136-143.

6. Елинов Н.П., Аркадьева Г.Е., Витовская Г.А., Громова Э.Г. Биологические свойства и химическая структура растворимого глюка на из Aureobasidium puiiulans Тр. Ленинград, хим.-фарм. инта, 1967, вып.22, с.57-65.

7. Елинов Н.П. Перспективы развития технической микологии в СССР.- В кн.: Эволюция и систематика грибов.- Л.:Наука, 1984, с. 157-170.

8. Елинов Н.П., Пронина М.И., Шаронова Н.Б., Гурина С.В. Изменчивость Aureobasidium pullulans(D By.) Arnaud ,вызванная действием УФ-лучей и митомицина С.- Микол. и фитопатол., 1982, т. 16, вып.5, с. 407-413.

9. Еданова-Н.Н., Василевская А.И. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте.- Киев:Наукова думка, 1982.-168с

10. Еизнь растений/Под ред. Горленко М.В. -М., 1976, т.2, с.370.

11. Жемчужина Н.С., Соболева А.Б. Характеристика факторов, влияющих на выход и степень регенерации протопластов Septoria nodorum и Pyricularia oryzae .- Биол. науки, 1984, IS 3, с. 102108.

12. Заикина A.M., Лакотышкина А.И. Получение протопластов дрожжей рода Candida .- Мшфобиология, 1970, т.39, вып. 6, с. 1082-1086.

13. Захаров И.А., Мироненко Н.В. Гетерокариоз и проблемы структуры популяций грибов.- Микол. и фитопатол., 1983, т.17, вып.5, с. 414-424.

14. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов.- Л.:Наука, 1984.- 143 с.

15. Имшенецкий А.А., Кондратьева Т.Ф. Экспериментальное получение полиплоидных форм у puliularia pullulans*- Докл. АН СССР, 1978, т. 239, с. 1235-1237.

16. Имшенецкий А.А., Кондратьева Т.Ф. 0 более активном синтезе полисахарида пуллулана полиплоидными культурами Puliularia pullulans .- Микробиология, 1979, т.48, вып.2, с.319-322.

17. Имшенецкий А.А., Кондратьева Т.Ф. Устойчивость штаммов Puliularia pullulans разного уровня плоидности к действию ультрафиолетовых лучей.- Микробиология, 1982, т.51, вып.4, с.570-575.

18. Имшенецкий А.А., Кондратьева Т.Ф., Смутько А.Н. Влияние источников углерода и азота на биосинтез пуллулана полиплоидными штаммами Puliularia pullulans Микробиология, 1981, т.50, вып.1, с.102-105.

19. Имшенецкий А.А., Кондратьева Т.Ф., Смутько А.Н. Влияниекислотности среды, условий аэрации и температуры на биосинтез пуллулана полиплоидными штаммами P.(Aureobasidium) puiiuians.-Микробиология, 1981а, т.50, вып. 3, с.471-474.

20. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика пола у грибов.- В кн.: Генетические основы устойчивости растений к болезням.- Л.:Колос, 1977, с.31-44.

21. Каневская И.Г., Лебедева Е.В. Биологическое повреждение каучуков, резин и изделий из них.- Школ, и фитопатол., 1980, т. 14, вып.3, с. 242-246.

22. Ковальцова С.В., Левитин М.М. Биохимические мутанты фи-топатогенного гриба Kabatiella(Polyspora) lini .- Генетика, 1968, т. 4, № 5, с. 148-150.

23. Ковальцова С.В., Левитин М.М., Захаров И.А. Устойчивость гриба Pullularia pullulans(de Bary)Berkh к летальному и мутагенному действию ультрафиолетовых и рентгеновых лучей.- Цитология, 1970, т. 12, JS 2, с. 233-237.

24. Кожина Т.Н. Использование протопластов дрожжей в генетической инженерии.- Успехи современ. биол., 1981, т.91, вып.З,с.366-379.- 138

25. Кожина Т.Н., Чепурная О.В. Слияние протопластов как метод получения гибридов у дрожжей-сахаромицетов.- Генетика, 1980,т. 16, Jb 2, с.360-363.

26. Кожина Т.Н., Мироненко Н.В., Чепурная О.В. Получение и регенерация протопластов у дрожжеподобных грибов.- Микол. и фи-топатол., 1983, т. 17, вып.З, с.248-251.

27. Корогодин В.И., Близник К.М. Закономерности формирования радиорас у дрожжевых организмов. Сообщ. I. Радиорасы диплоидных дрожжей Saccharomyces ellipsoideus (vini) Радиобиология, 1972, т. 12, вып. 2, с. 163-179.

28. Коссиор Л.А., Блинов Н.П., Пронина М.И. Мутагенное действие Н" -нитрозо-N -метилбиурета на Aureobasidium pullulans (d By. ) Arnaud Школ, и фитопатол., 1983, т.17, вып. 5, с.388-391.

29. Котляровский Д.И., .Джавахия В.Г. Получение, регенерация и слияние протопластов энтомопатогенного гриба Verticiiiium lecanii ( Zimm.) Viegas .- Школ, и фитопатол., 1984, т. 18, вып. 4, с. 271-274.

30. Ланда С.Б. Применение цитофлуорометрии для оцределения количества ДНК в клетках дрожжей.- Микробиология, 1979, т.5, вып.5, с.939-942.

31. Лащенков П.И., Липницкий А.В., Саямов С.Г., Ступенко Л.Н., Шелохович Л.И., Курилов В.Я. Получение сферопластов из клеток дрожжевой фазы диморфного гриба Histoplasma capsuiatum.- Микол. и фитопатол., 1980, т. 14, вып.4, с.337-340.

32. Левитин М.М. Естественная и индуцированная изменчивость возбудителя полиспороза льна.- Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Л., 1968.

33. Левитин М.М., Захаров И.А. Летальный и мутагенный эффект ультрафиолетовых лучей на возбудителя полиспороза льна.- Генетика, 1967, & 9, с.65-70.

34. Левитин М.М., Коновалова Г.С., Лебский В.К. Получение, регенерация и слияние протопластов Drechsiera teres ito.- Микол. и фитопатол., 1984, т. 18, вып. 4, с.276-280.

35. Лобанок А.Г. Характеристика полисахарида из Puiiularia puiiuians .- Известия АН БССР. Серия биол. наук, 1965, № 4, с. II8-I20.

36. Лугаускас АЛО. Методы, используемые для выделения и идентификации микромицетов-биодеструкторов.- В кн.: Методы выделения и идентификации почвенных микромицетов-биодеструкторов. Вильнюс, 1982, с. 5-13.

37. Лугаускас А.Ю. Мшфомицеты окультуренных почв Литовской ССР и их способность адаптироваться к разным субстратам. -Автореф. докт. дис. Киев, 1984.- 38 с.

38. Лугаускас А.Ю., Паутените Л.П. Микромицеты на полимерных материалах разной химической природы.- Школ, и фитопатол., 1983, т.17, вып.6, с.468-476.

39. Малиновский О.В., Соловьев В.А., Белостоцкая Г.Б., Валеев А.К., Вершилова Е.Ю., Гильяно Н.Я., Степанов С.И., Третьяков А.Н., Харламов А.Д. Лазерный проточный цитофлуориметр-сорти-ровщик "ЛАСКАН".- Л.гЛИЯФ, 1982.- 22 с.

40. Мироненко Н.В. Слияние протопластов гриба Aureobasidium pullulans D By.) Arnaud Микол. и фитопатол., 1984, т. 18,вып.1, с. 14-16.

41. Морозова Е.С., Бакалов T.JI. Получение, регенерация и слияние протопластов Trichodeima reesei Генетика, 1984, т. 20,8, с. 1387-1391.

42. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Наумова Т.Н., Гудкова Н.К. Генетические основы классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Изучение выживаемости аскоспор гибридов,- Ж. общ.биол., 1983, т.54, й 5, с.648-660.

43. Орлова Е.И. Утилизация полимерных материалов грибами.- Микол. и фитопатол., 1980, т.14, вып.5, с. 422-425.

44. Пронина М.И., Елинов Н.П., Дранишников А.Н. Изменчивость A.puliulans (De Вагу) Arnaud ,индуцированная ВТ -нитроз оме тилмочевиной.- Микробиология, 1980, т.49, № I, с.93-97.

45. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки.- М.:Мир, 1979.- 415 с.

46. Савченко Г.В., Виханский Ю.Д., Капульцевич Ю.Г. Использование метода слияния протопластов в селекции метанолусваивающих дрожжей Hansenula polymorpha .- Генетика, 1981, т.17, № 8, с.1520-1523.

47. Сибирный А.А., Шавловский Г.М., Кенановская Б.В., Куцяба В.И. Внутривидовая и межвидовая гибридизация дрожжей путем слияния протопластов.- Молек. биол., 1982, вып.32, с.16-24.

48. Сидорова И.И., Тарасов К.Л. Современные представления о филогении и систематике грибов.- В кн.: Итоги науки и техники. Сер. Ботаника, 1980, т.4, с.3-48.

49. Синкус А.Г. Асинхронная эддоредупликация хромосом как возможный источник анеуплоидии и псеццодиплоидии.- Генетика, 1969, т.5, № 8, с. 144-150.

50. Толсторуков И.И., Близник К.М., Корогодин В.И. Митотичес-кая нестабильность диплоидных клеток дрожжей Pichia pinus. Сообщение I. Спонтанное расщепление.- Генетика, 1979, т.15, №12, с. 2140-2148.- 141

51. Троицкий Н.А., Яковенко К.Н., Козлова Л.С. Получение и регенерация протопластов Sclerotinia sclerotlorum (Lib.) d By.- Микол. и фитопатол., 1978, т. 12, вып.6, с. 475-479.

52. Феофилова Е.П. Значение состава клеточной стенки для систематики и филогении микроскопических грибов.- Микол. и фитопатол., 1982, т. 16, вып. 2, с. 166-174.

53. Чепурная О.В., Кожина Т.В., Захаров И.А. Гибридизация дрожжей-дебариомицетов методом слияния протопластов.- Генетика, 1981, т. 17, № 4, с. 618-621.

54. Юрченко Л.В. Изучение локализации плазмид эписомного типа в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae при использовании теста с гетерокарионом,- Генетика, 1984, т. 20, № 3, с. 389-397.

55. Яковлев А.Г., Джавахия В.Г. Выделение и регенерация мице-лиальных протопластов Pyricuiaria oryzae Cav. Школ, и фитопатол., 1981, т. 15, вып.6, с. 472-477.

56. Aguirre M.J.R., Garcia-Acha I., Villanueva J.R. Formation of protoplasts of Fusarium culmorum by strepzyme. Antonie van Leeuvenhoek, 1964, v.50, p.33-44,

57. Ahkong Q.F., Howell J.I., Lucy J.A., Safwat F., Davey M.Z. Cocking E.C. Fusion of hen erythrocytes with yeast protoplasts induced by polyethylene glycol. Nature, 1975» v.225, p.66-67.

58. Akamatsu, Z., Kamada Т., Takemaru T. Release and regeneration of protoplast from the oidia of Coprinus cinereus. -Trans.Mycol.Soc.Japan., 1983, v.24, p.173-184.

59. Allmark Б.М., Morgan A.J., Whittaker P.A. The use of protoplast fusion in demonstrating chromosomal and mitochondrial inheritance of respiratory-deficiency in Kluyveromyces lactis, a petite-negative yeast. Mol.Gen.Genet., 1978, v.159, p.297-299.- 142

60. Anne J., Peberdy J.F. Conditions for induced fusion of fungal protoplasts in polyethylene glycol solutions. Arch. Microbiol., 1975, v.105, p.201.

61. Anne J., Peberdy J.F. Induced fusion of fungal protoplasts following treatment with polyethylene glycol. J.Gen.Microbiol., 1976, v.92, p.415-417.

62. Arima К., Takano I. Multiple fusion of protoplasts in Saccharomyces yeasts. Mol.Gen.Genet., 1979, v.5, p.271-277.

63. Banks G.E. Chromosomal ША.sequences from Ustilago maydis promote autonomous replication of plasmids in Saccharomyces cerevisiae. Current Genet., 1985, v,7, p.79-84.

64. Banks G.E. Transformation of Ustilago maydis by a plasmid containing yeast 2-micron DM. Current Genet., 1985a,v.7, p.75-77.

65. Bartnicki-Garcia S. Cell wall chemistry, morphogenesis and taxonomy of fungi. Ann.Eev.Microbiol., 1968, v.22,p.841-858.

66. Bartnicki-Garcia S., Lippman E. Liberation of protoplasts from the mycelium of Phytophthora. J.Gen.Microbiol., 1966, v.42, p.411-416.

67. Bastide J.M., Hadibi E.H., Bastide M. Taxonomic significance of yeast sphaeroplast release after enzymic treatment of intact cells.' J.Gen.Microbiol., 1979, v.115, p.147-155.- 143

68. Belcour L. Cytoplasmic mutations isolated from protoplasts of Podospora anserina. Genet.Res., Camb., 1975» v.25»p.155-161.

69. Benitez Т., Castillo L., Aguilera A., Conde J. Instability of Saccharomyces cerevisiae heterokaryons. Current Genet., 1984, v.8, p.545-352.

70. Benitez Т., Ramos S., Garcia-Acha I. Protoplasts of Trichoderma viride. Formation and regeneration. Arch.Microbiol. 1975, v.103, p.199-205.

71. Bennet F.I. On Dematium puiiuians De B. and its ascigerous stage. Ann.Appl.Mycol., 1928, v.15, p.5

72. Bonnett H.T., Eriksson T. Transfer of algal chloroplasts into protoplasts of higher plants. -.Planta, 1974, v.120,p.71-79.

73. Bos C.J., Slakhorst S.M. Isolation of protoplasts from Aspergillus nidulans conidiospores. Can.J.Microbiol., 1981, v.27, p.400-407- 144

74. Bottcher F., Becher D., Elinner U., Samsonova I.A., Schilova B. Genetic structure of yeast hybrids constructed by protoplast fusion. In: Advances in protoplast research. -Oxford: Pergamon Press, 1980, p.99-104.

75. Bouveng H.O., Kiessling H., Lindberg В., McKay J. Polysaccharides elaborated by Pullularia pullulans. Acta Chem. Scand., 1962, v.3, p.615-622.

76. Bradshaw R.E., Kang-up Lee, Peberdy J.P. Aspects of genetic interaction in hybrids of Aspergillus nidulans and Aspergillus rugulosus obtained by protoplast fusion. J.Gen.Microbiol., 1983 v.129, p.3525-3533.

77. Bradshaw R.E., Bennett J.W., Peberdy J.F. Parasexual analysis of Aspergillus parasiticus. J. Gen.Microbiol., 1983a, v.129, p.2117-2123.

78. Buck K.W., Chen A.W., Dickerson A.G., Chain E.B. Formation and structure of extracellular glucans produced by Clavi-ceps species. J.Gen.Microbiol., 1968, v.51» p.337-352.87* Burnett J.H. Speciation in fungi. Trans.Brit.Mycol.Soc., 1983, v.81, p.1-14.

79. Butt Г.М., Beckett A., Wilding N. Protoplasts in the in vivo life cycle of Erynia neoaphidis. J.Gen.Microbiol., 1981, v.127, p.417-421.

80. Cabib E. Molecular aspects of yeast morphogenesis.-Ann.Bev.Microbiol., 1975, v.29,p.191-214.

81. Cameron J.R., Loh E.Y., Davis R.W. Evidence for transposition of dispersed repetitive ША families in yeast. Cell,1979, v.16, p.739-752.

82. Case M.E., Schweizer M., Kushner S.R., Giles N.H. Efficien- 145 transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrids plas-mid ША. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979,v.76, p.5259-5263.

83. Conde J., Fink G.A. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1976,v.37, p.3651-3655.

84. Constabel F., Kao E.N. Agglutination and fusion of protoplasts by polyethylene glycol. Canad.J.Botany, 1974, v.52, p.1603-1606.

85. Cooke W.M.B. The natural occurence of Aureobasidium. -Recent advances in botany, 1959» v.1, p.330-354.

86. Crandall M. UV-induced mitotic co-segregation of genetic markers in Candida albicans: evidence for linkage. Current Genet., 1983, v.7, p.167-173.

87. Dales E.B.G., Moorhouse J., Croft J.H. The location and analysis of two heterokaryon incompatibility ( het )• loci in- 146 strains of Aspergillus nidulans. J.Gen.Microbiol., 1983» v.129, p.3637-^642.

88. Delgado J.M., Herrera L.S. Protoplast fusion in the yeast Candida utilis. Acta Microbiol., Acad. Sci. Hung., 1981, v.28, p. 339-345•

89. Dlugonski J., Sedlaczek L., Jaworski A. Protoplast release from fungi capable of steroid transformation. Can.J.Microbiol., 1984, v.30, p.57-62.

90. Dooijewaard-Kloosterziel A.M.P., Sietsma J.H., V/outers J. Formation and regeneration of Geotrichum candidum protoplasts. -J.Gen.Microbiol., 1973, v.74, p.205-209.

91. Emerson S., Emerson M.R. Production, reproduction and reversion of protoplast-like structures in the osmotic strain of Neurospora crassa. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1958, v.44,p.668-671.

92. Esposito M.S., Wagstaff J.E. Mechanisms of mitotic recombination. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces life cycle and inheritance. - Cold Spring Harbor, N.I., Cold Spring Harbor Lab., 1984, p.341-370.

93. Federici F. Extracellular enzymatic activities in Aureobasidium pullulans. Mycologia, 1982, v.74, p.738-743.

94. Ferenczy L., Kevei F., Szegedi M. High frequency fusion of fungal protoplasts. Expedientia, 1975, v.31, p.1028-1030.

95. Ferenczy L., Kevei F., Zsolt J. Fusion of fungal protoplasts. Nature, 1974, v.248, p.793-794.

96. Ferenczy.L., Maraz A. Transfer of mitochondria by protoplast fusion in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 1977, v.268, p.524-525.

97. Ferenczy L., Szegedi M., Kevei F. Interspecific protoplast fusion and complementation in Aspergilli. Experientia, 1977, v.33, p.184-186.

98. Finkelman M.A.J., Vardanis A. Pullulan elaboration by Aureobasidium pullulans protoplasts. Appl.Environ.Microbio1., 1982, v.44, p.121-127.- 148

99. Finkelman M.A.J., Zajic J.E., Vardanis A. New method of producing protoplasts of Aureobasidium pullulans. Appl. Environ.Microbiol., 1980, v.59, p.925-925.

100. Founder P., Provost A., Bourguignon C., Heslot H. Recombination after protoplast fusion in the yeast Candida tropicalis. Arch.Microbiol., 1977, v.115, P« 14.5-149.

101. Fournier P., Gaillardin C., Lovencourt L., Heslot H., Lang B.F., Kaudewitz F. г-ША plasmid from Schizosaccharomyces pombe: cloning and use in yeast transformation. Current Genet. 1982, v.6, p.51-58.

102. Gabriel M. Formation and regeneration of protoplasts in the mold Rhizopus nigricans. Folia microbiologica, 1968, v.15, p.251-254.

103. Gadd G.M. Mechanisms implicated in the ecological success of polymorphic fungi in metal-polluted habitats. Environ. Technology Letters, 1981, v.2, p.551-556.

104. Gadd G.M. Effect of copper pn Aureobasidium pullulans in solid medium: adaptation not necessary for tolerant behaviour. Trans.Brit.Mycol.Soc.,1984, v.5,p.546-549.

105. Gadd G.M., Griffits A.G. Influence of pH on toxicity and uptake of copper in Aureobasidium pullulans. Trans.Brit.Mycol. Soc., 1980, v.75, p.91-96.

106. Galeotti C.L., Sriprakash K.S., BatumC.M., Clard-Walker G.D. An unexpected response of Torulopsis glabrata fusion products to X-irradiation. Mutat.Res., 1981, v.81, p.155-164.

107. Garber R.CV Turgeon B.G., loder P.C. A mitochondrial plasmid from the plant pathogenic fungus Cochliobolus heterostro-phus. Mol.Gen.Genet., 1984, v.196, p.501-510.

108. Genthner F.J., Borgia P.T. Spheroplast fusion and hete-rokaryon formation in Mucor racemosus. J.Bacteriol., 1978, v.134, p.349-352.

109. Gerson D.F., Meadows M.G., Fihkelman M., Walden D.B. The biophysics of protoplast fusion. In: Advances in protoplast research. - Oxford: Pergamon Press, 1980, p.447-456.

110. Ghabrial S.A., Sanderlin R.S., Calvert L.A. Morphology and viruslike particle content of Helminthosporium victoriae colonies regenerated from protoplasts of normal and diseased isolates. Phytopathology, 1979, v.69, p.312-515.

111. Gold M.H., Cheng T.M., Alic M. Formation, fusion and regeneration of protoplasts from wild-type and auxotrophic strains of the white rot basidiomycete Phanerochaete chryso-sporium. Appl.Environ.Microbiol., 1983, v.46, p.260-263.

112. Griffith Y/.L., Compere A.L. Production of a high viscosity glucan by Sclerotium rolfsii ATCC 15206. Dev. Ind.Microbiol., 1978, v.19, p.609-617.

113. Groves D.P., Oliver S.G. Formation of intergeneric hybrids of yeast by protoplast fusion of Yarrowia and Kluyveromyces species. -Current Genet., 1984, v.8, p.49-55.

114. Gumpert J. Electron microscopic analysis of protoplast fusion in Streptomyces hydroscopicus arid consideration on structural alterations in fusing membranes. Arch.Microbiol., 1980, v.126, p.263-269.

115. Hamlyn P.F., Ball C. Recombination studies with Cephalo-sporium acremonium. In: Genetics of industrial microorganisms.-Washington: Amer. Soc. for Microbiol., 1979» p.185-191.

116. Han Y.W., Cheeke P.R., Anderson А.V/., Lecprayoon C. Growth of Aureobasidium puiiuians on straw hydrolysate.- 150

117. Appl. Environ.Microbiol., 1976, v.32, p.799-802.

118. Hashiba Т., Yamada M. Formation and purification of protoplasts from Rhizoctoniae solani. Phytopathology, 1982, v.72, p.849-853.

119. Hashiba Т., Yamada M. Interspecific protoplast fusion between auxotrophic mutants of Rhizoctonia solani. -Phytopathology, 1984, v.74, p. 398-401.

120. Hastie A.G. Benlate induced instability of Aspergillus diploids. - Nature, 1970, v.226, p.771.

121. Haydu Z., Lazar G., Dudits D. Increased frequency of polyethylene glycol induced protoplast fusion by dimethilsulfoxide. • Plant.Sci.Lett., 1979, v.10, p.357.

122. Hedenstrom M.V., Hofer M. Protoplasten der Hefe Rhodoto-rula gracilis. Arch.Microbiol., 1974, v.98, p.51.

123. Heick H.M.C., Stewart H.B. Preparation and properties of protoplasts Lipomyces lipofer. Canad.J.Biochem., 1965,v.45, p.549-559.

124. Hermanidis-Nijhof E.J. Aureobasidium and allied genera.-Studies in Mycology, 1977, v.15, p.141-177.

125. HinnenA., Hicks J.В., Fink G.R. Transformation of yeast. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1978, v.75, p.1929-1933.

126. Holliday R.A. A new method for the identification of biochemical mutants of microorganisms. Nature, 1956, v.178,p.987«

127. Johannsen E. Hybridization studies within the genus Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt. Antonie van Leewenhoek, 1980, v.46, p.177-189.

128. Johannsen E., Halland L., Opperman A. Protoplast fusion within the genus Kluyveromyces van der 7/alt emend, van der Walt.-Canad.J.Microbiol., 1984, v.30, p.540-552.

129. Kakar S.N., Magee P.T. Genetic analysis of Candida albicans: identification of different isoleucine-valin, methianine and arginine alleles by complementation. J.Bacterid., 1982, v.151, p.1247-1252.

130. Kakar S.N., Partridge E.M., Magee P.T. A genetic analysis of Candida albicans: isolation of a wide variety of auxotrophs and demonstration of linkage and complementation. -Genetics, 1983, v.104, p.241-255*

131. Kao K.N., Michayluk M.R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta ( Berl. ), 1974, v.115, p.355-367.

132. Kato Т., Okamoto I., lokuya Т., Takahashi A. Solution properties and chain flexibility pullulan in aqueous solution.-Biopolymers, .1982, v.21, p.1623-1634.

133. Keller U. Highly efficient mutagenesis of Claviceps purpurea by using protoplasts. Appl.Environ.Microbiol., 1983, v.46, p.580-584.

134. Kevei F., Peberdy J.F. Induced segregation in interspecific hybrids of Aspergillus nidulans and Aspergillus rugulosus obtained by protoplast fusion. Mol.Gen.Genet., 1979, v.170, p.213-218.

135. Kevei F., Peberdy J.F. Further studies on protoplast fusioi and interspecific hybridization within the Aspergillus nidulans group. J.Gen. Microbiol., 1984, v.130, p.2229-2236.

136. Kidwell M.G., Kidwell J.F. Hybrid dysgenesis in Drosophi-la melanogaster: a syndrome of abberant' traits including imitation, sterility and male recombination. Genetics, 1977,v.86, p.813-833.

137. Kingsman A.J., Clarke L., Mortimer E.E., Carbon J. Replication in Saccharomyces cerevisiae of plasmid pBR313 carrying DNA from the yeast trp1 region. Gene, 1979, v.7, p.141-152

138. Klinner U., Bottcher F., Samsonova T.A. Hybridization of Pichia guilliermondii by protoplast fusion. In: Advancesin protoplast research. Oxford: Pergamon Press, 1980, p.113-11;

139. Knutton S., Pasternak C.A. The mechanism of cell-cell fusion. -Trends Biochem. Sci., 1979, v.4, p.220-223.

140. Kohli J., Hottinger H., Munz P., Strauss A., Thuriaux P. Genetic mapping in Schizosaccharomyces pombe by mitotic and meiotic analysis and induced haploidization. Genetics, 1977, v.87, p.471-489.

141. Koltin Y. Genetic recognition phenomena in fungi-fungal incompatibility. Revista de biologia, 1983, v. 1-2, p.197-216.

142. Kristiansen В., Charley R.C., Seviour В., Harvey L., Habeeb S., Smith J.E. Over-production of metabolites by filamentous fungi. In: Over-production of microbial products.- 153 1.ndon: Academ. Press, 1982, p.195-210.

143. Kunz B.A., Haynes R.H. Phenomenology and genetic control of mitotic recombination in yeast. Ann.Rev.Genet., 1981, v.15, p.57-89.

144. Labarere J., Bernet J. Protoplasmic incompatibility in Podospora anserina: A posisible role for its associated proteolytic activity. Genetics, 1979, v.93» p.525-537.

145. Lambowitz A.M., Kobayashi G.S., Painter A., Medoff G. Possible relationship of morphogenesis in pathogenic fungus, Histoplasma capsulatum, to heat shock response. Nature, 1983, v.303, p.806-808.

146. LaskerB.A., Borgia P.T. High-frequency heterokaryon formation by Mucor racemosus. J. Bacteriol., 1980, v.141, p.565-569.

147. Lazdins J.В., Cummings D.J. Autonomously replicating sequences in young and senescent mitochondrial DNA from Podospora anserina. Current Genet., 1982, v.6, p.173-178.

148. Leach J., Yoder O.C. Heterokaryosis in Cochliobolus heterostrophus. Mycology, 1982, v.6, p.364-374.

149. Leach J., Yoder O.C. Heterokaryon incompatibility in the plant-pathogenic fungus, Cochliobolus Heterostrophus.

150. J. Heredity, 1983, v.74, p.149-152.

151. Loper-Belmonte F., Garcia-Acha I., Villanueva J.E. Observations of the protoplasts of Fusarium culmorum and on their fusion. J.Gen.Microbiol., 1966, v.45, p.127-154.

152. McClintock B. Chromosome organization and expression. -Cold Spring Harbor Symp. Quant; Biol., 1951, v.16, p.15-47.

153. Microbial deseases of fish. Ed. by E.J.Roberts, Univer. of Stirling, Scotland, 1982, 505p.

154. Mishra N.C., Taturn E.T.L. Non-mendelian inheritance of DNA-induced inositol independence in Neurospora. Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1975, v.70, p. 5875-5879.

155. Morgan A.J., Nicolaidis A. Intergeneric plasmid transfer in yeast by protoplast fusion genetic transfusion. -Heredity, 1985, v.50, p.211-212.

156. Mowatt N., Johnston J., Watson D. Hybridisation of distil lery yeast by spheroplast fusion. In: The molecular biologyof yeast. New York: Cold Spring Harbor,1985, p.198.

157. Necas 0. Eegeneration of protoplasts. In: Advances in protoplast research. Oxford: Pergamon Press, 1980, p.151-162.

158. Otte E. Eine mykose bei einem Stachelrochen ( Trigon pastinaceae). Wiener tierarztliche Monaksschrift, 1964, v.51, p.171-175

159. Park D. Inorganic nitrogen nutrition and yeast-mycelial dimorphism in Aureobasidium pullulans. Trans.Btit.Mycol.Soc., 1982, v.78, p.585-588.

160. Park D. Amino acid nutrition and yeast-mycelial dimorphis; in Aureobasidium pullulans. Trans.Brit.Mycol.Soc., 1982p., v.79, p.170-172.

161. Po^ntecorvo G., Roper J.A., Forbes E. Genetic recombination without sexual reproduction in Aspergillus niger. J.Gen. Microbiol., 1953, v.8, p.198-210.

162. Poulter R., JefferyK., Hubbard M.J., Shepherd G., Sullivan P.A. Parasexual genetic analysis of Candida albicans by spheroplast fusion. J.Bacterid., 1981, v.146, p.833-840.

163. Poulter R., Rikkerink E. Genetic analysis of red, ade-nine-requiring mutants of Candida albicans. J.Bacterid., 1983, v.156, p.1066-1077.

164. Provost A., Bourguignon C., Fournier P., Ribet A.M., Heslot H. Intergeneric hybridization in yeasts through protoplasts fusion. FEMS Microbiol. Lett., 1978, v.5, p.309-319.

165. Quigley D.R., Siehr D.J. Composition of regenerated cell walls of reverting Aureobasidium pullulans protoplasts. -Appl.Environ.Microbiol., 1984, v.47, p.882-883.

166. Ramos S., Garcia-Acha I. A vegetative cycle of Pullularia pullulans. Trans.Brit.Mycol.Soc.,1975, v.64, p.129-135»- 156

167. Ramos S., Garcia-Acha I. Cell wall enzymatic lysis of the yeast from of Pullularia puiiuians and wall regeneration by protoplasts. -Arch. Microbiol., 1975a, v.104, p.271-277»

168. Sanderson F.K. Description and epidemiology of Guignardia fulvida sp. nov., the ascogenous state of Aureobasidium puiiuians var. lini, ( Lafferty ) Cooke V.Z.- J.Agric.Res.,19&5» v.8, p.1'31-141.

169. Sarachek A., Rhoads D.D., Schwarzhoff R.H. Hybridization of Candida albicans through fusion of protoplasts. Arch. Microbiol., 1981, v.129, p.1-8.- 157

170. Sarachek A., Weber D.A. Temperature-dependent internuc-lear transfer of genetic material in heterokaryons of Candida albicans. Current Genet., 1984, v.8, p.181-187.

171. Savchenko G.V., Kapultsevich Yu.G. Hybridization of yeast from genus•Hansenula by protoplast fusion. In: Advances in protoplast research. - Oxford: Pergamon Press, 1980, p.125-130.

172. Serres de P.J. Studies with purple adenine mutants in Neurospora crassa. 1. Structed and functional complexity in thead-3 region. Genetics, 1956, v.41, p.668-676.

173. Sietsma J.H., Boer de W.E. Formation and regeneration of protoplasts from Pythium ERL 214. J.Gen.Microbiol., 1973, v.74, p. 211-217.

174. Singh M., Sinha U. Chloral hydrate induced haploidization in Aspergillus nidulans. Experientia, 1976, v.32, p.1144-1145.

175. Sipiczki M. Interspecific protoplast fusion in fission yeasts. Current Genet., 1979, v.3, p.37-40.

176. Sipiszki M., Ferenczy L. Protoplast fusion of Schizosac-charomyces pombe auxotrophic mutants of identifical mating type.-Mo1.Gen.Genet., 1977, v.151, p.77-81.

177. Sipiczki M., Kucsera J., Ulaszewski S.,Zsolt J. Hybridization studies by crossing and protoplast fusion within the genus Schizosaccharomyces Lindner. J.Gen.Microbiol., 1982, v.128, p.1989-2000.

178. Skatrud P.L., Queener S.W. Cloning of a DNA fragment from Cephalosporium acremonium which functions as an autonomous replication sequence in yeast. Current Genet., 1984, v.8,p.155-163.

179. Solingen P. van, Van der Plaat J.B. Fusion of yeast protoplasts. J. Bacteriol., 1977, v.130, p.946-947.- 158

180. Spata L., Weber H. A study oil protoplast fusion and parase xual hybridization of aleane utilizing yeasts. In: Advances in protoplast research. - Oxford: Pergamon Press, 1980, p.131-137»

181. Spencer J.P.Т., Spencer D.M. Genetic improvement of industrial yeasts. Arm.Eev.Microbiol., 1983, v.37, p.121-142.

182. Srikantha Т., Ramananda Rao G. A method for isolation of protoplasts from dermatophytes. J.Gen.Microbiol., 1984, v.130, p.1503-1506.

183. Stahl U. Zygote formation and recombination between like mating types in the yeast Saccharomycopsis lipolytica by protoplast fusion. Mol.Gen.Genet., 1978, v.160, p.111-113.

184. Stewart G.G. The genetic manipulation of an industrial strains. Can.J.Microbiol., 1981, v.27, p.973-990.

185. Sugawara Ж., Szostak J.W. Recombination between sequences in nongomologous positions. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1983, v.80, p.5675-5679*

186. Sutherland I.W. Biosynthesis of microbial exopolysaccha-rides. In: Advances in microbial physiology. - London, New York: Acad. Press, 1982,v.23, p. 80-150.,

187. Tamaki H. Genetic properties of abortive products resulting from the protoplast fusion in yeasts. Mol.Gen.Genet., 1982, v.187, p.177-179.

188. Tani Y., Yamada Y., Kamihara T. Morphological change in Candida tropicalis pk 233 caused by ethanol and its prevention- 159 by myo-inositol. Biochem.Biophys.Res.Communic., 1979» v.91, p.351

189. Tikhomirova L.P., Kryukov V.M., Strizhov N.I., Bayev A.A. mt DNA sequences of Candida utilis capable of supporting autonomous replication of plasmids in Saccharomyces cerevisiae. -Mol.Gen.Genet., 1983, v.189, p.479-484.

190. The polysaccharides. Ed. by G.O.Aspinall, York Univer. Downsview, Toronto, Ontario, Canada, 1983, 505p«

191. Toyama H., Yamaguchi K., Shinmyo A., Okada H. Protoplast fusion of Trichoderma reesei, using immature conidia. Appl. Environ.Microbiol., 1984, v.47, p.363-368.

192. Toyama H., Yokoyama Т., Shinmyo A., Okada H. Interspecific protoplast fusion of Trichoderma. J.Biotechnology, 1984a, v.1, p.25-35.

193. Typas M.A. Heterokaryon incompatibility and interspecific hybridization between Verticillium albo-atrum and Verticillium dahliae following protoplast fusion and microinjection. J.Gen. Microbiol.1983, v.129, p.3043-3056.

194. Tyrrell D., Peberdy J.P. Spontaneous and enzyme-induced protoplasts from Entomophthora species. In: Advances in protoplast research. - Oxford; Pergamon Press, 1980, p.229-234.

195. Vallin С .i Ferenczy L. Diploid formation of Candida tro— picalis via protoplast fusion. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1978, v.25, p.209-212.

196. Vries de M.H., Wessels J.G.H. Release of protoplasts from

197. Schizophyllum commune by combined action of purified c<-1,3-glutcanase and chitinase derived from Trichoderma viride. J.Gen. Microbiol., 1973, v.76, p.319-330.

198. Waterfield W.F., Sisler H.D. A method for rapid production- 160 .of protoplasts from Ustilago maydis sporidia. Phytopathology, 1984, v. 74, p.760.

199. Weber H., F'orster W., Berg H., Jacob H.-E. Parasexual hybridization of yeasts by electric field stimulated fusion of protoplasts. -Current Genet., 1981, v.4, p.165-166.

200. WhelanW., Magee P.T. Natural heterozygosity in Candida albicans. J.Bacteriol., 1981, v.145, p.896-905.

201. White C., Gadd G.M. Isolation and purification of protoplasts from yeast-like cells, hyphae and chlamydospores of Aureobasidium pullulans. J.Gen.Microbiol., 1984,v.150, p.1051-1054.

202. Wilson J.J., Khachtourians G.G., Ingledew W.M. Protoplast fusion in the yeast, Schwanniomyces alluvius. Mol.Gen.Genet., 1982, v.186, p.95-100.

203. Yelton M.M., Hamer J.E., Timberlake W.E. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 1984, v.81, p.1470-1474.

204. Zimmermann U., Scheurich P. Fusion of Avena sativa meso-phyll cell protoplasts by electrical breakdown. Biochem.Biophys Acta, 1981, v.641, p.160-165.

205. Zocher R., Klienkauf H. Biosynthesis of ergotamine in protoplasts of Claviceps purpurea. J.Gen.Microbiol., 1980, v.118, p.485-494.

206. Я очень благодарна Ланда С.Б. за получение спектров распределения ДНК по клеткам гриба, Левиной Б.В. за методическую помощь в приготовлении цитологических препаратов и Белостоц-кой Г.Б. за помощь в фотомикросъемке.