Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Слияние протопластов сибиреязвенного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Слияние протопластов сибиреязвенного микроба"

Государственный комитет РСФСР по санитарно-эпидемиологическону надзору Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамен» научно-исследовательский противочумный институт "ИикроС"

На правах рукописи

КОСТЮКОВА Татьяна Алексеевна

УДК 616.981.61:576.8

СЛИЯНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ СИБИРЕЯЗВЕНШГО МИКРОБА

03.00.0/. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Сюдогическкх наук

Саратов - 1991

- г -

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамегги научно - исследовательской противочумном институте "кикроб".

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор Лнисишз Е И., кандойат'медицинских наук старший научньй сотрудник Дроздов И. Г.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Самойлова Л. а , кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Сергеева Г. 11

Еьд'/Шй! организации - Научно-иоследоьательекиХ1 протово-чушкй институт Кавказа и Закавказья.

Автореферат разослан 199 «г.

Залита диссертации состоится ~> 199.2 г.

а часов на заседании специализированного совета Л 074.32.01 по эацете диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте "Ыикроб" (410071, г.Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией шяо ознакомиться в научной библиотеке Института "Микроб".

Ученый секретарь

специализированного Совета

шжтор Скологических наук Корнеев Г. А.

ОБЩАЯ XAPARTEPÏCTKKA РАБОТЫ

АКГУАЛЫЮСТЬ ПРОШЕШ. К настоящему EpsifcKï жтод слияния протопластов разработан для ¡¿norm видов грамполоянтелышх к грамотрицателышх микроорганизмов как способ генетичес!шго анашза и конструирования. ( Ливщиц, 198S; 1йланичева с соагт., 1990; йуцубвдзе, ¡'лесов, 1990; Орлова, 1091; Chen Zftongfu et al.. 198S; Psberdy, 1687).

Генстичэстай обшн, осущзствллешй при слияния протопластов, иыеот принципиальные отличия от других известных способов передачи генетического материала. Так, ери трансформации, ■транедукции и конъигации в рзципионмую клетку прсияк&кт лишь фрагменты реплисона донорного родителя. В противовес этому, ' при слияний протопластов во вновь образованной морфологической структура могут обнаруживаться полные наборы гоноша участвующих в слиянии партнеров (Белых с соавт. ,1983; Лившиц, 1338; Godfrey et al.. 1978).

Уникальной особенностью метода слияния бактериальных' протопластов является ненаправленное«» перекоса генетического ма-тернала, что обусловлено одинаковой ролью обеих родительских клеток в формировании гибридного потоштва (Fodor et al., 1978). ^направленность перекоса генетического ¡¿атернала при слиянии протопластов создает определенные методические удобства, существенно облегчая селекции против любого из партнеров с помощью тепловой инактивации протопластов.

Валким фактором, влияющим на Процесс образования гибридного потомства, является то обстоятельств, что при слиянии происходит смешение цитоплазматического материала родительских

. - 4 -

шташоа. При stou йоту? взаимодействовать и сливаться как два, так и более двух протопластов, что было поковано на прззшре стрептоницетов (Hopwood, 'aright, 1978) и бацилл (Frebal et al. ,1970).

Креиыуиество данного штода заключается в высокой частоте появления гибридного потомства (Chang, Cohen, 1979), что позволяет использовать его для передает не только шлки, но и крупных репликонов (¡сриптичаских плазмид. больших участков хромоссш). При атом сохраняется нативность передаваешго генетического материала, не требуется участке кзгаис-лкСо мобилизующих 'факторов, воэможьа передач?, маркеров, расположенных на Оольетх расстояниях друг от друга (Белых с соавт., 1983).

Несмотря на широкое применение ыетода слияния протопластов на микроорганизм многих., видов, в том числе представителях особо опасных инфекций (Дроздов ЯГ., 1087; Чернов, 1087), разработки на модели сибиреязвенного микроба до см пор не нашли достаточной реализации. В литературе имеются лишь отдельные сообадания о возможности получения дефектных по клеточной стенке форц сибиреязвенного цякроба и их применения в генетических. кзследовашшх <Чернов. 1984, 1987; Тарасова с соавт., 1990; Mikesall et al., 1883;' teklno et al.. 1987). Указанные форш бьши шкыгьзовшш п експериызнтах по трансфор-ы2ШШ iMlkosoll et al., 1983; ISaktno et al., 1987). Показана тагаг принципиальная возшгаюоть генетического обмена при слияниилротопдастоз ваззддагаго ¡таша a anthracis сти-1 и восковидной паловда (*5граов, 1037).

Вместе с тем, комплексного системного изучения действия ыурвикохитич$сюа атеггтов на ведаоазшщэ в генетическом отношении природные шшт снбирэяэвенного микроба, а такав клетки

- б -

атого микроорганизма с различным набором собственных пдаакнд на проводилось. Дз исследовались возиэйкостн внутривидового обмана и вопроси передач;! собственных пдазмэд посредством слияния протопластов. Ш изучались пзрспеют-зн использования различных индукторов слияния. •

Все вышеизложенное требовало проведения соответствушкх исследований а указанных направлениях.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в разработке эффективней методики протопла^тирования штаммов сибиреязвенного иикроба и изучении возможностей применения метода слияния протопластов на модели данного микроорганизма.

ОСНОВНЫЕ зшчи шущоаша

1. Разработать эффективный способ получения протопластов и протопластоподобтк стру!сглэ у сибиреязвенного шзсроба.

2. Осуществить внутривидовой генетический обмен наслздет-венной шфориацда на модели В. агХ'пг£С1з путей слияшм протопластов.

3. Выяснить влияние различных условий индукции процессов слияния протопластов возбудителя сибирской язвы на частоту образования гибридного потомства.

4. Изучить биологические характеристики гибридных клоноэ, В. аЩЬгаа1з, возникаю®« в процессе сейши.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые на шделн сибиреяевекног-о микроба получены протопласты природных вирулентных штаммов и их дано- я алдазшшых дериватов.

Изучено влияние различных условия индукции процесса слияния протопластов В. агЛпгас1з на частоту образования гибридного потомства.

Установлена возможность передачи !®к гетерологичньк

(рВйб и рС1С-1), так и собственных экстрахроыосомных иеконъ-игативных раплнковов (ржг и рЖ2) при внутривидовом ожинки протопластов возбудителя сибирской язва

Показана кошетеотнссть полученных протопластировашшх культур з трансформации ДНК плазмиды рВС16, детерминирукврй тетршдаушкрэзистентность.

Продукты слияния способны наследовать маркеры антибиотике резистентности плазмидной локализации со стабильностью, свойственной родительским штаммам.

3 случае объединения а цитоплазме слившихся ¡слеток двух собственны? еибиреязве^-шх плазмид, у фьмжаитов наблюдалось восстановление вирулентности для лабораторных животных.

ПРАКГИЧ2СКАЯ ЗНАЧИЖЮТЬ. Получение гибридного потомства в результате слияния протопластов В. алЬЬгаош открывает возможность использования данного штодэ для передачи собственных т гетеродогичных плазмид и делает возшлиым применение его в целя? генетического' конструирования. По итогам выполкешшх исследований составлены штодкческке рекомендации "Получвнкэ стерильных бактериальных лдаатоо клеток сибиреязвенного иакро-Оа" и "П&лучзнш протопластов на «одели сибиреязвенного ьозкро-еа", одобренные Учс-нш Советом Всесоюзного научно - исследовательского протйЬочуквого института "Кйкроб" и утверздещщэ директором института "1&кроб" проф. Шушвьш А, В. Создана и депонирована в музее тшвых кульуур ВШЯШ "Нжроб" изогешш система штатов с различнш набором собственных плазмид, а

такав тайм 8. апЫчгаз!з 81/1 Кп^ШГ1*, иуэещзй юртеры антиби-оуикоустойчивости ХрошеоыаоЗ природы. Штаммы используются как модельные для определения фупгадаа отдельных плазмид сибиреязвенного микроба и составляла их генов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационного исследования долокены на 12 Всесоюзной научной ¡озпферепцщ " Вак^ сериальные плазмиды" (Нальчик, 1990 г.) к научной конференции института "Микроб" (Саратов, 1991 г.), посвященной 121-ой годовщине со дня рождения а й, Ленина,

ПУБЛИКАЦИЯ Основное содержание работы отражено о шести опубликованных работах.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦ®!. Работа состоит из введения и Б глав, со^ртащих обзор литературы, экспериментальную часть, aaiсличения, выводов и списта литературы, включаюгззго 181 наименование. ОЗкиД объем диссертация 143 страницы. Тежт иллюстрирован 14 таблицами и 14 рисунками.

основные пош®, шиосише на защиту:

1. Сочетанное воздействие глицшюм и лиэоцимом на вегетативные клетки сибиреязвенного ьсгкроба с разным набором собственных илаэмид позволяет получить до 99Х осмотически чувствительных форы, из которых 70S составляют истинные протопласты и протопластоподобниз Форш.

2. Слияние протопластов возбудителя сибирской язвы с помощью индукторов (преципитат фосфата кальция и ПЭГ 6000)

приводит к формированию гибридных клонов с частотой 1С"5-10~4.

3. Передаваемые в результате слияния года- и гетеро -логичные плазвды эгапреосируст детерминируеш» ими признаки и наследуются со стабильностью, свойственной родительским штаммам В. anthracis.

4. В результате объединения в цитоплазме слившихся клеток Д1.ух собственных плазмид 8. anthracis, у фьтантов возможно восстановление вирулентности для лабораторных животных.

СОДЕИШИЕ ДИССЕРТАЦИИ

В иерБой главе литературного обзора приводятся данные о значении клеточной стенки для яизнедеятелъшсти клеи® иккро-срганязыов, характеристик структур с различной степенью пов-реадения клеточной стенки, рассматриваются условия получения протопластов и протопластоподобных фору Садил к их реверсии в исходные клетки. Вторая глава содержит сведения об особенностях генетического обмена при слиянии бактериальных протопластом и влиянии ряда факторов на этот процесс.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В главе приведен;: данные о питательных средах и реактивах, указаны методики получения стеночно-дефектных структур возбудителя сибирской язвы (Чернов, 198'?'; ¡¿Ikosell et ей., 1083; ).!ak mo et al., 1087).и визуализации степени повреддення клеточной стенки.

Эксперименты проводились на 20 иташах . сибнреяаввпяого микроба.

Для выращивания вегетативных форы возбудителя сибирской язвы использовали питательный Оулт.та (ПБ) Penassay broth, производства фирмы "DliTco" (СШ). Изучение свойств полученных гибридных клонов, селекцию штЕбштикорезистентных клонов проводил!! на LB-arape (Шшатш с соавт.» 1984). При необходи-мостз! а питательные среды добавляли соответствующие антибиотики:. тетради слин, хлораыфэникол, ркфакпищш и каяамицина сульфат. .■

Обработку нуреинотрошшми агентами осудаствляли на среде СШ1, представлявши собой сиэсь равных количеств 4 :: ПВ я ^ х СШ- буфера, состоящего из 0.6ÎÎ раствора сахарозы з 0,02Н ка-леатном буфере, pH 6.Б, с добавлением 0.02М раствора хлористого магния (Vynck, Rogers, -1973).

Выделение плазмидной ДНК из иташа В. subtilis 168 рБС1б осуществляли по иетоду Birnboim и Doly (1981). Далее препарат ДНК" очищали в градиенте хлористого цезия и диаяизон против 'ГЕ буфера в течение двух суток. Для выделения плазмидной ДШ£ из штамма В. anthracis pXül- р>С02- рВС1б использовали метод Green et al. (1986) в кодификации Ерешна С. А. (1987).

Электрофорез проводили в 0,7% агерозном геле при силе тока 70-80 мА."

Для индукции процесса слияния протопластов использовали полиэтиленгликоль (ПЭГ) и преципитат фосфата кальция согласно методике, описанной в работе К. Fodor н L. Alfoldi (197ö).

Электронно-микроскопическое исследование протопласткро-ваяных культур проводили по дад!фщированноыу методу R. Weiss (1978) и Frehel et al. (1079).

Вядовые свойства лташов сибиреязвенного микроба изучали а соответствии с "Инструкцией и методическими указаниями по лабораторной, клинической диагностике, профилаетике и лечению сибирской язвы у людей" (1980).

Вирулентность родительских штаммов и полученных в результате слияния гибридных кленов определяли подкожным заражением белых мыпей и морских свинок споровыми взвесями культур. Еа-числение величины LD50 и доверительного интервала для вероятности 95Z проводили на персональной компьютере "Olivetti" с помощью программы "SuperCalc4".

2. РЕЗУЛЬТАТЫ НАСЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Д® етученш генетнческзга аспектов патогенностн возбуди-1 ала сибирской язвы в' настоящее врем активно применяется различные 1йтодц генетического обмена, такие как трансформация, тргнсдукция, конъюгация (Гаврилоз с сотр., 1989; Еремин с соавт., 1589; Пузагюва, 1930; Братин с соавт., 1990; ИиЫег е1 а1.. 1984; ВаШзи о1 а1., 1985). В то же время используемый при исследовании геномов многих видов микроорганизмов иатод слияний протопластов епу? не нашел-широкого применения для изучении наследственного' аппарата сибиреязвенного микроба. К настоящему времени имеются отдельные сообщения о возможности передачи плазмид с помощью трансформации протопластов бацилл сибирской язвы (Мак1ло вЪ а1., 1087; МПжгеИ а1., 1983; Тарасова "с-соавт.,- 1990). Черновым В.С. (1987) показана принципиальная возможность передачи чуяероднов шшьгздноа ДНК а протопластировагшкэ ват вакцинных игашов В. апЬЬгас1з ССК-1 при ы&хвидовом смшш с протопластами сосковидной палочки. Однако, предлагаемые методы, в основном, адаптированы для выполнения конкретной аадачи на вполне определенном штамме, что затрудняю ; Еерсгйкгмвнуш оценку применения методики для работы с щшродоыш шга&шщ. Ш в одной иа приведенных работ по протопластам аозбудателя сибирской язвы нет еообщэккй о возможностях осуЕ^сзвдааи внутривидового обмена

Первой вададай кашРо шсйэдоаашк, направленного на выяснение возможностей штода слзянвд протопластов при изучении внутривидозого обдана на юдоли В. ьпии-ас'з, было получение протопластов природных ьтгашов и нх производных, июшдах раэ-

- 11 -

лганьй набор собственных плазыид.

Для этих целей мы попытались кспольговать приводишь в оригинальных статьях методшси получения протопластов для игаи-шв с разным набором собственных плааквд.

При воспроизведении методики Mikesell с соавт. (19S3), закачавшейся в 3,5- часовой обработке культур лиаошыом, не более 24% клзтск природных итамшв' 8. anthracis i,S9 и 81/1 приобретали осмотическую чувствительность. Воздействие ыутшга-лизином, другим мурекиолитическш фзршкгом, в концентрациях СТ 50 до БОО ьзсг/ия приводи» к появления в популяции'до 31 -35% осшчувствительньк фор^ Незначительный выход осмотически чувствительных структур в популяции при получении протопластов штаммов В. anthraoïs по методу Ш'озоП et al. (1983) vxm f.fek S по et al. (1987), применившие для этих целей обработку одним из .'»урекнолиткче ских феркентов (дизоциа,- ыутаиолиоин) привело к необходимости апробации■ Солее гэстких снособоэ зоз-- действия на клетки возбудителя сибирской язвы. Такие условия описаны Черновик Е С. ( 1987), использовавши а экспериментах последовательную обработку ¡меток сибиреязвенного микроба пенициллином и лизоцжом. В отличие от автора, получавшего этим способом до 99,9Х протопластов вакцинного итамка СТИ-1, в наших экспериментах было получено не более 16 -31% осмотически чувствительных форы, что явно недостаточно для перехода к экспериментам по генетическому обмену на подобных структурах. Электронно- юкросколическсе исследование образцов культур, полученных под действием пенициллина и лизоциш, показало, что у клеток сохранялся непрерывный контур клеточной стенки. О увеличением дозы лизоцима в реакционной сие с и до 10 мг/мд выяод осьюлабильных форм составил 83 - 882. Попытки повысить кон-

центрацшэ пенициллина до 1,0 ыкг/шг и изменить температуру.обработки о 37 "С до 42 "С при сохранении дозы лизоцнка Юнг/мл не приведи к существенному улучшении результата

Только переход к двухэтапной обработке культур сибиреязвенного микроба гяициноы и лкаоцимом позволил выполнить первую задача по получении протопластов, пригодных для осуществления генетического обыена с помощью слияния протопластов возбудителя сибирской язвы.

Шсле ночного выращивания культур в среде СШП с .глицином (0,5 - i,5 Z) последуютая обработка в течение 30 - 120 мин ли-зоциюм г концентраций 10,6 мг/мл приводила к почти полной конверсии 1 слеток б сферические формы (до 99%), из которых 70% составляли истинные протопласты. Необходимость столь длительного выращивания культуры в среде с глицином, воаможно, связана с удлиненном фазы покоя, предшествующей периоду экспоненциального роста ( Illing et al., 1989; Солньщюща с соавт., 1991), по достижению которого, как отыэчаят каюгиэ авторы, клетки становятся наиболее чувствительными, к лизоциыу. Нами была отмечена разная чувстгдаельЕость щганшь с разный набором еобсэ'ьзннкх плазшд к условиям обработки. Так для получения протопластов шгашзв, лишенных собственных плазмид, или несущих плаз мвду, отаетственнуа за синтез D - полиглотаминовоЯ капсулы, достаточно предварительное выращивание в СМЫЛ с 0.5Х глшдаа и обработка лизощшоа в течение 30 - 40 мин. Тогда как вирулентные аггаыт приобретали осшткческую чувствительность в 97 - 98% случаев посла выращивания в среде с 1,52 глицина и последующего воздействия лизоцимом в точение.2 часов. В то же время, для получети протопластов аспорогенного авирулент но го штамма Davis достаточно в среду для выращивания внести 0,061

глицина и далее клетки обработать лизоцимом в концентрации 5 мг/мл.

Ешвленная различная чувствительность етаммов с разным набором собственных плаэмид к примененным в работе способам обработки муреинолитическими вегоствани опосредованно отрззчает наличие у сибиреязвенного ьдакроба индивидуальных пггаммозых особенностей в строении клеточной стенки. Это обстоятельство шлет быть основным сдерживающим моментом при разработке универсального метода получения протопластов кз разных штатив этого возбудителя. Тем не менее, способ последовательной обработки глицином и лизоцимом вегетативных культур сибиреязвенного микроба позволяет получать до 95 - SÖX осмотически чувствительных форм вегетативных культур отаммов с различным набором собственных плазмид.

Решающим моментом в процедуре протопластировакия является определение жизнеспособности получаемых протопластов, их возможности реверсировать а бациллярные формы. ГЬроко исполь-вуемая для работы с грашголомггельныии микрооргаы5здаш среда, предложенная Vyrtck и Rogers (1&?3), оказалась неудачной для сибиреязвенного ьсикроСа. В ходе экспериментов было выяснено, что присутствушяй в среде а качестве осмотического стабилизатора сукцинат натрия, угнетающе влиял не только на протоп-ластированнш культуры, но и на интакткые клетки возбудителя. Пзэтому для регенерации протопласты a anthracis высевали на ре гене рационную среду, содерлшум в качестве осмотического стабилизатора 0,3 М сахарозу. Для создания благоприятных для реверсии условий в PC были введены такле ЕСА, стабилизирующий протопласты на начальных этапах регенерации ( Illing et al., 1989}, и желатин. , который способствует создания вокруг про-

топдастов "скелета", заменяющего клеточную стенку (Лакоыова с соавт., 1982; Bourne, Dancer, 1936). Заыэна БСА в PC на поли-виниллирролидон не привели к кагаш - лмбо улучшениям качества среды. Использование для осмотической эадаги протопластов каинита также не увеличили выход регенерировавших клеток.

Работы, служившие паи прототипами для получения протопластов сибиреязвенного микроба, практически не содержали сведений о степени дефектности клеточной стенки. Для изучения зтой характеристики ш воспользовались возможностями <1азово-' контрастной и электронной ы-исроскошт. Почти полная кокззарсш s шаровидные фор&п бша отмечена после обработки ысслздуешх культур последовательно пенициллином и лизоцимом (90% сфэри- ' чйскик форм) или глицином и лизоцкшм (99,91 шаровидных структур). Изучение аналогичным образом полученных сферический фори с помощью элегароиного микроскопа показало, что низкая осмотическая чувствительность популяции клеток, обработанных пенициллином и лизоциыом, связана с сохранением непрерывности клеточкой стенки. Лишь у отдельных клеток было отмечено отслоение к разрывы пептидсгликана. В то ко время, полученные последовательным действием глицина и лиаоцима структуры были полностью лишены щеточной стенка примерно в 70Х случаев. Остальные клетки имели значительные участки обнажения цитоплазматическо* мембраны.

Таким образом, увиденные под фазозо - контрастный и электронный микроскопом картины полностью подтвердили результаты, полученные с помощью подсчета доли осмотически резистентных форм на регенерационной среде.

Решение пзрьой задачи пс получении протопластов штаммов он'нрсяэюнного улкроба с различным набором собственных плаз-

мид позволило перейти к экспериментам по их трансформации и слклниа

Излученные протопластированные культуры сиОнроязвенного микроба при изучении их способности утилизировать экзогенную плазмидную ДНК проявляли компетентность, харшяерлу» для дефектных по клеточной стенке бактериальных форм.

В условиях прямой селекции трансформанты появлялись на чашках с селективной PC а течение 2 -4 суток. Причиной неодно4 временного появления колоний трансформантов могла бить разная степень повреждения клеточных стенок, для восстановления которых и начала деления ¡меток требовалось разное время. Тькое предположение подтваркдено появлением на регенерациояной среде L- колоний, которые послз длительного пребывания на PC (до 20 дней) постепенно приобретали типичную для сибиреязвенного микроба морфологи». При трансформации протопластов В. anthraois ЯНК плазмиды рВС16, вия&лешюй по кзтоду Kadb и Liu (1973) из а subtil!s 168 pBClS, эффективность трансформации составила

о

10 на мкг ДНК. Штдки кспольаовать в трансформации ДНК, выделенную из штамма - траясформанта, не привели к ожидаемому повышенна) эффективности процесса обмена, хотя многие авторы при аналогичном изменении методики трансформации наблюдет увеличение количества трансформантов в 10 - 10000 раз (Bakhiel., Sfcahly. 1086;-Engel, 1387; Bron et, al.. .1688).

Таким образом, подтвердив биологическую активность, проявляемую полученными с поиодьв обработки гдацгаюм и лязоцишы протопластами в трансформации, ш перешли к выполнению основной задачи исследования - осуществления передачи наследственного материала на модели сибиреязвеязого микроба посредством слияния протопластов.

- 16 -

Для выполнения экспериментов по слиянию изогенных систем с разным набором собственных плазмид различные варианты штам-

, мои были маркированы по хромосоме с помощью признаков КпГ и

Я1Гг или с помощью введения гетерогенной плазмилной ДНК рВС16 (2,8 Ш, детерминирующей резистентность к тетрациклину) и рС194 (2.0 Ш, ответственной за устойчивость к хлоран$еникоду).

3 условиях слияния протопластов итаммов В. ал1Ьгас!з «¡29

рХОГ рЖ2" рБС16 И В. апШгас^ И2Я рХОГ рХ02" рС194 при использовании в качестве индуктора слияния 40Х раствора ЮГ 3000 ("Могск", ФРГ) были получены гибридные клоны с частотой

О,65x10"¿т общего количества регенерировавших родительских протопластов.

Для того, чтобы убедиться, что получаемые рекокбинантнвэ клетки является Фысикштами были проведены серии контрольных экспериментов. Путем смешивания протопластов с иитактныш клетками, протопластов и лизатов, полученных после суспендаро-вания протопластированных культур в дистиллированной воде, кн-тактиых клеток родительских штаммов поеду собой и интактных клеток с протолластаьш в присутствии ДНКаэы и без нее наш было показано, что возникающие в результате слияния протопластов родительских пггаммов гибридные клоны были истинными фьюязнташ. При проведении необходимых контрольных опш-ов смеси интактных культур родительских штампов, яли протопластов каждого исходного Епшыа Бысеваиш на РС с двумя антибиотиками. Нормирования колоний через 2-3 суток не набдидали. Добавление ДНКазы (био* в мл) к смеси прстопластированных родительских клеток не уменьшило количества первичных колоний. Такие результаты контрольных вькевов позволили исключить предположение о том, что

возникающие на селектизной среде колонии были мутантаьш, трансформактзми, траясдугегаяташ или трансконъогантами.

Опираясь на приведенные вьше данные о принципиальной воз-№юсти интеграция цитоплазмзтического согэришэго меток, на следующем этапе наоей работы бши измены частоты появления гибридного потомства при использовании различных индукторов слияния и без их участия.

Оптимальным, по нашим наблюдениям, явилось оказызаеше на процесс слияния протопластов спбирайзвзшюго шггроба действие раствора ЮГ с молекулярной массой 6000. Изучение индуцирующэ-то влияния растворов ГОГ других молекулярных масс показало, что высокую токсичность для протопластов проявлял полкуер с молекулярной массой 20000, практически не повлиял на выход гибридного потомства раствор ГОГ 2000. При сравнении частот появления гибридных . клонов после обработки смеси родительских протопластов растворами ГОГ 6000 равных концентраций, обкару-гэно меньше стиыулирувдее действие 10, 20 и 50 - процентных растворов, чем 402 концентрации.- Вря такой индукции частота возникновения рекоыбинантав достигала наибольших значений

(0.95 а Ю"4). Аналогичзшо частоты были получены и при использовании в качестве индуктора преципитата фосфата кальция

(частота 1,16 х 10"Шдобныэ найвденил описаны РоЗог и "1Го1<11 (1979) для а п»гаЬэг1ш», Сое1ге© с соавг. (1979) на шдела РгоУ1<1впсе а1са11Гас1епз.

Независимо от источника выделения штаимов сибиреязвенного шкроба при слиянии протопластов клонов, лишенных собственных плазыид к маркированных шгакодалекуларншт гете -ропдазмвдами, детержнярутши аятибиотиксрезистениюсть, на селективной РС возникло примерно одинаковое количество коло-

нкй гибридных клонов. Они продолжали расти при пересеве на LB-arap с добавками тетрациклина и хлорамфе никола. Злектрофэ-ретический анализ лизатов культур, способных расти на среде о двумя антибиотиками, показал наличие в геноме гибридных клоков сибирепгвенного микроба двух полос, соответствующих по элект-рофоретичеекой подвижности ДНК плазмид рВС16 и рС194.

С помощью метода слияния протопластов сибиреязвенного иикроба был осуществлен генетический обмен между родителъскгш вггаымаык, кмевдши различный набор собственных лдазкид в шр-кированныэ по хромосоме или с подащью гетерологичных плззмвд. В случае слияния протопластов двух штаммов, один isa котормх имел гош- и гетерологичную плаамиду, а другой только ннзкоко-лекулярнуга гетерологичную плаамиду, или, когда в скредааши участвовали вирулентный, маркированный по хромосоме, и лишенный собственных плаамид, маркированный гетероплазмидой, чаето-

Ч'а гибридного потомства составила примерно 10 , то есть независимо от состава собственных плазмид в родительских штаммах гибридные колонии появлялись на PC с двумя селективнши антибиотиками с частотой 10"6- 10 При проверке фьшантов, полученных слиянием штаммов, один из которых содержал плаз жду рМ)2, ответственную за синтез капсулы, капсулопродукция отмечалась у 20 - 802 клонов при их выращивании на бикарбонапш агаре в атмосфере углекислого газа. Электрофоретичеакий анализ в агарозном геле показав, что утрата способности продуцировать капсулу этими клонами связана с отсутствием в репликонах ДНК плазмчды pXDZ. Многие исследователи, работавшие с протопластм-ровашшми культурами разлитых микроорганизмов, наблюдали t га-логичной явление утраты плазмид при протопластированик и реге-гераиии. Это событие они связывали с нарушением распределения

екстрахромосомного материала во время деления клеток (Novtck et al.. 1980; Gasson, 1983; Rinckel et al., 1990). Вполне вероятно, что эта m причина лежит в основе наблюдаемой нами элиминации собственной плазмиды.

В результате слияния протопластов штаммов В. anthraols

М29 pXDl~pXD2+pC194 В. anthracls М29 рХ01+рХ02'Я1 fr, получены фькшнты, обладающие двумя гомологичными плазмидами. Проверка на беспородных белых шшах я морских свинках ггагазала, что иуаш, полноценный по составу собственного плаэыидного ре пли-кона проявлял вирулентность. LD 50 таких клонсз, бала в три раза ниже, чем вирулентность исходного природного варианта из геэторого были получены моноплааикдные дериваты. В то же время, в отличие от гибридного потомства, моноллаямидкые родительские культуры, взятие в с .таяние, были авирулентны для морских сви-кок и только птамм, имевший плазкзду капсулопродукции, сохранял вирулентность для беспородных белых ыьшей. Фьшанты проявлял! способность к сохранении приобретенных признаков при спорообразовании. Гетерологичнш плезмяды во.'фьшаитах сохранялись со стабильностыэ, присущей родительски« штатам.

Та ска образом, разработанный нами способ получения протопластов a anthracis в отлична от предложенных рзнео (Чернов, 1987; Тарасова с ссавт., 1090; Mikesell et al., 1083; fâklno et al., 1987) имеет ряд преимуществ: подтвержденный о помощью электронно- микроскопического исследования высокий выход (примерно Z0Z клеточного состава всей популяции) истинных протопластов птаммов с различным набором собственных пяагшщ, возможность реверсии получаемых стеночно - дефектных форм s бациллы. Лавая положительный ответ на основнуп задачу исследования, можно сделать вывод о-возможности осуществления при

внутривидовом слиянии протопластов перо дата как низкомолекулярных гетеро- так и высокомолекулярных собственных плазмид, а такле восстановление вирулентности в случае совмещения во фьшсанте обеих гомологичных плазмид.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный "метод получения протопластов возбудителя сибирской язвы последовательной обработкой вегетативных культур глицином и лизоцимом.

Получены различия в ч^ств итель пост и шташов, ¡шзещх разный набор собственных плазмид к действию названных ыурекно-литических агентов.

Отмечено, что при воздействии на бациллы сибирской йзбы дизоцкмом, мутаяолкзкном или пенициллином в сочетания с лнао-цимом в аопуляции сохраняется высокий уровень осью резистентных клеток.

2. Показана компетентность полученных протоплаетиронанных культур в трансформации ДНК плазмиды рВС16, детермшшрунцэй

о

тетрациклкнрезис-теитность. Эффективность процесса 10 К0£/ чкг ДИК.

3. Отмечено, что в результате слияния протопластов сибиреязвенного микроба максимальный выход гибридного потомства получен при использовании в качества индуктора 4.0Х раствор ПЭГ

6000 или преципитат фосфата кальция (частота 10"6- 10"4).

б. Установлена возможность передачи как гетерологичных (рВС16 и рС1в4), так и собственных плазмидных репликонов (рХ01 и рХЭ2) при внутривидовом гчшянии протопластов Бозбудителя сибирской я8вы.

Продукта слияний способны наследовать шр>«ры ш."гибко-

тикорезистентности плаамздпоЯ локализации со стабильности, свойственной родительский штаммам.

6. В случае объединения в цитоплазма слившихся клеток двух собственных сибиреязвенных шиемяд, у фьхшнтоа павдкща-яэсь восстановление вирулентности для лабораторных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Еремин С. А., Ems il IL , Костикова T. A., Тучков И. Е , Дроздов И. Г. Определение плаэнидного профиля у пггаммов сибиреязвенного мюфоба методом з.пестрофораза в агарозноа геле// Какробиол., иммунобиол. и биохимия особо опасных инфекций. -Саратов, 1987.-0.91-66.

Я, Еремин С. А., Костюкова Т. А., Егорупкин Г. Е , Туадюв Е В.. Дроздов й. Г., Аписиюв П. II Понструированяе и мучение етезааов сибиреязвенного шсроба, ойгздащих различным набором пяавкид// Шлзкул генетита, иякробкол. и вкрусол. - 1089,-ШО. -а 25-33.

a Костикова Т. А., Дроздов iL Г., Ерешш С. А., Езов Ii Е , Ангойюв П. И Сравнительное изучзниэ различных методов получения протопластов возбудителя сибкрской.язвы и их слияния// Де-шшфовава в ВИНИТИ G8.02.1991. - Ш57-Ш1.

4. Еремин С.А., Егов H.H., Постшова Т.А., Никитин А.К., Тучков И. В., Дроздов й. Г. Траисфоршция шгазывдноя ДШК в клетки сибиреязвенного микроба с помощью электросорацки// ЛзО. диагностика и генетика вирулентности особа спас пых инфекция. -Сайтов, 1990.- О. 111-114.

б. Дроздов й. Г.. Еремин С. А., Егоз ЖЕ, Костикова Т. А., Е-житнн А. Н., Тучков И. В., Ашсимов П. И. Изучение вируленг-

носги и иммуногенности экспориуэнталышг игашов сибиреязвенного микроба, обладаадга различным набором собственных шаз-шад// Бактериальные плазшзды. Тез. докл. 12 Всееоюьн. конф.-Нальчик, 1990.- С. 7.

6. Костюкова Т. Д., Дроздов Я Г.. Рремин С. А.. Еетв й. Е , Анискмзв П. Я Сравнительное изучаю® различных методов получения и слияние протояластос Еозбудителя сибирской язвы// Гзнз-тика, микробиол. и совершенствование методов лаб. диагностш® особо опасных ипфегщий. - Саратов, 1931. - С. 87-48. '

____Т>р«»« /с'С а

7»логр»ф«я N3 е г.-о „Подиграфвс*"