Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение условий биосинтеза экстрацеллюлярных полисахаридов штаммами Aureobasidium pullulans var. aubasidani и A. pullulans var. pullulans

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение условий биосинтеза экстрацеллюлярных полисахаридов штаммами Aureobasidium pullulans var. aubasidani и A. pullulans var. pullulans"

О

с;"

На правах рукописи

КУДРЯШОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ БИОСИНТЕЗА ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ШТАММАМИ А иКЕОВЛ8Ю1Ш4 Р1ЛХ МАК.АиВАЗЮШ И А.РШШ1ЛЫБЧАК.Р111Ш[Л№

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учепой степени кандидата биологических наук

С.-Петербург 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Юрлова Н.А.

доктор биологических наук, профессор Яковлева Е.П., доктор медицинских наук, профессор Дубинина Е.Е.

Ведущая организация ГосНИИ Особо чистых биопрепаратов

Защита диссертации состоится ^£¿£^¿1997 г., в " " часов на заседании диссертационного совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. С.-Петербург, ул. Проф.Попова, 14.

Автореферат разослан " 5 Г " 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (197376, г.С.-Петербург, ул.Проф.Попова, 4/6).

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грибы рода Aureobasidium Viala & Boyer играют цественную роль в формировании экологических ниш (фитопатогены, ¡деструкторы, эпифитная флора растений), а также в прикладной микробиологии в ¡естве продуцентов биологически активных веществ (полисахаридов, ферментов, ганинов, противогрибковых антибиотиков ауреобазидинов). Представители шого рода активно образуют экстрацеллюлярные полисахариды различной шческой структуры, в частности пуллулан и аубазидан. Производимый за рубежом щулан используют в легкой, пищевой и фармацевтической промышленности. ;чественный аубазидан рекомендован в качестве субстанций для приготовления пензий, мазей и ряда других лекарственных форм, в ветеринарии, пищевой шышленности.

В результате комплексного изучения физиологических и молекулярно-шогических характеристик A.pullulans (de Вагу) Arnaud был описан новый тривидовой таксон A.pullulans var.aubasidani Yurlova (Yurlova, Hoog, 1997). -аммы разновидностей A.pullulans var.aubasidani и A.pullulans var.pullulans личались, в частности, по оптимальному источнику азота для биосинтеза ополисахарида, а также по химической структуре (аффинитету) ЭПС, образуемых в гимальных условиях: A.pullulans var.aubasidani синтезирует ЭПС аубазидановой |уктуры, A.pullulans var.pullulans - пуллулановой (Yurlova, Hoog, 1997). В этой связи >бый интерес представляет изучение влияния формы источника азота, соотношения [ерода к азоту (C/N) при изменении качественного и количественного соотношения ,тих компонентов среды на выход, химический состав и структуру ЭПС, эазуемых штаммами-представителями разных внутривидовых таксонов, что внесет эеделенный вклад в изучение регулируемых процессов биосинтеза не только ЭПС, и других биологически активных веществ, образуемых изучаемыми кромицетами. Наряду с этим представляет интерес сравнительное исследование гей метаболизма углерода у штаммов A.pullulans - представителей разных дривидовых таксонов в условиях различного азотного питания.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение условий эсинтеза экстрацелтолярных полисахаридов штаммами - представителями (новидностей A.pullulans var.aubasidani и A.pullulans var.pullulans.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Исследовать влияние источников неорганического азота в окисленной и остановленной формах, соотношения C/N при изменении качественного и

количественного состава других компонентов среды на выход ЭПС, образует штаммами-представителями А.ри11и1апз уаг.аиЬа81с1аш и А.ри11и1апз уаг.риШапв.

2. Оценить влияние источников азотного питания, С/Ы на состав и струю

ЭПС.

3. Изучить влияние источников азота на активность некоторых ферме! углеродного обмена у штаммов-представителей А.ри11и1апз уаг.аиЬаз1ёаш и А.ри11и уаг.риМапз.

4. Изучить условия биосинтеза экстрацеллюлярного полисахарида, образуеь новым штаммом А.риШаш уаг.ри11и1апз СПХФА 11.

5. Изучить спонтанную изменчивость А.риНЫапБ уаг.ри11и1ап5 СПХФА 11 признаку полисахаридобразования и условия его хранения.

Научная новизна работы

1. Впервые изучено влияние концентрации неорганических источников азо окисленной и восстановленной формах и соотношений углерода к азоту (С/Ы) изменении качественного и количественного соотношения других компонентов ср на биосинтез, химический состав и структуру ЭПС, образуемых штамма представителями внутривидовых таксонов А.ри11и1авд уаг.аиЬаз1с!ат и А.ри111 \'аг.ри11и1аш.

2. Впервые исследовано влияние источников азота на активность некотс ферментов углеродного обмена (гликолиза, пентозофосфатпого пути, вд трикарбоновых кислот, глюконеогенеза) у штаммов-представителей А.рцШ уаг.аиЬа51с1а1Ц и А.ри11и1аш уаг.риШапБ. Установлено, что в случае использов; оптимального для биосинтеза ЭПС источника азота (ЫаЖ>з - для А.ри1Шапз аиЬаз1<1аш и (N114)2504 - для А-риИШаш уаг.ри11и1апз) повышается активность исследованных в работе ферментов метаболизма углерода (глитаг пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот, глюконеогенеза).

3. Изучены условия биосинтеза ЭПС новым штаммом А.риШапз уаг.риШ СПХФА 11, предложены оптимальные сроки хранения штамма СПХФА 1 оптимальная питательная среда с целью максимальной продукции ЭПС. Изу естественная изменчивость А.риМапэ уаг.ри11и1аш СПХФА 11 и выделен наиб продуктивный морфологический вариант.

Практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использо] в биотехнологии для проведения регулируемых процессов биосинтеза определенного химического состава и строения (пуллуланового к аубазиданового), а также других БАВ, образуемых микромицетами А.ри11и1апз.

Предложены практические рекомендации для сохранения и поддержания ив но ста по признаку полисахаридобразования перспективного штамма A.pullulans .pullulans СПХФА 11 - продуцента пуллуланоподобного полисахарида.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на российских конференциях: "Химия и технология лекарственных веществ", Петербург, 1994; "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств", Петербург, 1996; на 5-м Международном микологическом конгрессе, Ванкувер шада), 1994; на совместном заседании кафедр микробиологии и биотехнологии нкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии 1.06.97).

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 3 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора гературы (3 главы), экспериментальной части (4 главы), обсуждения результатов, водов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 183 страницах [нинописного текста, содержит 17 таблиц, 32 рисунка. Список библиографии хержит 238 наименований, из них 161- на иностранных языках.

Объекты и методы исследования

В работе использовали штаммы СПХФА 11, ВКМ F-179 (типовой штамм llularia pullulans var.fusca (Browne) Berkhout=A.pullulans (de Вагу) Arnaud r.melanogenum Herrn anides-Njibof), ВКПМ F-371, BKM F-1125 Aureobasidium llulans (de Bary) Arnaud var.pullulans и ВКПМ F-448 (типовой штамм), BKM F-2204 pullulans (de Bary) Arnaud var.aubasidani Yurlova.

Культурально-морфологические характеристики изучали в жидких и на физованных питательных средах (сусло-агар (4%, 7%), картофельно-глюкозная гда (Бабьева, Голубев, 1979)) с помощью автоматизированной системы ВидеоТест пработчик ООО "ИСТА", С.-Петербург).

Образование экзополисахаридов (ЭПО изучали в жидких питательных средах пека-Докса и Уеда (без витамина В6) (Ueda et al., 1963) при неизменном этношении углерода к азоту (C/N) либо в соответствии с прописью среды Уеда /N=157), либо Чапека-Докса (C/N=40). Культивирование, выделение нативного лисахарида (полисахарид + биомасса), чистого полисахарида, биомассы проводили методам, приведенным в работах Блинова и др. (1975); Юрловой, Копыловой )93). Содержание биомассы и чистого полисахарида (в процентах) в нативном

полисахариде определяли также косвенным методом по количеству аз (микрометод Кьельдаля). После окончания процесса ферментации (96 час определяли рН потенциометрически, вязкость ферментационной массы, разбавлен] в 10 раз дистиллированной водой, - на ротационном вискозиметре "Реотест-2".

Химический состав и структуру ЭПС устанавливали методами: Хагедорна-Иенсена (редуцирующие вещества) (Белозерский, Проскуряков, 19: полного кислотного гидролиза с последующим определением моносахаров мето, распределительной одномерной восходящей хроматографии на бумаге (Зайц 1955); частичного кислотного гидролиза; периодатного окисления (Захаров, Kocei 1982); метилирования (по методу Хакомори) (Xakomori, 1964) с последую! идентификацией частично метилированных метилгликозидов методом ГЖХ (Beb et al., 1972); ИК-спектроскопии; определения удельного вращения 0,1% вод растворов полисахаридных препаратов на автоматическом поляриметре Perkin-Eli 241.

Определяли также белок (по Лоури), влажность и зольность (Государствен фармакопея СССР, 1987), относительную вязкость 0,1% водных растворов ЭПС.

Гомогенность ЭПС определяли при фракционировании 2,5% водным раство цетавлона и гель-хроматографией на сефарозе-4В.

Определение активности ферментов метаболизма углерода проводил) бесклеточных экстрактах, полученных путем ультразвукового разрушения отмьш калий-фосфатном буфере клеток, по методам, описанным в работах : Driscoll, Fi 1993; Romanov ct al., 1994; Hansen et al., 1976; Saroso et al., 1986; Miller et al., 1 Maino, Young, 1974. При определении ферментативных активностей об реакционной смеси составлял 1 мл, а температура 25°С. За единицу акгивю принимали такое количество фермента, которое катализировало превращение 1 m субстрата в минуту. Удельные активности рассчитывали как число еда ферментативной активности на 1 мг белка. Содержание белка в бесклеточ экстрактах определяли по методу Лоури. Спекгрофотометрические измер< проводили на приборе Pye Unicam SP 30 UV (Англия).

Оптимизацию состава питательной среды проводили методами дроб] факторного эксперимента и крутого восхождения (Лисенков, 1979; Налимов, Ива 1988).

Полисахаридобразующую активность штамма-продуцента изучали на вариантах питательных сред: Чапека-Докса, Голубева (Голубев, Вдовина, 1974), 1 (Ueda et al., 1963), Харада (Harada et al., 1966), среде с аспарагином (Lingappa е 1963).

Естественную изменчивость штамма-продуцента изучали методом истощенного хева на плотные питательные среды взвеси клеток двухсуточной культуры, ращенной на 7% сусло-агаре при (25±1)°С. Культуры после хранения в течение 6, 36 месяцев на скошенном сусло-агаре при (4±1)°С пассировали путем ¡хкратного пересева на свежескошенный сусло-агар через 48-72 часа, при (25±1)°С. лее проводили: цитологические исследования с помощью трансмиссивной :ктронной микроскопии (Tesla-613, Чехословакия); рассев культуры по методу, ^санному выше; определение полисахаридобразующей активности исходного амма и выделенного наиболее продуктивного морфологического варианта на гимизированной питательной среде; анализ состава и структуры ЭПС.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по ГОСТ 004-74.

Результаты и обсуждение

1 .Условия биосинтеза ЭПС

1.1. Влияние неорганических источников азота в окисленной и восстановленной рмах на биосинтез ЭПС.

В исследованиях использовали 12 вариантов жидких питательных сред: Чапека-кса, Уеда и Уеда без дрожжевого экстракта с различными источниками органического азота (ЫаЖ)з, (NHU^SO^ и разным их содержанием при лношении C/N=157 и 40.

В результате проведенных экспериментов было показано, что для штаммов F-

F-371 и F-1125 - представителей A.pullulans var.pullulans максимальное шчество нативного полисахарида образуется в средах Уеда и Чапека-Докса с остановленным источником азота (сульфатом аммония). Лишь для штамма F-371 ^больший выход нативного полисахарида был в среде Уеда с нитратом натрия в ясутствии дрожжевого экстракта. Однако в изученных вариантах питательных сред п>ко с неорганическим источником азота выявляется закономерность, характерная i штаммов - представителей данного внутривидового таксона: образование {большего количества полисахарида в присутствии (NH^SO.) (табл.1).

Особенностью процесса роста в средах Чапека-Докса и Уеда исследованных ни штаммов F-179, F-371 и F-1125 A.pullulans var.pullulans явилась прямая ¡исимость между исходным количеством источника азотного питания (как в деленной (КаЖ)з), так и восстановленной ((NH^SO-i) формах) и накоплением эмассы, и как следствие - снижение продуктивности (грамм ЭПС/грамм биомассы)

Влияние условий культивирования на биосинтетическую активность А.ри11и1апз Уаг.ри11и1апя штамм Б-179

Пита- Источник Соотно- Выход Выход Выход Содержание Содержание Продуктив-

тельная азота шение нативного нативного чистого биомассы чистого ность,

среда СЖ поли- поли- поли- в нативном полисахарида гЭПС

сахарида, г/л сахарида по отношению к контролю, % сахарида, г/л полисахариде, % в нативном,

% г биомассы

ИаШз 40 7,63±0,32 39 5,18±0,21 32 68 2,12

Чапека- ЫаЫОз 157 3,28±0,21 17 2,10+0,10 36 64 1,77

Докса (Ш^БС^ 40 11,05±0,78 57 5,53±0,12 50 50 1,00

(ЫШ^СМ 157 10,76±0,72 55 5,60+0,17 48 52 1,08

Уеда ИаШз 40 5,83±0,30 30 4,08±0,19 30 70 2,33

без ЫаШ3 157 10,67+0,63 55 7,79±0,20 27 73 2,70

дрожж. 40 12,07+0,81 62 7,72±0,42 36 64 0,31

Экстр. 157 11,41±0,81 59 9,01 ±0,84 21 79 3,76

№Шз 40 15,46±0,73 79 8,97±0,75 42 58 1,35

Уеда ЫаНОз 157 13,18±0,89 68 8,43±0,64 36 64 1,86

(ЫКОгБОц 40 19,25±1,02 99 11,16±0,86 42 58 1,38

(Ш4)2804 157 19,47±0,93 100 12,65±0,87 35 65 1,86

оо

1ьтур. Наиболее ярко эта закономерность прослеживается во всех средах с иьфатом аммония. Так, при повышении концентрации (ТчИ^С^ с 0,6 г/л (€/N=157) 2,33 г/л (СЖ=40) происходит снижение продуктивности: в 10 раз у штамма Р-179 в где Уеда без дрожжевого экстракта (табл.1); в 2,7 и 3,7 раза у штамма Р-371 в среде да без дрожжевого экстракта и в среде Чапека-Докса соответственно; в 1,7-3 раза ;реде Чапека-Докса и Уеда без дрожжевого экстракта и в 3 раза в среде Уеда у амма Р-1125. Таким образом, для штаммов - представителей А.риНЫапБ \pullulans выявлено ингибирующее влияние высоких концентраций сульфата мония (соотношение СЛЧ=40 ) на биосинтез ЭПС. Этот же факт был отмечен ранее шя других штаммов А.ри11и1аш - продуцентов пуллулана (СаНеу, 1971, 1973).

В результате изучения влияния разных форм неорганического азота на писахаридобразующую активность штаммов Р-448 и Р-2204 А.риШапэ ".аиЬа51<1аш было отмечено, что максимальное образование нативного полисахарида жзополисахарида происходит во всех средах, где источником азота является нитрат грия (табл. 2). Причем наибольший выход нативного полисахарида и ^полисахарида и у штамма Р-448, и у штамма Р-2204 отмечен в среде Уеда с тратом натрия в присутствии дрожжевого экстракта.

Для А.ри11и1апз уаг.аиЬа$1с1аш Р-448 и Р-2204 выявлена четкая корреляция между нцснтрацией источника азотного питания и биосинтезом экзополисахарида. Эти аммы в отличие от представителей А.ри11и1апз уаг.ри11и1апз проявляют наибольшую одуктивность по образованию ЭПС в нелимитируемых по источнику азота аовиях роста, т.е. при соотношении С/Ы=40. В данных условиях культивирования, сравнению с условиями лимитирования по азоту (€/N=157), с нитратом натрия одуктивность штамма Р-448 возрастает в 1,3 раза в среде Чапека-Докса, в 1,7 раза в еде Уеда, в 2,4 раза в среде Уеда без дрожжевого экстракта. Штамм Р-448 в среде пека-Докса с сульфатом аммония в концентрации 0,6 г/л (С/И=157) практически не нтезировал ЭПС. А в среде Уеда и Уеда без дрожжевого экстракта при данной нцентрации (№14)2804 (С/М=157) продуктивно^^ составляла менее 0,49 г ЭПС/г омассы, и 0,16 г ЭПС/г биомассы, что в 1,б)(раза меньше, чем при концентрации Н4)2804=2,33 г/л (С/Ы=40) (табл.2). Таким образом, для штаммов разновидности риМапэ уаг.аиЬаБ1с1аш высокая концентрация источника азотного питания (и в исленной, и в восстановленной формах; €/N=40) способствует увеличению выхода зополисахарида и продуктивности клеток.

1.2. Влияние источника азота на химический состав и строение ЭПС.

Было изучено влияние источников азотного питания (КаИОз , (МН^^Од ) при менении качественного состава других компонентов питательной среды и

Влияние условий культивирования на биосинтетическую активность A.pullulans var.aubasidani штамм F-448

Пита- Источник Соотно- Выход Выход Выход Содержание Содержание Продуктив-

тельная азота шение нативного нативного чистого биомассы чистого ность,

среда C/N поли- поли- поли- в нативном полисахарида гЭПС

сахарида, сахарида по сахарида, полисахариде, в нативном,

г/л отношению к г/л % % г биомассы

контролю, %

NaN03 40 5,85±0,88 100 3,45±0,22 41 59 1,44

Чапека- NaN03 157 6,56+1,12 112 3,48±0,17 47 53 1,13

Докса (NH^SO, 40 3,46±0,12 59 0,62±0,11 82 18 0,22

(NH4)2S04 157 2,38+0,14 41 0,02±0,01 99 1 0,01

Уеда NaN03 40 4,67±0,20 80 2,94+0,81 37 63 1,70

без NaN03 157 6,81+0,27 116 2,86±0,13 58 42 0,72

дрожж. (NH4)2S04 40 2,61±0,17 45 1,15±0,10 56 44 0,79

Экстр. (NH4)2S04 157 3,83±0,15 66 0,54±0,21 86 14 0,16

NaN03 40 12,91±1,04 221 9,68±0,78 25 75 3,00

Уеда NaN03 157 13,23±1,15 226 8,47±0,60 36 64 1,77

(NHO2SO4 40 10,02+0,92 171 4,51+0,41 55 45 0,82

(NH4)2S04 157 8,92±0,90 152 2,94±0,34 67 33 0,49

этношения C/N на химический состав и структуру ЭПС, образуемых A.pullulans '.pullulans F-371 и A.pullulans var.aubasidani F-448.

Установлено, что штамм F-371 A.pullulans var.pullulans з средах Чапека-Докса и да с оптимальным источником азота (NbLt^SOi синтезирует экзоглюкан, близкий структуре пуллулану (табл.3). Экзополисахариды, образуемые этим штаммом в гдах Уеда и Уеда без дрожжевого экстракта с нитратом натрия в качестве гочника азота также имеют пуллулановый аффинитет. Однако при выращивании гамма F-371 в среде Чапека-Докса (неблагоприятная среда для биосинтеза ЭПС) с тратом натрия (неоптимальный для биосинтеза источник азота) как при митирующем, так и при избыточном его количестве происходит синтез зогликанов, сходных по структуре с аубазиданом (табл.3).

В результате фракционирования цетавлоном полисахаридов, образуемых "аммом F-371 в среде Уеда с разными источниками азота ((NH4)2S04 , NaN03) при отношении C/N=157, выделены 2 фракции (табл.4). Преобладающей фракцией оих полисахаридных препаратов была вторая цетавлоновая фракция, выход которой ставляет 81% и 93% (источники азота (NH4)2S04 и NaN03 соответственно). Ее руктура близка к таковой пуллулана. Выход первых цетавлоновых фракций значителен (7% и 19% соответственно), а их структура сходна с аубазиданом.

Таким образом, нами подтверждены опубликованные ранее данные о синтезе гаммом F-371 А.pullulans var.pullulans в оптимальных условиях экзоглюкана ллуланового аффинитета (Юрлова, 1997; Yurlova, Hoog de, 1997). В изученных едах Чапека-Докса, Уеда с оптимальным для биосинтеза источником азота •H-L^SO^ при соотношении C/N=40 и 157 штамм F-371 образует ЭПС ллуланового аффинитета.

Типовой штамм F-448 A.pullulans var.aubasidani в средах Чапека-Докса, Уеда с ггратом натрия при соотношении C/N=40 и 157, а также в среде Чапека-Докса с льфатом аммония (C/N=40 и 157) синтезирует экзоглюканы аубазиданового >финитета (табл.5). В то же время экзополисахарид, образуемый данным штаммом . среде Уеда без дрожжевого экстракта с лимитирующей концентрацией сульфата [мония (C/N=157), представляет собой полисахарид, состоящий из глюкозы и едовых количеств (менее 1%) маннозы, [a]20D=+83 (против +16...+45 в зополисахаридах аубазиданового типа). Экзополисахарид, синтезируемый pullulans var.aubasidani F-448 на среде Уеда с сульфатом аммония (C/N=157) имел 'ллулановый аффинитет (табл.4).

В результате фракционирования ЭПС, образуемых штаммом F-448 в среде Уеда NaNÜ3 и (NH4)2S04 (C/N=157), выделены две фракции (табл.4). Причем отмечено,

Влияние условий культивирования на структуру экзополисахаридов, образуемых А.риМапБ уаг.риИикпБ штаммом Р-371

Питательная Источник Соотношение Моно- Аффинитет Угол Периодатное окисление

среда азота СМ сахаридный вращения, Соотношение гликозидных связей, %

состав [а]20о* 1-6** 1-3

Чапека-Докса 40 Глюкоза А +46 20 49 31

ИаШз 157 Глюкоза А +26 38 14 48

Уеда" 157 Глюкоза П +137 36 52 12

Уеда 157 Глюкоза П +150 15 72 13

Чапека-Докса 40 Глюкоза П +95 51 44 5

(Ш4)2804 157 Глюкоза П +153 33 47 20

Уеда" 157 Глюкоза П +147 42 38 20

Уеда 157 Глюкоза П +118 17 60 23

Примечания: А - аубазидановый; П - пуллулановый; [а]20и* - удельное вращение 0,1% водного раствора полисахарида; Уеда" - среда Уеда без дрожжевого экстракта; 1-6** - 1-6 и/или концевые нередуцирующие группы; 1-4*** - 1-4 и/или 1-2 связи.

Таблица 4

Результаты структурного анализа цетавлоновых фракций экзополисахаридов, образуемых А.ри11и1апз уаг.ри11и1апз штаммом Р-371 и А.ри11и1апз уаг.аьй^ёат штаммом Р-448

в среде Уеда с разными источниками азота

Штамм Источник Фракция Выход, Угол вращения, Периодатное окисление

азота % [а]20о Соотношение гликозидных связей, %

1-6 1-4 1-3

ИаКОз I 7 +44 10 12 78

Р-371 П 93 +254 24 62 14

(N114)2804 I 19 +23 24 17 59

П 81 +128 26 70 4

КаШ3 I 91 +36 26 29 45

Р-448 II 9 +195 - -

(шадо« I 15 +10 - - -

II 85 +178 30 69 1

Примечания: см. табл.3.

-* - не определено вследствие незначительного количества.

Влияние условий культивирования на структуру экзополисахаридов, образуемых А.риИиЬпя уаг.аиЬа51с1аш штаммом Р-448

Источник Питательная Соотношение Моно- Аффинитет Угол Периодатное окисление

азота среда С/И сахаридный вращения, Соотношение гликозидных связей,

состав М20п 1-6 % 1-4 1-3

Чапека-Докса 40 Глюкоза А +16 31 24 45

№N03 157 Глюкоза А +40 59 4 37

Уеда' . 157 Глюкоза А +28 42 22 36

Уеда 157 Глюкоза А +45 32 31 37

Чапека-Докса 40 Глюкоза А +20 _ * - -

(ЫН4)2304 -». 157 Глюкоза А +23 32 12 56

Уеда" 157 Глюкоза,ман-ноза (<1%) П +83 42 33 25

Примечания: см. табл. 3.

-* - не определено вследствие сверхокисления.

то соотношение фракций меняется в зависимости от условий культивирования, в астности, источника азотного питания. Так, полисахаридный препарат, выделенный госле культивирования штамма Р-448 в среде с 1ЧаЖ)з , содержит преимущественно (ервую цетавлоновую фракцию (91%), сходную с аубазиданом. Экзоглюкан, |бразуемый в неблагоприятной для биосинтеза ЭПС среде (среда Уеда) с геоптимальным источником азота ((N114)2804 при С/Ы=157), содержит ^значительное количество первой, аубазидановой, фракции (15%) и [реимущественное количество второй (85%), пуллулановой, то есть в этих условиях гультура продуцирует экзополисахарид пуллулановой, а не аубазидановой структуры.

2. Влияние источников азота на активность ферментов углеродного обмена у цтаммов А.риИикпБ уаг.ри11и1ап5 и А.риМапз уаг.аиЬа51с1ат.

Для изучения влияния источников азота на активность ферментов углеродного >бмена (гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, пентозофосфатного цикла и люконеогенеза) проводили культивирование А.ри11и1апз уаг.риМапэ штамма СПХФА 1 и типового штамма Е-448 А.ри11и1аш уаг.аиЬа51"с1ат в жидкой питательной среде 1апека-Докса с ЫаЫОз шга (N114)2804 (при соотношении С/Ы=40) в течение 60 часов. Зремя окончания ферментации соответствовало высокой скорости роста культур и шосинтеза ЭПС.

При выращивании штамма 11 в среде с сульфатом аммония обнаружена более ¡ысокая активность всех изучаемых нами ферментов по сравнению с таковыми в условиях выращивания с нитратом натрия (табл.6). Так, удельные активности слючевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла (фосфофруктокиназы и люкозо-6-фосфатдегидрогеназы) были соответственно в 16 и 30 раз выше в клетках, ¡ыращенных в среде с сульфатом аммония, чем в клетках, выращенных в среде с пиратом натрия. При выращивании штамма 11 в среде с аммонием также более штивно функционирует цикл трикарбоновых кислот, о чем свидетельствуют ювышенные (в 14-30 раз) активности цитратсинтазы, изоцитратдегидрогеназы и ¿алатдегидрогеназы.

Таким образом, вышеприведенные данные указывают на гораздо более высокую жорость по сравнению с условиями ассимиляции нитрата катаболизма глюкозы (а шедовательно, и энергетического обмена) при ассимиляции клетками А.риМаш /аг.риМЫаш СПХФА 11 аммония. В то же время, можно полагать, что в этих условиях повышена интенсивность и анаболических процессов, на что указывает Золее высокая активность фосфоглюкомутазы (в 50 раз) и фосфоенолпируват-<арбоксикиназы (в 5 раз), поскольку их функционирование связано, хотя и

Удельные активности некоторых ферментов углеродного обмена в бесклеточных экстрактах А.ри11и1апз уаг.ри11и1апз СПХФА 11 и А.ри11и1ап5 vaг.aubasidaш Р-448, выращенных в средах с сульфатом аммония

или нитратом натрия

Удельная активность,

нмолъ/мин на 1 мг белка

Фермент А.риШаш уаг.ри11и1апз СПХФА 11 А.риПЫапБ var.aubasidam Б-448

(N^>2504 ЫаИОз (N114)2804 ИаМОз

Глюкозо-6-фосфат-

дегидрогеназа:

НАД-зависимая 429+196 62±2 120±19 310±12

НАДФ-зависимая 1326±157 48+2 116+12 463±38

Фосфоглюконатдегидрогеназа:

НАД-зависимая 156±34 26±2 72±16 40±10

НАДФ-зависимая 905+89 17±1 55±6 61+7

Фосфоглюкомутаза 2489±47 47±19 86±16 2691+72

Фосфофруктокиназа 635±28 40±5 34±9 111±8

Альдолаза 529±46 18±2 28±1 81±7

Цитратсинтаза 255±68 13±2 39±23 37±5

Изоцитратдегидрогеназа 1639+295 53±6 103±11 141±20

Малатдегидрогеназа 3902±779 279+6 186+16 859±33

Малик-фермент:

НАД-зависимый 111±7 34+19 28±1 114+6

НАДФ-зависимый 487±62 23±3 71±9 76±16

Фосфоенолнируват- 187±62 37±6 32±1 82+7

карбоксикиназа

осредованно, с синтезом предшественников активированных Сахаров, пользуемых для синтеза полисахаридов.

Для штамма Р-448 - представителя А.риЦЫаш уаг.аиЬа5!(1аш также были наружены различия в интенсивности функционирования путей углеродного обмена и различных условиях азотного питания. Причем в отличие от штамма 11 более сокие активности ферментов выявлены при росте клеток в среде с нитратом, ггивность изученных ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути исления глюкозы в данных условиях в 3-4 раза выше, чем у клеток А.ри11и1ап5 г.аиЬа51с1аш Р-448, выращенных в среде с аммонием. Не было обнаружено щественных различий между активностями цитратсинтазы и оцитратдегидрогеназы у клеток, растущих в среде с (N114)2804 или №N03 ■ Однако и росте Р-448 на среде с нитратом существенно выше удельные активности НАД-висимого малик-фермента, малатдегидрогеназы и фосфоенолпируват-рбоксикиназы. Можно предполагать, что этот факт наряду с увеличенной тивностью фосфоглюкомутазы (в 30 раз) отражает активизацию по сравнению с ловиями роста на сульфате аммония анаболических процессов.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о различном иянии окисленной и восстановленной форм азота на углеродный метаболизм риМапБ, а также указывают на гетерогенность популяции микромицета по данному сту и правомерность выделения разновидности А.ри11и1апз уаг.аиЬаз1(1аш.

3. Изучение штамма А.ри11и1апз уаг.ри11и1аш СПХФА 11 - продуцента ЭПС.

3.1. Изучение спонтанной изменчивости.

В результате изучения естественной изменчивости и оценки >лисахаридобразующей активности выделенных морфологических вариантов щелен наиболее продуктивный морфологический вариант.

Стабильность штамма-продуцента при хранении - одно из важных условий ¡пользования культуры в биотехнологии. В связи с этим были изучены естественная менчивость и полисахаридобразующая активность исходного штамма 11 и тделенного нами наиболее продуктивного морфологического варианта после •анения в течение 6, 12 и 36 месяцев при 4°С. В результате показано, что ютношение морфологических вариантов при хранении штамма 11 в течение трех лет основном сохраняется. При изучении естественной изменчивости выделенного нами рианта после хранения при 4°С на сусло-агаре в течение 6, 12 и 36 месяцев и следующего рассева в чашки Петри на сусло-агар наблюдали рост колоний, !рактерных только для данного варианта. Было показано, что его продуктивность )сле хранения в течение одного года с последующим однократным пассированием

на свежий сусло-агар увеличивается на 18%, а при более длительном хранени! течение трех лет) снижается на 30%.

Отмечено, что экзополисахариды, образуемые данным морфологичес вариантом, после хранения в течение одного-трех лет не изменяют своих физ! химических характеристик.

Таким образом, полученный морфологический вариант может б рекомендован в качестве продуцента ЭПС. Вариант стабилен при хранени] отличается большей продуктивностью на оптимизированной среде Уеда сравнению с исходным штаммом.

3.2. Изучение условий биосинтеза ЭПС.

В результате предварительной оценки полисахаридобразующей акгивнс штамма 11 на 5 вариантах питательных сред (Чапека-Докса, Уеда, Голубева, Хар, среда с аспарагином) было показано, что наибольшей продуктивностью дан] штамм обладает в среде Уеда. Качественный состав последней модифициров далее, учитывая наибольшее влияние на биосинтез ЭПС A.pullulans та макроэлементов, как углерод (Блинов и др., 1989), азот (Yurlova, Hoog, 1997 фосфор (Блинов и др., 1975). Наиболее благоприятными среди изученных источив углерода, источников азота и источников фосфора были сахароза, суль аммония, калий фосфорнокислый двузамещенный. Причем выявлено, что в сред мочевиной в качестве источника азота практически не происходит образова меланина, что позволяет исключить дополнительные стадии выделения и очис полисахарида в биотехнологическом процессе. Методом математическ планирования эксперимента был оптимизирован количественный сос модифицированной питательной среды. Состав оптимизированной среды дистиллированной воды): мочевина - 0,37; К2НРО4 ' ЗН2О - 6,0; MgS04' 7НгО -NaCl - 0,5; пептон - 0,6; сахароза - 50,0; pH - 5,5. В итоге на оптимизирован питательной среде увеличивались выход чистого полисахарида на 28,5% сравнению с исходной средой Уеда, вязкость ферментационной массы на 11, экономический коэффициент использования источника углерода на биосш целевого продукта на 11,8% (табл.7). Опытные образцы ЭПС, полученные исходной и оптимизированной питательных средах, обладали близкими физ^ химическими свойствами (табл.8). Глюкан, образуемый A.pullulans var.pullu СПХФА 11, по строению близкий, но не идентичный пуллулану (Wallenfels et 1965), состоял из двух различных фракций. Первая цетавлоновая фракция (23°/с общего количества ЭПС) сходна по строению с аубазиданом ([a]+2CD=+12, количес 1-6 гликозидных связей - 27%, 1-4 - 47%, 1-3 - 26%, значительная полоса поглоще

Таблица 7

Биосинтетическая активность А.ри11и1аш уаг.риНЫаш СПХФА 11 на исходной и оптимизированной средах

Среда Выход нативного полисахарида, г/л Выход чистого полисахарида, г/л Содержание чистого полисахарида в нативном, % Вязкость ферментационной массы (110, Н20), сПз Экономический коэффициент, %

Исходная, I 22,78+0,59 12,76+0,95 56 2,01 45,14

Оптимизированная, III 27,80±0,47 16,40±0,63 59 2,25 50,46

чо

Таблица 8

Физико-химические характеристики полисахаридов, образуемых А.ри11и1аш уаг.рЫЫапэ СПХФА 11

на исходной и оптимизированной средах

Среда Влажность, % Зольность, % Белок, % Редуцирующие вещества, % Угол вращения М20о Относительная вязкость (МО, Н20) Содержание гликозидных связей,% 1->6 1->4 1-»3

Исходная, I 6Д 1,5 0,79 91,6 +124 1,88 16 56 28

Оптимизированная, П1 6,4 0,5 0,63 93,0 +130 2,13 18 55 27

в области 890 см"1 ИК-спекгра), а вторая (основная) фракция (77%) представ] собой пуллуланоподобный линейный глюкан (([а]+2Сп=+190, количество гликозидных связей - 26%, 1-4 - 69%, 1-3 - 5%, значительная полоса поглощен области 840 см"1 ИК-спектра).

Результаты, полученные при изучении нового штамма А.риПикпэ уаг.риШ СПХФА 11, могут быть рекомендованы для апробации в промышлеи производстве пуллуланоподобного полисахарида.

Выводы

1. Установлено, что независимо от количественного содерж. неорганического источника азотного питания (соотношение С/И=40 и СЖ=15 качественного состава других компонентов питательной среды сохраня способность:

а) штаммов ВКМ Б-179, ВКПМ Р-371, ВКМ Р-1125 А.ри11и1ап.ч уаг.ри11и1а максимальному синтезу ЭПС в средах с неорганическим источником азот восстановленной форме ((ЫИ^О^;

б) штаммов ВКПМ Р-448, ВКМ Б-2204 А.ри11и1аш уаг.аиЬаз^ап максимальному синтезу ЭПС в средах с неорганическим источником азот окисленной форме (КаИСЬ).

2. Определено, что концентрация оптимального для биосинтеза ЭПС истош азота (соотношение С/Ы=40, С/1Ч-157) не влияет на химический состав и струк ЭПС, образуемых штаммом Р-371 А.рЫЫапэ уаприШаш и типовым штаммом Р А.ри11и1ап5 уаг.аиЬа51ёаш.

3. Обнаружено, что в неблагоприятной для биосинтеза среде с неоптималь источником азота штаммы, относящиеся к А.риПЫаш уаг.ри11и1аш (Р-37: А.ри11и1апз vaг.aubasidaш (Р-448), образуют ЭПС иной химической структуры, ч( оптимальных условиях.

4. Для штаммов А.риПикп.ч уаг.ри11и1апз (Р-179, Р-371, Р-1125) наибош продуктивность по образованию ЭПС отмечена в среде с меньшей концентра! (С/Ы=157) неорганического источника азота как в восстановленной, так окисленной формах независимо от качественного и количественного состава др компонентов среды.

Для штаммов А.ри11и1апз var.aubasidani (Р-448, Р-2204) наибош продуктивность обнаружена в средах с большей концентрацией (С/Ы

эрганического источника азота как в окисленной, так и восстановленной формах зависимо от качественного и количественного составов других компонентов среды.

5. Подтверждена правомерность использования химического состава и строения жорной цетавлоновой фракции ЭПС, образуемых A.pullulans в оптимальных ювиях, для характеристики внутривидовых таксонов A.pullulans var.pullulans и pullulans var.aubasidani.

6. Впервые изучено влияние неорганических источников азота в окисленной и :становленной формах на активность ферментов углеродного обмена эсфофруктокиназы, альдолазы, глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы, фосфоглюконат-гидрогеназы, цитратсинтазы, изоцшратдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лик-фермента, фосфоенолпируваткарбоксикиназы, фосфоглюкомутазы) у штаммов pullulans. Установлена более высокая активность всех изученных нами ферментов :

а) у A.pullulans var.pullulans СПХФА IIb среде с сульфатом аммония;

б) у типового штамма F-448 A.pullulans var.aubasidani в среде с нитратом натрия.

7. Изучена естественная изменчивость перспективного штамма A.pullulans -.pullulans СПХФА 11 - продуцента пуллуланоподобного полисахарида.

7.1.Выделен активный по признаку полисахаридобразования рфологический вариант, который может быть рекомендован в качестве продуцента 1С.

7.2. Показана стабильность данного варианта по образованию ЗПС при анении на сусло-агаре при (4±1)°С в течение 1 года.

8. Методом математического планирования эксперимента разработана тимальная питательная среда для биосинтеза ЭПС штаммом A.pullulans var.pullulans 1ХФА11.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Yurlova N.A., Kudijashova O.A., Hoog G.S.de. Exopolysaccharides produced by ireobasidium. 5th International Mycological Congress. Abstracts. Vancouver, British ilumbia. Canada. 1994. P.250.

2. Юрлова H.A., Кудряшова O.A. Экзополисахарид Aureobasidium pullulans гамм 11.Материалы Всероссийской научной конференции "Химия и технология карственныхвеществ". С.Петербург. СПХФИ. 1994. С.35.

3. Юрлова H.A., Кирш! А.И., Кудряшова O.A. Влияние состава питателы среды на биосинтез экстрацеллюларного полисахарида Aureobasidium pullulans шта 1 ¡//Микробиология. 1994. Т.63. N6. С.1031-1037.

4. Кудряшова O.A., Юрлова H.A. Влияние источников азота на активно ферментов метаболизма углерода Aureobasidium pullulans. Материалы Всероссийс: научной конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарствен! средств". С.Петербург. СПХФА. 1996. С.19.

5. Кудряшова O.A., Юрлова H.A. Изучение естественной изменчиво Aureobasidium pullulans штамм 11 - продуцента экзополисахарида//Микробиоло) 1997. Т.66. N3. С.354-357.

6. Юрлова H.A., Кудряшова O.A., Софьин A.B. Влияние источников азота биосинтез экзополисахаридов и активность ферментов углеродного обмена у Am basidium ри11и1апз//Микробиология. 1997. Т.66. N4. С.468-474.