Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спонтанная популяционная изменчивость Aureobasidium pullulans (D BY.) Arnaud в связи с полисахаридообразованием

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Спонтанная популяционная изменчивость Aureobasidium pullulans (D BY.) Arnaud в связи с полисахаридообразованием"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ / САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ

ИНСТИТУТ

на правах рукописи

КЛЕЦКО

Людмила Ивановна

УДК 582.282.23. :575.222.?

СПОНТАННАЯ ПОГГОЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ

AUREOBASIDIUM PULLULANS (D BY. ) ARNAUD В СВЯЗИ С ПОЛИСАХАРЩООБРАЗОВАНИЕМ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ -1994

Диссертационная,работа выполнена на кафеле ликробиологид Санкт-Патербургского хшико-фармацевгичаокого института

_ Научный руководитель доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, академик США, профессор Н»П. ЫШЩВ

Научный консультант -кандидат биологических наук,'-.старший научней сотрудавя; .М.И. ПРОНИНА

Официальные ошонентыг "доктор биологических наук Е.П, Н^СОВЕЩ, кандидат биологических наук ¿.Д.,КОЩЩРСКАЯ

Ведуцая.организация - ЦосковохиЯ Государственный Университет

им. И.В. Яомондсоэд

•• » иейя в " № 1

Защита состоится " " адйя в ' "М ■ часов на васвДащш специализированного совета К 08$,63.ОТ при Санкт-Натербургском химико-фермацевтичесвш институте цо адрвоу" - Ш376, Санк1Ч1етербург, ул. пррф,.Исаовв, 14.

С диссертацией ыохно ознакомиться в библиотеке Санкт- Еетер-бургокого жшико-фармацпвтичвского института,.

.Автореферат разослан мая 1994 года

УчешЯ секретарь спвцавдизкрованного совета,

какдчдйт опслогических наук ■ Н.В. КИМШЮВА

Актуальность темы . Вид АигеоЬаэ1й1щп ри11и1апа используется в настоящее время в странах СНГ, Японии, США кяк продуцент экзогликянов. Ня няфедре микробиологии СПХФИ имеется коллекция культур данного видя, в которую включен штамм а А. ри11и1ааа

- продуцент оригинального энзоглюкяня - аубяаидяня: Технология его получения была апробирована на Красноярском заводе медпрепарятов, где впоследствии был создан ОПР н» получение данного лолиса;:гридм. Ранее было установлено, что опытные серии яубгзидяна, полученные ня КЗШ, п зятем - п ня Ладыжинском биьфярмяцевтическом объединении "Энзим" отличались друг от другя по ряду показателей, что могло зависеть от популяционной вариабельности культуры-продуцента, однако эта проблема остявялясь недостаточно исследованной. Данная работа посвящена изучению спонтанной популяционной изменчивости А. роПи-1апа в в связи с синтезом аубязидана.

Цель и задачи исследования. Цель рябо:ы заключалась в определении закономерностей спонтанной популяционной изменчивости А. ра1Хи1апв 9

а зависимости от условий, культивирования, я тякже влияния факторов стабилизирующего отборя в отношении наиболее продукткь-ньгх по экзогликану вариантов. Конкретике задачи были следующими:

- определить подлинность таксономической принадлежности исследуемых культур;

- изучить диапазон вариабельности всех культур на разных средах;

- оценить стабильность продуцентов при хранении;

- изучить экзогликаны, продуцируемые всеми тест-культурами;

- отобрать и исследоаять наиболее продуктивные в»риянтн с цвлыв . вырабвткк практических рекомендаций.

Н»уин*я новизна. В результата исследования уотяновдано, чао струигу^ы популяций А, ри3.1и1апя В и ого в^ри^нтов з*сы.п дгн«»шчнк:

частот* мяникиопенир, различит чпр^олопг'еекчх гипса № ик вляи"«ш«

- 2 -

I -3

.'■(»ХОДОЕ достаточно ВЫСОК"» (10 - 10 ).

Выявлен* коррелятивная связь между уровнем активности образования экзогликянов отдельны!«! вяриянтями и их морфолого-культуряльны-ми свойствами. *

Доказано стябилизирующет действие питательного ягяря Сябуро не трлько в отношении морфолого-культуряльных, но и физиолого-бко--кмических характеристик A. pullulans 8 и его вяриянтов.

Покязяно, что эффект стабилизации полисчхяридйобрязовяния СВЯЗЯМ о изменением соотношения клеток различных морфологических типов A. pullulans прч зямено сусло-ягяря ня ягяр Сябуро.

Установлено, что вяркчнтям A. palluíano 8 свойственна

различная степень стабильности при хранении.

Установлено генетическое единообразие гено?лов исследуемых культур A. pullulana 8 и его вяриянтов с помощью полимеряэной цепной реакции с универсальным пряймером 45.

Покязяно, что обряботкя клеток A. pullulans 8 и его

вариантов акридиновым оранжевым приводит к стабилизации культур ( зя исключением "белого" варианта) по морфолого-культуряльным признакам , я также к увеличению их способностей к синтезу экзогликяня .

Практическая значимость. Установлено, что использование «гяря Сябуро для получения посевного мятерияля сопровождается сужением дияпязоня вяри-бельности культур по обрязовянию окзогликянов и возрастанием частоты вяриянтов, обладающих большей способностью синтезировать яубязидян.

Покяэянс, ч?о для стабилизации ня высоком уровне ПОЛИСЯХарИДО-обрязовяния необходимо, чтобы в процессе ферментации в популяции продуцента преобладали клетки низкопяри«бельчых продуктивных типов; ото может быть достигнуто двумя путями: либо использованном ст^или-зирупщеЯ среды Сябуро для полуени;- инокулвч*, либо искупптирнкь"' со''Д*нием популяциfi - f»c с оцч* htor.

- з -

Одним из предпочтительных способов сохрянеьия жизнеспособными продуцентов является их хранение нв скошенном сусло-ягяре при 4-5°С в течение годя без пересевов ( до 10 лет - по наблюдению М.И. Прониной).

При сокращенном времени вырящивяния посевного млтерияля ( от V суток ня сусло-ягяре - по регламенту-, до 2 суток ня ягяре Сябуро -по няшим дяннш) и сокращенной длительности фарментяции ( от 120 чясов - по регляменту,- до 96 чясов- по дяинш няших экспериментов) мояно достичь регламентного выходя экзоглихяня в случив культивирования продуцентов ня среде Чяпекя-Докся с исходным значением рН 4,0 (вместо 6,2 - 6,4).

При ферментяции четцрехсуточных культур продуцентов ня среде Чяпекя-Докся с исходным рН 6,2 - 6,4 ( либо с рН 4,0) в течение 120 чясов удяется достигнуть двухкратного увеличения внг.одя конечного продукт«.

Полученные результаты могут быть иснскьзовяш для совершенствования биотехнологии яубязидяня в ляборяторных и производственных условиях.

Апробяция ряботы. Мятериялы диссертяции были доложены ня Лленярной Сессии микробиологического общества и Няучного Советя по проблеме "Микробиология" РАН ня конференции "Микробиология в биотехнологии" (IS93) и ня зяседяниях сотрудников кяфедры микробиологии СПХФИ (19S2, 1993, 1994).

Публикяции. Мятериялы диссертяции опубликовяны в трех стятьях в журнялпх "Микробиология" РАН, "Микология и фитопатология" РАН.

Объем и структур* диссертяции. Диссерт«ция состоит из вьедения, об-зоря литерятуры, экспериментяльной чясти, обсуждения результатов, выводов и биАлкогряфии. Рпботв изложеия т

СТряНЖИК. содержит ?-Q таблиц, рисунков. С/ше.ж цитнруст-сП Л!<т.)р1тур«

ИЛТО'ШИКОВ.

материалы и методы исследования.

В качеств,« объекта исследования использовали культуру А. ри1-1ц1апз штамм 8 - продуцент оригинального эхзоглюивня

аубазид*на, а также 4 его спонтанных варианта.

Изучение некоторых морфологических и биохимических свойств X. ро11и1апв 8 проводили в соответствии со "Схемой стандартного описания новых видов дрожжей"(Бабьева, Голубев, 1979).

Изменчивость культур по морфолого-культуральным признакам изучали на трех средах: сусло-агаре, агаре Счбуро и среде Лоддвр и Крегер ван Ридж с добавлением 1,05» ( НЙ4)2 (Блинов ,1964).

Для рассева использовали взвесь дрожжевых клеток двухсуточных культур, выращенных на сусло-агаре, густотой 1,0'Ю кл/мл. Количество клеток в суспензии определяли в камере Горяева. Исходную суспензию разводили стерильной водой в - 10^ раз и по 0,1 мл каждого разведения вносили в чашки Петри и распределяли шпателем по поверхности среды. Чашки с посевами инкубировали в течение 7 суток при 25 ± 1°С. При описаний морфологической изменчивости культур учитывали размер выросших колоний, их форму и окраску, образование меланинов, наличие воздушного мицелия.

Ферментации проводили при 25 Й°С в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл со 100 мл жидкой питательной среды Чапека-Докса с 5,0$ сахара-рафинада при непрерывном перемешивании на качалках (М= 220 об/ мин) в течение % часов. Засев ферментационных колб проводили посевным материалом, выращенным в аналогичных условиях в течение 48-50 часов.

Выход полисахарид« определяли чесовнм методом. Культур*льнуга жидкость центрифугировали при 35 ООО об/мин в течение 10 мин для отделения клеток от полисахарид», к супернат«нту прилив^лг дв* обьсм» 96% этанола. Отделенный СТ ч-цос-дочной ЖИДКОСТИ полисахарид

" - 5 -

высушивали до постоянного веса при ЮЬ°С.

Исследуемые культуры ри11и1ааа хранили и размножали

на скошенном сусло-агаре в пробирках диаметром 20 мм , рН до стерилизации устанавливали равным 6,2 - 6,4. Культуры выращивали на скощенном сусло-агарэ в течьние 7 суток при 25+1°С и хранили е холодильнике при 4-6°С. Кроме того, для длительного хранения продуцентов

яубазидана использовали лиофилизацию с применением различных сред: 0,3% водного раствора аубазидана; ХОД раствора сахарозы; среды, состоящей из 10% раствора сяхярозы, 1,5% желитина, 0,1$ агар-агара; сусла с 7% сахара; снятого молока. Режим лкофилиэации : при ( -20°) С в течение 24 часов, затем медленный подогрев до 5°С в точение 4-6 часов. Ампулы запаизали под вакуумом и сохраняли в хояздилыткв при 4-6°С. После окончания процесса лиофшшзации определяли жизнеспособность лиофильно высушенных культур.

Образцы чистых полисахаридов получали из неразбавленной фермои-тационьой массы с помощью ультрацентрифуги МОГ»! 3170 В ( 35 ООО об/мин 10 мин). Супернат«нт очищали от остатков питательной среды и продуктов метаболизма двухкратным оскдением 96% этанолом. Осадок растворяли в дистиллированной воде и затем вновь осаждали 55% этанолом. Полисахарид высушивали при 40°С в течение п-8 часов. Полученный образцы анализировали по следующим показателям: удельному вращению - на автоматическом поляриметре "Регк1п - Е1иег-241"( соотношению гликозидкых связей - методом перйодатного окисления ( ^Чеугуи Ьапеа ,1933).

Клеточные лиэагы получали по методу Булата и др.(1992). Мйцв-. лиальную пленку трехсуточной культуры суспендировали в лизируицем буфере и инкубировали 3 часа. Для очистки и ося'кдения ДНК использовали последовательна смесь хлороформ~окт»ноя, изопропанол и эганол. Осадок, содержащий ДНК, растворяли р буфере ТЕ с РНКазой А и полученный лизят - грубый препарат ДНК - хранили при .

Полимвразную цепную рчякцич (ПНР) про роя» пи в 30 икл буфера, ^пдяржпцто Ю-Г-ЮО кг гоночной Д'К (0,1 - I мкл лиг>л таI,

- 3 ед тер'дост»бильной ДНК- полимер* зы ЪЬегюорЬПив

(Кябоев и др., 1989), по 40-100 нг пряймеров. ПЦР (30 циклов), осуществляли н» термоциклере в режиме: денятуряция -92°С, 50 сск; отжиг - 53°С, 60 сек; синтез ± 70°С, 70 сек. Использо вяли универсальный пр»ймер 45 ( Булят и др., 1392; Макрсуеов ; 1993

Разделение смеси ямплифицировянных фрягментов ДНК проводили в «гярозном гело (1,7$)( который окряшивяли бромистым этидием и фотографировали ня пленку "Микрят - 300 " в УФ-свете (302 нм) (Мяниятис и др., 1984)..

Для обработки культур якридиновым оряняовым (АО) готовили раствор последнего в стерильной дистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл, стерилизовяли фильтрованием через фильтр Зейтця, зятем дс бявляли в ряспляпленный и охлажденный до 40°С сусяо-ягяр до достижения концентряции 200 мкг/мл. Среду рязливяли в пробирки, которые оясевяли культурами двухсуточного возрястя, предвярительно выращен ными ня сусло-ягяре. В целях повышения эффект« действия АО провод? ли по 5 последовательных пересеввв кяждой из исследуемых культур > питательную среда' с АО в пробиркях.

Статистическую обработку д*шых проводили по известным методик ! ( Жуковя, Коммунярскяя, 1978).

Результаты исследований и их обсуждение I. Споктянняя изменчивость А. рч11и1апс г популяциях

В результяте няших исследований устяновлено, что популяция клеток рчХ1и1вп8 8 . _ гстерогенн" и расщепляется при рассев?»: ня ягяризовянних питятельных средах ня несколько типов, отличающих' ся ПО морфолого-культуряльныи И фПЗИ0Л0Г0-бИ0ХИ>.'ИЧВСКЛМ приэнткгм.

В таблице I прс-дсгчвг.ени .плнныг по споч1»нноЯ изменчивости &.. ри11и1аав ъчтрут о -то Бчр'.!*ИГОП ПРИ рч^ВКТИИ «П Ср'Д^Х V"

л о а ■ о СО о

X) Уз тз /Ь ь

О В о о

о' 1 о 1 о

в » 1=1 -» ТВ И л »

ст. 1 О 01 п О Ос ч

л ТЗ ■ ё Т! ё Л -й

о со -а о © ■п о

>£. ГО О»

о

ю

03

си

• Ц1

о

ю

О

тГ X

сл

ЙЭ

СлЭ

»-ч I М

-

СЛ сл <о 1 СП

О с; о

8

СП сл

СГ>

о

о» о

со ст> 1С

о го

2

о -<2

<2

к о X о

>1 ГЕ Е

•О » о сд й ю Е л

Ш

Число просмотр. клонов

¡очень крупные, |светлобекевые, 1 морщинистые • 1 1 1 1-е Ь-Н 1 £ ю м ю М

1Л

¡очень крупные, ¡бежевые, сек-{ториоовянные, I морщинистые ГТЗ га Я 1Ж ГШ . 1!э №

'очень крупные, ¡черные, шеро-| ховятые 1Я 1К 1 К 1Ш 1 ю

¡крупные, белые, 1 скл^дчятые —к 1Ы << ¿= к

}карликовые, коричневые, 5 выпуклые | П5Я 1 1 << 1 1 1

Т1

>Э> О

о

1

0

1

я ь

(7*

в

и

сг

X

I

а -й к к

2

о •с

а ы к

я о •ч о

о о

«о

с

р>

и

СС

о

личного состав«, Для определения границ морфологической вариабельности культур их ряссевали на 3-х средах: сусло-агаре, агаре Сябуро и среде " Лодцер и Крегер в*н Ридж(с добавление« 1,0% ( ИН+)2 80^). Популяп,ионный состав продуцентов зависел от состава питательной среды. Наибольшая В»ри*бвЛЬНОСТЬ Культур Проявлялась При р»ССвВв На сусло-пгаре ( выявлено 5 морфологических типов), наименьшая - при р.-ссеве на »гаре Сабуро и среде Лоддер и Крегер вян Рида с добавлением 1,0% (ИН4)2 ЭО^ ( по три морфологических типа на каждой среде).

Основным морфе югическим типом для штамма 8 во всех случаях являлся I- морфологический тип - "светлобежевый": частота его появления в популяции составляла 6£,25% - 87,0256.

В свою очередь при рассевах вариантов штамма 8 на сусло-агаре основным для них являлся тип, определяющий название соответствующего морфологического варианта. Так, В популяции "светлобежевого" варианта !<о/онии"светлобежеввго" типа составляют 59,0%; в популчции "бежевого" варианта - "бежевого" - 62,00$; частота встречаемости колоний "черног типа у "черного" варианта - 62,40$; "белого" тип* у "белого" вяриян -та - 87,50%. При рассевах на агаре Сабуро и среде Лоддер и Крегер Ван Г'ИДЖ ( С добавлением 1,0$ (ИВ^г 304 ) У всвх вариантов, за исключением "белого", основным являлся "светлобежевый" тип. Что касается "белого" вариант», то в составе его популяций при рассевах н» различных средах вс всех случаях основным явялялся "белый" морфологический тип - 74,40$ - 91,80$, что свидетельствует о его большей генетической стабильности.

Таким образом, применительно к популяциям исходной культуры и морфологических вариантов А. риНиХапв 8 , сусло-»гар является дифференцирующей, а ягар Обуро - стабилизирующей средоЯ. Использов«-нио среды Лоддер и Крегер п»н Ридж п качестве стабилизирующей возможно, но не экономично из-я« значительной ( до 32,пО'Л частоты появлет1 карликовых морфологических В»ри*НТОВ, Хар«кТррН>1ук;!ЧИХСЯ Н1\чКИЧ уровнем активности образования пелиоажаткла»

При расщеплении популяции микроорганизмов на варианты с;.«временно с изменением 'культуральинъ характеристик меняются , к»к известно, многие физиологически? особенности тест-аультур. С целью пыяв-ления коррелятивной связи между уровнем активности образования экзо-гликанов отдельными вариантами и их морфолого-культур'льными свойствами был проведен анализ образования ЛОЛИСЯхариДя различными ТИПямИ колоний А. рч11а1апе ц.

Как било;.установлено ранее, естественная популяция штяммя 8 характеризуется высокой вариабельностью по биосинтезу аубазидан-», коэффициент изменчивости ( ст) равен 37,80$.

Популяции исследуемых вариантов ри11и1апв 8 ^ виде^лнных С сусло-ягяря, иян видно из таблицы 2 и рис. I., также характеризуются значительным размахом спонтанной изменчивости в отношении продукции *убазидан«: ОТ НЯИМЙНЫЗвГО у "бйКЗБОГо" варианта (25,37%) ДО наибольшего у "коричневого" (46,08%).

Существует зависимость между морфологическими особенностями ко -лоний и их биосинтетичесними способностями: наибольшее количество экзогликан» синтезируют культуры "балог"" вариант?», наименьшее -"коричневого" (табл. 2).

Применение среды Обуро для вырящивяния посевного м*териал* привело К сужению диапазона вариабвЛЬНОСТИ Культур ПО обряЗОВ'НИЮ ЗКЗО-" гликанов ( в пределах контроля) и к увеличению частоты вариантов, обладающих большей ( по сравнению с контролем) способностью синтезировать аубязидян (табл. 3, рис. I).

Таких! образом, агар Сабуро оказался СТабИЛИЗИруЮЩеЛ СрвДОЙ Нв только в отношении морфолого-культуральных, но и физиолого-биохими-ческих хар»ктеристик А» раНиХааа .

Эф$акт стабилизации полисахаридеоб разования связан с изменением соотношения клеток различных морфологических типов ри31и1вп« при замене сусло-агара на агар Сабуро.

В результате изученчя изменения пвпуляционного составав а процессе ферментации на ерем Чяпек»~Докгя при впрядавшим п я

Т*бЛИЦ* 2.

Изменчивость шт'-мм» 8 a. pullulans , . по признаку образования полисахарид*

гпзи вырягздоиии посевного материал» нп сусло-»гяре

Наименование ВЯРИЯНТОВ Образование полисахарид*, % к КОНТРОЛЮ Коэффициент изменчивости (сТ),% Ч»етотя вяриянтов с измененной активностью , %

X * и предел?' колебоний плюс— в»риянты минус- вяриянты

"светлобеяевкй" 96,67 + 5,74 57,36 * 131,62 23,02 0 0

"белый1* 98,15 i 7,22 31,00 i 192,00 38,23 7,411 5,04 0

"бежевый" 119,00 ± 6,88 76,90 * 200,00 25,85 5,00 ± 4,87. 0

"черный" 90,00 ♦ 8,75 31,00 f 192,00 40,06 5,ае î 5,71 0

Тябдиц» 3. ...

Изменчивость исследуемых вяриянтов Ж. ри11иХапо шт»>гчя 8 по приэн»ну.обрязовяния

аолис»хяридг> при вырящйврнии посевного мятеркяля н» ягяре Сябуро

» ; Кякменовяние | эрриянтов 1 ! 1 " 1 [ " Обрязовяние полисяхярздя, % х контролю Коэффициент изменчивости Чястотя вяриянтов с измененной активностью,'%

• х ♦ в пределы колебялий плюс-вяриянты минус-вяриянть-

I "светлобежевый" ( I 107,89 + 4,30 61,00 + 137,50 ■ 17,36 0 0

! 1 "белый" 108,101 5,15 61,00 150,00 21,82 0 0

; | "коричневый" 1 100,53 ± 5,16 61,00 + 150,00 22,36 5,26 ± 5,12 0

-ю зо

20

10

О

30

20 10

0

40

30

20 10

0

30 • 20

10

О

50 40

30

20

10

х ± 2 6

„П

(II)

(а)

30 -20 10 0

ix±2á

40 80 120 160 _ х± 26 '

x±2¿

x±2cS

0 40 80 120 160

Рис. I. Образование П0ЛИС*Х*РИД» Вариантами штамма 8 :

(I) - при выр»цивании посевного

материала на суСЛ0-»Г»ре,

(II) - при выр»щив»нии посевного

м»терн»л» на »гаре С»буро; (»)-"светлобежевый" в»ри»нт, (б)- "белый", (в) -"коричневый", (г) -"бежезый", (д)- "черный".

40 80 120 160 200 240 0бр«эоБ»ние полисахарид«,1? к контр.

ноге материал* на сусло-агаре и агаре Сабуро установлено, что в популяции ру11и1вп8 8 в случае с сусло-агаром преобладали клетки основного "светлобвжевого" и "черного" типов ( 34,77% и 46,17% соответственно), а при использовании посевного материала, выращенного на агаре Сабуро - "светлобвжевого" и ¡'бежевого" типов (65,37% и 10,39% соответственно)". Культуры "черного" типа , как ¡было указано' ранее, характеризуются боле^ низйим, чем у"бежевого" уровнем активности синтеза экзогликанов| ' '

В популяциях морфологических вариантов А. ри11и1апа 8, ' 5" исключением "белого", При выращивании посевного материала на аГаре Сабуро также доминировали клетки продуктивных НИЗКОВарИябеЛЬНЫХ . "светлобвжевого" и "бежевого" типов. В популяции "белого" варианта при ферментации преобладали клетки, форлирухщив при рассеве ЦП "сусло-агаре колонии "белого" типа (71,0% - 92,8Й).

'Следует обратить внимание на то, что к концу ферментации в популяции "черного" варианта наблюдали высокий (16,3%) процент клеток низкопродуктивного"коричневого"типа, тогда как для популяций остальных исследуемых вариантов это не было характерно.

Таким образом, эффект Стабилизации-ПОЛИСахаридООбрааОВЯНИЯ При использовании агара Сабуро объясняется изменением соотношения клеток, различных морфологических типов в пользу клеток низковариябельных продуктивных типов.

При исследовании способности к синтезу полисахарида у искусственно созданных популяций-ассоциантов, В СОСТавб КОТОРЫХ Преобладали клетки тех или иных морфологических типов, было обнаружено, что выход полисахарид» при использовании В КачеСТВЙ посевного материала культур относительно низковариабельного Продуктивного Варианта в одним из внсоковари»бельных увеличивался с уменьшением коэффициента в"ригбельчости последних. Так, способность синтезу полис«харидя.у ассоциации Культур "беиеВОГО" Й "коричневого" вариантов - самая низ-

к»я; выход "нА'ишяогв" подисяхяридч - 7,С1> г/л, Ч'«1 составляет Ь9,(;,; по отношению к контролю (8,94 г/л). Выход полисахарида при печатании "бежевого"-и "белого" вариантов - 9,3^ г/л (105,0% к-контролю);

"бежевого" и "чсривгв" -10,51 г/л (118,0$ к контролю). * ■

В ассоциации высоков»риябельного "белого" варианта и 'высокое*-. ри:чбельного "чорнбгв" , обладающего бо^ев низкой продуктивностью и ■меньшей скоростью реем, основными являлись клетки "белого" типа и ниакеьяринбельиего и менее продуктивного "еввтлобежеьоге" (57,53$ и 42,14^ соответственно). При предварительной стабилизации ассоциянтой ( выращиванием посевного млтвриялл н* среде Сябуро) деля клеток "белого" типа в искусственной, популяции составляла 74,86%. Отсутствий колоний "черного". гчцм при рассевах спр¿делялрсь, вероятно, его ьиз-кей скоростью роста ( по ¿сравнению с' остальными вариантами)., а такжи особыми селективными" преимуществами клеток "белого" типа.

Таким образом, для стабилизации пояисяхаридаобрязовяния необходимо, утрбы р процессе, ферментации в популяции продуцента- преобладали клетка низковгриабелышх-продуктивных типов, что'может быть дсстигиу-ть двууя путями: либо исйользованием стабилизирующей среды Счбуро Для получения инокулшя, либо искусственным соьданием пепуляций-ао-СОЦМНТбВ. «

Наиболее простым в исполнении и эффективным является первый путь,-особенно при испольэйьянни в к|»чествь продуцента "белвго" варияц 19, популяция «второго в данном случае менее гетерогення, * продуктивность клеток демцкирущего в сняодтельной степени "белого" тип* деитято'-лго высек».

2. Сценка стабильности спонтанных вариантов При ХранвНИИ

В»|-к«чт«м рц11и1апе Г. свойством}"» различная 01 впонь стя-,б*д< 49? тя.лри '-«ранвмни , что лучач лсего шглистрягувтс? [^яультмями

опытов по сохранению культур в лйофилыю высушенном состоянии.

Из табл. V видно, что варианты обладают различной степенью резистентности к высушиванию вне зависимости от состава сред. •.

ШИЧ ДИЯПЯЭОНОМ ЗЯЩИЩеННОСТИ характеризуется ''белый" вариант, наименьшим - "черный".

К сожалению, все культуры ри11и1апв 8, оказались внсо--

МЧУВСТВИТСЛЬНЫМИ к лиофирзации.

Одним из предпочтительных способов сохранения прлуцантов,. гарантирующим полную выживаемость культур и сохранение их биосиптетичвс-КИХ способностей является хранение на косяках сусло-агара при 4~Г)°С ( срок наблюдения - I год). По данным М.И. Прониной культуры '

1и1апз 8 могут сохраняться в т*ких условиях до 10 лет без периодических пересевов. Из табл. 5 видно, что состав популяций продуцент** после хранения в течение I года ( без пересевов) в вназнязв иных условиях изменялся , обеспечивая, очевидна, выживание наиболее приспособленных форм. При этом не наблюдалось существенных колебаний п образовании экзогликанов, диапазон вариации культур по этому признаку и количество вингезируемого полисахарид* остяаялись н* исходном уровне ( рис. 2, таб/. 6).

3. Экзогликяны, обрязуемне вариантами А. ри1?.и1апв 3

Все варианты А. ри11и1адо 8 В регламентных условиях куль -

тивирования синтезировали яубяэидан. При использовании В кячоптве фер*ентациснной среды для получения пуллуляня продуктами ферментации былч полисахарида РАЗЛИЧНОЙ СТруКТурч С Преобладанием - гликоекд-ннх связей. Очевидно, А. риИШала О - продуцент яубяэидяня- п определенных з'словиях вир«щив«ния монет синтезировать экзоглпя'. м, отличные пп строению ОТ «убазндаца.

"я&пгая I,

бг® „токошашй различных .вариантов роХХШааз 6 , (£) Посл~ хранения

з течвяиь -4-х 1кгт в лкофчльно звсзтаенксяй состоянии при ?емяегятутзе'4 - С

.¿ост-'в

Наименование вариантов-'

1 суспензионной , среда "светлобежевый"• "Оежевйй-" "белый"' ь - " "" "черный"

' 0.3% водный раствор ; (И) I .0 0 0 0

10" раствор | с®х»розы ("2; 1,03 Ю-2 о •.■ ■ 1.25 1СГ4 ' . 7,64 1

! 10% р-Т) сахарозы, ■ ; 1,5% келятиня, . 2,73 ' 1,10 КГ2 . 6,45 • 5,00 Ю-4 •

; сусло с 7%спхяр» (М) 6,67 Ю-4 • | '4,00'ПГ4 1,50 1С-1. 0

; | . 0 ' • 4,00 Ю~2 I 1.73 1С-2 ; снятое молоко (го) < ,] ■ , с

ст.

I

Изучение стабильности вариантов А. ри11и1вов а при хранении их в течение I года»

сусло-»гярз при температуре

4 - 5° С по морфологическим признакам

1 ! Наименование ! ЗР0ИЯНТ0В 1 ! . 'число просмотренных колоний Соотношение различных морфологических типов в популяции, %

"светло-бежевый" "бежевый" "черный" '"оелый" "светлобеже-вый ДФ"

| "сззтлобежевый" 1241 35,37 3,06 0,73 60,84

| "белый" 1 '. 1583 2,27 0,06 4,80 ■92,10 .' 0,76

1 "бежевый" 1105 55,20 21,90 12,58 .0,36 Ф 9,95

"черный" • 1127 . 2,84 ' • 2,04 84,12 . 3,55 7,45

DÛ

50

40

30

20,

10

о

40

30

20

10

О

40

30

20

О

50

40

зо'

20

10

о

<й.

ле хранения при 4-5°С с течение I' юд« и» суоло-«г»рй

Гч б ЛИЦО 6.

Образование экзоглакяня различными вариантами РнИиАяав 8 после хранения

нр сусло-»горе в течение I года при температуре 4-5° С

^»именование езриянтов Образование полисахарид», % к контролю Коэффициент изменчивости (ст ) ,% Частота вяриянтов с измененной АКТИВНОСТЬЮ, %_

х 1 я пределы ' колебаний щю с-■ варианты мкнус-вярипнты

"сзетлобежевый" 96,67 + 5,74 57,35 V 131,62 23,02 0 0

"белый" ! 98,15+ 7,22 " 31,00 192,00 38,23 7,41+ 5,04 0

1 ■ ■ "беяевый" 119,00+ -6,88 • 76,90 200,00 25,85 5%,00 2ГТ,67 0

"черный" • 1 90,00+ 8,75 . 31,00 + 192,00 40,06 5,88+ 5,71 0 I

4. Характеристика культур после обработки. акриди-

новым оранжевым

Структуры популяций Л. pullulane а . и его вариантов очень . динамичны: частота возникновения различных морфологических Типов и их вэ. иыных переход»» достаточно высока (10 - 10 ), что характерно для процесса диссоциации. Частота случайных мутаций, как известке, на несколько порядков ниже.

Процесс диссоциации у бактерий создает фенотипичоскоо разнообразив ферм ия .единой генетической основе, а в его рвгуляцнр, вероятие

определенный вклад могут знести' мигрирующие генетические элементы ■ * %

. (. транспозеиц, прсфяги,1 плазмиды, I S-элементы).

У дро„жжвЙ извойтны чиллер- и 2-хмикронная плазмиды, Ту -фактор). У A. pullulane половой процесс не обнаружен, и , может быть, ствль,высокая частота взаимных переходов различных морфологических Типов" объясняется перенесен' генетической информации с участием каких-либо .мигрирующих генетических ¡элементов.

При сравнении геномов исследуемых культур 1» pulluíana

с помвщыэ пвяиьирязной цепной реакции с универсальный прайм ером 45 *

не было обнаружено различий иежду ДНК у вариантов - продуцентов полисахаридов . .

Обработка клеток X, pullulane 8 АО привела к стабилизации культур ( вэ исключаем "бЬЛОГв" варианта) по морфолего-культураль-кым признакам, а'такжв к увеличению ( на 40$ - 70^) их бивсинтети-че-:кчх, способностей.

Сохрялвни» культур в точение 15 месяцев на косяках сусло-агара с, двбаглшивм АО в' концентрации 200 икг/мд при температуре 4-5®С не ОНИВИЗО эффекта ОТ*бИ1НЭЯЦШ1 вариантов X. pullulane 8 пе мпрфв^вгс-Jf."ík*ypaíbHi.v признакам, но спясебность к синтезу аклогликянрв у • QOJC культу? »«-KÍUKO снизилась.

. -.21 -

Результаты обработки A. pullulane 8 АО аналогичны в отношении вовх вариантов, За ИСКЛВЧвНИвМ "ббЛОГв". ПвС^в обработки АО аначительно увеличилась гетерогенность ere популяции, а способность к синтезу аубазидана понизилась; после сохранения в течение 15 месяцев на косяках сусло-ягара о добавлением АО активность синтеза Ькзогли-кяна стабилизировалась и, даже, возросла.

■ !> • . '

5. Исследование i наиболее продуктивных вариантов в стандарт-

\ .. ..

ных уоловияхг^культивирования . , .

Поиск высокоактивных в отношении синтеза экзогликанов продуцентов проводили как среди культур наиболее стабильного и продуктивного "белого" варианта, так И срвДИ ОСТаЛЬНЫХ вариантов.

Отобранные культуры "белого" варианта использовали при определении условий биосинтеза е целью сокращения его продолжительности. Для сравнения в данном эксперименте брали культуры "бологе кратер-ного" варианта, выделенного из популяции «бработанного АО "белого" при его рассеве на сусло-агаре.

В результате установлено, что возможно сокращение сроков акра-щивания посевного материала до 2-х суток на агаре Сабура ( вместо 7 на сусло-агаре), длительности ферментации - до 95 часов с сохранением регламентного выхода экзогликана при культивировании продуцентов на среде Чапека-Докса со значением рН 4,0 ( вместо 6,2 - 6,4).

Можно ДОСТИЧЬ также ПОЧТИ двухкратного увеличения выхода полисахарида при культивировании чотйрехсутбчных культур продуцентов на • среде Чапек*-Докса с рН 6,2 - 6,4 ( либо с рН 4,0) в течение 120 часов.

Кроме того, обнаружено, что культуры "белого" варианта в сравнении С "белыми кратерными" обладают большей адаптационной СПОССб-ностью к неблагоприятным воздействиям внешней среды, :что иллюстри- . руегся кривыми роста и выживаемости данных культур при фер^ентациях' н" средп различного состаз» (рис. 3,4);

<) 24 '48 72 S6 ' 120 Ч»сы фврмент»ции

Рис. 3. Кривые ростр четырехсуточных культур "белого" и "белого . крятерн'ого" вариантов в процессе ферментяций ня средях: И - Ч;Ч[е1У»-Дбкс.я, pli =, 6,2 - 6,4 ; №2 - Чяпекр-Докся,рН=4,0; Jf3 - Чяпекя-Докс'я, рН = 4,0, с 1,Ь% пептоня.

3

f'HC. 4. Изменение ç числя кийнеспособных клеток четырехсуточных культур "белого" и "белого кр»терного" вярияигоБ при 4ep».eiiTfnaii.4 ня срвд«х:

(VI - "»пы^-Докс*, рН « 0,!: - о,4; ("*•) ~ ф»иаьч-Доко, S ri • <1,0;(«*-),>■•;. - Чя|.«Л(п -¡Доне» v пеп'.огг » ( 1 ,Г; г/л),fil 4,0

ВЫВОДЫ

I.При изучении закономерностей спонтанной изменчивости риИиЗапо 8 и его вариантов установлено," что их популяции гвтерогенни И ВКЛЮчаЮТ В Свбя, В ЭавИСШОСТИ ОТ СОСТава ПЙТаТвЛЬНЭЙ СрйДН, 3-5 морфологических ТИПОВ, характеризующихся ВЫСОКИЙ частей возникноа?!-иия (Ю-1 - КГ3) и Отличающихся по марфолого-культур*льним и

I

фИЗИОЛОГО-бИОХИМИЧ^СКИМ Признакам. ' '

?.. Максимальное число морфологических типов (пять) формируется на сусло-агаре, минимальное { три) - на агаро Сабур®. Поэтому оусдэ-агар является дифференцирующей, * агар Обуро - стабилизирующей средой.

3. Снижение вариабельности продуцентов по признаку синтеза экЗо-гликан» может быть достигнуто благодаря использованию стабилизирующей среды для выращивания инокулша или искусственному созданию пслуляций-ассоциантоя, в состава которых преобладают клетки низковариабельных продуктивных типов ("светлзбежевого" и "бежевого'9 Наиболее эффективным и простым по исполнению является первый

путь, особенно при использовании в качество продуцента стабильного и продуктивного "белого" варианта.

4. Штамм 8 А. ри11и1опа и его варианты отличаются высоким уровнем ■ выживаемости и стабильности синтеза полисахаридов при длительном хранении н« косяках сусло-агара при 4-5°С без периодических пересевов ( до 10 лет).

Г>. При варьировании УСЛОВИЙ Процесса биосинтез* «убазидаца ПО таким параметрам как возраст посевного материала,'состав ферментационной среды У. значение рН установлено, что возможно: - получение экзогликана в предусмотренном регламентом количестве (V - 1Г' г/л) при использовании п качестве посевного материала ччухсуточчои культуры продуцента, выр"Я(»ННОП на агаре СабурО

-24 - ;■

(вместо свмисуточной на оусдо-агаре — по регламенту) и последующем выращивании ее на ферментационной среде Чапека-Докс* о исходным pH 4,0 в течение 96 часов; . : повысить выход целевого продукт* в дв^реэа, аоли использовать посевной материал в возрасте четырех суток, выращенный на агаре Сабуро , и проводить ферментации на среде Чапака-Докса с исходным pH 4,0 ь течение 120 часов.

6. Показано, что обработка A. pullulena 8 , и его вариантов (за исключением."белого") акридиновым оранжевым в концентрации 200 ииг/их приводит к стабилизации продуцентов по морфологе- культу-ральным признакам к к повышению ( на 40 - 70%) их способностей

. синтезировать экзоглйкан.

ЭфЬект, стабилизации »культур по морфолого-культуральным признакам сохраняется в течение 15 месяцев ( время наблюдения) при 4-5®С на сусло-агаре с добавлением акридинового оранжевого в концентрации 200 мкг/мл, однако способность К синтезу полисахарида насколько снижается..

7. Полученные данные могут быть наложены в основу рекомендаций для включения в существующий 0ПР на аубазидан' после их апробации в производственных условиях.

Статьи, опубликованные по темв диссертации . .

»

I. Слинов H.H., Пронина М.И., Коссиор Л.А., Погребная A.B., Ананьева Е.Д., Сагуккэва Т,Я,, Клецке Л.И. Особенности мутагенеза и гибридизации Aowob&eidiun pulluiaaa (Dt В-У) Amaud Ц Rhodotorula rubra { йошлс) ¿odder ' - продуцентев полисахаридов// Микология и фитопатология РАН, 1390. Т; ?4, «т.2, с. 136 - 140.

¿,. hiMHbt ü.П., Пронине М.И., погребная A.B., Коссиор ^.А., Кле^о Л.Ii.

ДвРь-Т*»« ■*'!* WVfCKH ' И ХШИчеСИИХ муТаГОНОВ На НГ»'вН'-ШВОСТЬ

ИкгагЛчкеШиж yullttlftWi (l.W), Атааай шт««»' Ь - продула*?« «,уб«аи-